一、心管发生的分子机制（论文文献综述）
李小灯[1]（2021）在《lncRNA ihha-as在斑马鱼早期胚胎发育中的功能研究》文中研究表明近年来,随着生物信息学与基因组学的发展,研究发现并不是所有的转录产物都具有编码功能。其中长链非编码RNA（long noncoding RNA,lnc RNA）是指长度大于200 nt,不具备蛋白质编码功能的一类RNA。但其能够在多个生物学水平上对基因表达进行调控。ihha-as（indian hedgehog signaling molecule a antisense）是存在于编码基因ihha（indian hedgehog signaling molecule a）附近的一条单外显子反义长链非编码RNA,研究发现ihha在斑马鱼发育和代谢过程中有着非常重要的作用。但是其反义lnc RNA ihha-as在斑马鱼早期胚胎和心血管发育过程中的作用至今没有报道。因此本研究旨在确定ihha-as在斑马鱼早期胚胎和心血管发育中的作用。为了探究ihha-as在斑马鱼早期胚胎和心血管发育中的作用,我们进行了一些研究。首先对ihha-as进行了生物信息学分析;其次利用q PCR和原位杂交确定了ihha-as在斑马鱼中的时空表达;然后观察了ihha-as过表达后对斑马鱼早期发育和心血管标志基因的影响;最后利用原位杂交和q PCR检测了morpholino干扰以及ihha-as挽救后对心血管形态、ihha-as的正义编码基因ihha和心血管发育标记基因表达的影响。结果显示,ihha-as是由斑马鱼9号染色体产生的一个具有极高保守性的反义lnc RNA;时空表达发现ihha-as在斑马鱼不同发育时期和成鱼不同器官中都具有一定的表达,尤其在心脏和脑中含量较高;过表达后,斑马鱼胚胎未发生明显的形态和功能变化,但是心房特异性肌球蛋白重链（atrium-specific myosin heavy chain,amhc）、心室特异性肌球蛋白重链（ventricular myosin heavy chain,vmhc）、心肌轻链蛋白基因（cardiae myosin light chain 2,cmlc2）和血管内皮生长因子受体（Fetal liver kinase 1,flk1）等心血管标记基因均有所上调;ihha-as-MO敲低后,斑马鱼出现心包水肿、心脏出血和骨骼弯曲等症状,心血管标记基因的表达量明显下调,原位杂交表明敲低后心脏未环化、心血管发育变慢;ihha-as挽救后,斑马鱼畸形症状有所缓解,心血管标记基因的表达量上升,心血管发育异常得到改善;最后ihha-as敲低后,编码基因ihha表达量明显增加,挽救后表达大幅度下降。这些结果表明长链非编码RNA ihha-as通过影响ihha表达,来调控斑马鱼早期心血管发育。本研究对lnc RNA在斑马鱼早期心血管发育过程中的相关分子机制及生物学功能提供了一定的实验依据。
刘静雯[2]（2020）在《趋化因子信号调控胚胎左右不对称》文中指出脊椎动物在它们的心血管及消化系统的结构和位置上都显示出惊人的左右不对称的特征,例如心脏位于左侧,而肝脏位于右侧。起初,早期的胚胎会沿着预定的体轴的中线进行对称的发育,这种胚胎的对称发育会在体节期随着左右组织者（left-right organizer,LRO）内纤毛的产生和不对称的液流的出现而被打破。左右组织者是位于脊柱末端的的一个暂时的器官。在斑马鱼中,被纤毛所覆盖的左右组织者就是指KV囊泡（Kupffer’s vesicle,KV）。之前的研究表明非对称的KV囊泡的结构以及KV纤毛运动产生逆时针方向的nodal液流。非对称的nodal液流导致早期不对称基因,例如spaw和pitx2c,特异地在左侧侧板中胚层表达,最终确立胚胎左右不对称的图式。这种左右不对称的图式形成机制在许多的脊椎动物中都是保守的,并且这种图式形成缺陷会造成许多的出生缺陷,其中包括先天性心脏畸形。KV囊泡起源于背部先驱者细胞（Dorsal forerunner cells,DFCs）,背部先驱者细胞就是原肠胚时期背部组织者区域附近的一群特化的上皮细胞。背部先驱者细胞会在原肠期经历剧烈的增殖,然后脱离细胞周期形成特化的有长纤毛的KV囊泡细胞。背部先驱者细胞增殖的缺陷经常伴随着KV囊泡纤毛形成缺陷,但是人们对细胞周期进程与纤毛形成之间的功能及分子联系却知之甚少。本研究以斑马鱼为模式生物,揭示趋化因子信号受体Cxcr4a通过调控背部先驱者细胞的增殖和KV囊泡纤毛的形成来影响左右不对称图式形成的具体机制。功能分析揭示Cxcr4a通过ERK1/2信号通路诱导cyclin D1的表达,Cyclin D1-CDK4/6复合体驱动背部先驱者细胞中G1/S期转换,促进背部先驱者细胞增殖,并且能够磷酸化Foxj1a蛋白,Foxj1a蛋白的磷酸化阻止Foxj1a蛋白与蛋白酶体19S调节亚基Psmd4b的结合,导致Foxj1a不能通过不依赖泛素的蛋白酶体途径进行降解。Foxj1a蛋白的升高诱导KV纤毛的形成和延伸,使KV能够行使其正常的功能。外包期背部先驱者细胞的快速增殖不仅为KV囊泡的建立提供足够数目的细胞,更为了接下来的KV纤毛生成留下足够多的zFoxj1a蛋白。综上所述,本研究不仅揭示Cxcr4a在左右不对称图式形成中的重要作用,并且提出在左右不对称发育过程中细胞周期进程与纤毛形成之间互相联系的观点,为接下来关于左右不对称的研究提供新的研究思路和方法。
李晓亮[3]（2020）在《15q11.2微缺失导致全肺静脉异位引流心肌发育异常的分子机制研究》文中认为目的:完全型肺静脉异位引流（TAPVC）是一种先天性心血管疾病,约占先天性心脏病的2%,不仅心肺连接出现异位,心脏结构发育和功能也会出现异常,但其致病机制不明。本文通过对TAPVC病例进行拷贝数变异检测,并且进一步通过细胞模型研究拷贝数变异导致TAPVC并引起心肌机能改变的发生机制,以从拷贝数变异、体外心肌分化过程中转录组差异和心肌特性的改变入手,解释TAPVC的发生机制。方法:1.利用CNVplex?技术,对231例TAPVC患者和200例健康对照样本进行检测,探讨TAPVC患者中CNV的发生率以及与相关临床表型的关系。2.利用i PSC技术诱导15q11.2微缺失的TAPVC患者核心家系（Trio）的i PS细胞系,建立细胞研究模型,通过i PSC体外诱导分化成心肌细胞,并对分化过程中关键阶段的细胞进行转录组测序,检测受影响的信号通路以及心肌细胞各阶段形态功能和分化标志物,分析患者和正常人之间心肌细胞的形态、分化效率、分化各个时期标志物的表达量和定位的差异。3.通过对15q11.2 BP1-BP2区域内相关基因的敲除,研究15q11.2微缺失对心肌细胞分化和功能的影响,初步阐明15q11.2微缺失与心肌功能异常的相关性。结果:1.231例TAPVC患者中,携带可能致病的拷贝数变异患者22例;200例健康对照组中检测出临床意义不明的拷贝数变异6例。统计学分析显示,与正常组比较15q11.2近端微缺失在TAPVC患者中显着富集。2.通过i PS技术建立15q11.2微缺失的TAPVC患者核心家系的i PS细胞系模型,研究发现患儿的i PSCs在心肌分化的过程中,分化各个时期标志物和15q11.2区域蛋白编码基因的表达量、分化效率、心肌细胞形态、跳动频率和收缩力度相较于正常对照组均降低,结果存在统计学差异;转录组测序结果表明TAPVC致病相关基因（如PITX2,NKX2-5和ANKRD1）在先证者中存在显着的高表达。3.家系成员中表型正常的先证者父亲i PSCs在干细胞阶段TUBGCP5和NIPA1的表达存在异质性,不同克隆之间表现出TUBGCP5和NIPA1表达的不一致性,并且发现TUBGCP5基因表达降低的克隆,心肌分化效率降低。4.TUBGCP5敲除后的i PSCs在诱导分化心肌细胞过程中分化各个时期标志物的表达量、分化效率、心肌细胞形态,跳动频率和收缩力度相较于正常对照组都有降低的趋势,结果存在统计学差异。说明微缺失中TUBGCP5基因表达的异常是引起心肌功能异常的关键基因之一。结论:本研究发现15q11.2微缺失在TAPVC患者中显着富集。细胞模型实验表明,TAPVC核心家系中15q11.2缺失携带者的TUBGCP5、CYFIP1、NIPA2和NIPA1基因表达受到了显着影响,在不同克隆之间存在异质性。TUBGCP5表达降低的克隆,心肌分化过程中Marker基因表达以及心肌分化效率和质量均受到影响,利用转录组测序发现在心肌细胞分化过程中胚层阶段15q11.2微缺失会引起TAPVC的致病相关基因（如PITX2,NKX2-5和ANKRD1）表达量升高。进而利用Crispr敲除发现,15q11.2微缺失中TUBGCP5基因表达降低影响心肌细胞的正常分化,是导致TAPVC发病的重要分子机制。
庄思斯[4]（2020）在《基于斑马鱼模型的miR-375过表达致心脏发育异常的作用机制研究》文中研究指明先天性心脏病（Congenital heart disease,CHD）是全球婴儿出生缺陷中最常见的疾病,其发生率高,严重危害人类健康,给家庭和社会带来沉重的医疗和经济负担。CHD的发生机制仍尚未明确,可能是由复杂的遗传因素和环境因素共同作用的结果,随着新的基因测序技术,尤其是反向遗传技术的进步,一些新的基因被发现和CHD相关,因此展开了一系列的研究。Micro RNAs（mi RNA）作为一种小的非编码RNA,通过与靶基因的结合来调控靶基因的表达,在生物体生长发育和疾病发生等过程中发挥重要作用,尤其对心脏的正常发育具有重要意义。在先前对自然流产的室间隔缺损胚胎组织样本的研究中,课题组采用Microarray技术筛选出一系列差异性高表达的基因序列,对其中的mi R-375进行进一步深入的研究的基础上,前期研究在细胞学水平证实了mi R-375在心肌细胞分化中起着关键作用。本研究采用反向遗传学技术进一步通过斑马鱼模型来深入探讨mi R-375在斑马鱼心脏发育中的重要作用及其作用机制。通过在斑马鱼胚胎中显微注射不同浓度的mi R-375 mimic构建mi R-375过表达的动物模型,在体观察斑马鱼的心脏发育过程。我们发现mi R-375的过度表达对斑马鱼胚胎的心脏发育造成一系列的损伤,包括心率减慢、心包水肿和循环异常。同时,除了心脏的表型,斑马鱼其他器官也不同程度受到影响,包括脑、眼睛、消化系统、骨骼和尾鳍等,提示mi R-375过表达对胚胎的影响除了心脏还涉及其他多系统。通过实时定量PCR技术,我们证实了过表达mi R-375会显着抑制心脏发育相关基因的表达。进一步通过双荧光素酶报告基因研究证实了notch2是mi R-375的靶基因,同时过表达mi R-375之后NOTCH信号通路相关下游基因的表达也受到明显抑制,胚胎整体原位杂交技术显示心脏发育关键基因notch2的表达明显下调,表达范围变小。证实过表达mi R-375影响斑马鱼心脏发育是通过直接作用于靶基因notch2进而影响NOTCH信号通路实现的。综上所述,斑马鱼可以作为一种优质的动物模型运用于心脏发育的研究中,mi R-375可以通过作用于靶基因notch2影响NOTCH信号通路从而影响斑马鱼心脏的发育。
刘慧霞[5]（2019）在《中间丝蛋白desmin、LaminA与早期人胚心脏传导系统的构建》文中研究说明研究背景:心血管系统是人和脊椎动物胚体内最早发育和发挥作用的器官系统。心脏通过一个专门的组织网络——心脏传导系统来精确地启动和传递动作电位,从而实现心房和心室的协调收缩。窦房结、房室结、房室束（希氏束）与左右束支近端部分构成中枢传导系统,左右束支远端部分和外周心室传导网络构成周围传导系统。由于胚胎心脏发育是一个复杂的过程,以及人胚胎标本的特殊性,人胚胎传导系统的发育机制尚未阐明。近几十年,随着分子生物学技术的快速发展,应用细胞追踪、转基因、条件性基因敲除等技术对鸡胚、啮齿类动物和斑马鱼胚胎心脏传导系统发育的研究表明,传导系统的发育和分化依赖于体内复杂的信号网络,包括T-box转录因子Tbx3。在小鼠胚胎,Tbx3作为阻遏蛋白可抑制腔室工作心肌特异性蛋白（心钠素Nppa、快传导缝隙连接蛋白CX43和CX40等）的表达,从而保证Tbx3阳性的原始心肌细胞分化成中枢传导系统的心肌细胞,而不向腔室工作心肌方向分化。转基因动物研究表明,Tbx3异位表达会出现传导系统功能异常或致命性心律失常的发生。肌细胞特异性中间丝结蛋白desmin作为细胞骨架的重要结构,在Z线周围将肌原纤维、肌膜和细胞核进行整合,维持心肌细胞结构完整性,并参与心肌细胞闰盘的装配。在成体,Desmin通过核骨架细胞骨架连接复合体（LINC）与位于核膜内层的核纤层蛋白LaminA相连,构成贯穿于细胞核和细胞质的统一网架结构体系。文献报导,人类编码desmin的DES基因突变导致显着性心律失常和频发的心源性死亡;人类编码LaminA的LMNA基因突变通常以心传导系统疾病或心律失常为首发症状,提示desmin和LaminA与人类心脏传导系统的发育密切相关。然而,有关二者在人胚心脏表达模式的研究报道甚少,尤其缺乏人胚早期的资料,限制了实验研究从动物到人的推理。本研究系统观察了Carnegie10-20期人胚心脏传导系统的形态演变过程,阐述了中间丝蛋白desmin和LaminA在传导系统的时空表达模式及与Tbx3、Isl-1和Nkx2.5等不同转录因子表达模式的关系。与模型动物相比,我们的数据为理解人类DES和LMNA基因突变引起的心律失常提供了直接的形态学基础。第一部分中间丝蛋白desmin、LaminA在早期人胚心脏传导系统的时空表达特点及意义目的:阐明中间丝蛋白desmin和LaminA在人胚胎早期心脏发育过程中传导系统的时空表达模式及与Tbx3等转录因子表达模式的关系,探讨desmin和LaminA在心脏传导系统发育中的作用,为人类DES和LMNA基因突变导致的传导功能障碍发病机制的研究提供形态学依据。方法:收集自然流产的形态完整的Carnegie10-20期（受精后3-8周）人胚,制作心脏连续切片进行HE,免疫组织化学和免疫荧光染色。本实验选用抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体标记早期原始心肌细胞,抗心肌肌球蛋白重链（MHC）抗体标记横纹肌心肌细胞,抗Tbx3抗体标记人胚心脏中枢传导系统,系统观察结蛋白（desmin）、核纤层蛋白A（LaminA）和缝隙连接蛋白43（Connexin43）在人胚心脏传导系统的时空表达模式。为了更好地理解胚胎心脏发育过程,部分胚胎染色结果进行计算机三维重建。结果:人胚发育第10期,Tbx3在心脏广泛表达,阳性结果弥漫至除静脉窦外的MHC或α-SMA阳性的心肌细胞,但较强的desmin阳性颗粒主要局限在中枢传导系统的房室管右侧壁。人胚发育第11期,房室管内侧覆以间充质细胞构成的心内膜垫,Tbx3阳性表达主要局限于房室管壁心肌细胞,desmin在房室管壁心肌细胞的表达与Tbx3表达模式相同。LaminA首先在心室近腔面的小梁心肌,即蒲肯野纤维阳性表达。人胚发育第12期,人胚房室管前壁可见Tbx3和desmin双阳性细胞从腹侧向背侧延伸经右心房顶壁与发育中的假隔融合,房室管后壁的Tbx3和desmin阳性细胞向房间隔基部延伸扩展到左心房底壁的左肺嵴,Tbx3阳性结果随近左肺嵴逐渐减弱直至消失。人胚发育第13期,房室管背侧壁心肌增厚区为人胚房室结原基,心肌细胞排列稀疏,胞质嗜酸性弱,Tbx3、desmin、LaminA和Nkx2.5表达强度强于心房或心室心肌细胞,但α-SMA表达缺失。人胚发育第14期,希氏束出现并与房室管右背侧壁相连,二者共同表达desmin和Tbx3,desmin阳性表达范围从中枢传导系统扩展到周围传导系统的左右束支远端和蒲肯野纤维。人胚发育第15期和17期,窦房结和房室结明显可辨,窦房结借右静脉瓣与房室管背侧的房室结相延续,左静脉瓣向房室管方向延伸并插入房间隔尖端的的背侧间充质突内,这两条位于窦房结和房室结之间的传导通路在人胚发育17-20期始终可以观察到并较好地表达Tbx3和desmin。房室结连接希氏束,希氏束与左右束支和蒲肯野纤维相连。因此,从窦房结到心室蒲肯野纤维之间连续的传导通路的雏形基本建立,可见Tbx3阳性表达部位局限在中枢传导系统。Desmin阳性表达早期在中枢传导系统,表达时间早于Tbx3,但在人胚发育第20期扩展到除致密心肌外的由左右束支远段和心室小梁心肌构成的周围传导系统和工作心肌。LaminA在传导系统的表达明显晚于desmin,阳性表达范围从周围传导系统的蒲肯野纤维逐渐向上延伸至中枢传导系统各结构,直至人胚发育第20期,窦房结才获得LaminA较强的阳性表达。结论:1.Desmin与Tbx3在早期人胚心脏中枢传导系统具有相似的表达模式提示,胞浆骨架蛋白desmin参与中枢传导系统基本框架的搭建,Tbx3促进原始心肌细胞分化为中枢传导系统的慢传导心肌细胞,二者协同作用确保心脏形态发生与其传导功能相适应。2.联合应用desmin和Tbx3作为标记蛋白可以很好地显示人胚心脏早期发育过程中从窦房结到蒲肯野纤维之间完整的心脏传导系统。3.LaminA在人胚心脏传导系统的表达晚于desmin,阳性表达部位从周围传导系统逐渐延伸到中枢传导系统,这两种中间丝蛋白不同的表达模式提示,直至人胚发育至20期,二者在结构和功能上尚未建立偶联。4.人胚心脏周围传导系统和心房工作心肌的发育需要desmin的参与。第二部分人胚心脏静脉窦和窦房结的早期发育目的:研究人胚心脏窦房结的起源和发育的动态形态演变过程,探明转录因子Tbx3、Isl1的表达与窦房结发育的形态学关系,为揭示人类先天性起搏组织异常的病因提供宝贵的形态学资料。方法:选用α-SMA、MHC单克隆抗体和抗Tbx3、抗Isl-1和抗Nkx2.5多克隆抗体对Carnegie10-20期（受精后3-8周）人胚心脏连续石蜡切片进行免疫组织化学染色。结果:人胚胎发育第10期,静脉窦初现于共同心房的尾端,免疫组织化学染色显示早期心肌特异性蛋白α-SMA阴性、Nkx2.5阴性和Isl-1阳性,可见Isl-1阳性细胞从前肠腹侧的间充质细胞延续至静脉窦背侧壁。人胚发育第11期,静脉窦开始表达α-SMA,人胚发育第12期,Nkx2.5阴性的静脉窦头端与Nkx2.5阳性表达的右心耳尾端延续并折叠成两层不同成分构成的右静脉瓣,右静脉瓣向心脏头端延续与发育中的假隔融合。人胚发育第13期,左静脉瓣发育,左右静脉瓣向头端延伸并与假隔相互融合,显示Nkx2.5阳性、Isl1阴性的表达模式。与心房其它部位的心肌表达特点不同,介于两瓣膜基部之间右心房壁上的心肌细胞显Nkx2.5阴性和Isl1阳性,提示这部分心肌细胞来源于静脉窦。人胚发育第14期,心尾端来源于静脉窦未融入到心房壁的Isl1阳性细胞参与构成右静脉窦角和左侧的冠状窦,右静脉窦角管壁较13期明显增厚,位于右上腔静脉和右心房之间,免疫组织化学染色显示右静脉窦角表达较强的α-SMA和desmin,但未检测到Tbx3阳性颗粒。可见前肠腹侧Isl-1阳性的间充质细胞借肺静脉右侧的背侧间充质突延伸到增厚的右静脉窦角尾端。人胚胎发育第15期,窦房结位于心脏的头端、右心房的背侧,窦房结头端包绕右心房和右上腔静脉连接处,尾端沿右静脉瓣（界嵴）走形,在不同切面窦房结形态呈现为逗号样或U形结构。窦房结头端已广泛表达desmin,但慢传导系标记物Tbx3才开始阳性表达,与早期心肌特异性蛋白α-SMA的表达模式呈现严格的互补性,即获得Tbx3阳性表达的窦房结区域同时失去α-SMA的表达并演变为分布稀疏的结构。人胚胎发育第16期开始,Tbx3的表达沿右静脉瓣进一步向窦房结头部远侧端延伸。直至胚胎发育第20期,横纹肌特异性蛋白MHC已蔓延到整个窦房结,仍有部分窦房结头端显Tbx3阴性和α-SMA阳性的互补表达模式,第二生心区心前体细胞标记物Isl1在窦房结头端始终保持强阳性表达。结论:1.人胚静脉窦最早于人胚胎发育第10期发育,窦壁为间充质细胞。间充质细胞于第11期开始心肌化,第12期发生心肌化的心肌细胞从静脉窦头端向尾端逐渐演变为具有横纹的心肌细胞。2.人胚胎发育第13期,右心房壁上界于左右静脉瓣之间的部分构成窦房结尾部的原基,显示Isl-1阳性、Nkx2.5阴性的表达特点;第14期,连接右上腔静脉和右心房的右静脉窦角尾端形成窦房结头部的原基;第15期,心脏经历汇聚后,窦房结原基从右心房的尾端返折到右心房的头端,达到晚期人胚和成人的解剖学位置。3.窦房结获得成人解剖学位置后,Tbx3阳性表达部位沿右静脉瓣逐步向窦房结头部近心房侧扩展,而且Tbx3和早期心肌特异性蛋白α-SMA的表达模式呈现严格的互补性,提示窦房结细胞从尾端向头端逐步分化与成熟。4.与小鼠胚胎相同,人胚静脉窦和窦房结具有特殊的Nkx2.5阴性、Isl-1阳性表达模式,可选用转录因子Nkx2.5和Isl-1作为理想的标记物。
黄蒙蒙[6]（2019）在《丙烯酰胺对斑马鱼胚胎心脏发育毒性的分子毒理学效应及Notch信号通路激活机制》文中进行了进一步梳理2002年,瑞典科学家在富含碳水化合物的热加工食品中首次发现高含量的丙烯酰胺,由此引发的食品安全问题备受国际关注。丙烯酰胺及其一级代谢产物环氧丙酰胺可以血红蛋白结合物的形式通过胎盘屏障进入胎儿体内,其发育毒性已在欧洲大型母婴队列研究中得以证实。此外,本课题组前期人群队列研究表明,丙烯酰胺的体内暴露水平与心血管疾病的发生率和死亡率呈显着正相关性。心脏是脊椎动物最早形成并发挥功能的器官,特别是早于解毒器官肝脏。因此,本文以斑马鱼胚胎为模型,从急性和亚慢性角度探究丙烯酰胺心脏发育毒性及其致毒机制。主要研究结果如下:首先,丙烯酰胺急性暴露对斑马鱼胚胎具有明显的致死致畸作用,且呈剂量依赖和时间依赖关系。受精后的斑马鱼胚胎暴露于丙烯酰胺72和96小时的半致死剂量(LC50)分别为2.7 mM和2.2 mM,主要表型为心包水肿、心率缓慢、心脏线性化、体长减小和鱼鳔无法发育等。毒性敏感性评估研究表明,发育早期阶段暴露丙烯酰胺,胚胎心脏的畸形表型最为显着。活性氧（ROS）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽（GSH）含量和谷胱甘肽硫转移酶（GST）活性等氧化还原指标观测发现,2.0 mM丙烯酰胺暴露组胚胎出现明显的氧化损伤,且活性氧探针染色和油红O染色结果发现,心脏区域出现大量阳性染色信号,而低于2.0 mM暴露组胚胎与对照组相比并无明显差异。该结果意味着氧化损伤可能是高剂量丙烯酰胺的致毒途径,心脏可能是丙烯酰胺致发育毒性的靶器官。其次,丙烯酰胺急性暴露对斑马鱼胚胎具有明确的心脏发育毒性。2.0 mM丙烯酰胺暴露后,胚胎心脏静脉窦-动脉球间距显着变大、心室横截面积和心室容积显着减小;而在功能上,心率、心室收缩分数和红细胞流速均显着下降。整胚原位杂交和定量PCR观测发现,丙烯酰胺暴露导致心管环化不全,腔室膨胀异常;心脏房室发育中心肌蛋白myl7、vmhc和myh6基因表达下调;房室通道分化中bmp4、notch1b和tbx2b基因限制性表达的功能部分或完全丧失;房室瓣膜形成过程中has2、klf2a和nfatc1基因异位表达;心脏疾病相关标志基因nppa和nppb异位高表达,而tnnc1a显着下降。上述结果意味着丙烯酰胺急性暴露抑制房室心肌蛋白的形成、房室通道的分化和瓣膜发育,并出现病理性特征。此外,中胚层心脏前体标志物nkx2.5表达下调,暗示了丙烯酰胺急性暴露对心脏发育的影响可能始于心脏前体时期。第三,丙烯酰胺急性暴露抑制心脏发育过程中细胞的增殖和分化。丙烯酰胺暴露后显着降低了心肌细胞和心内膜细胞的数目。通过增殖标志物PH3免疫荧光和TUNEL凋亡等观测发现,丙烯酰胺并不影响心脏发育过程中细胞凋亡水平,但显着抑制其有丝分裂,这是导致细胞数目减少的可能原因。丙烯酰胺并不影响心脏腔室心肌细胞的特异性分化,但显着抑制房室通道处心内膜细胞从上皮细胞向间质细胞转变的过程。此外,丙烯酰胺暴露导致发育早期心肌和心内膜之间的物理间隙增加,二者之间交错信号（crosstalk）减少,随着暴露时间的延长,心室心肌层和心内膜明显增厚,暗示心脏成熟期发育可能出现异常。第四,丙烯酰胺亚慢性暴露对心脏早期发育过程中的形态和功能虽无明显影响,但显着影响心脏成熟过程中的形态发生和收缩功能。通过Notch信号荧光报告转基因鱼系Tg（TP1:d2GFP）发现,0.5 mM和1.0 mM丙烯酰胺暴露导致心脏发育早期心内膜Notch信号部分失去瞬时动态活性,进而持续高表达至肌小梁形成早期,而心肌层Notch信号在肌小梁形成后期持续高表达,最终导致肌小梁芽增生和无法迁移。通过Notch信号抑制剂DAPT对心内膜Notch信号进行不完全抑制后,新生的肌小梁正常发育并向腔室内部延伸,从而起到拯救效果。以上结果表明,丙烯酰胺亚慢性暴露影响心脏发育早期阶段心内膜失去部分活性,无法实现Notch信号限制性表达,进而导致后期肌小梁过度增殖,而成熟后期心肌Notch信号的高表达属于应激反应。第五,丙烯酰胺亚慢性暴露引起心室壁肌小梁增生且无法迁移而堆积于心室壁,可能原因为:（1）经1.0 mM丙烯酰胺暴露后,Notch下游通路中erbb2在肌小梁形成早期显着上调,而nrg2a在肌小梁形成过程中显着上调,这是肌小梁增生的可能原因;（2）受Erbb2信号调控的N-cadherin蛋白大量聚集且无法重排,大大增加了心肌细胞之间的粘附性,是导致新生肌小梁无法迁移而堆积于心室壁的可能原因;（3）心肌细胞能量代谢和收缩运动所需的线粒体和肌原纤维结构异常,是导致成熟期心室收缩功能下降的可能原因。此外,丙烯酰胺亚慢性暴露可致心脏早期发育关键特异性转录因子nkx2.5和hand2等在心室成熟期高表达,可能为斑马鱼心脏损伤后的特有再生应激反应。综上所述,本研究以斑马鱼胚胎为模型,从毒理学效应、细胞生物学机制以及分子机制等层面系统研究丙烯酰胺急性暴露和亚慢性暴露后对心脏发育的影响及其致毒机理,相关研究成果为完善食品加工污染物发育毒性和毒理学效应评价体系提供科学依据,对于我国食品化学安全危害因素的循证和溯源研究具有重要意义。
刘亚杰[7]（2019）在《自噬参与心外膜祖细胞向冠状动脉平滑肌细胞分化的实验研究》文中进行了进一步梳理研究冠脉血管的发育,明确冠脉血管平滑肌细胞（coronary smooth muscle cells,CoSMCs）的起源及分化机制,将为先天性心脏病的防治及心肌梗死后冠脉侧枝循环血管的形成等研究领域提供重要信息。目前研究提示,心外膜祖细胞（Epicardial progenitor cells,EPCs）是CoSMCs的主要起源,但EPCs向CoSMCs分化的具体机制尚不完全明确。自噬（autophagy）是由溶酶体介导的蛋白质及其他细胞器的分解过程,与衰老的细胞器及破坏的蛋白质的清除和维持细胞内环境稳定有密切关系。既往研究证实自噬在哺乳动物的心脏发育与重塑组织和细胞分化过程起着重要作用,但尚无证据表明自噬是否能够参与调控EPCs向CoSMCs分化。在本研究中,我们成功体外培育了小鼠原代EPCs,并通过自噬的诱导和抑制实验观察自噬对EPCs向平滑肌细胞分化的影响,同时进一步在体观察自噬对小鼠冠脉平滑肌发育的影响,以期证实自噬参与调控心外膜祖细胞向冠状动脉平滑肌细胞分化。第一部分:原代EPCs的培养与鉴定目的:探讨构建高纯度心外膜祖细胞的方法,为体外培养并揭示心外膜祖细胞的分化机制奠定基础。方法:首先分离E11.5小鼠胚胎心脏,利用组织贴壁法建立心外膜祖细胞体外培养模型。镜下观察培养细胞的自身特性,进一步通过qRT-PCR技术及免疫荧光技术检测心外膜祖细胞标志基因Tbx18及WT1基因的表达,借此来检测培养的细胞纯度。结果:成功培养出原代心外膜祖细胞群。并首先以形态学观察证实该原代细胞群具有典型上皮形态,并连续观察72小时证实该细胞群分化的形态学变化。进一步以心肌细胞为对照组,通过qPCR及免疫荧光证实该细胞能同时表达心外膜祖细胞标志性基因Tbx18及WT1。结论:通过组织贴壁法进行原代培养所得心外膜祖细胞方法相对简单且同时表达多个心外膜上皮标志基因,细胞纯度高。体外培养的原代心外膜祖细胞爬出后形成的细胞群形态和排列均呈典型上皮形态,且在形态学上观察到能够进一步分化,为后续心外膜祖细胞的分化研究打下基础。第二部分:体外实验揭示细胞自噬对心外膜祖细胞向平滑肌细胞分化的影响目的:探讨细胞自噬对心外膜心外膜祖细胞向平滑肌细胞分化的影响,及对EPCs分化而来的SMCs功能的影响。方法:在原代心外膜祖细胞模型店基础上,用自噬诱导剂RAPA及抑制剂3-MA分别建立了自噬诱导和抑制模型。观察自噬诱导/抑制对心外膜祖细胞分化的形态学影响,并通过qPCR测定自噬相关Akt及mTOR的mRNA水平变化。进一步通过MDC染色及LC3B蛋白荧光染色及Westernblot实验揭示心外膜祖细胞分化过程是否细胞自噬。后以qPCR及免疫荧光检测培养72h后细胞平滑肌标志蛋白a-SMA及MYH11水平,MTT实验检测各组细胞增殖能力。再收集培养96h细胞,以胶原凝胶收缩实验评价其收缩功能,划痕实验评价细胞迁移能力。结果:我们的实验观察到,RAPA在72h内显着诱导心外膜祖细胞自噬水平上调,进而导致心外膜祖细胞增殖明显减慢,但长梭形大体积异形细胞增多。免疫荧光染色见RAPA组a-SMA及MYH11峰值提前,提示自噬可能诱导心外膜祖细胞提前分化,在细胞培养48h即出现大量梭形,异形的分化细胞,结合免疫染色结果可见RAPA诱导的自噬使平滑肌细胞的分化提前,但增殖较NORMAL组及3-MA组明显减弱。而在3-MA组其自噬水平明显下调后,出现细胞增殖及迁移上调,而分化延迟的表现。提示抑制自噬可能抑制心外膜祖细胞向平滑肌细胞分化,而促进其增殖及迁移。结论:细胞自噬参与调控心外膜祖细胞向平滑肌细胞分化,自噬上调可能诱导心外膜祖细胞提前分化,而使平滑肌细胞收缩能力增强,增殖迁移能力下降,而抑制则可能抑制心外膜祖细胞向平滑肌细胞分化,而促进其增殖及迁移。第三部分:体内实验揭示自噬对小鼠冠状动脉发育的影响目的:在组织水平明确心外膜祖细胞对冠脉血管平滑肌发育的影响及自噬标识信号分子与平滑肌标志基因的空间定位关系,从而在体探讨自噬对心外膜祖细胞对冠状动脉发育的影响。方法:应用羊膜腔注射给药的方式建立小鼠自噬诱导/抑制模型,通过HE染色观察自噬诱导/抑制对小鼠E12.5-E14.5冠脉发育的结构影响,通过qPCR及免疫荧光观察自噬对小鼠冠状动脉平滑肌分化过程中a-SMA的RNA及蛋白表达的影响,进而将自噬标志蛋白LC3B与平滑肌细胞标志蛋白MYH11共染,观察两者的空间定位关系。结果:自噬诱导后,心脏几乎未能形成管腔发育成熟的冠状动脉血管,但可见心内膜下逐渐出现的血窦样变化,提示小鼠心脏发育未能发育出成熟冠脉及建立有效的冠脉循环。同时亦观察到自噬诱导后出现的心室流出道发育障碍,心脏循环缺陷及心室壁变薄。qPCR及组织免疫荧光结果提示,小鼠E12.5-14.5的自噬现象可同时出现在心外膜及心肌组织中。而自噬诱导组我们可见在E12.5天时,心外膜内的心肌组织中a-SMA的表达量略高于NORMAL组,但在E14.5天时,RAPA组a-SMA表达量明显低于NORMAL组,并且未能发育为成熟冠状动脉管腔。而在E12.5-14.5天,自噬抑制组a-SMA表达量各时间段均低于NORMAL组,最终冠状动脉周围a-SMA表达量也比NORMAL组更低。荧光共染实验证实,多处心外膜及心外膜下MYH11阳性细胞能够与LC3B蛋白共表达。结论:自噬在冠脉发育中需要适宜的强度。过度激活自噬可能导致导平滑肌细胞的提前分化和迁移能力增强,有可能使内皮细胞周围平滑肌细胞的募集失调,不能形成有效的冠脉管腔。总体来说,冠状动脉发育受到抑制。而自噬抑制可能使心外膜祖细胞分化延迟,从而使冠脉形成的数量减少。心外膜祖细胞向冠脉平滑肌分化的过程需要适宜的自噬强度。
孔旭[8]（2018）在《Rbm24调控心脏肌节组装及与心肌病关系的研究》文中进行了进一步梳理目的研究出生后Rbm24在维持心脏结构和功能中的调控机制,探究Rbm24缺失与扩张型心肌病发生的关系以及潜在的发病机制。此外,深入分析Rbm24蛋白的磷酸化修饰机制以及Rbm24蛋白稳定性与心脏肌节组装的关系。为RNA结合蛋白调控的RNA剪接与扩张型心肌病发病机制提供更加全面的认知,通过改变Stk38/Rbm24蛋白活性揭示潜在的心肌病的发生机制提供了研究的新思路和途径。方法首先运用Cre-loxP系统构建Flper小鼠并与心脏特异表达的MHC-cre小鼠交配,得到Rbm24心脏特异敲除的小鼠。分别在RNA水平和蛋白水平上分析KO小鼠、杂合子小鼠心脏中Rbm24的敲除效率,进而确定后续实验研究的对象和时间点。此外,在组织学水平利用HE染色、Masson染色等技术分析KO小鼠心脏的结构变化,并且结合qPCR分析扩心病Marker以及心脏超声综合判断心脏疾病类型。利用RNA测序深入分析Rbm24缺失导致的选择性剪接的变化,并进行聚类分析。选择已报道的心肌病相关基因以及肌节相关基因进行RT-PCR具体验证分析。分别在细胞系HL-1以及原代心肌细胞中敲低Stk38表达,RT-PCR分析肌节相关基因的可变剪接,Western blot以及免疫荧光染色检测肌节的紊乱情况。此外,在沉默了 Stk38表达的心肌细胞系过表达Rbm24分析肌节组装的恢复。进行体外激酶实验分析Rbm24的磷酸化水平。同时,分别运用Stk38激酶活性的抑制剂BAPTA-AM或激活剂OA并结合免疫沉淀技术分析Rbm24的磷酸化水平以及Rbm24蛋白的稳定性。结果Rbm24的心脏条件性敲除小鼠在出生后第5天Rbm24已经完全敲除,而且两个月内全部死亡。检测相关疾病特异性marker,HE和Masson染色以及心脏功能检测证实,敲除Rbm24导致小鼠出生后发生扩张型心肌病,最终引起小鼠死亡。Rbm24缺失后引起一系列基因的选择性剪接,Rbm24主要调控的选择性剪接类型是Skipped exon（SE）。Rbm24作为选择性剪接的抑制因子调控心脏中特定基因的可变剪接,对被调控的基因进行生物学功能分析发现这些基因主要参与心肌细胞的骨架形成、肌节的组装、心肌的节律性收缩等方面。Rbm24缺失导致相关基因如Titin等肌节相关基因发生异常剪接,引起心肌细胞的肌节排列发生紊乱,肌节结构改变,心脏功能异常。心肌细胞中,Stk38的表达下降导致Rbm24蛋白的稳定性下降。体外激酶等实验证实Rbm24是一种磷酸化蛋白,其磷酸化水平受Stk38直接调节。使用Stk38激酶抑制剂或激活剂进一步研究阐明Rbm24蛋白稳定性以激酶活性依赖性方式进行调节。在心肌细胞中,Stk38的表达下降或激酶活性降低可引起肌节相关蛋白的减少,肌节组装的紊乱。结论心脏中特异敲除Rbm24导致小鼠发生扩张型心肌病死亡。Rbm24缺失引起一系列心肌相关基因发生异常可变剪接进而导致扩心病的发生。此外,在心肌细胞中Stk38通过磷酸化Rbm24增强其蛋白的稳定性进而调控心肌肌节的组装。这一发现将进一步加深我们对心脏肌节组装在生理和病理情况下的调节机制的理解,并通过调节Stk38/Rbm24蛋白活性的调控机制揭示了一种潜在的心肌病发生的新途径。
李春莉[9]（2018）在《文山地区先天性心脏病的临床特征与NKX2-5基因遗传相关性研究》文中研究表明先天性心脏病（Congenital heart disease,CHD）,是目前关注度很高并且危害性极强的一种疾病,是先天性畸形中最常见的一类,约占各种先天畸形的28%。先天性心脏病主要是由于在胚胎发育过程中心脏及大血管发育异常而形成的,该病是目前人类发病率最高的出生缺陷,严重危害小儿生命和健康,给家庭和社会带来了沉重的精神心理和经济负担。CHD是新生儿死亡的主要原因之一,全球约有0.4%1%的新生儿患有先天性心脏病,据报道,约有10%的胎儿流产与心脏的发育不全有关。在我国,先天性心脏病的发病率占到出生活婴的4.09‰,并且CHD的发生率还有逐年上升的趋势。已有众多证据表明,先天性心脏病是环境与遗传因素共同作用的结果,遗传因素是基础,环境因素是诱因,遗传主要是由于基因突变引起的。而目前已有研究表明,云南地区CHD总体患病率为6.964‰,高于全国平均水平,这可能与云南地区地处西南边陲,有着特殊的地理环境及民族特征,因此开展对云南地区先天性心脏病患者临床特征的研究,以及有遗传史家族进行相关的基因检测具有十分重要的价值。随着先天性心脏病及其他出生缺陷领域遗传学研究的迅猛发展,已经陆续发现了一些与心脏发育有关的基因,如:GATA4,NKX2-5等。NKX2-5基因是在先天性心脏病的中发现的第一个致病基因,其突变在家族性常染色体显性遗传房室间隔缺损中已经得到了验证,到目前为止,已经发现NKX2-5基因中共有7个变异位点rs17052019、rs2277923、rs3729938、rs3729753、rs3729754、rs703752和rs11552707与心脏的发育不全有关。本研究通过构建文山壮族、苗族自治州地区的先心病样本库和资料库,分析其临床特征,最后应用Sanger测序,并对其测序结果进行比对分析,找出NKX2-5基因中可能的疾病相关变异位点。本研究选取2015年11月至2017年05月在文山壮族苗族自治州人民医院心内科收治的经心脏彩超及心导管造影检查确诊为先天性心脏病患者750例,对其临床特征进行相关的统计分析发现,文山地区单纯性先天性心脏病病例中房间隔缺损最多,其次是室间隔缺损,然后是动脉导管未闭,且房间隔缺损是成年人中最常见的先天性心脏病;其次发现,合并多种先天性心脏病病例之间无明显差异;另外,不管是单纯性先天性心脏病还是合并多种先天性心脏病,其症状与畸形大小与其复杂程度有关。而后对其中的10个有家族史的先天性心脏病家族的NKX2-5基因进行遗传测试及研究。采集其外周静脉血进行基因检测。发现10家族中有3个家族与rs2277923和rs703752双突变相关,分别来自彝族,景颇族和壮族,暗示这两个SNP的组合很有可能在这三个少数民族中有较高的突变率;另外,NKX2-5基因中的rs2277923 SNP位点有着较高的突变率,为81.25%,rs703752 SNP位点的突变率为18.75%,并且在家族中存在遗传现象;并且对于携带一个或两个突变的家族成员,尤其是2个突变携带者,建议家庭应给与足够的重视,谨慎对待,尽量规避风险。
张静[10]（2018）在《肠道微生物产生的内毒素增加心管不融合发生率的机制研究》文中指出目的存在于细菌细胞壁的脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）可以诱导细胞毒性和炎症相关的反应。然而,在产前胎儿中LPS参与诱导的心脏畸形的机制仍然是未知的。本课题利用早期鸡胚为模型,探索LPS影响胚胎早期心管发育的细胞及其分子机制。方法首先对人及老鼠肠道菌群紊乱后内毒素水平进行检测,利用鸡胚LPS处理后,HH10期观察其心管发育情况;其次在HH7、HH10期取材,利用免疫荧光、原位杂交、Q-PCR、Western blot、电穿孔转染-移植等方法,观察LPS环境下胚胎早期心管发育中关键转录因子的表达,心肌细胞迁移、分化情况,心肌细胞的增殖凋亡情况及ROS水平等的改变,探索LPS对心管发育的影响机制。并结合体外原代培养及H9c2细胞培养探索LPS诱导ROS水平升高参与心管畸形的机制。结果我们发现在肠道菌群紊乱的孕妇体内内毒素水平有升高趋势。随即,我们又在肠道菌群紊乱的小鼠身上得到进一步验证。在鸡胚HH10时期,LPS暴露增加了心管不融合的发生率。基因转染和组织移植的迁移轨迹表明,LPS暴露限制了心脏祖细胞向两侧生心区的细胞迁移。体外培养的心脏前体细胞表明LPS可以抑制细胞向周围迁移。从细胞划痕实验中也得到了类似的观察结果,即使H9c2细胞暴露于LPS中培养。在暴露于LPS的胚胎中,Nkx2.5和GATA5的表达受到干扰,当心管融合发生时,这些基因与心肌细胞分化相关。另外,pHIS3、ccaspase3免疫组织学染色表明,在鸡胚的早期心管中,细胞增殖减少,细胞凋亡增多。在体外细胞实验中,细胞流式凋亡检测,pHIS3免疫组织染色和Hochest/PI染色得出类似的结论。LPS暴露也导致了过量ROS的产生,这可能会损害发育中的胚胎的心脏前体细胞。最后,通过添加抗氧化剂,可以部分逆转LPS诱导的心管不融合。结论总之,这些结果表明,在鸡胚发育过程中,LPS诱导的心管不融合与过量的ROS产生相关。
二、心管发生的分子机制（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、心管发生的分子机制（论文提纲范文）
（1）lncRNA ihha-as在斑马鱼早期胚胎发育中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 非编码RNA |
| 1.2 长链非编码RNA |
| 1.2.1 长链非编码RNA生物学特征 |
| 1.2.2 长链非编码RNA的作用机制 |
| 1.2.3 长链非编码RNA的功能 |
| 1.3 模式生物斑马鱼 |
| 1.3.1 斑马鱼作为模式生物的优势 |
| 1.3.2 斑马鱼早期胚胎发育过程 |
| 1.3.3 斑马鱼中lncRNA的研究近况 |
| 1.4 心血管系统发生与疾病 |
| 1.5 ihha和 ihha-as的概述 |
| 1.5.1 ihha基因的简介 |
| 1.5.2 ihha-as的简介 |
| 1.6 Morpholino干扰技术 |
| 1.7 整体原位杂交技术 |
| 1.8 本研究的目的与意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 菌种 |
| 2.1.3 Morpholino |
| 2.1.4 质粒 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.1.6 主要实验试剂 |
| 2.1.7 主要实验仪器 |
| 2.1.8 主要实验试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 胚胎和组织中总RNA的提取 |
| 2.2.2 cDNA的合成 |
| 2.2.3 半定量PCR反应体系及反应条件 |
| 2.2.4 DNA片段的胶回收 |
| 2.2.5 感受态的制备 |
| 2.2.6 重组质粒构建 |
| 2.2.7 去内毒提质粒 |
| 2.2.8 体外转录 |
| 2.2.9 RNA纯化 |
| 2.2.10 斑马鱼胚胎的显微注射 |
| 2.2.11 斑马鱼胚胎原位杂交 |
| 2.2.12 荧光定量PCR |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 ihha-as生物信息学分析 |
| 3.2 ihha-as时空表达 |
| 3.3 ihha-as过表达对斑马鱼早期胚胎发育的影响 |
| 3.4 ihha-as敲低和挽救对斑马鱼早期胚胎发育的影响 |
| 3.4.1 Mopholino敲低ihha-as的有效性验证 |
| 3.4.2 ihha-as-MO注射的最佳浓度确定 |
| 3.4.3 ihha-as-MO敲低和挽救对斑马鱼胚胎发育的影响 |
| 3.4.4 ihha-as敲低和挽救对ihha表达的影响 |
| 3.4.5 ihha-as-MO 敲低和挽救对心血管发育标记基因表达的影响 |
| 3.4.6 ihha-as-MO敲低和挽救对心血管发育的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）趋化因子信号调控胚胎左右不对称（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 脊椎动物基本体轴的建立 |
| 1.2 左右不对称发育缺陷引起的人类遗传疾病 |
| 1.3 左右不对称发育图式建立过程 |
| 1.3.1 左右不对称组织中心的发育过程 |
| 1.3.2 左右不对称信号的传递 |
| 1.3.3 左右不对称信号指导器官原基左右不对称发育 |
| 1.4 斑马鱼研究的历史和主要技术手段 |
| 1.5 斑马鱼的发育过程 |
| 1.6 Cxcl12b和Cxcr4a在脊椎动物中的作用 |
| 1.7 Foxj1蛋白在纤毛形成中的作用 |
| 1.8 泛素依赖和非泛素依赖的蛋白酶体降解途径 |
| 1.9 细胞周期进程与纤毛形成的联系 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 斑马鱼的饲养及胚胎采集 |
| 2.2 斑马鱼突变体鉴定及转基因品系的特征 |
| 2.3 抑制剂处理 |
| 2.4 实验中所用的探针质粒,表达质粒的信息和构建 |
| 2.4.1 原位杂交探针质粒的构建 |
| 2.4.2 表达载体的构建 |
| 2.5 实验中MO的序列及中囊胚注射 |
| 2.6 原位杂交 |
| 2.6.1 普通原位杂交 |
| 2.6.2 荧光原位杂交 |
| 2.7 细胞系及转染,Western和免疫共沉淀实验 |
| 2.8 免疫荧光及共聚焦拍照 |
| 2.8.1 胚胎免疫荧光 |
| 2.8.2 细胞免疫荧光 |
| 2.9 荧光微珠观察实验 |
| 2.10 活体纤毛高速运动成像 |
| 2.11 BrdU渗入实验 |
| 2.12 体外GST Pull-Down |
| 2.13 体外磷酸化 |
| 2.14 统计结果分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 Cxcl12b-Cxcr4a趋化因子信号对于斑马鱼左右轴不对称发育是必须的 |
| 3.2 Cxcr4a的缺失会导致KV发育和纤毛形成的缺陷 |
| 3.3 Cxcr4a的缺失会减弱G1/S1期的过渡和zFoxj1a蛋白水平 |
| 3.4 Cxcr4a-ERK1/2级联通路能够通过控制cyclin D1的表达调控DFCs增殖 |
| 3.5 CDK4及其激酶活性对于Foxj1蛋白的稳定性是必须的 |
| 3.6 CDK4能够与zFoxj1蛋白相互作用和直接磷酸化zFoxj1蛋白 |
| 3.7 zFoxj1与Psmd4b的直接结合通过非泛素依赖的蛋白酶体途径进行降解 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 总结和展望 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
| 参考文献 |
（3）15q11.2微缺失导致全肺静脉异位引流心肌发育异常的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstrcat |
| 符号说明 |
| 绪论 |
| 第一部分 TAPVC患者基因组拷贝数变异分析 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 主要实验仪器及试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 样本DNA的提取 |
| 1.2.2 CNVplex?技术检测CNV |
| 1.2.3 基因组拷贝数的计算 |
| 1.2.4 CNV致病性判断 |
| 1.2.5 全基因组芯片验证(Affymetrix Cyto Scan750k芯片) |
| 1.2.6 统计学分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 TAPVC患者拷贝数变异检测结果 |
| 1.3.2 健康对照组拷贝数变异检测结果 |
| 1.3.3 CMA验证结果 |
| 1.3.4 15q11.2缺失的发生率 |
| 1.4 讨论 |
| 第二部分 1例TAPVC核心家系iPS细胞的建立以及心肌分化和转录组分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 主要实验试剂和仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 培养基的配置 |
| 2.2.2 单个核细胞分离培养与扩增 |
| 2.2.3 非基因整合方法重编程PBMC为 iPSCs |
| 2.2.4 TRA-1-60活染鉴定完全重编程的克隆 |
| 2.2.5 iPSCs单克隆的挑选和接种培养 |
| 2.2.6 iPSCs单克隆的免疫荧光 |
| 2.2.7 RNA提取及cDNA合成 |
| 2.2.8 qPCR检测RNA水平 |
| 2.2.9 iPS核型鉴定 |
| 2.2.10 畸胎瘤形成实验 |
| 2.2.11 心肌细胞的分化和纯化 |
| 2.2.12 分化阶段细胞收集、RNA的抽提和反转录 |
| 2.2.13 细胞总蛋白的提取及定量 |
| 2.2.14 Westen Blot鉴定iPSCs中TUBGCP5的表达 |
| 2.2.15 Real-time PCR |
| 2.2.16 转录组测序(RNAseq) |
| 2.2.17 RNAseq数据处理 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 先证者和父母的表型和拷贝数鉴定 |
| 2.3.2 iPSCs的诱导和鉴定 |
| 2.3.3 心肌分化各阶段标志物表达分析 |
| 2.3.4 心肌分化各阶段15q11.2区域基因表达分析 |
| 2.3.5 TAPVC家系成员不同iPSCs克隆之间15q11.2 区域基因表达量的差异 |
| 2.3.6 Western blot验证TUBGCP5蛋白的表达量 |
| 2.3.7 早期心肌细胞分化中转录组分析结果 |
| 2.3.8 家系成员CHD相关基因差异表达分析 |
| 2.3.9 CHD相关基因表达热敏分析及RT-qPCR验证 |
| 2.4 讨论 |
| 第三部分 15q11.2区域基因TUBGCP5敲除影响心肌分化 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 研究对象 |
| 3.1.2 主要实验仪器和试剂 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 TUBGCP5敲除质粒的构建 |
| 3.2.2 目的质粒的抽提 |
| 3.2.3 慢病毒的包装和浓缩 |
| 3.2.4 慢病毒感染正常iPSCs |
| 3.2.5 细胞总蛋白的提取及定量 |
| 3.2.6 Westen Blot鉴定iPSCs中TUBGCP5的表达 |
| 3.2.7 TUBGCP5敲除后的iPSCs心肌细胞分化 |
| 3.2.8 心肌细胞分化阶段细胞收集 |
| 3.2.9 分化阶段细胞RNA的抽提和反转录 |
| 3.2.10 Real-time PCR反应 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 Western blot验证TUBGCP5的敲除 |
| 3.3.2 TUBGCP5敲除后对心肌细胞分化各时期标志物表达的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 肺静脉异位引流的遗传学研究进展 |
| 参考文献 |
| 学术论文和科研成果目录 |
| 致谢 |
（4）基于斑马鱼模型的miR-375过表达致心脏发育异常的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分:miR-375过表达导致斑马鱼胚胎心脏发育异常 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 第二部分:miR-375抑制NOTCH信号通路调控斑马鱼胚胎的心脏发育 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 心脏疾病斑马鱼模型的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略词对照表 |
| 攻读学位期间发表文章 |
| 致谢 |
| 附件 |
（5）中间丝蛋白desmin、LaminA与早期人胚心脏传导系统的构建（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 中间丝蛋白desmin、LaminA在早期人胚心脏传导系统的时空表达特点及意义 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 人胚收集与标本制作 |
| 1.2 免疫组织化学染色(PAP法)及计算机三维重建 |
| 1.3 免疫荧光双标染色 |
| 2 结果 |
| 2.1 desmin和 Tbx3 在早期人胚心脏中枢传导系统呈共表达模式 |
| 2.2 早期人胚心脏LaminA的表达模式 |
| 3 讨论 |
| 3.1 早期人胚心脏发育过程中desmin参与中枢传导系统基本框架的搭建 |
| 3.2 核骨架蛋白LaminA与胞浆骨架蛋白desmin在人胚传导系统发育早期尚未建立偶联 |
| 4 结论 |
| 第二部分 人胚心脏静脉窦和窦房结的早期发育 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 标本收集与制作 |
| 1.2 免疫组织化学染色(PAP法) |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 人胚心脏静脉窦的发育 |
| 3.2 人胚心脏窦房结原基的出现 |
| 3.3 人胚心脏窦房结的分化与成熟 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果 |
| 承担/参与的科研课题 |
| 研究成果 |
| 个人简历 |
（6）丙烯酰胺对斑马鱼胚胎心脏发育毒性的分子毒理学效应及Notch信号通路激活机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 食品加工污染物丙烯酰胺 |
| 1.1.1 食品中丙烯酰胺的发现 |
| 1.1.2 丙烯酰胺人群暴露评估 |
| 1.1.3 丙烯酰胺体内代谢途径 |
| 1.2 丙烯酰胺发育毒性和心脏毒性 |
| 1.2.1 食品毒理学发展 |
| 1.2.2 丙烯酰胺毒理学研究 |
| 1.2.3 丙烯酰胺的发育毒性 |
| 1.2.4 丙烯酰胺的心脏毒性 |
| 1.3 斑马鱼作为模式生物的优势 |
| 1.3.1 斑马鱼模型 |
| 1.3.2 斑马鱼心脏发育 |
| 1.3.3 斑马鱼模型在心脏发育毒性评估中的优势 |
| 1.4 Notch信号通路与心脏发育 |
| 1.4.1 Notch信号通路 |
| 1.4.2 Notch信号通路在早期心脏发育中的作用 |
| 1.4.3 Notch信号通路在肌小梁形成过程中的作用 |
| 1.4.4 Notch信号通路在心脏再生过程中的作用 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 丙烯酰胺致斑马鱼胚胎发育毒性和氧化应激研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 斑马鱼饲养及品系 |
| 2.2.2 主要试剂和仪器设备 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 丙烯酰胺致斑马鱼胚胎发育毒性 |
| 2.3.2 丙烯酰胺致斑马鱼急性毒性敏感性评估 |
| 2.3.3 丙烯酰胺致斑马鱼胚胎氧化应激 |
| 第三章 丙烯酰胺致斑马鱼胚胎心脏发育毒性分子毒理学研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 斑马鱼饲养及品系 |
| 3.2.2 主要试剂和仪器设备 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 丙烯酰胺对胚胎心脏早期形态和功能的影响 |
| 3.3.2 丙烯酰胺对胚胎心脏房室心肌和瓣膜发育的影响 |
| 3.3.3 丙烯酰胺对ALPM区域心脏前体的影响 |
| 第四章 丙烯酰胺致斑马鱼心脏发育毒性的细胞机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 斑马鱼饲养及品系 |
| 4.2.2 主要试剂和仪器设备 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 丙烯酰胺对心肌细胞增殖和凋亡的影响 |
| 4.3.2 丙烯酰胺对心脏房室分化和形态发生的影响 |
| 4.3.3 丙烯酰胺对心脏房室通道分化的影响 |
| 第五章 丙烯酰胺干扰Notch信号动态活性致心室肌小梁增生研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 斑马鱼饲养及品系 |
| 5.2.2 主要试剂和仪器设备 |
| 5.2.3 实验方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 丙烯酰胺影响胚胎心脏成熟过程中的形态和功能 |
| 5.3.2 丙烯酰胺干扰心室肌小梁形成过程中Notch信号通路 |
| 5.3.3 Notch信号通路抑制剂拯救丙烯酰胺导致的心室肌小梁发育不良 |
| 第六章 丙烯酰胺促进心室肌小梁增生并抑制其迁移机制研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 斑马鱼饲养及品系 |
| 6.2.2 主要试剂和仪器设备 |
| 6.2.3 实验方法 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 丙烯酰胺对心室肌小梁形成相关基因的影响 |
| 6.3.2 丙烯酰胺对心肌细胞之间N-cadherin蛋白的影响 |
| 6.3.3 丙烯酰胺对心肌细胞亚结构的影响 |
| 6.3.4 丙烯酰胺对心脏特异性转录因子的影响 |
| 第七章 总结、创新点与展望 |
| 7.1 全文总结 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间主要的研究成果 |
| 致谢 |
（7）自噬参与心外膜祖细胞向冠状动脉平滑肌细胞分化的实验研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 原代EPCs的培养与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 体外实验揭示细胞自噬对心外膜祖细胞向平滑肌细胞的分化的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 体内实验揭示自噬对冠状动脉平滑肌发育的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
（8）Rbm24调控心脏肌节组装及与心肌病关系的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 心脏的肌节组装 |
| 1.1.1 肌节的结构 |
| 1.1.2 Titin与肌节的组装 |
| 1.2 RNA结合蛋白的研究进展 |
| 1.2.1 RNA结合蛋白概述 |
| 1.2.2 RNA结合蛋白结构研究 |
| 1.2.3 RNA结合蛋白的功能研究 |
| 1.2.4 RNA结合蛋白研究方法与技术 |
| 1.3 RNA结合蛋白在心脏肌节组装以及心脏功能中的作用 |
| 1.3.1 Rbm20 |
| 1.3.2 Rbm4 |
| 1.3.3 Rbm38 |
| 1.3.4 Rbm24 |
| 1.4 遗传性心肌病 |
| 1.4.1 扩张型心肌病 |
| 1.4.2 肌节与扩心病发生 |
| 1.5 RNA结合蛋白在心肌病发生中的作用 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验所用细胞系 |
| 2.1.2 菌株以及表达载体 |
| 2.1.3 常用抗体 |
| 2.1.4 引物序列 |
| 2.2 仪器与试剂 |
| 2.3 实验内容与方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 过表达质粒的构建 |
| 2.3.3 质粒的提取 |
| 2.3.4 蛋白质免疫印迹实验 |
| 2.3.5 细胞免疫荧光实验 |
| 2.3.6 免疫共沉淀 |
| 2.3.7 免疫沉淀 |
| 2.3.8 磷酸化蛋白染色 |
| 2.3.9 体外激酶实验 |
| 2.3.10 总RNA的提取 |
| 2.3.11 RNA反转录 |
| 2.3.12 荧光定量PCR |
| 2.3.13 选择性剪接分析实验 |
| 2.3.14 基因敲除小鼠的构建 |
| 2.3.15 伊红-苏木素染色 |
| 2.3.16 Masson染色 |
| 2.3.17 组织免疫荧光 |
| 2.3.18 组织超显微结构分析 |
| 2.3.19 统计学分析 |
| 第三章 Rbm24特异性敲除导致扩张型心肌病发生的研究 |
| 3.1 Rbm24心脏特异性敲除小鼠的构建 |
| 3.2 Rbm24敲除小鼠的鉴定 |
| 3.3 杂合子小鼠(+/-)心脏中Rbm24的敲除效率 |
| 3.4 Rbm24敲除小鼠的生存率统计 |
| 3.5 敲除小鼠骨骼肌中Rbm24的表达无变化 |
| 3.6 敲除Rbm24导致心脏发生扩张型心肌病 |
| 3.7 Rbm24敲除小鼠心脏呈现高度纤维化 |
| 3.8 Rbm24调控的选择性剪接事件的功能性分析 |
| 3.9 敲除Rbm24导致心脏疾病相关基因异常剪接 |
| 3.10 敲除Rbm24引起心脏肌节结构紊乱 |
| 3.11 Rbm24调控Titin的选择性剪接 |
| 3.12 Rbm24是Titin选择性剪接发生的直接调控因子 |
| 3.13 讨论与展望 |
| 第四章 Stk38介导Rbm24蛋白稳定性进而调控心肌肌节组装的研究 |
| 4.1 Stk38影响Rbm24蛋白稳定性 |
| 4.2 Stk38影响Rbm24的蛋白功能 |
| 4.3 Stk38表达异常影响心肌细胞肌节的组装 |
| 4.4 Stk38通过Rbm24调控肌节组装 |
| 4.5 过表达Rbm24补偿shStk38调控的肌节紊乱 |
| 4.6 Rbm24是磷酸化蛋白 |
| 4.7 Stk38调控Rbm24蛋白磷酸化 |
| 4.8 磷酸化修饰提高Rbm24蛋白稳定性 |
| 4.9 讨论与展望 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 科研成果 |
| 致谢 |
（9）文山地区先天性心脏病的临床特征与NKX2-5基因遗传相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1、先天性心脏病的概念 |
| 2、流行和危害 |
| 3、先天性心脏病的发病机制 |
| 3.1 心脏的形成 |
| 3.2 先天性心脏病的病因 |
| 4、先天性心脏病遗传研究现状 |
| 5、基因检测的意义 |
| 6、基因检测常用技术方法 |
| 7、研究目的、意义及创新点 |
| 7.1 研究的目的及意义 |
| 7.2 本研究的创新点 |
| 8、本研究的技术路线图 |
| 第二章 文山地区先天性心脏病的临床特征 |
| 1、引言 |
| 1.1 先天性心脏病的临床表现 |
| 1.2 辅助检查 |
| 2、材料与方法 |
| 2.1 对象与分组 |
| 2.2 主要仪器 |
| 3、统计学处理 |
| 4、结果 |
| 4.1 一般资料 |
| 4.2 文山州不同种类先天性心脏病在不同地区不同民族不同年龄段的分布情况 |
| 5、讨论 |
| 6 小结 |
| 第三章 文山地区先天性心脏病致病基因检测 |
| 1、引言 |
| 2、材料与仪器 |
| 2.1 实验试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 数据分析 |
| 2.4 培养基及其他缓冲液的配制 |
| 3、实验过程 |
| 3.1 实验对象 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 扩增引物 |
| 3.4 核酸提取 |
| 3.5 靶基因PCR反应的体系及优化条件 |
| 3.6 PCR扩增结果检测 |
| 3.7 PCR产物的纯化 |
| 3.8 目的片段纯化后进行测序 |
| 3.9 双峰样品TA克隆 |
| 4、结果 |
| 4.1 血液基因组DNA提取 |
| 4.2 家族1 |
| 4.3 家族2 |
| 4.4 家族3 |
| 4.5 家族4 |
| 4.6 家族5 |
| 4.7 家族6 |
| 4.8 家族7 |
| 4.9 家族8 |
| 4.10 家族9 |
| 4.11 家族10 |
| 5、小结 |
| 6、讨论 |
| 第四章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A攻读硕士期间发表论文目录 |
（10）肠道微生物产生的内毒素增加心管不融合发生率的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 肠道菌群 |
| 1.2 肠道菌群失调 |
| 1.3 内毒素(LPS) |
| 1.4 胚胎心管发生过程 |
| 1.5 肠道微生物中的LPS与胚胎发育 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 2 实验材料与实验方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要的试剂与仪器 |
| 2.3 主要的试剂配制 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.5 统计学分析 |
| 2.6 研究思路 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 肠道菌群紊乱导致内毒素升高会影响小鼠胚胎生存率 |
| 3.2 LPS升高导致早期鸡胚心管不融合 |
| 3.3 LPS暴露限制了鸡胚发育过程中心脏祖细胞迁移 |
| 3.4 LPS暴露影响早期鸡胚胚发育过程中心脏前体细胞的分化 |
| 3.5 LPS暴露使心肌细胞增殖减少 |
| 3.6 LPS暴露使心肌细胞凋亡增加 |
| 3.7 LPS暴露导致过量ROS产生诱导心管畸形 |
| 3.8 维生素C可以缓解LPS导致的过量ROS产生和细胞增殖减少 |
| 3.9 维生素C可以缓解LPS导致的细胞凋亡增加 |
| 3.10 LPS诱导心管不融合机制的模式图 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表索引 |
| 在校期间发表论文清单 |
| 致谢 |
四、心管发生的分子机制（论文参考文献）
- [1]lncRNA ihha-as在斑马鱼早期胚胎发育中的功能研究[D]. 李小灯. 湖南师范大学, 2021
- [2]趋化因子信号调控胚胎左右不对称[D]. 刘静雯. 中国科学技术大学, 2020(01)
- [3]15q11.2微缺失导致全肺静脉异位引流心肌发育异常的分子机制研究[D]. 李晓亮. 上海交通大学, 2020(01)
- [4]基于斑马鱼模型的miR-375过表达致心脏发育异常的作用机制研究[D]. 庄思斯. 南京医科大学, 2020(06)
- [5]中间丝蛋白desmin、LaminA与早期人胚心脏传导系统的构建[D]. 刘慧霞. 山西医科大学, 2019(11)
- [6]丙烯酰胺对斑马鱼胚胎心脏发育毒性的分子毒理学效应及Notch信号通路激活机制[D]. 黄蒙蒙. 浙江大学, 2019(01)
- [7]自噬参与心外膜祖细胞向冠状动脉平滑肌细胞分化的实验研究[D]. 刘亚杰. 重庆医科大学, 2019(01)
- [8]Rbm24调控心脏肌节组装及与心肌病关系的研究[D]. 孔旭. 厦门大学, 2018(06)
- [9]文山地区先天性心脏病的临床特征与NKX2-5基因遗传相关性研究[D]. 李春莉. 昆明理工大学, 2018(04)
- [10]肠道微生物产生的内毒素增加心管不融合发生率的机制研究[D]. 张静. 暨南大学, 2018(05)