一、HPLC在杀虫剂表皮穿透研究中的应用（论文文献综述）
乔建文[1]（2021）在《豌豆蚜表皮碳氢化合物合成和转运相关基因的功能研究》文中提出昆虫表皮碳氢化合物（Cuticular hydrocarbon,CHC）作为与外界环境直接接触的第一道屏障,在诸多方面对昆虫起到保护作用,比如:在干旱环境下防止陆生昆虫体内水分通过表皮蒸发流失和阻挡外源微生物细菌、真菌和病毒对昆虫的侵入。另外,昆虫CHC作为昆虫性信息素的物质基础,在昆虫进行物种和性别识别以及雌雄交配等社会行为方面至关重要。因此,本论文主要聚焦于影响CHC合成、转运和接收三方面,通过对豌豆蚜中NADPH-细胞色素P450还原酶（cytochrome P450 reductase,CPR）、载脂蛋白D（apolipoprotein D,ApoD）和脂蛋白受体（lipophorin receptor,LpR）三个基因进行分子鉴定和表征以及功能研究,发现CPR、ApoD和LpR都对豌豆蚜CHC的积累和干旱耐受性起到调控作用,同时还发现ApoD和LpR对豌豆蚜的生殖力产生重要影响。主要研究结果如下:1.在调控CHC合成的豌豆蚜CPR（Acyrthosiphon pisum CPR,ApCPR）基因研究方面:首先对ApCPR基因的分子特征和蛋白功能域进行了表征以及通过构建系统发育树对其进化关系进行了阐明。其次,对豌豆蚜干旱胁迫处理后,发现ApCPR基因的表达量与对照组相比显着上调。接着,在获得ApCPR基因的最佳dsRNA注射剂量为1.82μg和在该剂量下ApCPR沉默效应持续5天的基础上,通过GC-MS对dsRNA注射后第3、4和5天的豌豆蚜CHC和内部碳氢化合物（Internal hydrocarbon,IHC）含量进行了测定,发现ApCPR的沉默导致豌豆蚜CHC和IHC含量显着降低,同时还对CHC和IHC的组分进行了鉴定和定量,结果表明豌豆蚜CHC是由9种C25-C33的正构烷烃组成,而IHC中除了正构烷烃还包含大量带有甲基支链的HCs,并且ApCPR基因沉默对豌豆蚜CHC和IHC中不同的组分影响不同。然后,在ApCPR基因沉默导致豌豆蚜CHC含量显着降低后,通过扫描电镜观察到处理组蚜虫腹部体表与对照组相比显得平整干净和覆盖少量脂质物质以及在干旱环境下存活时间明显缩短。最后,在获得三种农药杀虫剂毒死蜱、吡虫啉和高效氯氰菊酯的LC50值的基础上,在ApCPR基因表达被抑制的豌豆蚜腹部表皮涂抹0.3μL杀虫剂溶液,结果表明ApCPR基因沉默导致豌豆蚜对三种农药杀虫剂敏感性增加,与对照组相比死亡率显着升高。因此,ApCPR具有成为蚜虫防治新靶标的潜力。2.在调控CHC转运的豌豆蚜ApoD（Acyrthosiphon pisum ApoD,ApApoD）基因研究方面:首先对ApApoD基因的分子特征和蛋白功能域进行了表征以及与其它代表性昆虫的蛋白结构进行比较和构建系统发育树分析了其进化关系。其次,在干旱胁迫条件下,发现ApApoD基因的表达显着上调。接着,对ApApoD基因的RNAi参数进行了优化,在最佳dsRNA注射剂量为1.21μg和沉默效应持续5天的基础上,收取dsRNA注射后第3天的豌豆蚜通过GC-MS对其CHC和IHC含量进行测定,结果发现两者的含量均显着下降且对其CHC和IHC中的不同组分影响不同。然后,发现ApApoD基因沉默导致豌豆蚜在干旱环境下存活时间明显缩短,干旱耐受性显着下降。最后,ApApoD基因沉默导致豌豆蚜成虫生殖力显着下降,具体表现为与对照组相比产生新生若蚜时间推迟和累积平均生殖量较低以及胚胎数量减少和发育迟缓。因此,ApApoD基因可能成为基于RNAi技术的蚜虫防治新靶标。3.在调控CHC接收的豌豆蚜LpR（Acyrthosiphon pisum LpR,ApLpR）基因研究方面:首先将ApLpR基因的蛋白功能域与其它代表性昆虫的LpR进行了比较和通过构建系统发育树对其进化关系进行了分析。其次,在干旱胁迫下,发现ApLpR mRNA的丰度显着上调。接着,获得ApLpR的最佳dsRNA注射剂量为1.21μg和在该剂量下ApLpR沉默效应能够保持4天,在此基础上,对dsRNA注射后第3天的豌豆蚜CHC和IHC含量通过GC-MS进行了测定,发现CHC和IHC含量显着降低,并且对豌豆蚜CHC和IHC的组分进行了鉴定和定量,发现ApLpR基因沉默对它们不同的组分影响不同。然后,在干旱胁迫下,发现ApLpR基因沉默导致豌豆蚜干旱耐受性显着下降。最后,ApLpR基因沉默还导致豌豆蚜成虫生殖力显着下降。因此,ApLpR基因可能成为用于蚜虫防治的RNAi新靶标。综上所述,本工作系统地研究了调控豌豆蚜CHC合成、转运和接收的三个基因ApCPR、ApApoD和ApLpR的分子特征和功能特性,揭示了它们在豌豆蚜CHC含量积累和干旱耐受性方面的重要调控作用以及ApApoD和ApLpR对豌豆蚜成虫生殖力的重要影响,不仅为后续进一步研究它们在CHC合成、转运和接收以及豌豆蚜生殖力上的调控机制提供了基础,也为基于RNAi技术的蚜虫防治提供了潜在靶标。
温胜芳[2]（2021）在《灰飞虱对三氟苯嘧啶的抗性风险评估及代谢抗性机制初探》文中研究说明灰飞虱（Laodelphax striatellus,SBPH）是危害水稻、玉米和小麦的主要刺吸式口器害虫之一。三氟苯嘧啶是美国杜邦公司研发的新型介离子类杀虫剂,对灰飞虱具有很好的活性。但是灰飞虱对三氟苯嘧啶的抗性风险以及抗性机理方面的研究较少。为了评价灰飞虱对三氟苯嘧啶的抗性风险,在室内,使用三氟苯嘧啶对灰飞虱相对敏感品系进行连续抗性选育,筛选出灰飞虱抗三氟苯嘧啶品系,测定了其抗性现实遗传力、抗性稳定性、交互抗性以及生物适合度。进一步测定并比较了抗性品系和相对敏感品系体内三种解毒代谢酶活性和细胞色素P450基因表达量,初步探讨了灰飞虱对三氟苯嘧啶产生抗性的代谢机制。研究结果表明,三氟苯嘧啶对灰飞虱连续汰选21代后,LC50值从0.5529 mg·L-1上升到14.4563 mg·L-1,抗性倍数上升至26.15倍,达到中抗水平。其中,从F0到F8代,抗性发展缓慢,抗性倍数仅增至3.25倍,从F8到F21代,抗性发展呈快速上升趋势,抗性倍数从3.25倍增至26.15倍。灰飞虱对三氟苯嘧啶的抗性风险评估研究结果表明,灰飞虱对三氟苯嘧啶的抗性现实遗传力为0.0928,当筛选压力达到90%时,灰飞虱对三氟苯嘧啶的抗性上升10倍仅需8代。抗性稳定性结果表明,抗性品系在无药条件下连续饲养5代后,LC50值从7.1822mg·L-1下降到6.0525 mg·L-1,抗性倍数下降2.04倍,抗性衰退速率为0.0149。交互抗性结果表明,抗三氟苯嘧啶灰飞虱品系与吡虫啉、烯啶虫胺、噻虫嗪、呋虫胺、氟啶虫酰胺、吡蚜酮以及溴氰虫酰胺均没有交互抗性。生物适合度结果表明,抗性品系的适合度代价为0.89。与相对敏感品系相比,抗性品系的3龄和5龄若虫历期、成虫前期、成虫产卵前期、寿命、羽化率以及孵化率显着降低,雌雄比显着升高;而抗性品系的繁殖力、预期寿命、固有增长率（r）、有限增长率（λ）、净生殖率（R0）和平均世代时间（T）虽略有下降,但无显着差异。三氟苯嘧啶抗性和敏感品系代谢酶活性测定结果表明,与敏感品系相比,抗性品系细胞色素P450单加氧酶（CYP450M）和羧酸酯酶（Car E）的活性显着升高,分别是敏感品系的1.71倍和1.16倍;但谷胱甘肽S-转移酶（GST）的活性无差异。酶抑制剂测定结果表明,酶抑制剂PBO对抗性和敏感品系均有显着的增效作用,增效倍数分别为1.88和1.52倍,抗性品系增效更明显;酶抑制剂TPP和DEM对抗性和敏感品系均无明显的增效作用。细胞色素P450基因表达量测定发现,与敏感品系相比,抗性品系中的CYP4CE2和CYP4C78基因存在明显过量表达。其中,CYP4CE2基因在抗性品系中的表达量是敏感品系的8.92倍。综合研究结果,灰飞虱对三氟苯嘧啶的抗性可能与CYP4CE2基因的过量表达导致CYP450M活性升高有关。
李一帆[3]（2021）在《小菜蛾解毒酶对4类化合物的作用机理研究》文中进行了进一步梳理小菜蛾Plutella xylostella（L.）是十字花科作物的重要害虫,具有分布广、世代短、繁殖快、抗药性发展迅速等特点,给蔬菜生产造成了巨额的经济损失。由于化学杀虫剂的不合理使用,导致小菜蛾对目前市面上所有类型的杀虫剂都产生了不同程度的抗药性,所以探究小菜蛾对杀虫剂的抗药性机理迫在眉睫。解毒酶介导的代谢抗性在小菜蛾对杀虫剂的抗药性机理中尤为重要,但小菜蛾解毒酶对很多杀虫剂解毒代谢的分子机制尚不明确。因此,研究小菜蛾解毒酶的作用机理对解决小菜蛾的抗药性问题具有重要科学价值和应用前景。本研究通过解毒酶活性分析的方法,研究了小菜蛾解毒酶对斑蝥素的解毒代谢功能;采用分子生物学实验和计算机分子模拟结合的手段研究了小菜蛾谷胱甘肽-S-转移酶（PxGSTs）对唑虫酰胺（TFP）解毒代谢的分子机理;联合使用同源模建、分子动力学（MD）模拟、单残基能量分解、计算丙氨酸扫描（CAS）等方法,以谷胱甘肽-S-转移酶（GST）抑制剂——S-己基谷胱甘肽（GTX）为分子探针分析了PxGSTs与化合物的相互作用方式以及结合的关键氨基酸;通过蛋白质三维结构模建、分子对接、分子动力学模拟等技术联合分子生物学实验,阐明了小菜蛾羧酸酯酶（PxEst-6）代谢4种拟除虫菊酯（联苯菊酯,氟氯氰菊酯,氯氰菊酯和λ-氯氟氰菊酯）的分子机理。主要研究结果如下:1.小菜蛾解毒酶系对斑蝥素的解毒代谢目前关于小菜蛾对生物源杀虫剂的解毒代谢已有大量的报道,但是相关研究还未涉及小菜蛾对斑蝥素的解毒代谢。我们通过对小菜蛾解毒酶系（谷胱甘肽-S-转移酶,羧酸酯酶和细胞色素P450酶）和PSPs酶系活性的测定,发现亚致死剂量的斑蝥素处理后小菜蛾体内PSPs的活性呈现出随时间先降低后逐步恢复的趋势;而小菜蛾体内解毒酶系的活性呈现出先降低后升高的趋势（P450酶活性的升高最为显着）,且解毒酶系活性升高的趋势与PSPs酶系活性恢复的趋势相同。该结果表明小菜蛾解毒酶能够在体内对斑蝥素解毒代谢,并使PSPs被抑制的活性逐渐恢复,该研究结果填补了小菜蛾解毒酶系对斑蝥素的解毒代谢功能的空白。2.小菜蛾PxGSTs对唑虫酰胺的解毒代谢作用关于昆虫GSTs在唑虫酰胺解毒代谢中的作用目前还知之甚少。我们以小菜蛾为研究对象通过RT-q PCR分析发现,小菜蛾在经唑虫酰胺处理后PxGSTs（PxGSTδ、PxGSTσ和PxGSTε）的表达量明显上调。体外抑制实验和代谢实验发现,唑虫酰胺对PxGSTs具有一定的抑制效果,并且PxGSTs能够在体外代谢唑虫酰胺,其中PxGSTσ具有最高的代谢效率。基于分子对接的结合模式分析结果表明,Tyr107和Tyr162侧链提供的氢键是PxGSTσ代谢唑虫酰胺的关键相互作用。对Tyr107（PxGSTσY107A）和Tyr162（PxGSTσY162A）位点进行丙氨酸定点突变后发现,突变体蛋白对唑虫酰胺的结合和代谢能力大幅度下降,揭示了PxGSTs和唑虫酰胺之间的代谢相互作用,并阐明了PxGSTσ对唑虫酰胺代谢的分子机理,为新型唑虫酰胺类杀虫剂的设计和优化提供了新的方法。3.小菜蛾PxGSTs与其抑制剂GTX的相互作用昆虫GSTs参与了多种杀虫剂的代谢抗性,以GST抑制剂GTX为分子探针可以揭示杀虫剂抑制昆虫GSTs的分子机理。我们采用同源性模建和分子对接的方法构建了PxGSTσ与GTX分子的三维结构模型（PxGSTσ-GTX）,并通过分子动力学（MD）模拟和结合自由能计算描述了PxGSTσ-GTX复合物的稳定性。通过结合自由能的分析发现,PxGSTσ-GTX复合物的形成和稳定主要由氨基酸残基侧链提供的氢键和疏水相互作用来驱动。通过丙氨酸扫描和定点诱变发现,Lys43和Arg99是PxGSTσ与GTX结合的关键氨基酸位点。并且结合唑虫酰胺与PxGSTσ相互作用的关键位点分析,发现Tyr107可能是化合物对PxGSTσ产生抑制作用的关键残基。该结果为研究现有杀虫剂抑制GST解毒酶系的分子机理提供了结构生物学的参照,为评估新型杀虫剂与GST解毒酶系的相互作用提供了理论指导。4.小菜蛾羧酸酯酶PxEst-6对拟除虫菊酯的代谢机理羧酸酯酶（Car Es）是昆虫体内一种涉及拟除虫菊酯抗药性的解毒酶。我们通过RT-q PCR分析发现,PxEst-6在小菜蛾三龄幼虫的中肠和表皮内高表达,在经4种拟除虫菊酯类杀虫剂（联苯菊酯,氟氯氰菊酯,氯氰菊酯和λ-氯氟氰菊酯）处理后,PxEst-6的表达量迅速上调。通过杀虫剂代谢实验发现PxEst-6具有代谢这4种拟除虫菊酯杀虫剂的能力。通过三维结构模建、分子对接和分子动力学模拟分析了PxEst-6与拟除虫菊酯的结合模式,揭示了参与代谢的关键氨基酸残基和相互作用方式,结果表明PxEst-6通过Gln431、His451和Lys458残基与拟除虫菊酯的乙酸酯基团发生极性或氢键相互作用从而对其进行代谢,并以丙氨酸定点突变对这一结果进行了验证,阐明了PxEst-6代谢拟除虫菊酯类杀虫剂的分子机理。
杨雪梅[4]（2021）在《ABC转运蛋白在二化螟对氯虫苯甲酰胺和阿维菌素解毒代谢中的作用研究》文中研究指明二化螟（Chilo suppressalis）是水稻作物上最主要的害虫之一。由于化学农药的不合理使用,导致二化螟对杀虫剂的抗药性迅速发展,进一步加大了防治难度。ABC转运蛋白（ATP-binding cassette transporter）是生物中最大的跨膜蛋白家族之一,广泛存在于古生菌、真细菌及真核生物中,能够对细胞中多种物质如脂类、氨基酸、多肽类、代谢产物、金属离子、毒素和化学治疗药物等进行跨膜转运。ABC转运蛋白参与对药物的吸收与排泄,而不经过其他酶的修饰,因此在药物代谢动力学机制上起重要作用。本研究利用RNA-Seq技术,对LC30亚致死剂量氯虫苯甲酰胺处理的二化螟幼虫进行比较转录组分析,探索氯虫苯甲酰胺对二化螟幼虫基因表达的影响。研究结果共鉴定出908个差异表达基因（DEGs）,其中441个基因表达上调,467个个基因表达下调。基因富集分析表明,下调的DEGs主要与糖类、能量、脂肪和氨基酸代谢及翻译后修饰有关,参与信号转导的大部分DEGs则上调表达。通过数据库检索,进一步将差异表达基因（DEGs）分类并富集在不同的功能类别和通路中,利用RT-qPCR对参与防御和解毒代谢的DEGs的表达变化进行验证。研究结果为理解二化螟的解毒代谢分子机制奠定基础。从二化螟基因组和转录组中共鉴定到54个ABC转运蛋白,通过Blast比对与系统发育分析,将ABC转运蛋白分为八个亚家族（ABCA-ABCH）,包括6个ABCA亚家族基因,10个ABCB亚家族基因,12个ABCC亚家族基因,2个ABCD亚家族基因,1个ABCE亚家族基因,3个ABCF亚家族基因,16个ABCG亚家族基因和4个ABCH亚家族基因。ABC转运蛋白基因序列的开放阅读框大小范围为1674bp（CsABCA13）到9273 bp（CsABCB1B）之间,编码558～3091个氨基酸,分子量大小在 60.96 kDa（CsABCA13）到341.55 kDa（CsABCB1B）之间,等电点介于5.55～9.26之间。系统发育分析表明,二化螟CsABCH与CsABCA和CsABCG家族的同源性最近,CsABCC与CsABCE和CsABCD具有较高的同源性,CsABCB与CsABCC具有很高的同源性。相同亚家族的基因聚为一支,且每个亚家族都有明显的功能聚类。杀虫剂增效作用实验表明,使用ABC转运蛋白抑制剂维拉帕米处理后可显着增加氯虫苯甲酰胺和阿维菌素对二化螟的毒力作用。结合转录组分析结果,对氯虫苯甲酰胺处理24小时后引起表达量变化的21个ABC基因进行验证,其中6个ABC转运蛋白基因显着上调,包括CsABCC8、CsABCG1C和CsABCH1等。经阿维菌素处理24小时后有6个ABC转运蛋白基因显着上调,包括CsABCA4、CsABCE1、CsABCF1、CsABCF2、CsABCC8和CsABCH1。同时测定了氯虫苯甲酰胺和阿维菌素处理后,ABC转运蛋白基因在解毒相关组织中的表达变化。利用RT-qPCR检测CsABCC8,CsACG1C和CsABCH1在二化螟不同发育阶段和不同组织的表达量,CsABCC8表达量明显高于CsABCG1C和CsABCH1在不同龄期的表达量,CsABCG1C和CsABCH1在幼虫阶段的表达量均较低。组织表达分析结果显示,CsABCC8基因在二化螟不同组织中的表达量均较高,在脑中的表达量最高。CsABCG1C和CsABCH1基因在二化螟神经索、脑和卵巢中均有较高表达,且CsABCG1C基因在二化螟表皮中也有较高的表达。为进一步验证二化螟ABC转运蛋白对杀虫剂的转运功能,我们对前期发现过表达的CsABCC8,CsABCG1C和CsABCH1等5个ABC基因的开放阅读框进行克隆并体外表达。通过构建稳定表达的pFastBACHTA真核表达体系,将二化螟CsABC和对照绿色荧光蛋白EGFP在昆虫Sf9细胞中重组表达。利用免疫荧光技术,检测到重组蛋白在细胞中成功表达。使用CCK8方法对表达不同重组蛋白的细胞毒性进行测定,在不使用杀虫剂处理下,表达CsABCC8、CsABCH1和CsABCE1的细胞活性显着高于表达EGFP的细胞活性。在使用杀虫剂处理下,相比于表达EGFP的细胞活性,表达CsABCC8、CsABCH1和CsABCE1蛋白的细胞活性进一步显着增加,表达的ABC蛋白增加了细胞对杀虫剂的外排作用从而显着降低杀虫剂对Sf9细胞的毒性。其中,相比于表达EGFP的细胞,表达CsABCC8和CsABCH1的细胞对氯虫本甲酰胺、溴氰虫酰胺、阿维菌素、氟虫腈和毒死蜱的细胞活性显着增加,表达CsABCE1的细胞对氯虫本甲酰胺、溴氰虫酰胺、阿维菌素、溴氰菊酯和茚虫威的细胞活性显着增加,说明二化螟CsABCC8、CsABCH1和CsABCCE1参与了对杀虫剂的转运代谢。本文研究结果为二化螟ABC蛋白转运代谢杀虫剂提供直接证据,进一步丰富了昆虫对杀虫剂的抗药性机制,为昆虫ABC转运蛋白的功能研究奠定了基础。
张丹[5]（2021）在《MrVoc1在罗伯茨绿僵菌与昆虫微生物群落互作中的作用研究》文中研究说明昆虫病原真菌对宿主的入侵是一个非常复杂的过程,正常情况下,宿主微生物群在宿主体内维持着动态的生态平衡。一旦昆虫病原真菌入侵,宿主内微生态平衡会被打破,宿主-病原真菌-宿主微生物群落三者间会发生复杂的相互作用。现阶段,昆虫病原真菌与宿主之间的互作已进行了大量研究,但对昆虫病原真菌与宿主微生物群落互作的认识还非常有限。发现并阐明昆虫病原真菌与宿主微生物群落之间的互作模式对全面认识昆虫病原真菌的致病机制具有重要意义,可为开发绿色高效稳定的真菌杀虫剂提供理论依据。罗伯茨绿僵菌（Metarhizium robertsii）的寄主范围非常广泛,可成功感染几百种不同种类的昆虫,是研究昆虫病原真菌与宿主微生物群落互作的良好材料。实验室前期的研究发现,罗伯茨绿僵菌通过水平基因转移（horizontal gene transfer,HGT）获得包括MrVoc1在内的18个基因,但MrVoc1基因的具体功能还未被研究清楚。本研究发现MrVoc1参与罗伯茨绿僵菌与昆虫微生物群落的互作过程。主要研究结果如下:1)前期研究发现,MrVoc1对罗伯茨绿僵菌的杀虫毒力无贡献。但q RT-PCR显示MrVoc1在大蜡螟血淋巴条件下高水平表达。本研究分析罗伯茨绿僵菌侵染致死的大蜡螟尸体发现,大蜡螟被罗伯茨绿僵菌侵染致死后呈红色的僵虫状;保湿10～15d后,根据表面微生物的生长情况可将大蜡螟尸体分为以下四类。类型Ⅰ:尸体是僵虫,其表面几乎全部被罗伯茨绿僵菌的孢子覆盖。类型Ⅱ:尸体是僵虫,其表面被菌丝覆盖,只有少量的罗伯茨绿僵菌孢子。类型Ⅲ:虫尸不僵硬或部分僵硬,其上除了有罗伯茨绿僵菌孢子和菌丝之外,还有其它真菌或细菌生长,并有黑色液体流出。类型Ⅳ:尸体是僵虫,其上只有较少的罗伯茨绿僵菌菌丝体。WT感染致死的虫尸中,四种类型虫尸的比例分别为46%、29%、22%和3%;ΔMrVoc1感染致死的虫尸中,四种类型虫尸的比例分别为26%、38%、32%和4%。ΔMrVoc1感染的类型Ⅰ虫尸的比例显着低于WT;ΔMrVoc1感染的类型Ⅱ虫尸的比例显着高于WT;ΔMrVoc1感染的类型Ⅲ虫尸的比例显着高于WT。2)从罗伯茨绿僵菌感染的昆虫体内分离出两株细菌——GMG1和GMG2,通过16S r RNA测序和系统发育树分析进行鉴定,推测这两株细菌分别为Staphylococcus属和Proteus属的一员。WT感染致死的大蜡螟尸体提取物对GMG1和GMG2的抑制作用均显着大于ΔMrVoc1。通过硅胶层析色谱分离大蜡螟尸体提取物,发现MrVoc1的敲除使感染的大蜡螟尸体提取物中能够抑制GMG1或GMG2的部分抑菌物质消失。3)MrVoc1不影响罗伯茨绿僵菌和大肠杆菌对抗生素的抗性。在博来霉素存在的条件下,ΔMrVoc1菌株、MrVoc1OE菌株以及C-ΔMrVoc1菌株的生长速率与WT菌株无显着差异。原核表达MrVoc1蛋白不影响大肠杆菌BL21菌株对博来霉素、链霉素、妥布霉素、庆大霉素、青霉素、氨苄青霉素和头孢噻肟的抗性。在利福平存在的条件下,无论是否添加IPTG,BL21菌株、转入pET-28a空载或pET-28a-MrVoc1的BL21菌株均能生长,但转入pET-28a空载或pET-28a-MrVoc1的BL21菌株在添加IPTG的条件下,生长都受到一定程度的抑制,且转入pET-28a-MrVoc1的BL21菌株的生长抑制效果更显着;在潮霉素B存在的条件下,无论是否添加IPTG,BL21菌株均能生长,转入pET-28a空载或pET-28a-MrVoc1的BL21菌株在不添加IPTG的条件下均能生长,但转入pET-28a空载或pET-28a-MrVoc1的BL21菌株在添加IPTG的条件下,生长均受到抑制。纯化的MrVoc1蛋白与潮霉素B的反应产物对BL21无抑制作用;纯化的MrVoc1蛋白与利福平的反应产物对BL21也无抑制作用。4)MrVoc1的过表达使罗伯茨绿僵菌的代谢物组发生改变,WT菌株中含有甲基乙二醛（MG）等代谢物,MrVoc1OE菌株中不存在。罗伯茨绿僵菌入侵后,大蜡螟体内MG含量显着升高,且WT菌株和MrVoc1OE菌株侵染致死的大蜡螟尸体中MG含量显着高于ΔMrVoc1菌株。MG能抑制罗伯茨绿僵菌及GMG1和GMG2的生长,MG对GMG1和GMG2的抑制作用比对罗伯茨绿僵菌更显着。此外,喂食MG的白纹伊蚊的肠道菌群总数量显着高于正常的白纹伊蚊,且两组白纹伊蚊肠道中的优势菌群也显着不同。综上,本研究发现MrVoc1参与罗伯茨绿僵菌与昆虫微生物群落的互作过程,进一步挖掘了昆虫病原真菌与宿主微生物群落之间互作的部分机制,加深了对病原真菌-宿主微生物群落-宿主三者间互作的认识。
蒙力维[6]（2021）在《BdmiR-994靶向BdCPCFC调控桔小实蝇对马拉硫磷的穿透抗性》文中研究指明桔小实蝇Bactrocera dorsalis是一种重要的农业害虫,由于寄主范围广、适应能力强、繁殖速度快等特点,导致其在田间对包括马拉硫磷在内的多种杀虫剂产生了抗药性。虽然已有研究发现,解毒代谢酶基因上调表达在桔小实蝇对马拉硫磷的抗性中具有一定的作用,但尚不清楚是否有其它抗性机制在桔小实蝇对马拉硫磷的抗性形成中发挥作用。穿透抗性通过改变昆虫表皮结构和成分使杀虫剂穿透受阻,降低昆虫对杀虫剂的敏感性,是田间害虫交互抗性形成的原因之一。明确桔小实蝇对马拉硫磷是否存在穿透抗性及其分子机制,有助于延长杀虫剂的使用寿命,降低对桔小实蝇的防治成本。据此,本学位论文基于室内桔小实蝇马拉硫磷敏感品系和经连续多代筛选获得的抗性品系,通过透射电镜、高效液相色谱和不同施药方式等技术和手段,发现桔小实蝇的前胸背板表皮增厚导致马拉硫磷穿透受阻,从而形成对马拉硫磷的穿透抗性。在此基础上,综合运用高通量转录组测序、生物信息学分析、生物素-链霉亲和素RNA Pull-down、双荧光素酶报告系统、荧光原位杂交、免疫组化、异源表达以及RNAi等技术和方法,系统揭示BdmiR-994调控表皮蛋白BdCPCFC介导桔小实蝇对马拉硫磷穿透抗性的分子机制。主要研究结果如下:1桔小实蝇对马拉硫磷穿透抗性的理化分析利用前胸背板点滴法在室内连续多代筛选获得桔小实蝇对马拉硫磷的抗性品系。经前胸背板点滴施药的生物测定表明,桔小实蝇马拉硫磷抗性和敏感品系LD50分别为3452.5、64.3 ng/fly,抗性倍数达53.6倍。与上述施药方式相比,桔小实蝇抗性与敏感品系经胸部注射马拉硫磷后LD50分别降至1344.1和44.1 ng/fly,表明前胸背板表皮在桔小实蝇对马拉硫磷的抗性中发挥作用。使用高效液相色谱测定马拉硫磷的穿透率,结果显示在前胸背板点滴马拉硫磷处理后的1、3、6和9 h,其在抗性品系的穿透率分别为60.3%、70.7%、79.9%和84.6%,而在敏感品系则穿透率分别为83.1%、96.9%、98.0%和98.5%。可见马拉硫磷在抗性品系前胸背板处穿透受阻,且穿透率显着低于敏感品系。进一步使用透射电子显微镜观察桔小实蝇前胸背板的超微结构发现,抗性品系前胸背板的表皮厚度显着增加约4.5μm。因此,抗性品系表皮增厚导致马拉硫磷穿透路径增加引起穿透受阻,从而降低桔小实蝇对马拉硫磷的敏感性,最终产生对马拉硫磷的穿透抗性。2桔小实蝇与马拉硫磷抗性相关基因的挖掘基于构建的桔小实蝇马拉硫磷抗性与敏感品系高通量转录组文库,在抗性品系中共挖掘获得157个上调和266个下调表达基因。注释分析发现,抗性品系有18个表皮蛋白基因上调表达,分别属于CPR和CPCFC家族。采用实时荧光定量PCR（RT-q PCR）的验证显示,16个表皮蛋白基因在抗性品系中上调0.9至11.6倍,与转录组测序分析结果一致。进一步解析这些表皮蛋白在桔小实蝇成虫不同日龄的表达模式,结果显示Bd RR1-2、Bd RR1-32、Bd RR1-35和BdCPCFC在抗性品系多个日龄显着上调表达,表明其可能在抗性品系表皮结构改变中承担一定的功能。分析这些基因的组织表达模式发现,Bd RR1-2、Bd RR1-35和BdCPCFC分别在抗性品系前胸背板的表皮显着上调6.0、1.8和1.0倍,暗示这3个表皮蛋白基因在桔小实蝇抗性品系的前胸背板表皮的相关生理过程发挥作用。基于桔小实蝇马拉硫磷抗性与敏感品系的miRNA高通量转录组文库,鉴定获得75个已知miRNAs和372个novel miRNAs。其中,在抗性品系中下调的5个已知miRNAs中,4个TPM值均超过100。进一步分析其表达模式,BdmiR-994在抗性品系整虫及成虫前胸背板表皮分别显着下调80.0%和67.7%,暗示BdmiR-994可能通过靶向前胸背板表皮中的相关功能基因调控桔小实蝇对马拉硫磷的抗性。3桔小实蝇BdmiR-994对表皮蛋白基因BdCPCFC的靶向调控关系联合分析桔小实蝇过表达BdmiR-994（注射BdmiR-994 mimic）的转录组和桔小实蝇前胸背板表皮的转录组（包括抗性品系和敏感品系）,并结合4种miRNA靶基因预测软件的分析结果,最终获得4个候选靶基因。使用生物素-链霉亲和素RNA Pull-down分析发现,仅表皮蛋白基因BdCPCFC显着富集,说明桔小实蝇BdmiR-994与BdCPCFC能够直接作用。荧光原位杂交结果显示,BdmiR-994与BdCPCFC的荧光信号均在桔小实蝇前胸背板表皮富集,表明BdmiR-994和BdCPCFC在桔小实蝇体内同一位置表达。RT-q PCR与Western blot检测结果显示,注射BdmiR-994 mimic后,桔小实蝇BdmiR-994的表达量上调64.0倍,而BdCPCFC的表达量降低56.8%,同时虫体内的BdCPCFC蛋白也显着减少;注射BdmiR-994 inhibitor后,桔小实蝇BdmiR-994的表达量下调90.0%,而BdCPCFC的表达量上调1.1倍,同时虫体内的BdCPCFC蛋白也明显增多。进一步使用双荧光素酶报告系统的分析结果显示,BdmiR-994负向调控BdCPCFC的表达,BdmiR-994与BdCPCFC 3’端非编码区（UTR）的TCCTTA序列通过碱基互补配对结合。上述结果阐明了桔小实蝇BdmiR-994对BdCPCFC的靶向调控关系。4 BdmiR-994/BdCPCFC介导桔小实蝇马拉硫磷穿透抗性的分子机制基于BdmiR-994在桔小实蝇马拉硫磷抗性与敏感品系的表达模式,分别以BdmiR-994 mimic和inhibitor注射处理抗性和敏感品系试虫,利用透射电子显微镜观察其前胸背板表皮的厚度并进行马拉硫磷生物测定,分析BdmiR-994在桔小实蝇马拉硫磷抗性中的作用。结果显示:注射BdmiR-994 mimic后,抗性品系桔小实蝇前胸背板表皮的厚度显着降低约3.1μm,且对马拉硫磷的敏感性显着提升30.0%;注射BdmiR-994 inhibitor后,桔小实蝇敏感品系前胸背板表皮的厚度显着增加约1.1μm,且对马拉硫磷的敏感性显着降低23.3%。上述结果表明BdmiR-994通过参与调控桔小实蝇前胸背板表皮的厚度影响其对马拉硫磷的敏感性,在桔小实蝇对马拉硫磷的穿透抗性中发挥作用。克隆获得BdCPCFC开放阅读框489 bp,编码162个氨基酸。生物信息学分析发现,BdCPCFC具有CPCFC家族特有的3个C-X（5）-C保守结构域。RT-q PCR分析发现,BdCPCFC在抗性品系中显着上调表达2.4倍。采用免疫组化、胶体金免疫定位和几丁质结合能力测定分析发现,表皮蛋白BdCPCFC位于桔小实蝇前胸背板表皮的几丁质片层中,且能有效结合几丁质树脂,表明BdCPCFC是桔小实蝇前胸背板表皮中的结构蛋白。注射ds BdCPCFC后,桔小实蝇BdCPCFC的表达量显着降低43.5%,蛋白含量明显减少,同时其前胸背板表皮的厚度显着降低约2.1μm,且对马拉硫磷的敏感性显着提升30.0%。综上所述,桔小实蝇BdmiR-994通过靶向调控BdCPCFC的表达影响前胸背板表皮增厚,最终导致马拉硫磷穿透路径增加,从而形成穿透抗性。本学位论文的研究结果不仅丰富了昆虫杀虫剂穿透抗性的研究体系,为新型杀虫剂的研发提供了研究思路,同时为桔小实蝇田间抗性防控策略的制定奠定了理论基础。
刘娇[7]（2020）在《飞蝗细胞色素P450的杀虫剂代谢解毒特性及其表达调控研究》文中指出飞蝗（Locusta migratoria）喜食多种农作物,是重要的农业害虫之一。目前,高密度蝗灾的防治仍然依赖于大量化学杀虫剂的施用。杀虫剂的大规模、高频率施用又会带来一系列环境和生态问题,包括昆虫抗药性的产生及农业环境污染等。研究表明,导致害虫抗药性产生的重要机制之一是害虫体内解毒酶解毒能力的增强。细胞色素P450（Cytochrome P450,P450）是昆虫体内重要的解毒酶系之一,由多个基因编码,在昆虫对包括多种化学杀虫剂在内的内源和外源化合物代谢解毒过程中发挥着重要作用。随着飞蝗基因组测序的完成和转录组数据库的积累,越来越多的细胞色素P450基因被克隆。迄今为止,飞蝗中至少已有78个P450基因被克隆并命名,面对如此庞大数目的P450基因,对各个基因功能及其表达调控机制的解析成为P450研究所面临的巨大挑战。课题组前期通过RNAi结合杀虫剂生测实验,发现一些可能参与杀虫剂解毒的P450基因,但鉴于虫体内环境的复杂性和RNAi技术的局限性,从蛋白水平对P450的生化特性和解毒机制的解析具有重要作用。另一方面,P450蛋白表达具有精密复杂的调控机制,以适应多变的环境条件。因此,深入了解其调控机理对揭示P450的诱导机制及害虫抗药性机理具有重要意义。本文主要研究内容如下:1、飞蝗微粒体细胞色素P450蛋白含量及其对底物和化学杀虫剂代谢活性比较对飞蝗5龄若虫4种主要解毒组织器官（中肠、胃盲囊、马氏管和脂肪体）中微粒体细胞色素P450蛋白含量和酶活力进行了比较。结果显示,胃盲囊中微粒体P450蛋白含量最高,其次是中肠和马氏管。脂肪体中微粒体P450含量最低,却表现出较高的芳环羟基化（aromatic hydroxylation）、O-脱烷基化（O-dealkylation）和脱苄基化（O-dearylation）活性。尽管胃盲囊中细胞色素P450蛋白含量最高,但对7种检测底物中的6种都显示出较低的酶活性。此外,中肠、胃盲囊和脂肪体可以显着代谢两种拟除虫菊酯类杀虫剂（溴氰菊酯和氟氨氰菊酯）,然而,对其他4种杀虫剂（马拉硫磷、毒死蜱、西维因和烯虫酯）则没有明显的代谢活性。由此可见,昆虫P450酶活性具有组织器官特异性和底物选择性。此外,研究结果还提示我们,仅根据总微粒体P450蛋白含量预测其酶活性是不全面的;2、重组飞蝗CYP6FD1蛋白对模式底物及杀虫剂的代谢研究通过杆状病毒-昆虫细胞表达系统在Sf9细胞中成功表达飞蝗CYP6FD1（LmCYP6FD1）和细胞色素P450还原酶（LmCPR）。测定了重组蛋白对6种模式底物（Luciferin-H、Luciferin-Me、Luciferin-Be、Luciferin-PFBE、Luciferin-CEE和7-ethoxycoumarin）和4种杀虫剂（溴氰菊酯,毒死蜱、西维因和烯虫酯）的催化活性。结果表明,LmCYP6FD1可以催化7-ethoxycoumarin和Luciferin-Me的脱烷基化反应,但未检测到对其他萤光素底物的活性。此外,重组LmCYP6FD1可有效催化溴氰菊酯氧化为羟基溴氰菊酯,且反应过程具有时间依赖性。3、飞蝗CYP6FE1蛋白重组表达及其杀虫剂代谢功能研究采用杆状病毒表达系统在Sf9细胞中成功表达飞蝗CYP6FE1（LmCYP6FE1）和细胞色素P450还原酶（LmCPR）。测定了重组蛋白对6种模式底物（Luciferin-H、Luciferin-Me、Luciferin-Be、Luciferin-PFBE、Luciferin-CEE和7-ethoxycoumarin）的催化活性。结果表明,重组CYP6FE1对几种模式底物均未出现可检测到的活性。鉴于P450对底物的高度选择性,且重组蛋白具有典型的P450吸收峰,通过HPLC技术检测了重组蛋白对5种杀虫剂（溴氰菊酯、毒死蜱、西维因、烯虫酯和吡虫啉）的代谢,发现重组LmCYP6FE1可以催化吡虫啉代谢,进一步通过质谱技术对代谢产物进行分析,发现重组LmCYP6FE1可以将吡虫啉代谢,转化为羟基吡虫啉。4、飞蝗细胞色素b5分子特性及其在P450介导的氧化反应中的功能研究基于飞蝗录组数据库,通过RT-PCR技术克隆获得飞蝗Cyt-b5（LmCyt-b5）全长cDNA序列,并经测序进行验证。对其氨基酸聚类分析结果表明,LmCyt-b5与蜚蠊目的Cyt-b5聚为一枝。定量分析结果表明,LmCyt-b5在飞蝗卵巢、马氏管、中肠、胃盲囊和脂肪体中高表达。沉默LmCyt-b5表达后,飞蝗对4种杀虫剂的敏感性未出现明显变化。干扰LmCyt-b5或同时干扰LmCyt-b5和LmCPR基因表达后,飞蝗总微粒体蛋白对底物7-ethoxycoumarin（7-EC）的催化活性未出现明显改变。然而,通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统将LmCyt-b5与LmCYP6FD1和LmCPR共表达时,可显着提高重组LmCYP6FD1对底物7-EC的催化活性。研究结果表明,LmCyt-b5在LmCYP6FD1对7-EC的催化反应过程中发挥着一定的作用。5、转录因子CncC对飞蝗杀虫剂解毒相关基因的表达调控研究克隆获得飞蝗CncC（LmCncC）全长cDNA序列,进一步沉默飞蝗CncC基因表达后,结合杀虫剂生物测定实验,发现干扰LmCncC基因表达后,飞蝗对溴氰菊酯和吡虫啉的敏感性增加。为进一步解析CncC通过调控哪些解毒基因表达,从而导致杀虫剂敏感性增加。本文对注射dsCncC和dsGFP的样品进行比较转录组测序,筛选到与解毒相关的9个下调表达基因,包括5个细胞色素P450基因（CYP6FD1、CYP6FD2、CYP6FE1、CYP6HL1和CYP6MU1）和4个UGT（UGT392A1、UGT392A2、UGT392B1和UGT392C1）基因。对上述基因进行测序验证后,通过RNAi结合杀虫剂生测实验,分析其在溴氰菊酯和吡虫啉解毒中的作用。结果发现,沉默LmCYP6FD1和LmUGT392C1基因表达后,飞蝗若虫对溴氰菊酯的敏感性增强;沉默LmCYP6FE1和LmUGT392C1基因表达后,飞蝗对吡虫啉的敏感性增强。由此推测,飞蝗CncC通过调控上述基因的表达,参与溴氰菊酯和吡虫啉的代谢。综上所述,本文首先从蛋白水平对飞蝗主要解毒组织器官中微粒体P450的生化特性进行了系统分析;接着以两个CYP6家族细胞色素P450为代表,借助Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,表达重组P450蛋白,并对其酶活特性和杀虫剂代谢功能进行了系统研究;最后,从解毒基因重要转录调控因子CncC入手,研究了其对杀虫剂的响应及对解毒基因表达的调控作用,本文研究结果将为今后深入开展飞蝗P450基因表达调控机制、蛋白生理生化特性及杀虫剂代谢解毒机理提供理论与实践依据。
程沈航[8]（2020）在《农药对胡瓜钝绥螨的风险评估及甲维盐的胁迫效应机制》文中研究表明胡瓜钝绥螨是农田中重要的非靶标节肢动物（non-target arthropods,NTAs）,能够作为捕食性天敌生物,防控朱砂叶螨、二斑叶螨等害螨。当前,人们为了追求农作物的高产量高收益,大量喷施农药,在控制靶标有害生物的同时也会使胡瓜钝绥螨等有益生物及生态环境受到影响。因此,开展农药对胡瓜钝绥螨的风险评估研究,并筛选对NTAs和靶标害虫具有高度选择性的药剂,从而达到农药减量化,对保护NTAs的生物功能及生态环境具有非常重要的价值。本研究首先选择胡瓜钝绥螨和其捕食对象朱砂叶螨进行研究,建立毒性效应测试方法,测试了25种常用农药对2种物种的毒性差异,筛选出了对胡瓜钝绥螨和朱砂叶螨具有高度选择性的药剂甲氨基阿维菌素苯甲酸盐（简称甲维盐）,并进行了风险评估,采用物种敏感度模型对多种NTAs的敏感度进行分析,明确了胡瓜钝绥螨在NTAs中的敏感性地位。在此基础上,为探索甲维盐的胁迫效应机理,本研究建立了两性生命表模型,获得生长发育参数,从种群层面评估甲维盐对胡瓜钝绥螨的长期毒性效应;通过表皮穿透和酶活测定,从生化角度分析甲维盐的胁迫效应影响;通过转录组和代谢组测定,从微观层面上,找到了表达代谢酶和保护酶相对应的基因和代谢通路。本研究及成果对相关农药品种研发,及国内外农药对NATs的研究从宏观到微观,从体系到具体的方法都有很好的导向作用。本文主要研究内容和结论如下:（1）25种农药对胡瓜钝绥螨和朱砂叶螨的毒性效应采用叶盘喷雾法测定了25种常用农药对胡瓜钝绥螨和朱砂叶螨的急性毒性影响。发现胡瓜钝绥螨和害螨朱砂叶螨对抗生素类杀虫剂甲维盐和阿维菌素的耐药性具有明显的差异,其差异倍数达到了883倍和622倍;新烟碱类杀虫剂对两种试虫的选择性不明显,差异倍数在0.58～2.00倍;有机磷类杀虫剂乐果和马拉硫磷对两种试虫的选择性相反;拟除虫菊酯类杀虫剂对两种试虫毒性差异倍数在0.04～2.37倍,且多数表现为对胡瓜钝绥螨毒性更强。综合认为,抗生素类杀虫剂甲维盐和阿维菌素对胡瓜钝绥螨和害螨朱砂叶螨具有高度的选择性。（2）25种农药对天敌胡瓜钝绥螨的生态风险评估采用我国农药登记环境风险评估指南标准体系,评估25种农药对天敌胡瓜钝绥螨的生态风险。发现在农田内暴露场景下,抗生素类和新烟碱类杀虫剂对胡瓜钝绥螨表现为低风险（HQ<5）,有机磷类和拟除虫菊酯类杀虫剂对胡瓜钝绥螨表现出高风险性（HQ>5）;在农田外暴露场景下,多数农药品种对胡瓜钝绥螨都表现出低风险,但是联苯菊酯和马拉硫磷对农田外风险不可接受;一些杀螨剂如螺螨酯、螺虫乙酯、炔螨特和哒螨灵等属于低风险药剂。（3）13种NTAs对5种农药的物种敏感度分布采用种群敏感性分布模型,进行了包括胡瓜钝绥螨在内的13种NTAs对5种农药的物种敏感度比较。结果为13种NTAs对不同类型的药剂敏感性差异较大,表现为NTAs对有机磷类药剂乐果、拟除虫菊酯类药剂联苯菊酯和新烟碱类药剂吡虫啉的敏感性要大于抗生素类药剂阿维菌素和甲维盐。在寄生类天敌中,表现为松毛虫赤眼蜂相比螟黄赤眼蜂和玉米螟赤眼蜂都更为敏感,烟蚜茧蜂的敏感性较差;在捕食性天敌中,总体上表现为七星瓢虫的敏感性要高于捕食螨、小花蝽等。在低风险药剂选择方面,甲维盐在低剂量下就可以控制80%以上的害虫,同时对NTAs的潜在影响比例为32.5%。（4）甲维盐对胡瓜钝绥螨的生长发育和种群参数的影响通过模拟自然条件,室内采用喷雾法处理若螨,建立实验种群两性生命表,观察甲维盐对胡瓜钝绥螨全生命周期发育历期参数等的影响作用。发现甲维盐浓度升高能够缩短胡瓜钝绥螨的寿命和成螨产卵前期,减少雌螨产卵量。净增值率R0和平均世代周期T都会下降,内禀增长率r和周限增长率λ则下降不明显,胡瓜钝绥螨种群增长虽然低于健康种群,但整体上仍呈现上升趋势,且雄螨比雌螨更容易受到影响。（5）甲维盐对胡瓜钝绥螨的表皮穿透和相关酶系的诱导效应通过甲维盐在朱砂叶螨和胡瓜钝绥螨体内的含量测定及代谢酶和保护酶的酶活测定,发现表皮穿透力并不是导致这两种生物体对甲维盐敏感性差异较大的主要原因;甲维盐处理后,胡瓜钝绥螨体内解毒代谢酶GST、Car E、Ach E和保护酶POD的比活力降低,相关保护酶SOD和CAT比活力增大。表明SOD和CAT在胡瓜钝绥螨受到甲维盐胁迫后参与了生理活动的保护机制。（6）甲维盐胁迫下胡瓜钝绥螨的转录组学分析采用Illumina RNA-seq测序技术分析了经甲维盐胁迫下对胡瓜钝绥螨基因层面的影响。转录组差异表达结果显示,在田间剂量下,有1035个基因有显着的表达差异,其中上调基因和下调基因分别为510和525个。P450、GST和Ach E家族上调基因分别为1、1和2个,下调基因分别为5、12和2个,Car E下调基因1个,没有上调基因;POD家族上调和下调的基因各1个;SOD家族有2个上调基因,CAT家族有1个上调基因;靶标基因GABACl有3个上调基因,2个下调基因;Glu Cl的2条差异基因都表现为上调基因。对筛选的靶标基因进行了Q-PCR验证,结果和测序结果相吻合,同时对关键酶基因的表达量和表观酶活力进行比较,找到了相对应的酶系基因。（7）甲维盐胁迫下胡瓜钝绥螨的代谢组学分析利用液质联用系统LC-MS技术对暴露于甲维盐田间剂量下的胡瓜钝绥螨进行全组分代谢组学分析,共检测出318个可注释的代谢产物,其中79种具有差异的代谢产物,上调33个,下调46个;主要差异代谢产物体现在8-9-环氧二十碳三烯酸、四氢生物蝶呤和L-3-羟基犬尿氨酸等物质,主要的差异代谢通路体现在氨酰基-t RNA生物合成途径、苯丙氨酸代谢途径、氮素代谢代谢途径等。
黄河[9]（2019）在《甜菜夜蛾GST和UGT与杀虫剂抗性的关系》文中提出解毒代谢能力增强是导致害虫对杀虫剂产生抗性的重要机制,这种解毒能力的提高往往是因为Ⅰ相代谢酶与Ⅱ相代谢酶活性升高的结果。Ⅰ相代谢酶,如多功能氧化酶,在害虫代谢抗性中的作用已有很多的研究报道,但Ⅱ相代谢酶,如谷胱甘肽-S-转移酶（GST）与尿苷二磷酸糖基转移酶（UGT）,在害虫抗药性中所起作用的研究报道较少,尤其是在甜菜夜蛾的抗药性中Ⅱ代谢的作用尚不清楚。本研究以对多种杀虫剂均已产生高水平抗性的广东惠州甜菜夜蛾田间种群为研究对象,探讨甜菜夜蛾的GST和UGT与杀虫剂抗性的关系。首先对田间种群进行毒力测定揭示其抗药性水平,通过解毒酶活性测定与增效剂试验揭示抗药性与GST以及UGT的联系,在此基础上分析抗性种群中GST与UGT基因表达水平的差异,找到抗性种群中组成型高表达的相关基因。针对组成型高表达的GST基因进行原核表达,利用体外表达的GST酶分析其对杀虫剂的体外代谢活性,并通过HPLC方法分析对杀虫剂的降解作用。针对具有杀虫剂代谢能力并在抗性种群中高表达的GST基因,克隆其上游序列,预测分析其转录因子结合位点,并构建报告质粒,采用荧光报告质粒分析上游序列的启动子活性,以期揭示抗性种群中解毒基因组成型上调表达的调控机制。一、甜菜夜蛾谷胱甘肽-S-转移酶与杀虫剂抗性的关系采用叶片浸渍法测定了广东惠州地区甜菜夜蛾田间种群对六种常用杀虫剂的抗性水平,发现该种群对毒死蜱和氯氰菊酯的抗性倍数分别达到1155倍和931倍,属极高水平的抗药性。增效剂试验表明,谷胱甘肽-S-转移酶抑制剂DEM能明显提高毒死蜱和氯氰菊酯对抗性种群的毒力,增效倍数分别为5.5和4.1倍;比较敏感和HZ16种群间GST酶活性我们发现,HZ16种群GST酶活性是敏感种群的2.9倍,这表明GST酶活性升高在毒死蜱和氯氰菊酯抗性中起一定作用。通过定量PCR,比较HZ16和敏感种群31个SeGST基因的相对表达水平,我们发现6个GST基因（SeGSTd3,SeGSTe1,SeGSTe6,SeGSTe9,SeGSTo2 和 SeGSTs1）在 HZ16 种群中存在明显地过表达,而对于其他25个GST基因,HZ16和敏感种群之间没有显着的差异。在HZ16种群中上调表达程度最高的GST基因是SeGSTo2、SeGSTe6和SeGSTd3,分别上调109.1倍、60.7倍和34.8倍,这些上调表达的GST基因可能与毒死蜱和氯氰菊酯抗性有关。针对这3个表达上调最多的GST基因我们进行了原核表达,成功得到了纯化的GST蛋白酶。使用底物CDNB和GSH测定了这3种重组GST蛋白的动力学参数,SeGSTo2、SeGSTe6 和 SeGSTd3的最大反应速度（Vmax）分别为 1.57 μmol/min/mg、4.98 μmol/min/mg和2.77 μmol/min/mg。酶活性抑制试验显示,毒死蜱与氯氰菊酯均可抑制这3种GST酶与其底物CDNB的结合,毒死蜱对CDNB与SeGST蛋白结合的抑制率分别是GSTe6为68.0%、GSTo2为61.8%、SeGSTd3为45.8%;氯氰菊酯的抑制率是 GSTo2 为 73.7%、GSTe6为 65.5%、SeGSTd3为54.1%,这表明 SeGSTs 与杀虫剂之间存在直接相互作用。体外代谢试验显示,七种杀虫剂与重组三种GST酶孵育后,其中SeGSTd3对毒死蜱、氯氰菊酯、甲维盐、三唑磷、氯虫苯甲酰胺、茚虫威和氟铃脲的清除率分别为55.3%、37.7%、29.1%、10.1%、8.8%、1.7%和29.3%;GSTe6对以上七种杀虫剂的清除率分别为27.3%、35.4%、14.1%、5.0%、19.9%、61.1%和15.2%;GSTo2对以上七种杀虫剂的清除率分别为45.1%、33.3%、17.9%、14.5%、18.0%、3.3%和4.1%。总体来看杀虫剂与重组蛋白一起孵育后反应溶液中毒死蜱和氯氰菊酯的含量降低最为明显,而三唑磷基本上没有降低,这表明SeGSTs可以代谢毒死蜱和氯氰菊酯等杀虫剂,从而参与杀虫剂抗性的产生。我们通过基因组步移克隆了SeGSTd3、SeGSTe6和SeGSTo2基因的上游序列,虽然甜菜夜蛾HZ 16和敏感种群来自不同的来源并且具有不同的遗传背景,但是这两个种群之间SeGST基因的上游序列没有明显差异。使用在线工具JASPAR和ALGGEN预测和分析转录因子（TF）结合位点,我们发现SeGSTd3上游序列具有Dfd、BR-C和 CncC/Maf 的结合位点,SeGSTe6 具有 AhR/ARNT、HSF、CncC/Maf 和 PXR/RXR的结合位点,SeGSTo2的上游序列含有HSF、AhR/ARNT、BR-C和CncC/Maf结合位点。甜菜夜蛾HZ16种群的三个SeGST基因中均存在CncC/Maf的结合序列。这表明甜菜夜蛾SeGSTd3、SeGSTe6和SeGSTo2的转录可能受相同的顺式调节元件和转录因子CncC和Maf调控。通过定量PCR,我们分析了转录因子表达水平,与敏感种群相比,HZ16种群中CncC、Maf和AhR的mRNA水平显着上调,分别上调8.5倍、2.8倍和1.6倍,但ARNT、HR96、USP、Dfd、BR-C和HSF等转录因子的表达量无显着差异。因此,我们推测SeGST基因上游序列中具有结合位点的转录因子的上调表达能够增强HZ16种群中相应GST基因的转录。针对这3个GST基因的上游序列,分别构建了3个荧光报告质粒,这3个报告质粒均有一定的组成型荧光报告活性,以SeGSTe6上游序列的启动子活性最高,因此,选择SeGSTe6的上游序列开展进一步的研究。将CncC和/或Maf表达构建载体与SeGSTe6报告质粒共转染可显着增强启动子活性,说明CncC或Maf的上调表达可增强其上游靶标基因的转录水平。类似地,由于SeGSTe6基因的上游序列中存在AhR/ARNT结合位点,AhR和/或ARNT的表达构建体与该报告质粒共转染也明显增加荧光报告活性。分别将这2个位点突变后,CncC/Maf或AhR/ARNT表达构建体与突变报告质粒的共转染不再增加转录的活性,说明这2个转录因子的结合位点在该基因的转录中起重要作用。由于HZ16种群SeGSTd3、SeGSTe6和SeGSTo2基因上游序列与敏感种群的序列没有明显差异,而转录因子CncC、Maf以及AhR在HZ16种群中却组成型的过表达,这些转录因子的上调表达造成相关靶基因的组成型上调表达,包括多个GST基因的上调表达,这可能就是多种GST基因上调表达,并导致抗药性的分子机制。二、甜菜夜蛾尿苷二磷酸糖基转移酶对毒死蜱敏感性的影响我们已经发现广东惠州地区甜菜夜蛾田间种群对毒死蜱产生了极高水平的抗药性。抗性种群不仅具有较高的GST酶活性,还具有显着高于敏感种群的UGT酶活性,抗性幼虫UGT酶活性是敏感品系的3倍。利用实时荧光定量PCR技术对抗性与敏感幼虫的32个UGT基因表达水平进行了比较分析,我们发现32个UGT基因中有17个UGT基因在抗性种群中表达上调3倍以上,并且与敏感种群表达水平有显着差异,其中UGT33J3上调表达最高（42倍）,其次是UGT33F7（37倍）和UGT33F5（34倍）,这说明抗性种群的抗药性可能与UGT基因上调表达有关。利用UGT表达诱导物（苯巴比妥）处理抗性幼虫,我们发现单独使用苯巴比妥和毒死蜱均能够提高UGT33F5、UGT33F7、UGT33J3三个基因的表达水平,其中UGT33F5最为明显,但苯巴比妥与毒死蜱联合使用并未使基因表达水平进一步上调;同时UGT基因在外源物苯巴比妥处理24 h后,抗性种群幼虫的UGT酶活性明显增加,用毒死蜱（LC30）处理幼虫也产生类似于苯巴比妥的诱导效果,而毒死蜱与苯巴比妥联合处理后UGT酶活性又进一步显着增加,这说明UGT酶活性的增加应是UGT基因的上调表达所致。当用苯巴比妥与毒死蜱的LC50浓度联合处理时,相对于对照,敏感种群和抗性种群的死亡率分别下降了 36.6%和23.3%,这说明UGT的上调表达增加了受胁迫幼虫对毒死蜱的解毒代谢能力。采用UGT抑制剂可抑制幼虫的UGT酶活性,5-硝基脲嘧啶与苯磺唑酮对甜菜夜蛾幼虫UGT酶活性的抑制中浓度分别为348.7 μM/L和489.8 μM/L,这2种抑制剂可用于抑制甜菜夜蛾的UGT酶活性。当用2个品系的毒死蜱LC50浓度分别处理抗性与敏感幼虫时,死亡率是46.7%,当与UGT酶抑制剂5-硝基脲嘧啶或苯磺唑酮联合处理甜菜夜蛾幼虫时,敏感品系幼虫的死亡率分别升高到73.3%与83.3%,2种抑制剂分别提高毒死蜱的毒力57%和78%;抗性幼虫的死亡率分别升高到76.6%与67.7%,分别提高毒死蜱毒力64%与45%,均显着地高于毒死蜱单用时产生的死亡率,说明抗性与敏感种群中UGT酶活抑制剂均能显着地提高毒死蜱的毒力。综上所述,甜菜夜蛾体内的Ⅱ相解毒代谢酶GST与UGT均在杀虫剂抗性中发挥着一定的作用,增加了人们对甜菜夜蛾抗药性机制的理解,将有助于甜菜夜蛾抗药性治理,为探索抗性治理技术提供理论指导。
谢天[10]（2019）在《G蛋白信号调控基因在罗伯茨绿僵菌生长发育、抗逆和致病过程中的功能分析》文中指出罗伯茨绿僵菌（Metarhizium roberstii）是一种重要的昆虫病原真菌,广泛应用于农林害虫的防治。然而,作为一种新型的生物农药,绿僵菌的应用有明显缺陷,如侵染宿主时的效果慢、周期长,在野外环境中防治效果不稳定,这些都严重阻碍了绿僵菌在农业生产中的大规模应用。因此了解绿僵菌生长发育及致病过程中所涉及的分子机制,从基因层面提高绿僵菌的杀虫毒力、增强其抗逆境能力,是绿僵菌高效防治农林病虫害的一个关键途径。G蛋白信号调控因子（RGS）是一种GTPase激活蛋白,通过增强Gα亚基GTPase活性,促进和Gα结合的GTP的分解,进而负调控G蛋白信号转导。本论文主要对G蛋白信号途径中的不同的G蛋白信号调控因子在罗伯茨绿僵菌生长发育、抗逆和致病过程中的功能差异分析进行了系统研究,结果如下:1.G蛋白信号调控因子RGS是G蛋白信号途径中的负调控因子。本文从罗伯茨绿僵菌全基因序列中鉴定到7个分别与稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）G蛋白信号调控因子MoRGS同源的MrRGS。比对发现罗伯茨绿僵菌中MrRGS1-7蛋白与稻瘟病菌中MoRgs1-8（除MoRgs5）蛋白的氨基酸非常同源,分别达59%、43%、78%、52%、45%、45%和46%,并且这7对蛋白在特定的位置都含有相同的功能域和跨膜结构。2.不同的Mrrgs在罗伯茨绿僵菌不同生长发育阶段的转录水平有明显差异,进一步进行生物学功能分析发现这些不同的MrRGS蛋白在其生长发育中具有不同的功能。如:缺失Mrrgs1、Mrrgs2和Mrrgs6对罗伯茨绿僵菌的生长速度影响较大,同时这3个基因的缺失也影响了菌株的产孢能力,而Mrrgs3、Mrrgs4、Mrrgs5和Mrrgs7这4个基因的缺失对绿僵菌的生长速率与产孢影响不大。进一步检测绿僵菌中参与调控细胞生长或者孢子产生的基因在ΔMrrgs中的表达情况,结果显示ΔMrrgs1突变株中,wetA、StuA等产孢相关的关键基因表达量显着下降,其他的产孢相关基因flbA、flbB flbC、flbD、brlA、vosA的表达量也明显下降:存ΔMrrgs2突变株中,AbaA、wetA等产孢关键基因表达量也显着下降,flbA、brlA的表达量也都下降明显;在ΔMrrgs6突变株中产孢相关的关键基因AbaA表达量显着下降,flbB、flbD、brlA的表达量也明显下降。表明MrRGS是罗伯茨绿僵菌中调节生长发育的重要因子,参与该病菌的营养生长和产生分生孢子等生理过程。3.不同的G蛋白信号调控因子不同程度上调控罗伯茨绿僵菌的致病性。生物测定表明缺失Mrrgs3、Mrrgs4和Mrrgs7对毒力影响最大,而缺失Mrrgs2对其影响不大。在注射实验中ΔMrrgs4和ΔMrrgs6的毒力分别下降17.7%和28.4%,而缺失Mrrgs1、Mrrgs3、Mrrgs4、Mrrgs5和Mrrgs7的绿僵菌在浸渍实验的毒力分别下降29.9%、33.5%、53.4%、29.3%和32.4%。为探索其影响毒力的机理,我们分别从菌丝疏水性,附着胞的形成、菌丝的cAMP含量三个方面加以系统研究。其结果如下:（1）通过在野生型和各突变体菌株的菌落上进行疏水性测定实验。发现,ΔMrrgs3、ΔMrrgs、5菌丝的疏水性明显下降。同时检测2个与疏水性相关基因在ΔMrrgs突变株中的表达情况,结果表明,与野生菌株相比,除了 ΔMrrgs2和ΔMrrgs6,另外5个突变株中的MHP1和MPG1的表达量都下降了。表明Mrrgs3和Mrrgs5的突变直接影响了罗伯茨绿僵菌的疏水性。（2）罗伯茨绿僵菌缺失Mrrgs的突变体在疏水培养皿和蝉翅上的附着胞形成率除了 ΔMrrgs2和ΔMrrgs6,其他5个突变体都明显下降,其中,ΔMrrgs1、ΔMrrgs3、ΔMrrgs5和ΔMrrgs7下降最为显着。（3）通过HPLC液相色谱的方法测定胞内cAMP的水平。发现与野生型相比,5个ΔMrrgs中cAMP的含量有不同程度的下降,其中有ΔMrrgs1、ΔMrrgs3、ΔMrrgs和ΔMr4rgs5这4个突变株的cAMP含量下降最显着。ΔMrrgs7中cAMP含量反而上升。上述结果表明,RGS蛋白参与调控该罗伯茨绿僵菌的胞内cAMP水平。4.罗伯茨绿僵菌中不同的Mrrgs对化学试剂、热、和紫外胁迫也具有不同的功能。化学试剂胁迫实验表明不同Mrrgs对罗伯茨绿僵菌的细胞壁完整性、抗氧化和抗渗透压能力影响有明显的差异,如:ΔMrrgs2、ΔMrrgs3、ΔMrrgs5、ΔMrrgs6和ΔMrrgs7在含有H202培养基上的生长抑制率比野生型菌株分别降低76.8%、59.0%、24.2%、31.2%和86.4%。ΔMrrgs2、ΔMrrgs3和ΔMrrgs6在含有NaCl的培养基上生长抑制率比野生型菌株分别降低了 65.6%、60.9%和84.7%。而NaCl对ΔMrrgs7生长抑制率的比野生型绿僵菌相比升高了 177.8%。在热胁迫和紫外胁迫条件下孢子萌发实验发现,经42℃1h处理后,ΔMrrgs7孢子的相对萌发率显着性降低,达27.3%。在能量为60J的紫外灯下照射12 s,ΔMrrgs5孢子的相对萌发率下降明显,达37.0%。综上所述,不同的G蛋白信号调控因子在罗伯茨绿僵菌生长发育和致病过程中有不同的功能。其中,Mrrgs1、Mrrgs2和Mrrgs6对罗伯茨绿僵菌的生长速度和产孢能力起正调控作用,进一步从转录水平分析,发现这3个G蛋白信号调控因子是通过调节产孢相关基因的表达来最终影响产孢能力。另外,在对致病性的研究中发现,Mrrgs1、Mrrgs3、Mrrgs4、Mrrgs5和Mrrgs7通过调节罗伯茨绿僵菌的疏水性来影响其附着胞的形成,从而影响毒力。
二、HPLC在杀虫剂表皮穿透研究中的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、HPLC在杀虫剂表皮穿透研究中的应用（论文提纲范文）
（1）豌豆蚜表皮碳氢化合物合成和转运相关基因的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 昆虫表皮碳氢化合物 |
| 1.1.1 组分和结构 |
| 1.1.2 合成部位和途径 |
| 1.1.3 转运 |
| 1.1.4 生物学功能 |
| 1.2 NADPH-细胞色素P450 还原酶 |
| 1.2.1 CPR的结构 |
| 1.2.2 CPR的功能和研究现状 |
| 1.3 载脂蛋白D |
| 1.3.1 ApoD的结构 |
| 1.3.2 ApoD的功能和研究现状 |
| 1.4 脂蛋白受体 |
| 1.4.1 LpR的结构 |
| 1.4.2 LpR的功能和研究现状 |
| 1.5 RNAi |
| 1.5.1 RNAi的通路和机制 |
| 1.5.2 RNAi在蚜虫中的研究现状 |
| 1.6 豌豆蚜的分布、危害和防治 |
| 1.7 立题依据及内容 |
| 第二章 P450 还原酶CPR对豌豆蚜抗逆性的功能研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 供试昆虫 |
| 2.2.2 主要仪器和试剂 |
| 2.2.3 基因序列和系统发育分析 |
| 2.2.4 组织解剖 |
| 2.2.5RNA提取 |
| 2.2.6 c DNA合成 |
| 2.2.7 基因片段PCR扩增 |
| 2.2.8 电泳检测 |
| 2.2.9 PCR产物胶回收 |
| 2.2.10 载体连接 |
| 2.2.11 热激转化 |
| 2.2.12 质粒提取 |
| 2.2.13 实时荧光定量PCR(q RT-PCR) |
| 2.2.14 干旱胁迫 |
| 2.2.15 dsRNA合成 |
| 2.2.16RNAi显微注射 |
| 2.2.17RNAi效率检测 |
| 2.2.18 CHC提取 |
| 2.2.19 IHC提取 |
| 2.2.20 GC-MS检测 |
| 2.2.21 扫描电镜观察 |
| 2.2.22 耐旱性测定 |
| 2.2.23 农药敏感性测定 |
| 2.2.24 统计学分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 ApCPR序列分析和RNAi策略 |
| 2.3.2 ApCPR系统发育分析 |
| 2.3.3 ApCPR时空表达分析 |
| 2.3.4 干旱胁迫对ApCPR表达的影响 |
| 2.3.5 ApCPR沉默效率检测 |
| 2.3.6 ApCPR沉默对CHC含量的影响 |
| 2.3.7 ApCPR沉默对IHC含量的影响 |
| 2.3.8 ApCPR沉默对耐旱性的影响 |
| 2.3.9 ApCPR沉默对豌豆蚜腹部体表的影响 |
| 2.3.10 ApCPR沉默对农药杀虫剂敏感性的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 载脂蛋白ApoD对豌豆蚜干旱耐受性的功能研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 供试昆虫 |
| 3.2.2 主要仪器和试剂 |
| 3.2.3 基因序列和系统发育分析 |
| 3.2.4 组织解剖 |
| 3.2.5RNA提取 |
| 3.2.6 c DNA合成 |
| 3.2.7 基因片段PCR扩增 |
| 3.2.8 电泳检测 |
| 3.2.9 PCR产物胶回收 |
| 3.2.10 载体连接 |
| 3.2.11 热激转化 |
| 3.2.12 质粒提取 |
| 3.2.13 实时荧光定量PCR(q RT-PCR) |
| 3.2.14 干旱胁迫 |
| 3.2.15 dsRNA合成 |
| 3.2.16RNAi显微注射 |
| 3.2.17RNAi效率检测 |
| 3.2.18 CHC提取 |
| 3.2.19 IHC提取 |
| 3.2.20 GC-MS检测 |
| 3.2.21 耐旱性测定 |
| 3.2.22 生殖力评价 |
| 3.2.23 统计学分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 ApApoD分子特征和RNAi策略分析 |
| 3.3.2 ApApoD系统发育分析 |
| 3.3.3 ApApoD时空表达分析 |
| 3.3.4 干旱胁迫对ApApoD表达的影响 |
| 3.3.5 ApApoD沉默效率检测 |
| 3.3.6 ApApoD沉默对HC含量的影响 |
| 3.3.7 ApApoD沉默对耐旱性的影响 |
| 3.3.8 ApApoD沉默对豌豆蚜生殖力的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 脂蛋白受体LpR对豌豆蚜干旱抗性的功能研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 供试昆虫 |
| 4.2.2 主要仪器和试剂 |
| 4.2.3 基因序列和系统发育分析 |
| 4.2.4 组织解剖 |
| 4.2.5RNA提取 |
| 4.2.6 cDNA合成 |
| 4.2.7 基因片段PCR扩增 |
| 4.2.8 电泳检测 |
| 4.2.9 PCR产物胶回收 |
| 4.2.10 载体连接 |
| 4.2.11 热激转化 |
| 4.2.12 质粒提取 |
| 4.2.13 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 4.2.14 干旱胁迫 |
| 4.2.15 dsRNA合成 |
| 4.2.16 RNAi显微注射 |
| 4.2.17 RNAi效率检测 |
| 4.2.18 CHC提取 |
| 4.2.19 IHC提取 |
| 4.2.20 GC-MS检测 |
| 4.2.21 耐旱性测定 |
| 4.2.22 生殖力评价 |
| 4.2.23 统计学分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 ApLpR分子特征和系统发育分析 |
| 4.3.2 ApLpR时空表达分析 |
| 4.3.3 干旱胁迫对ApLpR表达的影响 |
| 4.3.4 ApLpR沉默效率检测 |
| 4.3.5 ApLpR沉默对HC含量的影响 |
| 4.3.6 ApLpR沉默对耐旱性的影响 |
| 4.3.7 ApLpR沉默对豌豆蚜生殖力的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）灰飞虱对三氟苯嘧啶的抗性风险评估及代谢抗性机制初探（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 灰飞虱的研究概况 |
| 1.1.1 灰飞虱的分布与危害 |
| 1.1.2 灰飞虱的生物学特性 |
| 1.2 灰飞虱的抗药性研究进展 |
| 1.2.1 灰飞虱对有机氯类、有机磷类、氨基甲酸酯类杀虫剂抗性 |
| 1.2.2 灰飞虱对苯基吡唑类杀虫剂性 |
| 1.2.3 灰飞虱对昆虫生长调节剂类杀虫剂抗性 |
| 1.2.4 灰飞虱对新烟碱类杀虫剂抗性 |
| 1.2.5 灰飞虱对其他杀虫剂的抗性 |
| 1.3 灰飞虱的抗药性机理研究 |
| 1.3.1 昆虫表皮穿透速率下降 |
| 1.3.2 解毒代谢作用增强 |
| 1.3.3 靶标敏感性降低 |
| 1.4 抗性风险评估 |
| 1.4.1 抗性现实遗传力 |
| 1.4.2 抗性稳定性 |
| 1.4.3 交互抗性 |
| 1.4.4 生物适合度 |
| 1.5 三氟苯嘧啶研究现状 |
| 1.5.1 三氟苯嘧啶的理化性质与毒性 |
| 1.5.2 三氟苯嘧啶的作用机理 |
| 1.5.3 三氟苯嘧啶防效与安全性 |
| 1.5.4 三氟苯嘧啶的登记情况 |
| 1.6 研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 供试虫源及饲养 |
| 2.1.1 供试虫源 |
| 2.1.2 灰飞虱饲养方法 |
| 2.2 供试药剂、试剂和仪器 |
| 2.2.1 供试药剂 |
| 2.2.2 供试试剂 |
| 2.2.3 试验器具 |
| 2.3 灰飞虱生物活性测定 |
| 2.4 灰飞虱抗性选育 |
| 2.5 抗性现实遗传力估算和抗性发展速率预测 |
| 2.6 三氟苯嘧啶抗性稳定性测定 |
| 2.7 交互抗性测定 |
| 2.8 灰飞虱对三氟苯嘧啶的生物适合度 |
| 2.9 酶抑制剂效果测定 |
| 2.10 解毒代谢酶活性测定 |
| 2.10.1 羧酸酯酶(CarE)活力测定 |
| 2.10.2 谷胱甘肽S-转移酶(GST)活力测定 |
| 2.10.3 细胞色素P450单加氧酶(CYP450M)活力测定 |
| 2.10.4 蛋白含量测定 |
| 2.11 基因表达量测定 |
| 2.11.1 定量PCR引物设计 |
| 2.11.2 灰飞虱RNA提取 |
| 2.11.3 cDNA合成 |
| 2.11.4 荧光定量PCR |
| 2.12 数据处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 三氟苯嘧啶对灰飞虱抗性选育 |
| 3.2 抗性现实遗传力估算和抗性发展速率预测 |
| 3.3 灰飞虱抗三氟苯嘧啶品系的抗性稳定性 |
| 3.4 灰飞虱抗三氟苯嘧啶品系的交互抗性 |
| 3.5 灰飞虱抗三氟苯嘧啶品系的生物适合度 |
| 3.6 酶抑制剂效果测定 |
| 3.7 解毒代谢酶活力测定 |
| 3.8 抗性和敏感品系P450 基因表达量测定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 三氟苯嘧啶对灰飞虱的抗性选育 |
| 4.2 三氟苯嘧啶对灰飞虱的抗性风险评估 |
| 4.2.1 灰飞虱对三氟苯嘧啶的抗性现实遗传力 |
| 4.2.2 灰飞虱抗三氟苯嘧啶品系的抗性稳定性 |
| 4.2.3 三氟苯嘧啶的交互抗性 |
| 4.2.4 灰飞虱对三氟苯嘧啶的抗性适合度 |
| 4.3 灰飞虱对三氟苯嘧啶的代谢抗性机制 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（3）小菜蛾解毒酶对4类化合物的作用机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 小菜蛾的危害及分布 |
| 1.2 小菜蛾的抗药性 |
| 1.2.1 小菜蛾的田间抗药性 |
| 1.2.2 昆虫抗药性机理 |
| 1.3 昆虫解毒酶 |
| 1.3.1 谷胱甘肽-S-转移酶 |
| 1.3.2 羧酸酯酶 |
| 1.3.3 细胞色素P450酶 |
| 1.4 斑蝥素、吡唑和嘧啶类及拟除虫菊酯类杀虫剂 |
| 1.4.1 斑蝥素 |
| 1.4.2 吡唑和嘧啶类杀虫杀螨剂 |
| 1.4.3 拟除虫菊酯类杀虫剂 |
| 1.5 昆虫解毒酶对杀虫剂的解毒代谢 |
| 1.6 研究的目的和意义 |
| 第二章 小菜蛾解毒酶系对斑蝥素的解毒代谢 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 供试昆虫 |
| 2.1.2 试剂与材料 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 斑蝥素对小菜蛾的生物测定 |
| 2.2.2 亚致死剂量斑蝥素对小菜蛾的处理 |
| 2.2.3 斑蝥素处理后PSPs酶活性检测 |
| 2.2.4 斑蝥素处理后解毒酶系活性测定 |
| 2.2.5 统计分析方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 斑蝥素对小菜蛾的胃毒活性 |
| 2.3.2 斑蝥素对小菜蛾的PSPs活性的影响 |
| 2.3.3 斑蝥素处理后小菜蛾解毒酶系活性的变化 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 小菜蛾PxGSTs对唑虫酰胺的解毒代谢作用 |
| 3.1 材料与仪器 |
| 3.1.1 供试昆虫 |
| 3.1.2 试剂和材料 |
| 3.1.3 缓冲液配制 |
| 3.1.4 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 唑虫酰胺对小菜蛾的生物测定 |
| 3.2.2 唑虫酰胺对小菜蛾的处理 |
| 3.2.3 小菜蛾的RNA提取 |
| 3.2.4 用于实时定量PCR的 c DNA模板制作 |
| 3.2.5 实时定量PCR检测 |
| 3.2.6 PxGSTs基因合成和表达菌株构建 |
| 3.2.7 PxGSTs蛋白表达及纯化 |
| 3.2.8 PxGSTs重组蛋白酶动力学检测 |
| 3.2.9 杀虫剂对PxGSTs重组蛋白抑制检测 |
| 3.2.10 PxGSTs对唑虫酰胺的代谢效率测定 |
| 3.2.11 唑虫酰胺和PxGSTσ的结合模式分析 |
| 3.2.12 结合自由能运算 |
| 3.2.13 PxGSTσ基因定点突变与蛋白表达 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 唑虫酰胺对小菜蛾的胃毒作用 |
| 3.3.2 唑虫酰胺处理后小菜蛾PxGSTs转录水平变化 |
| 3.3.3 PxGSTs重组蛋白的表达和动力学分析 |
| 3.3.4 杀虫剂在体外对PxGSTs重组蛋白的抑制作用 |
| 3.3.5 PxGSTs重组蛋白对唑虫酰胺的代谢效率测定 |
| 3.3.6 PxGSTσ与唑虫酰胺结合模式分析 |
| 3.3.7 PxGSTσ定点突变和代谢效率测定 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 小菜蛾PxGSTs与其抑制剂GTX的相互作用 |
| 4.1 材料与仪器 |
| 4.1.1 试剂和材料 |
| 4.1.2 缓冲液配制 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 3种PxGSTs的基因合成、蛋白表达与纯化 |
| 4.2.2 PxGSTs重组蛋白酶动力学检测 |
| 4.2.3 GTX对 PxGSTs重组蛋白的抑制作用 |
| 4.2.4 PxGSTσ蛋白三维结构的同源模建和PxGSTσ-GTX复合物结构 |
| 4.2.5 分子动力学(MD)模拟 |
| 4.2.6 结合自由能计算 |
| 4.2.7 结合自由能单残基能量分解 |
| 4.2.8 丙氨酸扫描计算 |
| 4.2.9 PxGSTσ基因定点突变、蛋白表达和抑制检测 |
| 4.2.10 统计分析方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 GTX对 PxGSTs的抑制作用 |
| 4.3.2 PxGSTσ三维结构模型的构建 |
| 4.3.3 PxGSTσ-GTX复合物的分子动力学分析 |
| 4.3.4 PxGSTσ-GTX复合物结合模式分析。 |
| 4.3.5 结合自由能计算 |
| 4.3.6 氨基酸残基的自由能分解 |
| 4.3.7 基于CAS的定点突变 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 小菜蛾羧酸酯酶PxEst-6 对拟除虫菊酯的代谢机理 |
| 5.1 材料与仪器 |
| 5.1.1 供试昆虫 |
| 5.1.2 试剂和材料 |
| 5.1.3 缓冲液配制 |
| 5.1.4 实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 拟除虫菊酯对小菜蛾的胃毒测定 |
| 5.2.2 拟除虫菊酯类杀虫剂对小菜蛾的处理 |
| 5.2.3 实时定量PCR检测 |
| 5.2.4 PxEst-6 基因合成和定点突变 |
| 5.2.5 PxEst-6 的表达和纯化 |
| 5.2.6 PxEst-6 酶活力和酶抑制分析 |
| 5.2.7 PxEst-6 对拟除虫菊酯类杀虫剂的代谢效率分析 |
| 5.2.8 PxEst-6 三维结构模型的构建 |
| 5.2.9 分子对接模拟 |
| 5.2.10 分子动力学(MD)模拟 |
| 5.2.11 结合自由能计算 |
| 5.2.12 统计分析方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 4 种拟除虫菊酯对小菜蛾的毒杀作用 |
| 5.3.2 小菜蛾PxEst-6 的组织特异性表达 |
| 5.3.3 拟除虫菊酯处理后小菜蛾PxEst-6 转录水平变化 |
| 5.3.4 拟除虫菊酯对PxEst-6 的抑制活性以及PxEst-6 对拟除虫菊酯的代谢 |
| 5.3.5 4 种拟除虫菊酯与PxEst-6 的结合模式分析和分子动力学模拟 |
| 5.3.6 利用丙氨酸突变揭示4 种拟除虫菊酯代谢中的关键氨基酸 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（4）ABC转运蛋白在二化螟对氯虫苯甲酰胺和阿维菌素解毒代谢中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 综述 |
| 1 二化螟及其对杀虫剂的抗药性现状 |
| 2 昆虫对杀虫剂的抗药性机制 |
| 2.1 行为抗性 |
| 2.2 表皮抗性 |
| 2.3 靶标抗性 |
| 2.4 代谢抗性 |
| 3 ABC转运蛋白 |
| 3.1 ABC转运蛋白的分类 |
| 3.2 ABC转运蛋白的结构 |
| 3.3 ABC转运蛋白的功能 |
| 4 ABC转运蛋白在昆虫解毒代谢中的作用 |
| 4.1 昆虫ABC转运蛋白与Bt毒素 |
| 4.2 昆虫ABC转运蛋白与抗药性 |
| 5 研究目的和意义 |
| 第二章 亚致死剂量氯虫苯甲酰胺对二化螟整体基因表达水平的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试虫 |
| 1.2 二化螟人工饲料配制 |
| 1.3 主要试剂和仪器 |
| 1.4 转录组测序样本的制备 |
| 1.5 RNA提取,基因文库构建和转录组测序 |
| 1.6 转录组组装和unigene功能注释 |
| 1.7 差异表达基因的分析 |
| 1.8 实时定量PCR (RT-qPCR) |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 转录组测序和de novo组装 |
| 2.2 功能注释和分类 |
| 2.3 样本间的相关性分析 |
| 2.4 DEGs的鉴定与分析 |
| 2.5 DEGs的KEGG富集分析 |
| 2.6 转录组中解毒代谢和防御相关差异表达基因的分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 基于二化螟基因组和转录组的ABC转运蛋白基因鉴定分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 试虫饲养 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 二化螟ABC转运蛋白基因鉴定及系统发育分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 二化螟ABC转运蛋白基因的序列鉴定与分析 |
| 2.2 二化螟ABC转运蛋白基因的系统发育分析 |
| 3 讨论 |
| 第四章 ABC转运蛋白在二化螟对氯虫苯甲酰胺和阿维菌素解毒代谢中的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 试虫饲养 |
| 1.3 主要试剂和仪器 |
| 1.4 室内毒力测定和维拉帕米增效方法 |
| 1.5 二化螟敏感品系中ABC转运蛋白基因对氯虫苯甲酰胺和阿维菌素的诱导响应 |
| 1.6 荧光实时定量PCR |
| 1.6.1 总RNA提取和cDNA第一链的合成 |
| 1.6.2 定量PCR反应体系和条件 |
| 1.6.3 目标基因表达比较和数据统计方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 维拉帕米与氯虫苯甲酰胺和阿维菌素的协同作用 |
| 2.2 二化螟ABC转运蛋白基因对氯虫苯甲酰胺和阿维菌素的诱导响应 |
| 2.4 CsABCC8、CsABCG1C和CsABCH1在LC_(30)氯虫苯甲酰胺处理后特异组织的诱导响应 |
| 2.5 CsABCA4、CsABCE1、CsABCF1、CsABCF2、CsABCC8和CsABCH1在阿维菌素处理后特异组织的诱导响应 |
| 2.6 被氯虫苯甲酰胺诱导的ABC转运蛋白基因在二化螟中的表达分析 |
| 2.6.1 二化螟21个ABC转运蛋白基因在二化螟三龄幼虫中的相对表达量 |
| 2.6.2 CsABCC8、CsABCG1C和CsABCH1在二化螟不同发育阶段和不同组织中的表达量 |
| 3 讨论 |
| 第五章 二化螟ABC转运蛋白的体外表达及对杀虫剂的转运 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 试虫饲养 |
| 1.3 主要试剂和仪器 |
| 1.4 二化螟ABC转运蛋白开放阅读框的克隆验证与分析 |
| 1.4.1 总RNA的提取和cDNA的合成 |
| 1.4.1.1 总RNA提取 |
| 1.4.1.2 普通cDNA第一链的合成 |
| 1.5 目的片段体外表达载体构建 |
| 1.5.1 引物设计 |
| 1.5.2 目的片段扩增 |
| 1.5.3 表达载体酶切 |
| 1.5.4 PCR产物的纯化 |
| 1.5.5 目的片段与载体的连接与转化 |
| 1.5.6 单克隆的挑选及扩大培养 |
| 1.5.7 目标片段的检测与测序 |
| 1.5.8 质粒提取 |
| 1.5.9 序列分析 |
| 1.6 重组杆状病毒质粒的构建 |
| 1.6.1 表达质粒的转化与扩大培养 |
| 1.6.2 重组杆状病毒质粒的检测 |
| 1.6.3 重组杆状病毒质粒的提取 |
| 1.7 昆虫细胞Sf9的培养、转染、高滴度病毒液制备及蛋白表达 |
| 1.7.1 昆虫细胞Sf9的培养、保存 |
| 1.7.2 重组杆状病毒质粒对昆虫细胞的转染及高滴度病毒制备 |
| 1.7.3 目的蛋白的表达 |
| 1.8 免疫荧光检测ABC转运蛋白表达 |
| 1.9 细胞活性检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 ABC转运蛋白的开放阅读框的克隆验证与分析 |
| 2.2 ABC转运蛋白的体外表达 |
| 2.2.1 真核表达载体的构建 |
| 2.2.2 重组杆状病毒Bacmid DNA转染Sf9细胞 |
| 2.3 免疫荧光检测ABC转运蛋白的表达 |
| 2.4 过表达ABC转运蛋白对细胞活性的影响 |
| 2.4.1 过表达不同CsABC转运蛋白的Sf9细胞活性 |
| 2.4.2 CsABC转运蛋白对不同杀虫剂转运代谢 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（5）MrVoc1在罗伯茨绿僵菌与昆虫微生物群落互作中的作用研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 昆虫病原真菌、宿主及宿主微生物群落三者之间互作的研究概况 |
| 1.1.1 昆虫病原真菌与宿主之间的互作 |
| 1.1.2 宿主菌群与昆虫病原真菌之间的互作 |
| 1.1.3 宿主与宿主菌群之间的互作 |
| 1.2 生物体内甲基乙二醛的研究概况 |
| 1.2.1 生物体内甲基乙二醛的来源 |
| 1.2.2 甲基乙二醛对生物体的毒性 |
| 1.2.3 生物体内甲基乙二醛的降解途径 |
| 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验所用菌株与质粒载体 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 主要试剂与试剂盒 |
| 2.1.4 培养基的配制 |
| 2.1.5 实验所用引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌转化 |
| 2.2.2 根癌农杆菌的转化 |
| 2.2.3 根癌农杆菌介导的真菌遗传转化 |
| 2.2.4 过表达菌株的构建 |
| 2.2.5 真菌 RNA样品的制备和真菌 RNA的提取 |
| 2.2.6 反转录与实时荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 2.2.7 生物测定 |
| 2.2.8 罗伯茨绿僵菌毒力测定及菌虫保湿 |
| 2.2.9 菌虫血腔和肠道内微生物数量测定 |
| 2.2.10 菌虫中抑菌物质的提取及分离 |
| 2.2.11 菌虫提取物抑菌活性的检测 |
| 2.2.12 MrVoc1 蛋白的原核表达和纯化 |
| 2.2.13 MrVoc1 蛋白与抗生素的共孵育及其产物抑菌活性的检测 |
| 2.2.14 代谢组学样品制备及HPLC检测方法 |
| 2.2.15 大蜡螟尸体中甲基乙二醛的含量测定 |
| 2.2.16 甲基乙二醛(MG)对微生物的生长影响检测 |
| 2.2.17 白纹伊蚊(Aedes albopictus)肠道菌群的生长 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 MrVoc1 的序列与结构域分析 |
| 3.2 MrVoc1 的表达规律 |
| 3.3 MrVoc1 过表达菌株的构建 |
| 3.4 MrVoc1不影响罗伯茨绿僵菌的生长发育 |
| 3.5 MrVoc1 参与罗伯茨绿僵菌与昆虫微生物群落的互作 |
| 3.5.1 MrVoc1 的敲除显着降低感染的大蜡螟尸体中僵虫的比例 |
| 3.5.2 敲除MrVoc1显着增加感染过程中的大蜡螟体内细菌数量 |
| 3.6 MrVoc1 介导罗伯茨绿僵菌与昆虫体内微生物群落互作过程中抗菌物质的合成 |
| 3.6.1 昆虫体内细菌的分离及其16S rRNA系统发育树的构建 |
| 3.6.2 敲除MrVoc1 削弱大蜡螟尸体提取物对昆虫体内其它微生物的抑制作用 |
| 3.6.3 敲除MrVoc1 后大蜡螟尸体提取物中部分抑菌物质消失 |
| 3.7 MrVoc1 不影响罗伯茨绿僵菌和大肠杆菌对抗生素的抗性 |
| 3.7.1 MrVoc1 的敲除不影响罗伯茨绿僵菌对博来霉素的抗性 |
| 3.7.2 MrVoc1 蛋白不影响大肠杆菌对抗生素的抗性 |
| 3.7.3 抗生素与MrVoc1 蛋白反应后对大肠杆菌的抑菌活性不变 |
| 3.8 MrVoc1 介导罗伯茨绿僵菌与昆虫体内微生物群落互作过程中甲基乙二醛的代谢 |
| 3.8.1 过表达MrVoc1 改变罗伯茨绿僵菌的代谢物组 |
| 3.8.2 敲除MrVoc1 显着降低感染致死24 h的僵虫体内甲基乙二醛的含量 |
| 3.8.3 甲基乙二醛影响昆虫体内其他微生物的生长 |
| 4 讨论 |
| 5 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（6）BdmiR-994靶向BdCPCFC调控桔小实蝇对马拉硫磷的穿透抗性（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 桔小实蝇危害及抗药性现状 |
| 1.1 昆虫的抗药性机制 |
| 1.2 桔小实蝇与杀虫剂抗性 |
| 2 杀虫剂穿透抗性机制 |
| 2.1 昆虫的表皮结构与成分 |
| 2.2 昆虫的几丁质 |
| 2.3 昆虫的表皮烃 |
| 2.4 表皮蛋白 |
| 2.4.1 表皮蛋白分类 |
| 2.4.2 表皮蛋白与杀虫剂抗性的关系 |
| 2.5 表皮与杀虫剂抗性的关系 |
| 3 miRNA在昆虫抗药性中的研究现状 |
| 4 学位论文的研究目的、意义及主要内容 |
| 第二章 桔小实蝇对马拉硫磷穿透抗性形成的理化分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 1.3 不同施药方式下马拉硫磷对桔小实蝇的毒力测定 |
| 1.4 桔小实蝇抗性、敏感品系的药剂穿透率检测 |
| 1.5 桔小实蝇前胸背板超微结构观察 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 马拉硫磷对桔小实蝇的毒力 |
| 2.2 马拉硫磷在桔小实蝇抗性与敏感品系的穿透率 |
| 2.3 桔小实蝇马拉硫磷抗性与敏感品系前胸背板表皮的厚度 |
| 3 小结 |
| 本章讨论 |
| 第三章 桔小实蝇马拉硫磷抗性与敏感品系转录组比较分析 |
| 第一节 桔小实蝇马拉硫磷抗性相关m RNA的鉴定与分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 1.3 转录组样品收集以及总RNA提取 |
| 1.4 文库构建与测序 |
| 1.5 生物信息学分析 |
| 1.6 mRNA差异表达分析 |
| 1.7 荧光定量PCR(RT-qPCR)定量分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 mRNA转录组文库 |
| 2.2 桔小实蝇马拉硫磷抗性与敏感品系差异表达m RNA |
| 2.3 表皮蛋白基因的时空表达模式 |
| 3 小结 |
| 第二节 桔小实蝇马拉硫磷抗性相关miRNA的鉴定与分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 1.3 样品收集与及总RNA提取 |
| 1.4 建库与转录组分析 |
| 1.5 miRNA鉴定与差异表达分析 |
| 1.6 RT-qPCR定量分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 转录组文库与测序 |
| 2.2 miRNA鉴定与特征 |
| 2.3 差异表达miRNA |
| 3 小结 |
| 本章讨论 |
| 第四章 桔小实蝇BdmiR-994对BdCPCFC的靶向调控关系 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 1.3 BdmiR-994 mimic处理后的转录组文库构建 |
| 1.4 桔小实蝇抗性和敏感品系前胸背板表皮转录组文库构建 |
| 1.5 BdmiR-994 靶基因预测 |
| 1.6 生物素-链霉亲和素RNA Pull-down |
| 1.7 荧光原位杂交 |
| 1.8 双荧光素酶报告系统 |
| 1.9 mimic/inhibitor处理后的靶基因表达分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 BdmiR-994 靶基因筛选 |
| 2.2 生物素-链霉亲和素RNA Pull-down检测候选靶基因 |
| 2.3 BdmiR-994与BdCPCFC的表达调控关系 |
| 2.4 荧光原位杂交定位BdmiR-994/BdCPCFC |
| 2.5 双荧光素梅报告系统检测BdmiR-994与BdCPCFC的结合关系 |
| 3 小结 |
| 本章讨论 |
| 第五章 BdCPCFC/BdmiR-994 在桔小实蝇马拉硫磷穿透抗性中的功能 |
| 第一节 BdmiR-994 在桔小实蝇马拉硫磷穿透抗性中的功能分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 1.3 BdmiR-994 mimic/inhibitor处理 |
| 1.4 表皮超微结构观察 |
| 1.5 BdmiR-994 mimic处理后的解毒代谢酶活性分析 |
| 1.6 马拉硫磷敏感性测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 BdmiR-994 mimic处理后的解毒代谢酶活性 |
| 2.2 BdmiR-994 mimic/inhibitor处理后的前胸背板表皮厚度 |
| 2.3 BdmiR-994 mimic/inhibitor处理后的马拉硫磷敏感性测定 |
| 3 小结 |
| 第二节 BdCPCFC在桔小实蝇马拉硫磷穿透抗性中的功能分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 1.3 序列生物信息学分析 |
| 1.4 BdCPCFC转录与蛋白水平分析 |
| 1.5 BdCPCFC蛋白组织定位 |
| 1.6 胶体金免疫 |
| 1.7 表皮蛋白异源表达及几丁质结合能力测定 |
| 1.8 基于RNAi解析BdCPCFC功能 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 表皮蛋白CPCFC多重序列比对 |
| 2.2 桔小实蝇BdCPCFC在抗性与敏感品系中的表达 |
| 2.3 BdCPCFC蛋白组织定位 |
| 2.4 BdCPCFC与几丁质结合能力检测 |
| 2.5 桔小实蝇BdCPCFC功能解析 |
| 3 小结 |
| 本章讨论 |
| 第六章 主要结果结论、创新点及研究展望 |
| 1 主要结果和结论 |
| 1.1 桔小实蝇通过表皮增厚介导对马拉硫磷的穿透抗性 |
| 1.2 桔小实蝇马拉硫磷抗性相关基因挖掘 |
| 1.3 桔小实蝇BdmiR-994对BdCPCFC的靶向调控关系 |
| 1.4 BdmiR-994/BdCPCFC参与桔小实蝇对马拉硫磷的穿透抗性 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表论文及参研课题情况 |
| 论文发表目录 |
| 参会情况 |
| 参研课题 |
| 致谢 |
（7）飞蝗细胞色素P450的杀虫剂代谢解毒特性及其表达调控研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 飞蝗概述 |
| 1.1.1 飞蝗为害与防治 |
| 1.1.2 飞蝗研究动态 |
| 1.2 细胞色素P450 概述 |
| 1.2.1 细胞色素P450 的发现与命名 |
| 1.2.2 细胞色素P450 的分子特性 |
| 1.2.3 细胞色素P450 的催化机制 |
| 1.2.4 细胞色素P450 Redox Partners |
| 1.2.5 昆虫细胞色素P450 的生理功能 |
| 1.2.6 昆虫细胞色素P450 解毒功能研究方法 |
| 1.2.7 杀虫剂解毒相关P450 基因的调控研究 |
| 1.3 本文立题依据及主要研究内容 |
| 第二章 飞蝗微粒体细胞色素P450 含量及其对底物和杀虫剂的代谢活性比较 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试昆虫 |
| 2.1.2 飞蝗组织器官解剖 |
| 2.1.3 不同组织器官微粒体蛋白制备 |
| 2.1.4 微粒体蛋白浓度测定 |
| 2.1.5 微粒体细胞色素P450 含量测定 |
| 2.1.6 微粒体细胞色素P450 对模式底物催化活性比较 |
| 2.1.7 微粒体细胞色素P450 对杀虫剂代谢活性比较 |
| 2.1.8 统计分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 细胞色素P450 含量测定结果 |
| 2.2.2 细胞色素P450 对模式底物的催化活性 |
| 2.2.3 细胞色素P450 对杀虫剂的代谢活性 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 重组飞蝗CYP6FD1 蛋白对模式底物及杀虫剂代谢研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试昆虫及Sf9 细胞培养 |
| 3.1.2 重组bacmids的构建 |
| 3.1.3 CYP6FD1和CPR蛋白的重组表达 |
| 3.1.4 CO差光谱测定重组CYP6FD1 的完整性 |
| 3.1.5 重组CYP6FD1 的活性测定 |
| 3.1.6杀虫剂处理和细胞毒性实验 |
| 3.1.7 高效液相色谱-质谱联用分析杀虫剂代谢 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 重组飞蝗CYP6FD1和CPR表达分析 |
| 3.2.2 血红素前体对CYP6FD1 表达的影响 |
| 3.2.3 重组CYP6FD1 对模式底物催化活性测定 |
| 3.2.4 杀虫剂对CYP6FD1/CPR表达细胞的细胞毒性 |
| 3.2.5 CYP6FD1/CPR对杀虫剂的体外代谢 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 飞蝗CYP6FE1 重组表达及其杀虫剂代谢功能研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 供试昆虫及Sf9 细胞培养 |
| 4.1.2 LmCYP6FE1 重组表达 |
| 4.1.3 重组LmCYP6FE1 活性测定 |
| 4.1.4 高效液相色谱-质谱联用分析杀虫剂代谢 |
| 4.1.5 LmCYP6FE1 在飞蝗吡虫啉解毒中的功能分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 重组飞蝗CYP6FE1 表达分析 |
| 4.2.2 重组CYP6FE1 对模式底物活性测定 |
| 4.2.3 CYP6FE1/CPR对杀虫剂的体外代谢 |
| 4.2.4 LmCYP6FE1 基因沉默后飞蝗对吡虫啉的敏感性变化 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 飞蝗细胞色素b5分子特性及其在P450 介导的氧化反应中的功能研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 供试昆虫及Sf9 细胞培养 |
| 5.1.2 LmCyt-b5 全长c DNA克隆 |
| 5.1.3 LmCyt-b5 生物信息学分析 |
| 5.1.4 LmCyt-b5 的组织器官特异性表达分析 |
| 5.1.5 沉默LmCyt-b5表达后飞蝗对杀虫剂敏感性分析 |
| 5.1.6 沉默LmCPR和(或)LmCyt-b5表达后P450 酶活性分析 |
| 5.1.7 重组LmCyt-b5对LmCYP6FD1 活性的影响 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 LmCyt-b5 全长c DNA克隆及序列分析 |
| 5.2.2 昆虫Cyt-b5的系统发育关系 |
| 5.2.3 LmCyt-b5 的组织器官特异性表达模式分析 |
| 5.2.4 沉默LmCyt-b5表达后飞蝗对杀虫剂敏感性分析 |
| 5.2.5 沉默LmCPR和(或)LmCyt-b5表达后P450 酶活性分析 |
| 5.2.6 重组LmCyt-b5对LmCYP6FD1 活性的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 转录因子CncC对飞蝗杀虫剂解毒基因表达调控研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 供试昆虫 |
| 6.1.2 飞蝗CncC基因克隆及序列分析 |
| 6.1.3 沉默CncC表达后飞蝗对杀虫剂敏感性分析 |
| 6.1.4 沉默CncC后飞蝗转录组数据库建立 |
| 6.1.5 差异表达基因验证及序列分析 |
| 6.1.6 差异表达基因的杀虫剂解毒功能验证 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 干扰LmCncC基因表达后飞蝗对杀虫剂敏感性分析 |
| 6.2.2 沉默CncC基因后差异表达基因筛选 |
| 6.2.3 差异表达基因序列验证 |
| 6.2.4 RT-qPCR验证差异表达基因 |
| 6.2.5 差异表达基因的杀虫剂解毒功能分析 |
| 6.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
（8）农药对胡瓜钝绥螨的风险评估及甲维盐的胁迫效应机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 非靶标节肢动物 |
| 1.1.1 非靶标节肢动物在生态系统中的地位 |
| 1.1.2 NTAs风险评估研究进展及评估体系 |
| 1.1.3 NTAs的风险评价体系中指示物种的确定 |
| 1.1.4 物种敏感度分布(species sensitivity distribution,SSD) |
| 1.2 胡瓜钝绥螨的生物防治现状 |
| 1.2.1 胡瓜钝绥螨及其应用 |
| 1.2.2 朱砂叶螨及防治现状 |
| 1.3 选择性杀虫(螨)剂 |
| 1.3.1 选择性杀虫(螨)剂的研究现状 |
| 1.3.2 本研究高效选择性药剂的筛选 |
| 1.3.3 甲维盐的研究现状 |
| 1.4 化学药剂对昆虫(螨)的毒性效应机制 |
| 1.4.1 药剂对物种表皮穿透作用的研究 |
| 1.4.2 解毒代谢酶和保护酶与昆虫(螨)毒性响应的关系研究 |
| 1.4.3 靶标受体与物种毒性响应的关系研究 |
| 1.5 转录组学在生态毒理中的应用 |
| 1.6 代谢组学在生态毒理中的应用 |
| 1.7 论文设计 |
| 1.7.1 研究目的 |
| 1.7.2 研究内容 |
| 1.7.3 技术路线 |
| 2 农药对捕食螨胡瓜钝绥螨和害螨朱砂叶螨的毒性效应 |
| 2.1 供试材料与方法 |
| 2.1.1 供试虫源 |
| 2.1.2 仪器与试剂 |
| 2.1.3 胡瓜钝绥螨室内养殖方法 |
| 2.1.4 生物测定方法 |
| 2.1.5 结果处理 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 参比试验结果 |
| 2.2.2 25 种农药对胡瓜钝绥螨的急性毒性结果 |
| 2.2.3 25 种农药对朱砂叶螨的急性毒性结果 |
| 2.2.4 胡瓜钝绥螨和朱砂叶螨对25 种农药的敏感性差异 |
| 2.3 本章小结 |
| 3 农药对胡瓜钝绥螨的生态风险及敏感性地位评估 |
| 3.1 农药对胡瓜钝绥螨的生态风险评估 |
| 3.1.1 初级暴露评估 |
| 3.1.2 初级效应分析 |
| 3.1.3 初级风险表征 |
| 3.1.4 风险商值HQ值的分析 |
| 3.1.5 胡瓜钝绥螨和离盲走螨风险商值HQ的比较 |
| 3.2 胡瓜钝绥螨的敏感性地位评估 |
| 3.2.1 NTAs物种和药剂的选择 |
| 3.2.2 NTAs物种毒性数据来源 |
| 3.2.3 物种敏感度分布SSDs曲线的绘制 |
| 3.2.4 物种敏感度分布SSDs模型的建立 |
| 3.2.5 SSDs模型的检验 |
| 3.2.6 HC5 和PAF的计算 |
| 3.2.7 甲维盐对靶标害虫的防治效果 |
| 3.3 本章小结 |
| 4 甲维盐对胡瓜钝绥螨发育繁殖及种群参数的影响 |
| 4.1 试验方法 |
| 4.1.1 甲维盐染毒方法及浓度设置 |
| 4.1.2 两性生命表的构建 |
| 4.1.3 数据处理 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 甲维盐对胡瓜钝绥螨生长发育及繁殖力的影响 |
| 4.2.2 甲维盐对胡瓜钝绥螨种群参数的影响 |
| 4.2.3 甲维盐对胡瓜钝绥螨年龄-龄期存活率(sxj)的影响 |
| 4.2.4 甲维盐对胡瓜钝绥螨种群年龄-特征存活率(lx)和繁殖力(mx)的影响 |
| 4.2.5 甲维盐对胡瓜钝绥螨生命期望值(exj)的影响 |
| 4.2.6 甲维盐对胡瓜钝绥螨繁殖率贡献值(vxj)的影响 |
| 4.2.7 甲维盐对胡瓜钝绥螨种群预测的影响 |
| 4.3 本章小结 |
| 5 甲维盐对胡瓜钝绥螨的表皮穿透和酶的诱导效应 |
| 5.1 甲维盐胁迫下的表皮穿透研究 |
| 5.1.1 甲维盐浓度的设计 |
| 5.1.2 试验试剂与材料 |
| 5.1.3 试验方法和步骤 |
| 5.1.4 甲维盐标准品图谱分析 |
| 5.1.5 甲维盐标准品标准曲线的绘制 |
| 5.1.6 甲维盐理论测试浓度 |
| 5.1.7 甲维盐在朱砂叶螨和胡瓜钝绥螨体内的含量 |
| 5.2 甲维盐胁迫下螨体内酶活性研究 |
| 5.2.1 供试试剂 |
| 5.2.2 供试仪器 |
| 5.2.3 试验方法 |
| 5.2.4 数据处理 |
| 5.2.5 甲维盐对胡瓜钝绥螨解毒代谢酶活性的影响 |
| 5.2.6 甲维盐对胡瓜钝绥螨保护酶活性的影响 |
| 5.3 本章小结 |
| 6 甲维盐胁迫下胡瓜钝绥螨的转录组学分析 |
| 6.1 试验材料 |
| 6.1.1 供试虫源 |
| 6.1.2 试验试剂与材料 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 样本采集 |
| 6.2.2 总RNA提取与质量检测 |
| 6.2.3 mRNA文库的构建及Illumina测序 |
| 6.2.4 转录组测序数据组装及生物信息分析 |
| 6.3 荧光定量q-PCR验证 |
| 6.3.1 引物的设计 |
| 6.3.2 cDNA第一链合成 |
| 6.3.3 荧光定量PCR检测 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 总RNA质量检测结果 |
| 6.4.2 转录组测序基本信息 |
| 6.4.3 基因功能注释 |
| 6.4.4 基因差异表达分析 |
| 6.4.5 差异表达基因的GO功能注释 |
| 6.4.6 差异表达基因的KEGG代谢通路富集分析 |
| 6.4.7 胡瓜钝绥螨解毒酶基因差异性分析 |
| 6.4.8 胡瓜钝绥螨保护酶基因表达水平分析 |
| 6.4.9 靶标受体基因表达水平分析 |
| 6.4.10 q-PCR靶标基因验证结果 |
| 6.5 本章小结 |
| 7 甲维盐胁迫下胡瓜钝绥螨全组分代谢组学研究 |
| 7.1 试验材料 |
| 7.1.1 供试虫源 |
| 7.1.2 试验试剂与材料 |
| 7.1.3 主要仪器设备 |
| 7.2 试验方法 |
| 7.2.1 样本采集 |
| 7.2.2 代谢物提取 |
| 7.2.3 液质联用检测条件 |
| 7.2.4 数据分析和潜在差异代谢物鉴定 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 含量前20 的代谢产物 |
| 7.3.2 代谢物的生物学注释 |
| 7.3.3 胡瓜钝绥螨在甲维盐胁迫前后差异代谢产物的筛选 |
| 7.3.4 胡瓜钝绥螨在甲维盐胁迫前后代谢轮廓的影响 |
| 7.3.5 胡瓜钝绥螨处理前后差异代谢产物的代谢通路富集 |
| 7.4 本章小结 |
| 8 主要结论、创新点及研究展望 |
| 8.1 主要结论 |
| 8.2 主要创新点 |
| 8.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）甜菜夜蛾GST和UGT与杀虫剂抗性的关系（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 害虫抗药性 |
| 1.2 害虫抗药性的机理 |
| 1.2.1 行为抗性 |
| 1.2.2 穿透抗性 |
| 1.2.3 靶标抗性 |
| 1.2.4 代谢抗性 |
| 1.3 昆虫解毒代谢酶 |
| 1.3.1 Ⅰ相 解毒代谢 |
| 1.3.2 Ⅱ相解毒代谢 |
| 1.4 甜菜夜蛾抗药性 |
| 1.4.1 国内外甜菜夜蛾抗性现状 |
| 1.4.2 甜菜夜蛾抗药性机制 |
| 1.4.3 甜菜夜蛾抗药性研究存在问题 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 谷胱甘肽-S-转移酶介导杀虫剂抗性及表达调控机制 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试昆虫 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 杀虫剂毒力测定 |
| 2.1.5 基因克隆 |
| 2.1.6 SeGST基因上游启动子序列的克隆与预测 |
| 2.1.7 实时荧光定量PCR |
| 2.1.8 GST基因的原核表达与蛋白纯化 |
| 2.1.9 原核表达GSTs酶的活性测定 |
| 2.1.10 GST酶对杀虫剂的代谢活性 |
| 2.1.11 杀虫剂代谢的HPLC分析 |
| 2.1.12 荧光报告质粒构建与荧光报告活性分析 |
| 2.2 结果分析 |
| 2.2.1 增效剂DEM对抗性水平的影响 |
| 2.2.2 敏感和HZ16种群之间的GST酶活性差异 |
| 2.2.3 敏感和HZ16种群GST基因表达水平差异 |
| 2.2.4 SeGSTs的原核表达和蛋白纯化 |
| 2.2.5 GST对杀虫剂的代谢作用 |
| 2.2.6 SeGSTs转录因子结合位点的预测 |
| 2.2.7 转录因子的表达水平 |
| 2.2.8 CncC和Maf增加SeGST启动子的转录活性 |
| 2.2.9 AhR和ARNT上调SeGST启动子的转录活性 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 甜菜夜蛾尿苷二磷酸糖基转移酶对毒死蜱敏感性的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试昆虫 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 杀虫剂生物测定 |
| 3.1.5 实时荧光定量PCR |
| 3.1.6 UGT酶活性测定 |
| 3.1.7 数据分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 甜菜夜蛾抗性种群对毒死蜱的抗性水平与UGT酶活性 |
| 3.2.2 抗性种群UGT基因的表达水平 |
| 3.2.3 甜菜夜蛾UGT基因的诱导表达 |
| 3.2.4 UGT诱导表达对毒死蜱毒力的影响 |
| 3.2.5 UGT酶抑制剂对毒死蜱毒力的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录: 攻读硕士学位期间学术论文发表情况 |
| 致谢 |
（10）G蛋白信号调控基因在罗伯茨绿僵菌生长发育、抗逆和致病过程中的功能分析（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词和符号表 |
| 第一章 文献综述 |
| 引言 |
| 1.1 丝状真菌营养生长和繁殖研究进展 |
| 1.1.1 丝状真菌营养生长 |
| 1.1.2 丝状真菌繁殖 |
| 1.1.3 丝状真菌营养生长的分子机理 |
| 1.1.4 丝状真菌繁殖的分子机理 |
| 1.2 丝状真菌对昆虫致病研究概述 |
| 1.2.1 昆虫病原真菌致病机制 |
| 1.2.2 昆虫病原真菌致病相关因子研究进展 |
| 1.3 真菌中G蛋白信号调控因子RGS的研究进展 |
| 1.3.1 酵母中G蛋白信号转导途径 |
| 1.3.2 稻瘟菌中G蛋白信号转导途径 |
| 1.3.3 其他真菌中G蛋白信号转导途径 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究目的和意义 |
| 2.2 主要研究内容 |
| 第三章 罗伯茨绿僵菌中G蛋白信号调控因子生物信息学分析 |
| 3.1 材料及其来源 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 主要培养基配方 |
| 3.1.5 主要试剂溶液配方 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 菌株和培养条件 |
| 3.2.2 MrRGS系统进化树构建 |
| 3.2.3 MrRGS氨基酸序列保守功能域、信号肽及跨膜结构的预测 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 MrRGS1生物信息学分析结果 |
| 3.3.2 MrRGS2生物信息学分析结果 |
| 3.3.3 MrRGS3生物信息学分析结果 |
| 3.3.4 MrRGS4生物信息学分析结果 |
| 3.3.5 MrRGS5生物信息学分析结果 |
| 3.3.6 MrRGS6生物信息学分析结果 |
| 3.3.7 MrRGS7生物信息学分析结果 |
| 3.4 结论与讨论 |
| 第四章 不同G蛋白信号调控因子在罗伯茨绿僵菌生长发育中的功能 |
| 4.1 材料及其来源 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 实验试剂 |
| 4.1.4 主要培养基配方 |
| 4.1.5 主要试剂溶液配方 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 菌株和培养条件 |
| 4.2.2 Mrrgs在罗伯茨绿僵菌不同生长发育阶段表达分析 |
| 4.2.3 罗伯茨绿僵菌Mrrgs的敲除 |
| 4.2.4 菌落形态观察、营养生长和产孢量的测定 |
| 4.2.5 敲除突变株中产孢相关基因表达量的测定 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 Mrrgs在绿僵菌不同生长发育阶段的表达水平 |
| 4.3.2 Mrrgs突变体的获得 |
| 4.3.3 Mrrgs1、Mrrgs2和Mrrgs6调控营养生长和分生孢子产生 |
| 4.4 结论与讨论 |
| 第五章 不同G蛋白信号调控因子对杀虫毒力的影响及其杀虫机制的初步研究 |
| 5.1 材料及其来源 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.1.3 实验试剂 |
| 5.1.4 主要培养基 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 菌株和培养条件 |
| 5.2.2 不同敲除突变株毒力测试 |
| 5.2.3 附着胞形成率测定 |
| 5.2.4 对绿僵菌表面疏水性测定 |
| 5.2.5 用HPLC法测定绿僵菌中cAMP的含量 |
| 5.3 实验结果与分析 |
| 5.3.1 Mrrgs调控罗伯茨绿僵菌致病性 |
| 5.3.2 Mrrgs1、Mrrgs3、Mrrgs5和Mrrgs7参与调控附着胞的分化 |
| 5.3.3 Mrrgs3和Mrrgs5调控罗伯茨绿僵菌气生菌丝的疏水性 |
| 5.3.4 Mrrgs调控胞内的cAMP水平 |
| 5.4 结论与讨论 |
| 第六章 不同G蛋白信号调控因子在罗伯茨绿僵菌抗逆境中的作用 |
| 6.1 材料及其来源 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 实验仪器 |
| 6.1.3 实验试剂 |
| 6.1.4 主要培养基 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 菌株和培养条件 |
| 6.2.2 对化学药品耐受能力的测定 |
| 6.2.3 对紫外和热胁迫耐受力的测定 |
| 6.3 实验结果与分析 |
| 6.3.1 Mrrgs参与调控细胞壁完整性、抗氧化和抗渗透压能力 |
| 6.3.2 Mrrgs5参与调控紫外逆境耐受性、Mrrgs7参与调控热耐受性 |
| 6.4 结论与讨论 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 结论与讨论 |
| 7.1.1 罗伯茨绿僵菌G蛋白信号调控因子MrRGS生物信息学分析 |
| 7.1.2 G蛋白信号调控因子在罗伯茨绿僵菌生长发育过程中的作用 |
| 7.1.3 G蛋白信号调控因子对罗伯茨绿僵菌致病性的调控作用 |
| 7.1.4 G蛋白信号调控因子在罗伯茨绿僵菌抗逆性中的作用 |
| 7.2 展望 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 参与科研项目 |
| 发表论文 |
四、HPLC在杀虫剂表皮穿透研究中的应用（论文参考文献）
- [1]豌豆蚜表皮碳氢化合物合成和转运相关基因的功能研究[D]. 乔建文. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [2]灰飞虱对三氟苯嘧啶的抗性风险评估及代谢抗性机制初探[D]. 温胜芳. 山东农业大学, 2021(01)
- [3]小菜蛾解毒酶对4类化合物的作用机理研究[D]. 李一帆. 西北农林科技大学, 2021
- [4]ABC转运蛋白在二化螟对氯虫苯甲酰胺和阿维菌素解毒代谢中的作用研究[D]. 杨雪梅. 扬州大学, 2021
- [5]MrVoc1在罗伯茨绿僵菌与昆虫微生物群落互作中的作用研究[D]. 张丹. 浙江大学, 2021(01)
- [6]BdmiR-994靶向BdCPCFC调控桔小实蝇对马拉硫磷的穿透抗性[D]. 蒙力维. 西南大学, 2021
- [7]飞蝗细胞色素P450的杀虫剂代谢解毒特性及其表达调控研究[D]. 刘娇. 山西大学, 2020
- [8]农药对胡瓜钝绥螨的风险评估及甲维盐的胁迫效应机制[D]. 程沈航. 中国矿业大学(北京), 2020(01)
- [9]甜菜夜蛾GST和UGT与杀虫剂抗性的关系[D]. 黄河. 南京农业大学, 2019(08)
- [10]G蛋白信号调控基因在罗伯茨绿僵菌生长发育、抗逆和致病过程中的功能分析[D]. 谢天. 安徽农业大学, 2019(05)