多西环素体外抑制基质金属蛋白酶2在PC-3细胞中的表达和侵袭

一、强力霉素抑制PC-3细胞基质金属蛋白酶-2表达及侵袭的体外研究（论文文献综述）

邹亮^[1]（2021）在《基质金属蛋白酶对脑动脉瘤的影响及其相互关系研究》文中认为第一部分基质金属蛋白酶在脑动脉瘤形成和发展中的作用目的:通过人群研究分析MMP-2、MMP-9和TIMP-2在动脉瘤患者血清中表达的临床意义,并在动物实验中分析MMPs在动脉瘤形成中的意义。方法:1.人群实验:收集2016年3月至2019年3月本院动脉瘤患者156例为病例组。同期在医院健康体检中心收集健康体检者120例为对照组。病例组入组后采集静脉血5ml于抗凝管中,1000rpm离心10min,取上清液。收集对照组每位研究对象初诊或体检时的静脉血5ml于抗凝管中,采用同样的方法,1000rpm离心10min,取上清液。采用ELISA试剂盒检测患者血清中的MMP-2、MMP-9和TIMP-2表达水平。2.家兔实验:成年新西兰兔32只购自北京维通利华实验动物技术有限公司。分为4组,分别是正常对照组、1周组、2周组和3周组,每组8只。弹性蛋白酶诱导家兔形成颈动脉分叉部动脉瘤。1周组、2周组和3周组分别诱导1周、2周和3周。干预结束后,给予兔全身麻醉,沿颈部切口暴露右侧颈总动脉,用游标卡尺测量颈动脉瘤的大小。Western Blot方法检测动脉瘤组织中MMP-2、MMP-9和TIMP-2蛋白的表达水平。RT-PCR方法检测动脉瘤组织中MMP-2、MMP-9和TIMP-2 m RNA的表达水平。HE染色做病理切片。3.大鼠实验:SPF级雄性Wistar大鼠30只和TIMP-2缺陷Wistar大鼠10只购自北京维通利华实验动物技术有限公司。30只大鼠随机分成3组,即正常对照组、模型组、强力霉素组,TIMP-2缺陷Wistar大鼠为TIMP-2缺陷组。在模型组、强力霉素组和TIMP-2缺陷组中,肾动脉高压法诱导大鼠模型,正常对照组行假手术对照。手术后,强力霉素组大鼠皮下注射浓度为25mg/ml的强力霉素0.5ml,每天2次。其余三组注射生理盐水对照,连续干预1周。诱导4周后处死大鼠,取血,开颅取脑,显微镜下仔细观察颅内动脉瘤,并测量其动脉瘤大小。取出动脉瘤组织,HE染色做病理切片。采用ELISA试剂盒检测血清中MMP-2、MMP-9、TIMP-2表达水平。结果:1.人群实验:（1）动脉瘤患者血清MMP-2、MMP-9和TIMP-2蛋白表达水平显着高于正常对照组;动脉瘤患者血清中MMP-2/TIMP-2和MMP-9/TIMP-2比值显着高于正常对照组。（2）血清MMP-2蛋白在Hunt-Hess分级Ⅳ-Ⅴ、动脉瘤直径>2.5cm的患者中表达水平显着增加;血清TIMP-2蛋白在Hunt-Hess分级Ⅳ-Ⅴ的患者中表达水平显着增加;MMP-9蛋白水平、MMP-2/TIMP-2和MMP-9/TIMP-2比值在Hunt-Hess分级Ⅳ-Ⅴ、动脉瘤多发、动脉瘤直径1.2-2.5cm和>2.5cm的患者中显着升高。（3）多因素logistic回归分析表明,高水平的MMP-2、MMP-9、MMP-2/TIMP-2和MMP-9/TIMP-2是患者死亡的独立影响因素。2.家兔实验:（1）MMP-2、MMP-9和TIMP-2 m RNA在各组动脉瘤组织中相对表达顺序是6周组>3周组>1周组>对照组;MMP-2和MMP-9在对照组、1周组、3周组和6周组的两两比较中均存在显着性差异;TIMP-2在3周组和6周组间无显着差异,其余组别见均存在显着差异。（2）1周组、3周组和6周组的MMP-2、MMP-9、TIMP-2蛋白均显着高于对照组,且在1周组、3周组和6周组中逐渐增加。（3）1周组、3周组和6周组动脉瘤宽度（mm,均值）分别是2.31、4.37和5.46,三组宽度均存在显着性差异;1周组、3周组和6周组动脉瘤高度（mm,均值）分别是3.15、6.08和6.98,三组高度存在显着性差异（F=7.54,P=0.010）,但是3周组和6周组高度差异无统计学意义。（4）1周组、3周组和6周组均有动脉瘤壁弹性纤维断裂,平滑肌细胞数量减少和内皮细胞受损的病理表现,6周组受损最严重。3.大鼠实验:（1）各组大鼠血清的MMP-2、MMP-9、TIMP-2蛋白水平差异有统计学意义。模型组、强力霉素组和TIMP-2缺陷组的MMP-2和MMP-9蛋白水平较对照组升高,强力霉素组的MMP-2和MMP-9蛋白水平显着低于模型组,TIMP-2缺陷组的MMP-2和MMP-9蛋白水平显着高于模型组。模型组的TIMP-2蛋白水平显着高于对照组;强力霉素组的血清TIMP-2蛋白水平显着低于模型组;TIMP-2缺陷组的血清TIMP-2蛋白水平显着低于其余三组。（2）模型组、强力霉素组和TIMP-2缺陷组的成瘤率分别为90%、60%和100%,强力霉素组的成瘤率显着低于模型组和TIMP-2缺陷组。强力霉素组动脉瘤的宽度和高度显着低于模型组,TIMP-2缺陷组动脉瘤的宽度和高度显着高于模型组。（3）正常对照组动脉内膜、中膜和外膜结构完整,无异常细胞浸润。模型组和强力霉素组内膜变薄,弹性纤维断裂,结构紊乱,但是强力霉素组的动脉内膜较模型组厚。TIMP-2缺陷组内膜结构破坏或消失,结构紊乱,纤维断裂。结论:MMP-2、MMP-9和TIMP-2在动脉瘤的形成、进展和患者预后方面均具相关第二部分血管内介入栓塞术和开颅夹闭术对MMPs、炎症因子、氧化应激因子和Caspase3的影响目的:血管内介入栓塞术和开颅夹闭术对MMP-2、MMP-9、炎症因子、氧化应激因子和Caspase-3表达的影响,以探究其治疗效果的机制。方法:1.人群研究:研究对象纳入和手术方式同第一部分,手术后1d、3d、5d和7d取患者静脉血5ml于抗凝管中,1000rpm离心10min,取上清液。酶联免疫法检测血清中MMP-2和MMP-9表达水平。2.家兔实验:新西兰兔32只购自北京维通利华实验动物技术有限公司。分为4组,分别是对照组、模型组、血管介入组和开颅夹闭组,每组8只。对模型组、血管介入组和开颅夹闭组诱导模型,诱导方法同第二部分。对血管介入组和开颅夹闭组分别采用血管介入栓塞术和开颅夹闭术治疗家兔,手术方式同第一部分,血管介入栓塞术只采用单弹簧圈治疗。术后7天,沿颈部切口给予兔全身麻醉,暴露右侧颈总动脉,取动脉瘤组织或周围动脉血管壁组织,做相应处理检测组织中各指标水平。RT-PCR检测组织中MMP-2、MMP-9、IL-6和TNF-αm RNA相对表达水平。采用羟胺法检测组织中的SOD活力。采用比色法检测组织中总一氧化氮合成酶活性,分光光度法检测组织中Caspase-3活性。结果:1.人群结果:（1）介入组和夹闭组血清中中MMP-2和MMP-9蛋白表达水平在手术后逐渐下降。在手术后5天和7天,夹闭组患者血清中MMP-2蛋白表达水平显着高于介入组。在手术后3天、5天和7天,夹闭组患者血清中MMP-9蛋白表达水平显着高于介入组。（2）手术时间越长,术中出血量越多,手术后患者血清中MMP-2和MMP-9表达水平越高。（3）多因素Logistic回归分析结果表明,血管介入栓塞术是术后低水平MMP-2和MMP-9的独立影响因素。（4）单纯弹簧圈组、支架辅助组和球囊辅助组的血清MMP-2和MMP-9表示水平差异无统计学意义。2.家兔实验:（1）模型组、介入组和夹闭组的MMP-2和MMP-9 m RNA的相对表达水平显着高于对照组,介入组和夹闭组显着低于模型组,介入组显着低于夹闭组。（2）模型组、介入组和夹闭组的IL-6和TNF-αm RNA的相对表达水平显着高于对照组,介入组和模型组显着低于夹闭组,介入组和模型组差异无显着性意义。（3）模型组、介入组和夹闭组的SOD活性显着低于对照组,介入组显着高于夹闭组和模型组,夹闭组和模型组差异无显着性意义。模型组、介入组和夹闭组的i NOS活性显着高于对照组,介入组和夹闭组显着低于模型组,介入组显着低于夹闭组。（4）模型组、介入组和夹闭组的Caspase-3活性显着高于对照组,介入组显着低于夹闭组和模型组,夹闭组和模型组差异无显着性意义。结论:相对于开颅夹闭术,血管介入栓塞术能显着降低患者血清中的MMP-2和MMP-9,降低促炎症因子、氧化应激水平和促凋亡因子水平

马丽娟^[2]（2020）在《转录因子TWIST1在子痫前期发病中的作用及其机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景妊娠期高血压疾病是全世界范围内严重威胁母婴健康的妊娠期并发症,发病率为5%-12%。子痫前期（Preeclampsia,PE）在妊娠20周后发病,临床症状严重的子痫前期为重度子痫前期,妊娠34周之前发病的重度子痫前期称为早发性重度子痫前期（Early Onset Severe Preeclampsia,EOSP）。患者发病越早、病情越重,母儿预后越差。子痫前期的基本病理生理改变表现为患者全身小血管痉挛、血管内皮损伤和器官血液灌流量减少,多脏器出现缺血缺氧性损害,同时胎盘灌注不足可导致胎儿损伤。目前认为,胎盘浅着床是子痫前期发病的基础,导致胎盘长期缺血、氧化应激,释放异常胎盘因子进入母体血液循环,诱发子痫前期。有研究证实,EOSP是与胎盘发育缺陷关系最为密切的子痫前期类型。胎盘滋养细胞是胎盘向子宫内膜和肌层浸润的执行者,因此探索调控滋养细胞活性和功能的因素及其干预手段,是阐明子痫前期发病机制及指导其防治的关键点。TWIST1在多种人体组织和肿瘤中有调节细胞分化、抑制凋亡和增强侵袭等作用。TWIST1在胎盘滋养细胞中广泛表达,并且其表达量呈现孕周依赖性增加。文献报道TWIST1有促进滋养细胞分化和侵袭的能力,因此我们推测其可能在妊娠期胎盘相关性疾病--子痫前期的发病中有重要的作用,但两者之间的相关性需要进一步证实。此外,TWIST1是否对介导滋养细胞的凋亡发挥作用也尚未明确。低分子肝素（Low Molecular Weight Heparin,LMWH）和阿司匹林（Aspirin）是目前临床上公认有效的降低子痫前期发病风险的药物,有研究表明LMWHH和Aspirin可以直接调节滋养细胞的活性和功能,但作用机制未明。第一部分EOSP患者与体外缺氧模型中滋养细胞凋亡率及TWIST1表达背景及目的:在妊娠早期,胎盘滋养细胞处于生理性缺氧状态,随后滋养细胞逐渐浸润至子宫内膜直至肌层的内1/3,并进入子宫螺旋小动脉管腔取代血管内皮,导致管腔增大、弹性增加。胎盘的绒毛面积逐渐扩大,子宫-胎盘的血流供应阻力降低、血容量增加,胎盘滋养细胞的缺氧状态得到纠正。胎盘滋养细胞凋亡率增加和侵袭能力下降会引起胎盘浸润不足和子宫血管重铸障碍,导致胎盘供血不足和滋养细胞氧化应激,最终导致子痫前期的发生。TWIST1促进滋养细胞分化和侵袭的作用已被证实,但其在子痫前期患者滋养细胞中的表达情况未见报道。在第一部分中,首先对EOSP患者和匹配孕周非高血压孕妇分娩的新生儿重量、评分以及胎盘重量进行比较,并检测两组间胎盘TWISTI的表达和滋养细胞凋亡率的差异,然后在体外模拟妊娠早期和子痫前期患者胎盘滋养细胞的缺氧状态,检测TWIST1表达和细胞凋亡率的变化。方法:1.采用回顾性研究,对2016.12-2018.10年间分娩的27例EOSP患者与31例孕周相匹配的非高血压孕妇分娩的新生儿体重、Apgar评分和胎盘重量的差异进行统计分析。2.利用Western blot、PCR和免疫组化检测EOSP患者和孕周相匹配的非高血压孕妇胎盘中TWIST1的表达;利用Tunel染色和Western blot检测两组间胎盘滋养细胞的凋亡情况。3.在体外缺氧模型中,利用Western blot检测滋养细胞TWIST1的表达;利用Hoechst 33258染色和Annexin V检测细胞增殖和凋亡的情况。结果:1.与同孕期分娩的非高血压孕妇相比,EOSP患者分娩的新生儿体重、Apgar评分及胎盘重量明显降低。2.与同孕期分娩的非高血压孕妇相比,EOSP患者胎盘中TWIST1表达降低,滋养细胞凋亡率增加;3.缺氧可导致体外培养的滋养细胞TWIST1表达降低、细胞凋亡率升高,而且呈现时间依赖性。结论:EOSP患者的新生儿不良结局发生率高;胎盘滋养细胞TWIST1表达降低与细胞凋亡率升高及EOSP发病具有正相关性。第二部分TWIST1在缺氧滋养细胞中的作用背景及目的:在女性生殖功能中,TWIST1有调节子宫基质细胞蜕膜化、胚胎发育和器官分化的作用。胎盘的发育和肿瘤的生长在诸多方面有极其相似的特点,因此可以推测TWIST1对肿瘤细胞凋亡的调控机制也作用于滋养细胞中。在本章中,着眼于缺氧引起的滋养细胞活性和功能的改变,通过调节TWIST1的表达,检测缺氧滋养细胞增殖、凋亡、侵袭、血管生成能力等方面的变化,从而深入探讨TWIST1在胎盘发育和子痫前期发病机制中的作用。方法:1.通过转染过表达TWIST1的质粒获得过表达TWIST1的细胞株,借助慢病毒载体获得干扰TWIST1表达的稳定细胞株,并对上述细胞株进行缺氧培养。2.利用 Edu 染色、Hochst33342 染色、Annexin V 和 Western blot 检测缺氧模型中TWIST1过//低表达对滋养细胞增殖、凋亡、凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9）和侵袭相关蛋白（MMP-2、MMP-9）表达的作用。3.利用平板克隆、Transwell、血管形成实验检测缺氧模型中TWIST1过/低表达对滋养细胞克隆形成能力、细胞迁移和侵袭以及血管生成能力的作用。4.利用流式细胞术检测缺氧模型中TWIST1过/低表达对滋养细胞ROS和线粒体膜电位的作用。结果:1.过表达TWIST1抑制缺氧引起滋养细胞的凋亡,促进细胞增殖,凋亡相关蛋白也发生相应变化;而低表达TWIST1则促进细胞的凋亡、抑制细胞的增殖。2.过表达TWIST1可以逆转缺氧导致的滋养细胞克隆形成、血管生成能力、细胞迁移和侵袭能力的降低,伴随着侵袭相关蛋白表达的升高;而低表达TWIST1则进一步加剧缺氧导致的滋养细胞侵袭能力的降低。3.过表达TWIST1降低缺氧滋养细胞的活性氧簇（Reactive Oxygen Species,ROS）水平,提高细胞线粒体膜电位;而低表达TWIST1进一步加剧缺氧导致的滋养细胞ROS增加和线粒体膜电位下降。结论:TWIST1参与缺氧状态下滋养细胞的增殖、凋亡、血管形成、细胞迁移能力的调节,抑制细胞凋亡,促进细胞侵袭。第三部分 凋亡激活剂/抑制剂对TWIST1调节缺氧滋养细胞凋亡的影响背景及目的:细胞凋亡是基因控制的细胞自主有序的死亡,目前已确定的是线粒体途径、死亡受体途径和内质网途径三条通路,其中线粒体途径是哺乳动物中最重要的凋亡通路。线粒体途径激活后,线粒体膜电位和凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax比降低,进而启动Caspase家族级联反应,导致凋亡。Caspase-9是线粒体凋亡途径中承上启下的关键因子,而Caspase-3是三条凋亡通路的共同底物,是细胞凋亡的执行者。我们之前的研究证实,TWIST1可以调节缺氧滋养细胞的凋亡,同时伴随着线粒体途径中凋亡相关蛋白和线粒体膜电位的变化,提示TWIST1可能影响滋养细胞的线粒体凋亡途径。在本章中,通过在缺氧滋养细胞模型中分别加入Caspase-3的激活剂以及Caspase-9的激活剂/抑制剂,进一步探讨TWIST1调节滋养细胞凋亡的作用机制。方法:1.在缺氧滋养细胞模型中过表达TWIST1,并加入Caspase-3的激活剂（PAC-1）、Caspase-9 的激活剂（YC137）或抑制剂（Z-LEHD-FMK）,利用 Hoechst染色和Annexin V检测细胞凋亡的情况。2.利用Western blot检测加入Caspase-3的激活剂、Caspase-9的激活剂或抑制剂后的缺氧滋养细胞中线粒体凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9）和侵袭相关蛋白（MMP-2、MMP-9）的表达。结果:1.过表达TWIST1抑制了缺氧导致的滋养细胞凋亡,加入Caspase-3和Caspase-9激活剂均可逆转TWIST1对细胞凋亡的保护性作用,而加入Caspase-9抑制剂则增强了 TWIST1抑制凋亡的作用。2.过表达TWIST1抑制了缺氧对滋养细胞凋亡相关蛋白和侵袭相关蛋白表达的影响,加入Caspase-3和Caspase-9激活剂后逆转了其作用效果,而加入Caspase-9抑制剂后增强了其作用效果。结论:TWIST1通过介导线粒体凋亡途径发挥调节缺氧滋养细胞凋亡的作用。第四部分TWIST1调节Aspirin和LMWH影响滋养细胞活性和功能的机制背景及目的:Aspirin和LMWH降低子痫前期发病风险的作用已得到公认。研究证实,除通过发挥抗凝作用改善胎盘循环外,Aspirin和LMWH也可直接作用于胎盘滋养细胞,调节其活性和功能,但其作用机制尚未完全明确。在本章中,在缺氧培养的滋养细胞中加入Aspirin和LMWH,探讨药物对滋养细胞凋亡和侵袭功能的影响;此外,通过干扰TWIST1的表达进一步探讨Aspirin和LMWH对滋养细胞发挥作用的机制。方法:1.用不同剂量Aspirin和LMWH处理缺氧滋养细胞,利用Annexin V检测细胞凋亡率的变化,选择对细胞凋亡影响最明显且浓度最低的药物剂量。2.利用Edu染色、transwell检测Aspirin和LMWH对缺氧滋养细胞增殖和侵袭能力的影响;利用Real-time PCR、Western blot和免疫荧光检测Aspirin和LMWH对缺氧滋养细胞TWIST1表达、凋亡相关蛋白表达和侵袭相关蛋白表达的影响;利用流式细胞术检测Aspirin和LMWH对缺氧滋养细胞ROS和线粒体膜电位的影响。3.在缺氧滋养细胞模型中低表达TWIST1,利用Edu染色、Annexin V、Transwell和Western blot检测Aspirin和LMWH对滋养细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响;利用流式细胞术检测干扰TWIST1表达后Aspirin和LMWH对缺氧滋养细胞ROS和线粒体膜电位的影响。结果:1.Aspirin和LMWH降低缺氧滋养细胞的凋亡率,增加其增殖和侵袭能力;Aspirin和LMWH逆转缺氧导致的TWIST1表达、凋亡和侵袭相关蛋白变化;Aspirin和LMWH逆转缺氧引起的滋养细胞ROS升高和线粒体膜电位下降。2.低表达TWIST1逆转Aspirin和LMWH对缺氧滋养细胞增殖、迁移和凋亡的保护性作用,削弱Aspirin和LMWH对缺氧滋养细胞ROS和线粒体膜电位的影响。结论:Aspirin和LMWH可以通过促进TWIST1的表达抑制缺氧滋养细胞的凋亡,促进细胞侵袭,在胎盘发育和子宫血管重铸过程中发挥保护性作用。这一机制的明确为Aspirin和LMWH用于子痫前期的早期预防提供了理论依据。小结在本论文中,首先通过比较EOSP患者与非高血压孕妇分娩的新生儿结局和胎盘重量的差异,以及两组孕妇胎盘TWIST1表达及细胞凋亡率的差异,发现EOSP患者胎儿预后不良,胎盘滋养细胞TWIST1表达降低和细胞凋亡率增加。然后,模拟妊娠早期及子痫前期患者滋养细胞的缺氧状态,建立细胞模型,研究TWIST1对滋养细胞凋亡和侵袭浸润功能的影响,并深入探讨其调节滋养细胞凋亡的机制,发现TWIST1可以通过介导线粒体凋亡途径降低缺氧导致的细胞凋亡,并促进细胞侵袭。最后,在缺氧培养的滋养细胞中加入Aspirin和LMWH,检测细胞活性和功能的变化,并通过干扰TWIST1的表达探讨药物的作用机制,发现Aspirin和LMWH可以通过促进TWIST1的表达降低滋养细胞的凋亡,增强其侵袭能力。

章萌^[3]（2020）在《促红细胞生成素导致腹主动脉瘤形成的作用及分子机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景腹主动脉瘤（abdominal aortic aneurysm,AAA）是一种潜在的致命性血管疾病,其定义为腹主动脉局部扩张,直径大于3cm或超过正常主动脉直径50%。AAA主要累及肾动脉分支以下的腹主动脉,患者通常没有症状,即使医生查体也难以触及扩张的腹主动脉,患者常由于其他临床指征行腹部超声或CT检查时偶然发现AAA,因此早期发现极为困难。一旦发生AAA破裂,死亡率高达85%-90%,几乎是不治之症。如何发现AAA的发病原因和快速膨胀因素并进行有效的抑制,是临床医学界面临的重大难题。尽管在AAA发病机制的研究领域已取得了巨大进展,但目前尚无有效的临床预测因子或药物治疗来降低AAA的发病风险或限制其进展。当男性和女性患者的AAA内径分别大于55mm和50mm时,可实施外科矫正术或血管内介入手术,术后存活率超过95%。因此,对于预防AAA破裂,手术矫正和支架介入是唯一有效的方法,但这些操作均有创伤性和并发症。大力研发可抑制AAA发生和发展的新药,已成为AAA研究领域中的当务之急。促红细胞生成素（EPO）由165个氨基酸和4条分子量为34kd的紧密球状结构的碳水化合物侧链组成。EPO对正常红细胞的产生至关重要,主要由胎儿肝脏及成年人肾脏合成。EPO主要通过刺激造血系统中的促红细胞生成素受体（EPOR）起到促进红细胞生成的作用。EPO可在缺氧时由肾小管间质细胞产生,通过促进红细胞生成和抑制红细胞祖细胞的凋亡而增加红细胞数量。此外,EPO潜在的造血外功能也备受关注。研究表明,EPO可由肾脏以外组织产生,且EPORs在红系祖细胞以外的其他组织中亦有广泛分布。肾脏以外产生的EPO是通过旁分泌/自分泌的途径而发挥作用,而非造血功能中的激素样作用。在创伤和炎症反应中,EPO及其受体表达明显增加,从而触发创伤组织和器官中的关键保护反应。EPO的组织保护作用已在多个动物的疾病模型中得到证实,包括局灶性脑缺血、栓塞性卒中、创伤性脑损伤、心肌缺血、急性肾损伤、肢体缺血、组织创伤等。临床研究表明,在严重创伤患者中给予EPO治疗可降低患者的死亡率。最近的研究发现,EPO可通过促进内皮细胞增殖迁移和基质金属蛋白酶2（MMP2）表达促进血管新生。接受腹主动脉腔内修复的AAA患者有三分之一患有贫血,其血红蛋白水平与AAA的大小呈独立负相关,但其机制并不明确。最近一项高脂血症小鼠中输注血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）的实验研究发现,抑制缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）减弱了 AAA的进展。众所周知,慢性贫血和HIF可增加EPO的生成,而最近的证据表明,Ang Ⅱ可直接刺激造血祖细胞的受体或间接调节EPO的基因表达来影响造血功能。有罕见病例报道,一位长期进行血液透析并应用重组人EPO治疗的患者,无明显原因地对重组人EPO产生了耐药性,并CT检测发现了 AAA。这些临床和实验研究强烈提示EPO和AAA之间可能存在着某种联系,主动脉壁新生血管的形成,也被称为血管新生,是实验和临床AAAs的病理标志。有证据表明,主动脉瘤管壁内的血管新生可能在动脉瘤的进展和破裂中起关键作用。在人动脉瘤组织中,尤其是在邻近破裂区域和被白细胞浸润的区域,血管新生更为普遍。抑制实验性AAA进展的药物,也会减少动脉壁血管新生。基质金属蛋白酶（MMPs）家族密切参与新血管形成的过程,并发挥关键的促血管生成作用,而MMPs与动脉管壁的降解和破裂有关。缺氧和炎症是刺激血管新生的两个关键因素。HIF-1α及其靶基因在人类和实验性AAAs中表达增加。抑制HIF-1a治疗可以阻止实验性AAA进展,并减轻管壁白细胞浸润、血管新生和MMPs的过度表达。炎症和免疫相关疾病与血管新生相关,因为大多数白细胞能够产生一系列促血管生成因子,如血管内皮生长因子（VEGF）、血小板衍生生长因子（b-FGF）、碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）以及蛋白酶,如糜蛋白酶、胰蛋白酶、MMPs。有报道称肥大细胞特异性的糜蛋白酶和胰蛋白酶诱导内皮细胞（ECs）表达粘附分子和趋化因子,其利用趋化因子受体2（CCR2）作为募集趋化因子的受体,降解基质蛋白,促进血管新生,诱导平滑肌细胞凋亡。AAA发生和发展过程涉及了多种病理过程,比如血管新生、炎症浸润、氧化应激和平滑肌细胞凋亡等,在本研究中,我们提出如下科学假说,在ApoE-/-小鼠或野生型小鼠中,EPO可以剂量依赖性地导致AAA的发生,并且EPO通过促进血管新生,增加炎症浸润,诱导平滑肌凋亡,导致AAA的发生,为了验证这一假说,我们精心设计并进行了一系列的体内外实验。研究目的1.探讨EPO是否可在ApoE-/-小鼠和野生型小鼠中导致AAA的产生及其剂量效应;2.探讨EPO对小鼠AAA的影响是否受高脂喂养和高脂血症的影响;3.探讨EPO通过何种类型受体发挥作用对AAA产生影响;4.探讨EPO引起小鼠AAA的病理生理机制;5.探讨EPO对血管壁三种细胞（内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞）的作用及其机制。6.探讨在AAA临床患者中,血清EPO与AAA的发生有无关联。研究方法1.动物模型的建立和分组（1）雄性ApoE-/-小鼠60只,全程给予高脂饲料喂养,随机分为4组,每组15只;分别给予生理盐水、EPO 2,500 IU/kg/day、EPO 5,000 IU/kg/day 和 EPO 10,000 IU/kg/day腹腔注射,期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,4周后小鼠给予安乐死。（2）雄性ApoE-/-小鼠60只,全程给予普通饲料喂养,随机分为4组,每组15只;分别给予生理盐水、EPO 2,500 IU/kg/day、EPO 5,000 IU/kg/day 和 EPO 10,000 IU/kg/day腹腔注射,期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,4周后小鼠给予安乐死。（3）雄性野生型小鼠60只,全程给予普通饲料喂养,随机分为4组,每组15只;分别给予生理盐水、EPO2,500 IU/kg/day、EPO 5,000 IU/kg/day 和 EPO 10,000 IU/kg/day腹腔注射,期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,4周后小鼠给予安乐死。（4）雌性APoE-/-小鼠30只,全程给予高脂饲料喂养,随机分为2组,每组15只;雌性野生型小鼠30只,全程给予普通饲料喂养,随机分为2组,每组15只;分别给予生理盐水和EPO5,000IU/kg/day腹腔注射,期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,4周后小鼠给予安乐死。（5）雄性ApoE-/-小鼠45只,全程给予高脂饲料喂养,随机分为3组,每组15只;雄性野生型小鼠45只,全程给予普通饲料喂养,随机分为3组,每组15只;分别给予生理盐水、焦谷氨酸螺旋B表面肽（pHBSP）30 mg/kg/day和pHBSP 300mg/kg/day持续泵入,期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,4周后小鼠给予安乐死。（6）雄性ApoE-/-小鼠或野生型小鼠各30只,随机分为两组,每组15只;对照组给予生理盐水持续泵入,实验组给予Ang Ⅱ（1.44mg/kg/day）持续泵入,全程给予高脂高胆固醇喂养或普通饲料喂养,期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,4周后小鼠给予安乐死。2.鼠尾血压测量应用小动物鼠尾血压计测量所有小鼠的血压,测量部位为小鼠尾动脉,每只小鼠检测3次,取其平均值作为最终数值。3.组织取材小鼠取材前饥饿6-8小时,麻醉小鼠后取材,留取全血、血清、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、脂肪组织和主动脉;各组织一部分放入液氮速冻,-80℃冰箱保存,一部分置于4%多聚甲醛中固定,以备后续实验。4.血脂血常规、肝肾功检测检测各组小鼠血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐和尿素氮的水平;检测各组小鼠全血红细胞计数、血红蛋白含量和红细胞压积。5.血管组织全基因组测序分析接受EPO中剂量注射的ApoE-/-小鼠3只,正常对照组3只,取出其主动脉组织,加入RNAlater液氮速冻,送至北京诺禾致源生物科技有限公司进行RNA测序。6.病理学检测腹主动脉组织或肝肾组织制备石蜡切片,主要进行H&E染色、Verhoff弹力纤维染色和 Masson 染色。对 Endomucin、MMP2、MMP9、MT1-MMP、CD68、ICAM-1、VCAM-1、IL-6、IL-1β、MCP-1和TNF-α等指标进行免疫组织化学染色,对 CD68、IL-6、IL-1β、MCP-1、TNF-α、CD144 和 Ki67 等指标进行组织免疫双荧光染色。7.蛋白免疫印迹实验提取腹主动脉段血管组织蛋白和各种细胞总蛋白,进行BCA蛋白浓度测定。配制SDS-PAGE凝胶,通过蛋白免疫印迹检测胶原Ⅰ、胶原Ⅲ、MMP2、MMP9、MT1-MMP、VEGF、TGF-β1、KDR、Tie2、CD68、ICAM-1、VCAM-1、IL-6、IL-1β、MCP-1和TNF-α的蛋白含量。8.明胶酶谱实验配制含1%明胶的SDS-PAGE凝胶,提取腹主动脉段血管组织蛋白和各种细胞总蛋白,并进行BCA蛋白浓度测定。使用明胶酶谱试剂盒检测MMP2和MMP9的蛋白酶活性。9.RNA 提取、mRNA 逆转录、RT-PCR提取腹主动脉段血管组织RNA和各种细胞总RNA,应用TaKaRa#RR047A逆转录试剂盒进行mRNA逆转录。通过实时荧光定量PCR,得出循环阈值Ct值,通过公式2-ΔΔCT计算出cDNA的相对表达水平。10.细胞培养和信号通路（1）根据EPO浓度梯度预实验,5 IU/mL EPO刺激HUVEC 24小时,所表达的MMP2和MMP9酶活性最高,因此接下来的细胞实验选用EPO 5 IU/mL刺激24小时,作为实验组条件;（2）HUVEC、HAEC、HASMC和巨噬细胞:实验组加入5IU/mLEPO,对照组加入等体积1x PBS,刺激24小时,收集细胞和上清;（3）HUVEC实验组加入5 IU/mL EPO,对照组加入等体积1x PBS,刺激24小时,收集上清;加入预先种好板的HASMC中,刺激24小时,收集细胞和上清;（4）HUVEC实验组加入5 IU/mL EPO,对照组加入等体积1x PBS,刺激24小时,收集上清;加入预先种好板的巨噬细胞中,分别刺激0、2、4、6、8和10小时,收集细胞和上清;（5）HUVEC实验组加入10mg/L pHBSP,对照组加入等体积1xPBS,刺激24小时,收集细胞和上清;（6）实验分为4组:对照组加入DMSO（作为溶剂对照）,EPO组加入EPO（5 IU/mL）+DMSO,JAK2 抑制剂组加入 EPO（5 IU/mL）+TG101348（1 μM）[49,50],STAT5 抑制剂组加入 EPO（5IU/mL）+CAS285986-31-4（50μg/mL）,刺激24小时,收集细胞或者观察拍照。11.EDU细胞增殖实验使用EDU试剂盒检测HUVEC或HASMC的增殖能力。12.内皮细胞迁移实验通过划痕实验和Transwell小室细胞迁移实验,检测HUVEC和HAEC在EPO作用下的迁移能力。13.体外小管生成实验利用低生长因子Matrigel基质胶观察HUVEC和HAEC在EPO作用下体外小管生成能力。14.主动脉环出芽实验取野生型小鼠胸主动脉段,将血管剪成长约1mm的小段,置于Matrigel基质胶中,加入相应的药物刺激,每天观察拍照,软件分析计算主动脉出芽数量和长度。15.单核-内皮细胞粘附实验将HUVEC给予EPO刺激24小时;用BCECF-AM（pH荧光探针）标记THP-1细胞悬液;取1x105/mL THP-1混悬液加入到上述HUVEC细胞培养板中,孵育至少1小时;4%多聚甲醛固定细胞。16.TUNEL细胞凋亡检测给予HASMC EPO或者EPO处理过的HUVEC上清干预,使用TUNEL试剂盒检测HASMC的凋亡情况。17.腹腔巨噬细胞的提取选取8-12周雄性野生型小鼠,提前3天给予腹腔注射6%淀粉溶液1mL;小鼠脱颈处死,撕开皮肤,充分暴露腹膜;用无菌注射器注入DMEM于腹腔中,回抽液体至新的50mL离心管中;冲洗腹腔3次,直至DMEM变澄清,得到腹腔巨噬细胞混悬液。18.体内基质胶塞血管新生实验使用高浓度Matrigel基质胶,配制基质胶与药物混合液,取0.7mL基质胶混合液,注入小鼠皮下。14天后,切除基质胶塞;4%多聚甲醛固定过夜,观察基质胶塞大体形态颜色;石蜡包埋,切片,进行常规染色和免疫组化。19.酶联免疫吸附实验使用ELISA方法检测血清中EPO的水平。20.腹主动脉瘤病人血清收集我们纳入40例AAA患者,在患者住院24小时内采集血样。患有贫血、心衰、慢性呼吸系统疾病和肾功能衰竭的病人排除入组。纳入45例健康志愿者的血清作为正常对照组。21.数据统计分析所有数据均以均数±标准误来表示,两组计量资料采用独立样本t检验,多组计量资料采用单因素方差分析LSD事后检验;计数资料采用卡方检验;生存分析采用Log-Rank检验;P<0.05认为有统计学差异。研究结果1.EPO剂量依赖性地诱导ApoE-/-小鼠和野生型小鼠AAA的发生腹腔注射高中低剂量EPO4周后,发现EPO剂量依赖的增加了小鼠AAA的发生率,腹主动脉直径明显增加;同时,小鼠死亡率也呈剂量依赖性增加。EPO高剂量组诱导ApoE-/-小鼠AAA发生率与Ang Ⅱ相当,而EPO高剂量组诱导野生型小鼠AAA发生率明显高于Ang Ⅱ。2.EPO导致ApoE-/-小鼠和野生型小鼠腹主动脉管壁增厚弹力板断裂结果显示注射低中高剂量EPO后,动脉管壁明显增厚,弹力纤维断裂,管腔内可伴有血栓形成。3.EPO不影响ApoE-/-、鼠和野生型小鼠血压和血脂的变化EPO注射4周后,与对照组相比,EPO低中高剂量组血压并无显着差异;同样,EPO注射后没有影响小鼠血脂水平变化。由此推断,EPO注射4周,对小鼠的血压和血脂无显着影响。4.EPO不影响ApoE-/-小鼠和野生型小鼠肝功和肾功的变化EPO注射四周后,与对照组相比,EPO低中高剂量组的指标没有明显变化;取对照组和EPO高剂量组小鼠的肝脏和肾脏进行H&E染色,组织形态亦没有明显差别。由此,从药物毒理学角度推测,EPO注射4周,并没有引起肝脏和肾脏的功能障碍。5.高脂饮食不影响EPO对ApoE-/-小鼠AAA形成的剂量效应在全程普通饲料喂养过程中,发现EPO剂量依赖的增加了 ApoE/-小鼠AAA的发生率,且与高脂喂养模型的发生率无显着差异;同时,高脂喂养与否,EPO高剂量组小鼠的死亡率无明显统计学意义。由此得出,高脂饮食不影响EPO对ApoE-/-小鼠AAA形成的剂量效应。6.EPO可诱导雌性ApoE-/-小鼠和野生型小鼠AAA的发生结果显示,在中剂量EPO刺激下雌性ApoE-/-小鼠和雌性野生型小鼠均有AAA发生,但都略低于雄性小鼠发生率,这符合人类AAA发病率中,男性高于女性的特征。7.pHBSP不能剂量依赖性的诱导小鼠AAA的发生结果显示pHBSP不能诱导两种基因型的小鼠发生AAA,因此推断EPO可能通过同源二聚体受体发挥作用,导致AAA。8.AAA患者血清EPO水平明显增高两组之间在年龄、性别、肾功能和药物治疗方面没有显着差异,但吸烟者在AAA组比正常对照组更常见。通过分析显示,年龄在>65岁和≤65岁之间、男性和女性之间、吸烟者和非吸烟者之间的腹主动脉直径没有显着差异,这表明在这组患者中,AAA直径不受传统动脉粥样硬化危险因素的影响。与健康对照组相比,AAA患者的血清EPO水平显着升高,这表明该组患者分泌了更多的EPO于循环血液中。9.基因测序分析EPO对ApoE-/-小鼠主动脉组织mRNA表达谱的影响基因本体论分析发现,两组间差异基因主要富集在血管形态发生、血管新生、细胞周期和迁移、炎症反应、白细胞浸润、和细胞外基质重塑中。10.血管新生和胶原代谢参与EPO诱导AAA的过程结果显示,与对照组相比,EPO组腹主动脉管壁胶原显着减少,尤其是胶原Ⅰ和胶原Ⅲ表达。MMPs蛋白表达和活性明显高于对照组。EPO组腹主动脉管壁微血管密度明显增加,VEGF、TGF-β1、KDR和Tie2蛋白表达明显增高。11.炎症反应参与EPO诱导AAA的过程结果显示,EPO组腹主动脉CD68阳性细胞浸润动脉壁的程度明显高于对照组。同时 ICAM-1、VCAM-1、IL-6、IL-1β、MCP-1 和 TNF-α 等炎症因子 mRNA水平和蛋白水平表达明显多于对照组。CD68阳性细胞来源的炎症因子明显增高。MSD检测发现,血清炎症因子水平也明显高于对照组小鼠。12.EPO对小鼠红细胞、白细胞和血小板数量的影响给予小鼠EPO注射4周后,结果显示与对照组相比,EPO组红细胞计数、血红蛋白和红细胞压积明显增高。而白细胞计数、单核细胞计数、淋巴细胞计数、粒细胞计数和血小板计数在两组之间无显着性差别。13.三种细胞中内皮细胞EPOR mRNA表达水平最高与平滑肌细胞和巨噬细胞相比,内皮细胞的EPOR表达最高,提示EPO可能主要以内皮细胞为靶点发挥作用。14.EPO促进内皮细胞的增殖和迁移通过EDU实验可以观察到EPO促进HUVEC增殖。通过划痕实验和Transwell小室细胞迁移实验观察到EPO促进HUVEC和HAEC迁移。15.EPO促进内皮细胞体外小管形成和小鼠主动脉环出芽结果显示EPO组内皮细胞更容易形成闭合的管状结构。小鼠胸主动脉环种植于Matrigel基质胶中,在EPO刺激下,主动脉环比对照组更容易出芽,出芽的数量和出芽长度明显增加。16.EPO促进内皮细胞血管新生相关蛋白的表达结果显示,给予EPO刺激后HUVEC或HAEC的MMPs蛋白表达水平和活性明显高于对照组。EPO组细胞的KDR和Tie2表达明显增高。17.pHBSP不能促进HUVEC迁移、体外小管形成和MMPs的表达结果显示,对照组和pHBSP组细胞迁移数量无明显差别,形成小管数量和小管总长度无显着差异。给予pHBSP刺激后HUVEC的MMPs蛋白表达水平和酶活性与对照组无明显差别。18.EPO促进内皮-单核细胞间的粘附作用结果显示,与对照组相比,EPO组粘附的单核细胞数明显增多,由此得出,EPO能够促进内皮-单核细胞间的粘附作用。19.EPO对巨噬细胞炎症因子表达的影响直接给予EPO刺激,巨噬细胞炎症因子的表达无意义;溶剂对照或EPO刺激HUVEC 24小时后,取细胞培养液来刺激巨噬细胞,结果显示,IL-6、IL-1β和TNF-α在6小时明显增高,MCP-1在8小时明显增高,由此得出,内皮细胞参与是EPO诱导巨噬细胞炎症因子上调的关键环节。20.EPO对巨噬细胞MMPs表达的影响溶剂对照或EPO刺激巨噬细胞24小时后,两组MMP2和MMP9的蛋白表达和酶活性无明显差别。溶剂对照或EPO刺激HUVEC 24小时后,取细胞培养液来刺激巨噬细胞,结果发现,两组MMP2和MMP9的蛋白表达和酶活性依然没有明显差别。由此推断,EPO并不能影响巨噬细胞MMPs的表达。21.EPO对平滑肌细胞胶原蛋白、MMPs和凋亡相关蛋白表达的影响给予浓度梯度的EPO刺激HASMC后,其胶原Ⅰ、胶原Ⅲ、MMP2和MMP9表达没有明显变化。EPO组HASMC表达BCL2和BAX与对照组也没有明显差异。溶剂对照或EPO刺激HUVEC 24小时后,取细胞培养液来刺激平滑肌细胞,结果显示,EPO组HASMC表达胶原Ⅰ和胶原Ⅲ明显减少,而MMP2和MMP9蛋白表达和酶活性明显增加。EPO组表达抗凋亡蛋白BCL2明显少于对照组,而表达促凋亡蛋白BAX明显多于对照组。22.EPO对平滑肌细胞增殖和凋亡的影响结果显示直接给予EPO刺激,诱导的HASMC增殖和凋亡的数量与对照组无明显差别。溶剂对照或EPO刺激HUVEC 24小时后,取细胞培养液来刺激HASMC,结果显示EPO组TUNEL 阳性细胞比例明显高于对照组,而EDU 阳性细胞比例明显低于对照组。23.EPO在体内水平促进血管新生和炎症浸润14天后从小鼠体内取出基质胶塞显示:混有溶剂对照的基质胶塞呈清晰的黄色,而含有EPO的基质胶塞呈红色,说明基质胶塞内形成了血管。EPO组侵袭的细胞和血管数量明显增多。EPO组CD144和Ki67阳性细胞数量明显高于对照组,说明EPO促进内皮细胞的增殖和迁移。并且EPO组切片CD68阳性细胞浸润程度和炎症因子表达明显高于对照组,这表明EPO促进炎症细胞入侵和炎症因子的表达。24.EPO通过JAK2/STAT5通路诱导血管新生结果显示,EPO明显增强了 JAK2和STAT5的磷酸化水平,而JAK2抑制剂明显抑制了 JAK2和STAT5的磷酸化水平,STAT5抑制剂只抑制了 STAT5的磷酸化水平,并没有影响JAK2的磷酸化水平。加入JAK2抑制剂和STAT5抑制剂后明显抑制了内皮细胞闭合管状结构的形成。通过以上结果可知,EPO通过JAK2/STAT5通路促进内皮细胞形成新生血管。25.EPO诱导AAA形成和发展的机制通过以上体内体外实验,我们基本得出EPO诱导AAA形成和发展的机制为:EPO刺激血管内皮细胞,激活JAK2/STAT5通路,促进血管新生、基质金属蛋白分泌、平滑肌细胞凋亡,抑制平滑肌细胞合成胶原蛋白,增强炎性细胞聚集和炎症因子释放,导致AAA的形成和发展。实验结论1.EPO剂量依赖性地促进了 ApoE-/-小鼠和野生型小鼠AAA的形成,EPO导致ApoE-/-小鼠AAA发生率与Ang Ⅱ相当,EPO导致野生型小鼠AAA发生率明显高于Ang Ⅱ;2.EPO是通过（EPOR）2同型二聚体发挥作用促进AAA的形成;3.EPO通过引起血管新生、炎症反应和胶原降解而导致AAA的形成;4.EPO通过内皮细胞的介导诱导巨噬细胞表达炎症因子,抑制HASMC胶原分泌,促进HASMC凋亡。研究背景在腹主动脉瘤（AAA）发生发展过程中,由于AAA常与主动脉壁严重动脉粥样硬化损伤相关,因此传统认为AAA是动脉粥样硬化的结果。但这一传统观点近年来受到越来越多的挑战。与不合并动脉粥样硬化性心血管疾病的人群相比,合并冠心病、周围血管疾病、颈动脉疾病、脑血管疾病的患者发生AAA的OR值分别为1.72、1.59、1.51和1.18。在6446例接受颈动脉、股动脉和腹主动脉超声检查的Troms0研究中,斑块负荷与AAA发生率之间无量效关系,提示动脉粥样硬化与AAA可能是伴随关系而非因果关系。糖尿病是动脉粥样硬化的重要危险因素,但却是AAA的保护性因素,在美国310万人AAA流行病学调查中,与非糖尿病患者相比,糖尿病患者发生AAA的OR值为0.75,提示糖尿病可使AAA风险减少25%。这一反常现象提示,动脉粥样硬化与AAA可能是两个互相独立的疾病。吸烟与AAA的发生有很强的临床联系。吸烟人群中AAA的患病率是终身不吸烟人群的四倍以上。一份比较慢性吸烟者罹患不同疾病的相对风险的报告显示,罹患AAA的风险比罹患冠状动脉疾病的风险高出三倍,比罹患脑血管疾病的风险高出近五倍。2011年在瑞典进行的26256例65岁以上老年男性超声检查结果表明,AAA的发病率已下降至2.2%,其主要原因可能是吸烟人群的减少,提示控制吸烟可能是一个预防AAA的有效策略。基于这些临床观察,慢性吸烟可能是AAA发生发展的最重要的环境危险因素。除了吸烟外,其他危险因素还包括男性、年龄、高血压、慢性阻塞性肺疾病、高脂血症和家族病史。动物模型是一种强有力的工具,可以提供AAA发生和发展机制的理解。目前,AngⅡ注射模型是最常用的AAA动物模型。在高脂喂养的ApoE-/-或LDLR-/-小鼠皮下埋置微量渗透泵,持续注射大剂量Ang Ⅱ,可导致AAA,因此目前有关AAA发生和发展的细胞和分子机制主要来自于这类模型的研究。已提出的AAA发病机制包括:氧化应激机制:AAA患者或小鼠模型中促氧化剂增多,而抗氧化剂减少,从而导致ROS水平的上升,氧化应激增加,刺激血管紧张素转换酶（ACE）表达,内源性Ang Ⅱ增多,炎症反应增强。肾素-血管紧张素激活机制:持续滴注AngⅡ首先导致腹主动脉的炎症反应,继之出现弹性蛋白降解、血管中层断裂和管腔扩张,这些作用通过AT1R所介导,使用ACEI、ARB和ACE2过表达等方法以减少Ang Ⅱ的产生和作用,均可减轻小鼠AAA病变。AMPKa2激活机制:尼古丁和Ang Ⅱ可通过激活细胞膜表面的G蛋白偶联受体增加胞内的活性氧水平,活性氧可激活AMPK,形成AMPKa2/AP-2o/MMP2级联反应,从而活化MMP2的基因转录,最终导致血管壁细胞外基质的降解加速,引发AAA。胶原代谢机制:炎性因子不仅通过刺激MMPs表达而增加细胞外间质的降解,而且使得胶原合成障碍,加速AAA的形成。由于AAA是一个病因不明、病程迁延、病变发展、治疗有限、预后险恶的多因素疾病,且所得出的干预靶点在临床试验中尚无成功的先例,因此,对于AAA发生和发展机制的研究,我们仍处于早期阶段。Ang Ⅱ可以促进特定造血细胞系的増殖,而且Ang Ⅱ也参与了EPO在体内的调控。对健康志愿者的临床研究表明,Ang Ⅱ通过激活AT1R使血清EPO浓度升高约35%或更高。此外,在另一项对健康志愿者的研究中,ACEI类药物卡托普利和依那普利显着降低了血浆EPO水平,降幅高达20-30%。这些发现表明Ang Ⅱ在体内通过受体依赖信号调节EPO的产生,但EPO是否介导了Ang Ⅱ在体内的生物学作用,且引起AAA产生尚无报道。结合本研究论文I和论文Ⅱ的结论,EPO能够导致AAA的产生,因此我们假设在ApoE-/-小鼠中,EPO介导了Ang Ⅱ诱导的AAA的发生和发展,因此我们设计了一系列体内体外实验以验证此假说。研究目的1.探讨EPO/EPOR信号通路在Ang Ⅱ诱导AAA过程中起到的作用;2.探讨Ang Ⅱ诱导野生型小鼠AAA发生率较低的原因;3.探讨Ang Ⅱ作用于EPO的分子机制。研究方法1.动物模型的建立和分组（1）雄性ApoE-/-小鼠60只,随机分为4组:其中对照组给予生理盐水持续泵入+生理盐水尾静脉注射,Ang Ⅱ组给予Ang Ⅱ持续泵入+生理盐水尾静脉注射,Ang Ⅱ+IgG2a组给予Ang Ⅱ持续泵入+EPO尾静脉注射,Ang Ⅱ+EPO中和抗体组给予Ang Ⅱ持续泵入+EPO中和抗体尾静脉注射,4周后小鼠给予安乐死。（2）实验组为EPOR+/-ApoE-/-双敲小鼠,对照组为同窝ApoE-/-小鼠,同时给予Ang Ⅱ持续栗入,4周后小鼠给予安乐死。（3）雄性野生型小鼠30只,随机分为两组,每组15只;对照组给予生理盐水持续栗入,实验组给予Ang Ⅱ持续泵入,全程给予普通饲料喂养,4周后小鼠给予安乐死。2.细胞培养和分组（1）实验分为四组:对照组（溶剂对照）,Ang Ⅱ（50μM）组,Ang Ⅱ+替米沙坦（lμM）组,AngII+PD123319（50μM）组,刺激12小时,收集细胞;（2）实验分为四组:对照组（溶剂对照）,Ang Ⅱ（50μM）组,Ang 11+替米沙坦（lμM）组,AngII+U0126（50μM）组,刺激12小时,收集细胞。3.鼠尾血压测量在给予药物干预4周末,应用小动物鼠尾血压计测量所有小鼠的血压,测量部位为小鼠尾动脉,每只小鼠检测3次,取其平均值作为最终数值。4.组织取材步骤小鼠取材前饥饿6-8小时,麻醉小鼠后取材,留取全血、血清、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、脂肪组织和主动脉;各组织一部分放入液氮速冻,-80℃冰箱保存,一部分置于4%多聚甲醛中固定,以备后续实验。5.血常规检测使用兽用全自动血液细胞分析仪检测各组小鼠全血红细胞计数,血红蛋白含量和红细胞压积。6.免疫组织化学染色腹主动脉组织制备石蜡切片,对IL-6、IL-lβ、MCP-1和TNF-α进行免疫组织化学染色。7.蛋白免疫印迹实验提取腹主动脉段血管姐织蛋白和各种细胞总蛋白,进行BCA蛋白浓度测定。配制SDS-PAGE凝胶,通过蛋白免疫印迹检测EPO、EPOR、ERK1/2的蛋白含量。8.RNA提取、mRNA逆转录、RT-PCR提取腹主动脉段血管组织RNA和各种细胞总RNA,应用TaKaRa#RR047A逆转录试剂盒进行mRNA逆转录。通过实时荧光定量PCR,得出循环阈值Ct值,通过公式2-△△CT计算出cDNA的相对表达水平。9.酶联免疫吸附实验使用ELISA方法检测血清中EPO的水平。10.数据统计分析所有数据均以均数±标准误来表示,两组计量资料采用独立样本t检验,多组计量资料采用单因素方差分析LSD事后检验;不符合正态分布的数据采用秩和检验;计数资料采用卡方检验;生存分析采用Log-Rank检验;户<0.05认为有统计学差异。研究结果1.EPO在Ang Ⅱ诱导ApoE-/-小鼠发生AAA的过程中起到重要作用结果显示,Ang Ⅱ组和Ang Ⅱ+IgG2a组AAA发生率明显增高;Ang Ⅱ组和Ang Ⅱ+IgG2a组之间无显着性差异,而Ang Ⅱ+EP0中和抗体组AAA发生率降为20%。Ang Ⅱ+EP0中和抗体组腹主动脉直径明显降低,死亡率明显下降。2.EPOR在Ang Ⅱ诱导ApoE-/-小鼠发生AAA的过程中起到重要作用由于EPOR-/-纯合小鼠致死,故我们只能获得EPOR+/-杂合小鼠。给予Ang Ⅱ埋泵4周后,结果显示与ApoE+小鼠组相比,EPOR+/-ApoE-/-双敲小鼠组AAA发生率明显降低,且腹主动脉直径明显降低,死亡率降低至0。3.EPOR敲除抑制Ang Ⅱ诱导ApoE-/-小鼠AAA中炎症因子的表达EPOR+/-ApoE-/-双敲小鼠组腹主动脉管壁IL-6、IL-lp、MCP-1、TNF-a的表达明显少于ApoE-/-小鼠组。4.各组小鼠血清EPO水平比较ApoE-/-小鼠和野生型小鼠给予Ang Ⅱ千预后,Ang Ⅱ组的血清EPO水平比对照组高出2倍以上。同样给予Ang Ⅱ干预的ApoE-/-小鼠的血清EPO水平显着高于野生型小鼠的血清EPO水平。在野生型小鼠中,EPO注射组导致的血清EPO水平远高于Ang Ⅱ干预组。在Ang Ⅱ和EPO诱导的ApoE-/-小鼠和野生型小鼠AAA发病机制中EPO起了至关重要的作用。5.EPO介导了Ang Ⅱ诱导ApoE-/-小鼠的脾肿大和造血增加解剖小鼠后发现,与对照组相比,Angll组小鼠有明显的脾肿大现象,且脾脏重量明显高于对照组。EPO中和抗体治疗后,脾脏的大小和重量明显减少,且可显着抑制Ang Ⅱ诱导的RBC、HGB和HCT的增加。而EPOR+/-ApoE-/-小鼠与ApoE-/-小鼠相比,经Ang Ⅱ干预后造血表型无明显改变。6.Ang Ⅱ上调EPO表达的机制与对照组相比,Ang Ⅱ组表达EPO水平明显增高,Ang 11+替米沙坦组表达EPO水平显着低于Ang Ⅱ组,Ang Ⅱ+PD123319组表达EPO水平与Ang Ⅱ组无明显差异。Ang Ⅱ+U0126组表达EPO含量明显低于Ang Ⅱ组。Ang Ⅱ对786-0和HASMC有同样的作用。实验结论1.EPO/EPOR信号通路在Ang Ⅱ诱导AAA过程中起到关键性作用;2.血清EPO水平在Ang Ⅱ和EPO诱导的ApoE-/-和野生型小鼠AAA发病机制中起到关键作用;3.Ang Ⅱ通过AT1R/ERK1/2通路上调肾脏细胞和平滑肌细胞EPO表达,分别增加循环EPO水平和局部组织EPO水平。

陈思宇^[4]（2019）在《醋酸棉酚对人舌鳞癌Cal-27细胞迁移性及侵袭性作用的研究》文中进行了进一步梳理[目的]分析体外应用醋酸棉酚（GAA）对人舌鳞癌Cal-27细胞迁移侵袭影响,探讨醋酸棉酚对人舌鳞癌Cal-27细胞侵袭性作用影响的机制,为临床肿瘤治疗提供相关的理论基础。[方法]1.用二甲基亚砜（DMSO）溶解2.5μmol/L、5.0μmol/L、10.0μmol/L几种浓度的GAA作用于人舌鳞癌Cal-27细胞,并以不加GAA的完全培养基并加入DMSO作为对照组。设置实验时间点为3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h。2.通过划痕实验研究GAA对人舌鳞癌Cal-27细胞迁移能力的影响。3.采用Transwell小室实验检测GAA对人舌鳞癌Cal-27细胞侵袭和迁移能力的抑制作用。4.通过qRT-PCR实验检测GAA对人舌鳞癌Cal-27细胞中MMP-2、MMP-9 mRNA表达的影响。5.通过Western blot实验检测GAA对人舌鳞癌Cal-27细胞中MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响。[结果]1.细胞划痕实验显示,2.5μmol/L、5.0μmol/L、10.0μmol/L几种浓度GAA对人舌鳞癌Cal-27细胞产生作用以后,可以对人舌鳞癌Cal-27细胞迁移产生抑制作用,基于实验浓度的范围中,迁移量随浓度增加而减少,对照组和实验组的差异有统计学意义（P<0.05）,提示GAA有效抑制Cal-27细胞的迁移。2.Transwell实验结果表明:2.5、5、10.0μmol/L浓度下,GAA对人舌鳞癌中Cal-27细胞产生作用之后,对Cal-27细胞的迁移及侵袭能力有一定的抑制作用,且在实验浓度范围内,其迁移及侵袭能力随GAA浓度的增加而减弱。对照组和实验组的差异有统计学意义（P<0.05）3.qRT-PCR实验显示,人舌鳞癌Cal-27 细胞中加入 2.5μmol/L、5.0μmol/L、1O.Oμmol/L 浓度的 GAA 后,结果显示MMP-2、MMP-9 mRNA的表达明显降低,且在实验浓度范围内,GAA浓度越高,MMP-2、MMP-9的mRNA表达越低,对照组和实验组的差异有统计学意义（P<0.05）。4.在 Western-blot 的检测中可知,2.5μmol/L、5.0μmol/L、10.0μmol/浓度下人舌鳞癌Cal-27细胞受到GAA作用之后,基质金属蛋白酶2与基质金属蛋白酶9（MMP-2、MMP-9）蛋白相对表达量降低,且随GAA浓度增高,其降低量明显增加,对照组和实验组的差异有统计学意义（P<0.05）。[结论]1、GAA可以将人舌鳞癌Cal-27细胞的侵袭性、迁移性降低,基于实验浓度的范围中,随着作用时间增加与GAA的浓度加大,会降低其侵袭性、迁移性。2、一定浓度GAA可以降低人舌鳞癌Cal-27细胞之中MMP-2、MMP-9的mRNA及蛋白表达水平。

涂其武^[5]（2019）在《miR-34a通过其靶基因MMP2影响脑胶质瘤细胞侵袭迁移实验研究》文中认为目的:通过检测miR-34a与MMP2在脑胶质瘤细胞株中的表达情况,探讨miR-34a通过其靶基因MMP2对脑胶质瘤细胞侵袭迁移的影响。方法:采用荧光定量PCR检测miR-34a,荧光定量PCR及western blot检测MMP2在脑胶质瘤细胞株中的表达情况;选取U87与A172,使用miR-34a摸拟物、miR-34a抑制剂进行分组转染,通过qRT-PCR观察miR-34a,qRT-PCR及western blot观察MMP2的表达水平;应用mRNA数据库预测miR-34a结合MMP2区域,然后构建出野生型与突变型MMP2 3’UTR荧光素酶质粒以及miR-34a质粒,采用荧光素酶报告基因实验;通过Transwell侵袭以及划痕实验对U87细胞侵袭迁移能力进行观察。结果:（1）各株脑胶质瘤细胞株内MMP2蛋白含量均高表达,其中以U87、A172最明显,MMP2的mRNA表达水平与其蛋白基本一致,但miR-34a的mRNA水平的表达相对偏低,miR-34a的mRNA表达水平与MMP2呈负相关,MMP2可能为miR-34a下游靶基因。（2）将miR-34a mimic、抑制剂转染U87与A172细胞后,转染mimic细胞株内MMP2的蛋白及mRNA水平均明显降低,转染抑制剂细胞株内MMP2的蛋白及mRNA水平均明显升高。（3）将野生型与突变型MMP2 3’UTR区的荧光素酶质粒分别与pcDNA5-miR-34a质粒转入U87与A172细胞后,实验组突变型MMP2 3’UTR区荧光素酶活性与空白对照组无明显差异,但实验组野生型MMP2 3’UTR区荧光素酶活性较空白对照组明显下降。（4）通过Transwell侵袭实验与划痕实验检测细胞侵袭迁移显示,miR-34a可抑制肿瘤侵袭迁移,且可逆转因MMP2增强的侵袭迁移能力使其下降。结论:（1）miR-34a的mRNA表达水平与MMP2的mRANA表达呈负相关,MMP2可能为miR-34a下游靶基因。（2）脑胶质瘤细胞株内miR-34a可通过结合MMP2 3’UTR区的特定序列来下调MMP2的蛋白及mRNA表达水平。（3）脑胶质瘤内miR-34a为抑癌基因,其通过下调MMP2的表达来对脑胶质瘤细胞的侵袭迁移产生抑制作用。

李俊君,常德贵,董良,阳方,俞旭君^[6]（2017）在《前列腺癌组织中血管生成拟态形成的分子通路研究进展》文中进行了进一步梳理血管生成拟态（vasculogenic mimicry,VM）是近年来发现的一种肿瘤血液供应的新方式,随着研究的深入,正受到越来越多的关注。前列腺癌组织中亦发现有VM的存在,其形成可能与通路HIF-1α→VEGFα→Eph A2→MMPs→Laminin5γ2→VM有关。本文综述了近几年国内外对该通路中相关因子的研究进展,为下一步前列腺癌VM的基础研究提供思路。

俞旭君^[7]（2016）在《芪蓝胶囊基于VEGF抑制前列腺癌VM形成的机制研究》文中研究说明研究背景和目的：前列腺恶性肿瘤逐年高发,发病率在欧美国家成年男性中已排第一位。国内由于老龄化社会的到来和健康体检的推广,该病的发病率也已连年上升。长期以来,肿瘤血管生成是被认为其获得血液供应的唯一途径,但血管生成可能不是所有肿瘤获得微循环血液供应的唯一机制,某些高度恶性的肿瘤细胞可以模拟内皮依赖性血管（Edothelium dependent vessel, EDV）的形态结构形成一种新的血液供应模式,称之为“血管生成拟态”（Vasculogenic mimicry, VM）。肝癌、PCa、卵巢癌等恶性肿瘤中已报道有VM存在的证据。VM在前列腺癌的发生、发展中发挥着重要作用。VEGF在前列腺癌组织中表达增高,增加血管通透性和刺激新生血管形成,从而给肿瘤细胞供应足够的营养,使其生长、转移等过程能够顺利进行。近来研究发现,VEGF可通过HIF-1α→VEGFα→EphA2→MMPs→Laminin-5γ2→VM路径诱导前列腺肿瘤细胞形成VM,尤其在生殖系肿瘤当中,只有高表达VEGF的细胞才有形成VM的潜能。因此,我们遴选VEGF参与介导形成VM的通路,探讨芪蓝胶囊基于VEGF抑制前列腺癌VM形成的作用机制。本研究拟分析芪蓝胶囊对VM形成的影响,探讨芪蓝胶囊干预VM形成的作用规律及“量-效”关系。同时我们在3D培养体系中,采用RNAi干扰技术分别沉默VEGF通路上各位点的表达,运用RT-qPCR和Western-blotting技术检测VEGF通路上各点的基因表达及表达产物变化,目的在于探寻芪蓝胶囊在抑制VEGF介导形成前列腺癌VM的通路中的作用位点及其作用机制。研究方法：1.将PC-3细胞冻存管从液氮罐中取出,迅速融化,转移到离心管,加入2mlDMEM/F-12培养液,吹打混匀,离心后弃去上清,加入1ml DMEM/F-12,吹打使细胞混匀,形成单细胞悬液。将制成的悬液转移至25ml细胞培养瓶,加入DMEM/F-12培养基（含10%FBS） 5ml进行细胞传代培养,细胞计数直至获得足够数量的细胞用于实验。培养好的细胞再次通过BeaverNanoTM 3D细胞培养方法进行3D培养,将3D培养的细胞随机分为：空白对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,每组设3个复孔。芪蓝胶囊含药血清按10%,5%,2.5%（培养体系体积比）设置高、中、低剂量组给药,不足10%的组别用胎牛血清补足；空白组采用10%大鼠空白血清给药,作用时间48h。最后采用显微镜对培养孔中的细胞VM进行观察。2.PC-3细胞在培养瓶中处于对数生长期时,处理后加DMEM/F-12（含10%FBS）2ml,吹打形成单细胞悬液。按2.5x105细胞/孔的浓度接种,6孔板,混匀后置于37-C,5%CO2培养箱24小时。培养后进行siRNA的转染,转染后的混合物逐滴加入6孔板中混匀,温育6h。开始转染判定,转染率>80%时,进行后续步骤,荧光标记组停止后续步骤。将细胞分组,包括空白对照组、HIF-1α siRNA组、VEGF-α siRNA组、EphA2 siRNA组、芪蓝胶囊（中剂量）组、芪蓝胶囊+HIF-Iα siRNA组、芪蓝胶囊+VEGF-α siRNA组、芪蓝胶囊+EphA2 siRNA组。最后采用RT-qPCR和Western-blotting技术检测VEGF通路上各点的基因表达及表达产物变化。研究结果：1.空白组中细胞增殖明显,可见VM形成的各类表现,芪蓝胶囊低剂量组细胞增殖明显,可见直的、平行排列的、十字交叉的、彩虹样的（没有完全封闭）、有分支的彩虹样的通道,但数量较空白组少；中、高剂量组细胞增殖受到抑制,仅见极少量直行通道形成。2.芪蓝胶囊可减少HIF-1α、VEGF-α、MMP-1的基因表达,但对EphA2的基因表达无显着性影响。转染HIF-1α siRNA后,HIF-1α、MMP-1勺基因表达受到明显抑制VEGF-α、EphA2的基因表达未受明显抑制。转染VEGF-α siRNA后,HIF-1α、 VEGF-α的基因表达未受明显抑制,MMP-1、EphA2的基因表达受到明显抑制,转染EphA2 siRNA后,HIF-1α、VEGF-α的基因表达无明显抑制,EphA2.MMP-1的基因表达受到明显抑制。加入芪蓝胶囊的4组均可明显抑制HIF-1α蛋白的表达,加入芪蓝胶囊4组与HIF-1α siRNA、VEGF-α siRNA、EphA2 siRNA组均可抑制VEGF-α蛋白的表达,芪蓝胶囊对EphA2蛋白表达无明显影响。研究结论：1.芪蓝胶囊含药血清可明显抑制体外前列腺癌PC-3细胞3D培养模型中VM的形成,以中、高剂量组的抑制作用更为明显；2.VEGF-α、EphA2、MMP-1之间存在明显的上下游关系,是VM形成的重要上游因子,证实在VM形成的过程中通路VEGF-α→EphA2-MMP-1→VM真实存在。而HIF-1α与VEGF-α、EphA2之间没有明显的抑制关系,可能与上游VEGF-α基因受到其他更多因子调节有关。MMP-1的表达在HIF-1α沉默后受到抑制,提示HIF-1α可能通过其他路径抑制了MMP-1的表达,从而影响VM的形成,还需要进一步深入研究。3.芪蓝胶囊通过抑制HIF-1α、VEGF-α、MMP-1基因以及蛋白的表达,从而使前列腺癌组织中VM形成受到抑制,影响了肿瘤组织自身血液供应系统的生长、发展过程,最终起到治疗前列腺癌的临床作用。

许敏^[8]（2014）在《强力霉素对胃癌细胞BGC-823增殖及侵袭能力影响的研究》文中研究指明目的研究强力霉素对胃癌细胞BGC-823细胞的增殖及侵袭能力的影响，探讨强力霉素通过Notch1信号通路对胃癌细胞增殖、侵袭的影响的可能机制，为胃癌治疗的新手段提供新的依据，同时为胃癌的治疗提供新的抗肿瘤药物。方法分别以0、5、10、20、40μg/mL终浓度的强力霉素作用于人胃癌细胞系BGC-823，运用MTT法检测细胞增殖程度；流式细胞仪检测细胞周期分布的影响；Transwell小室评估细胞迁徙能力；Western Blot检测Notch1、CyclinD1、CyclinE、MMP-9、VEGF、COX-2蛋白水平的表达。结果MTT实验检测结果显示：强力霉素对BGC-823细胞的生长起抑制作用，在同一时间点，随着强力霉素浓度的升高，细胞的抑制率升高；同一药物浓度下，随着作用时间的增加，抑制率也逐渐升高，表明强力霉素对胃癌细胞的抑制率具有时间、浓度依赖性，差异具有统计学意义（F分组=102.050, F时间=617.376, F交互=40.552, P<0.05）。流式细胞仪结果显示：强力霉素作用于BGC-823细胞48h后，随着强力霉素浓度的升高，G0/G1期比例逐渐增加（F=892.530, P<0.05），而S期较对照组比例却呈下降趋势（F=949.002, P<0.05），G2/M期也比例也逐渐下降（F=139.190, P<0.05）。Western blot免疫印迹结果显示：不同浓度强力霉素作用BGC-823细胞48h后，随着强力霉素作用浓度的升高，Notch1的表达升高，而CyclinD1、CyclinE、MMP-9、COX-2、VEGF的表达逐渐降低，并且呈浓度依赖性，以上差距均存在统计学意义（P<0.05），采用Pearson相关性分析，表明Notch1和MMP-9表达呈负相关（r=-0.994, P<0.05）。Transwell小室结果显示：强力霉素干预BGC-823细胞24h后，随着强力霉素作用浓度的升高，穿过Transwell小室滤膜的细胞数逐渐减少，差距具有统计学意义（P<0.05），且穿过滤膜的细胞数与药物作用浓度呈负相关（r=-0.862, P<0.05）。结论Notch1可以抑制胃癌细胞BGC-823的增殖和侵袭；强力霉素可以抑制胃癌细胞BGC-823的增殖和侵袭；强力霉素对胃癌细胞BGC-823的抑制增殖和侵袭，Notch1信号通路的激活为可能的机制之一。

赵然^[9]（2014）在《强力霉素联合阿霉素对胃癌细胞BGC823凋亡的影响及其作用机制的研究》文中研究表明目的通过用强力霉素、阿霉素单药及两药联合用药组作用于胃癌BGC823细胞，观察三组药物对胃癌BGC823细胞凋亡的影响，分析诱导肿瘤细胞凋亡过程中对Bcl-2、Bax、Caspase-3、 Notch-1蛋白表达的情况，并对其机制进行初步探讨，以期为临床肿瘤化疗提供高效低毒的治疗方案。方法通过对胃癌BGC823细胞培养及干预，分别以终浓度为5、10、15、20、25ug/ml的强力霉素；2.0、2.5、3.0、3.5、4.0ug/ml的阿霉素；5/2.0、5/2.5、5/3.0、5/3.5、5/4.0ug/ml的联合用药组作用于人胃癌细胞BGC823，用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）检测各组药物对胃癌细胞的抑制率。取小剂量的强力霉素与高浓度的阿霉素及联合用药组并分为4组：A：空白对照组；B：5ug/ml的强力霉素组；C：4.0ug/ml的阿霉素组；5/4.0ug/ml的联合用药组。采用瑞氏姬母萨染色液染色，显微镜下观察细胞形态学变化；流式细胞法检测肿瘤细胞凋亡率的影响；Westernblot法检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、 Notch-1蛋白表达的变化。结果1、用强力霉素、阿霉素及联合用药组分别作用于BGC823细胞24h、48h及72h，MTT结果显示：各组药物对BGC823细胞的增殖均有抑制作用，且呈剂量-时间依赖性，即随着各组药物浓度的增大和作用时间的延长，对胃癌细胞BGC823的增殖抑制作用越明显。2、采用瑞姬氏染色液进行染色，显微镜下观察细胞形态学变化，对照组胃癌细胞BGC823呈多角形或卵圆形，胞浆透亮，单层贴壁生长，经各药物处理后，生存细胞数量及胞浆透明度明显下降，胞膜完整但出现发泡现象。3、流式细胞仪检测结果显示,与对照组相比，强力霉素和阿霉素作用于BGC823细胞后，起到了明显诱导细胞凋亡的作用。当强力霉素与的阿霉素联合使用后，显着增强了阿霉素的诱导细胞凋亡作用。4、Western结果进行计算机图象分析，Western Blot检测结果显示，与对照组比较，强力霉素和阿霉素单药均显示Bax增加而Bcl-2减少，联合用药组Bax增加和Bcl-2减少更为明显。与对照组比较，强力霉素和阿霉素单药组显示Notch1、caspase-3表达增加，联合用药组中Notch1、caspase-3蛋白的表达显着增加。结论1、强力霉素与阿霉素联合用药效果优于强力霉素和阿霉素单独用药组。2、与阿霉素单药组相比，联合用药可促进胃癌细胞BGC823的凋亡，其作用可能与上调Notch-1的表达，活化caspase-3，激活Bax和抑制Bcl-2有关。3、强力霉素作为凋亡诱导剂与化疗药物联合应用可抑制肿瘤细胞的凋亡。

叶林^[10]（2009）在《糖尿病足感染伤口渗液中基质金属蛋白酶2和金属蛋白酶2组织抑制因子的定量研究及强力霉素的治疗作用》文中进行了进一步梳理背景和目的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）是一类含Zn2+的内源性蛋白水解酶,MMPs能降解除多糖以外的所有细胞外基质（extracellular matrix,ECM）成分,金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitors of metalloproteinases,TIMPs）是其内源性抑制因子,主要功能是特异性抑制MMPs。二者协同作用,维持动态平衡,在各种生理和病理过程中发挥重要作用。研究证实,基质金属蛋白酶在时间和空间上有控制的表达对创伤愈合与组织修复必不可少。四环素族药物作为一类广谱抗生素被广泛应用于临床,但近期的研究发现它还是一种能影响细胞多种功能的药物,具有较强的对MMPs的抑制作用。进一步的研究证明脱氧羟基四环素（强力霉素）在一定浓度范围对动物模型或人体组织细胞可降低MMPs的表达,减少MMPs的合成,抑制MMPs的活性。本研究探讨基质金属蛋白酶2（MMP-2）及金属蛋白酶2组织抑制因子（TIMP-2）在糖尿病足感染创面渗液中的表达,旨在阐明其表达水平变化与糖尿病足感染创面的内在联系,并通过MMP-2/TIMP-2比值的变化,进一步阐明MMPs与TIMPs表达水平的动态失衡与糖尿病足溃疡愈合机制的相关性。同时应用强力霉素对糖尿病足溃疡进行局部外用治疗,观察其治疗效果,为糖尿病足溃疡的治疗提供新的方法。材料与方法1.糖尿病足溃疡并感染患者20例（DF组）,符合1999年WHO糖尿病诊断标准,均为2型糖尿病,按Wagnar分类标准在Ⅱ级8例,Ⅲ级12例。其患肢踝肱比（ABI）在0.4-0.9之间,糖尿病足部溃疡的病程均在4周以上,排除下肢静脉性溃疡,无肝、肾功能不全及免疫缺陷病。行溃疡局部分泌物或深部坏死组织细菌培养证实合并感染:单一细菌感染者15例,混合细菌感染者5例。对照组分为糖尿病非感染手术患者10例（DM组）,均符合1999年WHO糖尿病诊断标准,均为2型糖尿病;非糖尿病非感染手术患者10例（N组）,患者的年龄、性别与糖尿病足溃疡并感染组基本匹配,均多次行手术创面局部分泌物细菌培养排除合并感染。2.标本收集:收集糖尿病足感染伤口渗液及手术创面引流液。3.采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）测定创面渗液样本中MMP-2、TIMP-2的浓度,并计算各样本MMP-2/TIMP-2的比值。比较三组之间的差异是否具有统计学意义。4.以外敷生理盐水为对照,在合并有细菌感染的溃疡局部加入强力霉素治疗（强力霉素药物浓度为100mg/L）,观察比较两组的肉芽组织出现时间（GT）及溃疡愈合时间（HT）是否有统计学差异。结果:1.糖尿病足溃疡并感染组渗液中MMP-2的浓度为83.58±15.09 ng/ml, TIMP-2的浓度为12.88±2.59 ng/ml,MMP-2/TIMP-2比值为6.84±2.33;糖尿病非感染手术创面组渗液中MMP-2的浓度为32.18±4.29 ng/ml,TIMP-2的浓度为30.71±3.91 ng/ml,MMP-2/TIMP-2比值为1.06±0.20;非糖尿病非感染手术创面组渗液中MMP-2的浓度为21.51±3.62 ng/ml,TIMP-2的浓度为20.74±2.72 ng/ml,MMP-2/TIMP-2比值为1.05±0.23。糖尿病足溃疡并感染组渗液中MMP-2的浓度与对照组间的差异具有统计学意义（P=0.000）;三组之间MMP-2浓度的差异具有统计学意义（P<0.05）,提示DF组渗液中MMP-2浓度较DM组升高,同时DM组MMP-2浓度较N组升高。糖尿病足溃疡并感染组渗液中TIMP-2的浓度与对照组间的差异具有统计学意义（P=0.000）;三组之间TIMP-2浓度的差异具有统计学意义（P<0.05）,提示DM组渗液中TIMP-2浓度较N组升高,同时N组TIMP-2浓度较DF组升高。糖尿病足溃疡并感染组渗液中MMP-2/TIMP-2比值与对照组的差异具有统计学意义（P=0.000）;DF组MMP-2/TIMP-2比值与其余两组比较,差异均具有统计学意义（P<0.01）,提示DF组MMP-2/TIMP-2比值较其余两组显着升高;而DM组与N组之间两两比较,其差异不具有统计学意义（P>0.05）。2.糖尿病足溃疡并感染组中作分组比较:单一感染组MMP-2的浓度为79.26±13.77 ng/ml,TIMP-2的浓度为12.98±2.80 ng/ml,MMP-2/TIMP-2比值为6.51±2.48;混合感染组MMP-2的浓度为96.51±11.82 ng/ml,TIMP-2的浓度为12.58±2.09 ng/ml,MMP-2/TIMP-2比值为7.85±1.62。单一感染组与混合感染组间MMP-2的浓度差异具有统计学意义（P=0.022）,提示混合感染组MMP-2的浓度较单一感染组升高;两组间TIMP-2的浓度及MMP-2/TIMP-2比值差异没有统计学意义（P>0.05）。3.糖尿病足溃疡并感染组中作分组比较:Ⅱ级溃疡组MMP-2的浓度73.0±8.56 ng/ml,TIMP-2的浓度为13.56±2.82 ng/ml,MMP-2/TIMP-2比值为5.59±1.33;Ⅲ级溃疡组MMP-2的浓度为90.62±18.54 ng/ml,TIMP-2的浓度为12.43±2.45 ng/ml,MMP-2/TIMP-2比值为7.68±2.53。Ⅱ级溃疡组与Ⅲ级溃疡组间MMP-2的浓度差异具有统计学意义（P=0.007）,提示Ⅲ级溃疡组MMP-2的浓度较Ⅱ级溃疡组升高;两组间MMP-2/TIMP-2比值的差异具有统计学意义（P=0.047）,提示Ⅲ级溃疡组MMP-2/TIMP-2比值较Ⅱ级溃疡组升高;两组间TIMP-2的浓度差异没有统计学意义（P>0.05）。4.强力霉素治疗组中,Wagnar分级Ⅱ、Ⅲ级患者肉芽组织出现时间（GT）分别为:3.5±1.3天及4.8±1.5天;溃疡愈合时间（HT）分别为:22.8±3.3天及25.2±4.4天;Ⅱ级+Ⅲ级患者溃疡肉芽组织出现时间（GT）及溃疡愈合时间（HT）分别为:4.3±1.5天及24.2±4.0天。生理盐水对照组中,Wagnar分级Ⅱ、Ⅲ级患者溃疡肉芽组织出现时间（GT）分别为:6.3±1.3天及7.3±1.5天;溃疡愈合时间（HT）分别为:38.3±3.4天及46.5±5.0天。Ⅱ级+Ⅲ级患者溃疡肉芽组织出现时间（GT）及溃疡愈合时间（HT）分别为:6.9±1.5天及43.2±6.0天。强力霉素治疗组与对照组的GT、HT差异有显着性意义（P<0.01）;提示强力霉素治疗组溃疡部位肉芽组织出现时间（GT）及溃疡愈合时间（HT）较对照组明显缩短。结论1.糖尿病足溃疡合并感染创面中MMP-2的浓度明显升高,TIMP-2的浓度明显下降,MMP-2/TIMP-2比值明显升高;2.强力霉素局部外用能明显缩短糖尿病足溃疡肉芽组织出现时间及溃疡愈合时间,促进糖尿病足溃疡愈合。

二、强力霉素抑制PC-3细胞基质金属蛋白酶-2表达及侵袭的体外研究（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、强力霉素抑制PC-3细胞基质金属蛋白酶-2表达及侵袭的体外研究（论文提纲范文）

（1）基质金属蛋白酶对脑动脉瘤的影响及其相互关系研究（论文提纲范文）

（2）转录因子TWIST1在子痫前期发病中的作用及其机制研究（论文提纲范文）

（3）促红细胞生成素导致腹主动脉瘤形成的作用及分子机制研究（论文提纲范文）

（4）醋酸棉酚对人舌鳞癌Cal-27细胞迁移性及侵袭性作用的研究（论文提纲范文）

（5）miR-34a通过其靶基因MMP2影响脑胶质瘤细胞侵袭迁移实验研究（论文提纲范文）

（6）前列腺癌组织中血管生成拟态形成的分子通路研究进展（论文提纲范文）

（7）芪蓝胶囊基于VEGF抑制前列腺癌VM形成的机制研究（论文提纲范文）

（8）强力霉素对胃癌细胞BGC-823增殖及侵袭能力影响的研究（论文提纲范文）

（9）强力霉素联合阿霉素对胃癌细胞BGC823凋亡的影响及其作用机制的研究（论文提纲范文）

（10）糖尿病足感染伤口渗液中基质金属蛋白酶2和金属蛋白酶2组织抑制因子的定量研究及强力霉素的治疗作用（论文提纲范文）

四、强力霉素抑制PC-3细胞基质金属蛋白酶-2表达及侵袭的体外研究（论文参考文献）

• [1]基质金属蛋白酶对脑动脉瘤的影响及其相互关系研究[D]. 邹亮. 苏州大学, 2021(06)
• [2]转录因子TWIST1在子痫前期发病中的作用及其机制研究[D]. 马丽娟. 山东大学, 2020(12)
• [3]促红细胞生成素导致腹主动脉瘤形成的作用及分子机制研究[D]. 章萌. 山东大学, 2020(12)
• [4]醋酸棉酚对人舌鳞癌Cal-27细胞迁移性及侵袭性作用的研究[D]. 陈思宇. 昆明医科大学, 2019(06)
• [5]miR-34a通过其靶基因MMP2影响脑胶质瘤细胞侵袭迁移实验研究[D]. 涂其武. 南昌大学, 2019(01)
• [6]前列腺癌组织中血管生成拟态形成的分子通路研究进展[J]. 李俊君,常德贵,董良,阳方,俞旭君. 中国性科学, 2017(05)
• [7]芪蓝胶囊基于VEGF抑制前列腺癌VM形成的机制研究[D]. 俞旭君. 成都中医药大学, 2016(05)
• [8]强力霉素对胃癌细胞BGC-823增殖及侵袭能力影响的研究[D]. 许敏. 辽宁医学院, 2014(03)
• [9]强力霉素联合阿霉素对胃癌细胞BGC823凋亡的影响及其作用机制的研究[D]. 赵然. 辽宁医学院, 2014(02)
• [10]糖尿病足感染伤口渗液中基质金属蛋白酶2和金属蛋白酶2组织抑制因子的定量研究及强力霉素的治疗作用[D]. 叶林. 广州医学院, 2009(07)

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