一、睾丸免疫的研究进展（论文文献综述）
杨喆[1]（2021）在《多聚嘧啶束结合蛋白1对小鼠血睾屏障完整性和支持细胞自噬的影响》文中提出目的:睾丸支持细胞（Sertoli cells,SCs）是构成生精小管管壁结构的重要组成之一,其参与形成的血睾屏障(Blood-testis barrier,BTB在维护生精细胞的生长、发育以及精子的形成中起着不可或缺的作用。多聚嘧啶束结合蛋白1（polypyrmidine tract-binding protein 1,PTBP1）是调节前体m RNA剪接和选择性剪接事件的关键蛋白,其不仅能促进精原细胞增殖,也能调控紧密连接（Tight junction,TJ）相关蛋白的表达。PTBP1还可以通过激活PI3K/Akt通路和抑制自噬来促进细胞生长,而PI3K/Akt通路和自噬活性均在支持细胞维持血睾屏障完整性中起重要作用。因此,我们在观察到睾丸支持细胞PTBP1的表达随着年龄增长显着降低的基础上,进一步探索PTBP1是否通过影响紧密连接相关蛋白分子表达和自噬来调控血睾屏障的完整性。方法:1.收集2月龄、6月龄和18月龄小鼠的左侧睾丸,经HE染色和透射电镜观察不同年龄段小鼠睾丸的组织光镜结构和超微结构特征变化;2.收集2月龄、6月龄和18月龄小鼠的右侧睾丸,经蛋白印迹（Western blot）、实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time q PCR）和免疫荧光染色检测PTBP1的表达变化;3.取2月龄、6月龄和18月龄小鼠的附睾尾部精子,通过透明质酸酶HYD活性检测和体外受精穿卵率检测精子活性;4.以胶原酶IV与胰酶联合消化的方法分离与培养小鼠原代SCs,经免疫组化和免疫荧光分别检测SCs特异性标志分子SOX-9和Wt-1来鉴定细胞纯度,并通过免疫荧光染色检测PTBP1在原代SCs中的表达;5.原代SCs分别转染重组慢病毒Lv-sh-EGFP和Lv-sh PTBP1-EGFP,三天后在荧光显微镜下观察EGFP的表达鉴定病毒转染率,并通过Western blot和Real-time q PCR法检测PTBP1、TJ相关蛋白（ZO-1、occludin和claudin-5）的表达;6.原代SCs传代至Trans-well板中,分别转染重组慢病毒Lv-sh-EGFP和Lv-sh PTBP1-EGFP,三天后通过跨上皮细胞电阻（Trans epithelium electrical resistant TEER）法检测BTB的通透性;7.原代SCs分别转染重组慢病毒Lv-sh-EGFP和Lv-sh PTBP1-EGFP,三天后通过Western blot检测PI3K/Akt/m TOR通路及自噬相关分子（LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1和p62）表达变化;8.原代SCs分别转染重组慢病毒Lv-EGFP和Lv-PTBP1-EGFP,三天后在荧光显微镜下观察EGFP的表达鉴定病毒转染率,并通过Western blot和Real-time q PCR法检测PTBP1的表达。9.原代SCs分别转染重组慢病毒Lv-EGFP、Lv-PTBP1-EGFP以及PI3K通路抑制剂LY294002,三天后通过Western blot检测PI3K/Akt/m TOR通路及自噬相关分子（LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1和p62）表达变化;Western blot和Real-time q PCR法检测TJ相关蛋白（ZO-1、occludin和claudin-5）的表达,TEER检测BTB的通透性。10.通过睾丸网微注射法,在6周小鼠睾丸后缘睾丸纵膈处分别注射慢病毒Lv-EGFP、Lv-sh PTBP1-EGFP和Lv-PTBP1-EGFP,并在第7天、14天、28天进行补充注射,四周后冰冻切片荧光显微镜观察感染结构;透射电镜观察睾丸组织SCs的TJ结构变化。结果:1.HE染色和透射电镜观察结果:2月龄与6月龄小鼠睾丸组织结构完整,生精细胞层次分明,精子HYD活性及体外受精率无明显差异;18月龄小鼠睾丸组织的生精上皮排列紊乱,层数进一步减少,多数精原细胞出现空泡样改变,部分管腔中可见大量脱落的生精细胞,SCs与相邻生精细胞之间连接松散,在透射电镜下发现SCs之间的TJ结构松散,连接缺失;2.Western blot、Real-time q PCR和免疫荧光检测PTBP1的结果:18月龄小鼠睾丸组织PTBP1阳性细胞数量减少、PTBP1在蛋白水平和m RNA水平表达显着降低。3.透明质酸酶HYD活性检测和体外受精穿卵率检测精子活性:18月龄小鼠的精子HYD阳性率和活性强度以及体外受精率明显下降。4.成功分离培养原代SCs,PTBP1在原代SCs中稳定表达。5.原代SCs分别成功转染重组慢病毒Lv-EGFP和Lv-sh PTBP1-EGFP;Lv-sh-PTBP1组的PTBP1在蛋白水平和m RNA水平表达显着降低,TJ相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5在蛋白水平和m RNA水平表达均明显降低。6.TEER检测BTB的通透性结果:Lv-sh-PTBP1组细胞电阻降低,BTB的通透性增大。7.Western blot检测PI3K/Akt/m TOR通路及自噬相关分子表达结果:Lv-sh-PTBP1组p-PI3K、p-Akt、p-m TOR表达降低,自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1表达明显升高,p62表达降低。8.原代SCs分别成功转染重组慢病毒Lv-EGFP和Lv-PTBP1-EGFP;Lv-PTBP1组的PTBP1在蛋白水平和m RNA水平表达显着增高。9.原代SCs分别转染重组慢病毒Lv-EGFP、Lv-PTBP1-EGFP和PI3K通路抑制剂LY294002后:Lv-PTBP1组电阻增高,BTB的通透性降低,TJ相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5在蛋白水平和m RNA水平表达均明显增高;LY294002组电阻降低,BTB的通透性增大,TJ相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5在蛋白水平和m RNA水平表达均明显降低;Lv-PTBP1组p-PI3K、p-Akt、p-m TOR表达增高,自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ以及Beclin1表达明显降低,p62表达升高;LY294002组p-PI3K、p-Akt、p-m TOR表达降低,自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ以及Beclin1表达明显升高,p62表达降低。10.通过睾丸网微注射Lv-EGFP、Lv-sh PTBP1-EGFP和Lv-PTBP1-EGFP后结果:Lv-sh-PTBP1组的睾丸组织PTBP1在蛋白水平表达显着降低,TJ相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5在蛋白水平表达均明显降低,TJ超微结构不完整;Lv-PTBP1组的睾丸组织PTBP1在蛋白水平表达显着增高,TJ相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5在蛋白水平表达均明显升高,TJ超微结构紧密。结论:随着年龄增高,小鼠睾丸SCs内PTBP1的表达降低,PTBP1可能通过调节PI3K/Akt/m TOP通路影响TJ相关蛋白的表达,同时影响SCs的自噬,从而改变BTB的完整性,导致维护生精细胞正常发育的微环境发生变化。
李讨讨[2]（2021）在《基于转录组学的藏绵羊睾丸功能基因鉴定及其表达调控》文中认为绵羊睾丸发育和精子发生直接决定着公羊的繁殖力。藏绵羊作为我国青藏高原及其毗邻地区最重要的家畜品种之一,具有繁殖力低、性成熟晚等生殖特点。因此,研究其睾丸发育和精子发生的调控机理对绵羊生殖生物学研究具有重要意义。然而目前在绵羊（尤其藏绵羊）上有关睾丸功能维持的分子生物学认识仍然非常欠缺。本研究以3月龄（性成熟前）、1岁龄（性成熟后）、3岁龄（成年）藏绵羊睾丸组织作为研究材料,进行如下研究:1)借助RNA-seq技术及生物信息学分析对3个发育阶段睾丸组织中的m RNA、circ RNA和mi RNA表达谱进行分析,并进行差异表达分析和功能富集分析;2)根据“ce RNA假说”及circ RNAs、mi RNAs和m RNAs的表达变化趋势,构建ce RNA调控网络;3)基于3月龄和1岁龄组的睾丸转录组数据,对潜在的免疫稳态维持相关候选基因进行鉴定,并对这些基因所富集的mi RNA-m RNA模块及circ RNA-mi RNA-m RNA调控网络进行分析;4)原代分离培养绵羊睾丸支持细胞,以研究精子发生关键基因及相关的circ RNA-mi RNA-m RNA轴在绵羊睾丸细胞中的生物学作用。研究的主要结果如下:1.在3月龄vs 1岁龄、1岁龄vs 3岁龄、3月龄vs 3岁龄睾丸中,分别鉴定到26084（10247个上调,15837个下调）、57个（27个上调,30个下调）、25535个（10017个上调,15518个下调）差异表达m RNAs;分别鉴定到3982（2079个上调,1903个下调）、414（201个上调,213个下调）和4060个（2107个上调,1953个下调）差异表达circ RNAs;分别鉴定到715个（561个上调,154个下调）、57个（46个上调,11个下调）、790个（628个上调,162个下调）差异表达mi RNAs。随机选择的10个m RNAs、10个circ RNAs和12个mi RNAs的RT-q PCR验证结果表明RNA-seq获得的转录组数据是可靠的。差异表达m RNAs、差异表达circ RNAs来源基因、及二者共享基因的GO和KEGG分析结果均显示,它们主要参与生长、发育、生殖、免疫、代谢等相关生物学过程;显着富集在m TOR、TGFβ等生殖相关,以及紧密连接、减数分裂等细胞连接或细胞发育密切相关的信号通路上。2.基于circ RNAs、mi RNAs和m RNAs共表达ce RNA网络分析发现,差异表达circ RNAs的靶基因主要涉及细胞发育、生殖等生物学过程以及粘附连接、局部粘附、ECM-受体相互作用、肌动蛋白细胞骨架调节、MAPK、Wnt、TGFβ等信号通路。在此基础上,构建了睾丸功能（如精子发生、生殖细胞发育、细胞周期、减数分裂、血-睾屏障等）密切相关基因的ce RNA调控网络;通过RT-q PCR、Western blot、免疫荧光染色和双荧光素酶分析发现,BOLL基因主要表达于减数分裂后的圆形和长形精子细胞中,并且其表达受到circ＿029155/mi R-760-3p信号轴的调控。3.基于性成熟前、后藏绵羊睾丸的转录组测序和功能富集数据,共筛选出1118个免疫相关差异表达m RNAs（包括873个下调和245个上调的m RNAs）。GO和KEGG富集分析结果显示,它们主要富集在免疫系统发育、细胞粘附/连接、刺激反应调节、免疫反应调节等生物学过程,以及细胞粘附、T细胞和B细胞受体信号通路、白细胞跨内皮迁移、趋化因子、NF-κB、PI3K/Akt等信号通路上。在此基础上,构建了与睾丸免疫稳态维持相关候选基因的潜在mi RNA-m RNA网络和circ RNA-m RNA-m RNA网络。此外,双荧光素酶分析证实了ITGB1/circ＿013761/circ＿014236与mi R-29b以及ITGB1/circ＿001254与mi R-1185-3p间存在靶向关系。4.由构建的ce RNA网络可知,IGF1基因受到oar-mi R-29b和circ＿026259的潜在调控。RT-PCR、RT-q PCR、荧光原位杂交和免疫荧光分析显示,它们在发育的藏绵羊睾丸中具有相似的RNA分布模式:广泛分布于生殖细胞、间质细胞和支持细胞中。随后,采用两步酶消化法成功分离获得了绵羊睾丸支持细胞。RNase R酶消化法、PCR和Sanger测序证实了circ＿026259的环化特征,即由绵羊KLHL5基因第2-5个外显子产生,且由第2和第5个外显子反向剪接形成环化结构（将circ＿026259命名为circ KLHL5）。通过一系列双荧光素酶、过表达、敲低、CCK-8、Ed U染色、细胞流式分析发现,circ KLHL5可通过靶向oar-mi R-29b促进支持细胞中IGF1基因的表达,进而诱导支持细胞的增殖并抑制其凋亡。综上所述,转录组测序结合相关分子生物学方法揭示了许多差异表达基因在发育的藏绵羊以年龄依赖的表达模式参与生殖细胞发育、减数分裂、血-睾屏障、免疫稳态等生物学过程,并且这些基因中的大多数表达可能受到mi RNAs和/或circ RNAs的调控,以响应不断发育的睾丸内环境及持续的精子发生过程。同时,鉴定到一个由绵羊KLHL5基因产生的新的环状RNA circ KLHL5,并证实其通过靶向oar-mi R-29b调节IGF1基因的表达和睾丸支持细胞的发育。这些发现填补了有关绵羊睾丸组织circ RNAs认识的空白,丰富了现有的绵羊转录组信息,并为进一步理解绵羊及其他高原哺乳动物睾丸发育和精子发生机制提供了理论依据。
汤玉燕[3]（2021）在《性成熟前和性成熟水牛睾丸支持细胞差异蛋白质组学研究》文中认为水牛是亚热带重要的经济物种之一,是乳肉兼用型的优良种质资源。睾丸是雄性动物最重要的生殖器官,睾丸中的支持细胞是曲细精管的重要组成部分。性成熟前（3-6个月）水牛曲细精管中只含有支持细胞和精原细胞,无完整的精子发生功能,此阶段支持细胞主要进行自身的增殖;性成熟（2-3岁）水牛曲细精管由支持细胞和各级生精细胞组成,进行持续的精子发生,此阶段支持细胞主要维持精子发生的正常进行。本研究采用两步酶法结合差速贴壁法分离纯化培养性成熟前和性成熟水牛睾丸支持细胞,并采用iTRAQ标记结合液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）技术对两个不同发育时期的支持细胞蛋白质组进行定量和鉴定,比较其蛋白质在组成和表达水平上的不同,挑选与水牛睾丸支持细胞功能以及维持精子发生相关的重要蛋白,加深对支持细胞生长发育机制的了解,为进一步研究支持细胞对精子发生过程的作用提供理论依据。本研究的主要结果如下:1.水牛睾丸支持细胞的分离纯化与鉴定。研究结果显示:为鉴定WT1的特异性,对其进行免疫组织化学荧光分析,结果表明,WT1阳性细胞分布在睾丸曲细精管靠近基底膜附近的细胞的细胞核上,定位结果与支持细胞在睾丸中分布的位置相符。采用两步酶消化法获得支持细胞-生精细胞悬液,利用4种差速贴壁法纯化支持细胞,发现支持细胞在方法a即37℃、5%CO2的培养箱中培养4 h后去除悬浮细胞,继续在37℃培养支持细胞纯化效果最佳。为了获得高纯度的支持细胞,将支持细胞结合方法a进行传代培养,免疫荧光染色显示,第4代性成熟前和性成熟水牛睾丸支持细胞WT1阳性率均达95%以上。2.利用iTRAQ标记结合LC-MS/MS技术对性成熟前和性成熟水牛睾丸支持细胞蛋白质进行定量和鉴定。结果显示,共鉴定到1908个蛋白质,以性成熟前水牛睾丸支持细胞为对照组,性成熟水牛睾丸支持细胞为实验组,共鉴定到411个差异倍数≥1.3的蛋白质,包括116个上调蛋白和295个下调蛋白。生物信息学分析差异蛋白质,GO分析结果显示,生物学进程分类中差异蛋白质显着富集在RNA加工、RNA剪接和m RNA代谢过程;主要定位在胞内非膜结合细胞器、非膜结合细胞器和细胞器;最显着富集到的结构域是RNA识别基序结构域;KEGG分析显示,剪接体信号通路在差异蛋白质中富集最显着;STRING分析显示,差异蛋白质之间相互作用关系复杂,其中,H2B等10个蛋白质在蛋白互作网络中起中枢作用。Western blot证实了组蛋白H2B和热休克蛋白HSPA2的表达量变化与质谱鉴定结果保持一致;免疫荧光分析发现,H2B位于支持细胞的细胞核内,HSPA2位于支持细胞的细胞质内,与其功能定位一致。综上所述,本研究成功分离获得水牛睾丸支持细胞,采用iTRAQ标记结合LC-MS/MS技术首次建立了性成熟前和性成熟水牛睾丸支持细胞差异蛋白质表达谱,该研究为阐明支持细胞在精子发生过程中的分子机制提供新的视角,为探索支持细胞在睾丸发育过程中的调控机制提供参考。
朱文倩[4]（2021）在《牛睾丸组织冻存体系的优化及应用》文中认为睾丸组织冷冻保存作为雄性遗传资源多样性保护的重要策略之一,为生殖细胞保存、珍稀濒危物种保护及未成年雄性辅助生殖提供了新的途径。目前,啮齿类睾丸组织冻存体系及体外生精的研究已取得显着进展,但牛等大家畜的相关研究仍处于探索阶段。由于睾丸组织结构复杂,各类细胞的大小、低温耐受能力、膜渗透压等均存在差异,冻存-复苏过程中睾丸组织和细胞的生理活性一般会显着降低。因此,现有的睾丸组织冻存体系仍需完善,特别是在牛等大家畜方面。基于前期基础,本研究探索了海藻糖对牛睾丸组织冻存的适宜浓度,优化了冷冻体系及精原干细胞（spermatogonial stem cells,SSCs）培养体系,进而应用于冻存复苏后睾丸组织的体外培养、移植及透射电镜样品制备,通过电镜观察、免疫组化染色和细胞培养,鉴定分析了新型间质细胞——特络细胞（Telocytes,TCs）的形态特征、定位分布及生物学特性,评估了复苏后组织的活性及生精上皮发育能力。冻存体系优化结果显示,冻存液（freezing medium,FM）中添加不同浓度的海藻糖对牛睾丸组织长期低温保存（6个月）具有显着影响。采用含10%二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）、10%血清替代物（Knockout serum replacement,KSR）和20%海藻糖的FM5,结合非程控慢速冷冻（uncontrolled slow freezing,USF）程序,对牛睾丸组织冻存的效果较好。与其它浓度海藻糖添加组（FM1-FM4,FM6）+USF体系相比,FM5组睾丸组织复苏后结构完整、生精细胞排列规则、细胞凋亡率低且存活率高,利于UCHL1（SSCs标记）阳性SSCs的保存。因此,后续实验均采用FM5组冻存的组织。在此基础上,分离获得成年牛生精上皮细胞悬液,差速贴壁以富集SSCs,探讨了牛SSCs在自体睾丸细胞和小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast,MEF）饲养层共培养体系中的差异。荧光定量PCR分析显示,自体睾丸细胞共培养体系可维持其多能性基因（Sox2,Pou5f1）、SSCs标记基因（Gfrα-1,Uchl1）的高水平表达,产生较多SSCs克隆。这表明该体系更有利于牛SSCs体外培养。在复苏后睾丸组织培养方面,以琼脂凝胶为支撑,通过凝胶底部吸收培养液中营养物质,将待培养组织置于气液界面上,维持和促进未成熟睾丸组织发育的方法已在啮齿类和人的研究中取得进展。基于前人的研究,本实验比较了复苏后犊牛睾丸组织在有、无琼脂凝胶培养条件下体外发育的差异。培养18、27 d后分析显示,与贴壁培养相比,琼脂凝胶培养法有利于维持睾丸组织结构和生精上皮的发育,可显着降低细胞凋亡,上调睾丸组织中SSCs标记（Gfrα-1,Uchl1）、减数分裂标记（Sycp3）、成熟精子标记（Crisp1）及体细胞标记（Star,Sox9,Acta2）基因的表达,促进生精细胞的增殖、分化和发育。我们还观察到,贴壁培养组织的周围迁移出大量有狭窄-膨大节段交替形成的念珠样长突起的TCs样细胞,此类细胞表达特异性标记分子CD34、VIM、PDGFRα,具有TCs的典型特征。因冻存-复苏组织的细胞活性与其良好的微细结构保持有密切关系,为检验复苏后牛睾丸组织微细结构的完整性,本研究制备了透射电镜样品以观察超微结构,进而探明上述TCs在牛睾丸组织中的定位分布及形态学特征。结果显示:成年牛和犊牛睾丸组织超微结构完好,TCs均位于曲细精管基膜和管周肌样细胞（peritubular myoid cell,PMC）外侧,胞体较小,呈椭圆形或三角形,有2-3条细长的节结状突起（telopodes,Tps）,可与同类细胞或其他类型细胞相互连接,在间质内形成复杂的3D网络;其核内异染色质多,核外胞质少,内有线粒体等细胞器。睾丸组织切片免疫组化染色结果与上述超微结构观察一致,成年牛及犊牛的TCs特异性标记分子CD34主要分布在曲细精管基膜外侧。表明TCs主要位于间质中,这为进一步了解牛睾丸生理结构奠定了基础。为进一步评估冻存-复苏后犊牛睾丸组织的活性及其生精上皮的发育分化能力,本研究还将其进行了小鼠背部皮下异种移植实验。结果显示,牛睾丸组织移植28天后,保留了曲细精管样结构;生精细胞在相关基因水平启动分化机制,与正常30日龄的牛睾丸发育状态基本保持一致。这表明移植的组织确有活性,其生精上皮和间质组织有一定的发育分化能力。综上,本研究筛选建立了添加20%海藻糖的牛睾丸组织冻存优化体系FM5+USF,确证自体睾丸细胞共培养体系对牛SSCs短期培养更为适宜,琼脂凝胶法有利于睾丸组织培养,冻存-复苏的组织移植后可存活发育,证实睾丸冷冻技术联合组织培养及移植技术应用的可行性,同时也明确了TCs在牛睾丸中的存在和分布特征,为进一步了解大型经济动物的睾丸生理结构,保存雄性种质资源提供参考。
郭军培[5]（2021）在《猪GRP多克隆抗体的制备与应用及其对Leydig cells睾酮分泌的影响》文中进行了进一步梳理胃泌素释放肽（Gastrin-releasingpeptide,GRP）是1979年从猪的胃组织中分离得到的一种神经肽,是哺乳动物蛙皮素样肽家族中的一员,在体内GRP通过与其受体（Gastrin-releasing peptide receptor,GRPR）结合发挥多种生理功能。GRP及其受体在多种动物的神经系统和外周组织中广泛表达,参与调控体内多种生物学作用,包括:促进正常/肿瘤细胞的增殖分化、促进胰液分泌、调节应激和恐惧等情绪性行为、参与调控摄食和节律等。自GRP发现以来,目前大多数关于GRP及其受体功能的研究都集中于人和大小鼠上,关于猪体内GRP的表达及其生物学作用的研究较缺乏。为研究GRP在猪体内的分布情况,我们首先制备了猪GRP多克隆抗体,并研究了GRP蛋白在猪体内的分布。本课题组前期研究结果表明,GRP可能对公猪的生殖功能具有调控作用,因此本试验以猪Leydig cells为模型,研究GRP对猪Leydig cells睾酮分泌/合成、增殖及凋亡的影响。通过以上研究旨在发现GPR在猪体内可能存在的生理功能及对猪Leydig cells的影响,为进一步研究GRP对公猪生殖相关激素的调控机制奠定基础。1.猪GRP多克隆抗体的制备本试验通过大肠杆菌原核表达技术,构建了重组表达载体pET32a（+）-pGRP,并转化到表达菌株BL21（DE3）获得pGRP融合蛋白表达菌株,IPTG诱导表达菌株获得Histag-pGRP融合蛋白,以纯化后的融合蛋白为免疫原,制定免疫程序免疫试验动物后获得抗血清,即为制备的多克隆抗体。具体如下:（1）根据猪GRP基因序列,设计并合成添加酶切位点的引物序列;通过PCR扩增获得pGRP目的片段,包括全长开放阅读框（441 bp）,编码146个氨基酸;随后与pMD19T连接构建pMD19T-pGRP重组质粒;将pMD19T-pGRP和pET32a（+）质粒经双酶切线性化后连接构建pET32a（+）-pGRP重组表达载体;并转化至表达菌株BL21（DE3）中获得BL21（DE3）-pET32a（+）-pGRP融合蛋白表达菌株。（2）利用IPTG诱导BL21（DE3）-pET32a（+）-pGRP融合蛋白表达菌株获得His-tag-pGRP融合蛋白,并对获得的蛋白进行检测和纯化。（3）制定免疫程序后,以纯化后的融合蛋白为免疫原免疫试验动物家兔,并获得抗血清;采用ELISA检测抗血清的效价为1:50,000,并通过Western Blot检测抗血清的反应原性;纯化后的抗血清即为制备的多克隆抗体。2.GRP在猪体内的分布定位和表达本部分主要通过IHC和Western Blot检测GRP蛋白在猪组织中的分布表达情况。结果表明:GRP蛋白在猪的中枢神经系统和外周组织器官中都有表达,其中在中枢神经系统GRP蛋白主要表达在下丘脑、小脑等组织;在外周组织中主要表达在胃肠道和泌尿生殖道。综上所述,GRP蛋白在猪体内的广泛存在表明GRP可能对猪的多种生理功能具有调节作用。3.GRP对猪Leydigcells的影响为研究GRP对猪Leydig cells的影响,我们使用一定浓度的GRP处理猪Leydig cells,收集上清和蛋白样品分别进行如下检测:检测GRPR蛋白在Leydig cells中表达,结果表明一定浓度（1和10 nM）的GRP可以显着促进GRPR蛋白的表达;检测上清中睾酮分泌和睾酮合成相关蛋白（StAR、CYP11A1和HSD3B2）表达的影响,结果表明GRP能够促进睾酮的分泌,其中1和10nM的GRP能够显着增加睾酮的浓度（P<0.01和P<0.05）;Western Blot结果也表明不同浓度GRP处理细胞对睾酮合成相关蛋白（StAR、CYP11A1和HSD3B2）的表达有一定的促进作用;进一步检测了GRP对Leydig cells细胞增殖和凋亡的影响,CCK-8结果表明GRP对细胞活性有一定的作用,GRP浓度为1和10nM时能够显着增加细胞数量（P<0.01和P<0.05）;Western Blot检测结果表明一定浓度的GRP对Cyclin B1蛋白表达有促进作用,但是对PCNA影响不显着;同时流式细胞术检测结果表明一定剂量的GRP能够促进细胞凋亡并促进凋亡相关蛋白的表达;检测了GRP处理对G-蛋白偶联受体信号通路中pPKC/PKC和pPKA/PKA蛋白表达的影响,结果显示一定浓度的GRP能够增加pPKC/PKC的比值,但是对pPKA/PKA的比值影响不显着。该论文构建重组表达载体pET32a（+）-pGRP并制备猪GRP多克隆抗体,通过IHC和Western Blot检测GRP蛋白猪体内的分布和表达情况,结果表明GRP蛋白在猪组织中具有广泛的分布表达,表明GRP在猪体内可能具有多种生理功能。该论文进一步研究GRP对猪睾丸间质细胞睾酮的分泌和合成的影响,结果表明一定浓度的GRP能够促进睾酮分泌并调节睾酮合成相关蛋白的表达;另外,研究结果还表明一定浓度的GRP对睾丸间质细胞的细胞增殖和凋亡也有影响;并发现GRP/GRPR系统对睾丸间质细胞的调节作用可能是通过pPKC/PKC途径。
贾芳[6]（2021）在《布鲁氏菌S19 bvfA基因缺失株免疫保护性及其与睾丸支持细胞互作组学研究》文中进行了进一步梳理布鲁氏菌病（布病）作为一种全球性的人畜共患病,严重影响着流行地区居民的身体健康和经济发展,因此,布病的防控工作受到越来越多国家的重视。目前,免疫预防是控制布病的主要手段之一。由于现有的动物疫苗存在毒性残留和干扰常规血清学检测等缺点,制备高效、安全的毒力基因缺失活疫苗成为控制布病的新趋势。bvfA（Brucella virulence factor A）基因是布鲁氏菌（Brucella）特有的赋予其在宿主胞内建立复制生态位的毒力基因。但bvfA基因在布鲁氏菌中具体生物学功能尚未明确,特别是bvfA基因在布鲁氏菌感染靶细胞过程中的功能尚处于空白。方法:本研究利用开放性读码框预测软件确定编码BvfA蛋白的基因序列,利用PCR技术测定bvfA基因在临床布鲁氏菌分离株中的分布频率,利用基因同源重组和细菌接合转移原理构建B.abortus S19△bvfA菌株及其回补株,模拟细胞内环境条件检测B.abortus S19△bvfA菌株的应激能力;CCK-8法评估B.abortus S19△bvfA菌株在TM4睾丸支持细胞中的增殖能力,LDH法检测B.abortvs S19ΔbvfA菌株对TM4睾丸支持细胞的损伤性,用ELISA方法评价B.abortus S19△bvfA菌株的免疫原性和免疫反应性,用组织细菌计数法评估B.abortus S19△bvfA菌株对布鲁氏菌强毒株攻击的免疫保护性;HE组织切片染色展示B.abortus S19△bvfA菌株与其它布鲁氏菌对组织损伤的区别。用Illumina Hiseq测序和液相色谱-串联质谱技术在转录组、蛋白质组和代谢组水平上联合分析bfA基因在布鲁氏菌中的作用及其在布鲁氏菌感染宿主时的作用。结果:（1）获得了大小为336 bp的bvfA基因序列,将bvfA基因提交到Genbank中获得基因序列号（MN651999）;确定bvfA基因在临床布鲁氏菌分离株中100%保有。（2）B.abortus S19△bvfA菌株较它的亲本株和回补株生长速度慢;在热刺激、高盐、高渗、强酸和抗菌素条件下,B.abortus S19△bvfA菌株生长均受到抑制,仅在氧化压力下生长良好（p<0.05）。（3）在12 h、24 h和48 h时,B.abortus S19△bvfA菌株入侵TM4睾丸支持细胞富集到的菌落数分别是B.abortus S19菌株的90%、95%和96%;在12 h、24 h和48 h时,TM4睾丸支持细胞感染B.B abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株后的死亡率分别是13.39%和7.14%,14.97%和12.40%,33.8%和31.2%。（4）免疫B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株小鼠血清中抗体效价1～3周均呈上升趋势,4周趋于平稳,两者抗体水平无显着性差异（P>0.05）。血清中IFN-γ含量在1周～2周升高,IL-2在1周～4周升高,IL-4在2周～3周升高。B.abortvs S19△bvfA菌株和.abortusS19菌株免疫小鼠血清抗体与BvfA蛋白反应的抗体效价分别是2.16和4.21（2周）,2.16和4.52（3周）。免疫B.abortus S19△bvfA菌株小鼠脾载菌量是B.abortus S19菌株的86%（1周）、93%（2周）和84%（4周）。小鼠免疫B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株后攻强毒株B.melitensis 16M,脾载菌量是未免疫攻强毒株B.tmeliensis 16M的0.03%和2.9%（1周）,0.75%和0.33%（2周）。小鼠免疫B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株后攻强毒株B.abortus 2308,脾载菌量是未免疫攻强毒株B.abortus 2308的9.8%和6.5%（1周）,6.8%和6.8%（2周）。（5）转录组学和蛋白质组学技术关联分析显示,B.abortuAs S19△bvf菌株RNA聚合酶中的rpoA、rpoC和rpoB基因表达量下调;蛋白质组学和代谢组学技术关联分析显示,B.abortus S19△bvfA菌株和B.S19菌株蛋白质组和代谢组差异主要表现为ABC转运、嘌呤代谢和氨酰-tRNA生物合成。（6）转录组学和蛋白质组学技术关联分析显示,分别感染B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株的TM4睾丸支持细胞之间的差异表现为逆行神经信号通路;蛋白质组学和代谢组学技术关联分析显示,感染B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株的TM4睾丸支持细胞之间的差异表现为逆行神经信号通路,矿物质吸收和鞘脂信号通路。结论:（1）bvfA基因参与了 B.abortus S19菌株在宿主细胞中的增殖和对宿主细胞内环境的适应。B.abortu sS19△bvfA菌株在感染早期（12h）对TM4睾丸支持细胞的损伤强于其他布鲁氏菌。小鼠腹腔注射B.abortus S19△bvfA菌株1周即能引起免疫应答,且具有很好的免疫保护效果。B.S19△bvfA菌株对小鼠脾脏和睾丸的毒性及病理损伤均小于B.abortus S19菌株。（2）bvfA基因主要参与B.abortus S19菌株RNA聚合酶的转录、ABC转运、嘌呤代谢和氨酰-tRNA生物合成;bvfA基因能干扰宿主细胞的矿物质吸收、鞘脂信号通路和线粒体中NADH泛醌氧化还原酶复合体的功能。感染B.abortus S19△bvfA菌株的TM4睾丸支持细胞CatSper2表达量高度下调,推测CatSper通道可能是布鲁氏菌引起不育的主要靶点,P53表达量增加,推测bvfA基因能抑制TM4睾丸支持细胞的凋亡。
赵浩名[7]（2021）在《VD3/VDR对小鼠睾丸与肾脏的抗衰老作用评价及机理研究》文中研究说明衰老是一种随着时间推移而出现的人体生理功能退化的自然现象。随着老龄化人口增加,抗衰老机制的探索和抗衰老药物的研发越来越受到社会关注。VD3是一种重要的类固醇衍生物,具有多种生理功能,在骨质疏松症、佝偻病、心脑血管疾病、自身免疫系统疾病、多发性硬化症和癌症等疾病中具有重要作用。近期研究发现,VD3在抗衰老方面具有一定的生物学功能。本课题前期发现VDR-/-小鼠伴有脱毛、体型佝偻、发育迟缓、个体矮小和生殖能力低下等特点,表现出早衰的特征。据此,本研究认为VDR的敲除,阻断了 VD3的利用及生物学功能,进而加速了小鼠衰老。为了进一步阐明VD3/VDR在雄性生殖系统中的作用和抗衰老机制,本研究对6月龄与12月龄WT和VDR-/-小鼠睾丸组织进行转录组分析,以期获得受VD3/VDR调控的衰老相关基因,为抗衰老研究提供新的靶点,并为VD3功能进一步开发提供新的思路。在获得的转录组分析数据基础上,为了进一步研究VD3/VDR对小鼠睾丸与肾脏的抗衰老作用,本研究构建D-半乳糖（D-Gal）衰老模型小鼠。基于动物模型,结合组织形态观察、病理学检测及衰老相关生化指标检测分析了 VD3/VDR对雄性小鼠生殖系统的抗衰老作用。最终,本研究结合VDR-/-小鼠睾丸组织转录组数据、VD3的抗衰老作用评价及衰老相关信号通路的分子水平分析,进行了 VD3/VDR对小鼠睾丸与肾脏的抗衰老机制探索,为抗衰老领域的研究提供一定的数据补充与借鉴。本研究获得以下实验结果:1.VDR敲除雄鼠血清、睾丸及肾脏中超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH）活力下降;睾丸转录组分析筛选衰老相关基因,获得受VDR影响的DNA损伤修复相关基因p53结合蛋白1（53BP1）和乳腺癌1号基因（BRCA1）,炎症因子白细胞介素-1（IL-1）和白细胞介素-2（IL-2）,氧化应激相关基因核因子E2相关因子2（Nrf2）和NADPH氧化酶4（Nox4）,细胞增殖相关基因p16、p21及p53。VDR可能通过介导DNA损伤修复、炎症及氧化应激相关基因表达,进而延缓小鼠生殖系统衰老。2.构建D-Gal亚急性衰老小鼠模型,验证VD3在小鼠睾丸和肾脏中的抗衰老作用。D-Gal处理小鼠体重增长缓慢,脏器系数降低,睾丸与肾脏组织衰老现象明显,抗氧化相关酶系水平均显着下降,表明D-Gal衰老小鼠模型构建成功;VD3处理组小鼠睾丸和肾脏组织受到的损伤减轻,抗氧化相关酶系水平均显着升高,表明VD3延缓小鼠生殖系统衰老。3.VD3促进衰老小鼠睾丸和肾脏中VDR的表达;VDR抑制细胞增殖相关基因p16、p21及p53的表达;VDR促进DNA损伤修复相关基因53BP1和BRCA1的表达;VDR抑制炎症因子IL-1和IL-2的表达;VDR抑制氧化应激相关基因Nrf2和Nox4的表达。推测VDR可能通过促进DNA损伤修复、抑制炎症反应及氧化应激过程,进而延缓小鼠生殖系统衰老。
李小丰[8]（2021）在《PRM1在非小细胞肺癌中的表达及生物学作用研究》文中研究说明背景:目前,肺恶性肿瘤仍是威胁人类健康的最大敌人之一,中国癌症发病和死亡统计显示,2015年我国肺癌的新发病例数为78.7万,死亡人数为63.1万,均列癌症首位。根据临床和病理特点的不同,肺癌分为小细胞肺癌（占13%）和非小细胞肺癌（占87%）,其5年总生存率仅为18.2%。传统的治疗方法包括手术、化疗、放疗等,但对于晚期肺癌患者均疗效不佳。近年来,随着分子靶向治疗的兴起,非小细胞肺癌的无进展生存期和总生存期都得到了显着改善。具有敏感基因突变的肺癌患者,分子靶向治疗是最有效的治疗方式之一,而对于没有敏感突变或在靶向治疗过程中发生靶基因耐药突变的患者而言,发现新的肿瘤生物学标志物和新的治疗靶点显得尤为重要。鱼精蛋白-1（PRM1）是肿瘤-睾丸抗原（CTA）的一种,CTA在正常情况下只在睾丸组织中表达,而其它组织不表达或极低表达,但当机体出现肿瘤时则可以在某些肿瘤组织中高表达,肿瘤-睾丸抗原也因此得名。既往对于PRM1的研究主要集中在男性生殖领域。近年来,随着CTA在肿瘤领域研究的深入,关于PRM1在恶性肿瘤中的作用也逐渐被重视,研究发现PRM1是结肠癌相关的肿瘤-睾丸抗原基因,利用RT-PCR技术分析PRM1在结肠癌和癌旁组织的表达水平,发现肠癌组织中PRM1-m RNA水平明显高于癌旁和正常组织。也有研究发现PRM1在慢性淋巴细胞白血病患者中高表达,PRM1也被认为是慢性淋巴性白血病的CTA基因。另有研究表明,PRM1在恶性肿瘤中的异常表达,可能与肿瘤的生长侵袭相关。在动物实验中,给裸鼠皮下注射PRM1蛋白可明显提高小鼠肠道肿瘤的发生率。目前为止,尚无关于PRM1在非小细胞肺癌中表达情况的报道,课题组的前期工作已证实,与正常组织比较,PRM1在非小细胞肺癌组织中的表达明显升高。同时,PRM1对非小细胞肺癌细胞具有促进增殖作用。本研究中,我们检测了PRM1在非小细胞肺癌肿瘤组织和外周血中的表达情况,分析了PRM1蛋白水平与临床特征的相关性;并评估了PRM1在非小细胞肺癌中的诊断价值;通过过表达和敲低PRM1基因观察其对细胞增殖、凋亡及周期的影响;建立非小细胞肺癌裸鼠转移瘤模型,检测转移瘤裸鼠外周血PRM1蛋白的表达水平,观察外源性PRM1重组蛋白和PRM1抗体对裸鼠转移瘤生长的影响。旨在评估PRM1作为新的生物学标志物对非小细胞肺癌的诊断价值,研究PRM1对非小细胞肺癌细胞的促增殖作用,并对其机制作初步探讨。方法:1、收集110例非小细胞肺癌肿瘤组织、配对正常组织、术前血清和健康者血清标本,应用RT-PCR法、免疫组织化学染色法和ELISA法检测其中PRM1基因和蛋白水平,应用卡方检验统计分析患者肿瘤组织和外周血中PRM1蛋白水平与临床特点的相关性。2、评估PRM1的诊断价值,应用SPSS软件统计分析外周血中PRM1蛋白水平对非小细胞肺癌及其亚组肺腺癌、肺鳞癌的诊断价值,并与临床常用的肿瘤标志物CEA、SCC和CYFRA21-1进行比较,评估PRM1诊断价值的优劣性。3、观察细胞内PRM1表达水平对细胞增殖的影响,通过质粒构建技术及si RNA转染技术,过表达和敲低A549、NCI-H460细胞的PRM1基因,应用RTPCR和ELISA法检测细胞PRM1基因和蛋白表达水平,应用CCK8法和Ed U法检测细胞增殖情况,应用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况。4、观察外源性PRM1重组蛋白和抗体对细胞增殖的影响,将人源重组PRM1蛋白和PRM1抗体加入到A549、NCI-H460细胞培养液中,应用CCK8法和Ed U法检测细胞增殖情况。5、观察细胞在不同营养状态下PRM1的表达情况,将A549、NCI-H460细胞培养于含不同浓度血清的培养液中,应用RT-PCR法和ELISA法检测细胞的PRM1基因及蛋白水平。6、观察外源性PRM1重组蛋白和抗体对动物转移瘤生长的影响,制备裸鼠转移瘤模型,将非小细胞肺癌细胞A549皮下注射到裸鼠背部偏右侧,肿瘤形成后,（1）应用ELISA法检测转移瘤裸鼠和健康裸鼠外周血PRM1蛋白水平,并分析其差异性;（2）分别经尾静脉注射人源重组PRM1蛋白、PRM1抗体及两者混合剂,每3日测量并计算肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。（3）第33天于麻醉下处死裸鼠,取出肿瘤组织,测量重量并计算肿瘤体积,分析外源性PRM1重组蛋白和PRM1抗体对裸鼠转移瘤生长的影响。结果:1、非小细胞肺癌肿瘤组织中PRM1的m RNA和蛋白水平较配对正常组织明显升高。统计分析显示:随着肿瘤组织中PRM1蛋白水平的增加,肿瘤T分期越晚,淋巴结转移阳性率越高,而与病理类型、年龄、性别、脉管及神经浸润无相关性;2、非小细胞肺癌患者外周血中PRM1蛋白水平较健康者显着升高。统计分析显示,淋巴结转移阳性和临床分期较晚的患者外周血中的PRM1蛋白水平更高,而与病理类型、年龄、性别、脉管及神经浸润不相关。3、PPM1对于非小细胞具有较高的诊断价值。SPSS软件统计分析显示:（1）外周血中PRM1蛋白水平在非小细胞肺癌及其亚组肺腺癌、肺鳞癌中均具有较高的诊断价值。（2）在肺腺癌中,PRM1的诊断价值高于CEA;在肺鳞癌中,PRM1的诊断价值明显强于SCC且与CYFRA21-1相当;（3）含有PRM1的肿瘤标志物组合的诊断价值明显高于传统组合;（4）在早期的肺腺癌中,PRM1的诊断价值高于CEA;在早期肺鳞癌中,PRM1诊断价值高于SCC且不劣于CYFRA21-1。提示PRM1具有较高的非小细胞肺癌诊断价值。4、非小细胞肺癌细胞株A549和NCI-H460的PRM1 m RNA水平较人正常肺上皮细胞株BEAS-2B明显升高;同样,A549、NCI-H460细胞内和培养液中的PRM1蛋白水平较BEAS-2B细胞均显着升高。5、成功构建PRM1过表达和敲低的A549、NCI-H460细胞株模型,与对照组比较,过表达PRM1促进A549和NCI-H460细胞的增殖,而敲低PRM1则抑制细胞的增殖。6、外源性PRM1重组蛋白能够促进非小细胞肺癌A549和NCI-H460细胞的增殖,而PRM1抗体则抑制细胞增殖。7、不同营养状态下PRM1的表达存在差异。实验结果显示,随着细胞培养液中血清浓度的降低,A549和NCI-H460细胞PRM1表达水平显着增加。8、细胞周期检测结果提示,过表达PRM1使细胞周期中G0/G1期比例降低,S期细胞比例增加,肿瘤细胞增殖活跃;而敲低PRM1则使细胞周期发生G0-G1期阻滞,S期细胞比例降低,肿瘤细胞增殖受抑;细胞凋亡结果显示,敲低PRM1对A549和NCI-H460细胞的凋亡水平无显着影响。9、动物实验结果:（1）与健康对照组比较,转移瘤裸鼠外周血中PRM1蛋白水平明显升高,也证实了动物实验和体外细胞实验结果与人体组织实验结果一致。（2）外源性PRM1重组蛋白具有促进裸鼠转移瘤生长的作用,而PRM1抗体则抑制转移瘤生长。实验结果提示,与对照组比较,经尾静脉给予外源性PRM1重组蛋白的裸鼠肿瘤生长速度快,肿瘤体积大,而给予PRM1抗体的裸鼠肿瘤生长速度较慢,且肿瘤体积较小。结论:1、PRM1在非小细胞肺癌肿瘤组织和外周血中的特异性高表达,及其对非小细胞肺癌特别是早期患者的诊断价值,使其具备了成为非小细胞肺癌血清学肿瘤标志物的潜质。2、过表达和敲低PRM1基因双向验证了其对非小细胞肺癌细胞株A549和NCI-H460的促增殖作用,这种作用与增加细胞周期中S期细胞比例相关,而非抑制细胞的凋亡。3、细胞内外PRM1蛋白水平的增加均可促进细胞的增殖,提示PRM1促增殖作用可能存在多条途径,为进一步研究PRM1的作用机制提供线索。4、营养供应差时细胞PRM1的表达水平反而增加,这种负反馈调节作用在一定程度上解释非小细胞肺癌在血供不良的情况下仍快速生长的原因。5、外源性PRM1重组蛋白和抗体对裸鼠转移瘤生长的影响,进一步在生物体内验证了PRM1促进肿瘤生长的作用,同时,PRM1抗体的抑瘤作用也为其成为肿瘤治疗靶点提供直接的理论支持。
王霞[9]（2021）在《藏绵羊睾酮合成相关基因在睾丸和附睾中的表达特征及生物学功能》文中认为哺乳动物的睾酮合成受很多基因的共同调控,其中某些基因的表达量减少或者缺失都将影响睾酮合成的水平,睾酮缺乏会对生精过程会产生不利影响。研究发现STAR、CYP11A1、HSD3B1、CYP17A1、HSD17B3和GLOD4在雄性动物睾丸中表达,与雄性动物睾酮合成过程以及睾丸功能维持密切相关,但是其在不同物种中的表达特征及发挥的生物学作用存在差异。因此,本研究利用q RT-PCR和Western Blot方法检测STAR、CYP11A1、HSD3B1、CYP17A1、HSD17B3和GLOD4在3月龄（性成熟前）、1岁龄（性成熟）、3岁龄（成年）3个关键发育阶段藏绵羊睾丸和附睾组织中的表达特征,并运用免疫荧光技术对其蛋白的阳性信号分布特征进行检测。此外,采用q RT-PCR和双荧光素酶报告系统对oar-miR-190-3p和oar-miR-363-3p的表达特征与HSD17B3的靶向关系进行验证。主要研究结果如下:1.与3月龄相比,1岁龄和3岁龄藏绵羊睾丸中STAR、HSD3B1、CYP17A1和HSD17B3 mRNA的表达量显着下调（P<0.01）,而其蛋白的表达量显着上调（P<0.01）,1岁龄和3岁龄睾丸中CYP11A1和GLOD4 mRNA和蛋白的表达量均显着上调（P<0.01）。免疫荧光染色结果发现,STAR、CYP11A1、HSD3B1、CYP17A1、HSD17B3和GLOD4蛋白主要分布在性成熟后（1岁龄和3岁龄）藏绵羊的睾丸间质细胞中,在整个发育阶段的生殖细胞中也有少量分布。研究结果表明,睾酮合成相关基因可能通过维持睾丸间质细胞的功能及调控藏绵羊间质细胞睾酮的分泌及来参与精子发生。2.STAR、CYP11A1、HSD3B1、CYP17A1和HSD17B3 mRNA和蛋白在不同发育阶段藏绵羊附睾头、体和尾中均有表达。STAR、CYP11A1、HSD3B1、CYP17A1和HSD17B3mRNA在不同发育阶段附睾（头、体和尾）中差异表达,而其蛋白的表达均显着上调（P<0.01）。免疫荧光结果显示,STAR、CYP11A1、HSD3B1、CYP17A1和HSD17B3蛋白主要存在于不同发育阶段藏绵羊附睾上皮细胞中,并且随着年龄的增加信号强度逐渐增强。此外,在性成熟后（1岁龄和3岁龄）藏绵羊附睾（头、体和尾）管腔的精子中也存在中等强度的阳性信号分布。研究结果表明,STAR、CYP11A1、HSD3B1、CYP17A1和HSD17B3在不同发育阶段藏绵羊附睾中主要通过调控附睾上皮细胞的分泌和吸收功能进而参与附睾发育以及精子成熟。3.随着年龄的增加,oar-miR-190-3p和oar-miR-363-3p在睾丸中表达显着上调（P<0.01）,在不同发育阶段附睾中呈区段性差异表达。双荧光素酶报告系统检测结果发现oar-miR-190-3p和oar-miR-363-3p模拟物均明显降低了HSD17B3 3′UTR野生型的荧光素酶活性（P<0.05）。这些结果表明,oar-miR-190-3p和oar-miR-363-3p可以靶向调控绵羊HSD17B3基因的表达。
梁景辉[10]（2021）在《桂药生精胶囊对不育症大鼠睾丸组织Bcl-2/Bax、Caspase-9/3表达的影响》文中提出目的:观察桂药生精胶囊对环磷酰胺（Cyclophosphamide,CTX）诱导的不育症（Male Infertility,MI）大鼠睾丸组织Bcl-2、Bax、Caspase-9和Caspase-3表达的影响。方法:采用SPF级雄性SD大鼠50只,随机抽取10只为空白组、40只为模型组,空白组予腹腔注射生理盐水,模型组予腹腔注射CTX（40mg/kg）,连续5天以建立MI大鼠模型。造模结束后随机抽取空白组大鼠3只、模型组大鼠5只进行模型验证,确定造模成功后将模型组大鼠均分为模型组、阳性对照组、桂药低剂量组、桂药中剂量组、桂药高剂量组,并开始进行干预。空白组与模型组给予生理盐水（1m L/d）灌胃,阳性对照组给予缬沙坦胶囊（1.44mg/m L/d）灌胃,桂药组给予桂药生精胶囊低、中、高剂量（28.5mg/ml/d、57mg/ml/d、114mg/ml/d）灌胃,连续4周。干预结束后测量大鼠体质量,在无菌条件下摘取大鼠睾丸、附睾称重,采用扩散法检测大鼠附睾精子参数、HE染色法观察大鼠睾丸组织结构的变化、IHC染色法检测各组大鼠睾丸组织Bcl-2、Bax、Caspase-9和Caspase-3的表达水平。结果:1.模型验证:模型组大鼠体质量、睾丸及附睾质量、精子密度、运动精子百分率、前向运动精子百分率均较空白组显着降低,模型组大鼠睾丸组织结构形态可见明显病理改变,此次大鼠模型制备符合MI模型标准。2.大鼠睾丸病理学观察:桂药低、中、高剂量组睾丸组织结构较模型组与阳性对照组有明显改善,生精小管形态趋向规则,基底膜增厚,纤维肌细胞与支持细胞数量分布均匀,精原细胞与精母细胞排列趋于整齐、层数增多,细胞外膜破损可见修复,精子细胞与精子数量增多,微血管供血改善,炎性细胞浸润减少。其中桂药高剂量组睾丸组织形态结构未见明显病理改变,改善最为明显,与空白组比较无明显差异。3.大鼠体质量:干预后桂药组、阳性对照组体质量与模型组比较显着增高（P<0.01）,且桂药中、高剂量组优于阳性对照组（P<0.05）,桂药高剂量组体质量与空白组比较无明显差异（P>0.05）。4.大鼠睾丸及附睾质量:（1）睾丸质量:桂药组、阳性对照组睾丸质量与模型组比较显着增高（P<0.01）,且桂药高剂量组优于阳性对照组（P<0.05）,桂药高剂量组睾丸质量与空白组比较无明显差异（P>0.05）。（2）附睾质量:桂药组、阳性对照组附睾质量与模型组比较上升（P<0.05）,且桂药高剂量组优于阳性对照组（P<0.05）,桂药高剂量组附睾质量与空白组比较无明显差异（P>0.05）。5.大鼠精子参数:（1）精子密度:桂药组、阳性对照组精子密度与模型组比较显着增高（P<0.01）,且桂药组优于阳性对照组（P<0.01）,桂药高剂量组精子密度与空白组比较无明显差异（P>0.05）。（2）运动精子百分率:桂药组、阳性对照组运动精子百分率与模型组比较显着增高（P<0.01）,且桂药中、高剂量组优于阳性对照组（P<0.01）,桂药高剂量组运动精子百分率与空白组比较无明显差异（P>0.05）。（3）前向运动精子百分率:桂药组、阳性对照组前向运动精子百分率与模型组比较显着增高（P<0.01）,且桂药中、高剂量组优于阳性对照组（P<0.01）,桂药中、高剂量组前向运动精子百分率与空白组比较无明显差异（P>0.05）。6.大鼠睾丸组织Bcl-2的表达情况:桂药组、阳性对照组Bcl-2阳性表达率与模型组比较显着增高（P<0.01）,且桂药组优于阳性对照组（P<0.05）,桂药高剂量组Bcl-2阳性表达率与空白组比较无明显差异（P>0.05）。7.大鼠睾丸组织Bax的表达情况:桂药组、阳性对照组Bax阳性表达率与模型组比较显着降低（P<0.01）,且桂药中、高剂量组优于阳性对照组（P<0.01）。8.大鼠睾丸组织Caspase-9的表达情况:桂药组、阳性对照组Caspase-9阳性表达率与模型组比较显着降低（P<0.01）,且桂药中、高剂量组优于阳性对照组（P<0.01）。9.大鼠睾丸组织Caspase-3的表达情况:桂药组、阳性对照组Caspase-3阳性表达率与模型组比较显着降低（P<0.01）,且桂药高剂量组优于阳性对照组（P<0.05）。结论:桂药生精胶囊能改善MI大鼠睾丸病理损伤,提高MI大鼠体质量、睾丸及附睾质量、精子总数及活动力,并能上调睾丸组织Bcl-2的表达,下调Bax、Caspase-9、Caspase-3的表达,且呈明显的量效关系,这可能是桂药生精胶囊治疗MI的作用机理之一。
二、睾丸免疫的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、睾丸免疫的研究进展（论文提纲范文）
（1）多聚嘧啶束结合蛋白1对小鼠血睾屏障完整性和支持细胞自噬的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 支持细胞在血睾屏障中的作用机制的发展研究 |
| 参考文献 |
| 作者简介及攻读学位期间科研成果 |
| 致谢 |
| 学位论文数据集 |
（2）基于转录组学的藏绵羊睾丸功能基因鉴定及其表达调控（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Summary |
| 第一章 文献综述 |
| 1 睾丸的生物学功能概述 |
| 1.1 精子发生 |
| 1.2 睾丸支持细胞的生物学功能 |
| 1.3 免疫豁免特性 |
| 1.3.1 血-睾屏障 |
| 1.3.2 免疫抑制 |
| 2 非编码RNAs及其在雄性动物生殖系统中的研究进展 |
| 2.1 miRNAs及其在哺乳动物睾丸中的研究进展 |
| 2.2 CircRNAs及其在雄性动物生殖系统中的研究进展 |
| 3 转录组测序技术在哺乳动物生殖系统中的应用研究进展 |
| 4 研究目的及意义 |
| 第二章 不同发育期藏绵羊睾丸circRNA/miRNA/mRNA表达谱特征分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物及样品收集 |
| 1.2 试验仪器与试剂 |
| 1.2.1 试验仪器 |
| 1.2.2 试验试剂 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 组织形态学分析 |
| 1.3.2 总RNA提取及质检 |
| 1.3.3 cDNA文库和小RNA文库的构建及测序 |
| 1.3.4 数据质控及mRNA、circRNA、miRNA的鉴定 |
| 1.3.5 差异表达分析 |
| 1.3.6 功能富集分析 |
| 1.3.7 RT-qPCR验证 |
| 1.3.8 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同发育阶段藏绵羊睾丸组织形态学特征比较分析 |
| 2.2 mRNA、circRNA和miRNA测序数据概述 |
| 2.3 差异表达分析 |
| 2.3.1 差异表达mRNA分析 |
| 2.3.2 CircRNA表征及差异表达分析 |
| 2.3.3 差异表达miRNA分析 |
| 2.4 测序结果验证 |
| 2.4.1 mRNA测序结果验证 |
| 2.4.2 CircRNA测序结果验证 |
| 2.4.3 miRNA测序结果验证 |
| 2.5 功能注释与富集分析 |
| 2.5.1 差异表达mRNAs功能注释与富集分析 |
| 2.5.2 差异circRNAs来源基因功能注释与富集分析 |
| 2.5.3 差异circRNAs来源基因与差异mRNAs共享基因的功能富集分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 CircRNA-miRNA-mRNA整合分析及睾丸功能维持相关基因的ceRNA调控网络鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物及样品 |
| 1.2 试验仪器与试剂 |
| 1.2.1 主要试验仪器 |
| 1.2.2 试验试剂 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 CircRNA-miRNA-mRNA关联性分析 |
| 1.3.2 功能注释与富集分析 |
| 1.3.3 荧光素酶报告基因载体构建及鉴定 |
| 1.3.4 细胞转染及双荧光素酶活性检测 |
| 1.3.5 RT-qPCR检测 |
| 1.3.6 Western blot分析 |
| 1.3.7 组织免疫荧光染色(间接法) |
| 1.3.8 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 CircRNA/miRNA/mRNA关联性分析 |
| 2.2 ceRNA网络中mRNAs的功能富集分析 |
| 2.3 CircRNA-miRNA-mRNA网络构建 |
| 2.4 Circ_015256/circ_029155-miR-760-3p-BOLL靶向关系验证 |
| 2.5 Circ_029155/miR-760-3p/BOLL在睾丸中的表达特征 |
| 2.6 BOLL蛋白在绵羊睾丸中的表达与分布特征 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 睾丸免疫特权维持相关基因的鉴定及其ceRNA调控网络研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物及样品 |
| 1.2 试验仪器与试剂 |
| 1.2.1 主要试验仪器 |
| 1.2.2 试验试剂 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 免疫相关差异表达基因鉴定与筛选 |
| 1.3.2 免疫相关miRNA-mRNA对及ceRNA共表达网络构建 |
| 1.3.3 RT-qPCR分析 |
| 1.3.4 Western blot分析 |
| 1.3.5 免疫荧光染色 |
| 1.3.6 双荧光素酶报告试验 |
| 1.3.7 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 性成熟前、后睾丸差异基因功能分类 |
| 2.2 免疫相关基因鉴定及表达特征分析 |
| 2.3 免疫相关差异基因的RT-qPCR验证 |
| 2.4 免疫相关基因编码蛋白的表达与定位 |
| 2.5 免疫相关基因功能注释分析 |
| 2.6 免疫相关基因的miRNA-mRNA调控网络分析 |
| 2.7 免疫相关差异miRNAs的RT-qPCR验证 |
| 2.8 免疫相关基因的circRNA-miRNA-mRNA互作网络分析 |
| 2.9 免疫相关差异表达circRNAs的RT-qPCR验证 |
| 2.10 靶向关系验证 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 CircKLHL5靶向miR-29b/IGF1信号轴对绵羊睾丸支持细胞发育的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物及样品采集 |
| 1.2 试验仪器与试剂 |
| 1.2.1 试验仪器 |
| 1.2.2 试验试剂 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 藏绵羊睾丸支持细胞的体外分离与纯化 |
| 1.3.2 支持细胞纯度鉴定 |
| 1.3.3 载体构建、细胞培养与转染 |
| 1.3.4 支持细胞核质分离 |
| 1.3.5 CircHLHL5成环鉴定 |
| 1.3.6 CCK-8分析 |
| 1.3.7 EdU染色 |
| 1.3.8 RT-qPCR |
| 1.3.9 Western blot |
| 1.3.10 细胞免疫荧光染色(间接法) |
| 1.3.11 酪胺信号放大-荧光原位杂交(TSA-FISH) |
| 1.3.12 流式检测细胞凋亡 |
| 1.3.13 双荧光素报告基因检测 |
| 1.3.14 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 Circ_026259/miR-29b/IGF1轴的组织表达特征 |
| 2.2 绵羊睾丸支持细胞形态及免疫荧光鉴定 |
| 2.3 睾丸支持细胞中circKLHL5的鉴定 |
| 2.4 CircKLHL5转染效率检测 |
| 2.5 CircKLHL5可促进绵羊睾丸支持细胞增殖并抑制其凋亡 |
| 2.6 CircKLHL5与miR-29b靶向关系验证 |
| 2.7 Oar-miR-29b对睾丸支持细胞增殖和凋亡的影响 |
| 2.8 Oar-miR-29b与IGF1基因间靶向关系验证 |
| 2.9 IGF1转染效率检测 |
| 2.10 IGF1基因对支持细胞增殖和凋亡的影响 |
| 2.11 Oar-miR-29b可逆转circKLHL5对支持细胞表型的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第六章 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（3）性成熟前和性成熟水牛睾丸支持细胞差异蛋白质组学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 重要缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 睾丸支持细胞的研究进展 |
| 1.1.1 支持细胞的生物学特性 |
| 1.1.2 支持细胞的功能 |
| 1.1.3 支持细胞的蛋白质标记物 |
| 1.2 蛋白质组学在睾丸支持细胞研究中的应用 |
| 1.2.1 蛋白质组学的研究进展 |
| 1.2.2 睾丸支持细胞相关蛋白质组学研究进展 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 第二章 水牛睾丸支持细胞的分离纯化与鉴定 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 水牛睾丸 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂及耗材 |
| 2.1.4 主要溶液配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 水牛睾丸免疫组织化学荧光分析 |
| 2.2.2 水牛睾丸支持细胞的分离 |
| 2.2.3 支持细胞的纯化方法 |
| 2.2.4 支持细胞传代培养 |
| 2.2.5 支持细胞的鉴定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 支持细胞WT1抗体特异性鉴定 |
| 2.3.2 水牛睾丸组织酶解效果 |
| 2.3.3 支持细胞的纯化结果 |
| 2.3.4 水牛睾丸支持细胞的鉴定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 性成熟前和性成熟水牛睾丸支持细胞的差异蛋白质组学分析 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 主要仪器设备 |
| 3.1.3 主要试剂及耗材 |
| 3.1.4 主要溶液配制 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 支持细胞蛋白样品的制备 |
| 3.2.2 支持细胞蛋白质浓度的测定(BCA法) |
| 3.2.3 蛋白质的酶切 |
| 3.2.4 SDS-PAGE电泳 |
| 3.2.5 利用Sep-Pak~RC_(18)纯化柱纯化总肽段 |
| 3.2.6 肽段iTRAQ标记 |
| 3.2.7 反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离 |
| 3.2.8 利用Ziptip C18柱对分离馏分脱盐 |
| 3.2.9 LC-MS/MS分析 |
| 3.2.10 数据检索 |
| 3.2.11 Western Blot |
| 3.2.12 免疫荧光 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 支持细胞蛋白提取及酶切效果 |
| 3.3.2 肽段预分离结果 |
| 3.3.3 差异蛋白质组质谱鉴定结果 |
| 3.3.4 差异蛋白层次聚类分析 |
| 3.3.5 差异蛋白功能注释 |
| 3.3.6 蛋白结构域分析 |
| 3.3.7 信号通路分析 |
| 3.3.8 蛋白质相互作用(PPI)分析 |
| 3.3.9 差异蛋白的质谱数据验证 |
| 3.3.10 差异蛋白的亚细胞定位分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（4）牛睾丸组织冻存体系的优化及应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 综述部分 |
| 第1章 睾丸组织冷冻保存研究进展 |
| 1.1 睾丸组织冷冻保存的方法 |
| 1.2 睾丸组织冷冻保护剂的应用 |
| 1.3 冷冻保存对睾丸组织的影响 |
| 1.4 结语 |
| 第2章 睾丸组织冷冻保存技术的应用 |
| 2.1 SSCS的分离富集 |
| 2.2 SSCS的移植 |
| 2.3 睾丸组织培养 |
| 2.4 睾丸组织移植 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第1章 海藻糖对牛睾丸组织冷冻保存的影响 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 冷冻保存犊牛睾丸组织的体外培养 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 冷冻保存牛睾丸组织微细结构观察及TC鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 冷冻保存犊牛睾丸组织的移植 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（5）猪GRP多克隆抗体的制备与应用及其对Leydig cells睾酮分泌的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 文献综述: 胃泌素释放肽及其受体与睾丸间质细胞研究进展 |
| 1 胃泌素释放肽及其受体研究进展 |
| 1.1 胃泌素释放肽及其受体的发现 |
| 1.2 胃泌素释放肽及其受体在体内的表达 |
| 1.3 胃泌素释放肽及其受体在体内的功能研究 |
| 1.4 GRP多克隆抗体的制备 |
| 2 睾丸间质细胞研究进展 |
| 2.1 睾丸间质细胞 |
| 2.2 生殖相关激素睾酮 |
| 2.3 睾丸间质细胞的增殖与凋亡 |
| 3 研究目的及意义 |
| 第1章 猪胃泌素释放肽的原核表达及其多克隆抗体的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 仪器和试剂 |
| 1.2 重组载体的构建 |
| 1.3 融合蛋白pGRP的获得 |
| 1.4 多克隆抗体的制备 |
| 2 结果 |
| 2.1 pET32a(+)-pGRP重组载体的构建 |
| 2.2 His-tag-pGRP融合蛋白的获得 |
| 2.3. pGRP多克隆抗体的获得 |
| 3 讨论 |
| 第2章 GRP蛋白在猪体内的分布与表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1仪器和试剂 |
| 1.2 GRP在猪外周组织的分布情况 |
| 1.3 GRP蛋白在猪组织中的表达情况 |
| 2 结果 |
| 2.1 GRP在猪外周组织的分布情况 |
| 2.2 GRP蛋白在猪组织中的表达情况 |
| 3 讨论 |
| 第3章 GRP对猪睾丸间质细胞睾酮分泌和合成的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 仪器和试剂 |
| 1.2 细胞培养和处理 |
| 1.3 GRP对Leydig cells中GRPR表达的影响 |
| 1.4 GRP对猪Leydig cells睾酮分泌的影响 |
| 1.5 GRP对Leydig cells睾酮合成相关蛋白表达的影响 |
| 1.6 GRP对Leydig cells细胞增殖的影响 |
| 1.7 GRP对Leydig cells凋亡的影响 |
| 1.8 GRP对Leydig cells增殖和凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 1.9 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 GRPR在Leydig cells中的表达情况 |
| 2.2 GRP对猪Leydig cells睾酮分泌及睾酮合成相关蛋白的影响 |
| 2.3 GRP对猪Leydig cells细胞活性的影响 |
| 2.4 GRP对猪Leydig cells细胞凋亡的影响 |
| 2.5 GRP对猪Leydig cells中pPKA/PKA和pPKC/PKC蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（6）布鲁氏菌S19 bvfA基因缺失株免疫保护性及其与睾丸支持细胞互作组学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号与缩略语说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 布鲁氏菌病及其流行病学概况 |
| 1.1.1 布鲁氏菌病概述 |
| 1.1.2 布病流行病学特点 |
| 1.2 布鲁氏菌毒力因子研究进展 |
| 1.2.1 脂多糖 |
| 1.2.2 Ⅳ型分泌系统 |
| 1.2.3 BvrR/BvrS双组分调控系统 |
| 1.2.4 外膜蛋白 |
| 1.2.5 布鲁氏菌毒力因子在生殖疾病中的作用 |
| 1.2.6 布鲁氏菌毒力基因作为候选疫苗保护性抗原的研究 |
| 1.3 布鲁氏菌对宿主免疫反应的调节 |
| 1.3.1 布鲁氏菌与TLRs的识别 |
| 1.3.2 布鲁氏菌对先天免疫反应的调节 |
| 1.3.3 布鲁氏菌对适应性免疫反应的调节 |
| 1.3.4 布鲁氏菌OMPs的免疫反应 |
| 1.4 组学技术在布鲁氏菌疾病中的应用进展 |
| 1.4.1 转录组学 |
| 1.4.2 蛋白质组学 |
| 1.4.3 代谢组学 |
| 1.5 研究意义及技术路线 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.5 技术路线 |
| 第二章 临床布鲁氏菌分离株bvfA基因的分布频率及B.abortus S19ΔbvfA菌株的构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 临床布鲁氏菌分离株bvfA基因的检测 |
| 2.2.2 B.abortus S19△bvfA菌株的构建 |
| 2.2.3 B.abortus S19△bvfA/bvfA回补株的构建 |
| 2.2.4 GFP标记B.abortus S19及bvfA基因缺失株和回补株 |
| 2.2.5 bvfA基因的原核表达 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 毒力基因在临床布鲁氏菌分离株中的分布频率 |
| 2.3.2 B.abortus S19ΔbvfA菌株构建结果 |
| 2.3.3 B.abortus S19△bvfA/bvfA回补株构建结果 |
| 2.3.4 GFP标记B.abortus S19及bvfA基因缺失株和回补株结果 |
| 2.3.5 bvfA基因原核表达结果 |
| 2.4 讨论 |
| 小结 |
| 第三章 bvfA基因对B.abortus S19菌株及其宿主生物学特性的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株、细胞系和实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 B.abortus S19△bvfA菌株的生长曲线测定 |
| 3.2.2 B.abortus S19△bvfA菌株体外应激水平检测 |
| 3.2.3 B.abortus S19△bvfA菌株与TM4睾丸支持细胞的相互作用 |
| 3.2.4 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 bvfA基因缺失减弱了B.abortus S19△bvfA菌株体外增殖活性 |
| 3.3.2 bvfA基因缺失影响了布鲁氏菌的体外应激水平 |
| 3.3.3 B.abortus S19△bvfA菌株入侵和在TM4睾丸支持细胞内增殖能力减弱 |
| 3.3.4 布鲁氏菌没有影响TM4睾丸支持细胞的增殖活性 |
| 3.3.5 B.abortus S19△bvfA菌株对早期感染的TM4睾丸支持细胞杀伤力强 |
| 3.3.6 B.abortus S19△bvfA菌株对小鼠毒力降低 |
| 3.4 讨论 |
| 小结 |
| 第四章 B.abortus S19△bvfA菌株的免疫原性和免疫保护性 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 菌株与试验动物 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 菌株制备 |
| 4.2.2 制备血清 |
| 4.2.3 抗体水平检测 |
| 4.2.4 细胞因子水平检测 |
| 4.2.5 BvfA蛋白与B.abortus S19AbvfA菌株免疫小鼠血清反应性检测 |
| 4.2.6 B.abortus S19△bvfA菌株免疫保护性检测 |
| 4.2.7 B.abortus S19△bvfA菌株对小鼠脾脏和睾丸的毒性和病理损伤研究 |
| 4.2.8 统计学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 B.abortus S19△bvfA菌株免疫小鼠血清抗体水平 |
| 4.3.2 B.abortus S19△bvfA菌株免疫小鼠血清细胞因子水平的变化 |
| 4.3.3 BvfA蛋白具有区分疫苗免疫和野生毒株感染的能力 |
| 4.3.4 B.abortus S19△bvfA菌株具有针对强毒株攻击的免疫保护作用 |
| 4.3.5 B.abortus S19△bvfA菌株对小鼠脾脏和睾丸的毒性较低 |
| 4.3.6 B.abortus S19AbvfA菌株对小鼠脾脏和睾丸的病理损伤减小 |
| 4.4 讨论 |
| 小结 |
| 第五章 组学分析bvfA基因在B.abortus S19中的作用 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 菌株和细胞系 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 细菌总RNA的提取 |
| 5.2.2 转录组测序 |
| 5.2.3 细菌总蛋白质的提取 |
| 5.2.4 Label free蛋白组学技术 |
| 5.2.5 细菌总代谢物的提取 |
| 5.2.6 LC-MS非靶代谢组学技术 |
| 5.2.7 统计分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 转录组质量评估结果 |
| 5.3.2 B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株转录组轮廓分析 |
| 5.3.3 B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株转录组学研究 |
| 5.3.4 布鲁氏菌菌体蛋白质的浓度与质量结果 |
| 5.3.5 B.abortus S19△bvfA菌体和B.abortus S19菌体总蛋白质组学研究 |
| 5.3.6 B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株代谢组学研究 |
| 5.3.7 转录组学与蛋白质组学技术关联分析bvfA基因在B.abortus S19中的作用 |
| 5.3.8 蛋白质学与代谢组学技术关联分析bvfA基因在B.abortus S19中的作用 |
| 5.4 讨论 |
| 小结 |
| 第六章 组学通路下bvfA基因对B.abortus S19感染TM4睾丸支持细胞的影响 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 菌株和细胞系 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 细胞样本准备 |
| 6.2.2 转录组测序和转录组质量评估 |
| 6.2.3 蛋白质和代谢产物的提取 |
| 6.2.4 Label free蛋白组学技术和LC-MS非靶代谢组学技术 |
| 6.2.5 平行反应监测和Westen blot对蛋白表达量验证 |
| 6.2.6 统计分析和可视化 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 RNA质量分析 |
| 6.3.2 转录组学揭示bvfA基因在B.abortus S19菌株感染TM4睾丸支持细胞中的作用 |
| 6.3.3 蛋白质组学揭示bvfA基因在B.abortus S19菌株感染TM4睾丸支持细胞中的作用 |
| 6.3.4 代谢组学揭示bvfA基因在B.abortusS19菌株感染TM4睾丸支持细胞中的作用 |
| 6.3.5 转录组学与蛋白质组学关联分析感染B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株TM4睾丸支持细胞差异表达基因功能 |
| 6.3.6 蛋白质组学与代谢组学关联分析感染B.abortus S19△bvfA菌株B.abortusS19菌株TM4睾丸支持细胞差异表达基因功能 |
| 6.3.7 感染B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株的TM4睾丸支持细胞差异蛋白质验证 |
| 6.4 讨论 |
| 小结 |
| 第七章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简介 |
（7）VD3/VDR对小鼠睾丸与肾脏的抗衰老作用评价及机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 衰老的研究进展 |
| 1.1.1 衰老的定义 |
| 1.1.2 环境伤害导致衰老的学说 |
| 1.1.3 遗传因素导致衰老的学说 |
| 1.2 维生素D的研究进展 |
| 1.2.1 维生素D的结构 |
| 1.2.2 维生素D受体的结构 |
| 1.2.3 VDR的生物学功能 |
| 1.3 维生素D与衰老 |
| 1.3.1 维生素D抗衰老的途径 |
| 1.3.2 维生素D在肠道钙吸收中的代谢和活性 |
| 1.3.3 维生素D在肾脏中的代谢和活性 |
| 1.3.4 维生素D在肌肉骨骼系统中的代谢和活性 |
| 1.3.5 维生素D、细胞衰老与端粒生物学 |
| 1.4 研究目的意义 |
| 第2章 VDR~(-/-)雄性小鼠生殖衰老相关基因表达分析 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验动物、细胞及质粒 |
| 2.1.2 主要试剂及材料 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 主要试剂配制方法 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 衰老相关生化指标测定 |
| 2.2.2 WT和VDR~(-/-)小鼠睾丸组织转录组测序分析 |
| 2.2.3 WT和VDR~(-/-)小鼠DNA损伤修复相关基因表达检测 |
| 2.2.4 VDR超表达HEK293T细胞 |
| 2.2.5 VDR超表达HEK293T细胞DNA损伤修复相关基因表达检测 |
| 2.2.6 统计学方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 WT与VDR~(-/-)小鼠衰老相关生化指标检测 |
| 2.3.2 WT和VDR~(-/-)雄鼠睾丸组织转录组测序分析 |
| 2.3.3 VDR超表达HEK293T细胞 |
| 2.3.4 VDR超表达HEK293T细胞中DNA损伤修复相关基因表达 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 VD_3对D-Gal亚急性衰老小鼠抗衰老作用评价 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试验动物 |
| 3.1.2 主要试剂及材料 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 主要试剂配制方法 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 实验动物模型的建立 |
| 3.2.2 脏器系数计算 |
| 3.2.3 组织形态学检测 |
| 3.2.4 衰老β-半乳糖苷酶染色检测 |
| 3.2.5 衰老相关生化指标测定 |
| 3.2.6 统计学处理 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 小鼠形态特征与体重观察 |
| 3.3.2 小鼠睾丸与肾脏组织形态观察 |
| 3.3.3 脏器系数 |
| 3.3.4 小鼠睾丸与肾脏组织衰老相关β半乳糖苷酶染色鉴定 |
| 3.3.5 小鼠睾丸与肾脏组织结构比较 |
| 3.3.6 小鼠衰老相关老生化指标差异 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 VD_3/VDR对小鼠睾丸与肾脏的抗衰老作用机理研究 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 试验动物 |
| 4.1.2 主要试剂及材料 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.1.4 主要试剂配制方法 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 衰老相关基因启动子VDR应答元件分析 |
| 4.2.2 衰老相关基因表达分析 |
| 4.2.3 Western blot检测衰老相关蛋白表达 |
| 4.2.4 统计学处理 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 VD_3促进衰老小鼠组织中VDR的表达 |
| 4.3.2 VD_3/VDR抑制细胞增殖相关基因表达 |
| 4.3.3 VD_3/VDR促进DNA损伤修复延缓衰老 |
| 4.3.4 VD_3/VDR抑制炎症反应延缓衰老 |
| 4.3.5 VD_3/VDR减少氧化应激延缓衰老 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 主要试剂及材料 |
| 附录2 主要仪器设备 |
| 攻读硕士期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（8）PRM1在非小细胞肺癌中的表达及生物学作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肺癌的研究进展 |
| 1.1.1 肺癌的分类 |
| 1.1.2 非小细胞肺癌的诊断 |
| 1.1.3 非小细胞肺癌的治疗 |
| 1.2 肿瘤-睾丸抗原(CTA)的研究进展 |
| 1.2.1 CTA分类及特征 |
| 1.2.2 CTA表达调控 |
| 1.2.3 CTA作用和功能 |
| 1.2.4 配子发生与恶性生殖 |
| 1.2.5 CTA在恶性肿瘤中的诊断价值 |
| 1.2.6 肿瘤疫苗和免疫治疗 |
| 1.3 人鱼精蛋白1(PRM1) |
| 1.3.1 PRM1 的作用 |
| 1.3.2 PRM1 与恶性肿瘤 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验设备和试剂 |
| 2.1.1 实验设备 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验细胞和动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 临床样本的收集 |
| 2.2.2 RT-PCTR法检测样本mRNA水平 |
| 2.2.3 免疫组织化学染色(IHC) |
| 2.2.4 酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 2.2.5 细胞株复苏与培养 |
| 2.2.6 非小细胞肺癌细胞株活力检测 |
| 2.2.7 非小细胞肺癌细胞在不同血清浓度下孵育 |
| 2.2.8 质粒转染和RNA干扰 |
| 2.2.9 人源重组PRM1 蛋白孵育实验 |
| 2.2.10 CCK8 法检测细胞增殖 |
| 2.2.11 EdU法检测细胞增殖实验 |
| 2.2.12 动物实验 |
| 2.3 统计学方法 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 PRM1 在非小细胞肺癌肿瘤组织和外周血中的表达 |
| 3.1.1 非小细胞肺癌肿瘤组织与配对正常组织PRM1-mRNA水平的差异 |
| 3.1.2 非小细胞肺癌肿瘤组织中PRM1 蛋白水平及临床相关性 |
| 3.1.3 非小细胞肺癌患者外周血中PRM1 蛋白水平及与临床特征的相关性 |
| 3.2 PRM1 诊断价值的评估 |
| 3.2.1 外周血PRM1 蛋白水平对非小细胞肺癌的诊断价值 |
| 3.2.2 PRM1 在肺腺癌中诊断价值的评估 |
| 3.2.3 PRM1 在肺鳞癌中诊断价值的评估 |
| 3.2.4 PRM1 在组合标志物中诊断价值的评估 |
| 3.2.5 PRM1 对不同分期的非小细胞肺癌的诊断价值评估 |
| 3.2.6 PRM1 在Ⅰ-Ⅱ期肺鳞癌和肺腺癌中的诊断价值 |
| 3.3 PRM1 在非小细胞肺癌中生物学作用的研究-细胞学实验 |
| 3.3.1 PRM1 在非小细胞肺癌细胞株中的表达 |
| 3.3.2 PRM1 基因过表达和敲低对非小细胞肺癌细胞株增殖的影响 |
| 3.3.3 外源性PRM1 重组蛋白和PRM1 抗体对非小细胞肺癌细胞增殖的影响 |
| 3.3.4 细胞营养状态对PRM1 表达水平的影响 |
| 3.3.5 PRM1对A549、NCI-H460 细胞的细胞周期和凋亡的影响 |
| 3.4 PRM1 在非小细胞肺癌中生物学作用研究-动物学实验 |
| 3.4.1 构建A549 细胞裸鼠转移瘤模型 |
| 3.4.2 非小细胞肺癌细胞A549 转移瘤裸鼠血清中PRM1 表达水平 |
| 3.4.3 外源性PRM1 重组蛋白和PRM1 抗体对肿瘤生长曲线的影响 |
| 3.4.4 外源性PRM1 重组蛋白和PRM1 抗体对肿瘤体积和重量的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（9）藏绵羊睾酮合成相关基因在睾丸和附睾中的表达特征及生物学功能（论文提纲范文）
| 缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Summary |
| 第一章 绪论 |
| 1 睾丸与附睾 |
| 2 间质细胞发育及睾酮生成调控机制 |
| 3 睾酮合成相关基因研究进展 |
| 3.1 STAR基因 |
| 3.2 CYP11A1和CYP17A1 基因 |
| 3.2.1 CYP11A1 基因 |
| 3.2.2 CYP17A1 基因 |
| 3.3 HSD3B1和HSD17B3 基因 |
| 3.3.1 HSD3B1 基因 |
| 3.3.2 HSD17B3 基因 |
| 3.4 GLOD4 基因 |
| 4 研究目的与意义 |
| 第二章 睾酮合成相关基因在藏绵羊睾丸中的表达特征 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物及组织样品收集 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 组织总RNA提取 |
| 1.4.2 cDNA合成 |
| 1.4.3 引物设计与合成 |
| 1.4.4 qRT-PCR |
| 1.4.5 总蛋白提取 |
| 1.4.6 蛋白浓度测定与变性 |
| 1.4.7 WesternBlot |
| 1.4.8 免疫荧光染色定位蛋白分布 |
| 1.5 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 睾酮合成相关基因mRNA在藏绵羊睾丸组织中的表达模式 |
| 2.2 藏绵羊睾丸组织中睾酮合成相关基因蛋白的表达 |
| 2.3 藏绵羊睾丸组织中睾酮合成相关基因蛋白的免疫定位 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 睾酮合成相关基因在藏绵羊附睾中的表达特征 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物及组织样品收集 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.5 数据统计与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 藏绵羊附睾组织中睾酮合成相关基因mRNA的表达 |
| 2.1.1 藏绵羊附睾头中睾酮合成相关基因mRNA的表达 |
| 2.1.2 藏绵羊附睾体组织中睾酮合成相关基因mRNA的表达 |
| 2.1.3 藏绵羊附睾尾组织中睾酮合成相关基因mRNA的表达 |
| 2.2 藏绵羊附睾组织中睾酮合成相关基因蛋白的表达 |
| 2.2.1 藏绵羊附睾头中睾酮合成相关基因蛋白的表达 |
| 2.2.2 藏绵羊附睾体中睾酮合成相关基因蛋白的表达 |
| 2.2.3 藏绵羊附睾尾中睾酮合成相关基因蛋白的表达 |
| 2.3 藏绵羊附睾组织中睾酮合成相关基因蛋白的定位 |
| 2.3.1 藏绵羊附睾头中睾酮合成相关基因蛋白的定位 |
| 2.3.2 藏绵羊附睾体组织中睾酮合成相关基因蛋白的定位 |
| 2.3.3 藏绵羊附睾尾中睾酮合成相关基因蛋白的定位 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 miR-190-3p和 miR-363-3p与 HSD17B3 靶标关系验证 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要方法 |
| 1.3.1 组织总RNA提取 |
| 1.3.2 第一链c DNA合成 |
| 1.3.3 qRT-PCR |
| 1.3.4 HSD17B3 3'-UTR野生型及突变型序列的设计 |
| 1.3.5 HSD17B3 3′-UTR野生型(WT)和突变型(MUT)重组载体的构建和鉴定 |
| 1.3.6 miRNA模拟物化学合成 |
| 1.3.7 细胞转染 |
| 1.3.8 双荧光素酶活性检测 |
| 1.3.9 统计学分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 潜在调控HSD17B3的miRNAs在雄性生殖器官中的表达特征 |
| 2.1.1 oar-miR-190-3p在藏绵羊睾丸和附睾组织的表达情况 |
| 2.1.2 oar-miR-363-3p在藏绵羊睾丸和附睾组织的表达情况 |
| 2.1.3 HSD17B3与miRNAs在藏绵羊睾丸和附睾组织中表达的相关性分析 |
| 2.2 重组质粒的鉴定结果 |
| 2.3 双荧光素酶活性检测结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在读期间发表论文和研究成果等 |
| 导师简介 |
（10）桂药生精胶囊对不育症大鼠睾丸组织Bcl-2/Bax、Caspase-9/3表达的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 实验研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药物与试剂 |
| 1.3 实验材料与仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 模型制备与分组 |
| 2.2 干预治疗 |
| 2.3 标本采集 |
| 3 检测指标 |
| 3.1 精子参数检测 |
| 3.2 睾丸组织处理 |
| 3.3 苏木精-伊红染色法 |
| 3.4 免疫组织化学染色法 |
| 4 统计学处理 |
| 第二章 实验结果 |
| 1 大鼠睾丸病理学观察 |
| 2 大鼠体质量 |
| 3 大鼠睾丸及附睾质量 |
| 4 大鼠精子参数 |
| 5 大鼠睾丸组织Bcl-2的表达情况 |
| 6 大鼠睾丸组织Bax的表达情况 |
| 7 大鼠睾丸组织Caspase-9的表达情况 |
| 8 大鼠睾丸组织Caspase-3的表达情况 |
| 第三章 讨论 |
| 1 现代医学对不育症的认识 |
| 1.1 病因及发病机制 |
| 1.2 治疗方法 |
| 2 中医对不育症的认识 |
| 2.1 病因病机 |
| 2.2 辨证论治 |
| 2.3 环磷酰胺对中医证候模型的影响 |
| 3 不育症与Bcl-2/Bax、Caspase-9/3信号通路之间的关系探讨 |
| 4 睾丸组织对精子发育的影响 |
| 5 桂药生精胶囊的组成与功效 |
| 结论 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 综述 中医药治疗男性不育症的研究近况 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历及攻读学位期间获得的科研成果 |
四、睾丸免疫的研究进展（论文参考文献）
- [1]多聚嘧啶束结合蛋白1对小鼠血睾屏障完整性和支持细胞自噬的影响[D]. 杨喆. 贵州医科大学, 2021(02)
- [2]基于转录组学的藏绵羊睾丸功能基因鉴定及其表达调控[D]. 李讨讨. 甘肃农业大学, 2021(01)
- [3]性成熟前和性成熟水牛睾丸支持细胞差异蛋白质组学研究[D]. 汤玉燕. 广西大学, 2021(12)
- [4]牛睾丸组织冻存体系的优化及应用[D]. 朱文倩. 吉林大学, 2021(01)
- [5]猪GRP多克隆抗体的制备与应用及其对Leydig cells睾酮分泌的影响[D]. 郭军培. 扬州大学, 2021
- [6]布鲁氏菌S19 bvfA基因缺失株免疫保护性及其与睾丸支持细胞互作组学研究[D]. 贾芳. 宁夏大学, 2021(02)
- [7]VD3/VDR对小鼠睾丸与肾脏的抗衰老作用评价及机理研究[D]. 赵浩名. 陕西理工大学, 2021
- [8]PRM1在非小细胞肺癌中的表达及生物学作用研究[D]. 李小丰. 吉林大学, 2021(01)
- [9]藏绵羊睾酮合成相关基因在睾丸和附睾中的表达特征及生物学功能[D]. 王霞. 甘肃农业大学, 2021
- [10]桂药生精胶囊对不育症大鼠睾丸组织Bcl-2/Bax、Caspase-9/3表达的影响[D]. 梁景辉. 广西中医药大学, 2021(02)