一、流感病毒H9N2亚型毒株RNA_4节段基因序列分析（论文文献综述）
张醒海[1]（2021）在《候鸟禽流感病毒遗传变异规律分析及在哺乳动物间传播机制研究》文中研究说明流感病毒是目前最受关注的人畜共患病原体之一,广泛分布在自然环境、家禽及候鸟等自然宿主中,可感染包括人类在内的多种哺乳动物,对国家生物安全、产业经济有着重要影响。该病毒对人类健康的危害主要表现为引起季节性流感、流感大流行和人感染动物流感等。候鸟是H3N8、H9N2和H5N8等众多亚型禽流感病毒的储存库,且这些病毒持续在我国候鸟中流行传播。近年来它们又出现新的生物表型或基因特性,如水禽不仅呈现无症状携带流感病毒,也出现了感染甚至致死的现象;部分候鸟来源的病毒,可发生水禽-陆禽的传播;出现禽源H9N2、H5N8感染人的现象。这些亚型病毒在中国候鸟中的流行、进化及引发公共卫生风险等问题亟待解决。本研究以监测中国东部候鸟禽流感病毒流行动态为切入点,研究内容包括发现候鸟禽流感病毒的亚洲-北美地区跨洲际传播的证据,揭示候鸟禽流感病毒在自然宿主中的遗传变异规律,提供禽流感病毒家禽-野禽间跨物种感染的证据,评估候鸟源禽流感病毒在哺乳动物间的传播能力以及识别决定禽流感病毒跨物种感染人的分子特征。第一部分:中国东部地区候鸟禽流感流行病学调查。在全球候鸟迁徙背景下,选取途经我国东部的东亚-澳大利亚候鸟迁徙路线上重要候鸟停歇与聚集地（湖南东洞庭湖、环渤海湾湿地、内蒙古图牧吉、上海崇明东滩）开展了2016-2019年为期四年的主动预警监测,分离跨洲际传播或新型重配候鸟源禽流感病毒株,并测定其全基因序列。监测过程中本研究共采集了来自96种不同鸟类的35604份样本,分离得到88株病毒,候鸟禽流感病毒携带率约为0.247%。亚型多样性分析表明分离毒株涵盖12种HA和9种NA组成的23种不同亚型。其中低致病性禽流感病毒H3、H6、H9亚型为优势流行毒株。病原学及血清学数据证明H9N2禽流感病毒在候鸟内广泛流行,H9N2禽流感病毒可以感染包括纵纹腹小鸮、红隼、苍鹰和雉鸡多种野生鸟类,在小型多宿主生态系统中H9N2可以发生有效的种间传播。自2020年10月底以来,H5N8病毒中国中东部候鸟中引发疫情。本研究证实了H5N8对大天鹅、尤鼻天鹅等候鸟的感染,确定2020 HPAIV H5N8为2.3.4.4b谱系。抗原性分析发现,由于抗原漂移,当前家禽H5疫苗株对2020年HPAIV H5N8病毒保护力下降,病毒传入家禽并大面积流行的风险极大,需要及时更新家禽候选疫苗株,并进一步加强监测和实施预防措施。第二部分:候鸟禽流感病毒遗传进化分析。本研究进而对禽流感病毒各基因片段在天然宿主中的进化速率及基因片段溯源分析:基于不同时间点分离的病毒之间遗传差异和时间分布,采用贝叶斯MCMC方法,估算各个基因片段进化变异的总体速率并推断其最近共同祖先（t MRCA）的年代。重点关注亚洲和北美洲之间候鸟禽流感病毒的洲际联系:利用病原基因组序列信息构建系统发育树,结合候鸟迁徙数据,分析病毒基因片段转移的方向性,通过各基因片段的地理溯源来确定亚洲和北美洲之间候鸟禽流感病毒的洲际联系,确定可能的病毒引入途径,解析候鸟在大陆之间和大陆内部的禽流感病毒流通过程中发挥的作用。系统发育分析揭示部分亚型AIVs基因片段存在洲际间的沟通与传播。遗传变异分析发现中国东部候鸟AIVs基因片段遗传多样性丰富、不同亚型及不同鸟种间出现基因节段流通与传播。H3N8亚型禽流感病毒在候鸟中广泛流行,且基因型十分丰富,分离到的8株H3N8禽流感病毒可以分为7个基因型。H13、H3N8亚型内部基因节段存在洲际间的沟通与传播。系统发生及基因型分析研究发现H9N2禽流感病毒存在由家禽向野禽溢出的现象。对2020 HPAIV H5N8进行各基因节段溯源,结合系统发生地理学及候鸟迁徙路线证明了2020年中国候鸟中流行的H5N8禽流感病毒为新型重配毒株,随候鸟迁徙由哈萨克斯坦及俄罗斯引入我国,明确了新型重排H5N8流感病毒各基因片段的进化地位和起源,揭示了H5N8禽流感病毒株在欧亚大陆内的洲内传播及非洲-欧亚大陆的洲际间传播的现象。第三部分:候鸟禽流感病毒公共卫生风险评估。在遗传变异分析的基础上,我们开展候鸟禽流感病毒新型重配病毒受体结合特性及其在非天然宿主中的致病与传播能力评估。针对首次出现感染人的2020 HPAIV H5N8高致病性禽流感病毒,采用哺乳动物模型评估其在不同宿主上的致病性及传播能力,评估其公共卫生风险;针对由家禽溢出到野鸟的H9N2亚型禽流感病毒,我们结合病毒基因组变异分析,受体结合偏好性与哺乳动物致病性及传播能力分析,系统评估其公共卫生风险;针对在候鸟中广泛流行的多个基因型的H3N8亚型禽流感病毒,我们评估其受体结合能力,利用小鼠、豚鼠、雪貂等动物模型检测其在哺乳动物致病性及传播能力,分析研判H3N8亚型人群间传播的潜在风险。生物学特性评估发现H5N8禽流感病毒在人际间传播的风险仍然很低,此判断基于H5N8禽流感病毒偏好与禽类受体结合,而且在豚鼠中不具备传播能力的研究数据。尽管近来首次出现2020 HPAIV H5N8禽流感病毒感染人的状况,本研究证实H5N8禽流感病毒尚不具备在人际间流行的潜力,提示其产生的公共卫生威胁有限。由家禽溢出到候鸟的H9N2毒株结合人样受体后,可以在豚鼠及雪貂模型间通过直接接触及呼吸道飞沫途径进行高效传播,这些结果强调了H9N2亚型禽流感病毒存在能够引发人际间流行的潜在的公共卫生风险。受体结合检测证实H3N8毒株普遍具有结合人样受体的能力,在豚鼠模型中具备高效的接触传播及呼吸道飞沫传播能力。候鸟H3N8亚型禽流感病毒具有感染人类并在人群中传播的潜在风险。第四部分:候鸟源H3N8禽流感病毒在哺乳间传播的分子机制研究。在候鸟源H3N8禽流感病毒的哺乳间传播评估过程中,本研究发现T222毒株不能在雪貂模型中通过呼吸道飞沫传播,而T222豚鼠适应1代毒株可以经呼吸道飞沫传播。因此,我们选择传播能力差异明显但遗传背景相似的以上两株H3N8亚型禽流感病毒毒株,结合反向遗传学技术,构建了PB1-S524G突变质粒并拯救r T222-S524G突变体。采用体外聚合酶活性检测,我们证实PB1-S524G突变增强了病毒聚合酶活性。进一步利用小鼠、豚鼠和雪貂等动物模型,发掘决定H3N8亚型哺乳动物间传播的关键分子标记。本研究证实PB1-S524G突变可以赋予H3N8在雪貂间经呼吸道飞沫传播的能力。PB1-S524G突变增强了病毒体内外复制能力,提高病毒在小鼠及雪貂上呼吸道的病毒复制滴度,加剧了由病毒导致的雪貂肺脏的病理损伤。研究结果表明PB1-S524G是影响候鸟H3N8禽流感病毒在哺乳动物宿主上致病及传播能力的关键分子标记。以上研究结果提示我们应持续加强对候鸟禽流感病毒的监测及对公共卫生安全的威胁进行评估,进一步加强候鸟禽流感病毒跨物种传播的分子机制的研究,为禽流感防控提供理论依据。
薛静[2]（2021）在《重组冷适应H9N2亚型禽流感减毒活疫苗的免疫效力及安全评价》文中提出禽流感（Avian influenza,AI）是由禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）引起的,严重危害我国养鸡业发展和人类健康的一种重要疫病,其中H9N2亚型AI在我国呈地方流行性,具有重要的经济和公共卫生学意义。灭活疫苗的免疫是我国目前防控的主要措施之一,但存在抗原谱窄,诱导免疫类型单一等问题,难以应对抗原的快速变异,所以免疫的养殖场仍时有暴发疫情的现象。相比之下,冷适应减毒活疫苗易于接种,能快速诱导机体产生黏膜、细胞和体液免疫,且更为安全。本实验室前期研制了一株H9N2亚型重组冷适应疫苗候选株rTX-HA-NA,现进一步对其生物学特性及理化特性进行测定;同时对其安全性和免疫效力进行评价,为疫苗的进一步开发奠定理论基础。1重组冷适应H9N2亚型减毒活疫苗的遗传稳定性和理化特性评价首先对rTX-HA-NA进行了纯净性检测;接着将rTX-HA-NA分别在SPF鸡胚和SPF鸡上连续培养,检测其在体外和体内的遗传稳定性;最后将rTX-HA-NA经不同理化条件处理后,接种到鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblast,CEF）中,通过测定细胞半数感染量（50%tissue culture infective dose,TCID50）以及血凝试验（HA）结果的变化探究rTX-HA-NA的理化特性。结果表明疫苗株无细菌和支原体污染。疫苗株在鸡胚上连续传代基因未发生突变,未改变生物学特性以及冷适应表型;经SPF鸡连续传代后,疫苗株的病毒检出率的显着降低,无毒力返强风险。疫苗株和母本毒rTX均对高温、乙醚和氯仿高度敏感,而对于1%胰酶具有较强耐受性。pH3.0-9.0范围内rTX-HA-NA的HA变化不显着。2重组冷适应H9N2亚型减毒活疫苗的安全性评价将病毒通过滴鼻点眼方式接种SPF鸡和麻鸭,观察临床表现、局部反应和组织病理学变化,同时检测血液理化指标、病毒体内分布、环境传播及接触传播能力,系统评价冷适应疫苗株对靶标动物和非靶标动物的安全性。结果显示rTX-HA-NA接种SPF鸡后,血液的个别指标稍有变化,对增重、体温无影响;组织病理学观察及体内分布结果显示,肺脏充血出血,但较rTX组轻微,其他脏器病变不明显;喉头排毒率显着低于rTX组,泄殖腔不排毒;接触传播结果显示,rTX-HA-NA不发生接触传播;与母本毒相比,饲料、饮水、粪便拭子排毒率降低,对周围环境安全;rTX-HA-NA接种麻鸭后结果显示,疫苗株不引起非靶动物的临床表现,病理组织变化以及血液理化指标的改变。3重组冷适应H9N2亚型减毒活疫苗的效力评价本研究通过对rTX-HA-NA免疫SPF鸡后诱导的体液、细胞及黏膜免疫水平进行了评价。血清检测结果显示rTX-HA-NA免疫后1周的HI抗体达5.2 log2,免疫后5周达到峰值8.75 log2。细胞因子检测结果显示,免疫后3 d和5 d,rTX-HA-NA组的细胞因子表达水平均显着高于rTX。黏膜免疫结果显示rTX-HA-NA组鼻腔和气管黏膜诱导产生的IgA表达水平均高于灭活rTX组;而灭活rTX组免疫后7 d鼻腔和气管中IgG表达水平高于rTX-HA-NA组。免疫效力试验结果显示,攻击同源病毒TX,P1和P15的rTX-HA-NA提供喉头排毒保护率分别为80%和90%的,泄殖腔排毒保护率均为100%;灭活rTX组提供喉头排毒保护率为80%,泄殖腔排毒保护率为100%。攻击异源毒株YZ-C,rTX-HA-NA只能提供一定的交叉保护。
韩雯雯[3]（2021）在《H9N2禽流感病毒血凝素蛋白稳定性分析及其对疫苗免疫原性的影响》文中研究指明H9N2亚型禽流感病毒自1992年在我国首次分离以来,逐渐在我国广泛传播并呈地方流行性。疫苗免疫是预防H9N2亚型禽流感最主要的措施,表面糖蛋白血凝素（HA）是流感病毒主要的保护性抗原和疫苗的主要组成,在流感病毒感染过程中介导病毒入侵宿主细胞和病毒囊膜与细胞膜融合。近年来,H9N2亚型禽流感病毒在我国分离率上升,而且在炎热的夏季也能分离到,不同于以往的明显冬春季节分离率高的分布特点,可能跟病毒对热的稳定性增强有关。热稳定性和酸稳定性是流感病毒的重要生物学特性之一,对病毒的致病性、免疫原性、复制能力等都具有重要影响,但是目前这方面的研究较少。已经有研究尝试对HA蛋白进行修饰改变流感病毒疫苗株的HA稳定性和免疫原性。本研究挑选不同年代H9N2分离株,进行热稳定性和酸稳定性分析,并对影响毒株稳定性的关键区域和氨基酸位点及其对疫苗免疫原性的影响进行分析。1.H9N2亚型禽流感病毒分离株HA稳定性研究前期流行病学监测过程中发现,与以往毒株相比,H9N2亚型禽流感病毒分离株无明显季节性,夏季也可以分离到,分离株对热的稳定性增强。因此我们根据H9N2病毒的分离时间和遗传分布不同挑选了 17株病毒,测定其对热和酸的稳定性。17株病毒中有6株热稳定型、9株中等稳定型和2株热不稳定型的毒株,6株热稳定型毒株中有5株为2012年以后的毒株,而热不稳定性毒株均属于2012年以前毒株;毒株酸稳定性无明显时间分布特点,但是部分毒株酸稳定性和热稳定性一致,如热、酸均稳定的毒株有AH463、FJ1802和C1,均不稳的毒株有5F2和SQ68。根据实验结果挑选了 AH463和5F2为稳定性差异分析的模式病毒,分别构建它们的HA、NA质粒,并以前期构建的H9N2病毒AH320（6个内部基因）反向遗传平台为基础,分别单替换或双替换H A和NA基因,构建重组病毒。重组病毒稳定性实验结果表明病毒稳定性主要受HA基因影响。随后进一步构建AH320和5F2的HA1、HA2互换的嵌合型质粒pHA-AH320 HA1+5F2HA2、pHA-5F2HA1+AH320HA2,AH320 提供其余 7 个片段（PB2、PB1、PA、N A、NP、M、NS）,转染后拯救重组病毒。替换5F2 HA1后重组病毒的热稳定性和酸稳定性与5F2毒株一致,而替换HA2后稳定性与母本病毒AH320一致,说明影响病毒稳定性的主要基因区域为HA1。同时我们将5F2和AH463的HA1、HA2进行互换,构建成重组嵌合质粒 PHA-5F2HA1+AH463HA2、pHA-AH463HA1+5F2HA2,AH320 提供其余7个片段（PB2、PB1、PA、NA、NP、M、NS）构建重组病毒。稳定性实验结果进一步证明影响病毒热和酸稳定性的关键区域位于HA1。2.H9N2亚型禽流感病毒HA稳定性关键氨基酸位点分析及其对疫苗候选株免疫原性的影响为了探究影响病毒稳定的氨基酸位点,我们从NCBI下载了 2010以来所有H9N2的HA序列,用treesub软件绘制进化树,分析氨基酸变异;同时分析不同稳定性毒株的HA序列及其差异氨基酸位点。根据位点分析结果,最后挑选两种分析结果中HA1上氨基酸位点差异重合的6个位点（从稳定到不稳定）:L79S、A138V、Q156R、T163 I、K246R、D248N（H3计数）。在疫苗候选株AH463 HA质粒上分别引入上述6个位点的突变,与AH463 NA质粒、AH320 6个内部基因质粒转染后拯救点突变病毒,稳定性实验结果表明HA发生A138V点突变（rAH320-AH463-A138V）会降低原毒株的热稳定性和酸稳定性,其他点突变没有引起明显改变,说明138位氨基酸是影响病毒HA稳定性的关键氨基酸位点。A138V突变使AH463在CEF和MDCK的复制水平下降,并显着降低疫苗候选株AH463的免疫原性,免疫后1-3周,HI抗体水平下降4-7.5log2（16-180倍）。因此病毒HA稳定性改变对病毒免疫原性和复制能力会产生重要影响,但具体机制还需进一步探究。综上所述,本研究对不同年代H9N2亚型禽流感病毒分离株的热稳定性和酸稳定性进行分析,稳定性差异的影响主要是HA1,并且A138V突变是影响病毒稳定性的关键氨基酸位点,同时影响病毒在体外的复制水平以及疫苗的免疫原性。
赖锰熙[4]（2021）在《河北省禽流感流行株分离鉴定及香菇多糖抗病毒效果研究》文中指出本研究旨在对2019年河北省家禽养殖场禽流感病毒流行株进行分离鉴定,选择具有代表性的进行遗传进化分析,评价该病毒对小鼠的致病性与传播能力,并初步探究香菇多糖对感染该病毒小鼠的保护作用,为流感防控与健康养殖提供新思路。试验一:分离鉴定禽流感病毒。将采集到的病料通过鸡胚盲传、测序鉴定,分离获得H9N2病毒6株,H5N6病毒5株;选取A/chicken/Hebei/078/2019（H9N2）和A/chicken/Hebei/089/2019（H5N6）毒株开展后续试验。遗传进化分析结果显示,HB078的HA与NA基因遗传进化来源单一,属于Y280-like分支。HB 089的HA与NA基因遗传进化树分支均属于欧亚谱系,可能与貂同源,具有感染哺乳动物的风险。试验二:HB 078和HB 089对小鼠致病性的研究。通过滴鼻感染小鼠,监测小鼠体重变化与肺部病变等指标。结果显示感染HB 078禽流感病毒小鼠体重轻微下降后自行恢复,死亡率为0;而感染HB 089禽流感病毒小鼠在3 d时,体重剧烈下降,死亡率达100%,且对小鼠肺脏组织造成严重的病毒性急性肺损伤。试验三:HB 078和HB 089在豚鼠间传播风险的研究。用三传三的模式,将豚鼠分为直接接触传播组与间接接触传播组,建立流感病毒传播能力豚鼠动物模型。通过对豚鼠鼻洗液检测发现,HB 078和HB 089可以通过直接接触传播,效率为66.7%。试验四:用HB 078禽流感病毒小鼠模型来验证了香菇多糖对目前养殖场流行株的抑制作用。将BALB/c小鼠分为空白对照（BC）、阴性对照（NC）（病毒模型组）、阳性对照（PC）（磷酸奥司他韦组）、低、中、高剂量香菇多糖六个组,测取小鼠体重变化、肺指数与抑制率、肺炎性因子变化等数据。结果显示,中剂量香菇多糖可有效抑制HB 078禽流感病毒感染造成的小鼠体重减轻,在感染后第3天,小鼠肺组织中病毒载量极显着下降至103.0EID50/m L,P<0.01。在感染后第5天,肺指数显着下降至1.36±0.16,P<0.05,且肺指数抑制率提高至49.08%;肺组织中的INF-γ基因表达量极显着升高,TNF-α基因表达量极显着降低,P<0.01。综上所述,本研究结果表明:（1）河北省家禽养殖中场主要流行禽流感病毒亚型为H9N2与H5N6;两株具有代表性的禽流感病毒均能在实验室条件下不经适应直接感染小鼠与豚鼠,且HB 089株（H5N6）对小鼠致病性更强;两株病毒可通过直接接触在豚鼠间高效传播,但尚不具备空气传播能力;（2）香菇多糖主要通过降低小鼠肺部组织病毒载量,减轻肺部炎症,调节肺部组织细胞因子表达量,缓解小鼠对流感病毒特异性免疫功能的抑制,来保证机体抗病毒机制的功能,进而达到对感染禽流感病毒小鼠的保护作用。
石伟[5]（2021）在《辽宁省人感染H7N9禽流感病毒分子流行病学特征研究》文中研究表明目的:全面探究辽宁省人感染H7N9禽流感病毒分子流行病学特征,通过分析H7N9禽流感病毒全基因序列特征,为今后辽宁省人感染H7N9禽流感疫情的基因朔源提供参考依据,同时也为今后辽宁省H7N9禽流感防控提供分子流行病学数据参考,有助于丰富今后辽宁省人感染H7N9禽流感防控手段的多样化,以便为未来辽宁省人感染H7N9禽流感疫情防控提供科学依据。研究方法:首先对采取样本按照标准操作规程进行病毒核酸提取,使用荧光定量PCR检测已提取病毒核酸,CT≤37即样本阳性;病毒分离和全基因组测序由中国疾病预防控制中心流感实验室协助完成,使用MEGA-X中的DISTANCE计算各序列间的遗传距离。从GISAID中下载所需的H7N9禽流感病毒参考序列,使用MEGA-X中的ALIGNMENT对本研究病毒序列和参考序列进行序列比对,采用邻近连接法（Neighbor-Joining,NJ）方法构建系统发生树,通过N-糖基化预测软件Net NGlyc 1.0 Server对HA和NA氨基酸序列糖基化位点进行在线分析。结果:辽宁省人感染H7N9禽流感病毒两个表面基因核苷酸同源性在97.9%～100.0%,氨基酸同源性在98.7%～100.0%;内部基因核苷酸同源性在93.9%～100.0%,氨基酸同源性在95.7%～100.0%。病毒编码的所有基因与WHO推荐的疫苗株A/Hunan/02650/2016的同源性最高。H7N9禽流感病毒表面基因和内部基因进化树表现出不同的特点,HA和NA基因遗传进化树显示辽宁省所有毒株均与同期的长江三角洲地区（江苏、浙江）聚集在一起,均属于长江三角洲谱系,而内部基因的遗传进化树显示辽宁省毒株没有明显地域划分,分散在长江三角洲谱系和珠江三角洲谱系毒株之间;并且可发现辽宁省所有毒株基因在进化树上均分化出亚分支,且相较于疫情初期的毒株较远。辽宁省所有毒株HA蛋白上裂解位点338-339位点无连续多个氨基酸插入（KRTA）,属于低致病性禽流感病毒分子特征。所有毒株HA蛋白受体结合位点均发生S138A、G186V、Q226L、T221P突变,增强病毒倾向结合人受体能力。所有毒株在NA蛋白茎区69-73位出现“QISNT”氨基酸的缺失;在NA蛋白上并没有出现耐药位点突变,但是在M2蛋白上出现S31N突变,病毒对金刚烷胺类药物耐药。研究发现辽宁省所有毒株均在PB2蛋白上发生E627K的突变,引起哺乳动物适应性增强;还有部分毒株在其他基因编码蛋白也发生毒力增强相关位点的突变,这些突变均在不同程度上增强H7N9禽流感病毒的毒力和复制力。通过对HA和NA糖基化位点分析发现,HA蛋白上糖基化位点较以往H7N9禽流感病毒比较在数目和位置上并未发生改变,但是部分毒株在NA蛋白上糖基化位点较以往毒株在第42位发生氨基酸序列NCSH→NCTH突变。结论:2016年至2017年辽宁省发生的人感染H7N9禽流感毒株之间同源性较高,亲缘关系近;所有毒株均与WHO推荐的当年疫苗株A/Hunan/02650/2016同源性最高。2016年至2017年辽宁省发生的人感染H7N9禽流感毒株属于长江三角洲谱系。发现H7N9禽流感病毒随着流行周期推移,病毒在持续的进化中。2016年至2017年辽宁省发生人感染H7N9禽流感毒株不具备高致病性H7N9禽流感病毒分子特征,属于低致病性禽流感病毒（LPAI）。HA蛋白受体结合位点关键氨基酸变异,病毒具备禽和人双受体结合特性。病毒的复制性、毒力以及宿主适应性有所增强;辽宁省H7N9禽流感毒株对神经氨酸酶抑制剂敏感,但是表现出对金刚烷胺类药物耐药性。
葛杰,徐志远,李鑫,刘健,杨德全,鞠厚斌,葛菲菲[6]（2021）在《2019年上海地区H9N2禽流感病毒分子特征及演化分析》文中进行了进一步梳理为了解上海市活禽市场H9N2亚型禽流感病毒（AIV）分离株的遗传变异情况,本研究对2019年分离的4株H9N2 AIV的8个基因节段进行PCR扩增、克隆和测序,并对获得的8个基因序列进行同源性以及基因进化分析,对与病毒适应性增加的关键氨基酸位点进行了分析,并和目前我国使用的H9N2流感疫苗毒株HA上的抗原位点进行了比较。结果:4个分离株的HA基因仍然属于Y280/97,8个基因节段的重组模式属于G57;裂解位点均为PSRSSR/GLF,符合低致病性AIV的分子特征;这4株病毒存在多个与适应性增加相关的氨基酸突变。在已报道的33个抗原位点中,这4株病毒与我国目前使用的2种H9N2禽流感疫苗毒株（A/chicken/Shandong/6/96 （6/96）和A/chicken/Shanghai/F/98 （F/98））相比较,最大差异18个抗原位点。以上研究为H9N2亚型AIV的防控和疫苗研制提供了科学参考。
刘娇[7]（2020）在《不同来源PB2基因影响重组H5N6亚型禽流感病毒复制能力的分子机制研究》文中提出近年来,H5N6已逐渐取代H5N1成为我国主要流行的H5亚型高致病性禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）,且随着病毒的不断进化其基因组构成日趋复杂,部分流行株的6个内部基因甚至全部由S基因型H9N2（H9N2/S）病毒提供。而当前国内鸡群中占据优势的H9N2/S,相较于前期流行的H基因型（H9N2/H）,在分子进化上显着的变化特征是PB2和M基因由G1-like替代了 F/98-like,并且禽体内与人感染病例中均已经出现了内部基因完全来源于H9N2/S的新型重组H5N6/S、H7N9/S、H10N8/S等病毒。因此,研究G1-like与F/98-like进化谱系的PB2基因对H5N6/S病毒复制能力的影响及相关机制,将为进一步解析H9N2/S病毒作为新型重组流感病毒内部基因供体的分子机制提供重要参考。1.从病毒竞争性重配角度探究不同来源PB2基因对重组H5N6亚型AIV复制能力的影响为了从病毒竞争性重配角度评价G1-like与F/98-like PB2基因在H5N6亚型AIV复制中的作用,选取3株H5N6/S流行株MZ34、YB0597和JT131,利用反向遗传学技术在MZ34的8基因重组质粒基础上另外添加F/98-like来源的PB2和M质粒,即以MZ34（8）+F/98（PB2+M）的10质粒共转染细胞进行重组H5N6病毒的竞争性拯救;并对拯救病毒经3轮空斑纯化后PCR扩增PB2和M基因进行测序。同时,为排除来源于同一母本病毒的8质粒易于自我组合包装的可能干扰,又将MZ34的PB2和M质粒替换为YB0597或JT131来源再次进行测定。结果显示,从拯救的重组H5N6病毒PB2和M基因的构成情况来看,G1-like PB2基因在各1 0质粒转染组的数量上均占绝对优势,G1-like M基因仅在MZ34（8）+F/98（PB2+M）组占优势。同时,相较于F/98-like PB2基因,含G1-like PB2基因的重组H5N6亚型AIV在CEF、A549、MDCK细胞上均具有更强的复制能力。表明,相较于F/98-like,G1-like PB2基因在H5N6病毒重配中具有显着的竞争优势,增强了 H5N6亚型AIV复制能力。2.从聚合酶活性角度探究不同来源PB2基因影响重组H5N6亚型AIV复制能力的分子基础为从聚合酶活性角度探究具有优势作用的G1-like PB2基因对H5N6病毒复制能力的影响及相关分子基础,本章基于H5N6/S代表株MZ34与H9N2/H代表株SH14,分别将其PB2基因按结构域分布划分为连续的三段,构建结构域相互嵌合型PB2质粒,鉴定G1-like PB2基因影响聚合酶活性的关键结构域及氨基酸。结果显示,在MZ34-PB2基因上替换入SH14-PB2的N端结构域（aa:1-250）或将89位氨基酸由蛋氨酸（M）突变为缬氨酸（V）后,聚合酶活性均显着降低。同时,相较于MZ34母本毒,PB2-M89V突变病毒能显着降低PB2基因的mRNA、vRNA、cRNA合成能力与PB2、PB1、NP蛋白表达水平。表明,相较于F/98-like,G1-like PB2基因显着增强了 H5N6亚型AIV的聚合酶活性;其中,G1-like PB2基因的N端是发挥作用的关键结构域,89M是关键的氨基酸位点。3.从帽结合能力角度探究不同来源PB2基因影响H5N6亚型AIV复制能力的相关机制另一方面,为从帽结合能力角度探究具有优势作用的G1-like PB2基因对H5N6病毒复制能力的影响及相关机制,本章仍以MZ34、SH14毒株为研究对象,初步探究其体外表达的cap-binding结构域蛋白与m7GTP的帽结合能力差异,并通过比对G1-like与F/98-like PB2基因序列,统计分析影响帽结合能力差异的潜在氨基酸位点。结果显示,真核表达的MZ34cap与m7GTP的结合能力显着高于SH14cap,表明cap-binding 结构域的帽结合能力可能是G1-like 与 F/98-like PB2 基因影响 H5N6 亚型 AIV复制能力差异的潜在机制;另外,G1-like PB2基因的340R、389K、456N可能是增强帽结合能力的关键氨基酸位点,值得进一步研究。
庄青叶[8]（2020）在《基于氨基酸序列的甲型流感病毒多样性及进化分析》文中研究说明甲型流感病毒（influenza A virus,IAV）可引起人和多种动物感染发病。IAV的多样性和分布特征非常复杂,揭示IAV的多样性和分布特征有助于分析IAV疫情状况和风险,阐明IAV的流行规律,以及预测IAV疫情发展态势。十年前,IAV的多样性和分布特征曾被全面解析。但是近十年来,新增了数万株IAV的基因序列,同时有些IAV基因的旧序列已被修订。这些新增和修订的毒株可能代表了一些新的分支或亚分支。并且,近十年计算机运算能力也显着增强,为系统运算更多、更新、更准确的IAV序列提供了工具。鉴于上述背景,本研究旨在重新全景式地解析了IAV多样性和分布特征,以完善了人们对IAV多样性和分布特征的认识。在本研究中,将主要在禽、人、猪、马和犬群体中流行的IAV,分别命名为禽流感病毒（AIV）、人流感病毒（Hu IV）、猪流感病毒（SIV）、马流感病毒（EIV）、犬流感病毒（CIV）;本研究从流感病毒资源数据库中（Influenza Virus Resource）筛选了背景清晰的139872条IAV的氨基酸序列,作为分析原始材料;对不同亚型的HA和NA基因节段,以及IAV的6个内部基因节段（PB2、PB1、PA、NP、MP、NS）,逐个利用MEGA 7.0软件进行序列比对、遗传进化分析、谱系划分,对既往IAV多样性和分布特征的描述修订了200处以上,并对全景图进行了抽样检验与实例应用。主要结果如下:1.IAV整体分布特征解析对139872条IAV的氨基酸序列进行统计分析,结果表明:H1、H3、H5和H9亚型的序列显着多于其他亚型;H1N1、H1N2、H3N2、H5N1和H9N2亚型的序列显着多于其他组合亚型;禽、人、猪为IAV主要的感染宿主;AIV中H9N2和H5N1亚型较多;Hu IV主要是H1N1或H3N2亚型;SIV主要是H1N1、H1N2或H3N2亚型;EIV主要是H3N8或H7N7亚型;CIV主要是H3N8或H3N2亚型。IAV这些整体分布特征反映了IAV的流行情况,也反映了各个宿主中某些亚型的流行潜力,对IAV的流行病学分析与风险预测具有重要意义。2.IAV各基因节段全景式多样性分析对139872条IAV的氨基酸序列进行比对、系统进化分析和谱系划分,结果表明:H1亚型IAV分为H1.1和H1.2,它们又各进一步划分了4个二级分支,每个二级分支都有明显宿主、时间或地理特征,如H1.1b对应着来自南美洲的AIV,H1.2a对应1918年的Hu IV,H1.2c对应在全球流行多年的H1亚型SIV;类似地,对H2-H18等其余17个HA亚型也进行了全景式多样性和分布分析。N1亚型IAV分为N1.1-N1.3,有些分支进一步划分了二级、三级和四级分支和五级分支,每个亚分支都有明显宿主、时间或地理特征,如N1.1b对应流行于西半球的AIV、N1.1c2a对应近些年在东半球广泛流行的H5N1亚型HPAIV;类似地,对N2-N11等其余10个NA亚型也进行了全景式多样性和分布分析。PB2基因分为PB2.1-PB2.4,有些分支进一步划分了二级、三级和四级分支,每个二级、三级或四级分支都有明显宿主、时间或地理特征,如PB2.1b对应1990s在北美暴发的SIV、PB2.1d对应近些年出现的H3N2亚型CIV;类似地,对PB1、NP、PA、MP、NS等5个内部基因也进行了全景式的多样性和分布分析。上述结果对既往IAV的多样性和分布特征的描述进行了200处以上的修订,主要包括:（1）确定以前研究中因为序列错误而设置了S1.7、S1.8、S2.7、S3.8、S5.9、S5.10、h3.3和h5.3等IAV分支,本研究中均予以删除;（2）本研究全景性地揭示了IAV在近些年形成的一些新分支（如2013年在中国引起大量人感染和死亡的H7N9亚型AIV所形成的分支PB2.1b1等）;（3）本研究揭示了H1和H3亚型SIV存在更多的分支或亚分支;（4）本研究还从整体上进一步证实了前人研究中的相关结论,如大多数AIV的基因都是分为东、西两个半球的分支,但H3和H13亚型AIV、N2亚型AIV以及病毒的NS基因,并不能简单地根据西半球和东半球而划分为两个分支;（5）本研究从整体上揭示了IAV的流行特征,如在东半球流行的SIV很少在西半球流行,但是在西半球流行的SIV却能时常在东半球流行。3.全景图的抽样检验与实例应用本研究筛选部分有参考意义的IAV代表毒株序列对全景图进行抽样检验。结果表明,本研究中所选取的有一定参考意义的代表毒株所构建的进化树,与上述全景图的进化树趋势上完全一致,且大多数分支及亚分支都获得较高步值（bootstrap）的支持,表明本研究结果是可靠的。同时,于2018年,从我国11省（直辖市）67个场点,采集8914份样品,开展AIV流行病学调查。并对分离到的2273株AIV的NA基因进行序列测定和谱系进化分析,结果进一步验证了本研究更新修订的IAV多样性与分布特征全景图的实用性和可靠性。综上,本研究通过对更准确、更多和更新的IAV序列进行运算,进行了200处以上的修订以及实例检验,更全面地描述了IAV的多样性、分布特征和IAV最新演化情况,为全球科研人员和疫病防控人员开展各类IAV流行病学调查、流行特征分析、流行风险预警,提供了全面的框架和背景信息,因而对各类IAV的防控具有重要意义。此外,本研究提出一种新的适用于所有IAV基因/亚型的分支和亚分支的合理而简洁的命名系统,这有助于统一和简化人们对IAV的学术交流。
李云燕[9]（2020）在《广西野鸟源H9亚型禽流感病毒分离鉴定和全基因组测序分析及二重RT-LAMP检测方法的建立》文中指出禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）属于正粘病毒科,A型流感病毒属。H9亚型AIV感染通常会使家禽表现出产蛋量下降、生长缓慢及呼吸道症状,严重危害家禽产业的健康发展。该亚型病毒不仅能感染家禽和鸟类,也能直接感染人类,还能为新的感染人的重组病毒如H5N6、H7N9、和H10N8等提供部分或全部内部基因,严重危害人类公共卫生安全。广西地理位置特殊,加强该地区H9亚型AIV生态进化的研究对禽流感的有效防控具有重要意义为了解广西地区野鸟源H9亚型AIV遗传进化情况,本研究对2017-2019年间从不同活禽市场采集的斑鸠、鸽子和山鸡等野鸟咽喉和泄殖腔拭子进行病毒分离和纯化,用RT-PCR方法扩增分离株全基因并克隆测序,同时对测序结果进行遗传进化分析。结果表明成功分离鉴定出15株H9亚型AIV,均符合低致病性禽流感的分子特征,遗传进化分析发现其全基因来源较为复杂,一共出现3种不同的基因组合形式。为了建立快速检测不同亚型禽流感病毒方法,本研究利用环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）检测方法快速、敏感和成本低的优点,从NCBI下载不同HA和NA基因序列,利用Primer Explorer V5（http://primerexplorer.jp/lampv5e/）在线软件设计多对HA（H9和H5）和NA（N2）LAMP特异性引物,同时又设计了四组使用不同荧光标记的探针（HA-H9-探针和NA-N2-探针组合,HA-H9-探针和HA-H5-探针组合）,成功建立了快速检测H9和N2亚型AIV和区分H9、H5亚型AIV的二重荧光RT-LAMP检测方法。
陈照坤[10]（2020）在《H9N2禽流感病毒分子进化和致病性研究》文中研究指明H9N2亚型禽流感（AI）持续在我国鸡群中广泛流行,不仅可以感染禽类,还可以感染哺乳动物以及人类,为了明确山东及周边养殖场H9N2亚型禽流感病毒（AIV）的分子进化情况及其致病性,本研究在2016年2019年间从山东及周边养殖场病鸡、病鸭等分离鉴定出37株H9N2 AIV,经病毒纯化后,将病毒各基因片段进行RT-PCR扩增和克隆测序,获得各分离株全基因组序列,并进行遗传演化和重要的氨基酸位点的变异分析。结果显示:37株H9N2 AIV 8个基因片段均属于欧亚谱系,但8个基因片段的分子进化关系呈现出基因多样性:37株HA和NA基因来自Y280-like;HA基因之间的核苷酸同源性为92.2%99.9%,NA基因之间的核苷酸同源性为90.6%99.9%;M、NS基因来自G1-like;PA、NP、PB1基因来自F98-like;PB2基因来自G9-like。HA蛋白的受体结合位点149、198、234和235位点变异最多,37株分离株HA第234位氨基酸（相当于H3第226位氨基酸）全部由Q突变为L,235位点全部突变为M,32株分离株在HA蛋白218300位糖基化位点缺失,所有分离株均在313315位出现潜在的糖基化位点;仅3株分离株的NA蛋白399位出现糖基化位点,而在264位有13株分离株出现了新的潜在糖基化位点,所有分离株NA蛋白颈部的63-65位氨基酸缺失;6株分离株在PB2蛋白的627位点发生变异,1株在714位点发生变异。选取HA基因进化距离较远和核苷酸同源性差异较大的12株H9N2 AIV进行抗原性分析,结果发现H9N2 AIV之间的交叉HI和R值存在差异,部分毒株抗原性存在差异显着。以上结果表明,近四年山东周边地区流行的H9N2 AIV是由不同进化方式而来,部分重要氨基酸位点和抗原性发生变异,具有潜在感染哺乳动物的可能性,因此需加强H9N2 AIV的分离鉴定,密切监测其遗传变异。基于对HA基因进化树和核苷酸同源性的分析,选取HA基因进化树距离较远和核苷酸同源性差异较大的代表毒株进行生物学活性测定,研究不同年代分离株SPF鸡和BALB/c小鼠的感染性和致病性。结果显示2016年2019年间H9N2 AIV代表株对SPF鸡胚的适应性较好,EID50数值在106109.25之间;在MDCK细胞上测定的TCID50值在100.75109之间,差异比较显着;所有代表株都能在鸡体进行复制并排毒,但病毒滴度较低;21株代表毒株中19株病毒不经适应就能在小鼠肺脏进行复制,并且大部分毒株的病毒滴度较高并引起明显的病理损伤和体重下降。结果表明近四年H9N2 AIV分离株在哺乳动物细胞和体内的复制能力存在差异,且对小鼠肺脏的感染能力相对于鸡肺脏的感染能力呈现一定上升趋势。因此,应重视家禽中H9N2 AIV的监测及其对哺乳动物致病性的变化,为低致病性AIV跨物种感染哺乳动物提供预警。为解析H9N2 AIV对哺乳动物感染能力增强的分子机制,本试验通过以上持续流行病学调查,结合生物信息学技术,筛选可能增强AIV感染哺乳动物的关键HA氨基酸突变位点,进一步利用H9N2 AIV反向遗传平台进行HA基因点突变,构建突变病毒,测定其生物学特性并鉴定HA互作差异宿主蛋白。本研究成功构建9株突变病毒,其中突变株CK/SD/903（N313Q）、CK/SD/903（T198I）、CK/SD/903（M235Q）、CK/SD/903（M235R）的TCID50值较野毒株略有增加,H9N2 AIV缺失HA蛋白218位糖基化位点后降低其在哺乳动物细胞中的感染能力。野毒株CK/SD/903和突变株CK/SD/903（N218Q）的HA蛋白共有互作宿主蛋白有27个,这些蛋白主要参与Anti gene processing and presentation、Ribosome、Spliceosome等信号通路,差异互作蛋白参与Antigen processing and presentation、Protein processing in endoplasmic reticμLum、Pathogenic Escherichia coli infection等通路。结果表明,H9N2 AIV病毒HA蛋白218位糖基化、Thr198和Met235位点的某种氨基酸突变能够提高病毒在哺乳动物细胞上的增殖,HA蛋白218位糖基化位点可能通过影响病原感染、抗原提呈、病毒蛋白合成等过程增强病毒对哺乳动物细胞的感染性。本试验结果为H9N2 AIV适应哺乳动物并引起致病的研究提供新的视角,为进一步探索H9N2 AIV跨物种感染机制奠定基础。
二、流感病毒H9N2亚型毒株RNA_4节段基因序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、流感病毒H9N2亚型毒株RNA_4节段基因序列分析（论文提纲范文）
（1）候鸟禽流感病毒遗传变异规律分析及在哺乳动物间传播机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 流感病毒病原学 |
| 1.1 流感病毒概述 |
| 1.2 流感病毒病原生态学特点 |
| 第二章 流感病毒受体 |
| 2.1 流感病毒受体概述 |
| 2.2 唾液酸的结构及种类 |
| 2.3 不同动物唾液酸受体的异质性 |
| 2.4 不同物种间流感病毒唾液酸受体的分布 |
| 2.5 病毒结合不同唾液酸受体的分子机制 |
| 2.6 流感病毒唾液酸受体研究方法 |
| 第三章 禽流感病毒跨种传播 |
| 3.1 禽流感病毒跨种传播的发生 |
| 3.2 影响禽流感病毒跨种传播的病原因素-基因突变 |
| 3.3 影响禽流感病毒跨种传播的病原因素-基因重组 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 中国东部地区候鸟禽流感流行病学调查研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验用鸡胚和细胞 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 样品采集 |
| 1.1.5 禽流感病毒分离 |
| 1.1.6 禽流感病毒RNA的提取 |
| 1.1.7 禽流感病毒高通量测序 |
| 1.1.8 候鸟禽流感病毒抗体检测 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 样品采集及毒株分离情况 |
| 1.2.2 候鸟AIVs亚型多样性和宿主特异性 |
| 1.2.3 H9N2 禽流感病毒在候鸟中流行的血清学调查 |
| 1.2.4 2020 年候鸟H5N8 禽流感病毒检测及抗原性分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 中国东部候鸟禽流感病毒遗传进化分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验用毒株 |
| 2.1.2 候鸟源禽流感病毒基因组收集及比对 |
| 2.1.3 系统发生分析 |
| 2.1.4 进化动力学的空间系统发育重建 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 候鸟源禽流感病毒遗传变异分析 |
| 2.2.2 候鸟源H9N2 禽流感病毒遗传进化分析 |
| 2.2.3 候鸟源H3N8 禽流感病毒遗传进化分析 |
| 2.2.4 候鸟源H13 亚型禽流感病毒遗传变异分析 |
| 2.2.5 候鸟源H5N8 禽流感病毒遗传变异分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 中国东部候鸟禽流感病毒分离株受体结合特性研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验用毒株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 红细胞法检测禽流感病毒受体 |
| 3.1.5 糖芯片法检测禽流感病毒受体 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 候鸟禽流感病毒红细胞法受体测定 |
| 3.2.2 候鸟禽流感病毒糖芯片法受体测定 |
| 3.2.3 候鸟禽流感病毒结合聚糖结构分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 候鸟禽流感病毒在哺乳动物间跨种传播能力评估 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验用毒株 |
| 4.1.2 实验用动物 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 小鼠致病性实验 |
| 4.1.6 豚鼠间传播实验 |
| 4.1.7 雪貂间呼吸道飞沫传播实验 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 候鸟H9N2 亚型禽流感病毒小鼠致病性 |
| 4.2.2 候鸟H9N2 亚型禽流感病毒豚鼠间传播 |
| 4.2.3 候鸟H9N2 亚型禽流感病毒雪貂间传播 |
| 4.2.4 候鸟H5N8 禽流感病毒小鼠致病性 |
| 4.2.5 候鸟H5N8 禽流感病毒豚鼠间传播 |
| 4.2.6 候鸟H3 亚型禽流感病毒豚鼠间传播 |
| 4.2.7 候鸟T222 分离株及豚鼠适应一代毒株雪貂间呼吸道飞沫传播 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 候鸟源H3N8 禽流感病毒在哺乳间传播的分子机制研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验用毒株、细胞及载体 |
| 5.1.2 实验用动物 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.1.5 候鸟源H3N8 流感病毒野毒株RNA提取 |
| 5.1.6 候鸟源H3N8 流感病毒野毒株c DNA制备 |
| 5.1.7 候鸟源H3N8 流感病毒野毒株全基因组及载体扩增 |
| 5.1.8 候鸟源H3N8 流感病毒野毒株感染性克隆的构建 |
| 5.1.9 候鸟源H3N8 禽流感病毒及其突变株的体外拯救 |
| 5.1.10 流感病毒聚合酶活性检测 |
| 5.1.11 病毒滴定和复制动力学测定 |
| 5.1.12 动物实验 |
| 5.1.13 雪貂适应1 代毒株测序 |
| 5.1.14 雪貂适应1 代毒及受体结合能力检测 |
| 5.1.15 病理及组化 |
| 5.1.16 统计分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 T222 毒株及T222-G1 毒株氨基酸差异比对 |
| 5.2.2 rT222-wild及 rT222-S524G突变株拯救 |
| 5.2.3 rT222-wild及 rT222-S524G豚鼠间传播 |
| 5.2.4 rT222-wild及 rT222-S524G雪貂间呼吸道飞沫传播 |
| 5.2.5 rT222-wild及 rT222-S524G雪貂间传播变异分析 |
| 5.2.6 雪貂适应1 代毒株受体结合检测 |
| 5.2.7 PB1-S524G增强了病毒聚合酶活性 |
| 5.2.8 PB1-S524G增强了H3N8 禽流感病毒的体外复制能力 |
| 5.2.9 PB1-S524G增强了H3N8 禽流感病毒的体内复制能力 |
| 5.2.10 PB1-S524G增强了H3N8 禽流感病毒对小鼠的致病性 |
| 5.2.11 PB1-S524G增加了H3N8 禽流感病毒对雪貂的致病性 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）重组冷适应H9N2亚型禽流感减毒活疫苗的免疫效力及安全评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述: H9N2亚型AIV疫苗研究进展及生物安全评价 |
| 1 H9N2亚型禽流感病毒的致病性研究 |
| 2 H9N2亚型AIV疫苗研究进展 |
| 3 疫苗生物安全评价 |
| 4 本研究的目的意义 |
| 参考文献 |
| 第一章 重组冷适应H9N2亚型减毒活疫苗的遗传稳定性和理化特性评价 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 重组冷适应H9N2亚型减毒活疫苗的安全评价 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 重组冷适应H9N2亚型减毒活疫苗的效力评价 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（3）H9N2禽流感病毒血凝素蛋白稳定性分析及其对疫苗免疫原性的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述 |
| 1. H9N2亚型禽流感流行现状 |
| 2. 血凝素蛋白(HA)结构 |
| 3. HA蛋白功能 |
| 4. HA稳定性 |
| 5. HA稳定性对病毒生物学特性的影响 |
| 5.1 影响病毒侵染活性 |
| 5.2 影响病毒复制能力 |
| 5.3 影响病毒宿主范围 |
| 5.4 对致病性的影响 |
| 5.5 病毒气溶胶传播 |
| 6. HA稳定性与流感疫苗设计研究 |
| 7. 研究目的及意义 |
| 第一章 H9N2亚型禽流感病毒分离株HA稳定性研究 |
| 1. 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 细胞及载体 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 SPF鸡红细胞 |
| 1.5 实验试剂的配制 |
| 1.6 实验设备及器材 |
| 1.7 生物学软件的使用 |
| 2. 方法 |
| 2.1 血凝实验(Hemagglutinination,HA) |
| 2.2 TCID_(50)的测定 |
| 2.3 热稳定性试验 |
| 2.4 酸稳定性试验 |
| 2.5 重组病毒的构建 |
| 3. 结果 |
| 3.1 H9N2亚型禽流感病毒稳定性测定结果 |
| 3.2 重组病毒的拯救及其稳定性测定 |
| 3.3 HA1/HA2重组嵌合病毒的构建和稳定性测定 |
| 4. 讨论 |
| 第二章 H9N2亚型禽流感病毒稳定性关键氨基酸位点分析及其对疫苗候选株免疫原性的影响 |
| 1. 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 SPF鸡胚、SPF鸡及鸡红细胞 |
| 1.3 质粒及细胞 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 实验设备及器材 |
| 1.6 分子生物学软件 |
| 2. 方法 |
| 2.1 拯救病毒 |
| 2.2 病毒生物学特性的测定 |
| 2.3 灭活苗制备 |
| 2.4 免疫原性实验 |
| 2.5 ELISA法测定流感病毒受体结合特性 |
| 3. 结果 |
| 3.1 HA基因序列分析 |
| 3.2 质粒的构建及病毒的拯救 |
| 3.3 点突变毒株基本生物学特性的测定 |
| 3.4 点突变病毒稳定性测定 |
| 3.5 A138V突变对H9N2病毒体外复制能力的影响 |
| 3.6 A138V突变对H9N2病毒受体结合特性的影响 |
| 3.7 A138V突变降低疫苗候选株AH463的免疫原性 |
| 4. 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文 |
| 附录 |
| 致谢 |
（4）河北省禽流感流行株分离鉴定及香菇多糖抗病毒效果研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 禽流感的研究进展 |
| 1.1 流感病毒简介 |
| 1.2 禽流感病毒的结构与功能 |
| 2 H9N2 亚型AIV的概述 |
| 3 H5N6 亚型AIV的概述 |
| 4 禽流感病毒的传播与流行 |
| 5 细胞因子在AIV感染中的免疫调节作用 |
| 5.1 肿瘤坏死因子 |
| 5.2 白细胞介素 |
| 5.3 干扰素 |
| 6 香菇多糖的研究进展 |
| 第二章 研究目的、意义、内容与技术路线 |
| 1 研究目的与意义 |
| 2 研究内容与技术路线 |
| 2.1 研究内容 |
| 2.2 技术路线 |
| 第三章 试验研究内容 |
| 试验一:禽流感病毒的分离鉴定与遗传进化分析 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 病料与试验地点 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.4.1 流感病毒分离鉴定 |
| 1.4.1.1 病料处理 |
| 1.4.1.2 病毒分离纯化及血凝效价(HA效价)鉴定 |
| 1.4.1.3 流感病毒鸡胚半数感染量(50%embryo infectious dose,EID_(50))测定 |
| 1.4.1.4 提取病毒基因组RNA |
| 1.4.1.5 病毒基因组的c DNA合成 |
| 1.4.2 流感病毒的同源性及遗传进化分析 |
| 1.4.2.1 流感病毒的同源性分析 |
| 1.4.2.2 流感病毒的遗传进化分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 流感病毒的分离鉴定结果 |
| 2.1.1 流感病毒的同源性 |
| 2.2 流感病毒的遗传进化分析 |
| 2.2.1 H9N2 亚型AIV遗传进化分析 |
| 2.2.2 H5N6 亚型AIV遗传进化分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 试验二:禽流感病毒对小鼠致病性的研究 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 毒株及实验动物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 病毒稀释 |
| 1.2.2 小鼠体重变化与存活率 |
| 1.2.3 流感病毒在小鼠不同组织中的分布 |
| 1.2.4 小鼠肺脏病变 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 小鼠感染情况、体重变化及存活率 |
| 2.2 禽流感病毒在小鼠脏器组织中的分布 |
| 2.2.1 H9N2 亚型禽流感病毒在小鼠脏器中的分布 |
| 2.2.2 H5N6 亚型禽流感病毒在小鼠脏器中的分布 |
| 2.3 流感病毒对小鼠肺脏的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 试验三:禽流感病毒在豚鼠间传播能力的研究 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 毒株及实验动物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 病毒稀释 |
| 1.2.2 试验设计 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 病毒稀释 |
| 1.3.2 两株流感病毒在豚鼠间传播能力的研究 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 禽流感病毒在豚鼠间直接接触传播的能力 |
| 2.2 禽流感病毒在豚鼠间间接接触传播的能力 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 试验四:香菇多糖对感染禽流感病毒小鼠的保护作用 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 毒株、实验动物及试剂 |
| 1.2 试验设计 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 病毒稀释 |
| 1.3.2 小鼠体重变化与存活率 |
| 1.3.3 用药后对小鼠机体的影响 |
| 1.3.4 小鼠肺指数与抑制率 |
| 1.3.5 香菇多糖对感染H9N2 亚型禽流感病毒小鼠肺部炎性因子的影响 |
| 1.4 分子生物分析软件及统计学方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 小鼠体重变化 |
| 2.2 香菇多糖对感染H9N2 亚型禽流感病毒小鼠肺部的保护作用 |
| 2.2.1 香菇多糖对感染H9N2 亚型禽流感病毒小鼠肺指数与肺指数抑制率的影响 |
| 2.2.2 香菇多糖对感染H9N2 亚型禽流感病毒小鼠肺组织中病毒载量的影响 |
| 2.3 香菇多糖对感染流感病毒小鼠肺部炎性因子的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1 A/chicken/Hebei/078/2019(H9N2)HA基因 |
| 2 A/chicken/Hebei/078/2019(H9N2)NA基因 |
| 3 A/chicken/Hebei/089/2019(H5N6)HA基因 |
| 4 A/chicken/Hebei/089/2019(H5N6)NA基因 |
（5）辽宁省人感染H7N9禽流感病毒分子流行病学特征研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 仪器与设备 |
| 2.3 试剂与材料 |
| 2.4 方法 |
| 2.4.1 H7N9 禽流感病毒的核酸提取 |
| 2.4.2 H7N9 禽流感病毒的核酸检测 |
| 2.4.3 H7N9 禽流感病毒的分离测序 |
| 2.4.4 遗传进化分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 毒株分离和测序结果 |
| 3.2 毒株基本信息 |
| 3.3 同源性分析 |
| 3.3.1 HA和NA基因同源性分析 |
| 3.3.2 内部基因同源性分析 |
| 3.4 H7N9 禽流感病毒遗传进化分析 |
| 3.5 氨基酸位点变异分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 遗传进化分析 |
| 4.2 氨基酸变异位点分析 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 人感染H7N9禽流感病毒研究进展 |
| 参考文献 |
| 社会实践 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（6）2019年上海地区H9N2禽流感病毒分子特征及演化分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒株 |
| 1.2 SPF鸡胚及主要试剂 |
| 1.3 8个基因的扩增及序列分析 |
| 1.4 序列分析比较 |
| 2 结果 |
| 2.1 全基因组同源性分析 |
| 2.2 8个基因遗传演化分析 |
| 2.3 4株H9N2禽流感病毒适应性增强的分子特征分析 |
| 2.4 H9N2流感病毒与目前使用的疫苗株同源性比较 |
| 3 讨论 |
（7）不同来源PB2基因影响重组H5N6亚型禽流感病毒复制能力的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述 H5N6亚型禽流感病毒在我国的进化及PB2蛋白影响病毒复制能力的研究进展 |
| 1. H5N6亚型AIV的出现与流行 |
| 2. PB2蛋白影响AIV复制能力的研究进展 |
| 3.研究目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第一章 从病毒竞争性重配角度探究不同来源PB2基因对重组H5N6亚型AIV复制能力的影响 |
| 引言 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 从聚合酶活性角度探究不同来源PB2基因影响重组H5N6亚型AIV复制能力的分子基础 |
| 引言 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 从帽结合能力角度探究不同来源PB2基因影响H5N6亚型AIV复制能力的相关机制 |
| 引言 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（8）基于氨基酸序列的甲型流感病毒多样性及进化分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词(Abbreviation) |
| 1 文献综述 |
| 1.1 甲型流感病毒感染的流行与危害 |
| 1.2 甲型流感病毒的基因组结构与功能 |
| 1.3 甲型流感病毒的命名和分类 |
| 1.3.1 甲型流感病毒的命名 |
| 1.3.2 甲型流感病毒的亚型 |
| 1.3.3 甲型流感病毒谱系/分支的命名 |
| 1.3.4 甲型流感病毒的分类 |
| 1.3.4.1 禽流感病毒 |
| 1.3.4.2 人流感病毒 |
| 1.3.4.3 猪流感病毒 |
| 1.3.4.4 马流感病毒 |
| 1.3.4.5 犬流感病毒 |
| 1.4 甲型流感病毒的进化 |
| 1.4.1 抗原漂移 |
| 1.4.2 抗原转变 |
| 1.4.3 遗传进化分析常用的技术及软件 |
| 1.4.4 甲型流感病毒的全景图分析 |
| 1.5 甲型流感病毒的防控现状 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 2 甲型流感病毒的分布研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 数据的收集与整理 |
| 2.2.2.1 流感病毒相关数据库 |
| 2.2.2.2 数据的下载和整理 |
| 2.2.3 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 IAV氨基酸序列的基本分布情况 |
| 2.3.2 HA基因的宿主分布 |
| 2.3.3 NA基因的氨基酸序列的宿主分布 |
| 2.3.4 HA基因的时间分布特征 |
| 2.3.5 NA基因序列的HA基因亚型分布 |
| 2.3.6 流感数据库的比较 |
| 2.3.6.1 Influenza Virus Resource和IRD数据库的比较 |
| 2.3.6.2 NCBI Influenza Virus Resource与GISAID数据库的比较 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 可用序列数据剧增 |
| 2.4.2 流行亚型的时空特点明显 |
| 2.4.3 感染宿主谱的倾向性明显 |
| 2.4.4 不同流感数据库各有特点 |
| 2.5 结论 |
| 3 甲型流感病毒的进化多样性分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 序列的选择和下载 |
| 3.3.2 进化树分析 |
| 3.3.3 分支和亚分支的注释 |
| 3.3.4 代表毒株的选择 |
| 3.3.5 GISAID独有数据库的验证 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 HA基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.1.1 H1亚型IAV的HA基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.1.2 H2亚型IAV的HA基因氨基酸序列的进化多样性及分布分析 |
| 3.4.1.3 H3亚型IAV的HA基因氨基酸序列的进化多样性及分布分析 |
| 3.4.1.4 H4亚型IAV的HA基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.1.5 H7和H15亚型IAV的HA基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.1.6 H9亚型IAV的HA基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.1.7 H5-H6、H8、H10-H12、H14和H16亚型IAV的HA基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.1.8 H13亚型IAV的HA基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.1.9 H17和H18亚型IAV的HA基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.2 NA基因序列氨基酸进化多样性及分布分析 |
| 3.4.2.1 N1亚型IAV的NA基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.2.2 N2亚型IAV的NA基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.2.3 N4-N6亚型IAV的NA基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.2.4 N3和N9亚型IAV的NA基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.2.5 N7和N8亚型IAV的NA基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.2.6 N10和N11亚型IAV的NA基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.3 内部基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.3.1 PB2基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.3.2 PB1基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.3.3 PA基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.3.4 NP基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.3.5 MP基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.3.6 NS基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.4 数据库的相关探索 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 全景图更新的必要性及意义 |
| 3.5.2 IAV的氨基酸序列与流行特征的相关性分析 |
| 3.5.3 数据库的相关探索 |
| 3.5.4 序列分析之前的前处理 |
| 3.5.5 IAV全景图研究的可靠性 |
| 3.5.6 IAV进化树全景图中分支和亚分支的命名 |
| 3.6 结论 |
| 4 甲型流感病毒全景图的抽样检验与实例应用 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.1.1 样品的采集 |
| 4.2.1.2 主要试剂和仪器等 |
| 4.2.1.3 主要溶液的配制方法 |
| 4.2.1.4 引物设计与合成 |
| 4.2.1.5 数据库及软件等 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.2.2.1 IAV全景图的抽样检验 |
| 4.2.2.2 2018年我国AIV毒株NA亚型的监测 |
| 4.2.2.2.1 病毒的分离 |
| 4.2.2.2.2 血凝试验 |
| 4.2.2.2.3 病毒RNA提取 |
| 4.2.2.2.4 一步法RT-PCR扩增AIV的 NA基因 |
| 4.2.2.2.5 RT-PCR产物实时毛细电泳 |
| 4.2.2.2.6 核苷酸序列测定及分析 |
| 4.2.2.2.7 分离毒株NA基因的分子进化分析 |
| 4.2.2.3 不同构建方法所构建进化树的比较及验证 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 基于IAV代表序列的全景图抽样检验 |
| 4.3.1.1 基于HA基因代表序列的H1亚型IAV抽样检验 |
| 4.3.1.2 基于HA基因代表序列的H3亚型IAV抽样检验 |
| 4.3.1.3 基于HA基因代表序列的H4和H14亚型IAV抽样检验 |
| 4.3.1.4 基于HA基因代表序列的H11亚型IAV抽样检验 |
| 4.3.1.5 基于HA基因代表序列的H2、H5和H6亚型IAV抽样检验 |
| 4.3.1.6 基于HA基因代表序列的H7、H10和H15亚型IAV抽样检验 |
| 4.3.1.7 基于HA基因代表序列的H8、H9和H12亚型IAV抽样检验 |
| 4.3.1.8 基于HA基因代表序列的H13和H16亚型IAV抽样检验 |
| 4.3.1.9 基于NA基因代表序列的N1亚型IAV抽样检验 |
| 4.3.1.10 基于NA基因代表序列的N2亚型IAV抽样检验 |
| 4.3.1.11 基于NA基因代表序列的N3和N4亚型IAV抽样检验 |
| 4.3.1.12 基于NA基因代表序列的N5和N8亚型IAV抽样检验 |
| 4.3.1.13 基于NA基因代表序列的N6、N7和N9亚型IAV抽样检验 |
| 4.3.1.14 基于PB2基因代表序列的IAV抽样检验 |
| 4.3.1.15 基于PB1基因代表序列的IAV抽样检验 |
| 4.3.1.16 基于PA基因代表序列的IAV抽样检验 |
| 4.3.1.17 基于MP基因代表序列的IAV抽样检验 |
| 4.3.1.18 基于NP基因代表序列的IAV抽样检验 |
| 4.3.1.19 基于NS基因代表序列的IAV抽样检验 |
| 4.3.2 2018 年我国AIV的 NA亚型监测对IAV全景图的验证 |
| 4.3.2.1 NA基因RT-PCR扩增结果 |
| 4.3.2.2 测序结果及遗传进化分析 |
| 4.3.2.2.1 2018年所分离的N1亚型AIV分子进化分析 |
| 4.3.2.2.2 2018年所分离的N2亚型AIV分子进化分析 |
| 4.3.2.2.3 2018年所分离的N3和N4亚型AIV分子进化分析 |
| 4.3.2.2.4 2018年所分离的N6亚型AIV分子进化分析 |
| 4.3.2.2.5 2018年所分离的N8亚型AIV分子进化分析 |
| 4.3.3 不同构建方法所构建进化树的比较及验证 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 IAV全景图的抽样检验 |
| 4.4.2 2018年我国AIV的NA亚型监测对IAV全景图的验证 |
| 4.4.3 不同构建方法所构建进化树的比较及验证 |
| 4.5 结论 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| References |
| 附录 |
| 攻读学位期间主要成果 |
| 致谢 |
（9）广西野鸟源H9亚型禽流感病毒分离鉴定和全基因组测序分析及二重RT-LAMP检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 A型流感病毒简介 |
| 1.2 禽流感病毒病原学特征 |
| 1.2.1 病毒形态结构 |
| 1.2.2 禽流感基因编码的蛋白及其功能 |
| 1.2.3 禽流感病毒的抗原漂移和抗原转变 |
| 1.3 H9N2亚型禽流感病毒 |
| 1.3.1 H9N2亚型禽流感病毒在中国的爆发和流行 |
| 1.3.2 H9N2亚型禽流感病毒诊断技术 |
| 1.4 环介导等温核酸扩增检测技术(LAMP)研究进展 |
| 1.4.1 LAMP技术基本原理 |
| 1.4.2 可视化LAMP技术 |
| 1.4.3 与其它技术相结合的LAMP技术 |
| 1.5 本课题研究的意义 |
| 第二章 广西野鸟源H9亚型禽流感病毒的分离鉴定和生物学特性研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品 |
| 2.1.2 主要试剂与仪器 |
| 2.1.3 鸡胚与标准血清 |
| 2.1.4 实验动物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒分离 |
| 2.2.2 病毒鉴定 |
| 2.2.3 分离株生物学特性测定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 病毒分离鉴定 |
| 2.3.2 分离株HA和NA基因型鉴定及标准命名 |
| 2.3.3 分离株生物学特性 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 15株广西野鸟源H9N2亚型禽流感病毒分离株全基因组序列测定及遗传进化分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 分离株RT-PCR全基因组扩增 |
| 3.2.2 RT-PCR扩增产物胶回收与连接转化 |
| 3.2.3 阳性菌液的鉴定与测序 |
| 3.2.4 测序结果分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 扩增及序列测定结果 |
| 3.3.2 遗传进化分析结果 |
| 3.3.3 15株野鸟源H9N2亚型AIV分离株基因分型 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 H9和N2 亚型禽流感病毒二重荧光RT-LAMP检测方法的建立 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 毒株 |
| 4.1.2 主要试剂与仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 引物设计 |
| 4.2.2 标准品的制备 |
| 4.2.3 反应体系的优化 |
| 4.2.4 特异性试验 |
| 4.2.5 干扰性试验 |
| 4.2.6 敏感性试验 |
| 4.2.7 临床样品检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 反应体系 |
| 4.3.2 结果观察 |
| 4.3.3 特异性试验 |
| 4.3.4 干扰性试验 |
| 4.3.5 敏感性试验 |
| 4.3.6 临床样品检测结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 H9和H5 亚型禽流感病毒二重荧光RT-LAMP检测方法的建立 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 毒株 |
| 5.1.2 主要试剂与仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 引物设计 |
| 5.2.2 标准品的制备 |
| 5.2.3 反应体系的优化 |
| 5.2.4 特异性试验 |
| 5.2.5 干扰性试验 |
| 5.2.6 敏感性试验 |
| 5.2.7 临床样品检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 反应体系 |
| 5.3.2 结果观察 |
| 5.3.3 特异性试验 |
| 5.3.4 干扰性试验 |
| 5.3.5 敏感性试验 |
| 5.3.6 临床样品检测结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间科研成果 |
（10）H9N2禽流感病毒分子进化和致病性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 禽流感病毒概述 |
| 1.1 流感病毒特点与分类 |
| 1.2 流感病毒的流行史 |
| 1.3 主要蛋白 |
| 2 流感病毒受体 |
| 3 H9N2 AIV突变及致病性 |
| 4 分子模拟技术在流感病毒突变研究中的应用 |
| 5 研究目的和意义 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第一章 H9N2 亚型AIV的全基因组测序、遗传进化与抗原变异分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 引物设计 |
| 1.3 H9N2 亚型AIV的鉴定 |
| 1.4 病毒的纯化 |
| 1.5 提取病毒RNA |
| 1.6 PCR产物胶回收 |
| 1.7 连接与转化 |
| 1.8 菌液PCR鉴定 |
| 1.9 序列分析 |
| 1.10 H9N2 AIV抗原性分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 病毒的分离与鉴定 |
| 2.2 序列测序结果 |
| 2.3 抗原性分析结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 H9N2 亚型AIV的致病性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 H9N2 AIV的生物学测定 |
| 1.3 H9N2 AIV感染SPF鸡的研究 |
| 1.4 H9N2 AIV感染BALB/c雌鼠的研究 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 鸡胚半数感染量(EID50)测定结果 |
| 2.2 组织半数感染量(TCID50)测定 |
| 2.3 H9N2 AIV感染SPF鸡的研究 |
| 2.4 H9N2 AIV感染BALB/c雌鼠的研究 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 HA关键突变位点预测与HA差异互作宿主蛋白筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 受体结合位点关键氨基酸突变位点预测 |
| 1.3 突变质粒的构建 |
| 1.4 突变病毒的拯救及鉴定 |
| 1.5 突变毒株TCID50测定 |
| 1.6 突变毒株复制动力学 |
| 1.7 H9N2 AIV变异HA蛋白差异互作宿主蛋白筛选 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 HA受体结合位点关键氨基酸突变位点预测结果 |
| 2.2 突变毒株拯救结果 |
| 2.3 突变毒株TCID50测定结果 |
| 2.4 突变株CK/SD/903(N218Q)复制动力学 |
| 2.5 H9N2 AIV变异HA蛋白互作宿主差异蛋白鉴定结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论着 |
| 附录 |
| 参与课题情况 |
四、流感病毒H9N2亚型毒株RNA_4节段基因序列分析（论文参考文献）
- [1]候鸟禽流感病毒遗传变异规律分析及在哺乳动物间传播机制研究[D]. 张醒海. 吉林大学, 2021
- [2]重组冷适应H9N2亚型禽流感减毒活疫苗的免疫效力及安全评价[D]. 薛静. 扬州大学, 2021(02)
- [3]H9N2禽流感病毒血凝素蛋白稳定性分析及其对疫苗免疫原性的影响[D]. 韩雯雯. 扬州大学, 2021(02)
- [4]河北省禽流感流行株分离鉴定及香菇多糖抗病毒效果研究[D]. 赖锰熙. 西南科技大学, 2021(08)
- [5]辽宁省人感染H7N9禽流感病毒分子流行病学特征研究[D]. 石伟. 中国医科大学, 2021(02)
- [6]2019年上海地区H9N2禽流感病毒分子特征及演化分析[J]. 葛杰,徐志远,李鑫,刘健,杨德全,鞠厚斌,葛菲菲. 畜牧与兽医, 2021(01)
- [7]不同来源PB2基因影响重组H5N6亚型禽流感病毒复制能力的分子机制研究[D]. 刘娇. 扬州大学, 2020
- [8]基于氨基酸序列的甲型流感病毒多样性及进化分析[D]. 庄青叶. 华中农业大学, 2020
- [9]广西野鸟源H9亚型禽流感病毒分离鉴定和全基因组测序分析及二重RT-LAMP检测方法的建立[D]. 李云燕. 广西大学, 2020(02)
- [10]H9N2禽流感病毒分子进化和致病性研究[D]. 陈照坤. 山东师范大学, 2020(08)