一、利用SPR研究海洋硫酸多糖911与GP120-V3区的相互作用特性—基于一种新的多糖在芯片表面的固定方法（论文文献综述）
付磊[1]（2020）在《原核生物Argonaute（pAgo）蛋白介导细菌基因组编辑及其机制研究》文中进行了进一步梳理虽然经典遗传操作工具在少数模式细菌中有着很好的效果,但并不适用于大多数重要病原菌在内的其它细菌。新型基因编辑技术CRISPR/Cas9由于存在表达元件复杂、脱靶效率高以及细菌存在抗Cas9分子等因素,限制了该技术在很多病原菌中的应用。因此,开发通用、简便、高效、无痕的遗传操作工具对于病原菌致病机制和防控技术的研究具有重要的价值和意义。多杀性巴氏杆菌对猪、牛、鸡、鸭等畜禽养殖业危害严重,缺乏高效的遗传操作工具极大限制了该病原菌致病机理的研究及防控产品的研发。为了研究禽多杀性巴氏杆菌的致病机理和基因工程疫苗,我们实验室前期应用多种经典遗传操作系统,如温敏自杀系统、Sac B筛选系统、galk筛选系统及thy A筛选系统等,来构建禽多杀性巴氏杆菌基因缺失突变株但都未成功。后来采用NgAgo/gDNA系统成功实现了禽多杀性巴氏杆菌和兔多杀性巴氏杆菌靶基因的敲除和敲入,并获得了毒力下降的疫苗候选菌株,说明NgAgo/gDNA系统为多杀性巴氏杆菌致病机制和防控产品的研究提供了遗传操作工具,但该系统介导细菌基因组编辑的分子机制并不清楚。鉴于此,本论文主要研究原核生物Argonaute（pAgo）蛋白介导多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌基因敲除及其分子机制,其研究内容如下:1)NgAgo介导不同细菌靶基因的敲除及敲入。我们实验室前期研究发现NgAgo/gDNA系统可以高效介导多杀性巴氏杆菌基因的敲除及敲入,但该系统能否用于其它细菌基因敲除需要进一步研究。本研究发现NgAgo/gDNA系统成功介导大肠杆菌aste基因缺失的效率高达90%。表明NgAgo/gDNA系统可以应用于多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌等细菌的基因敲除。2)NgAgo介导细菌基因敲除不依赖自身的DNA酶活性。CRISPR/Cas9系统可通过g RNA靶向切割基因组DNA而提高同源重组效应,来实现细菌基因组编辑,NgAgo/gDNA系统介导细菌基因敲除是否同样依赖gDNA靶向切割基因组DNA的水解酶活性需要进一步探究。故本论文将NgAgo潜在的酶活性位点（D633A,D738A）进行突变,发现仍能高效介导禽多杀性巴氏杆菌lyi基因敲除。不引入外源gDNA,NgAgo也可以高效介导禽多杀性巴氏杆菌lyi及opa基因的敲除。表明NgAgo提高细菌基因敲除的效率不依赖自身DNA酶活性及外源gDNA。3)NgAgo蛋白通过增强recA介导同源DNA链交换来提高同源重组效率。既然NgAgo介导细菌基因敲除不依赖其自身DNA酶活性及外源gDNA,其机制有待解析。本论文采用IP方法筛选NgAgo蛋白互作分子并通过质谱鉴定同源重组酶recA为其互作蛋白,随后通过正反向Co-IP验证NgAgo与内源性recA互作,且互作不受DNase I处理的影响。通过分析纯化的重组NgAgo蛋白和recA蛋白之间的互作,发现两种蛋白可直接互作,进一步应用SPR技术发现NgAgo与recA互作亲和力高于10n M,暗示recA为NgAgo的互作蛋白。同源重组过程中recA通过与单链DNA结合,并介导单链DNA与同源DNA的链交换而实现同源重组。本论文研究发现NgAgo蛋白并没有显着增加recA蛋白与单链DNA的结合,但却能显着增强recA介导的同源DNA链交换能力。表明NgAgo介导细菌基因敲除的机制是NgAgo蛋白与同源重组酶recA结合,并增强recA介导的同源DNA链交换能力,从而提高了同源重组效率,实现了细菌基因组编辑。4)PIWI结构域是NgAgo蛋白介导细菌基因组编辑的主要结构域。NgAgo蛋白主要由四个结构域构成,即N端、PAZ、MID及PIWI结构域,为了分析NgAgo介导细菌基因组编辑的主要结构域,将NgAgo分段为NgAgo-A（N端）、B（PAZ-MID-PIWI区域）、C（N-PAZ区域）、D（MID-PIWI区域）。发现NgAgo-A和NgAgo-C不能,而NgAgo-B和NgAgo-D能与recA互作且高效介导禽多杀性巴氏杆菌lyi基因的敲除。说明NgAgo蛋白C端是其介导细菌基因组编辑的主要结构域。为了排除C端PIWI结构域的DNA酶活性,本论文将NgAgo-D蛋白的酶活性位点进行突变,发现其仍能和recA互作,增强recA介导的同源DNA链交换能力,提高同源重组效率来介导禽多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌基因的敲除。表明NgAgo蛋白C端是其介导细菌基因组编辑的主要区域,且不依赖于自身DNA水解酶活性。为了进一步分析NgAgo介导细菌基因组编辑的主要结构域是MID或PIWI,故将NgAgo分段为NgAgo-E（MID）和NgAgo-F（PIWI）,发现PIWI是与recA互作且高效介导禽多杀性巴氏杆菌opa基因敲除的主要结构域。表明PIWI结构域是NgAgo蛋白介导基因组编辑的主要结构域,且不依赖于自身DNA水解酶活性。5)多种pAgo蛋白均能高效介导细菌基因敲除且不依赖其DNA酶活性。NgAgo蛋白可以通过PIWI结构域与recA互作,增强recA介导的同源重组效率来介导细菌基因组编辑,本论文进一步分析了其它原核生物Ago蛋白PIWI结构域的功能保守性。对嗜热栖热菌的Tt Ago、嗜热古细菌的Pf Ago及超嗜热菌的Aa Ago进行分析,发现三种pAgo（MID-PIWI区域）蛋白都能与细菌recA蛋白互作,能高效介导禽多杀性巴氏杆菌lyi及opa基因的敲除,且不依赖于PIWI区域的DNA酶活性。表明不同原核生物Ago蛋白的PIWI结构域具有功能保守性,均可介导细菌的基因组编辑。总之,本研究发现具有PIWI结构域的pAgo蛋白都能介导多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌的基因组编辑,其机制是不依赖于gDNA靶向切割基因组DNA的水解酶活性,而是pAgo的PIWI结构域与recA互作,增强recA介导的同源DNA链交换能力,从而提高同源重组效率。pAgo具有开发为通用、简便、高效、无痕的细菌基因组编辑工具的潜力,为研究重要病原菌的致病机理及防控产品等方面奠定了基础。
王骏畅[2]（2020）在《金催化剂的绿色制备及致病菌表面含有甘油-D-甘露庚糖的寡糖抗原的合成研究》文中指出作为最近兴起的热点,有关金的研究正不断地在化学（催化剂等）和生物（抗癌效果等）领域被报道。而传统路线中,制备金催化剂通常要用到刺鼻气味的硫试剂如二甲硫醚、二丙硫醚、四氢噻吩等,或者已经受到严格管制的硫代双乙醇,无论在科研还是生产方面都有着很大的不便。我们发明了一种新的绿色制备方法,通过使用基本无气味,价格便宜的4,4’-硫代二苯酚,合成了一系列常用的金催化剂,并在此基础上进行应用,成功得到了抗类风湿性关节炎药物金诺芬。幽门螺旋杆菌作为一种革兰氏阴性细菌,早在100多年前就在人们的胃中观察到了它的存在。30多年前,通过科学家Barry Marshall和Robin Warren为首的一部分人的努力,发现幽门螺旋杆菌和胃溃疡,胃癌等有着密切的关系。目前主要的治疗方式是利用抗生素对付此类细菌,但有着耐药性和病人依从性差等缺点。研究发现,1,3连接的D-甘油-D-甘露庚糖存在于幽门螺旋杆菌多种菌株中。我们发展了一种从头合成方法,通过两次aldol加成反应成功构建了正交保护的D-甘油-D-甘露庚糖砌块;然后,基于金催化的甘露庚糖邻炔基苯甲酸酯的α-立体选择性糖苷化反应构建了 D-甘油-D-甘露庚糖砌块之间的α-1,3糖苷键,并最终合成了幽门螺旋杆菌多种菌株（如O3,06血清型,MO19,D2,D4和D5菌株）表面脂多糖上的三糖抗原。同时,我们也获得了相应的单糖和二糖抗原。海洋来源的革兰氏阴性细菌副溶血性弧菌,常常会引起腹痛,腹泻,呕吐等一系列症状,是导致食物中毒的元凶之一。2003年,Kondo课题组报道了副溶血性弧菌02型的脂多糖上存在一个独特的高碳糖结构,其中包含L-甘油-D-甘露庚糖、D-甘油-D-甘露庚糖以及Kdo。我们发展了新型的合成方法,从L-来苏糖和D-核糖出发,基于Mukaiyama aldol反应有效构建了正交保护的L-甘油-D-甘露庚糖和D-甘油-D-甘露庚糖砌块,并通过立体选择性糖苷化反应成功合成了副溶血性弧菌O2型的脂多糖上的三糖抗原。在海洋中生活的异养细菌麦氏交替单胞菌,已有研究发现其具有反硝化的作用,这在污水处理等方面具有巨大的价值。Parrilli课题组在2006年报道了麦氏交替单胞菌ATCC 27126T菌株的R型脂多糖的结构,其中包含两种立体构型的Kdo以及L-甘油-D-甘露庚糖。基于上述的合成方法,我们合成了 7位选择性保护的L-甘油-D-甘露庚糖给体,并成功与Kdo的5位羟基建立了 1,5连接的糖苷键,并获得了关键的二糖片断。随后我们探索了利用Kdo邻炔基苯甲酸酯给体的糖苷化反应来构建含有两个Kdo和一个L-甘油-D-甘露庚糖的三糖片断。
王怡乔[3]（2020）在《好氧颗粒污泥中胞外DNA的来源与结构支撑功能研究》文中研究指明好氧颗粒污泥（AGS）被认为是一种具有应用前景的微生物技术,可替代常规活性污泥,用于生活污水和工业废水的处理。胞外多聚物（Extracellular Polymeric Substances,EPS）由多糖、蛋白质和细胞外DNA（exDNA）组成,它是影响AGS稳定性的主要因素。然而,目前研究主要集中在胞外多糖和蛋白的团聚作用,还没有研究报道过exDNA在AGS中的微生物来源及其结构稳定性作用。本研究采用高效分离胞内DNA（inDNA）和exDNA（exDNA）的方法,结合宏基因组学分析,对不同粒径AGSs中exDNA特性进行了研究。结果显示,exDNA的GC含量明显低于inDNA,约为46.0%,而inDNA的GC含量约为65.0%;分类学预测表明,exDNA中的reads片段大部分来自Bacteroidetes（55.0～64.2%）,而 inDNA 的 reads 主要来自Proteobacteria（50.9～57.8%）或Actinobacteria（18.0～28.0%）。inDNA reads 与 exDNA reads 拼接获得的Bacteroidetes基因组草图高度相似且完整,这说明AGS中的exDNA来源于细胞裂解。另外,通过对Bacteroidctes基因组的contigs进行功能注释发现,大多数Bacteroidetes基因组中含有较多的CRISPR间隔序列,并且在exDNA拼接获得的基因组草图中含有丰富的CRISPR-Cas蛋白,上述结果说明,在AGS中噬菌体感染可能是导致Bacteroidetes细胞裂解释放DNA的重要原因。DNase I消解实验表明,exDNA对维持粒径相对较小的AGS结构稳定性至关重要,而对粒径较大的AGS结构稳定性作用并不显着,扩展DLVO理论分析发现,exDNA主要通过改变Lewis酸-碱相互作用能影响AGS中微生物团聚行为。利用特异性荧光染色技术和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）原位显示exDNA发现,大部分的exDNA与胞外蛋白和胞外多糖绑定在一起,共同支撑AGS的结构。本研究揭示了 AGS中exDNA的特征及结构支撑作用,为AGS结构稳定性研究提供了新的视角,也为AGS技术的推广应用提供了理论支撑。
陈林林[4]（2020）在《基于STAT3抑制作用的中药活性成分筛选及其抗肿瘤恶病质作用研究》文中指出肿瘤恶病质（Cancer cachexia）是一种多因素疾病综合征,以体重减轻和骨骼肌萎缩为主要特征。多项研究也显示保存骨骼肌质量能延长肿瘤恶病质患者及模型小鼠的生存期。然而,迄今为止尚无有效的医学干预措施可完全逆转恶病质,也没有批准的药物疗法。肿瘤恶病质持续体重下降主要由骨骼肌萎缩引起。目前普遍认为,骨骼肌萎缩是肿瘤和机体免疫相互作用,释放过量的炎症细胞因子如白细胞介素-6（Interleukin 6,IL-6）,肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）和白细胞介素1β（Interleukin 1beta,IL-1β）等,活化骨骼肌组织中多条信号转导通路如信号转导和转录激活因子3（Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）、核因子kappa B（Nuclear factor-kappa B,NF-κB）及叉头蛋白O3（forkhead box protein O3,Fox O3）等,最终激活肌蛋白降解的主要途径——泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin-proteasome system,UPS）,促进组织蛋白水解和肌肉消耗。STAT3是细胞内的一种转录因子,具有调控细胞增殖、迁移、存活及凋亡等多种生物学功能。最近研究表明,肿瘤恶病质、慢性肾功能衰竭和糖尿病等多种动物模型的骨骼肌萎缩与STAT3激活密切相关;进一步机制研究发现,STAT3通过调控转录因子CCAAT增强子结合蛋白δ（CCAAT/Enhancer Binding Protein,Delta,C/EBPδ）激活UPS,最终导致骨骼肌萎缩。更重要的是,骨骼肌敲除或药理学抑制STAT3,均可显着改善肿瘤恶病质小鼠骨骼肌萎缩。这些研究提示STAT3是肿瘤恶病质治疗的重要药物靶标。在本研究中,基于肿瘤恶病质的病理特征和骨骼肌萎缩机制,我们以STAT3为靶点,采用表面等离子共振（Surface plasmon resonance,SPR）分析技术从抗恶病质中药方剂来源的1186种中药小分子化合物库中筛选能特异性结合于STAT3蛋白的中药活性成分,并采用双荧光素酶报告基因检测系统验证其对STAT3转录活性的抑制作用;随后进一步体外评估中药活性成分对肌管萎缩的保护作用,并通过体内研究其抗肿瘤恶病质骨骼肌萎缩的作用;最后利用基因过表达技术探讨中药活性成分是否通过STAT3发挥抗肿瘤恶病质骨骼肌萎缩作用,全面阐明中药活性成分抗肿瘤恶病质的作用及作用机制,为其能够成为理想的治疗肿瘤恶病质药物提供重要的理论依据。目的:1.从抗恶病质中药方剂中筛选和发现能结合并抑制STAT3激活的中药活性成分。2.评价STAT3抑制活性高的中药活性成分改善肌管萎缩及抗肿瘤恶病质骨骼肌萎缩作用。3.探讨中药活性成分改善肿瘤恶病质骨骼肌萎缩是否通过STAT3抑制实现。方法:1.采用SPR双蛋白低分子量筛选对1186种中药小分子化合物进行差异筛选,将STAT3蛋白及其对照蛋白固定在生物传感芯片表面,并配制等浓度的1186种中药小分子化合物溶液,使其逐一流过芯片;根据双蛋白间响应信号的差异初步筛选出与STAT3结合信号相对强的中药活性成分。采用SPR动力学分析验证不同浓度中药活性成分与STAT3蛋白的结合/解离过程,并分析其相互作用模式和动力学常数。随后采用双荧光素酶报告基因法检测各中药活性成分对IL-6+IL-6受体（Interleukin 6 receptor,IL-6R）激活的STAT3转录活性的影响。2.体外实验采用小鼠C2C12肌管细胞为研究对象,以不同浓度的中药活性成分处理肌管细胞,CCK-8法检测细胞活力,以确定其作用浓度范围。采用CT26结肠腺癌细胞上清（TCM）刺激的肌管萎缩为体外模型,不同浓度中药活性成分处理肌管后,免疫荧光法检测My HC蛋白表达及STAT3核位移情况,Western blot检测肌管中p-STAT3、Mu RF1及Atrogin-1蛋白表达水平,分析中药活性成分对肌管萎缩的保护作用及肌降解相关蛋白表达水平的影响。体内实验采用CT26结肠腺癌诱导小鼠肿瘤恶病质,分别制备肿瘤恶病质早期（22天）及恶病质期（30天）药物干预的动物模型,检测中药活性成分对小鼠体重、肿瘤生长、摄食、肌肉及脏器质量的影响;采用HE染色检测肌纤维大小及分布;Western blot检测腓肠肌中p-STAT3、Mu RF1及Atrogin-1蛋白表达水平;Real-time q PCR法检测腓肠肌Murf1及Atrogin-1 m RNA表达水平,体内分析中药活性成分对肿瘤恶病质的治疗作用及骨骼肌萎缩相关蛋白表达水平的影响。3.构建STAT3过表达慢病毒并感染C2C12肌管细胞,采用免疫荧光法检测肌管中My HC蛋白表达,Western blot检测p-STAT3、Mu RF1及Atrogin-1蛋白表达水平,体外分析中药活性成分对TCM诱导的肌管萎缩及肌蛋白降解的影响。采用慢病毒介导的腓肠肌STAT3基因过表达实验,体内检测中药活性成分对CT26诱导的肿瘤恶病质骨骼肌萎缩及肌蛋白降解的影响。4.构建小鼠肿瘤恶病质模型,采用Western blot分析恶病质小鼠肿瘤中p-STAT3表达水平,流式分析检测恶病质小鼠肿瘤浸润淋巴细胞中p-STAT3表达水平,体内研究中药活性成分对肿瘤及免疫细胞中STAT3激活的影响。体外分析采用中药活性成分预处理/不处理的CT26、RAW264.7以及CT26与RAW264.7细胞共培养上清对肌管进行刺激,免疫荧光法检测肌管中My HC蛋白表达,Western blot检测p-STAT3、Mu RF1及Atrogin-1蛋白表达水平,研究中药活性成分对肿瘤与免疫细胞共培养上清诱导的肌管萎缩及肌蛋白降解的影响。结果:1.中药小分子化合物库中的10种中药活性成分包括145、146、181、248、401、496、498、1034、1143和1186能够与STAT3蛋白特异性结合,并剂量依赖地抑制IL-6+IL-6R激活的STAT3转录活性。2.体外研究表明,中药活性成分欧前胡素（181）、柴胡皂苷D（496）及隐丹参酮（1186）能够剂量依赖地保护TCM诱导的肌管直径减小,并抑制升高的Mu RF1和Atrogin-1蛋白表达水平,同时抑制增加的STAT3磷酸化水平及核位移。体内研究表明,隐丹参酮及欧前胡素能显着改善肿瘤恶病质小鼠的体重减轻和肌肉消耗,且能够剂量依赖地抑制恶病质小鼠肌肉中p-STAT3、Mu RF1、Atrogin-1蛋白及Murf1、Atrogin-1 m RNA表达水平的升高。其中柴胡皂苷D治疗组小鼠显示急性毒性反应,之后不再进行深入研究。挑选体内外抗肿瘤恶病质骨骼肌萎缩作用较强的欧前胡素进行下一步机制研究。3.肌管细胞中STAT3过表达后,欧前胡素对TCM诱导的肌管萎缩及Mu RF1和Atrogin-1蛋白表达的逆转作用大大减弱,证明欧前胡素通过抑制STAT3发挥抗肌管萎缩作用;然而在小鼠腓肠肌过表达STAT3后,欧前胡素仍旧能够减轻CT26诱导的骨骼肌萎缩并抑制Mu RF1和Atrogin-1蛋白表达,结果表明欧前胡素还可能通过抑制肿瘤或者免疫细胞STAT3的激活发挥改善骨骼肌萎缩作用。4.欧前胡素在抑制肿瘤生长的同时,能够抑制肿瘤及肿瘤浸润淋巴细胞中STAT3激活,并减少血清及肌肉中IL-6、TNF-α及IL-1β的表达水平。CT26与RAW264.7细胞共培养上清加重了肌管萎缩,而欧前胡素预处理后的细胞共培养上清诱导肌管萎缩作用明显减弱,同时p-STAT3、Mu RF1和Atrogin-1的蛋白表达水平也显着下调;此外,欧前胡素能够降低CT26与RAW264.7细胞释放的IL-6及TNF-α水平。结果表明欧前胡素能够抑制肿瘤及免疫细胞中STAT3激活并减少炎症因子的释放。结论:中药活性成分欧前胡素、柴胡皂苷D及隐丹参酮能够特异性结合STAT3并抑制其转录活性,体内外的研究表明欧前胡素具有较强的抗肿瘤恶病质骨骼肌萎缩作用,能够显着改善TCM诱导的C2C12肌管萎缩以及CT26诱导的肿瘤恶病质骨骼肌萎缩。进一步的机制研究表明欧前胡素通过特异性靶向STAT3,直接抑制肌肉中STAT3信号通路的活化,进而抑制STAT3下游肌蛋白降解相关信号的表达,减少肌肉降解,改善骨骼肌萎缩;同时,欧前胡素间接作用于肿瘤及免疫细胞,抑制肿瘤及免疫细胞中STAT3激活并减少炎症因子的释放,改善肌肉消耗,最终发挥抗肿瘤恶病质作用。
刘福艳[5]（2017）在《两种多糖XG和MP-A作用于细胞表面受体Toll-like receptor 4（TLR4）的免疫药理学效应及胞内信号传导分子机制研究》文中研究指明研究目的多糖是一类重要大分子物质,具有多方面的药理学活性,其作用主要包括:免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、降血脂、抗病毒、降血压、降血糖、增强骨髓造血机能等等。多糖的这些良好的药理活性,以及几乎无毒性的优点,愈来愈引起国内外生物化学家、药理学家的兴趣。研究发现:从香菇（Lentinue edodes）分离的β-葡聚糖LNT-S、从酿酒酵母（S.cerevisiae）分离的β-葡聚糖BBG均能抑制LPS诱导的炎症因子NO, TNF-α,IL-1等的表达。这种抑制作用是通过抑制丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）通路的ERK1 / 2和JNK1 / 2的磷酸化而实现的。除了这两种β-葡聚糖外,是否还有其它具有α或者β-葡聚糖结构的多糖具有类似的生物学功能?是否所有D-葡聚糖结构的多糖均具有这种生物学活性?换言之,这种构效关系是否具有通用性?解决这些问题需要选择更多的含葡聚糖结构的多糖去验证和研究。本课题是在我们实验室前期工作的基础上开展,主要对2种以D-葡聚糖为主链的多糖的免疫调节作用及相关分子机制进行研究。一种是来源于甘蓝黑腐病黄单胞菌（Xanthomonas camperstris）细菌胞外杂多糖黄原胶（xanthan gum,XG ）,另一种是来源于贻贝（Mytilus coruscus）的均多糖（Mussel polysaccharide,MP-A）,两者都属于以D-葡聚糖为主链的高分子多糖。前期研究结果表明XG治疗骨关节炎动物实验研究取得很好的效果,MP-A调血脂、抗炎功能的动物实验研究疗效较好,两者均无显着毒副作用,良好安全性和有效性预示着优良的成药性和开发前景。多糖的生物学活性与多糖的一级结构、高级结构和理化性质密切相关。XG和MP-A虽然来源不同,但与LNT-S和BBG相似的是它们的主链中也含有D-葡聚糖结构,XG是含β-D-葡聚糖主链结构的杂多糖,而MP-A是含α-D-葡聚糖结构的同多糖。它们是否与已报道的LNT-S和BBG具有相似的生物学活性和分子机制尚未可知,目前对于这两种多糖的免疫药效学活性尚缺乏相关的研究数据。因此,本文对这2种多糖的免疫药理学活性进行考察,试图确定其细胞外靶标受体和胞内的分子传导机制。主要通过研究XG对小鼠RAW264.7巨噬细胞的影响,考察其体外免疫调节活性,特别考察XG对脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导活化的巨噬细胞的作用,确证其可能结合的受体,进一步通过多种技术手段胞内信号传导机制。通过研究MP-A对人THP-1巨噬细胞的影响,考察MP-A体外免疫调节作用,特别是MP-A对LPS诱导活化的THP-1细胞的作用,寻找和确证MP-A细胞表面受体,进而初步研究其胞内的信号传导机制。最后比较总结两种D-葡聚糖结构多糖XG和MP-A的免疫调节活性的特点及作用机制的异同,为活性多糖的构效关系研究提供更多的实验数据。研究方法1 XG体外免疫药理学效应研究首先我们以小鼠RAW264.7细胞作为体外实验体系,以LPS诱导的RAW264.7细胞作为炎症模型,采用Cell Counting Kit-8 （CCK-8）试剂盒检测测XG对其增殖或者毒性作用。主要试验方法包括:扫描电镜（scanning electron microscopy,SEM）观察XG对小鼠RAW264.7细胞形态的影响;流式细胞仪检测细胞吞噬FITC-dextran实验来分析其对巨噬细胞吞噬功能的影响;Griess试剂法测定RAW264.7细胞经XG作用后产生NO的水平变化;ELISA试剂盒测定XG对RAW264.7细胞分泌IL-1β、IL-6及TNF-α细胞因子的影响;荧光定量RT-PCR分析 XG 对 RAW264.7 细胞 iNOS、COX-2、IL-6、IL-1β 和 TNF-α 的 mRNA水平变化的影响;此外釆用Western blot实验考察了 XG对LPS诱导的RAW264.7细胞iNOS、COX-2蛋白表达量的影响,并运用SPR技术分析XG与重组TLR4的结合情况。2 XG作用于TLR4胞内信号转导机制研究采用小鼠RAW264.7细胞系,研究XG对LPS活化的巨噬细胞胞内信号传导分子机制,包括:用透射电镜（transmission Electron Microscope,TEM）观察XG对RAW264.7胞内细胞超微结构的影响;用Griess试剂法测定用抗小鼠TLR4抗体共孵育RAW264.7细胞30分钟后经XG作用后产生NO的水平变化;机制研究采用Western blot实验检测XG对RAW264.7细胞中丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPKs）途径相关蛋白的表达以及免疫荧光检测核转录因子（nuclear factor-κ-gene binding,NF-κB）的核转运的影响,并运用SPR技术分析XG除了 TLR4外与已知的常见其它受体dectin-1和TLR2的结合情况。3MP-A作用于活化的THP-1巨噬细胞TLR4受体的药理学效应及机制的研究我们以人THP-1细胞作为体外实验体系,以LPS诱导的THP-1巨噬细胞作为炎症模型,采用CCK-8试剂盒检测测MP-A对其增殖或者毒性作用。主要试验方法包括:流式细胞仪检测THP-1细胞吞噬FITC-dextran实验来分析MP-A对巨噬细胞吞噬功能的影响;Griess试剂法测定THP-1细胞经MP-A作用后产生NO的水平变化;ELISA试剂盒测定MP-A对THP-1细胞分泌TNF-α和PGE2的影响;此外采用Western blot实验考察了 MP-A对LPS诱导的THP-1细胞iNOS、COX-2蛋白以及MAPKs和NF-κB途径相关蛋白表达的影响,同时用免疫荧光检测了 MP-A对NF-κB的核转运的影响,运用SPR技术分析MP-A与重组TLR4、dectin-1和TLR2的结合情况。研究结果实验证明,两者均具有免疫调节活性,能够下调活化的巨噬细胞中炎症因子的表达。我们通过使用表面离子共振技术（SPR）考察了2种多糖与细胞表面已知的受体Dectin-1, TLR4和TLR2的亲和力,并确证了 TLR4是介导这2种多糖的受体。1.体外实验表明XG和MP-A均具有免疫调节活性,能够下调LPS活化的炎症因子NO、TNF-α、白介素（IL）或前列腺素2 （PGE2）等的表达。同时XG和MP-A具有增强巨噬细胞吞噬FITC-dextin功能的作用,表现出一定的免疫原性。暗示了 XG和MP-A可能具有双向调控的作用,同时说明炎症因子和吞噬功能可能是由不同的机制引起。2.初步确定了 XG和MP-A均可并由胞外TLR4受体识别,通过调节下游的丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）的磷酸化与核转录因子NF-κB的活化和核移位等方式完成胞内信号传导而发挥药理学作用。3.XG和MP-A下调活化的巨噬细胞炎症因子,同时可以抑制TLR4通路中的MAPK和NF-κB相关蛋白,表现出较强的抗炎活性,可用于炎性疾病治疗药物的开发。我们认为XG和MP-A可通过与LPS竞争性结合TLR4蛋白,抑制了 TLR4下游胞内信号主要是MAPK通路中的ERK和JNK蛋白的磷酸化而发挥抗炎的功能。这与研究报道的另外两种β-葡聚糖LNT-S和BBG结果一致,暗示了 D-葡聚糖结构可能是其生物学活性的必需基团。创新性和结论1.本文我们首次研究了 XG和MP-A体外免疫调节活性,研究了它们对巨噬细胞炎症因子的表达,吞噬功能,以及胞内相关蛋白表达的影响。2.首次通过SPR技术研究了 XG和MP-A分别和常见受体dectin-1、TLR4和TLR2的亲和力。首次确证了这XG和MP-A细胞表面受体为TLR4。3.首次考察了 XG和MP-A通过TLR4受体的胞内信号传导途径,进一步证实二者是通过调节下游的丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）的磷酸化与核转录因子NF-κB的活化和核移位等方式完成胞内信号传导而发挥抗炎药效,为XG和MP-A用于治疗炎性疾病的提供新见解。
邵晨[6]（2016）在《糖纳米粒子的制备新方法及其在糖—蛋白相互作用研究中的应用》文中提出糖类通过与蛋白质等分子的相互作用,在生物体内的一系列正常生命活动和病理变化中发挥着至关重要的识别和调节作用。由于单独的糖分子与其他生物分子的相互作用一般非常微弱,对糖参与的相互作用研究需要借助具有“糖簇效应”的工具进行。将糖分子修饰于纳米粒子（nanoparticle,NP）表面形成的糖纳米粒子是一种备受关注的糖簇结构研究工具,它将“糖簇效应”与各种纳米粒子的理化性征结合了起来,在糖生物学及生物医学等领域已得到了广泛的应用。随着糖纳米粒子应用范围不断扩展,开发出通用性好,操作简便,可拓展性强的糖纳米粒子制备方法对于扩大糖纳米粒子的应用范围,提升其应用潜力具有非常重要的意义。为此,我们基于全氟苯基叠氮化合物（PFPA）的光照插入反应和多巴胺的氧化自聚合反应开发了两种适用范围广、可操作性及可扩展性强的糖纳米粒子制备方法,进一步地,我们将所制备的糖纳米粒子在糖与蛋白的相互作用检测,癌细胞靶向成像以及靶向抗癌等方面进行了应用研究。本论文内容主要包括以下两个方面:一、利用光照插入反应制备糖纳米粒子并用于糖-蛋白相互作用研究PFPA在紫外光照射或加热条件下可转化为具有高反应活性的氮烯,理论上可以插入任何含C-H、N-H或C=C键的化合物,形成新的共价键。我们利用PFPA的光照插入反应将炔基引入到葡聚糖或聚乙烯醇（PVA）包被的氧化铁纳米粒子表面,并计算得修饰到葡聚糖纳米粒子表面的炔基量为1.22 mmol/g NPs;修饰到聚乙烯醇纳米粒子表面的炔基量为1.56 mmol/g NPs;在此基础上,利用炔基与叠氮基的“点击反应”分别制备了半乳糖修饰的葡聚糖纳米粒子、甘露糖修饰的聚乙烯醇纳米粒子、半乳糖修饰的聚乙烯醇纳米粒子以及罗丹明-半乳糖荧光纳米粒子。DLS分析显示所制备的各种糖纳米粒子的平均粒径在300-600 nm之间。我们采用石英晶体微天平（QCM）技术分别研究了上述三种糖纳米粒子与伴刀豆球蛋白A（Con A）,花生凝集素（PNA）,galectin-9以及Jurkat细胞、KM12细胞的相互作用。结果显示该方法所制备的糖纳米粒子与相应凝集素之间具有很好的特异性相互作用。罗丹明-半乳糖荧光纳米粒子则用于对人肝肿瘤HepG2细胞的靶向荧光成像研究。HepG2细胞的细胞膜上过量表达能特异性结合半乳糖及乳糖的非唾液酸糖蛋白受体（ASGP-R）。通过激光共聚焦显微镜和流式细胞仪的观察和分析,证实了罗丹明-半乳糖荧光纳米粒子可用于对HepG2细胞的靶向荧光成像。二、利用多巴胺自聚合反应制备载药糖纳米粒子并用于靶向抗癌研究在碱性溶液中并有氧存在时,多巴胺可以在多种固体界面发生自聚合反应形成聚多巴胺,聚多巴胺表面可通过其富含的邻苯二酚基团与氨基或巯基化合物通过席夫碱反应或迈克尔加成反应来进行改性修饰。在这部分工作中,我们在光敏剂金丝桃素存在的情况下使多巴胺在纳米粒子表面进行聚合,使得金丝桃素被“包裹”进纳米粒子表面的聚多巴胺层中,之后在有氧环境中加入氨基化的乳糖,将乳糖分子修饰在纳米粒子表面,制得了载金丝桃素乳糖纳米粒子。TEM和红外光谱分析证明了聚多巴胺包被纳米粒子的成功以及金丝桃素负载的成功;通过UV-Vis分析计算出糖纳米粒子中金丝桃素的负载量为33.1μg/mg NPs;通过DLS分析得知所制糖纳米粒子的平均粒径为546 nm。金丝桃素是一种高效光敏剂,在600 nm光照下可被激发产生活性氧,致细胞受损乃至死亡。然而,金丝桃素极差的水溶性制约了它在生物医药领域的应用。在此,我们将水分散性良好的载金丝桃素乳糖纳米粒子用于对HepG2细胞的靶向光动杀伤研究。细胞摄入研究结果显示糖纳米粒子对HepG2细胞具有靶向性;光照条件下纳米粒子在细胞内产生活性氧情况的研究以及细胞毒性研究结果则说明载金丝桃素乳糖纳米粒子可通过光动效应靶向地杀伤HepG2细胞。
李平利[7]（2014）在《硫酸化可德兰多糖的制备、体外免疫调节、抗乙肝病毒感染活性及体内用作乙肝疫苗佐剂研究》文中进行了进一步梳理研究目的乙肝病毒（hepatitis B virus, HBV）感染可以造成急慢性肝脏疾病,如病毒性肝炎、肝硬化及肝癌等,是危害人类健康的主要病因。我国HBV携带者约占全国总人口的10%,是乙型肝炎的高发区。目前临床使用抗HBV感染的典型药物有拉米夫定和α-干扰素,但是存在容易诱发病毒耐药突变以及副作用较多的问题,限制了疗效的发挥。HBV感染能够破坏机体免疫平衡,导致机体抗病毒免疫功能低下或紊乱,因此,抑制HBV感染需要激活机体抗病毒免疫应答。给易感人群接种乙肝疫苗是预防HBV感染的有效手段,但是仍有5%-10%的人接种后抗体水平很低或者无应答。铝佐剂是目前唯一可以用于乙肝疫苗的佐剂,虽然较安全,但是因其不能引起机体细胞免疫应答,使疫苗在预防和治疗HBV感染方面存在一定的不足,因而研制新型乙肝疫苗佐剂尤为重要。可德兰多糖（curdlan）是由产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）发酵产生的一种胞外多糖,具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎、抗凝血等活性,因其安全无毒且加热可成凝胶,被FDA批准用于食品工业。研究发现,curdlan硫酸化产物—硫酸化可德兰（curdlan sulfate）具有良好的抗HIV活性,并已对其开展Ⅱ期临床试验。鉴于curdlan和curdlan sulfate二者良好的免疫调节及抗病毒活性,我们期望通过本课题研究能够得到一种具有抗病毒感染作用的免疫调节剂,能够在免疫治疗方面发挥抗HBV感染的作用,同时还能增强重组乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen, HBsAg）的免疫原性,改善疫苗在预防和治疗HBV感染方面的应用。通过研究curdlan sulfate对小鼠免疫相关细胞的影响,考察其体外免疫调节活性,采用表面等离子共振（surface plasmon resonance, SPR）技术研究其结合的受体；利用HepG2.2.15细胞上清液浓缩得到的HBV感染HepG2及HepaRG细胞,研究curdlan sulfate是否可以干扰病毒感染细胞的过程,并用SPR技术研究多糖与重组HBsAg的结合情况；最后,将curdlan sulfate与重组HBsAg联合注射BALB/c小鼠,研究其能否增强疫苗的免疫原性,提高产生的抗体水平。本课题研究将为curdlan sulfate开发成为一种新型抗HBV的免疫预防及治疗剂提供重要的依据和基础。研究方法1Curdlan sulfate的制备及结构表征首先我们采用DMSO为溶剂、SO3-吡啶为硫酸化试剂,对curdlan进行修饰。通过控制反应温度,制备出四种curdlan sulfates。采用红外光谱分析技术鉴定所制备样品结构,凝胶渗透色谱-多角度激光散射（GPC-MALLS）联用技术测定重均分子量（Mw）,元素分析仪测定硫（S）含量。2Curdlan sulfate体外免疫调节活性及机制的研究分离小鼠脾淋巴细胞,采用MTT法测定curdlan sulfate对其增殖的影响。采用小鼠RAW264.7细胞系,研究curdlan sulfate对巨噬细胞活化的作用,包括：用细胞吞噬中性红和FITC-dextran实验来分析其对巨噬细胞吞噬功能的影响；Griess试剂法测定RAW264.7细胞经curdlan sulfate作用后产生NO的水平；ELISA试剂盒测定curdlan sulfate对RAW264.7分泌IL-6、IL-1β及TNF-α细胞因子的影响；iNOS、IL-6、IL-1β和TNF-a的mRNA水平采用荧光定量PCR （FQ-PCR）进行分析。分离并培养小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDCs）,采用流式细胞术检测curdlan sulfate对BMDCs表面成熟标志分子表达的影响。机制研究采用Westernblot实验检测RAW264.7细胞中丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）途径相关蛋白的表达以及NF-κB的活化情况,并运用SPR技术分析curdlan sulfates与小鼠重组dectin-1的结合情况。3Curdlan sulfate体外抗HBV感染活性及机制的研究采用PEG8000对HepG2.2.15细胞上清液进行浓缩得到HBV,用其感染HepG2及HepaRG细胞。采用FQ-PCR测定受感染细胞中HBV DNA的含量来考察curdlan sulfate对HBV黏附及入胞过程的影响；用HBsAg及HBeAg ELISA试剂盒检测受感染细胞培养第7d的细胞上清中HBsAg及HBeAg的含量,来考察curdlan sulfate对HBV感染细胞的影响；采用氯酸钠及硫酸乙酰肝素酶（HPA）处理HepG2及HepaRG细胞,用FQ-PCR检测HBV感染细胞的情况,并进一步用SPR技术分析curdlan sulfates与重组HBsAg的结合情况,探讨硫酸根在curdlansulfate与HBsAg结合中的作用,并进一步分析其作用机制。4Curdlan sulfate体内用作乙肝疫苗佐剂的研究Curdlan sulfate与重组HBsAg联合免疫BALB/c小鼠,于第0、14、28d共接种3次,第35d取小鼠脾淋巴细胞,采用流式细胞仪检测脾淋巴细胞巨噬细胞募集和树突状细胞成熟、CD4+、CD8+分群以及CD4活化情况；取小鼠脾淋巴细胞进行体外培养并用HBsAg再刺激,测定其增殖能力以及分泌IFN-γ、IL-17A、 IL-4、IL-10的水平；流式细胞术胞内染色法分析小鼠脾淋巴细胞中Th1、Th2及Th17类细胞因子的胞内表达情况。另外,在每次免疫后7d收集小鼠血清,用anti-HBs ELISA试剂盒测定血清中抗体的含量,并用间接ELISA方法测定anti-HBs免疫球蛋白亚型IgG1、IgG2a的含量,分析小鼠产生的免疫应答类型。研究结果1Curdlan sulfate的制备及结构表征通过控制反应条件,共制备了四种不同分子量及S含量的curdlan sulfates,分别命名为CS1、CS2、CS3及CSⅢ。红外光谱检测结果显示,curdlan sulfates在curdlan原有特征吸收峰基础上,在1258cm-1及816cm-1附近处出现了不对称S=O的伸缩振动峰及对称C-O-S的伸缩振动峰,说明curdlan已被成功硫酸化修饰。CS1、CS2、CS3和CSIII的Mw经GPC-MALLS测定为25.87kDa、87.03kDa、171.9kDa和62.54kDa,S含量分别为（4.806±0.30）%、（6.288±0.03）%、（9.340±0.16）%和（7.312±0.11）%。由于CS3含有最高的S含量,下面的活性检测均采用CS3样品进行实验。2CS3体外免疫调节活性与MAPKs途径有关CS3促进小鼠细胞脾淋巴细胞增殖效果显着,在400μg/mL时增殖率达到85.87%,但对RAW264.7细胞的增殖没有明显作用。CS3能增强RAW264.7吞噬中性红及FITC-dextran的能力,显着提高细胞产生NO、IL-6、IL-1β及TNF-α的水平,而且对细胞中iNOS、IL-6、IL-1β和TNF-a mRNA的水平也有一定的提高,并呈剂量依赖性。另外,CS3可促进BMDCs上调表达MHCⅡ、CDllc、 CD40、CD80、CD86分子,产生IL-12和IL-6,刺激细胞成熟。Western blot结果显示CS3可以通过促进MAPKs途径中Erkl/2和SAPK/JNK的磷酸化来传递信号,活化NF-κB,提高iNOS的表达。SPR技术表明curdlan sulfates可以与curdlan已知受体dectin-1结合,说明curdlan经硫酸化修饰后主要受体并未改变。3CS3可以抑制HBV感染的黏附过程FQ-PCR结果显示,CS3可以抑制HBV与HepG2及HepaRG细胞的黏附,500μg/mL时的抑制率为分别52.06%、50.43%；HBV感染细胞后上清中HBsAg及HBeAg的测定结果表明,CS3可以抑制HBV对细胞的感染。CS3对黏附过程的抑制率远高于其对HBV感染细胞的抑制率,说明CS3抗HBV感染的作用阶段主要是干扰病毒黏附入胞过程,而不是干扰病毒DNA复制等过程。氯酸钠和HPA作用的细胞不表达或低表达硫酸乙酰肝素（HS）,用HBV感染分别经氯酸钠和HPA处理后的HepG2细胞,发现病毒感染水平分别降低为阴性对照的（11.44±2.30）%和（57.17±0.79）%；感染经二者处理后的HepaRG细胞,感染率分别降低为阴性对照的（9.86±2.29）%和（49.70±±16.07）%。SPR技术分析发现curdlan sulfates可以与重组HBsAg结合,并且硫酸根含量越高,亲和力越强,提示CS3可能与HBV包膜蛋白结合,干扰HBV入胞。4CS3可以增强重组HBsAg免疫原性流式细胞术检测经3次免疫接种后的小鼠脾淋巴细胞结果表明,CS3联合重组HBsAg免疫小鼠,可以促进巨噬细胞在脾脏中的募集,F4/80阳性细胞数增加,占脾淋巴细胞总数的（34.27±±3.47）%,明显高于商品HB疫苗（HB vaccine）组（**p<0.01）；同时可以刺激树突状细胞的成熟,使细胞高表达MHCⅡ、CD11c、CD40和CD86分子；CD4+及CD8+T细胞亚群在脾淋巴细胞中的比例明显升高,与HB vaccine相比有显着性差异（*p<0.05）,且CD4+CD69+细胞数与单独注射HBsAg相比有显着性增加；分离小鼠脾淋巴细胞进行HBsAg体外再刺激,发现经CS3作用的小鼠脾细胞增殖能力增强,分泌Th1类型细胞因子IFN-y的量明显高于HB vaccine组（**p<0.01）,CS3在高剂量时可以促进Th2类型细胞因子IL-4和IL-10的产生,但在低、中剂量时则作用不明显甚至有一定的抑制作用,而对Thl7类细胞因子IL-17A则没有明显作用；采用流式细胞术分析胞内Thl及Th2类细胞因子蛋白的表达情况与细胞上清中测定结果一致。小鼠血清中anti-HBs检测结果显示,CS3可以明显提高HBsAg产生的anti-HBs水平,高剂量组要明显优于HB vaccine组。Anti-HBs免疫球蛋白亚型IgGl的水平经CS3作用后下降,IgG2a的水平显着升高,且Ig2a/IgG1的值与HB vaccine组相比明显升高（*p<0.05）,说明CS3用作HBsAg佐剂可以使机体免疫类型向Thl方向发展。创新性和结论（1）首次采用DMSO/SO3吡啶反应体系,制备了不同Mw和S含量的curdlan sulfates,此法安全方便,毒性较低,并且所得样品的Mw和S含量随反应温度的升高而降低。（2）首次研究了curdlan sulfate的体外免疫调节活性,样品CS3可以促进小鼠脾淋巴细胞增殖、RAW264.7细胞活化及BMDCs成熟。（3）首次采用SPR技术研究了curdlan sulfate与curdlan已知受体dectin-1的结合情况,确定dectin-1是curdlan sulfate的主要受体,明确CS3发挥体外免疫调节活性的机制是通过与免疫细胞表面dectin-1受体结合,激活MAPKs信号通过中的Erkl/2和SAPK/JNK途径,导致NF-κB向核内移位,调节相关基因的转录。（4）首次研究了curdlan sulfate体外抗HBV感染的活性,发现CS3可以抑制HBV感染HepG2和HepaRG细胞,并且主要是干扰HBV黏附细胞的过程。（5）采用氯酸钠、HPA处理HepG2和HepaRG细胞发现HS在HBV感染细胞过程中发挥一定的作用,借助SPR技术研究curdlan sulfates与重组HBsAg的结合能力,提示CS3发挥体外抗HBV感染活性的机制可能是通过与HBV包膜蛋白结合,干扰HS-HBV的相互作用,影响HBV与靶细胞的黏附和融合。（6）首次进行了curdlan sulfate用作乙肝疫苗佐剂的研究,CS3可以提高重组HBsAg的免疫原性,增强小鼠机体的免疫水平,提高血清中抗体滴度,并且主要诱导机体免疫应答向Thl型发展。
赵镭[8]（2012）在《新型人类免疫缺陷病毒相关抑制剂及糖肽的设计合成》文中研究表明人类获得性免疫缺陷综合症（艾滋病）是危害人类健康的主要杀手之一，全球有近三千多万人感染艾滋病。基础的免疫学方法在应对艾滋病治疗中很难取得突破，因此，研究HIV表面的蛋白质糖基化与设计病毒的抑制剂显得尤为重要。在HIV的侵染过程中，病毒表面的糖起到了重要的识别作用。本论文首先研究了人类免疫缺陷病毒HIV表面包膜糖蛋白gp120的糖单元，合成了gp120表面核心甘露三糖修饰的单价及多价糖－环肽缀合物。通过表面等离子共振的方法，研究糖与蛋白质的相互作用。这种相互作用揭示了HIV表面糖与目标蛋白之间存在着强烈的“糖簇作用”，为HIV的识别功能提供了理论基础。此外，在设计HIV膜融合抑制剂方面，我们先后提出了基于C34为识别多肽的识别－共价偶联与识别－切割策略。识别－共价偶联策略通过将膜蛋白gp41中保守盐桥Lys574－Asp632的电荷作用替换成共价偶联作用，实现了抑制的不可逆过程，其中共价偶联利用了修饰的异硫氰基（NCS）与游离氨基的亲和反应。识别－切割策略使用cyclen络合金属离子作为切割基团，通过对C34进行修饰后靠近目标蛋白并最终将目标蛋白水解。这两种策略均弥补了目前多肽类抑制剂功能单一的缺点，为设计多功能抑制剂分子打下了良好的基础。另外，为了提高目前多肽抑制剂的抑制活性，本论文通过在NHR与CHR之间增加新的盐桥作用，从而增强抑制剂的抑制效果。研究中发现，gp41中的I646K突变可以形成新的盐桥。当分子修饰了胆固醇以后，我们设计的抑制剂比已报导抑制效果最高的抑制剂有更强的抑制作用。由于HIV多肽类抑制剂的合成要基于多肽合成领域的发展，因此在合成方法学方面我们进行了化学连接方法（chemical ligation）的探索。合成了新型的连接辅助基团及带有新型辅助基团的多肽，有望发展成多肽化学连接的新方法。并且，我们研究了化学连接中硫酯的合成，研究了一种低成本的硫酯合成策略，高效高纯度的合成了目标硫酯。
谢桂煌[9]（2011）在《HIV假病毒的构建及抗HIV药物SPR、ELRSE筛选方法的建立》文中认为随着人类对艾滋病致病机制的深入研究,越来越多新的抗HIV药物进入临床试验阶段,但大量抗HIV药物的使用也导致了耐药性问题的出现。因此,建立高通量快速的抗HIV药物初步筛选平台对于研究新的抗HIV药物非常重要。针对传统抗HIV药物细胞水平筛选模型对实验室条件要求高,并且具有较高危险性等缺点,本论文通过构建HIV假病毒和应用体外药物靶向筛选方法来研究抗HIV药物的初步筛选,以建立快速方便且危险性较低抗HIV药物筛选和评价系统,用于新的抗HIV药物的开发。主要的研究内容如下：（1）构建HIV假病毒,为进一步建立基于HIV假病毒的抗HIV药物筛选细胞模型提供基础。实验过程中成功构建出了具有感染活性的HIV假病毒。但由于其感染活性较低,尚不能应用于抗HIV药物的筛选。需要进一步对假病毒构建的实验过程进行优化,以提高假病毒的感染活性,（2）利用SPR技术,建立抗HIV药物的筛选和分析方法,获得不同样品对HIV包膜蛋白rgp120 MN结合能力和平衡解离常数等数据,得出三个多糖样品中Za24-70-5-1002#与rgp120 MN的结合作用非常明显。动力学／亲和分析结果显示,Za24-70-5-1002#与rgp120 MN之间平衡解离常数KD（M）为1.172E-13M。两者之间具有很高的亲和力,因此Za24-70-5-10023可能具有较高的抗HIV活性,有必要对其药理作用进行进一步的研究。Za48-70-×100 J与rgp120 MN之间也具有比较好的亲和性,它们之间的平衡解离常数KD（M）为5.752E-6M。（3）应用ELISA法建立抗HIV药物初步筛选方法,以细胞表面受体CD4作为研究靶位,研究多糖样品对gp120与CD4结合的抑制作用。通过实验测得13个不同样品对gp120与CD4结合的抑制效果,计算出不同样品对gp120与CD4结合抑制的IC5o值,得到不同样品的IC5o值在1.150μg/mL之间。为进一步的药物筛选和分析提供依据。
韩章润[10]（2011）在《多糖荧光标记及运用糖芯片研究糖与蛋白相互作用》文中认为碳水化合物及其与蛋白质或脂类连接形成的糖化合物广泛地存在于生物体中,在生命活动中具有非常重要的意义。细胞表面的糖化合物不仅在正常细胞的识别、细胞黏附和细胞间信号传导等方面具有重要作用,而且在细胞病变、病原感染等病理过程中起到了关键作用。糖芯片是近年来新起的研究糖和蛋白作用的的生物检测技术,因其具有用量少、通量高、灵敏快速及信息量大等优点,已成为推动糖组学研究的强有力工具。多糖芯片是碳水化合物芯片的研究一个重要领域,构建多糖芯片平台无论是用于糖组学研究还是药物开发都是非常有必要的。利用实验室多年来从事的研究海洋多糖分离和提取鉴定等工作基础,在海洋糖库丰富的多糖基础上开展多糖芯片的研究。我们选择标记化学上最常用的标准荧光素异硫氰酸荧光素（FITC）及其衍生物（胺基荧光素,AF）,具有一样的荧光发色基团,可以使用同一仪器在同一激发发射波长检测。分别使用EDC/NHS介导的胺基荧光素对含有糖醛酸的多糖进行标记；二丁基二月桂酸锡（DBTD）催化的异硫氰酸荧光素多糖羟基标记；针对多糖还原端醛基的还原胺化异硫氰酸荧光素标记；选择了34种多糖,成功对不同类型,不同结构,物理化学性质不同的多糖,分别针对多糖羧基,羟基,还原端醛基成功进行了荧光标记,控制标记率在0.4%～2%。分离纯化标记多糖,经过相应的荧光定量和糖含量定量,使用芯片点样仪器将其点印在硝酸纤维素薄膜芯片上制备成荧光标记多糖芯片,利用硝酸纤维素薄膜的空间网状结构和吸附负电荷等特点来固定多糖,经过为减少非特异性的结合降低杂交背景的清洗步骤,多糖会有部分糖链暴露出来,漂浮在硝酸纤维素薄膜上面,和被各种形式的多糖所覆盖的细胞表面类似,可以和蛋白结合以验证其生物活性,这时多糖上标记的荧光探针就可以作为该多糖经过清洗后在芯片上保留量的指示。测多糖荧光探针就可以获知不同多糖在清洗前后的量的差别,即不同多糖的保留率,为糖与蛋白结合后信号的强度对比提供依据。制备了糖胺聚糖多糖芯片,选择与部分糖胺聚糖糖链相互作用的蛋白CS-56来验证荧光标记多糖芯片的可行性,实验发现,CS-56可以结合硫酸软骨素C,硫酸软骨素D,硫酸软骨素A。同过计算保留率和芯片上显示的信号强度,科学比较了CS-56结合能力大小是,硫酸软骨素C>硫酸软骨素D>硫酸软骨素A,不识别硫酸软骨素B,肝素和硫酸乙酰肝素。综上所述,本文系统的研究了多糖的荧光标记,针对不同多糖,选用不同的荧光标记方法标记了34种不同结构的多糖,将荧光标记多糖成功运用于糖芯片研究,即将这些标记后的多糖点印在硝酸纤维素薄膜上制成多糖芯片,利用其荧光强度变化可以获知多糖在硝酸纤维素薄膜上的保留率,从而解决了多糖点印在芯片上经过洗脱前后无法定量这一难题。选择硫酸软骨素抗体CS-56来进行糖与蛋白结合实验,验证了荧光标记多糖制成糖芯片后从事糖与蛋白作用的可行性,制备30多糖样品高密度芯片,初步筛选出能与结缔组织生长因子（Connective Tissue growth factor）相互作用的多糖。为多糖芯片应用于糖组学研究和糖药物的活性筛选提供了方法学参考。
二、利用SPR研究海洋硫酸多糖911与GP120-V3区的相互作用特性—基于一种新的多糖在芯片表面的固定方法（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、利用SPR研究海洋硫酸多糖911与GP120-V3区的相互作用特性—基于一种新的多糖在芯片表面的固定方法（论文提纲范文）
（1）原核生物Argonaute（pAgo）蛋白介导细菌基因组编辑及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 第一章 前言 |
| 1.1 研究问题的由来 |
| 1.2 细菌经典遗传操作系统 |
| 1.2.1 转座酶系统 |
| 1.2.2 位点特异性重组系统 |
| 1.2.3 同源重组系统 |
| 1.3 基于新型基因编辑技术的细菌遗传操作系统研究进展 |
| 1.3.1 基于CRISPR/Cas9 基因编辑技术的细菌遗传操作系统研究进展 |
| 1.3.2 基于碱基编辑器的细菌遗传操作系统研究进展 |
| 1.4 原核生物Ago(pAgo)蛋白的研究进展 |
| 1.4.1 Ago蛋白概述 |
| 1.4.2 Ago蛋白介导RNA干扰 |
| 1.4.3 pAgo蛋白的DNA水解酶活性 |
| 1.4.4 pAgo蛋白在基因编辑中的应用 |
| 第二章 研究目的及意义 |
| 第三章 材料和方法 |
| 3.1 质粒、菌株及其培养条件 |
| 3.2 主要试剂耗材 |
| 3.3 实验仪器 |
| 3.4 培养基配制 |
| 3.5 主要试剂配制 |
| 3.5.1 主要缓冲液 |
| 3.5.2 蛋白表达及纯化试剂 |
| 3.5.3 SDS-PAGE及 Western Blot相关试剂 |
| 3.5.4 IP及 Chip实验试剂 |
| 3.6 引物设计及基因合成 |
| 3.7 NgAgo系统能否介导大肠杆菌靶基因缺失的研究 |
| 3.7.1 大肠杆菌aste基因敲除的相关质粒的构建 |
| 3.7.2 NgAgo能否介导大肠杆菌aste基因缺失的检测 |
| 3.8 NgAgo介导细菌基因敲除是否依赖g DNA靶向的DNA酶活性的研究 |
| 3.8.1 DNA酶活性位点突变的NgAgo相关质粒的构建 |
| 3.8.2 DNA酶活性位点突变的NgAgo能否介导GX-PM基因缺失的检测 |
| 3.8.3 T7E1 方法检测NgAgo蛋白的DNA酶活性 |
| 3.8.4 不引入外源g DNA时 NgAgo能否介导GX-PM靶基因缺失的检测 |
| 3.8.5 NgAgo介导细菌靶基因敲除是否依赖提高同源重组效应的检测 |
| 3.9 NgAgo提高同源重组效率的机制研究 |
| 3.9.1 NgAgo蛋白两端融合Flag标签是否影响其介导基因缺失的检测 |
| 3.9.2 应用IP偶联质谱方法鉴定NgAgo在细菌中的互作蛋白 |
| 3.9.3 Co-IP检测NgAgo蛋白与细菌内源性recA的互作 |
| 3.9.4 Co-IP检测DNase I处理后NgAgo蛋白与recA的互作 |
| 3.9.5 重组蛋白recA及 NgAgo的原核表达质粒的构建 |
| 3.9.6 重组蛋白recA及 NgAgo的表达及纯化 |
| 3.9.7 重组蛋白NgAgo与 recA互作的检测 |
| 3.9.8 SPR方法检测重组蛋白NgAgo与 recA的互作亲和力 |
| 3.9.9 EMSA方法检测NgAgo蛋白能否增加recA蛋白与ss DNA的结合 |
| 3.9.10 NgAgo蛋白能否增强recA蛋白介导的DNA链交换能力的检测 |
| 3.9.11 Chip-q PCR方法检测NgAgo蛋白能否增加recA与细菌内同源靶序列的结合 |
| 3.10 NgAgo介导细菌基因组编辑的主要结构域的相关研究 |
| 3.10.1 NgAgo蛋白的截短体能否介导GX-PM靶基因缺失的检测 |
| 3.10.2 NgAgo不同截短体能否与recA互作的检测 |
| 3.10.3 DNA酶活性位点突变的NgAgo蛋白C端能否介导细菌靶基因缺失的检测 |
| 3.10.4 DNA酶活性位点突变的NgAgo蛋白C端与recA互作的检测 |
| 3.10.5 DNA酶活性位点突变的NgAgo蛋白C端能否增强recA介导的同源重组效率的检测 |
| 3.10.6 NgAgo蛋白MID及 PIWI结构域介导GX-PM靶基因缺失的检测 |
| 3.10.7 NgAgo蛋白MID及 PIWI结构域与recA互作的检测 |
| 3.11 不同原核生物Ago蛋白能否介导细菌基因组编辑的相关研究 |
| 3.11.1 不同pAgo蛋白介导GX-PM靶基因缺失相关质粒的构建 |
| 3.11.2 不同pAgo蛋白能否介导GX-PM菌株靶基因缺失的检测 |
| 3.11.3 不同pAgo蛋白能否与细菌recA互作的检测 |
| 3.11.4 DNA酶活性位点突变的pAgo蛋白相关质粒的构建 |
| 3.11.5 DNA酶活性位点突变的pAgo能否介导细菌基因缺失的检测 |
| 3.11.6 DNA酶活性位点突变的pAgo与细菌recA互作的检测 |
| 3.12 数据统计分析 |
| 第四章 结果与分析 |
| 4.1 NgAgo介导不同细菌靶基因的敲除 |
| 4.1.1 敲除大肠杆菌aste基因的相关质粒的构建 |
| 4.1.2 NgAgo介导大肠杆菌aste基因的缺失 |
| 4.2 NgAgo介导细菌基因缺失不依赖自身DNA酶活性及外源g DNA |
| 4.2.1 NgAgo蛋白的DNA酶活性位点突变质粒的构建 |
| 4.2.2 NgAgo介导细菌靶基因缺失不依赖自身DNA酶活性 |
| 4.2.3 NgAgo介导细菌靶基因缺失不依赖外源g DNA |
| 4.2.4 NgAgo介导细菌靶基因敲除依赖于提高同源重组效应 |
| 4.3 NgAgo增强recA介导的同源重组效率 |
| 4.3.1 NgAgo蛋白两端融合Flag标签不影响其介导细菌靶基因缺失 |
| 4.3.2 细菌中NgAgo互作蛋白的鉴定分析 |
| 4.3.3 NgAgo蛋白与细菌内源性recA互作 |
| 4.3.4 NgAgo蛋白与内源性recA蛋白互作不受DNase I的影响 |
| 4.3.5 重组蛋白recA及 NgAgo表达质粒的构建 |
| 4.3.6 重组蛋白recA及 NgAgo的纯化 |
| 4.3.7 重组蛋白NgAgo与 recA直接互作 |
| 4.3.8 重组蛋白NgAgo与 ErecA互作亲和力的分析 |
| 4.3.9 重组蛋白NgAgo与 PmrecA互作亲和力的分析 |
| 4.3.10 NgAgo蛋白并不能显着增加recA蛋白与ss DNA的结合 |
| 4.3.11 NgAgo蛋白能显着增强recA蛋白介导的DNA链交换能力 |
| 4.3.12 NgAgo蛋白能显着增加recA与细菌内同源靶序列的结合 |
| 4.4 NgAgo介导细菌基因组编辑的主要结构域的鉴定 |
| 4.4.1 C端是NgAgo介导细菌基因缺失的主要区域 |
| 4.4.2 NgAgo蛋白C端介导不同细菌基因缺失不依赖自身DNA酶活性 |
| 4.4.3 DNA酶活性位点突变的NgAgo蛋白C端同样显着增强recA介导的同源重组效应 |
| 4.4.4 PIWI结构域是NgAgo介导细菌基因组编辑的主要结构域 |
| 4.5 原核生物Ago蛋白均能介导细菌基因组编辑且不依赖DNA酶活性 |
| 4.5.1 不同pAgo蛋白介导细菌基因缺失相关质粒的构建 |
| 4.5.2 不同pAgo蛋白介导细菌靶基因的缺失 |
| 4.5.3 不同pAgo蛋白与细菌recA互作 |
| 4.5.4 不同pAgo蛋白的DNA酶活性位点突变质粒的构建 |
| 4.5.5 不同pAgo介导细菌基因组编辑不依赖自身DNA酶活性 |
| 4.5.6 DNA酶活性位点突变的Tt Ago蛋白与细菌recA互作 |
| 4.5.7 DNA酶活性位点突变的Aa Ago蛋白与细菌recA互作 |
| 第五章 讨论 |
| 5.1 pAgo介导细菌基因组编辑的机制 |
| 5.2 pAgo作为细菌遗传操作工具的优势 |
| 5.3 pAgo蛋白应用前景的展望 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 附录三 |
| 附录四 |
| 个人资料 |
| 致谢 |
（2）金催化剂的绿色制备及致病菌表面含有甘油-D-甘露庚糖的寡糖抗原的合成研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 糖芯片 |
| 1.2.1 使用糖芯片分析糖-凝集素的相互作用 |
| 1.2.2 糖芯片作为免疫学研究的工具 |
| 1.2.3 糖芯片在诊断中的应用 |
| 1.3 糖类疫苗 |
| 1.3.1 针对传染性疾病的糖类疫苗 |
| 1.3.2 糖的抗癌疫苗 |
| 1.4 糖蛋白在免疫学研究中的展望 |
| 1.5 金的相关介绍 |
| 1.6 细菌表面糖的研究 |
| 1.7 细菌脂多糖和荚膜多糖上的庚糖 |
| 1.8 甘油-D-甘露庚糖的合成方法 |
| 1.8.1 以甘露糖为原料合成甘油-D-甘露庚糖 |
| 1.8.2 以D-核糖为原料合成甘油-D-甘露庚糖 |
| 1.8.3 以来苏糖为原料合成L-甘油-D-甘露庚糖 |
| 1.8.4 基于简单原料从头合成L-甘油-D-甘露庚糖 |
| 1.9 我们课题组在庚糖合成上的研究进展 |
| 1.10 论文的选题依据和思路 |
| 第二章 金催化剂的绿色制备研究 |
| 2.1 背景介绍 |
| 2.2 金催化剂绿色制备的相关研究 |
| 2.2.1 设计思路 |
| 2.2.2 新的制备方法的建立以及优化 |
| 2.2.3 新的制备方法的底物扩展 |
| 2.2.4 新的制备方法的应用 |
| 2.3 本章小结 |
| 第三章 幽门螺旋杆菌表面含有D-甘油-D-甘露庚糖的三糖抗原的合成研究 |
| 3.1 幽门螺旋杆菌的相关介绍 |
| 3.2 三糖抗原的逆合成分析 |
| 3.3 目标三糖的合成研究 |
| 3.3.1 路线1的合成探索 |
| 3.3.2 路线2的合成探索 |
| 3.3.3 利用路线3构建七碳骨架 |
| 3.3.4 内酯3-26的合成研究 |
| 3.3.5 化合物3-26的保护基尝试 |
| 3.3.6 1位乙酰基化合物3-33的糖苷化反应研究 |
| 3.3.7 半缩醛3-36的合成及化合物3-38的糖苷化反应研究 |
| 3.3.8 糖基邻炔基苯甲酸酯给体3-42的合成 |
| 3.3.9 糖基邻炔基苯甲酸酯给体3-42的糖苷化反应研究 |
| 3.3.10 单糖砌块受体合成的另一种尝试 |
| 3.3.11 二糖受体3-50的合成 |
| 3.3.12 三糖骨架3-51的合成 |
| 3.3.13 单糖抗原的合成 |
| 3.3.14 二糖抗原的合成 |
| 3.3.15 三糖抗原的合成 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 副溶血性弧菌表面含有L/D-甘油-D-甘露庚糖的三糖抗原的合成研究 |
| 4.1 背景介绍 |
| 4.2 逆合成分析 |
| 4.3 利用双丙叉保护的L-来苏糖来构建L-甘油-D-甘露庚糖(方案一) |
| 4.4 利用多个TBS保护的L-来苏糖来构建L-甘油-D-甘露庚糖(方案二) |
| 4.4.1 TBS保护的L-来苏糖4-10的合成 |
| 4.4.2 化合物4-10进行碳链延伸的尝试 |
| 4.4.3 化合物4-10的结构鉴定 |
| 4.5 化合物3-O-对甲氧基苄基-4,5-O-异丙基-L-来苏糖二乙基二硫缩醛的合成(方案三) |
| 4.6 正交保护的L-甘油-D-甘露庚糖的合成(方案四) |
| 4.6.1 化合物4-17的合成 |
| 4.6.2 化合物4-20的合成 |
| 4.6.3 七碳骨架4-25的合成 |
| 4.6.4 化合物4-25的成环反应尝试 |
| 4.6.5 七碳骨架4-25的修饰尝试 |
| 4.6.6 内酯4-30的合成 |
| 4.6.7 内酯4-30的修饰尝试 |
| 4.6.8 庚糖砌块4-38的合成 |
| 4.7 L-甘油-D-甘露庚糖给体4-42的合成 |
| 4.8 D-甘油-D-甘露庚糖给体4-44的合成 |
| 4.9 二糖4-46的合成 |
| 4.10 二糖受体4-48的合成 |
| 4.11 三糖4-49的合成研究 |
| 4.12 目标三糖抗原4-1的合成 |
| 4.13 本章小结 |
| 第五章 麦氏交替单胞菌表面含有L-甘油-D-甘露庚糖的三糖抗原的合成研究 |
| 5.1 背景介绍 |
| 5.2 选题思路以及逆合成分析 |
| 5.3 糖基给体5-4的合成 |
| 5.3.1 异头位硫苷化合物5-7的合成 |
| 5.3.2 两种糖基给体的合成 |
| 5.4 二糖5-17的合成 |
| 5.5 二糖受体5-18的合成 |
| 5.6 三糖的合成探索 |
| 5.7 二糖脱Bz反应的尝试 |
| 5.8 糖基供体5-2和单糖受体5-21的糖苷化反应探索 |
| 5.9 本章小结 |
| 第六章 全文总结 |
| 第七章 实验部分 |
| 一、金催化剂的绿色制备 |
| 二、幽门螺旋杆菌表面含有D-甘油-D-甘露庚糖的三糖抗原的合成 |
| 三、副溶血性弧菌表面含有L/D-甘油-D-甘露庚糖的三糖抗原的合成研究 |
| 四、麦氏交替单胞菌表面含有L-甘油-D-甘露庚糖的三糖抗原的合成研究 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间已发表论文 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 附录三 |
（3）好氧颗粒污泥中胞外DNA的来源与结构支撑功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 好氧颗粒污泥技术研究进展 |
| 1.1.1 好氧颗粒污泥技术的特点 |
| 1.1.2 好氧颗粒污泥的应用概况 |
| 1.1.3 好氧颗粒污泥的形成与稳定 |
| 1.1.4 影响好氧颗粒污泥形成与稳定性的因素 |
| 1.2 好氧颗粒污泥胞外聚合物研究进展 |
| 1.2.1 EPS对好氧颗粒化的作用 |
| 1.2.2 影响EPS的主要因素及其作用 |
| 1.3 胞外DNA的研究进展 |
| 1.3.1 胞外DNA的来源 |
| 1.3.2 胞外DNA的作用 |
| 1.3.3 胞外DNA的研究方法及宏基因组学 |
| 1.4 本研究的目的和内容 |
| 1.4.1 研究目的 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 1.4.3 技术路线 |
| 第2章 实验材料与分析方法 |
| 2.1 实验材料与污泥样品 |
| 2.1.1 污泥样品 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 液体配制 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 污泥物理特性分析 |
| 2.2.2 不同粒径好氧颗粒污泥中EPS成分含量及分布测量 |
| 2.2.3 高效提取胞内DNA和胞外DNA |
| 2.2.4 污泥宏基因组测序与分析 |
| 2.2.5 DNase I消解实验及扩展DLVO理论应用 |
| 第3章 好氧颗粒污泥中胞外DNA的来源分析 |
| 3.1 序列统计及主成分分析 |
| 3.2 胞外DNA与胞内DNA主要来源分析 |
| 3.3 Bacteroidetes产生胞外DNA的机制分析 |
| 3.4 噬菌体侵染导致Bacteroidetes裂解分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 好氧颗粒污泥胞外DNA的结构支撑作用 |
| 4.1 去除胞外DNA后AGS结构的变化 |
| 4.2 去除胞外DNA后AGS团聚性的变化 |
| 4.3 胞外DNA结构支撑作用的机制分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间相关研究成果 |
（4）基于STAT3抑制作用的中药活性成分筛选及其抗肿瘤恶病质作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一部分 绪论 |
| 1.肿瘤恶病质的发病机制和治疗研究现状 |
| 2.STAT3 激活介导蛋白分解加速与骨骼肌萎缩 |
| 3.肿瘤恶病质的中医药理论基础和临床治疗研究进展 |
| 3.1.肿瘤恶病质的中医药理论基础 |
| 3.2.肿瘤恶病质的中医药临床治疗研究进展 |
| 4.基于靶蛋白的中药活性成分筛选方法 |
| 5.本课题的研究目的、内容和意义 |
| 5.1.研究目的 |
| 5.2.研究内容 |
| 5.3.研究意义 |
| 第二部分 基于STAT3 抑制作用的中药活性成分筛选及验证 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1.主要仪器与试剂 |
| 2.2.主要试剂的配制 |
| 2.3.生物传感芯片偶联STAT3 蛋白 |
| 2.4.STAT3 芯片特异性和亲和力检测 |
| 2.5.STAT3 结合的中药活性成分的筛选 |
| 2.6.STAT3 结合的中药活性成分抑制STAT3 转录水平 |
| 2.7.统计学处理 |
| 3.结果 |
| 3.1.SPR低分子量STAT3 抑制剂筛选体系条件摸索 |
| 3.2.SPR技术筛选与STAT3 结合的中药活性成分 |
| 3.3.SPR动力学验证与STAT3 结合的中药活性成分 |
| 3.4.报告基因法验证中药活性成分对STAT3 转录活性的抑制作用 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第三部分 体内外研究具有抑制STAT3 作用的中药活性成分对骨骼肌萎缩的影响 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1.主要仪器与试剂 |
| 2.2.主要试剂的配制 |
| 2.3.细胞培养与肌管萎缩模型建立 |
| 2.4.CCK-8 法检测肌管活力 |
| 2.5.动物饲养及肿瘤恶病质模型建立 |
| 2.6.动物实验与分组 |
| 2.7.免疫荧光检测 |
| 2.8.Western blot检测 |
| 2.9.实时荧光定量PCR检测 |
| 2.10.苏木精-伊红染色 |
| 2.11.免疫组织化学检测 |
| 2.12.统计学处理 |
| 3.结果 |
| 3.1.C2C12 成肌细胞分化成肌管的进程 |
| 3.2.中药活性成分对肌管细胞活力的影响 |
| 3.3.中药活性成分对肌管萎缩的保护作用比较 |
| 3.4.欧前胡素、隐丹参酮及柴胡皂苷D对肌管萎缩的保护作用 |
| 3.5.欧前胡素、隐丹参酮及柴胡皂苷D对肌管萎缩相关蛋白的影响 |
| 3.6.欧前胡素、隐丹参酮及柴胡皂苷D对STAT3 入核的影响 |
| 3.7.隐丹参酮对肿瘤恶病质小鼠的治疗作用 |
| 3.8.隐丹参酮改善骨骼肌萎缩并抑制肌蛋白降解 |
| 3.9.欧前胡素及柴胡皂苷D对肿瘤恶病质小鼠的治疗作用 |
| 3.10.欧前胡素改善骨骼肌萎缩并抑制肌蛋白降解及STAT3 激活 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第四部分 欧前胡素通过抑制STAT3 活性发挥抗骨骼肌萎缩作用 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1.主要仪器与试剂 |
| 2.2.主要试剂的配制 |
| 2.3.细胞培养 |
| 2.4.病毒的构建及包装 |
| 2.5.病毒感染肌管细胞及实验分组 |
| 2.6.免疫荧光检测 |
| 2.7.Western blot检测 |
| 2.8.病毒感染动物操作及实验分组 |
| 2.9.统计学处理 |
| 3.结果 |
| 3.1.STAT3 过表达诱导肌蛋白降解 |
| 3.2.欧前胡素在STAT3 过表达后对TCM诱导的肌管萎缩的逆转作用 |
| 3.3.欧前胡素在STAT3 过表达后对TCM诱导的E3 泛素连接酶表达影响 |
| 3.4.欧前胡素在 STAT3 过表达后对 CT26 诱导的骨骼肌萎缩的改善作用 |
| 3.5.欧前胡素在STAT3 过表达后对CT26 诱导的E3 泛素连接酶表达影响 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第五部分 欧前胡素通过抑制肿瘤及免疫细胞中STAT3 改善骨骼肌萎缩 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1.主要仪器与试剂 |
| 2.2.主要试剂的配制 |
| 2.3.动物饲养及肿瘤恶病质模型建立 |
| 2.4.动物实验分组及样本收集 |
| 2.5.Western blot检测 |
| 2.6.流式细胞术检测细胞p-STAT3 表达水平 |
| 2.7.CBA法检测血清炎症因子 |
| 2.8.Elisa法检测血清炎症因子 |
| 2.9.实时荧光定量PCR检测肌肉炎症因子 |
| 2.10.细胞培养 |
| 2.11.CT26 与RAW264.7 细胞共培养诱导肌管萎缩操作及分组 |
| 2.12.免疫荧光检测 |
| 2.13.CBA法检测细胞上清炎症因子 |
| 2.14.统计学处理 |
| 3.结果 |
| 3.1.欧前胡素对肿瘤及肿瘤浸润的淋巴细胞中STAT3 激活的影响 |
| 3.2.欧前胡素对肿瘤及肿瘤浸润淋巴细胞释放炎症因子的影响 |
| 3.3.CT26 与RAW264.7 细胞共培养上清对肌管萎缩的影响 |
| 3.4.欧前胡素预处理对CT26 及RAW264.7 细胞共培养上清刺激肌管萎缩的影响 |
| 3.5.欧前胡素预处理对CT26 及RAW264.7 细胞共培养上清中炎症因子的影响 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 结论、创新与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间科研成果及奖励 |
| 致谢 |
（5）两种多糖XG和MP-A作用于细胞表面受体Toll-like receptor 4（TLR4）的免疫药理学效应及胞内信号传导分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 前言 |
| 1 多糖的研究概况 |
| 1.1 多糖的提取与分离 |
| 1.2 多糖的结构分析 |
| 1.3 含葡聚糖结构多糖的药理活性研究 |
| 1.4 含葡聚糖结构多糖的免疫活性与结构关系研究进展 |
| 1.5 分子量与免疫活性的关系 |
| 1.6 含葡聚糖结构多糖免疫活性的分子机制的研究进展 |
| 2 Toll样受体4(TLR4)通路相关多糖的研究进展 |
| 2.1 TLR4通路相关多糖的单糖组成 |
| 2.2 常见TLR4通路相关杂多糖聚合类型 |
| 2.3 常见TLR4通路相关同多糖糖苷键类型 |
| 2.4 TLR4通路相关多糖免疫作用靶标细胞 |
| 2.5 TLR4通路相关多糖与蛋白质相互作用 |
| 2.6 TLR4通路相关多糖研究的小结和展望 |
| 3 TLR4介导的信号通路中潜在的炎症治疗靶点研究进展 |
| 3.1 NF-κB和上游靶标 |
| 3.2 AP-1和上游靶点 |
| 3.3 其他靶标 |
| 3.4 小结 |
| 4 本课题设计思路及拟解决问题 |
| 第二章 黄原胶(XG)体外免疫药理学效应研究 |
| 1 研究背景 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 主要试剂与抗体 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 实验溶液的配制 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 巨噬细胞培养 |
| 3.2 巨噬细胞增殖-毒性检测 |
| 3.3 巨噬细胞形态学观察 |
| 3.4 NO测定 |
| 3.5 典型细胞炎症因子测定 |
| 3.6 Western blot分析 |
| 3.7 RAW 264.7巨噬细胞吞噬功能的测定 |
| 3.8 荧光定量RT-PCR检测炎症因子mRNA水平 |
| 3.9 SPR技术分析XG与TLR4的结合性质研究 |
| 3.10 数据分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 XG对RAW264.7细胞生存或增殖的影响 |
| 4.2 XG对RAW264.7巨噬细胞形态学的影响 |
| 4.3 XG对RAW264.7细胞NO释放的影响 |
| 4.4 XG对RAW264.7细胞吞噬FITC标记的葡聚糖功能的影响 |
| 4.5 XG对RAW264.7细胞产生炎症因子IL-1β,IL-6,and TNF-α的影响 |
| 4.6 XG对RAW264.7细胞炎症因子和细胞因子mRNA表达的影响 |
| 4.7 XG抑制了LPS诱导的RAW264.7细胞iNOS和COX-2的表达 |
| 4.8 XG和LPS与TLR4蛋白的亲和性质的研究 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 第三章 黄原胶XG作用于TLR4胞内信号转导机制研究 |
| 1 研究背景 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 主要试剂与抗体 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 实验溶液的配制 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 巨噬细胞培养 |
| 3.2 透射电镜(TEM)观察RAW264.7巨噬细胞超微结构 |
| 3.3 NO测定 |
| 3.4 Western blot分析 |
| 3.5 NF-κB活化和核易位检测 |
| 3.6 SPR分析XG与Dectin-1、TLR2的结合性质研究 |
| 3.7 数据分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 透射电镜(TEM)观察XG对RAW264.7巨噬细胞胞内细胞器形态学的影响 |
| 4.2 抗TLR4抗体对XG抑制LPS诱导RAW264.7细胞的NO释放的影响 |
| 4.3 XG对RAW264.7细胞胞内MAPK信号通路蛋白表达的影响 |
| 4.4 XG对RAW264.7细胞NF-κB活化和核移位的影响 |
| 4.5 XG与TLR2、Dectin-1蛋白的亲和性质的研究 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 第四章 贻贝(Mytilus coruscus)多糖MP-A作用于活化的巨噬细胞TLR4受体的药理学效应及机制的研究 |
| 1 研究背景 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂与抗体 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 实验溶液的配制 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 THP-1巨噬细胞培养 |
| 3.2 THP-1巨噬细胞毒性检测 |
| 3.3 THP-1巨噬细胞吞噬功能检测 |
| 3.4 TNF-α和PGE2测定 |
| 3.5 NO释放量的测定 |
| 3.6 Western blot分析 |
| 3.7 NF-κB活化和核易位检测 |
| 3.8 SPR测定MP-A与TLR4,TLR2和Dectin-1的亲和力 |
| 3.9 统计分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 MP-A对THP-1细胞生存或增殖的影响 |
| 4.2 MP-A对THP-1细胞NO释放量的影响 |
| 4.3 MP-A对THP-1细胞吞噬FITC标记的葡聚糖的影响 |
| 4.4 MP-A抑制LPS刺激的THP-1细胞的TNF-α和PGE2释放 |
| 4.5 MP-A抑制LPS刺激的THP-1细胞中的iNOS和COX-2表达 |
| 4.6 MP-A抑制LPS诱导的THP-1细胞中MAPK和NF-κB的磷酸化 |
| 4.7 MP-A减弱LPS诱导的THP-1细胞中NF-κB活化和的核易位 |
| 4.8 MP-A与重组TLR4,TLR2和Dectin-1的亲和性质的研究 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 总结和展望 |
| 博士期间的论文成果 |
| 致谢 |
| ARTICLE |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（6）糖纳米粒子的制备新方法及其在糖—蛋白相互作用研究中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 糖纳米粒子的制备 |
| 1.2.1 糖金纳米粒子的制备 |
| 1.2.2 糖氧化铁纳米粒子的制备 |
| 1.2.3 糖量子点的制备 |
| 1.2.4 其他糖纳米粒子的制备 |
| 1.3 糖纳米粒子的生物学应用 |
| 1.3.1 糖纳米粒子在糖-糖相互作用研究中的应用 |
| 1.3.2 糖纳米粒子在糖-蛋白质相互作用研究中的应用 |
| 1.3.3 糖纳米粒子在生物成像方面的应用 |
| 1.3.4 糖纳米粒子作为抗粘附剂及药物输送载体在生物医学领域的应用 |
| 1.4 课题的提出与研究内容 |
| 第二章 基于全氟苯基叠氮化合物的光照插入反应制备糖纳米粒子 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验主要仪器 |
| 2.2.2 实验药品 |
| 2.2.3 糖纳米粒子（GIONs）及半乳糖-罗丹明B纳米粒子（Gal-RhB-IONPs）的制备 |
| 2.2.4 分析表征 |
| 2.2.5 合成部分 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 利用PFPA的光照插入反应向Dex-IONPs及PVA-IONPs表面引入炔基 |
| 2.3.2 通过点击反应由A-IONPs制备GIONs和Gal-RhB-IONPs |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 糖纳米粒子用于糖-蛋白相互作用检测及癌细胞靶向成像 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验主要仪器 |
| 3.2.2 实验药品 |
| 3.2.3 利用QCM检测GIONs与蛋白质和细胞的相互作用 |
| 3.2.4 利用Gal-RhB-IONPs对HepG2细胞进行靶向荧光成像 |
| 3.3 结果和讨论 |
| 3.3.1 QCM检测GIONs与蛋白质和细胞相互作用 |
| 3.3.2 Gal-RhB-IONPs用于对HepG2细胞靶向荧光成像 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 基于多巴胺的自聚合反应制备载金丝桃素乳糖纳米粒子 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验主要仪器 |
| 4.2.2 实验药品 |
| 4.2.3 载金丝桃素乳糖纳米粒子（Lac-PDA/Hy-MNPs）的制备 |
| 4.2.4 分析表征 |
| 4.2.5 合成部分 |
| 4.3 结果和讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 载金丝桃素乳糖纳米粒子用于光动靶向杀伤癌细胞的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 实验主要仪器 |
| 5.2.2 实验药品 |
| 5.2.3 细胞培养 |
| 5.2.4 Lac-PDA/Hy-MNPs和TEG-PDA/Hy-MNPs的细胞摄入研究 |
| 5.2.5 细胞内活性氧检测 |
| 5.2.6 细胞毒性测试 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 研究总结 |
| 6.1.1 利用光照插入反应制备糖纳米粒子并用于糖-蛋白相互作用研究 |
| 6.1.2 利用多巴胺自聚合反应制备载药糖纳米粒子并用于靶向抗癌研究 |
| 6.2 创新之处和展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附图 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）硫酸化可德兰多糖的制备、体外免疫调节、抗乙肝病毒感染活性及体内用作乙肝疫苗佐剂研究（论文提纲范文）
| 目录 |
| CATALOGUE |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语说明 |
| 第一章 前言 |
| 1 HBV感染 |
| 1.1 HBV |
| 1.2 HBV生命周期 |
| 1.3 HBV入胞机制 |
| 1.4 HBV感染与机体免疫应答 |
| 2 Curdlan |
| 2.1 Curdlan的结构与性质 |
| 2.2 Curdlan衍生物的制备方法及活性研究 |
| 3 硫酸化多糖抗病毒活性研究 |
| 4 多糖用作疫苗佐剂的研究 |
| 5 本课题设计思路及拟解决问题 |
| 第二章 硫酸化可德兰多糖及可德兰寡糖的制备及结构表征 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 试剂与材料 |
| 1.2 实验设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 硫酸化可德兰多糖(curdlan sulfate)的制备 |
| 2.2 可德兰寡糖(CRDO)的制备 |
| 2.3 Curdlan sulfate及CRDO的结构分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 Curdlan sulfates |
| 3.2 CRDO |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三章 Curdlan sulfate体外免疫调节活性及机制的研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 试剂与材料 |
| 1.2 仪器设备 |
| 1.3 细胞株 |
| 1.4 实验动物 |
| 1.5 溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 CS3对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 |
| 2.2 CS3对小鼠RAW264.7细胞活化的影响 |
| 2.3 CS3对小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDCs)成熟的影响 |
| 2.4 SPR技术分析不同curdlan sulfates与dectin-1的结合性质研究 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 CS3对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 |
| 3.2 CS3对小鼠RAW264.7细胞活化的影响 |
| 3.3 CS3对小鼠BMDCs成熟的影响 |
| 3.4 Curdlan sulfates与dectin-1的结合性质研究 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第四章 Curdlan sulfate体外抗乙肝病毒感染活性及机制的研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 试剂与材料 |
| 1.2 仪器设备 |
| 1.3 细胞株 |
| 1.4 溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 乙肝病毒浓缩液制备 |
| 2.2 HBV感染易感细胞 |
| 2.3 SPR分析硫酸化多糖与rHBsAg的结合性质研究 |
| 2.4 氯酸钠对HBV感染HepG2、HepaRG细胞的影响 |
| 2.5 HPA对HBV感染HepG2、HepaRG的影响 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 CS3对HBV感染易感细胞的影响 |
| 3.2 硫酸化多糖与rHBsAg亲和力分析 |
| 3.3 氯酸钠对HBV感染HepG2、HepaRG细胞的影响 |
| 3.4 HPA对HBV感染HepG2、HepaRG细胞的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第五章 Curdlan sulfate用于重组乙肝疫苗佐剂的研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 试剂与材料 |
| 1.2 仪器设备 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物分组及免疫接种 |
| 2.2 小鼠脾淋巴细胞制备 |
| 2.3 流式细胞术分析小鼠脾淋巴细胞表面标志分子 |
| 2.4 小鼠脾淋巴细胞体外增殖实验 |
| 2.5 小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-17A、IL-4、IL-10细胞因子检测 |
| 2.6 细胞内染色法检测胞内细胞因子IFN-γ、IL-17A、IL-4 |
| 2.7 小鼠血清中anti-HBs抗体滴度测定以及HBsAg特异性IgG亚型含量测定 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 CS3对免疫小鼠脾脏中巨噬细胞及树突状细胞募集和成熟的影响 |
| 3.2 CS3对小鼠脾脏中T淋巴细胞分群及活化的影响 |
| 3.3 CS3对小鼠脾淋巴细胞体外增殖能力的影响 |
| 3.4 CS3对小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-4、IL-10及IL-17A细胞因子的影响 |
| 3.5 CS3对小鼠脾淋巴细胞胞内表达IFN-γ、IL-4及IL-17A蛋白的影响 |
| 3.6 CS3对小鼠外周血中淋巴细胞胞内表达IFN-γ及IL-17A蛋白的影响 |
| 3.7 CS3对免疫小鼠体内产生anti-HBs及HBsAg特异性免疫球蛋白亚型IgG1、IgG2a的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 总结与展望 |
| 1 全文总结 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| Article 1 |
| Article 2 |
| Article 3 |
| 致谢 |
| 博士期间发表的论文 |
| 附表 |
（8）新型人类免疫缺陷病毒相关抑制剂及糖肽的设计合成（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 人类免疫缺陷病毒(HIV)概述 |
| 1.1.1 HIV 发展历史回顾 |
| 1.1.2 HIV 病毒的结构和功能 |
| 1.1.3 HIV 课题研究的关键问题 |
| 1.2 HIV 膜蛋白为靶点的研究 |
| 1.2.1 蛋白质糖基化与 HIV 包膜糖蛋白概述 |
| 1.2.2 以包膜糖蛋白 gp120 表面多糖为靶点的研究 |
| 1.2.3 以跨膜蛋白 gp41 为靶点的抗 HIV 抑制剂分子设计 |
| 1.3 多肽合成方法学中多肽连接技术的应用发展 |
| 1.4 问题的提出和论文研究的主要内容 |
| 1.4.1 基于 gp120 糖蛋白的相关糖肽合成 |
| 1.4.2 基于 gp41 螺旋核心区的 HIV 抑制剂分子设计 |
| 1.4.3 多肽合成中辅助基团的开发与硫酯合成的应用 |
| 第2章 基于 gp120 糖蛋白的相关糖肽合成 |
| 2.1 引言 |
| 2.1.1 寡糖的合成策略 |
| 2.1.2 环肽骨架的合成 |
| 2.1.3 糖肽缀合物的整体合成 |
| 2.2 表面等离子共振技术评价糖缀合物与蛋白质的相互作用 |
| 2.2.1 单价与多价单糖与蛋白质的相互作用 |
| 2.2.2 单价与多价多糖与蛋白质的相互作用 |
| 2.3 实验部分 |
| 2.3.1 试剂和仪器 |
| 2.3.2 多肽合成步骤 |
| 2.3.2.1 树脂的活化 |
| 2.3.2.2 氨基酸的偶联 |
| 2.3.2.3 多肽从树脂上的裂解 |
| 2.3.2.4 多肽的分离纯化 |
| 2.3.3 样品的制备 |
| 2.3.3.1 单体的合成 |
| 2.3.3.2 环肽骨架的合成 |
| 2.3.3.3 糖肽缀合物的合成 |
| 2.3.4 与蛋白质相互作用实验 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 基于 gp41 螺旋核心区的 HIV 抑制剂分子设计 |
| 3.1 引言 |
| 3.1.1 CHR 序列在抑制剂设计中的重要性 |
| 3.1.2 保守的盐桥作用在膜融合过程中的作用 |
| 3.1.3 脂筏锚定结构在膜融合抑制剂设计中的重要性 |
| 3.2 识别－共价结合抑制策略 |
| 3.2.1 设计思路 |
| 3.2.2 共价结合基团的选择 |
| 3.2.2.1 Building Block 方法 |
| 3.2.2.2 多肽合成后修饰的方法 |
| 3.2.2.3 修饰距离的选择 |
| 3.2.3 多肽抑制剂的序列设计与整体合成 |
| 3.2.4 分子水平评价抑制剂的效果 |
| 3.2.4.1 HPLC 评价抑制剂的效果 |
| 3.2.4.2 CD 评价抑制剂的效果 |
| 3.2.4.3 SDS-PAGE 与 Native-PAGE(N-PAGE)评价抑制剂的效果 |
| 3.2.5 假病毒与膜融合体系评价抑制剂的效果 |
| 3.2.5.1 假病毒体系评价抑制剂的效果 |
| 3.2.5.2 膜融合体系评价抑制剂的效果 |
| 3.2.6 本节结论 |
| 3.3 识别－切割抑制策略 |
| 3.3.1 设计思路 |
| 3.3.1.1 C34 序列分段切割研究设计 |
| 3.3.1.2 以 C34 全长为基础的切割抑制剂设计 |
| 3.3.2 切割基团与多肽抑制剂的合成 |
| 3.3.2.1 切割基团的合成 |
| 3.3.2.2 多肽抑制剂的整体合成 |
| 3.3.3 分子水平评价抑制剂的效果 |
| 3.3.3.1 C34 分段识别－切割实验 |
| 3.3.3.2 C34 全序列识别－切割实验 |
| 3.3.4 假病毒体系评价抑制剂的效果 |
| 3.3.5 本节小结 |
| 3.4 增加额外盐桥策略 |
| 3.4.1 设计思路 |
| 3.4.2 抑制剂多肽的整体合成 |
| 3.4.3 分子水平评价抑制剂的效果 |
| 3.4.3.1 计算机辅助模拟计算新型抑制剂的效果 |
| 3.4.3.2 N-PAGE 对 N 肽与 C 肽的作用效果检测 |
| 3.4.3.3 CD 光谱测定多肽抑制剂与目标蛋白的作用 |
| 3.4.4 假病毒体系评价抑制剂的效果 |
| 3.4.5 本节小结 |
| 3.5 实验部分 |
| 3.5.1 仪器和试剂 |
| 3.5.2 小分子 building block 的合成 |
| 3.5.3 多肽的合成 |
| 3.5.3.1 固相合成仪操作的程序设置与样品配置 |
| 3.5.3.2 含胆固醇修饰的多肽第一个氨基酸的偶联 |
| 3.5.3.3 含异硫氰基的多肽中异硫氰基的修饰 |
| 3.5.3.4 含 Cyclen 基团多肽的修饰 |
| 3.5.3.5 含异硫氰基修饰的多肽从树脂上裂解 |
| 3.5.4 多肽性质的测定方法 |
| 3.5.4.1 Native-PAGE 的操作方法 |
| 3.5.4.2 SDS-PAGE 的操作方法 |
| 3.5.4.3 圆二色谱(CD)的样品配置 |
| 3.5.4.4 高效液相色谱(HPLC)分析设置 |
| 3.5.4.5 计算机辅助分析的软件使用 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 多肽合成中辅助基团的开发与硫酯合成方法学研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.1.1 化学连接方法在多肽偶联中的应用 |
| 4.1.2 辅助基团在偶联中的应用 |
| 4.1.3 硫酯在多肽偶联及共价识别中的应用 |
| 4.2 辅助基团的合成 |
| 4.2.1 辅助基团小分子合成 |
| 4.2.2 含辅助基团的多肽合成 |
| 4.3 硫酯的合成 |
| 4.3.1 硫酯修饰的合成方法学研究 |
| 4.3.2 含硫酯修饰的合成 |
| 4.4 实验部分 |
| 4.4.1 仪器和试剂 |
| 4.4.2 单体的合成 |
| 4.4.3 多肽的合成 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
（9）HIV假病毒的构建及抗HIV药物SPR、ELRSE筛选方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 插图和附表清单 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 HIV病毒简介 |
| 1.1.1 HIV基因组 |
| 1.1.2 HIV的生活周期 |
| 1.2 治疗艾滋病的药物 |
| 1.2.1 核苷类逆转录酶抑制剂 |
| 1.2.2 非核苷类逆转录酶抑制剂 |
| 1.2.3 蛋白酶抑制剂 |
| 1.2.4 整合酶抑制剂 |
| 1.2.5 融合抑制剂和趋化因子共受体阻断剂 |
| 1.3 预防HIV性传播的多糖类杀微生物剂 |
| 1.4 HIV假病毒应用于抗HIV药物的筛选 |
| 1.4.1 HIV假病毒的构建方法 |
| 1.4.2 HIV-1假病毒感染细胞系统的建立 |
| 1.4.3 HIV-1假病毒感染细胞系统的应用 |
| 1.4.4 应用HIV假病毒的优势及局限性 |
| 1.5 本课题的研究内容及意义 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 第二章 HIV假病毒构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 大肠杆菌TOPO 10感受态制备 |
| 2.1.3 质粒转化大肠杆菌 |
| 2.1.4 质粒的小量提取 |
| 2.1.5 琼脂糖凝胶回收 |
| 2.1.6 将ENV基因克隆到pcDNA~(TM)3.1 D载体上 |
| 2.1.7 质粒的大量提取 |
| 2.1.8 DNA浓度的测定 |
| 2.1.9 细胞培养 |
| 2.1.10 利用Lipofectamine 2000进行转染 |
| 2.1.11 荧光素酶基因表达的检测 |
| 2.1.12 HIV假病毒的获得 |
| 2.1.13 假病毒感染活性的测定 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 HIV ENV基因片段获得 |
| 2.2.2 pcDNA~(TM)3.1-ENV真核表达质粒的构建与鉴定 |
| 2.2.3 HIV ENV测序结果及序列分析 |
| 2.2.4 转染结果和转染后基因表达 |
| 2.2.5 假病毒感染活性测定 |
| 2.3 小结 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 基于8PR技术的抗HIV药物筛选及分析方法的建立 |
| 3.1 SPR技术的作用原理 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 主要仪器设备 |
| 3.2.3 rgp120 MN固定到CM5芯片上的最适pH值确定 |
| 3.2.4 将gp120 MN固定到CM5芯片上 |
| 3.2.5 rgp120 MN芯片表面再生条件的确定 |
| 3.2.6 样品与gp120 MN的结合分析 |
| 3.2.7 样品与gp120 MN结合的动力学/亲和分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 rgp120 MN固定到CM5芯片上的最适pH值确定 |
| 3.3.2 rgp120 MN分子在CM5芯片上的固定 |
| 3.3.3 芯片表面再生条件的确定 |
| 3.3.4 样品与gp120 MN的结合 |
| 3.3.5 样品与rgp120 MN结合的动力学/亲和分析 |
| 3.4 小结 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 应用ELISA法建立抗HIV药物初步筛选方法 |
| 4.1 实验原理 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要试剂 |
| 4.2.2 主要设备 |
| 4.2.3 实剂及样品准备 |
| 4.2.4 样品检测实验步骤 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 吸光度测定值 |
| 4.3.2 实验组A中数据处理 |
| 4.3.3 实验组B中数据处理 |
| 4.3.4 不同样品、浓度对吸光度观测值的方差分析 |
| 4.4 小结 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 攻读硕士期间发表论文目录 |
| 附录B HIV ENV基因序列 |
（10）多糖荧光标记及运用糖芯片研究糖与蛋白相互作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1 课题研究目的 |
| 2 课题研究内容 |
| 3 课题研究意义 |
| 4 糖芯片研究进展 |
| 4.1 构建糖芯片库 |
| 4.2 构建糖芯片微阵列 |
| 4.3 糖芯片检测方法 |
| 4.4 糖芯片应用 |
| 4.5 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 EDC/NHS介导的糖醛酸多糖的荧光标记和分离纯化 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 一步法制备糖胺聚糖AF标记物 |
| 2.2 两步法制备糖胺聚糖AF标记物 |
| 2.2.1 多糖NHS酯纯化方法摸索 |
| 2.2.2 EDC/NHS比例的摸索 |
| 2.3 多糖伯羟基氧化及其荧光标记 |
| 2.3.1 TEMPO氧化 |
| 2.3.2 氧化多糖分子量变化 |
| 2.3.3 氧化多糖单糖组成的测定 |
| 2.3.4 氧化多糖标记 |
| 2.4 荧光标记多糖的纯化、纯度和含量分析 |
| 3 实验结果与讨论 |
| 3.1 一步法制备糖胺聚糖AF标记物 |
| 3.2 两步法制备糖胺聚糖AF标记物 |
| 3.2.1 多糖NHS酯纯化方法摸索 |
| 3.2.2 EDC/NHS比例的摸索 |
| 3.3 多糖氧化及其荧光标记 |
| 3.3.1 TEMPO氧化 |
| 3.3.2 氧化多糖分子量变化 |
| 3.3.3 氧化多糖单糖组成的测定 |
| 3.3.4 氧化多糖荧光标记 |
| 3.4 荧光标记多糖的纯化,纯度和含量分析 |
| 参考文献 |
| 第三章 多糖的羟基和还原端荧光标记及其分离纯化 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 FITC还原胺化法标记 |
| 2.2 FITC羟基标记 |
| 2.3 DTAF羟基标记 |
| 2.4 荧光标记多糖纯度和含量分析 |
| 3 实验结果与讨论 |
| 3.1 FITC醛基还原胺化标记 |
| 3.2 FITC羟基标记 |
| 3.3 DTAF羟基标记 |
| 3.4 荧光标记多糖纯度和含量分析 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 荧光标记多糖在糖芯片上的应用研究 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 手动点样仪制备芯片及其结合实验 |
| 2.2 高密度糖芯片的制备及其与蛋白结合实验 |
| 2.2.1 不同点样方式和不同点样基质选择 |
| 2.2.2 糖胺聚糖结合实验 |
| 2.2.3 28种荧光标记多糖芯片制备 |
| 3 实验结果与讨论 |
| 3.1 手动点样仪制备芯片及其结合实验 |
| 3.2 高密度多糖芯片的制备及其在膜中保留率研究 |
| 3.2.1 点样参数 |
| 3.2.2 自动点样仪制备芯片和CS-56结合实验 |
| 3.2.3 28种多糖芯片制备 |
| 3.2.4 结缔组织生长因子结合实验 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 发表及其参与发表的学术论文 |
| 硕士期间参与的课题 |
| 致谢 |
四、利用SPR研究海洋硫酸多糖911与GP120-V3区的相互作用特性—基于一种新的多糖在芯片表面的固定方法（论文参考文献）
- [1]原核生物Argonaute（pAgo）蛋白介导细菌基因组编辑及其机制研究[D]. 付磊. 华中农业大学, 2020
- [2]金催化剂的绿色制备及致病菌表面含有甘油-D-甘露庚糖的寡糖抗原的合成研究[D]. 王骏畅. 华东理工大学, 2020(01)
- [3]好氧颗粒污泥中胞外DNA的来源与结构支撑功能研究[D]. 王怡乔. 华东理工大学, 2020
- [4]基于STAT3抑制作用的中药活性成分筛选及其抗肿瘤恶病质作用研究[D]. 陈林林. 上海交通大学, 2020
- [5]两种多糖XG和MP-A作用于细胞表面受体Toll-like receptor 4（TLR4）的免疫药理学效应及胞内信号传导分子机制研究[D]. 刘福艳. 山东大学, 2017(12)
- [6]糖纳米粒子的制备新方法及其在糖—蛋白相互作用研究中的应用[D]. 邵晨. 西北农林科技大学, 2016(09)
- [7]硫酸化可德兰多糖的制备、体外免疫调节、抗乙肝病毒感染活性及体内用作乙肝疫苗佐剂研究[D]. 李平利. 山东大学, 2014(10)
- [8]新型人类免疫缺陷病毒相关抑制剂及糖肽的设计合成[D]. 赵镭. 清华大学, 2012(07)
- [9]HIV假病毒的构建及抗HIV药物SPR、ELRSE筛选方法的建立[D]. 谢桂煌. 昆明理工大学, 2011(07)
- [10]多糖荧光标记及运用糖芯片研究糖与蛋白相互作用[D]. 韩章润. 中国海洋大学, 2011(07)