一、EBV感染及TPA处理前后人CR2转染细胞的基因差异表达谱（论文文献综述）
丁艳[1]（2015）在《儿童系统性红斑狼疮中Epstein-Barr病毒基因异常表达的研究》文中进行了进一步梳理第一部分Epstein-Barr病毒在儿系统性红斑狼疮外周血单个核细胞中的表达研究[研究背景及目的]系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE）是一种T细胞依赖的、免疫复合物介导的累及多系统的自身免疫性疾病,可使包括心、肝、肾等多个器官以及神经、血液等多个系统受累,严重影响人类健康。儿童SLE可见于儿童的各个年龄时期,但很少5岁以前发病,青春期增多,新生儿亦可见。儿童SLE的发病机理、临床特点、实验室检查结果与成人SLE类似,但两者仍有显着的差异,儿童SLE临床表现更不典型,首发症状各异,易发生误诊,有潜在的致命性,如不及时治疗,预后远比成人严重。儿童SLE的病因尚不清楚,可能是遗传、性激素、病毒感染等环境因素的共同作用下,自身组织细胞发生或免疫活性细胞发生改变,从而失去自身耐受性,造成机体免疫调节失常。近年来研究发现EBV（Epstein-Barr virus, EBV）可能是与SLE发病关系较为密切的感染因素之一。EBV最先从非洲儿童恶性淋巴瘤体中被发现,属于Y亚科疱疹病毒。EBV具有嗜B淋巴细胞性,急性感染后可引起短暂B淋巴细胞克隆增殖,在免疫功能正常个体,这种B淋巴细胞增殖反应可很快被T淋巴细胞包括细胞毒性CD8+T细胞抑制,终生保持EBV潜伏感染状态。SLE患者存在严重免疫功能紊乱,不能完全像健康正常者一样有效控制EBV潜伏感染,SLE遗传易感者或SLE患者感染EBV后,EBV将作为一个持续存在的威胁因素,最终导致某些病理状况的发生。EBV基因组带有84个开放的阅读框,编码60种病毒蛋白。EBV基因按病毒表达的时期分为4期：潜伏期、即刻早期、早期和晚期结构基因。潜伏基因包括核抗原（EBNA1, EBNA2, EBNA3A, EBNA3B, EBNA3C和EBNA-LP）、潜伏期膜蛋白家族（LMP1、LMP2A和LMP2B）、EBV编码的RNA（EBER1和EBER2）。即刻早期基因是潜伏基因被激活后最早表达的一种病毒蛋白,属于转录因子家族,包括BZLF1和BRLF1等,能启动其他EBV活化相关基因的转录、翻译和表达。早期基因有BMLF1、BHRF1、BMRF1、BALF5和BARF1等,是与复制病毒基因组的相关酶有关,包括编码解旋酶、引物酶和DNA聚合酶等相应基因。晚期结构基因包括BCRF1、BLLF1等,包括编码结构蛋白的糖蛋白（gp350、 gp85、gp110）的基因和编码衣壳蛋白的基因。EBV在体内存在两种感染状态：裂解型感染及潜伏型感染。国内外大量的研究表明EBV与SLE的关系密切：1、SLE中EBV血清学异常：国内外大量的研究表明SLE患者中EBV血清学阳性率及EBV活化的早期抗原-D抗体、EBV-EA抗体、VCA-IgG抗体等阳性率等均显着高于健康对照组；2、SLE患者EBV病毒载量明显异常：SLE患者血液中EB病毒的载量明显高于正常人群,说明在SLE患者体内EB病毒处于失控状态；3、SLE患者EBV-DNA异常。国内大量的研究均表明SLE患者EBV-DNA有着较高的阳性率；4、SLE患者EBV基因表达的异常。Brian D. Poole等人发现SLE患者外周血单个核细胞EBV潜伏期基因LMP-1及裂解期基因BLLF1, BcRF1表达均显着增加。提示SLE患者中EBV基因表达异常,EBV可能参与了SLE的发病过程。近年来的研究表明EBV可通过分子模拟、分子功能模拟、T淋巴细胞免疫反应、细胞因子旁路机制、表观遗传等多种方式参与SLE发病。既往研究多是以成人SLE为研究对象,而EBV原发性感染多发生于儿童时期,因此分析儿童SLE与EBV感染之间的相关性可能更有助于探索两者之间关系。根据上述研究基础,并进一步研究EBV与儿童SLE相关性,本实验探讨儿童SLE患者与健康对照组外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC） EBV潜伏期基因及裂解期基因的表达情况,以及予以EBV感染后的两组PBMC EBV潜伏期基因及裂解期基因表达情况,试图探讨EBV基因在儿童SLE中的表达情况及可能致病作用,为SLE的致病机理及临床治疗提供新的思路。[方法]1.分离外周血单核细胞和提取DNA：抽取SLE患儿及健康对照组肝素抗凝静脉血30m1。用淋巴细胞分离液常规分离PBMC,提取其中15m1静脉血分离出的PBMC的DNA。2. B95.8 EBV株与1×106/mlPBMC按1：1共同培养12天后,用Trizol（?）试剂盒提取总RNA。3.实时荧光定量PCR法（Real-time fluorescence quantitative PCR, q-PCR）检测PBMCEBV DNA拷贝数。4.实时定量逆转录PCR法（Reverse transcription PCR, RT-PCR）检测EBV相关基因：EBV核抗原1（EBNA1）,潜伏膜蛋白1（LMP1）,潜伏膜蛋白2（LMP2）,即刻裂解基因（BZLF1）,晚期裂解基因（BcRF1）,晚期裂解基因（BLLF1）。[结果]1、儿童SLE PBMC EBV DNA拷贝数SLE患儿组平均为（658.6±205.7）拷贝/μg,其中活动组（785.2±173.3）拷贝/μg,非活动组（586±193.1）拷贝/μg；而健康对照组（40.1±11.6）拷贝/Lg。经t检验分析,SLE患儿组和健康对照组存在显着性差异（P<0.01）,SLE患儿组PBMC EBV DNA拷贝数是健康对照组的10余倍；方差分析表明,活动组、非活动组、对照组在3组间存在显着性差异（P=0.000,F=79.346）,两两比较进一步提示SLE患儿组内活动组和非活动组存在显着性差异（P=0.005）。2、儿童SLEPBMC EBV DNA拷贝数与SLEDAI无相关性（r=0.053,P=0.826）。3、儿童SLEPBMC中潜伏期基因和裂解期基因的异常表达实时定量RT-PCR法检测了20例SLE患儿及12例健康对照PBMCEBV基因的表达,发现10例患儿和1例健康对照检测到潜伏期基因LMP1表达,两者有统计学意义差异（p<0.05）。4例患儿和1例对照检测到潜伏期基因LMP2表达,13例患儿和3例对照检测到潜伏期基因EBNA1表达,3例患儿和1例对照检测到裂解期基因BCRF1表达,5例患儿和1例对照检测到裂解期基因BLLF1表达,但均无统计学意义差异（p>0.05）。4、EBV感染后儿童SLEPBMC中潜伏期基因和裂解期基因的异常表达用EBV感染SLE患儿和健康对照PBMC后,RT-PCR检测EBV基因表达,结果发现SLE患儿组潜伏期基因LMP1、LMP2、EBNA-1和裂解期基因BCRF1、 BLLF1的表达均显着高于健康对照组,差异有统计学意义（分别为LMP1:1.011±0.141比0.383±0.180, t=10.680, P=0.000; LMP2:1.001±0.093 比 0.208±0.082, t=25.109,P=0.000; EBNA-1:1.012±0.163 比 0.188±0.129, t=14.591, P=0.000; BCRF1:1.015±0.167比0.344±0.161, t=11.268,P=0.000; BLLF1:1.038±0.264比0.117±0.081, t=14.513,P=0.000）.[结论]1、儿童SLE患者外周血单个核细胞中EBV DNA拷贝数显着增加,活动期SLE的EBV DNA拷贝数高于非活动期患者,提示SLE患儿体内EBV活跃。2、儿童SLE患者外周血单个核细胞中潜伏期基因LMP1表达显着异常。3、EBV培养后儿童SLE患者外周血单个核细胞中潜伏期基因LMP1、LMP2、 EBNA-1和裂解期基因BCRF1、BLLF1表达异常。4、儿童SLE患者外周血单个核细胞EBV基因的表达异常,EBV基因可能参与了SLE的发病过程。第二部分Epstein-Barr病毒潜伏膜蛋白1（LMP-1）在儿童狼疮性肾炎肾脏中表达的研究[研究背景及目的]当SLE患儿出现蛋白尿、血尿、红细胞管型、白细胞管型等尿沉渣多样改变,以及水肿、高血压（排除其他因素引起）和（或）肾功能异常等肾实质损害表现时,即可诊断为狼疮性肾炎（Lupus Nephritis,LN）。SLE患儿LN发生率较高,并且随着SLE病程的延长,儿童SLE发生LN的机会逐年增加。多数报道儿童SLE初诊时约50%左右伴有LN,起病2年内达70%～80%,4年后可超过90%。如作肾活检,则几乎100%的患儿均有不同程度的肾脏病理改变。根据2003年国际肾脏病学会和肾脏病理学会联合制定的国际标准（ISN/RPS分型）,LN可分为：Ⅰ型（轻微系膜型LN）、Ⅱ型（系膜增生性LN）、Ⅲ型（局灶性LN）、Ⅳ型（弥漫性LN）、V型（膜性LN）及Ⅵ型（终末硬化性LN）。LN的病因及发病机制尚不十分清楚,研究认为包括以下可能机制：（1）循环免疫复合物在肾脏组织的沉积。（2）原位免疫复合物的形成。（3）自身抗体对肾脏的直接损害作用。（4）激活局部补体,产生自细胞趋化因子,造成局部炎症损害,此外还可形成膜攻击复合物直接攻击基底膜,造成肾小球和毛细血管通透性增加,造成肾脏损伤。（5）T细胞介导的免疫反应,参与调节B细胞分泌自身抗体,引起肾脏损伤。（6）其他因素如激肽缓激肽系统,单核细胞、巨噬细胞等在LN中也起到一定作用。国外的研究表明,LMP-1能够通过多种机制加重SLE的自身反应性,包括直接激活B细胞,增强B细胞活化的协同刺激信号,刺激B细胞活化因子（BAFF）的产生,能够协助打破自我耐受等。LMP-1可与CD40L结合,在细胞膜上募集肿瘤坏死因子受体相关因子（Tumor necrosiS factor receptor associated factor, TRAF）家族成员,激活信号传导途径,使EBV异常克隆增殖,并诱导B淋巴细胞大量活化。Bishop等人试验证明LMP-1可活化具有遗传素质的个体的B淋巴细胞,产生大量自身抗体,并导致肾脏损害。LMP-1诱导B淋巴细胞活化过程中肿瘤坏死因子受体结合因子-6（TRAF-6）起到重要作用。LMP-1可直接激活凋亡蛋白Bcl-2的表达,也可通过一些信号传导途径上调受感染B淋巴细胞中bcl-2的表达,抑制B细胞凋亡,促进B细胞存活,使自身抗体不断产生,导致SLE的发生发展。EBV抗原、EBV基因组和病毒抗原的血清学的研究均表明EBV参与了SLE的发病,第一部分研究发现EBV-LMP1基因在SLE发病中有重要作用,但LMP1在是否参与了LN的发病机理尚不清楚。本实验选用儿童LN患者作为研究对象,研究LN患儿临床症状、肾脏病理分级和抗体表达与LMP1的相关性,试图探讨LMP-1与儿童LN的发病的相关性。[方法]实验组来源于海南省妇幼保健院皮肤科与中南大学湘雅二医院儿童医学中心小儿肾脏专科,收取了自2009年1月1日至2013年11月收治的狼疮性肾炎患儿51例,收集患者完整的临床资料。免疫组化方法检测LN及正常对照组肾脏组织中LMP-1的表达,并与患者的临床状态、肾脏病理分级、临床症状及抗体表达进行相关性分析。[结果]1.免疫组化检测LN患儿肾脏组织中LMP-1的表达51例LN患儿和12例健康对照肾脏组织中检测LMP-1蛋白的表达,发现40例（78.4%）LN患儿和2例（16.7%）健康对照表达呈阳性,LN患儿肾脏的LMP-1表达的阳性率与健康对照相比,差异有统计学意义（P=0.000）。2.LN患者LMP-1的表达和不同的临床状态的关系LMP-1的表达与LN的病程无相关性。为了研究LMP-1的阳性率与临床症状的关系,我们检测了初发和复发LN患者的肾脏组织。15例初发患者中,有12例（80%）LMP-1表达阳性,36例复发患者中,有28例（77.8%）LMP-1表达阳性,初发和复发LN患者LMP-1表达无显着性差异（P=1.000）。我们进一步检测了合并细菌感染和未合细菌并感染的LN患儿的LMP1表达,发现20例未合并感染的LN患儿中有16例（80%）患儿LMP1表达阳性,而31例合并感染的LN患儿中有有24例（77.4%）患儿LMP1表达阳性。未合并感染和合并感染的LN患儿的肾脏组织LMP1表达阳性率无显着性差异（P=1.000）。3.LN患者LMP-1的表达和肾脏病理分级的相关性为了研究LN的分级与EBV感染是否有关系,我们检测了肾脏不同病理分级LN患儿的LMP1阳性率。Ⅱ型LN患儿LMP1阳性率为57.1%,Ⅲ型LN患儿LMP1阳性率为66.7%,Ⅳ型和Ⅲ+Ⅴ型LN患儿LMP1阳性率为分别80%和83.3%,Ⅳ+V型LN患儿LMP1阳性率为91.7%,是所有类型中阳性率最高的。LN患者LMP-1的表达和肾脏病理分级的Spearman相关分析表明,二者Spearman相关系数=1,P<0.01,提示LMP1阳性率与LN的分级可能有正相关性,EBV感染可能参与了LN的发病机理。4 LN患者LMP-1的表达和临床症状的关系我们也研究了LN患儿肾脏组织中LMP1阳性率与不同的临床症状的关系。40例LMP1阳性和11例LMP1阴性的LN患儿的贫血、高凝状态、低蛋白血症、低补体血症、血尿+蛋白尿的临床表现无显着性差异（P>0.05）。然而,LMP1阳性LN患儿与LMP1阴性LN患儿比较,肾功能不全、血尿、蛋白尿的发生率显着性升高（P<0.05）。5.LN患者LMP-1的表达和自身抗体的关系我们研究了自身抗体与LN患儿LMP-1的相关性,这些结果提示,LMP1阳性LN患儿与LMP1阴性LN患儿比较,只有anti-Sm抗体的阳性率在LMP1阳性LN患儿中显着升高（P=0.009）, ANA, anti-RNP, anti-Jo-1, anti-dsDNA, anti-SSA and anti-SSB抗体在两组间无显着性差异（P>0.05）。[结论]1、LMP-1与LN发病相关,但与病毒感染状态无关。2、LMP-1与LN患儿肾脏损害程度和类型呈阳性相关,EBV感染可能提高LN的肾脏分级。3、LMP-1阳性LN患者的肾功能不全、血尿、蛋白尿临床症状出现的阳性率更高。这些结果提示LN患儿的临床症状与LMP-1的表达呈阳性相关,EBV感染可能加重LN的临床表现。4、EBV感染可能通过增加Anti-Sm抗体的产生而成为LN病情加重的因素。第三部分Epstein-Barr病毒潜伏膜蛋白1在儿童狼疮性肾炎患者中表达的比较[研究背景及目的]通过实时定量逆转录PCR （RT-PCR）、肾脏免疫组化和ELISA3种方法研究儿童狼疮性肾炎（LN）中EB病毒（EBV）潜伏膜蛋白1（LMP-1）的表达,试图探讨LMP-1在儿童LN的致病机制。[方法]41例LN患儿和12例健康对照组,分别用RT-PCR法、免疫组化方法、ELISA法检测两组外周血单核细胞（PBMCs）、肾脏组织及血清中LMP-1的表达。[结果]① RT-PCR法、免疫组化法、ELISA法检测LN患儿和健康对照者的阳性率分别为（65.9% vs 8.3%,95.1% vs 16.7%,22.0% vs 8.3%）,差异有统计学意义（P<0.05）；②3种方法检测LMP-1的表达,免疫组化检测阳性率高于其它两组,差异有统计学意义（P<0.05）。[结论]儿童LN中存在EBV潜伏期基因LMP-1表达异常,其中肾脏组织中表达阳性率最高,提示LMP-1可能参与了儿童LN的发病。
俞海波[2]（2012）在《EB病毒感染对microRNA-203的表达影响及其相互作用是鼻咽癌发病学的重要机制》文中研究说明[背景]EB病毒（Epstein-Barr virus, EBV）是具有高度转化能力的病毒,并与多种恶性肿瘤如伯基特淋巴瘤（BL）和鼻咽癌（NPC）密切相关。但是,EBV在NPC发展中的作用尚未阐明。MicroRNAs （miRNAs）是一类高度保守的非编码小RNA,主要通过与靶基因3’末端非翻译区互补配对,从而抑制靶基因的表达而发挥生物学功能,miRNA可以控制多种生物进程：如细胞增殖,凋亡和分化。越来越多的证据表明miRNA表达异常参与肿瘤的发生。然而,在NPC中EBV能否并如何调控细胞miRNA的表达仍需要阐明。本课题利用前期构建的EBV稳定感染293-EBV细胞系和对照组293细胞系进行miRNA芯片分析。筛选受EBV调控的差异miRNAs,从miRNA的角度研究EBV促进NPC发生发展的机制。[miR-203在EBV感染的上皮细胞、淋巴细胞和低分化鼻咽癌组织中表达下调]对293及293-EBV细胞进行miRNA芯片检测和分析,筛选差异表达超过2.5倍的miRNAs,其中3个表达上调,15个表达下调。miR-203是上皮细胞中特异表达的一个miRNA,并在多种上皮肿瘤中表达下调,具有抑瘤基因的功能,因此,本课题选择miR-203作为下一步研究对象。芯片结果显示miR-203在293-EBV细胞中下调约3.7倍。qRT-PCR证实miR-203表达水平和芯片结果保持一致；在EBV感染的上皮细胞、淋巴细胞中miR-203明显下调；然而在EBV丢失上皮细胞中miR-203的表达水平恢复明显；证实miR-203在低分化NPC组织较正常鼻咽组织中的表达水平下调4.25倍。[miR-203调控新靶基因E2F3、CCNG1参与抑制上皮细胞的生长和恶性转化能力]通过miRBase软件分析差异表达miRNA分子的基本信息,在线miRNA靶基因预测软件targetscan和miRanda对下游靶基因进行分析,并利用荧光素报告载体活性检测实验证实E2F3和CCNG1是miR-203的直接调控的新靶基因。RT-PCR和Westernblot结果显示miR-203可以在mRNA和蛋白质水平调控靶基因的表达。MTT和流式细胞结果表明miR-203具有抑制上皮细胞生长能力,能抑制细胞从G0/G1期向S期转换的进程；miR-203明显抑制裸鼠移植瘤肿瘤细胞的生长。免疫组化和原为杂交结果显示miR-203过表达的裸鼠瘤组织中靶基因E2F3和CCNG1表达下调。在上皮细胞中过表达靶基因E2F3和CCNG1能够逆转miR-203对上皮细胞生物学功能的影响。[LMP1是EBV下调miR-203的关键病毒蛋白,并且通过激活JNK和NF-κB信号通路调控miR-203的表达]潜伏膜蛋白LMP1和LMP2是EBV编码的重要癌蛋白。qRT-PCR结果证实EBV通过LMP1参与调控Pri-miR-203和Mature-miR-203表达下调而LMP2却无此功能；在EBV和LMP1稳定转染的上皮细胞中沉默LMP1表达后,miR-203的表达量恢复明显。免疫组化和原位杂交结果显示miR-203在NPC旁较癌组织中表达高；LMP1表达阴性NPC组织较阳性癌组织的miR-203表达明显增高。LMP1发挥生物学功能的主要区域是C端的CTAR1、CTAR2和CTAR3结构域。Western-blot和qRT-PCR结果显示LMP1蛋白CTAR1和CTAR2结构域通过激活JNK和NF-κB信号通路调控miR-203的表达；而p38信号通路对miR-203的表达没有明显影响。同时,qRT-PCR结果证实LMP1蛋白CTAR3结构域不能下调miR-203的表达。[miR-203与鼻咽癌的侵袭转移及患者血清中EBV抗体VCA-IgA的表达水平密切相关]研究显示miR-203在EBV感染的NPC组织中低表达,miR-203可能是NPC潜在的抑瘤基因。本研究应用NPC组织芯片,原位杂交结果显示NPC组织中miR-203表达水平与NPC淋巴结转移和患者血清EBV抗体VCA-IgA表达量紧密相关。NPC组织中miR-203表达越低,淋巴结转移率越高,血清EBV抗体VCA-IgA表达水平越高。
吴正蓉[3]（2009）在《Cripto-1（CR-1）在鼻咽癌中的作用及其机制研究》文中研究说明研究背景和目的鼻咽癌是我国南方及东南亚地区常见的一种头颈部恶性肿瘤。目前普遍认为EB病毒、化学致癌物和遗传易感性是促使鼻咽癌发生发展的三大因素,但NPC的分子发病机制尚不完全清楚。由于鼻咽癌是一种低分化、高转移性恶性肿瘤,且其发生部位较为隐蔽,因此多数病人在确诊时都为中、晚期且常伴有转移,且治疗后五年生存率始终在60%以下,因此继续探索鼻咽癌发病的分子机制、寻找有价值的早期诊断生物标志物及治疗靶标仍具有重要意义。人Cripto-1（CR-1）,是表皮生长因子-CFC（epidermal growth factor-Cripto-1/FRL1/cryptic,EGF-CFC）家族成员,是一个由188个氨基酸组成的细胞外糖蛋白,为早期胚胎发生所必须。Cripto-1在体内有两种活性形式:一是通过糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol,GPI）键锚定于细胞膜上作为复合受体;二是GPI键断裂后以可溶性分泌蛋白的形式作为生长因子样的配体。虽然Cripto-1是胚胎干细胞的一个标志,成体内通常不表达,但却过表达于75%-80%的乳腺癌、结肠癌、肺癌以及50%-60%的胃癌、胰腺癌、卵巢癌及睾丸癌。此外,Cripto-1的表达在诸如结肠腺瘤、胃的肠上皮化生及乳腺导管原位癌等癌前病变中亦显着提高。Caterina等2006年报道血浆Cripto-1水平可作为是早期发现结肠癌和乳腺癌的生物标志物。体外实验和转基因鼠研究均表明,Cripto-1通过促进细胞增殖、生存、迁移、侵袭和诱导细胞转化、上皮-间充质转化（epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）及肿瘤血管形成等在肿瘤发生发展中发挥瘤基因的重要作用。由于Cripto-1在肿瘤组织高表达,正常组织低表达甚至不表达,因此它也是恶性肿瘤治疗的新靶点。体内体外实验均证明,拮抗Cripto-1的反义寡核苷酸及中和性封闭Cripto-1的单克隆抗体能明显抑制结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、睾丸癌及白血病细胞的生长。尽管目前已证明Cripro-1与某些恶性肿瘤发生发展存在相关,而且也展现出作为新的早期诊断和分子生物治疗靶点的潜力。然而,Cripto-1与鼻咽癌的关系如何,迄今尚无相关报道。同时,Cripto-1为何在肿瘤中重新高表达,其始动因素尚不得而知。因此本课题旨在研究Cripto-1在鼻咽癌细胞和组织中的表达特性;进一步通过改变Cripto-1的表达水平观察其对于鼻咽癌细胞生物学特性的影响;最后利用荧光差异双向凝胶电泳的蛋白组学方法,初步探讨Cripto-1在鼻咽癌发病机制中所涉及的信号通路,从而为进一步理解鼻咽癌发病的分子机制和寻找新的早期诊断与分子靶向治疗靶点提供新线索。研究内容与方法1.鼻咽癌中Cripto-1表达特性的鉴定及临床意义采用免疫组化、Western blot、荧光定量RT-PCR及RT-PCR方法从蛋白和mRNA水平检测Cripto-1在临床鼻咽癌组织标本及鼻咽癌细胞系CNE1、CNE2、SUNE1、HNE1、HONE1和C666-1中的表达情况,并分析其与临床特征的联系,探讨Cripto-1与鼻咽癌发生发展及侵袭转移的关系。2.Cripto-1表达沉默对鼻咽癌细胞CNE2生物学特性的影响利用已知的Cripto-1干扰片段,构建含H1启动子和绿色荧光蛋白（greenfluorescent protein,GFP）的慢病毒载体,将慢病毒载体质粒与辅助质粒共转染293FT细胞包装慢病毒,收集病毒上清,进行病毒滴度测定。将含Cripto-1特异干扰片段的慢病毒感染CNE2细胞,以空载体的病毒为阴性对照,利用GFP的表达用流式细胞仪筛选出稳定的干扰株。荧光定量PCR法检测Cripto-1在干扰前后mRNA的变化;Western blot法检测干扰前后Cripto-1蛋白表达的情况;用MTT法、平板克隆形成实验及流式细胞术检测Cripto-1沉默后对鼻咽癌细胞体外增殖能力的影响;利用体外侵袭实验（Boyden小室）检测Cripto-1沉默后对鼻咽癌细胞体外侵袭能力的影响。3.Cripto-1过表达对鼻咽癌细胞CNE1生物学特性的影响应用PCR、酶切及DNA测序鉴定Cripto-1真核表达载体pCI/CR-1。用其转染鼻咽癌细胞CNE1,以空载体pCI/neo为阴性对照,应用G418进行筛选获取Cripto-1稳定过表达的细胞克隆。荧光定量PCR法检测Cripto-1过表达前后mRNA的变化;Western blot法检测过表达前后Cripto-1蛋白表达的情况;用MTT法、平板克隆形成实验及流式细胞术检测Cripto-1过表达后对鼻咽癌细胞体外增殖能力的影响;利用Boyden小室检测Cripto-1过表达后对鼻咽癌细胞体外侵袭能力的影响。4.人鼻咽癌细胞株CNE1/neo和CNE1/CR-1+的蛋白质组荧光差异双向凝胶电泳分析为了更好的理解Cripto-1在鼻咽癌细胞中的作用机理和寻找其所参与的信号通路,我们运用双向荧光凝胶内差异显示电泳（two-dimensional differential in-gelelectrophoresis,2D-DIGE）技术对稳定过表达Cripto-1的CNE1/CR-1+及阴性对照CNE1/neo细胞进行了差异表达蛋白质组分析。经图像软件分析,获得有统计学差异的蛋白质点,选择2倍以上的差异表达蛋白质点进行质谱鉴定,并在mRNA水平对候选蛋白进行初步验证。结果1.鼻咽癌中Cripto-1表达特性的鉴定及临床意义（1）Cripto-1在鼻咽癌细胞中的表达采用Real-time RT-PCR检测Cripto-1基因在鼻咽癌细胞株及鼻咽永生化上皮细胞NP69中的表达情况,结果表明Cripto-1在鼻咽癌细胞株中的mRNA表达水平均显着高于鼻咽永生化上皮细胞NP69（P＜0.05）。SNK多重比较显示Cripto-1在CNE2细胞（ΔΔCt=-11.680±1.074）和C666-1（ΔΔCt=-10.637±0.637）细胞中表达最高,在CNE1细胞（ΔΔCt=-3.523±0.648）和HNE1细胞（ΔΔCt=-3.443±1.694）中表达最低,而HONE1（ΔΔCt=-6.150±1.536）和SUNE1（ΔΔCt=-6.447±0.396）细胞中的表达水平介于两者之间。单因素方差分析显示7种细胞株中Cripto-1的表达差异具有显着性（F=48.783,P＜0.001）。Western blot结果与荧光定量PCR结果一致。（2）RT-PCR检测Cripto-1在鼻咽癌组织中的表达共收集17例NPC、7例鼻咽慢性炎标本。在17例鼻咽癌组织中,13例Cripto-1呈阳性表达,阳性表达率为76.5%;7例慢性鼻咽炎中,仅有2例表达Cripto-1mRNA,阳性表达率为28.6%;两者表达水平的差异具有显着性（P=0.042）。（3）免疫组织化学检测Cripto-1蛋白在鼻咽癌组织中的表达SP免疫组化结果表明,Cripto-1表达主要定位在鼻咽癌细胞膜和细胞浆,而在慢性鼻咽炎组织及肿瘤周围相对正常组织、间质组织则为弱阳性或阴性表达。37例鼻咽癌组织中,Cripto-1蛋白阳性表达的有20例,而20例慢性鼻咽炎组织中则有4例,两者表达水平的差异比较具有显着性（X2=6.176,P=0.013）,与其在mRNA水平的表达情况一致。经统计分析,Cripto-1的表达与患者的年龄、性别及浸润深度的相关性P值均＞0.05;而与淋巴结转移、远处转移及临床分期则显着相关（P＜0.05）。转移组中Cripro-1的表达要高于未转移组,临床Ⅲ-Ⅳ期组要高于临床Ⅱ-Ⅰ期组,即Cripto-1阳性表达者淋巴结和远处转移发生率高,多为临床中晚期;Cripto-1阴性表达者转移发生率低,多为临床早期。上述实验结果提示我们Cripto-1在鼻咽癌表达上调,且与转移及临床分期显着相关。但其表达上调对于鼻咽癌细胞生物学特性的影响以及调控的具体机制仍不明确。2.Cripto-1表达沉默对鼻咽癌细胞CNE2生物学特性的影响PCR和测序证实,成功构建了Cripto-1 shRNA的慢病毒载体pLVTHM/shCripto-1。包装慢病毒,并测得病毒滴度为4.2×105TU/ml。慢病毒感染CNE2细胞,然后流式细胞仪分选鉴定GFP+细胞,荧光定量PCR和Western blot鉴定干扰效率后,建立了稳定干扰Cripto-1的鼻咽癌细胞株CNE2/GFP+/Cripto-1-。采用MTT法检测Cripto-1基因沉默后细胞的体外增殖情况,结果显示,与CNE2/GFP+/pLVTHM和CNE2细胞相比,CNE2/GFP+/Cripto-1-细胞的增殖速度显着减慢,并且呈时间依赖关系（F=32.364,P＜0.001）。平板克隆形成实验的结果同样显示CNE2/GFP+/Cripto-1-细胞的增殖能力显着下降,三组细胞的增殖能力具有显着性差异（F=25.475,P=0.001）。流式细胞仪检测三组细胞的细胞周期分布,结果显示三组细胞的细胞周期分布并无显着性差异。综上所述,Cripto-1表达沉默显着抑制了鼻咽癌细胞的体外增殖能力。采用Boyden小室检测Cripto-1基因沉默后细胞体外侵袭运动能力的改变,结果显示,与CNE2/GFP+/pLVTHM和CNE2细胞相比,CNE2/GFP+/Cripto-1-细胞穿过聚碳酸酯膜的细胞数减少,差异具有显着性（F=153.754,P＜0.001）,CNE2/GFP+/Cripto-1-细胞的侵袭能力显着降低。以上结果表明,Cripto-1基因沉默后显着降低了鼻咽癌细胞的体外迁移和侵袭能力。3.Cripto-1过表达对鼻咽癌细胞CNE1生物学特性的影响PCR、酶切及DNA测序鉴定Cripto-1真核表达载体pCI/CR-1,确认后以脂质体LipofectmineTM2000介导转染CNE1细胞,获得G418抗性单克隆,荧光定量PCR和Western blot确定Cripto-1过表达水平,建立稳定过表达Cripto-1的鼻咽癌细胞株CNE1/CR-1+。采用MTT法检测Cripto-1过表达后细胞的体外增殖情况,结果显示,与CNE1/neo和CNE1细胞相比,CNE1/CR-1+细胞的增殖速度显着增快,并且呈时间依赖关系（F=49.070,P＜0.001）。平板克隆形成实验的结果同样显示CNE1/CR-1+细胞的增殖能力显着提高,三组细胞的增殖能力具有显着性差异（F=5.861,P=0.039）。流式细胞仪检测两组细胞的细胞周期分布,结果显示相对于CNE1/neo细胞,CNE1/CR-1+细胞的S期比例显着增加（t=12.441,P＜0.001）,G0/G1期比例显着减少（t=-5.083,P=0.007）。综上所述,Cripto-1的过表达显着促进了鼻咽癌细胞的体外增殖能力。采用Boyden小室检测Cripto-1基因过表达后细胞体外侵袭运动能力的改变,结果显示,与CNE1/neo和CNE1细胞相比,CNE1/CR-1+细胞穿过聚碳酸酯膜的细胞数增多,差异具有显着性（F=106.081,P＜0.001）,CNE1/CR-1+细胞的侵袭能力显着增高。以上结果表明,Cripto-1基因过表达后显着提高了鼻咽癌细胞的体外迁移和侵袭能力。4.CNE1/neo和CNE1/CR-1+细胞的蛋白质组双向凝胶电泳分析运用凝胶内差异显示电泳技术对稳定过表达Cripto-1的CNE1/CR-1+及阴性对照CNE1/neo细胞进行了差异表达双向凝胶电泳分析,数字化图像分析发现有49个蛋白质斑点在两组凝胶中有显着性差异表达（表达量相差2倍以上）,其中在CNE1/CR-1+细胞中表达量升高的蛋白质斑点有37个,表达量下降的蛋白质斑点有12个。质谱鉴定最终得到23个Cripto-1过表达前后的差异表达蛋白质,其中上调的有17个,下调的有6个。初步发现肿瘤相关蛋白DJ-1和1433G可能是Cripto-1活化PI3K-Akt和MAPK信号通路的协同作用者;转移相关蛋白ANXA3可能与Cripto-1促转移的作用相关。结论1.相对于鼻咽永生化上皮细胞NP69和鼻咽慢性炎组织,Cripto-1在鼻咽癌细胞株和组织中表达上调,且与鼻咽癌的侵袭与转移密切相关;2.Cripto-1基因沉默后显着抑制了鼻咽癌细胞的体外增殖、迁移和侵袭能力;Cripto-1过表达后则明显促进了鼻咽癌细胞的体外增殖、迁移和侵袭能力。Cripto-1与鼻咽癌的发生发展密切相关;3.2D-DIGE/MS分析所得的差异表达蛋白:DJ-1、1433G和ANXA3可能与鼻咽癌中Cripto-1的作用相关。本研究的创新之处:1.在mRNA和蛋白水平证实Cripto-1在鼻咽癌细胞株和组织中表达上调,且与鼻咽癌的侵袭与转移密切相关;为进一步理解鼻咽癌发病的分子机制和寻找新的早期诊断与分子靶向治疗靶点提供新线索。2.构建了Cripto-1敲低的慢病毒载体,建立了稳定的Cripto-1过表达和敲低的相关细胞克隆;为进一步了解Cripto-1在鼻咽癌发生发展中可能的作用及其机制提供了有效工具;3.初步证实Cripto-1与鼻咽癌的发生发展密切相关,在体外可以促进鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭;4.建立了Cripto-1过表达后CNE1细胞的荧光差异蛋白质表达图谱。发现肿瘤相关蛋白DJ-1和1433G可能是Cripto-1活化PI3K-Akt和MAPK信号通路的协同作用者;转移相关蛋白ANXA3可能与Cripto-1促转移的作用相关。
杨帆[4]（2006）在《腺病毒转染核糖体蛋白基因RPS26对人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤生长分化影响的实验研究》文中进行了进一步梳理人结外鼻型NK／T细胞淋巴瘤（Human Nasal type NK／T celllymphoma）是一类具有特殊形态、免疫表型和生物学行为，多原发于淋巴结外器官或组织，存在高水平EB病毒感染的肿瘤。该肿瘤常表达T细胞分化抗原及自然杀伤（Natural Killer，NK）细胞相关抗原，故此得名。目前认为T细胞、NK细胞具有共同始祖细胞（P-T／NT细胞），在不同条件下可向T细胞或NK细胞分化。人结外鼻型NK／T细胞淋巴瘤可能来源于具有双向分化潜能的P-T／NT细胞，其瘤细胞的分化已超越前体细胞阶段（P-T／NT细胞、P-T细胞和P-NK细胞），但尚未达到成熟T淋巴细胞或NK细胞的阶段。新版WHO关于淋巴造血组织肿瘤的分类已将其列为一个独立的淋巴瘤类型。人结外鼻型NK／T细胞淋巴瘤在亚洲及南美洲发病率较高，西欧和北美地区少见，故该肿瘤是亚洲、也是中国的“特产”。四川大学华西医院病理科每年诊断该类肿瘤60余例，约占所有淋巴瘤的13.85％，约占非霍奇金淋巴瘤的16％。 人结外鼻型NK／T细胞淋巴瘤多发于中线面部，局部活检组织多较小，除做病理诊断和免疫表型检测外所剩无几，故实验材料的匮乏严重制约该肿瘤的深入研究。 我课题组经过三年多的工作成功建立人结外鼻型NK／T细胞淋巴瘤
江培洲,甘明,黄华,沈新明,应万涛,钱小红,姚开泰[5]（2005）在《运用蛋白质组学技术研究EB病毒诱导鼻咽癌细胞CNE2表达变化的蛋白质》文中进行了进一步梳理【目的】寻找并鉴定CNE2细胞在EB病毒感染后表达发生变化的功能蛋白质,为阐明该病毒诱导鼻咽上皮细胞发生生物学变化的作用机制提供线索。【方法】分别从EB病毒感染后的CNE2细胞和未经感染的CNE2细胞中抽提总蛋白质,通过双向电泳分离。运用软件比较分析上述两组的蛋白质表达图谱,寻找表达有差异的蛋白质点。从凝胶上切下差异蛋白质点,通过基质辅助激光解吸/离子化飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）鉴定。【结果】图像分析显示,EB病毒感染后的CNE2细胞和未经感染的CNE2细胞之间存在一些明显差异的蛋白质点。通过MALDI-TOF-MS成功地鉴定了其中4个蛋白质点,EB病毒感染CNE2细胞后蛋白质GRP78和硫氧还蛋白过氧化物酶1表达上调,蛋白质肌动蛋白胞浆组分2和蛋白酶体ι链表达下调。【结论】EB病毒感染鼻咽上皮细胞后引起生物学变化的分子机制可能包括:①诱导细胞大量合成蛋白质以促进增生,同时上调蛋白质GRP78的表达而抗凋亡;②提高细胞内氧化状态而诱导蛋白质硫氧还蛋白过氧化物酶1的表达,并可能通过该蛋白质调控NF-κB和AP-1来影响细胞生长。
王爽,吕丽春,李虹,江培洲,姚开泰[6]（2004）在《转染人pIgR的小鼠鼻咽上皮细胞在EBV感染前后基因表达谱差异》文中指出目的应用cDNA阵列技术研究转染人多聚免疫球蛋白受体（hpIgR）的二亚硝基哌嗪（n, n’-dinitrosoperazine, DNP）转化的小鼠鼻咽上皮（TMNE）细胞系在EBV感染前后基因表达谱差异,探索EBV在鼻咽癌发病过程中的作用及鼻咽癌的发病机制。方法提取转染hpIgR 的TMNE细胞在EBV感染前后的总RNA,逆转录成α-32P-dATP标记的cDNA探针,与AtlasTM mouse cancer array 1.2 阵列膜进行杂交。利用AtlasImageTM 软件分析基因表达差异。结果共有25个基因表达水平发生了改变,有23个基因表达上调,2个基因表达下调。结论EBV感染可使转染细胞的多个基因表达发生改变,这些基因可能与鼻咽癌的发生、发展有关。
王爽[7]（2004）在《鼻咽低分化鳞状细胞癌分子分类的初步研究》文中指出鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我国南方五省及东南亚地区常见的一类恶性肿瘤。病因学研究表明，遗传因素、环境因素和EB病毒感染均与NPC的发生有关。由于NPC的组织形态学比较复杂，目前对于NPC的病理学分型尚未有统一的认识，存在多种组织病理学分类方法。临床上，98％的NPC病例都属于低分化鳞状细胞癌，这种组织学特性决定了放射治疗是其主要的治疗手段。但治疗效果不是很理想，预后较差，5年生存率不超过60％。这种临床异质性提示了鼻咽低分化鳞状细胞癌很可能存在不同的分子亚型。 肿瘤的分子分类是指，以基因表达谱为根据，运用相关的分子生物学技术，结合一些计算机数据处理方法，筛选出数个或数十个肿瘤标志物，用以找出人类未知的肿瘤亚型和／或将一些特殊的肿瘤病例归入到已发现的肿瘤类型中，从而在分子水平上区分肿瘤的类型，以便更好地指导肿瘤的早期诊断，个性化治疗以及预后评估。这已成为肿瘤分子病理学中一个重要的研究方向。 cDNA微阵列或基因芯片（cDNA microarray or gene chip）技术不仅可高敏感地定性、定量的检测基因表达水平，其最大的优越性是可同时对成千上万个基因的表达情况进行检测或平行对比这些基因在不同组织中的表达，被认为是一种高通量的基因表达水平的检测方法。因此，cDNA微阵列技术可以成为肿瘤分子分类的主要手段之一。 本研究选用24例病理诊断为鼻咽低分化鳞状细胞癌且癌细胞数量超过细胞总量75％的鼻咽癌组织、24例作为对照的正常鼻咽组织及4种鼻咽癌细胞系进行研究，分别抽提各组织和细胞系的总RNA，并从24例正常鼻咽组织标本中分别取等量的RNA混合在一起作为一个共同的对照，经逆转录a一’ZP一deTP标记探针后，分别与Researeh Geneties公司生产的具有4132个人类已知功能的基因（包括表达序列标签，ESTs）的微阵列膜GFZH进行杂交，再利用该公司所配套的分析软件Pathways4.0对杂交强度进行分析，数据均一化后，分别得到24例鼻咽低分化鳞状细胞癌组织、鼻咽正常组织及4种鼻咽癌细胞系的41犯个基因的表达谱。 根据24例鼻咽低分化鳞状细胞癌组织和正常对照组织的基因表达灰度值，对每个基因进行t一test，共筛选出基因表达灰度值具有显着差异（P<0.05）的基因1625个。其中在鼻咽低分化鳞状细胞癌组织中表达基本上调的基因有114个，如基本转录因子3（B7子咨）、细胞周期素Dl（cCNDI）等;24例鼻咽低分化鳞状细胞癌组织表达基本下调的基因有42个，如细胞死亡调节蛋白GR从fl夕、翻译抑制蛋白尸14.J、表皮膜蛋白2等。 同时，将鼻咽癌组织和鼻咽癌细胞系的基因表达谱进行比较，筛选出在鼻咽癌组织中表达而鼻咽癌细胞系中不表达的基因50个，初步将其看作鼻咽癌组织间质细胞表达的基因。 基于4132个基因和1625个基因的表达谱，运用Cluster软件，分别对24例鼻咽低分化鳞状细胞癌标本进行聚类分析，二者聚类结果一致，同样将24例标本分成两类:NPC 101、105、106、110、112、113、一15及121标本聚成一类，而NPC102、103、104、107、108、109、111、114、1 16、1 17、1 18、1 19、120、122、123及124聚为一类。根据聚类结果，又筛选出两类间表达灰度值具有显着差异（P<0.05）的基因78个，对这78个基因再次进行聚类分析，结果与4132个及1625个基因的聚类结果一致，此结果也表明这78个基因基本上可以概括鼻咽低分化鳞状细胞癌分子分类的信息。将这78个基因与前面筛选的在间质细胞中表达的50个基因进行对比，未找到相同的基因，因此初步将它们作为鼻咽低分化鳞状细胞癌分子分类的候选指标。结合数据库信息发现这些基因的功能主要与转录调节、细胞生长和周期调节、信号转导、碳水化合物和蛋白质代谢等有关， 本实验结果表明:在鼻咽癌组织中，有多个基因的表达水平发生了改变，这些基因很可能是鼻咽癌发病过程中的重要参与者;同时鼻咽低分化鳞状细胞癌在分子水平上，可能至少存在两种亚型，在两种亚型中有多个基因的表达水平发生了变化，这些基因的功能主要集中在转录调节、细胞生长和周期调节、信号转导、碳水化合物和蛋白质代谢等方面。
沈新明,江培洲,黄华,李欣,姚开泰[8]（2004）在《运用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳和图像软件分析TPA处理NIH3T3细胞前后的蛋白质表达谱差异》文中进行了进一步梳理目的建立及优化聚丙烯酰胺双向凝胶电泳技术,并应用图像软件分析伏波醇酯（TPA）刺激前后小鼠成纤维细胞NIH3T3系的蛋白质差异表达,为进一步鉴定与TPA生物学作用有关的蛋白质奠定基础。方法分别提取TPA处理前后的NIH3T3细胞总蛋白质,经双向电泳,硝酸银染色后用软件分析显示两者蛋白质的差异表达。结果软件分析显示TPA刺激前后的细胞蛋白质有明显的差异表达。结论高质量的双向电泳设备、熟练的电泳操作和图像处理技能是寻找稳定可信的功能蛋白质的必要条件。
江培洲,甘明,沈新明,黄华,李欣,姚开泰[9]（2004）在《双向凝胶电泳-飞行时间质谱法分析促癌剂TPA诱导NIH3T3细胞表达变化的蛋白质》文中指出[目的]寻找并鉴定在TPA处理后小鼠成纤维细胞NIH3T3中表达发生变化的蛋白质,为阐明TPA在诱导细胞发生生物学变化的作用机制提供线索。[方法]用TPA刺激NIH3T3细胞,分别提取实验组和对照组的NIH3T3细胞的总蛋白质,通过聚丙烯酰胺凝胶双向电泳,硝酸银染色后用软件分析寻找差异表达的蛋白质,并对差异蛋白质进行质谱鉴定。[结果]软件分析显示TPA处理后的NIH3T3细胞中有明显的差异表达蛋白质,质谱鉴定表明TPA处理后,表达上调的蛋白质有线粒体基质蛋白P1前体、微管蛋白beta-5链;TPA处理后明显表达下调的蛋白质有galectin-1、N-myc下游调节基因1蛋白。[结论]TPA刺激NIH3T3细胞后可以下调生长抑制基因的表达,同时上调与细胞增生相关基因的表达。因此,促癌剂TPA可能对NIH3T3细胞有促进增生的作用。
江培洲[10]（2003）在《EBV与TPA分别及协同处理CNE2细胞诱导基因表达差异的蛋白质组学研究》文中研究表明鼻咽癌是东南亚和我国南方省份发病率很高的一种特色癌，它具有明显的种族性和地域性。以往的研究表明，鼻咽癌的病因涉及EB病毒的感染、遗传因素、饮食和某些环境因素。尽管该肿瘤的发病机制尚未彻底阐明，但随着研究的深入，EBV在鼻咽癌发生中的作用越来越受到重视，有利于EBV是鼻咽癌主要病因的证据也越来越多。 然而，要阐明鼻咽癌发生发展的机理，仅强调EBV与鼻咽癌的发生密切相关是不够的，必然要涉及到其中的关键问题，即EBV感染上皮细胞如鼻咽上皮后的作用机制。但是长期以来，由于上皮细胞大多缺乏EBV经典受体即CR2／CD21的表达，很难感染上EBV，因而没有有效用于EB病毒感染的上皮细胞模型，EBV对上皮细胞的感染引起的生物学性能的变化无法得以清楚了解。这期间尽管有人给某些上皮细胞转染CR2／CD21而成功使该细胞感染EBV，但是这种人工的操作仍然不足以阐明细胞自然的感染机制及其诱发的生物学变化。因此，寻找一种有效的病毒自然感染途径用于建立上皮细胞的EBV感染模型对阐明鼻咽癌的发生发展机理有着重要的意义。 此外，环境因素如伏波醇TPA对EBV的感染及鼻咽癌的发生的影响也备受关注。TPA的刺激能够促使EBV感染进而转化细胞以及NPC的地理区域分布与含TPA的植物分布明显相关等证据使得研究者对TPA诱导上皮细胞生物学改变的机理倍感兴趣。因此，弄情TPA处理前后上皮细胞在分子水平上的表达差异，对阐明EBV的感染及鼻咽癌发生的机制同样有着重要意义。 因此，我们用EBV和TPA分别及联合处理鼻咽上皮细胞，比较细胞在EBV感染及T以处理前后分子水平上的基因表达差异，从而寻找与它们的生物学性能相关的生物大分子，为阐明EBV感染及鼻咽癌发生的机理奠定基础。由于人正常鼻咽原代上皮材料来源很少，分离培养困难，传代增殖有限，无法满足实验的需要，并且有报道认为在正常条件下，EBV不能感染未转化的鼻咽部鳞状上皮细胞，因此我们拟选用鼻咽部低分化鳞癌上皮细胞株CNEZ进行研究。根据前人的工作经验，感染与未感染的细胞间接触培养及感染的方式是目前发现的新的EBV感染方法，因此我们选用该法用于感染试验。EBV感染及T以作用的实验细胞分为四组，即未作任何处理的CNEZ，EBV处理的CNEZ，TPA处理的CNEZ，EBV和TPA联合处理的CNEZ，分别同步培养处理，然后用于后续实验。 实验表明B95一8病毒株在接触感染实验中能有效地使鼻咽癌上皮细胞CNEZ感染EBV，与前人用其它的EB病毒株进行接触感染的结果相符，这提示了细胞间接触感染是建立EBV自发感染上皮细胞的模型的可行方法。 为了揭示CNEZ细胞在EBV感染及TPA处理前后生物学特征变化的分子机理，我们采用了新一代鉴定基因表达差异的技术一一功能蛋白质组学技术作为研究方法。 该方法是通过双向电泳分离前述4组细胞的总蛋白质，用图像分析软件对4组蛋白质凝胶图谱进行差异表达蛋白质的分析，然后切下感兴趣的差异蛋白质点，胶内酶解后点样用于MALDI一TOF一MS检测，以测定所得结果即肤指纹图谱为参数搜索蛋白质数据库（SWISS一PORT和肠EMBL da1Labase），获取有关蛋白质性质、表达变化和翻译后修饰加工情况等多方面信息，以期从整体上全面了解影响4组细胞生物性能变化 ·2·的各种相关的功能蛋白质，从而为EBV感染、T队作用的机制及鼻咽癌的发生发展机理提供有力依据。 我们将4张凝胶图作比较，发现了不少差异表达蛋白点，并用队LDI一TOF一Ms技术成功鉴定了其中巧个点所属的蛋白质。根据所鉴定蛋白质的功能，结合实验所观察的细胞生物学特征的变化，我们认为: 1) EBV的感染可能促使细胞大量合成与其功能相关的蛋白质，并诱 导605 aeidic ribosomal protein pZ和分子伴侣mitoehondrial matrix proteinPI的高表达以适应蛋白质产量的增加，随后在 内质网产生应激反应，促使细胞表达蛋白GRP78以免受应激伤害; 能诱导与增生相关的蛋白Stathmin、Nueleophosmin/B23，功能 未知的蛋白如Retieuloealbin 1 preeursor的表达;能诱导蛋 白质Thioredoxin peroxidasel的表达进而可能激活NF一KB路 径;能下调蛋白14一3一3 sigma的表达来抑制细胞分化。 2) TPA的处理能够抑制鼻咽癌细胞CNEZ生长，影响细胞的代谢，促 进细胞蛋白酶成分的增加以及改变细胞的形态。T以刺激CNEZ细 胞抑制了与分裂、增生相关的蛋白“Stathmin”、 “Nueleophosmin/B23”的表达，并阻断了“Nueleophosmin/B23” 的磷酸化，同时上调与分化及凋亡相关的蛋白“14一3一3 sigma” 的表达，从而抑制CNEZ细胞的生长;此外，T以还诱发了磷酸丙 糖异构酶在细胞中高表达，从而影响糖代谢;能引起蛋白酶成分 如proteasome iota ehain的增加;促进肌动蛋白aetin的高表 达，进而引起细胞骨架结构和细胞形态的改变、细胞膜的变化。 3) CNEZ细胞经EBV和TPA分别处理后可引起?
二、EBV感染及TPA处理前后人CR2转染细胞的基因差异表达谱（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、EBV感染及TPA处理前后人CR2转染细胞的基因差异表达谱（论文提纲范文）
（1）儿童系统性红斑狼疮中Epstein-Barr病毒基因异常表达的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 EpstenBarr病毒在儿童系统性红斑狼疮外周血单个核细胞中的表达研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Epstein-Barr病毒潜伏膜蛋白1(LMP-1)在儿童狼疮性肾炎肾炎肾脏中表达的研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 Epstein-Barr病毒潜伏膜蛋白1在儿童狼疮性肾炎患者中表达的比较 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 在读期间发表论文论着 |
（2）EB病毒感染对microRNA-203的表达影响及其相互作用是鼻咽癌发病学的重要机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写词简表 |
| 第一章 前言 |
| 技术路线 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 临床组织样本 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 菌株和质粒载体 |
| 1.5 试剂 |
| 1.6 引物 |
| 1.7 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 miRNA芯片检测 |
| 2.2 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 2.3 蛋白抽提 |
| 2.4 组织样本采集 |
| 2.5 miRNA及si-RNA转染目的细胞 |
| 2.6 MTT |
| 2.7 流式细胞分析细胞周期改变 |
| 2.8 免疫组化检测 |
| 2.9 原位杂交检测miRNA的表达 |
| 2.10 免疫组化和原位杂交结果分析 |
| 2.11 差异miRNA生物信息学分析 |
| 2.12 pcDNA3.1-LMP2真核表达载体的构建 |
| 2.13 G418筛选阳性克隆 |
| 2.14 建立EBV感染上皮细胞模型 |
| 2.15 裸鼠移植瘤实验 |
| 2.16 统计学分析 |
| 第三章 结果 |
| 第一部分 EBV对miR-203表达的影响 |
| 1.1 EBV在上皮细胞中所调控的miRNA筛选 |
| 1.2 miRNA芯片结果进行验证 |
| 1.3 EBV感染上皮细胞系的构建 |
| 1.4 miR-203在EBV感染的细胞和低分化NPC组织中表达下调 |
| 小结 |
| 第二部分 miR-203的生物信息学分析及其下游靶基因的预测与实验验证 |
| 2.1 生物信息学分析miR-203的基本信息 |
| 2.2 miR-203下游靶基因预测 |
| 2.3 对预测的miR-203潜在靶基因进行实验验证 |
| 小结 |
| 第三部分 miR-203对上皮细胞的生物学功能的影响 |
| 3.1 MTT实验检测miR-203对293-EBV细胞增殖的影响 |
| 3.2 流式细胞术检测miR-203对293-EBV细胞周期进程的影响 |
| 3.3 miR-203对裸鼠移植瘤细胞生长的影响 |
| 第四部分 LMP1是EBV调控miR-203的关键蛋白 |
| 4.1 EBV编码的潜伏蛋白LMP1及LMP2对miR-203的表达影响 |
| 4.2 LMP1激活NF-кB和JNK信号通路参与调控miR-203的表达 |
| 4.3 在鼻咽癌组织中LMP1与miR-203的表达量的关系 |
| 第五部分 NPC组织中miR-203的表达与临床意义 |
| 第四章 讨论 |
| 第一部分 EBV对iniR-203表达的影响 |
| 第二部分 LMP1是EBV调控miR-203的关键蛋白 |
| 第三部分 EBV-miRNA-班基因的交互作用是鼻咽癌的发病学机制 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间获得的学术成果 |
（3）Cripto-1（CR-1）在鼻咽癌中的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 技术路线 |
| 第一章 鼻咽癌中Cripto-1表达特性的鉴定 |
| 一 材料与方法 |
| 二 结果 |
| 三 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 Cripto-1基因沉默对鼻咽癌细胞生物学特性的影响 |
| 一 材料与方法 |
| 二 结果 |
| 三 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 Cripto-1过表达对鼻咽癌细胞生物学特性的影响 |
| 一 材料与方法 |
| 二 结果 |
| 三 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文讨论 |
| 全文小结 |
| 英文缩写注解 |
| 致谢 |
| 统计学证明 |
（4）腺病毒转染核糖体蛋白基因RPS26对人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤生长分化影响的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 人核糖体蛋白基因RPS13、RPS26mRNA在人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤中的表达 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 第二部分 人核糖体蛋白基因RPS26重组腺病毒表达载体制备 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 第三部分 腺病毒转染核糖体蛋白基因RPS26对人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤生长分化影响的实验研究 |
| 一、腺病毒转染核糖体蛋白基因RPS26对人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤细胞系SNK-6和SNT-8生长分化影响的实验研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 二、腺病毒转染核糖体蛋白基因RPS26对人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤动物模型生长分化影响的实验研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 核糖体蛋白基因与人类疾病研究进展 |
| 腺病毒载体研究进展 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（5）运用蛋白质组学技术研究EB病毒诱导鼻咽癌细胞CNE2表达变化的蛋白质（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 细胞、试剂盒和仪器 |
| 1.2 实验细胞的收集 |
| 1.3 蛋白质提取 |
| 1.4 双向凝胶电泳及凝胶染色 |
| 1.5 凝胶图象分析 |
| 1.6 胶内酶切 |
| 1.7 肽质量指纹谱鉴定蛋白质 |
| 2 结果 |
| 2.1 CNE2细胞经接触感染 |
| 2.2 双向电泳图谱及差异蛋白分析 |
| 2.3 差异蛋白质的鉴定 |
| 3 讨论 |
（7）鼻咽低分化鳞状细胞癌分子分类的初步研究（论文提纲范文）
| 英文缩写 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 技术路线 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
（10）EBV与TPA分别及协同处理CNE2细胞诱导基因表达差异的蛋白质组学研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 实验方法、材料及结果 |
| 一、 细胞的培养、处理、感染及验证 |
| (一) 实验材料 |
| (二) 实验方法 |
| (三) 实验结果 |
| 二、 蛋白质组学研究 |
| (一) 实验材料 |
| (二) 实验方法 |
| (三) 实验结果 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
四、EBV感染及TPA处理前后人CR2转染细胞的基因差异表达谱（论文参考文献）
- [1]儿童系统性红斑狼疮中Epstein-Barr病毒基因异常表达的研究[D]. 丁艳. 南方医科大学, 2015(03)
- [2]EB病毒感染对microRNA-203的表达影响及其相互作用是鼻咽癌发病学的重要机制[D]. 俞海波. 中南大学, 2012(12)
- [3]Cripto-1（CR-1）在鼻咽癌中的作用及其机制研究[D]. 吴正蓉. 南方医科大学, 2009(01)
- [4]腺病毒转染核糖体蛋白基因RPS26对人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤生长分化影响的实验研究[D]. 杨帆. 四川大学, 2006(03)
- [5]运用蛋白质组学技术研究EB病毒诱导鼻咽癌细胞CNE2表达变化的蛋白质[J]. 江培洲,甘明,黄华,沈新明,应万涛,钱小红,姚开泰. 中山大学学报(医学科学版), 2005(01)
- [6]转染人pIgR的小鼠鼻咽上皮细胞在EBV感染前后基因表达谱差异[J]. 王爽,吕丽春,李虹,江培洲,姚开泰. 第一军医大学学报, 2004(09)
- [7]鼻咽低分化鳞状细胞癌分子分类的初步研究[D]. 王爽. 第一军医大学, 2004(04)
- [8]运用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳和图像软件分析TPA处理NIH3T3细胞前后的蛋白质表达谱差异[J]. 沈新明,江培洲,黄华,李欣,姚开泰. 第一军医大学学报, 2004(03)
- [9]双向凝胶电泳-飞行时间质谱法分析促癌剂TPA诱导NIH3T3细胞表达变化的蛋白质[J]. 江培洲,甘明,沈新明,黄华,李欣,姚开泰. 中山大学学报(医学科学版), 2004(01)
- [10]EBV与TPA分别及协同处理CNE2细胞诱导基因表达差异的蛋白质组学研究[D]. 江培洲. 中国人民解放军第一军医大学, 2003(04)