一、诱导Th1细胞定向分化的新转录因子T-bet（论文文献综述）
孙妍,王明镜,曹新甜,刘为易,谌海燕,丁晓庆,肖海燕,许勇钢,全日城,胡晓梅[1]（2021）在《原发性免疫性血小板减少症患者外周血microRNAs的表达及与Th1/Th2失衡的关系》文中进行了进一步梳理目的:探讨原发性免疫性血小板减少症（ITP）患者外周血micoRNAs的表达量与Th1/Th2失衡的关系。方法:纳入30例ITP患者（ITP组）及15例健康人（对照组）,采用实时定量PCR（RT-PCR）法检测2组外周血中6种miRNA（miR-107、miR-205-5p、miR-138-5p、miR-326、miR-1827、miR-185-5p）和Th1特异性转录因子T-bet、Th2特异性转录因子GATA-3的表达水平,采用流式细胞术检测Th1、Th2细胞,Aim Plex流式细胞术高通量技术检测Th1细胞因子TNF-α、IFN-γ以及Th2细胞因子IL-4、IL-10含量。比较2组间miRNAs、mRNA、Th1、Th2细胞及其分泌的主要细胞因子的差异,分析ITP患者miRNAs与Th1、Th2细胞及其分泌的主要细胞因子的相关性。结果:与对照组相比,ITP组miRNA（miR-107、miR-205-5p、miR-138-5p、miR-326、miR-1827、miR-185-5p）和Th2细胞特异性转录因子GATA-3的表达水平均显着降低（P<0.05）; Th1细胞、Th1细胞特异性转录因子T-bet及Th1细胞因子TNF-α表达水平均显着升高（P<0.05）,T-bet/GATA-3和Th1/Th2比值均显着升高（P<0.05）。ITP患者miR-107、miR-205-5p、miR-138-5p相对表达量与Th2细胞均呈负相关（P<0.05,r=-0.411; r=-0.593; r=-0.403）; miR-1827相对表达量与TNF-α呈负相关（r=-0.390）。结论:ITP患者外周血6种miRNAs表达水平显着降低,导致T-bet mRNA/GATA-3mRNA比值升高,Th1/Th2失衡。
鲁德玕[2]（2020）在《白细胞介素-27在支气管哮喘气道炎症和气道重构中的作用》文中指出研究背景:支气管哮喘（哮喘）是以可变和可逆的气流受限以及气道高反应（Airway hyperresponsiveness,AHR）为特征的慢性炎症性疾病。其病理学特征为气道炎症和气道重构。哮喘患者气道重构导致气道高反应,也是肺功能受损、不可逆性气流受限的病理基础。气道重构一般表现为气道壁增厚和细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）沉积发生变化,新生血管形成以及气道平滑肌细胞（Airway smooth muscle,ASM）的增生与肥大。尽管目前的治疗可以有效地控制症状,但是无法防范和控制气道重构。T淋巴细胞（T-lymphocytes）及其细胞因子在哮喘病理过程中起着至关重要的作用。在发病的机制和原因上,哮喘和辅助性T细胞（T helper cells,Th）亚群细胞之间的失衡的免疫应答有关,Th1/Th2失衡是哮喘免疫学发病机制中的一个重要环节。Th1/Th2平衡的精确调节,Th1和Th2细胞涉及的信号下游通路的选择,对于肺脏稳态的维持、气道炎症以及气道重构至关重要。白细胞介素-27（Interleukin-27,IL-27）为新的IL-12家族的细胞因子,是一个来源不同的二聚体,由EB13和p28两条肽链组成,它们之间以二硫键连接。其受体由gp130和IL-27受体α链（IL-27Rα）组成,IL-27与受体结合可激活Janus激酶/信号转导和转录激活因子发挥生物学效应。IL-27可以提高Th1免疫应答的程度、减低Th2免疫应答的水平,防止炎症反应向过度方向发展,还可以减低Th17细胞分化的程度及相关的细胞因子的合成和释放,此外,IL-27对调节性T细胞（Regulatory T cells,Treg）也有不同程度的作用,这些都提示IL-27可能在哮喘的病理过程中扮演着重要角色。因此,IL-27可能是一个候选治疗哮喘的细胞因子。研究发现,急性发作期哮喘患者血清IL-27水平发生变化,且与患者肺功能状态相关。Jirmo AC及其同事发现IL-27可以增加干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-y）的分泌,而降低IL-5和IL-13的分泌,显示IL-27对Th2反应有直接抑制作用。他们的发现提供IL-27在抑制过敏性哮喘中具有重要作用的证据。基于卵清蛋白（Ovalbumin,OVA）诱导的小鼠模型,Yoshimoto等人已经证明经鼻给药IL-27可降低OVA诱发的气道高反应性和气道炎症。然而,Su X和同事发现预防性经鼻IL-27给药可减轻气道炎症并改善病理变化,而治疗性IL-27给药却没有以上效应,其原因是气道中已经存在己分化的Th2细胞,且对IL-27介导的Th2发育具有抵抗作用。此外,IL-27是否对哮喘慢性模型的气道重构有作用尚未有研究。目前有关IL-27和哮喘的研究,均着眼于IL-27对气道炎症的影响,没有关注气道重构这个哮喘的病理核心。治疗性给予IL-27是否能够减轻哮喘模型小鼠的气道炎症和气道高反应等病理过程研究结果尚不一致。此外,IL-27通过什么信号途径发挥上述作用尚有争议,目前也没有给予IL-27对气道重构有无影响的文献。目的:探讨预防性应用IL-27以及治疗性应用IL-27是否可以抑制哮喘模型小鼠的气道炎症、气道高反应以及气道重构等病理过程。进一步探讨其发挥上述作用的信号途径。为IL-27作为可能的干预因素针对哮喘气道重构的预防和治疗提供新的可能的靶点。方法:1.6周龄雌性BALB/c小鼠,利用鸡OVA构建急性和慢性哮喘模型。在预防处理组,小鼠随机分为正常对照组（PBS组）、模型组（OVA）组和IL-27预防处理组（OVA+IL-27）;在治疗处理组,小鼠随机分为正常对照组（PBS组）、模型组（OVA）组和IL-27治疗处理组（OVA+IL-27）,每组各8只小鼠。2.收集小鼠支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid,BALF）,对BALF进行瑞氏-吉姆萨（Wright-Giemsa）染色以及计数细胞总数,以及对中性粒细胞（Neutrophils,Neu）、单核细胞（Monocytes,Mon）、淋巴细胞（Lymphocytes,Lym）、嗜酸性粒细胞（Eosinophils,Eos）、嗜碱性粒细胞（Basophils,Bas）进行分类计数。3.酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）评估小鼠血清及 BALF 上清中 IL-4、IL-5、IL-13、IL-17 和 IFN-γ 的含量。4.应用有创的肺功能分析系统测定气道阻力和气道顺应性。5.实时聚合酶链反应（Real-time polymerase chain reaction amplification,Real-time PCR）检测小鼠肺脏组织中 ST AT1、STAT3、GAT A-binding protein-3（GATA-3）mRNA 和 T 细胞表达的转录因子 T-box（Transcription factors T-box expressed in T-cells,T-bet）mRNA 表达情况。6.Western blot 检测小鼠肺脏组织中 STAT1、磷酸化 STAT1（Phosphorylated STAT1,p-STAT1）、STAT3、p-STAT3、GATA3 和 T-bet 蛋白表达情况。同时计算p-STAT1和STAT1以及p-STAT3和STAT3的比值。7.采用不同染色方法评估肺组织气道重构情况:（1）采用H&E染色（Hematein eosin staining）方法,图像分析软件测量气道壁的面积（Area of airway wall,Wat）、平滑肌面积（Area of smooth muscle,Warm）、基底膜周长（Perimeter of basement membrane,Pbm）,用 Wat/Pbm（μm2/μm）和 Wam/Pbm（μm2/μm）,评估气道壁增厚、平滑肌增生情况。（2）采用 Masson 染色（Masson’s trichrome staining）方法,图像分析软件测量基底膜下蓝色胶原沉积面积,得到Masson+面积/Pbm,评估胶原沉积程度。（3）采用过碘酸-希夫（Periodic acid-Schiff,PAS）染色方法,图像分析软件测量PAS阳性面积,得到PAS+面积/Pbm（μm2/μm）,评估杯状细胞增生情况。（4）采用免疫组化α-平滑肌肌动蛋白（alpha smooth muscle actin,α-SMA）染色方法,图像分析软件测量α-SMA 阳性面积,得到α-SMA+面积/Pbm（μm2/μm）,评估肌成纤维细胞活化情况。（5）采用免疫组化CD31染色方法,图像分析软件测量CD31阳性面积,得到CD31+新生血管面积/Pbm（μm2/μm）,评估气道壁血管新生情况。结果:1.OVA诱导的哮喘小鼠模型临床表现哮喘模型组（OVA组）小鼠吸入OVA后即时出现明显的哮喘发作症状:烦躁不安,呼吸急促,腹肌抽搐,活动频繁,大、小便失禁,毛发竖起,部分小鼠出现可听到的哮鸣音,反应迟钝,动作迟缓等异常表现。这些表现均提示小鼠哮喘造模成功。2.小鼠BALF中细胞总数和分类2.1小鼠BALF中细胞总数2.1.1 IL-27在预防处理组可降低小鼠BALF中细胞总数三组小鼠BALF中细胞总数（X 104 cells/ml）有显着统计学差异（PBS组:8.38±1.94,OVA 组:190.70±29.77,OVA+IL-27 组:99.94±17.31,F=167.60,P<0.001,one-way ANOVA）。与OVA组相比,OVA+IL-27组小鼠BALF中细胞总数明显减少（t=9.11,P<0.001,Bonferroni’s Multiple Comparison Test）。2.1.2 IL-27在治疗处理组不能减少小鼠BALF中细胞总数三组小鼠BALF中细胞总数（X 104 cells/ml）有明显统计学差异（PBS组:8.59±2.07,OVA 组:193.50±40.35,OVA+IL-27 组:152.50±40.31,F=69.52,P<0.001,one-way ANOVA）。与OVA组相比,OVA+IL-27组小鼠BALF中细胞总数无明显变化（t=2.49,P>0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test）。2.2小鼠BALF中细胞分类2.2.1 IL-27在预防处理组可降低小鼠BALF中不同炎症细胞数三组小鼠 BALF 中 Mon 数（× 104 cells/ml）（PBS 组 vs OVA 组 vs OVA+IL-27组,下同:4.53±1.77 vs 17.82±5.18 vs 10.40±2.36,F=29.95,P<0.001,one-way ANOVA,下同）、Eos 数（0.47±0.25 vs 61.99±19.77 vs 17.22±4.36,F=59.26,P<0.001）、Neu 数（2.31±1.04 vs 27.79±6.17 vs 15.91±4.34,F=67.20,P<0.001）、Lym数（1.01±0.39 vs 74.97±16.53 vs 49.84±10.64,F=87.81,P<0.001）和 Bas 数（0.37±0.08 vs 6.03±1.76 vs 1.89±0.49,F=61.51,P<0.001）有显着统计学差异。与 OVA 组相比,OVA+IL-27 组小鼠 BALF 中 Mon 数（t=4.31,P<0.001,Bonferroni’s Multiple Comparison Test,下同）、Eos 数（t=7.66,P<0.001）、Neu 数（t=5.40,P<0.001）、Lym数（t=4.43,P<0.001）和 Bas 数（t=7.83,P<0.001）明显减少。2.2.2 IL-27在治疗处理组不能减少小鼠BALF中不同炎症细胞数三组小鼠 BALF 中 Mon 数（×104 cells/ml）（PBS 组 vs OVA 组 vs OVA+IL-27组,下同:4.70±1.59 vs 18.01 ±6.35 vs 13.56±5.14,F=16.01,P<0.001,one-way ANOVA,下同）、Eos数（0.50±0.25 vs 62.32±20.52 vs 52.78±13.33,F=44.38,P<0.001）、Neu 数（2.34±1.06 vs 28.17±5.78 vs 24.15±4.80,F=80.58,P<0.001）、Lym数（0.97±0.35 vs 78.23±15.32 vs 69.44±19.56,F=69.54,P<0.001）和 Bas 数（0.38±0.11 vs 6.23±2.19 vs 4.77±1.59,F=30.18,P<0.001）有显着统计学差异。与 OVA 组相比,OVA+IL-27 组小鼠 BALF 中 Mon 数（t=1.87,P>0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test,下同）、Eos 数（t=1.35,P>0.05）、Neu 数（t=1.83,P>0.05）、Lym数（t=1.23,P>0.05）和 Bas 数（t=1.87,P>0.05）无明显改变。3.小鼠的AHR测定3.1 IL-27降低预防处理组小鼠气道对乙酰胆碱的反应性三组小鼠气道基线反应无明显差异。当乙酰甲胆碱浓度为20 mg/ml激发时,与PBS组相比,OVA组小鼠气道对乙酰胆碱的反应性明显增强。表现为气道阻力（Airway resistance,R）增加（2.93±0.17 vs 5.10±0.19,F=285.30,P<0.001,one-way ANOVA;t=9.14,P<0.001,Bonferroni’s Multiple Comparison Test）,肺动态顺应性（Lung dynamic compliance,Cdyn）下降（0.48±0.02 vs 0.29±0.03,F=171.70,P<0.001,one-way ANOVA;t=10.19,P<0.001,Bonferroni’s Multiple Comparison Test）。与OVA组相比,OVA+IL-27组小鼠气道对乙酰胆碱的反应性显着下降。表现为当乙酰胆碱浓度为20 mg/ml激发时,R下降（5.10±0.19 vs 4.26±0.19,F=285.30,P<0.001,one-way ANOVA;t=9.14,P<0.001,Bonferroni’s Multiple Comparison Test）,Cdyn 上升（0.29±0.03 vs 0.39±0.02,F=171.70,P<0.001,one-way ANOVA;t=10.19,P<0.001,Bonferroni’s Multiple Comparison Test）。3.2 IL-27不能改善治疗处理组小鼠气道对乙酰胆碱的反应性三组气道基线反应无明显差异。当乙酰甲胆碱浓度为20 mg/ml激发时,与PBS组相比,OVA组小鼠气道对乙酰胆碱的反应性明显增强。表现为R增加（2.94±0.44 vs 5.02±0.20,F=111.10,P<0.001,one-way ANOVA;t=14.00,P<0.001,Bonferroni’s Multiple Comparison Test）,Cdyn 下降（0.49±0.02 vs 0.29±0.03,F=175.80,P<0.001,one-way ANOVA;t=17.37,P<0.001,Bonferroni’s Multiple Comparison Test）。与OVA组相比,OVA+IL-27组小鼠气道对乙酰胆碱的反应性无显着改变。表现为当乙酰胆碱浓度为20 mg/ml激发时,R无明显变化（5.02±0.20 vs 4.64±0.18,F=111.10,P<0.001,one-way ANOVA;t=2.56,P>0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test）,肺 Cdyn 无明显变化（0.29±0.03 vs 0.32±0.02,F=175.80,P<0.001,one-way ANOVA;t=2.56,P>0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test）。4.急性哮喘模型小鼠BALF上清中IL-4、IL-5、IL-13、IL-17和IFN-γ含量4.1 IL-27在预防处理组降低小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13、IL-17水平,提高IFN-γ水平三组小鼠 BALF 上清中 IL-4 含量（pg/m1）（PBS 组 vs OVA 组 vs OVA+IL-27组,下同:60.03±13.34 vs 134.20±26.59 vs 101.60±21.90,F=24.30,P<0.001,one-way ANOVA,下同）、IL-5含量（39.33±9.75 vs 84.52±14.70 vs 62.68±12.97,F=25.58,P<0.001）、IL-13 含量（122.90±26.79 vs 369.50±100.40 vs 244.60±68.97,F=23.48,P<0.001）、IL-17 含量（67.61±12.13 vs 203.50±38.32 vs 142.20±22.99,F=51.84,P<0.001）和 IFN-γ 含量（80.22±18.45 vs 39.99±9.21 vs 59.87±14.82,F=15.06,P<0.001）有显着统计学差异。与OVA组相比,OVA+IL-27组小鼠BALF中IL-4（t=3.06,P<0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test,下同）、IL-5（t=3.46,P<0.05）、IL-13（t=3.47,P<0.05）、IL-17（t=4.59,P<0.01）水平明显下降,IFN-γ水平明显增加（t=2.71,P<0.05）。4.2 IL-27在治疗处理组不影响小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13、IL-17和IFN-γ水平三组小鼠 BALF 上清中 IL-4 含量（pg/mI）（PBS 组 vs OVA 组 vs OVA+IL-27组,下同:58.96±15.47 vs 130.00±30.39 vs 104.60±26.14,F=16.84,P<0.001,one-way ANOVA,下同）、IL-5 含量（39.80±11.32 vs 79.61±23.60 vs 63.87±18.53,F=9.38,P<0.001）、IL-13 含量（117.50±34.18 vs 380.00±87.13 vs 285.20±87.69,F=25.77,P<0.001）、IL-17 含量（68.25±17.66 vs 215.80±46.22 vs 177.20±26.43,F=44.66,P<0.001）和 IFN-γ 含量（79.99±20.53 vs 47.60±17.49 vs 56.82±17.34,F=6.50,P<0.05）有显着统计学差异。与OVA组相比,OVA+IL-27组小鼠BALF中 IL-4（t=2.05,P>0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test,下同）、IL-5（t=1.70,P>0.05）、IL-13（t=2.56,P>0.05）、IL-17（t=2.39,P>0.05）水平无明显下降,IFN-γ水平无明显增加（t=0.99,P>0.05）。5.急性哮喘模型小鼠血清中IL-4、IL-5、IL-13、IL-17和IFN-γ含量5.1 IL-27在预防处理组降低小鼠血清中IL-4、IL-5、IL-13、IL-17水平,提高IFN-γ水平三组小鼠血清中IL-4含量（pg/ml）（PBS组vs OVA组vs OVA+IL-27组,下同:24.21±8.74 vs 110.60±20.39 vs 66.98±17.00,F=57.36,P<0.001,one-way ANOVA,下同）、IL-5含量（24.23±8.15 vs 82.87±18.42 vs 53.97±12.36,F=36.96,P<0.001）、IL-13 含量（156.80±33.10 vs 416.40±92.41 vs 269.70±77.54,F=25.98,P<0.001）、IL-17 含量（44.45±12.70 vs 154.5±27.24 vs 101.80±21.03,F=53.99,P<0.001）和 IFN-γ 含量（58.81±9.05 vs 32.76±9.55 vs 50.08±10.28,F= 15.13,P<0.001）有显着统计学差异。与OVA组相比,OVA+IL-27组小鼠血清中IL-4（t=5.41,P<0.01,Bonferroni’s Multiple Comparison Test,下同）、IL-5（t=4.24,P<0.01）、IL-13（t=4.06,P<0.05）、IL-17（t=4.98,P<0.01）)水平明显下降,IFN-γ 水平明显增加（t=3.59,P<0.01）。5.2 IL-27在治疗处理组不影响小鼠血清中IL-4、IL-5、IL-13、IL-17和IFN-γ水平三组小鼠血清中IL-4含量（pg/ml）（PBS组vs OVA组vs OVA+IL-27组,下同:26.25±12.01 vs 100.40±28.67 vs 80.58±24.13,F=22.74,P<0.05,one-way ANOVA,下同）、IL-5 含量（26.86±9.26 vs 79.57±19.31 vs 61.55±15.80,F=24.31,P<0.001）、IL-13 含量（149.90±39.42 vs 439.40±101.10 vs 345.40±112.20,F=21.48,P<0.001）、IL-17 含量（46.00±15.44 vs 157.70±37.82 vs 126.50±33.26,F=28.75,P<0.001）和 IFN-γ 含量（59.96±12.06 vs 33.84±12.47 vs 44.84±12.39,F=9.07,P<0.001）有显着统计学差异。与OVA组相比,OVA+IL-27组小鼠血清中IL-4（t=1.74,P>0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test,下同）、IL-5（t=2.35,P>0.05）、IL-13（t=2.09,P>0.05）、IL-17（t=2.05,P>0.05）水平无明显下降,IFN-γ水平无明显增加（t=1.79,P>0.05）。6.小鼠肺组织 STAT1、STAT3、T-bet 和 GATA3 mRNA 的表达6.1 IL-27在预防处理组可提高小鼠肺组织中STAT1 mRNA和T-bet mRNA、降低GATA3 mRNA表达水平三组小鼠肺组织中STAT1 mRNA表达水平有明显统计学差异（PBS组vs OVA 组 vs OVA+IL-27 组,下同:0.94±0.21 vs 0.67±0.19 vs 1.04±0.32,F=4.61,P<0.05,one-way ANOVA,下同）、GAT A3 mRNA 表达水平（1.15±0.39 vs 5.06±0.83 vs 2.93±0.90,F=55.30,P<0.01）和 T-bet mRNA 表达水平（0.97±0.29 vs 0.31±0.11 vs 0.62±0.25,F=16.83,P<0.001）有显着统计学差异。STAT3 mRNA表达水平（0.99±0.25 vs 0.73±0.24 vs 0.88±0.25,F=2.14,P>0.05）无明显统计学差异。与 OVA 组相比,OVA+IL-27 组小鼠肺组织中 STAT1 mRNA（t=2.94,P<0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test,下同）和 T-bet mRNA（t=2.72,P<0.05）表达水平提高,GATA3 mRNA表达水平下降（t=5.73,P<0.01）,STAT3m RNA表达水平无明显变化（t=1.21,P>0.05）。6.2 IL-27在治疗处理组对于小鼠肺组织中STAT1 mRNA、STAT3 mRNA、T-bet mRNA和GATA3 mRNA表达水平无影响三组小鼠肺组织中STAT1 mRNA（PBS组vs OVA组vs OVA+IL-27组,下同:1.04±0.23 vs 0.94±0.13 vs 1.03±0.16,F=0.74,P>0.05）和 STAT3 mRNA 表达水平（1.00±0.25 vs 0.79±0.33 vs 0.88±0.23,F=1.26,P>0.05）表达水平无明显统计学差异。GATA3 mRNA 表达水平（0.98±0.34 vs 5.56± 1.42 vs 4.37±1.36,F=34.04,P<0.01）和 T-bet mRNA 表达水平（0.96±0.29 vs 0.45±0.14 vs 0.64±0.22,F=9.85,P<0.01）有显着统计学差异。与OVA组相比,OVA+IL-27组小鼠肺组织中STAT1 mRNA（t=0.98,P>0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test,下同）、STAT3 mRNA（t=0.67,P>0.05）、GATA3 mRNA（t=2.07,P>0.05）和 T-bet mRNA（t=1.62,P<0.05）表达水平无明显变化。7.小鼠肺组织STAT1、磷酸化STAT1、STAT3、磷酸化STAT3、T-bet和GATA3蛋白的表达7.1 IL-27在预防处理组可提高小鼠肺组织中STAT1、p-STAT1、p-STAT3和T-bet蛋白表达水平,降低GATA3蛋白表达水平以β-actin作为内参,三组小鼠肺组织中STAT1（PBS组vs OVA组vs OVA+IL-27 组,下同:0.42±0.17 vs 0.39±0.13 vs 0.63±0.22,F=4.24,P<0.05,one-way ANOVA,下同）、磷酸化 STAT1（p-STAT1）（0.99±0.21 vs 0.49±0.11 vs 0.76±0.13,F=31.62,P<0.01）、p-STAT3 表达水平（1.15±0.25 vs 0.40±0.17 vs 0.96±0.31,F=19.64,P<0.01）、T-bet 表达水平（0.80±0.12 vs 0.34±0.11 vs 0.50±0.09,F=16.83,P<0.001）和 GATA3 表达水平（1.19±0.24 vs 3.12±0.95 vs 2.03±0.40,F=19.95,P<0.001）以及比值p-STAT1/STAT1（2.61±0.79 vs 1.04±0.30 vs 1.78±0.53,F=15.45,P<0.01）和 p-STAT3/STAT3（1.85±0.53 vs 0.69±0.33 vs 1.36±0.38,F=15.59,P<0.01）均有显着统计学差异。而STAT3表达水平无明显统计学差异（0.65±0.15 vs 0.63±0.19 vs 0.69±0.20,F=0.99,P>0.05）。与 OVA 组相比,OVA+IL-27 组小鼠肺组织中 STAT1（t=2.63,P<0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test,下同）、p-STAT1（t=4.83,P<0.01）、p-STAT3（t=4.54,P<0.01）和T-bet（t=2.72,P<0.05）蛋白表达水平提高,比值 p-STAT1/STAT1（t=2.69,P<0.05）和 p-STAT3/STAT3（t=3.21,P<0.05）均升高,GATA3 蛋白表达水平下降（t=3.56,P<0.05）,STAT3蛋白表达水平无明显变化（t=0.18,P>0.05）。7.2 IL-27在治疗处理组不改变小鼠肺组织中STAT1、p-STAT1、GATA3和T-bet蛋白表达水平三组小鼠肺组织中STAT1蛋白（PBS组vs OVA组vs OVA+IL-27组,下同:0.45±0.17 vs 0.41±0.12 vs 0.49±0.13,F=0.92,P>0.05,one-way ANOVA,下）和STAT3 蛋白（0.71±0.21 vs 0.68±0.23 vs 0.74±0.18,F=0.13,P>0.05）表达水平以及比值 p-STAT1/STAT1（2.83±1.79 vs 1.50±0.96 vs 1.52±0.80,F=2.92,P>0.05）和p-STAT3/STAT3（1.56±0.51 vs 1.36±0.85 vs 1.42±0.54,F=0.19,P>0.05）无显着统计学差异。p-STAT1 蛋白（1.04±0.26 vs 0.53±0.21 vs 0.70±0.28,F=8.46,P<0.01）、p-STAT3 蛋白（15±0.25 vs 0.76±0.11 vs 0.98±0.20,F=7.87,P<0.01）、T-bet 蛋白（0.79±0.14 vs 0.41±0.12 vs 0.56±0.14,F=17.15,P<0.001）和 GATA3蛋白（1.25±0.32 vs 3.46±0.83 vs 2.69±0.66,F=24.45,P<0.001）表达水平有显着统计学差异。与 OVA组相比,OVA+IL-27 组小鼠肺组织中 p-STAT1 蛋白（t=1.34,P>0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test,下同）、p-STAT3 蛋白（t=2.23,P>0.01）、T-bet 蛋白（t=2.27,P>0.05）和 GATA3 蛋白（t=2.41,P>0.05）表达水平以及比值 p-STAT1/STAT1（t=0.02,P>0.05）和 p-STAT3/STAT3（t=0.19,P>0.05）无明显变化。8.IL-27对慢性小鼠哮喘模型气道重构的影响8.1 IL-27在预防处理组可以改善预防处理组慢性小鼠哮喘模型气道重构三组小鼠肺组织H&E染色测量Wat/Pbm（μm2/μm）（PBS组vs OVA组vs OVA+IL-27 组,下同:3.59±1.42 vs 8.49±2.86 vs 5.38±2.21,F=9.78,P<0.001,one-way ANOVA,下同）和 Wam/Pbm（μm2/μm）（10.22±4.02 vs 24.87±6.44 vs 17.00±5.77,F=14.20,P<0.001）、马松三原色染色阳性基底膜下胶原纤维面积和Pbm的比值以（μm2/μm）（1.25±0.41 vs 3.79±0.97 vs 2.39±0.92,F=19.84,P<0.001）、PAS 染色阳性染色面积和 Pbm 的比值（μm2/μm）（0.36±0.18 vs 3.06±1.53 vs 1.31±0.92,F=14.05,P<0.001）、α-SMA免疫组织化学染色阳性染色面积和Pbm的比值（μm2/μm）（0.69±0.32 vs 2.74±1.21 vs 1.56±0.75,F=11.92,P<0.001）和 CD31免疫组织化学染色阳性染色面积和Pbm的比值（μm2/μm）（0.002±0.001 vs 0.37±0.15 vs 0.19±0.12,F=22.50,P<0.001）有明显统计学差异。与 OVA 组相比,OVA+IL-27 组模型小鼠 H&E 染色 Wat/Pbm（t=2.77,P<0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test,下同）、Wam/Pbm（t=2.86,P<0.05）、马松三原色染色阳性基底膜下胶原纤维面积和Pbm 比值（t=3.45,P<0.05）、PAS染色每um的PAS染色阳性染色面积和Pbm 比值（t=3.37,P<0.05）、α-SMA免疫组织化学染色阳性染色面积和Pbm 比值（t=2.79,P<0.05）以及CD31免疫组织化学染色阳性染色面积和Pbm（t=3.32,P<0.05）明显减小。8.2 IL-27在治疗处理组不能改善治疗处理组慢性小鼠哮喘模型气道重构三组小鼠肺组织H&E染色测量Wat/Pbm（μm2/μm）（PBS组vs OVA组vs OVA+IL-27 组,下同:3.91±1.81 vs 9.13±3.49 vs 6.61±2.38,F=7.75,P<0.01,one-way ANOVA,下同）和 Wam/Pbm（μm2/μm）1131±5.19 vs 26.27±10.23 vs 19.72±6.34,F=7.85,P<0.05)、马松三原色染色阳性基底膜下胶原纤维面积和Pbm比值（μm2/μm）（1.21±0.35 vs 3.82±1.24 vs 3.09±0.99,F=16.36,P<0.001）、PAS 染色阳性染色面积和 Pbm 比值（μm2/μm）（0.40±0.20 vs 3.53±1.55 vs 2.80±1.18,F=16.66,P<0.001）、α-SMA免疫组织化学染色阳性染色面积和Pbm 比值（μm2/μm）（0.73±0.34 vs 3.30±1.58 vs 2.37±1.46,F=8.58,P<0.001）和 CD31 免疫组织化学染色阳性染色面积和Pbm 比值（μm2/μm）（0.001±0.001 vs 0.40±0.16 vs 0.29±0.15,F=21.48,P<0.001）有显着统计学差异。与 OVA 组相比,OVA+IL-27组模型小鼠 H&E 染色 Wat/Pbm（t=1.91,P>0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test,下同）、Wam/Pbm（t=1.73,P>0.05）、马松三原色染色阳性基底膜下胶原纤维面积和Pbm 比值（t=1.57,P>0.05）、PAS染色每um的PAS染色阳性染色面积和Pbm 比值（t=1.28,P>0.05）、α-SMA免疫组织化学染色阳性染色面积和Pbm 比值（t=1.48,P>0.05）以及CD31免疫组织化学染色阳性染色面积和Pbm 比值（t=1.72,P>0.05）无明显改变。结论:1.IL-27可增强哮喘模型小鼠的Th1型免疫应答,抑制其Th2型免疫应答,改善Th1/Th2细胞因子平衡。2.预防性经鼻吸入IL-27通过STAT1和STAT3信号途径抑制哮喘模型小鼠的气道炎症、气道高反应和气道重构等病理过程。3.IL-27有望成为哮喘的预防和治疗的一个靶点。
陈一方[3]（2020）在《桦褐孔菌多糖对小鼠炎症性肠病模型的治疗作用及其机制研究》文中指出研究背景:炎症性肠病（Inflammatory bowel disease,IBD）是一种非特异性炎症性肠道疾病,主要包括克罗恩病（Crohn’s disease,CD）和溃疡性炎症性肠病（Ulcerative colitis,UC）两种疾病形式,此病在欧美国家多发,截至2015年,美国IBD患者数量已超过100万,欧洲超过250万,欧美等发达国家IBD发病率高达0.5%。近十年发现,亚洲、中东及南美等地区的新兴工业化国家IBD发病率也持续增加。由于新兴工业化国家发病率及人口总量急剧增长,预测至2025年,IBD患者总量将与西方国家人口总量相持平,IBD将成为新的全球性负担。IBD多发病于青壮年时期,致病因素尚不明确,多认为与易感基因突变、环境的改变、肠道菌群失衡及免疫应答异常等有关,致病因素的不确定性及多样性加剧了 IBD的治疗难度,其中免疫功能紊乱及免疫应答异常,被认为是引起IBD发病的主要因素,也是靶向治疗IBD的主要目标。树突状细胞（Dendritic cells,DC）是功能最强大的专职抗原提呈细胞（Antigen presenting cell,APC）,是连接固有免疫和适应性免疫的“桥梁”,通过自身耐受性及分泌的特异性细胞因子的不同,调控CD4+T细胞分化为不同的辅助T细胞（T helper cells,Th）或调节性 T 细胞（Regulatory cells,Treg）,使免疫系统发挥免疫激活或免疫耐受作用,进而参与包括IBD在内的多种自身免疫性疾病的发生与发展。CD4+T细胞主要由Th细胞亚群和Treg细胞亚群组成,IBD患者结肠组织往往伴随大量CD4+T细胞的浸润,最初认为Th1/Th2细胞分化失衡是介导IBD发病的主要机制,Th1细胞的过度活化使促炎因子IFN-γ大量表达,抑制IL-4依赖性的Th2细胞的分化,使Th1/Th2细胞轴产生严重偏移,加剧炎症反应,进而在IBD中发挥致病作用。随着IL-17分泌性Th17细胞亚群在IBD患者中检出,Th17细胞在IBD中的致病作用被逐步确定,补充了 Th1/Th2细胞失衡致病的理论。Th17细胞通过分泌促炎因子IL-17参与炎症反应,介导剧烈的组织损伤,其分化呈IL-6依赖性。IL-6抑制TGF-β依赖性亚群Treg细胞的分化,Treg细胞数量不足或功能受损也是IBD发病的机制之一,因此Th17/Treg细胞的分化失衡,成为介导IBD的新型机制,并被广泛探究。目前,IBD的治疗方案主要集中在药物治疗,主要包括氨基水杨酸类药物、皮质类固醇类药物、免疫抑制剂、单抗药物,及其他选择性药物如抗生素、益生菌、维生素及罗格列酮等。随着细胞分子医学及免疫学的深入研究,更多的IBD机制及药物靶点被发现,使IBD的治疗药物及治疗方式呈现多元化开发。然而目前IBD仍然难以被根治,复发率极高,且治疗药物价格昂贵、用药周期长、不良反应等因素,促使研究人员不断探索新的安全、高效、平价的IBD治疗药物或治疗手段。研究目的:桦褐孔菌又称白桦茸,是生长于白桦、银桦、榆树、赤杨等树皮下的一种可食用真菌,多分布于北纬40-50°的寒冷地带,如我国黑龙江省、吉林省长白山等地区,欧洲国家早在16世纪便利用其治疗恶性肿瘤、糖尿病、炎症等难治性疾病。桦褐孔菌多糖（Inonotus obliquus polysaccharide,IOP）是由桦褐孔菌提取的最具有药用价值的活性成分之一,具有抗炎、抗肿瘤、免疫调节、降血糖、降血脂等多种生物活性,但其对葡聚糖硫酸钠（Dextran sulphate sodium,DSS）诱导的实验性结肠炎的治疗作用及相关机制尚不明确。因此本研究采用不同浓度的IOP探索其对DSS诱导的急、慢性结肠炎的治疗作用,并探索其与DC及CD4+T细胞相关的治疗机制,为IOP治疗IBD提供可行性及理论依据,并通过IOP诱导的耐受性骨髓来源树突状细胞（Bone marrow-derived dendritic cells,BMDC）的体内回输,为IBD免疫细胞治疗提供新的可能性。第一部分IOP对DSS诱导的慢性炎症性肠病的治疗作用研究方法:采用热水浸提法提取IOP,并采用高效液相检测IOP的单糖组成。BALB/c雄性6-8周龄小鼠给予3%DSS三次循环共43天造模法建立慢性结肠炎模型,实验组给予三种不同浓度IOP（100,200,300mg/kg）处理,每日检测小鼠体重、粪便性状、便血情况,并进行疾病活动指数（Disease active index,DAI）评分。第44天脱颈法处死小鼠,测量小鼠结肠长度,评估小鼠肠道炎症严重程度。小鼠结肠石蜡切片进行苏木素-伊红染色（Hematoxylin-Eosin staining,HE）染色并进行组织学评分,免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）法检测小鼠结肠组织中带状闭合蛋白（Zonula occludens-1 protein,ZO-1）、Occludin这两种紧密连接（Tightjunction,TJ）蛋白的表达,观察小鼠结肠组织完整性及黏膜损伤情况;逆转录-聚合链酶反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）法检测小鼠结肠组织中与Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞、Treg细胞相关的特异性细胞因子及转录因子的基因水平表达情况。流式细胞术检测小鼠脾脏及肠系膜淋巴结（Mesenteric lymph node,MLN）中 Th1 细胞、Th2 细胞、Th17 细胞、Treg细胞的分化情况。IHC及免疫印迹（Western blot,WB）法检测与CD4+T细胞分化相关的JAK-STAT信号通路相关蛋白STAT1、STAT3、STAT6在结肠组织中的表达情况。研究结果:经高效液相法检测,我们所提取的IOP主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖组成,含量分别为9.2%、4.4%、46.6%、11.5%、11.1%、4.3%。糖度仪检测多糖含量大于90%,适用于后续研究。与模型组相比,IOP（100,200,300 mg/kg）治疗组小鼠体重变化率较小,结肠长度明显恢复,DAI及组织学评分显着降低,肠道炎症情况得到明显改善,结肠组织TJ蛋白ZO-1及Occludin丢失较少,显着保护了结肠组织通透性及完整性。RT-PCR结果显示,IOP（100,200,300 mg/kg）使结肠组织中Th1细胞、Th17细胞相关促炎因子IFN-y、IL-17及特异性转录因子T-bet、ROR-yt表达量下降,使Th2细胞、Treg细胞相关抑炎因子IL-4、IL-10及特异性转录因子GATA-3、Foxp3表达量上升。同时,IHC及WB结果表明,IOP（100,200,300 mg/kg）对CD4+T细胞分化相关的上游通路JAK-STAT信号通路具有调控作用,使STAT1及STAT3的磷酸化水平下调,入核量减少,STAT6的磷酸化水平上调,入核量增多。流式细胞术结果表明,IOP（100,200,300 mg/kg）可以显着抑制脾脏及MLN中Th1细胞及Th17细胞的分化,促进Th2细胞及Treg细胞的分化,使结肠炎小鼠体内Th1/Th2细胞、Th17/Treg细胞轴趋向平衡。研究结论:1.我们所提取的IOP（100,200,300mg/kg）可以显着缓解DSS诱导的慢性结肠炎的炎症情况。2.IOP（100,200,300 mg/kg）对实验性结肠炎的治疗作用与调控Th1/Th2细胞、Th17/Treg细胞的分化平衡有关。3.IOP（100,200,300 mg/kg）CD4十T细胞亚群的分化的作用可能与STAT1、STAT3、STAT6等蛋白的调控有关。第二部分IOP对CD4+T细胞体外分化的影响研究方法:为探索IOP对Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞及Treg细胞分化过程的影响,CD4+免疫磁珠阴性分选法获取C57BL/6雄性小鼠脾脏CD4+T细胞,活细胞荧光染料CFSE（2 μM）进行标记后,将细胞平均分为CD4+T组、对照组、IOP（10,20,40mg/mL）三种剂量组（即 IOP-L、IOP-M、IOP-H）,除 CD4十T 组外,均给予抗鼠CD3ε抗体（5μg/mL）及抗鼠CD28抗体（3μg/mL）刺激活化三天。流式细胞术检测IOP（L,M,H）分别对CD4+T细胞活化标志CD69、CD25的影响,以及对CD4+T细胞增殖率及增殖指数的影响。RT-PCR法检测Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞及Treg细胞相关细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-10及特异性转录因子T-bet、GATA-3、ROR-yt、Foxp3基因水平的表达情况。酶联反应吸附实验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测 IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-10蛋白水平的分泌情况。对Th1细胞、Th17细胞、Treg细胞三种细胞亚群给予定向分化,同时给予IOP（L,M,H）处理,流式细胞术检测IOP（L,M,H）对Th1细胞、Th17细胞、Treg细胞分化率的影响。研究结果:结果显示,与对照组相比,IOP（L,M,H）并不影响CD4+T细胞前期及后期的活化指标CD69、CD25的表达量,细胞的增殖率及增殖指数也未产生显着差异,提示IOP（L,M,H）可能并不作用于CD4+T细胞活化及增殖过程。RT-PCR结果显示,IOP（L,M,H）使活化的CD4+T细胞中,Th1细胞及Th17细胞相关的促炎因子IFN-γ、IL-17及特异性转录因子T-bet、ROR-γt的表达量明显降低,Treg相关的抑炎因子IL-10及特异性转录因子Foxp3的表达量明显上调,而对Th2细胞相关细胞因子IL-4及转录因子GATA-3作用较为局限。ELISA结果显示,IFN-γ、IL-17表达量下调,IL-10表达量上调。Th1细胞、Th17细胞、Treg细胞定向分化实验结果显示,IOP（L,M,H）使Th1细胞、Th17细胞分化率显着下调,使Treg细胞的分化率显着上调,IOP（L,M,H）对CD4+T细胞分化阶段具有直接调控作用。研究结论:1.IOP（L,M,H）并不参与CD4+T细胞的活化及增殖阶段,而是对其分化阶段产生直接调控作用。2.在体外,IOP（L,M,H）可以抑制Th1细胞、Th17细胞的分化,促进Treg细胞的分化,但是对Th2细胞的分化具有局限性。第三部分IOP对BMDC成熟度及功能的影响研究方法:DC是刺激CD4+T细胞分化的最重要的APC,其表面MHC-Ⅱ、共刺激分子的表达以及分泌细胞因子类型对CD4十T细胞的分化方向起绝对作用,DC成熟度的不同是决定其介导免疫耐受或免疫应答的关键,因此,我们在体外实验中探讨IOP对BMDC成熟度的影响,以及对BMDC诱导免疫耐受能力的影响。取C57BL/6雄性6-8周龄小鼠大腿骨骨髓细胞,以2 × 106个/孔铺于六孔板,并给予 rmGM-CSF（20ng/mL）、rmIL-4（20ng/mL）刺激分化 6 天,第 7 天收集板中悬浮及半悬浮细胞即为BMDC。采用100ng/mL脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）刺激BMDC24小时,使BMDC活化并成熟,即为BMDCLPS细胞,部分BMDCLPS细胞分别给予IOP（10,20,40 mg/mL）即IOPL,M,H处理。流式细胞术检测BMDC成熟度相关指标MHC-Ⅱ、CD40、CD86的表达情况,ELISA检测以及与诱导Th1细胞、Th17细胞和Treg细胞分化相关的细胞因子IL-12、IL-6、TGF-β的分泌情况。取不同处理的BMDC与CD4+T细胞以1:5的比例共同培养,总细胞量2 × 106个/孔铺于六孔板中,建立混合淋巴反应（Mixed lymphocyte reaction,MLR）体系,流式细胞术检测Th1细胞、Th17细胞、Treg细胞分化率,ELISA检测MLR体系中与此三种细胞分化启动相关的细胞因子IL-12、IL-6、TGF-β的分泌情况。研究结果:MHC-Ⅱ及表面共刺激分子CD40、CD86等的表达量是判断DC成熟与否的标志,同时也是激活CD4+T细胞的第一、二信号,流式细胞术结果显示,与未进行活化刺激的BMDC相比,BMDCLPS表面高表达MHC-Ⅱ以及共刺激分子CD40、CD86,成熟度显着升高。ELISA及流式细胞术检测显示,BMDCLPS分泌与Th1细胞、Th17细胞分化相关的细胞因子IL-12、IL-6明显增高,并使CD4+T细胞向Th1细胞、Th17细胞方向分化率显着上调,MLR体系整体呈现免疫激活状态。而 IOPL,M,H-BMDCLPS组与 BMDCLPS相比,MHC-Ⅱ、CD40 及 CD86 的表达量均明显下降,成熟度显着降低,且TGF-β的分泌量明显提升,使CD4+T细胞向Treg细胞方向分化比率显着上调,使MLR体系呈现免疫耐受状态。研究结论:1.IOPL,M,H使BMDCLPS维持低成熟状态。2.IOPL,M,H-BMDCLPS使CD4+T细胞向Treg细胞方向分化,具有维持免疫耐受的功能。第四部分IOPL-BMDC对DSS诱导的急性结肠炎的治疗作用研究方法:各种功能稳定的免疫耐受性DC被应用到结肠炎模型的治疗中,并验证具有显着的治疗效果,耐受性DC是IBD细胞治疗的重要细胞来源,因此我们探索IOP诱导的耐受性BMDC是否可以通过调控CD4+T细胞的分化,诱导机体免疫耐受,从而达到治疗结肠炎的作用。C57BL/6雄性6-8周龄小鼠采用3%DSS 6天造模法建立急性小鼠结肠炎模型,分为对照（Control）组、模型（DSS）组、BMDC组及IOPL-BMDC组,其中BMDC组及IOPL-BMDC组在给予3%DSS饮用水的前3天及第3天分别给予2 × 106个/只BMDC或IOPL-BMDC腹腔注射,并每日检测各组小鼠生存率、体重、是否便血及腹泻情况,并进行DAI评分。第7天断颈处死小鼠,测量小鼠结肠长度并拍照,评估小鼠肠道受损情况。结肠组织石蜡切片进行HE染色观察结肠组织完整性相关指标并进行组织学评分。IHC法检测小鼠结肠组织TJ蛋白ZO-1和Occludin的表达量,观察小鼠结肠组织完整性及黏膜损伤情况。取小鼠脾脏及MLN,流式细胞术检测Th1细胞、Th17细胞及Treg细胞的分化情况。ELISA法检测小鼠结肠组织匀浆上清液中与CD4+T细胞分化相关的细胞因子IL-12、IL-6、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-10的分泌情况。研究结果:BMDC及IOPL-BMDC的体内回输,使结肠炎小鼠体重变化率及DAI评分明显降低,恢复因炎症造成的结肠短缩,生存率得到明显改善,小鼠炎症程度得到显着控制。HE及IHC结果显示,与模型组相比,BMDC及IOPL-BMDC组小鼠结肠组织杯状数量增多,隐窝完整,组织完整性得到改善,TJ蛋白ZO-1、Occludin的流失减少,黏膜损伤程度明显降低,且以IOPL-BMDC抗炎效果更为显着。ELISA结果显示,IOPL-BMDC显着抑制与Th1细胞及Th17细胞分化相关的促炎因子IL-12、IFN-γ、IL-6、IL-17的分泌,提高Treg分化相关的抗炎因子TGF-β、IL-10的分泌。流式细胞术结果显示,Th17细胞亚群在正常组小鼠及结肠炎小鼠脾脏及MLN中的分化均不明显,模型组高表达促炎性T细胞亚群Th1细胞,低表达抗炎性T细胞亚群Treg细胞,给予BMDC及IOPL-BMDC回输治疗后,结肠炎小鼠脾脏及MLN中Th1细胞亚群分化率明显降低,而Treg细胞亚群分化率显着提升,其中以IOPL-BMDC组对CD4+T细胞亚群调控能力最为显着。研究结论:1.IOPL-BMDC可以通过调控结肠炎小鼠CD4+T细胞的分化缓解DSS诱导的小鼠急性炎症性肠病。2.IOPL-BMDC为炎症性肠病的细胞治疗提供新的可能性,为耐受性DC的制备提供新的思路。结论:不同剂量IOP（100,200,300 mg/kg）均可显着改善DSS诱导的慢性结肠炎小鼠疾病进程,调控结肠炎小鼠脾脏、MLN及结肠组织中Th1/Th2、Th17/Treg细胞亚群平衡,这种调控作用可能与JAK-STAT信号通路有关。不同浓度IOP（10,20,40 mg/mL）均不影响体外的脾脏来源的CD4+T细胞增殖及活化,对分化具有直接调控作用,抑制Th1细胞、Th17细胞分化,促进Treg细胞分化,对Th2细胞的分化调控具有局限性。IOPL,M,H均可维持LPS（100 ng/mL）诱导的炎性环境下BMDC的低成熟状态,并促进MLR反应体系中CD4+T细胞向Treg细胞方向分化,抑制Th1细胞及Th17细胞的分化。IOPL-BMDC显着缓解DSS诱导的急性炎症性肠病,并调控结肠炎小鼠脾脏及MLN中CD4+T细胞亚群分化,抑制Th1细胞分化,促进Treg细胞分化,对Th17细胞分化具有一定局限性。
雷道赟[4]（2020）在《右美托咪定通过STAT1/T-bet途径促使Th1细胞漂移的机制研究》文中研究表明研究背景CD4+T辅助细胞通过调控细胞和体液反应对多种病原体产生免疫应答。作为CD4+T辅助细胞亚型之一的Th1和Th2细胞是保护宿主免受病原入侵的关键,而两者所控制的免疫平衡失衡成为各种免疫紊乱的重要原因之一。手术应激诱导Th1/Th2比例的失衡抑制机体的细胞免疫功能并增加术后感染的几率。右美托咪定是一种具有镇静、镇痛作用的α2肾上腺素受体激动剂。临床发现右美托咪定可以通过促进患者术后Th1细胞漂移,增加Th1/Th2比例,增强细胞免疫功能。有文献报道,T细胞表面表达α2肾上腺素受体,并参与T细胞的分化。由此,我们推测右美托咪定可能通过激活T细胞表面的α2受体,促进T细胞向Th1分化。T-bet是调控Th1细胞分化的关键转录因子。T-bet可以通过改变Th细胞的表观遗传或染色质环境增强染色质易感性,并促进Th1特征性基因IFN-γ和IL-12的表达,从而诱导Th1极化。IFN-γ的表达进一步强化T-bet的表达和Th1细胞分化,形成正反馈调节。此外,T-bet也可以通过抑制Th2细胞分化关键转录因子GATA3的表达,抑制Th细胞向Th2细胞分化,间接促进T细胞向Th1漂移。转录信号转导剂和激活剂-1（STAT1）是STAT家族成员之一,具有调控细胞生长、分化作用。STAT1可以通过与IFN-γ启动子特异性结合,增强IFN-γ表达。STAT1-/-小鼠中Th1细胞分化受抑且T-bet的表达下降,表明STAT1可能调控T-bet的表达并参与Th1细胞分化。基于以上,我们推测右美托咪定可能通过T细胞表面α2受体,激活STAT1,增强Th1细胞关键转录因子T-bet表达,诱导Th1细胞分化。右美托咪定的这种诱导作用可以被α2受体拮抗剂和STAT1抑制剂所逆转。研究目的1.阐明α2受体在右美托咪定促进Th1分化的作用;2.探讨STAT1/T-bet途径在右美托咪定诱导Th1细胞漂移中的可能作用。研究方法1.使用CD3/CD28抗体活化纯化的CD4+T,添加不同浓度右美托咪定刺激细胞6h,使用流式细胞仪检测Th1和Th2细胞占比,RT-PCR和ELISA分别检测细胞因子IFN-γ和IL-4表达和浓度。2.使用CD3/CD28抗体活化纯化的CD4+T,添加或不添加α2受体抑制剂atipamezole与0.1nM右美托咪定共同刺激细胞6h,使用Western blot检测STAT1磷酸化水平和T-bet的表达,RT-PCR检测T-bet和GATA3的mRNA水平。3.使用CD3/CD28抗体活化纯化的CD4+T,添加或不添加STAT1抑制剂fludarabine与0.1nM右美托咪定共同刺激细胞6h,使用Western blot检测STAT1磷酸化水平和T-bet的表达,RT-PCR检测T-bet和GATA3的mRNA水平。研究结果1.右美托咪定刺激后各组T细胞向Th1细胞分化显着增多,IFN-γmRNA表达增强,浓度增加,且当右美托咪定浓度为0.1nM时,达到高峰。各组Th2细胞比例、IL-4表达和浓度均无显着差异。2.右美托咪定刺激后磷酸化STAT1水平增高（p-STAT1）、T-bet的mRNA和蛋白水平增加,GATA3的mRNA表达mRNA无显着变化。3.atipamezole与右美托咪定共刺激后,Th1细胞比例,IFN-γ的mRNA水平和含量,STAT1的磷酸化水平,T-bet的mRNA和蛋白水平均下降。4.fludarabine与右美托咪定共刺激后,Th1细胞比例,IFN-γ的mRNA水平和含量,T-bet的mRNA和蛋白水平均下降。研究结论1.右美托咪定直接作用于T细胞表面的α2受体诱导Th1细胞分化,且药物浓度为0.1nM时效果最为显着。2.右美托咪定诱导Th1细胞分化中,STAT1磷酸化水平升高,T-bet表达增多,该作用可被atipamezole和fludarabine逆转,表明右美托咪定激活α2受体后通过STAT1/T-bet途径促使Th1细胞漂移。
朱匡政[5]（2020）在《T-bet、GATA-3在膀胱尿路上皮癌组织中的检测及临床意义》文中指出目的检测T-bet、GATA-3在膀胱尿路上皮癌（BUC）组织、正常膀胱组织中的表达情况,分析T-bet、GATA-3在BUC组织中的表达水平与临床病理特征、预后的关系及其临床意义。方法收集79例临床和病理资料齐全患者术后的BUC组织标本及15例正常膀胱组织标本,采用免疫组化的方法检测标本中T-bet、GATA-3的表达情况,应用SPSS19.0软件利用χ2检验或Fisher确切概率法,分析T-bet、GATA-3在BUC组织及正常膀胱组织中的表达有无差异,分析BUC组织中T-bet、GATA-3的表达水平与年龄、性别、临床分期、病理分级、淋巴结转移、复发或进展的关系及其临床意义,分析T-bet和GATA-3在BUC组织中表达的相关性及其意义。结果T-bet在BUC组织中的表达水平显着高于正常膀胱组织（P=0.001）;GATA-3在正常膀胱组织的表达水平显着高于BUC组织（P=0.005）;T-bet在高级别BUC组织中的表达水平显着高于中、低级别BUC组织（P<0.001）;T-bet在肌层浸润性BUC组织（T2-T4）中的表达水平显着高于非肌层浸润性BUC组织（Ta-T1）（P<0.001）;T-bet在伴有复发或转移患者的BUC组织中的表达水平显着高于不伴复发或转移患者的BUC组织（P<0.05）;GATA-3在中、低级别BUC组织中的表达水平显着高于高级别BUC组织（P<0.001）;GATA-3在非肌层浸润性BUC组织（Ta-T1）中的表达水平显着高于肌层浸润性BUC组织（T2-T4）（P<0.05）;GATA-3在不伴复发或转移患者的BUC组织中的表达水平显着高于伴有复发或转移患者的BUC组织（P<0.05）;T-bet、GATA-3在不同性别、不同年龄或有无淋巴转移患者BUC组织中的表达水平无明显差异（P>0.05）;在BUC组织中,T-bet表达水平和GATA-3表达水平呈负相关（R=-0.610,P<0.001）。结论1.T-bet在BUC组织中的表达水平显着高于正常膀胱组织;2.GATA-3可作为鉴别BUC与其他泌尿系肿瘤的标志物;3.T-bet、GATA-3参与调控BUC的恶性生物学行为。T-bet在BUC组织中的高表达常提示较高的临床分期、病理分级,术后更易复发或进展。GATA-3在BUC组织中的高表达常提示较低的临床分期、病理分级,术后复发或进展的可能性较低;4.在BUC组织中,T-bet和GATA-3的表达水平呈负相关;5.对T-bet、GATA-3的深入研究有望为BUC提供新的靶向治疗方法。
唐大斌[6]（2020）在《全反式维甲酸治疗再生障碍性贫血的作用及机制研究》文中指出再生障碍性贫血（再障）是一种病死率较高的血液系统疾病,临床死因主要为无法控制的出血及感染,其发病机制尚未完全阐明,目前主流观点认为原发获得性再障的主要发病机制是异常活化的自身T细胞攻击骨髓造血干细胞以及其他重要的骨髓细胞成分从而导致骨髓脂肪化和骨髓衰竭,以抗胸腺细胞球蛋白联合环孢素的免疫抑制治疗方案可以挽救大部分病人,这进一步证实再障发病的主要原因为免疫异常,然而病人长期服用环孢素导致的严重副作用以及环孢素停用后的复发问题一直未能得到有效解决,因此非常有必要开发新的治疗方法以弥补免疫抑制治疗方式的不足。全反式维甲酸（维甲酸）是体内维生素A的正常代谢产物,具有免疫调节和影响T细胞亚群分化的作用,因而可能纠正再障的T细胞比例失衡从而对再障治疗起作用。在我们的研究中,通过构建经典的T细胞介导的获得性再障小鼠模型,利用流式细胞术、免疫荧光、液相色谱-质谱、转录组测序、染色质免疫沉淀测序等方法,探索维甲酸治疗再障的可能性及其机制。我们发现维甲酸可以减少再障小鼠骨髓中浸润的T细胞,增加骨髓有核细胞总数和造血干细胞数,改善外周血白细胞和血小板数量,抑制骨髓炎症增生性新生血管和降低内皮细胞比例,保护骨髓间充质干细胞、巨核细胞等重要骨髓细胞成分,显着延长再障小鼠的生存时间;维甲酸可以抑制再障小鼠的T细胞体内增殖、激活、迁移以及效应功能,降低骨髓中T细胞的Ki67、LFA-1、CD44、CXCR4和Fasl的蛋白表达,减少骨髓中非-T细胞的Fas表达;维甲酸可以抑制T细胞的代谢过程:增加骨髓T细胞的甜菜碱从而清除细胞内活性氧和线粒体活性氧;维甲酸可以降低骨髓T细胞的棕榈酰胺,减少活化T细胞增殖和发挥效应功能的能量来源。维甲酸可以维持再障小鼠骨髓内调节性T细胞比例至正常水平,但是调节性T细胞移植治疗再障小鼠并不能改善再障小鼠的预后,说明维甲酸治疗再障的主要机制不是通过维持Treg细胞的比例;维甲酸可以降低骨髓中辅助性T细胞（T helper cell,Th）1和Th17细胞的比例,增加Th2细胞的比例,减少外周血中Th1和Th17细胞相关的促炎因子,增加Th2细胞相关的抗炎因子,从而纠正再障的免疫不平衡,部分恢复Th1/Th2比例;进一步的分析揭示维甲酸通过抑制NFAT1通路,直接抑制IFN-γ和Th1细胞的关键转录因子T-bet,以及上调Th2细胞的的正向调控因子-Jun B,从而促进Th1细胞向Th2细胞分化偏倚;此外,维甲酸除了下调Th17细胞的关键转录因子-RORγt,还可激活RARα通路,上调Irf8,显示出强大的抑制Th17细胞分化的能力。总之,我们证实ATRA治疗T细胞介导的获得性再障小鼠具有非常好的效果,初步阐明了其具体作用机制,并且由于其具有的经济性及安全性,为其进一步进入临床应用研究奠定了坚实的基础。
孙莹莹[7]（2020）在《髓样树突状细胞中cofilin 1在重型再生障碍性贫血发病机制中作用的研究》文中研究表明目的通过研究SAA患者mDC内cofilin 1表达水平,及其对mDC和下游效应T淋巴细胞的影响,探索cofilin 1在SAA免疫发病中的作用,为完善SAA免疫发病机制,寻求新的治疗靶点提供理论依据。方法一,通过流式细胞术、WB方法检测30例SAA患者（初治15例、完全缓解15例）和15名健康对照者mDC内cofilin 1蛋白表达水平,并将SAA患者cofilin 1水平与其血常规、免疫指标作相关性分析。通过q RT-PCR方法检测三组患者mDC内cofilin 1的m RNA相对表达水平。二,应用RNAi技术敲低SAA患者mDC内cofilin 1表达水平,对敲低前后的mDC进行如下检测:CCK-8检测细胞增殖、流式细胞术检测凋亡、流式细胞术和免疫荧光方法检测吞噬能力、Transwell实验检测细胞迁移能力、流式细胞术检测共刺激分子CD80和CD86表达水平,免疫荧光检测F-actin。三,将cofilin 1敲低前后的SAA患者mDC与CD4+T淋巴细胞共培养,流式细胞术检测各组共培养上清Th1和Th2相关细胞因子的表达差异,流式细胞术检测Treg细胞foxp3的表达水平。四,将cofilin 1敲低前后的SAA患者mDC与CD8+T淋巴细胞共培养,CFSE检测各组CD8+T淋巴细胞的增殖状况差异,流式细胞术检测其分泌穿孔素、颗粒酶B水平变化。结果一,流式检测初治SAA患者mDC内cofilin 1水平[（70.37±22.70）%]明显高于健康对照者[（39.65±23.43）%,P=0.006]及SAA完全缓解者[（43.97±21.23）%,P=0.002],完全缓解组及健康对照组之间无统计学差异。SAA患者mDC内cofilin1水平,与患者的白细胞计数显着负相关（r=-0.57,P=0.0026）,与中性粒细胞绝对值显着负相关（r=-0.49,P=0.0134）,与血小板计数显着负相关（r=-0.57,P=0.0028）,与血红蛋白水平显着负相关（r=-0.47,P=0.0192）,与网织红细胞绝对值显着负相关（r=-0.4089,P=0.0424）;与CD4+/CD8+比值显着负相关（r=-0.62,P=0.0010）,与IL-2浓度显着正相关（r=0.56,P=0.0037）,与IFN-γ浓度显着正相关（r=0.56,P=0.0037）。WB检测显示SAA初治患者mDC内cofilin 1表达水平高于SAA完全缓解者及健康对照者。q RT-PCR检测提示SAA初治组患者骨髓培养mDC内cofilin 1的m RNA相对表达量（9.13±10.32）显着高于完全缓解组（2.91±3.08,P=0.049）和健康对照组（1.74±1.70,P=0.020）。二,经q RT-PCR和WB验证成功敲低mDC中cofilin 1水平,蛋白敲低水平为31.6%。应用流式细胞术检测mDC吞噬功能显示敲低组显着低于阴性转染组[（22.64±12.53）%vs（40.07±11.90）%,P=0.000],免疫荧光实验支持上述结果。Transwell检测mDC迁移功能结果示cofilin 1敲低组显着低于阴性转染组（45.08±31.98 vs 67.75±38.07,P=0.044）。流式细胞术检测mDC表面CD86表达水平示敲低组显着低于阴性转染组[（73.80±17.18）%vs（77.26±14.39）%,P=0.034]。Cofilin 1敲低组与阴性转染组之间mDC增殖、凋亡、CD80表达水平无统计学差异。免疫荧光检测结果显示cofilin 1敲低组F-actin含量增高,细胞突起密度增加,发生明显的重构。三,流式细胞术检测mDC与CD4+T淋巴细胞共培养体系中CD4+T淋巴细胞分泌Th1相关细胞因子水平:与阴性转染组相比,cofilin 1敲低组IL-2浓度降低[（179.48±180.52）pg/ml vs（216.32±203.24）pg/ml,P=0.024],TNF-α浓度降低[（178.08±146.00）pg/ml vs（232.48±157.75）pg/ml,P=0.017],IFN-γ浓度降低[（2499.71±2051.73）pg/ml vs（3020.96±2340.99）pg/ml,P=0.023];Th2相关细胞因子仅IL-6浓度降低（357.19±237.02）pg/ml vs（435.74±325.01）pg/ml,P=0.047],IL-4和IL-10浓度无差异。Cofilin 1敲低前后共培养体系Treg表达foxp3水平无差异。四,CFSE检测mDC与CD8+T淋巴细胞共培养体系中CD8+T淋巴细胞增殖,结果显示cofilin 1敲低组CD8+T淋巴细胞CFSE平均荧光强度为显着高于阴性转染组（1610313.97±1182187.85 vs 1107368.41±901731.27,P=0.028）。流式细胞术检测cofilin 1敲低组CD8+T淋巴细胞分泌穿孔素显着低于阴性转染组[（29.39±15.51）%vs（31.71±14.99）%,P=0.023],cofilin 1敲低组CD8+T淋巴细胞分泌颗粒酶B显着低于阴性转染组[（15.49±10.89）%vs（23.35±10.56）%,P=0.019]。结论一,初治SAA患者mDC内cofilin 1蛋白水平高于完全缓解者和健康对照者。SAA患者mDC内cofilin 1水平和患者的免疫状态、疾病严重程度密切相关,cofilin 1水平越高,免疫紊乱越严重,病情越重。q RT-PCR检测发现cofilin 1m RNA升高,提示cofilin 1在转录水平即升高。二,经RNAi技术敲低SAA患者mDC内cofilin 1,可通过F-actin重构,降低mDC吞噬、迁移功能以及表面共刺激分子CD86的表达水平。对mDC增殖、凋亡、CD80表达无影响。三,Cofilin 1能够增加SAA患者mDC刺激CD4+T淋巴细胞分泌Th1相关细胞因子（IL-2、TNF-α、IFN-γ）和Th2相关细胞因子（IL-6）的能力,以Th1为着。对Treg表达Foxp3能力无影响。四,Cofilin 1能够增加SAA患者mDC刺激CD8+T淋巴细胞增殖和分泌穿孔素、颗粒酶B的能力。五,SAA患者中cofilin 1表达水平或许可以作为SAA诊断和评价的新指标,有望成为SAA治疗的新靶点。
张良[8]（2020）在《WAS蛋白在急性LCMV感染中对CD4辅助T细胞和生发中心B细胞分化的影响研究》文中研究说明第一部分WAS蛋白在急性LCMV感染中对CD4辅助T细胞和生发中心B细胞分化的影响研究研究背景与目的:B细胞产生保护性抗体是机体体液免疫应答对抗病毒、细菌等微生物感染入侵的最重要机制之一,体液免疫应答形成的记忆B细胞和长寿命浆细胞是机体适应性免疫应答的核心,而该过程的产生依赖于生发中心B细胞免疫应答（Germinal Center B cell reaction）,活化的B细胞在此历经克隆增殖、体细胞超频突变、抗体类别转换、抗体亲和力成熟等过程,这些过程也需要与一类特殊的CD4辅助T细胞即滤泡辅助性T淋巴细胞（Follicular Helper T cell,Tfh）的相互作用。在急性LCMV病毒感染模型中,CD4辅助T细胞在不同的TCR信号、细胞因子、信号转导分子、核转录因子的调控下主要分化成Tfh细胞和Th1细胞,分别发挥辅助B细胞和CD8 T细胞的作用。Tfh的分化是一个多步骤的过程,涉及到DC细胞和活化T细胞间突触、TCR-MHCⅡ的相互作用,共刺激分子、细胞因子及信号转导分子对其主要转录因子BCL6的调控决定Tfh早期分化命运;早期分化的Tfh迁移至GC,在此处与GCB细胞间通过频繁的细胞接触、细胞因子、共刺激分子等相互作用进一步发育为GCTfh,在GC中Tfh和GCB间相互作用,既促进GCB免疫应答,也促进和维持GCTfh的分化和功能。急性LCMV病毒感染是研究CD4辅助T细胞分化、Tfh分化发育、生发中心B细胞免疫应答、抗体生成、Th1功能和免疫记忆的理想模型之一。Wiskott-Aldrich综合征（Wiskott-Aldrich syndrome,WAS）是一种少见的X-连锁隐性遗传性免疫缺陷病,该病由编码WAS蛋白（WASp）的WAS基因突变所致,WAS患儿易感染各种病原,包括病毒、细菌、真菌等。WASp仅在造血系统表达,是肌动蛋白多聚化和细胞骨架重塑的关键分子,通过细胞骨架依赖及非依赖途径在造血细胞分化、迁移,免疫突触形成,细胞信号传导中起重要作用,WASp缺陷可导致多种免疫细胞的功能异常,导致机体对病原体产生特异性抗体功能缺陷和细胞免疫应答缺陷。但目前WASp缺陷如何影响感染状态下CD4 T与B淋巴细胞的免疫应答的机制尚不十分清楚,本研究使用急性LCMV病毒感染WASKO小鼠为模型,探讨WASp缺陷对CD4辅助T细胞和生发中心B细胞分化的影响和可能的分子机制。方法:通过流式细胞术检测不同时间段急性LCMV病毒感染后WASKO和WT小鼠脾脏中CD4辅助T细胞中Th1和Tfh细胞亚群的比例、主要分化发育相关的共刺激分子、信号转导分子和主要的核转录因子,检测GCB发育、GCB亚群、GCB的主要核转录因子BCL6。利用四聚体技术检测抗原特异性Th1和Tfh细胞的比例。通过NP-KLH免疫小鼠后,检测小鼠脾脏记忆B细胞前体细胞比例,探讨抗原特异性GCB细胞的分化。通过WASKO/WT骨髓嵌合体小鼠模型验证WAS蛋白缺陷在急性LCMV病毒感染时特异性T和B细胞免疫缺陷是否为固有存在。结果:WASKO小鼠在急性LCMV病毒感染条件下CD4辅助T细胞早期分化阶段出现IL2-CD25-STAT5轴信号转导障碍导致Th1细胞发育障碍,进而Tfh分化占优势;WASp缺陷影响Tfh进一步发育的主要功能分子BCL6和ICOS,导致GCTfh的发育障碍;WASKO小鼠GCB主要的核转录因子BCL6表达障碍,GCB暗区形成障碍;GCB细胞分化异常表现为GCB分化为多克隆性记忆B细胞前体细胞比例增高而分化成多克隆性记忆B细胞存在障碍;NP-KLH免疫条件下抗原特异性GCB分化为记忆B细胞前体细胞比例增加,但分化形成抗原特异性记忆B细胞存在障碍。WT小鼠GCB细胞内WASp呈现异质性表达的现象,并且BCL6的表达量与WASp呈正相关。结论:WASp作为肌动蛋白骨架蛋白调节因子通过多种途径参与了急性LCMV病毒感染中CD4辅助T细胞的早期分化命运、Tfh的发育和GCB免疫应答和记忆B细胞形成的过程。第二部分PI3Kδ过度活化对脾脏前体B细胞发育的影响研究研究背景与目的:活化的磷酸肌醇3-激酶δ综合征（Activated phosphoinositide 3-kinaseδsyndrome APDS）是一种由PIK3CD增功能突变（gain-of-function（GOF）mutation）引起的常染色体显性遗传性原发性免疫缺陷病,该基因编码磷酸肌醇3-激酶δ（PI3Kδ）的催化亚基p110δ。PI3Kδ是包含p110δ催化亚基和p85a调控亚基的异二聚体,催化产生磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸酯,PI3Kδ主要表达在白细胞中并在其增殖生存和激活中起重要作用。APDS患者临床主要表现为反复窦肺感染、支气管扩张、良性淋巴组织增生、疱疹病毒感染以及自身免疫性疾病,其免疫表型主要为高Ig M、低Ig G、CD4 T淋巴细胞减少、衰老耗竭性CD8 T淋巴细胞增加。目前研究阐明Tfh和GCB的异常导致患者出现低Ig G,但患者出现高Ig M血症的机制尚不十分清楚。在机体边缘区B细胞（marginal zone B cell,MZB）及B1细胞是产生Ig M的主要来源,患者和小鼠模型中均发现在B细胞亚群中MZB及B1细胞比例增加和滤泡B细胞的明显减少,且增多的MZB和B1与自身免疫性疾病和肺部感染易感性相关,但p110δ过度活化如何导致MZB和B1细胞增加的机制尚不清楚。早期B细胞在骨髓发育后进入脾脏进一步发育分化成熟,逐渐经历过渡性B细胞T1、T2阶段分化为成熟的滤泡B细胞和MZB,目前的研究表明在更早的T1B阶段即存在ADAM10阳性的细胞亚群为专职发育成MZB的前体细胞以及CD19+B220low CD5+Ig M+CD93+的过渡性B细胞为专职发育成B1的前体细胞。本实验拟通过检测APDS小鼠脾脏前体B细胞亚群,探讨PI3Kδ过度活化是否在过渡性B细胞阶段即影响了专职的MZB前体细胞和B1前体细胞的分化进而导致B细胞的分化发育异常。方法:通过流式细胞术检测APDS小鼠和WT小鼠脾脏T1B、T2B、CD19+B220low CD5+Ig M+CD93+B、ADAM10+T1B等B细胞各亚群的比例。通过APDS/WT骨髓嵌合体小鼠模型验证B细胞各亚群的发育分化异常是否为固有存在。结果:与WT小鼠相比,APDS小鼠脾脏成熟滤泡B细胞比例下降,CD19+B220+CD21+CD23-CD93-和CD19+B220+CD21+CD1d+CD93-MZB增加,CD19+B220low CD5+B1细胞增加,CD19+B220+CD21-CD23-CD93-的双阴性B细胞比例增加;APDS小鼠CD19+B220+Ig M+CD23-CD93+的T1B细胞比例增加,CD19+B220+Ig M+CD23+CD93+的T2B细胞比例下降;APDS小鼠脾脏B1细胞前体细胞CD19+B220low CD5+Ig M+CD93+、MZB前体细胞ADAM10+T1B细胞亚群比例增高。结论:PI3K过度活化通过影响T1B细胞ADAM10的表达使得在T1B细胞阶段专职的MZB前体细胞分化增加是APDS小鼠MZB细胞发育增加而成熟滤泡B细胞发育减少的重要机制之一;PI3K过度活化在过渡性B细胞阶段导致脾脏前体细胞CD19+B220low CD5+Ig M+CD93+分化增加进而导致脾脏B1细胞的发育增加。第三部分一例RAC2基因自发突变患儿临床研究研究背景:RAC2蛋白（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 2,RAC2）属于GTP酶的Rho超家族的成员,其主要表达于造血系统,作为中性粒细胞NADPH组成元件参与粒细胞ROS产生、作为分子开关通过调节GTP结合状态（活化状态）与GDP结合状态（失活状态）间的相互转换促发下游级联反应发挥免疫细胞骨架重排、细胞伪足形成、吞噬细胞黏附趋化吞噬功能、T淋巴细胞和B淋巴细胞的发育、迁移、活化及参与PAK1等多种信号通路信号传导发挥多种生物信息功能。RAC2基因突变病例极其罕见,既往报道RAC2基因突变方式包括常染色体显性失功能突变方式导致中性粒细胞功能严重障碍而表现为CGD的临床症状,部分患儿表现为T淋巴细胞的严重减少;以及常染色体隐性失功能突变方式导致CVID的临床表现;这两种遗传方式导致的RAC2蛋白的表达明显下降或缺失,为失功能（loss of function,LOF）的突变。随着基因测序技术的发展和广泛应用,目前逐渐有RAC2常染色体显性增功能突变方式导致RAC2蛋白活性增强（gain of function,GOF）的病例报道,此类患儿的临床表现各异,其粒细胞ROS活性增强,T淋巴细胞和B淋巴细胞严重减低,对于T淋巴细胞和B淋巴细胞严重减低的机制目前不清楚。本中心收治1例RAC2基因自发突变的患儿,该突变位点未见报道,临床主要变现为反复的肺部感染和支气管扩张,我们对其临床和部分免疫细胞功能进行了初步研究。研究方法:分离外周血单个核淋巴细胞及中性粒细胞,进行一代测序;通过流式细胞术检测患儿淋巴细胞亚群表型;通过CD3+CD28及PMA+离子霉素体外刺激检测T淋巴细胞增殖功能;通过鲁米诺放大化学发光法检测中性粒细胞ROS的产生;通过流式细胞术检测中性粒细胞肌动蛋白的表达情况;通过共聚焦显微镜观察中性粒细胞及T淋巴细胞极化状态;通过蛋白免疫印迹检测RAC2蛋白的表达情况;通过流式细胞术检测中性粒细胞和T淋巴细胞及B淋巴细胞凋亡;通过流式细胞术检测单个核淋巴细胞亚群RAC2的表达情况。结果:患儿为RAC2基因自发错义突变,患儿单个核淋巴细胞及中性粒细胞均存在此突变,其免疫表型为联合免疫缺陷,其T细胞增殖功能减低,粒细胞产生ROS功能增强,粒细胞肌动蛋白表达增强;患儿中性粒细胞及T淋巴细胞体外刺激时细胞actin和RAC2极化状态缺陷;患儿中性粒细胞RAC2蛋白表达增强;患儿中性粒细胞和淋巴细胞凋亡增加;患儿淋巴细胞中存在RAC2高表达亚群。结论:本研究发现一例罕见的RAC2基因自发突变,表现为增功能突变,免疫表型为联合免疫缺陷,其淋巴细胞及中性粒细胞功能均受影响。
严胡铃[9]（2020）在《探讨hUC-MSCs调节HBV肝硬化患者免疫功能的可能机制》文中进行了进一步梳理目的:本研究通过分析人脐带间充质干细胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs）移植治疗脾切除术后HBV-LC患者的多项肝功能和免疫学指标的变化,对比其与标准内科治疗的HBV-LC和正常人群免疫功能之间是否存在差异,探究hUC-MSCs移植的疗效和可能的作用机制。方法:共纳入符合标准的HBV-LC患者20例,其中10例自愿接受hUC-MSCs移植治疗,其余10例接受标准内科治疗,并选取同期健康体检者10例作为健康对照。hUC-MSCs移植组患者入院后1周在超声引导下经皮经肝门静脉输注1×108个hUC-MSCs,1次。分别检测hUC-MSCs移植组与内科治疗组移植/治疗前1周、移植/治疗后1、4、12周,以及健康对照组在入院体检的各血生化、凝血常规等指标,并计算Child-Pugh分级与MELD评分;采用免疫图谱分析TCR多样性;流式细胞术分析各T淋巴细胞亚群比例;ELISA检测血清中相关细胞因子分泌情况、Real-time PCR检测相关转录因子mRNA表达水平。结果:（1）hUC-MSCs移植组及内科治疗组移植/治疗前TP、Alb、A/G值均低于健康对照组,且分别在hUC-MSCs移植后第4、12周及内科治疗后第1、4、12周明显升高,且hUC-MSCs移植组在第12周时以上指标高于内科治疗组,各指标差异均具有统计学意义（P<0.05）。（2）hUC-MSCs移植组及内科治疗组TBIL、DBIL、IBIL、AST、ALT、γ-GGT、Child-Pugh分级、MELD评分在移植/治疗前均低于健康对照组,分别在hUC-MSCs移植后第4、12周以及内科治疗第1、4、12周后显着降低,此外,hUC-MSCs移植后第4、12周以上各指标均低于同期内科治疗组,各指标差异均具有统计学意义（P<0.05）。（3）hUC-MSCs移植组与内科治疗组TCR D50值在移植/治疗前均低于健康对照组,且hUC-MSCs移植组在移植后第1、4、12周TCR D50值显着升高,且高于内科治疗组,差异有统计学意义（P<0.05）。（4）流式检测结果表明hUC-MSCs移植组与内科治疗组CTLs比例及CD28+/CD28-比值在移植/治疗前低于健康对照组,且在经hUC-MSCs移植后第4、12周较移植前增加,并高于内科治疗组;而Th17比例及Th17/Treg比值在移植/治疗前高于健康对照组,在移植后1、4、12周均较移植前明显降低,并低于内科治疗组,差异有统计学意义（P<0.05）。（5）ELISA检测结果表明hUC-MSCs移植组移植前IL-17、IL-21浓度明显高于健康对照组,在移植后1、4、12周后显着降低;IL-10、TGF-β浓度低于健康对照组,于移植后4、12周明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）。（6）RT-PCR结果显示hUC-MSCs移植组RORγt mRNA表达量及RORγt/Foxp3 mRNA比值均高于健康对照组,经移植后1、4、12周后逐渐降低,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:（1）hUC-MSCs移植治疗可有效改善HBV-LC患者的肝功,是一种治疗HBV-LC的有效方法。（2）hUC-MSCs移植可通过改善异常克隆,提高TCR多样性,从而调节免疫平衡,增加机体免疫力。（3）hUC-MSCs通过提高CD8+CD28+/CD8+CD28-比值,增加CTLs比例,增强HBV-LC患者抗感染能力;通过Th17、Treg淋巴细胞数量与功能的变化改善HBV-LC患者肝功能及免疫功能。（4）hUC-MSCs通过促进TGF-β分泌,促进Tregs增殖与活化,抑制Th17的数量与功能,调节免疫平衡以改善HBV-LC患者肝功能,延缓疾病进展。
张林丽[10]（2020）在《Th1/Th2细胞功能失衡与脑卒中后抑郁的相关性研究》文中研究指明背景脑卒中后抑郁（Post-stroke depression,PSD）是指继发于卒中后的抑郁,属于继发性抑郁。中风患者在识别抑郁症方面面临着独特的挑战。目前,对PSD的发病机制尚未明确,免疫炎症反应在卒中后抑郁病理生理过程中可能发挥重要作用,尤其是CD4+T淋巴细胞及其相关细胞因子的失衡。所以本研究探究Th1/Th2细胞功能失衡与PSD发生的相关性,可能为PSD的识别及诊治提供新的线索。目的研究Th1/Th2细胞的功能失衡机制与PSD发生的关联性。方法根据入组标准及排除标准,选取2018年3月至2019年11月本院神经内科收治的首次发生急性缺血性脑卒中在院患者,均已完成影像学检查及相关量表评估,给与常规神经内科治疗。于卒中后30天进行随访,复查头颅磁共振检查、各项生化指标检测及量表评定。根据汉密尔顿抑郁量表17项（Hamilton depression scale 17 items,HAMD-17）,分为PSD组（总分≥7分）和非PSD组（总分<7分）。收集患者人口学资料、既往病史（高血压病、糖尿病等）及各项神经系统评分（美国国立卫生院卒中量表评分、简易智能精神状态检查量表、蒙特利尔认知评估量表、Barthel指数评定量表）。取患者卒中后30天的空腹肘静脉血,采用Dynabeads磁珠分选CD4+T淋巴细胞,流式细胞仪检测技术检测CD4+T淋巴细胞纯度后,提取其RNA,采用定量即时聚合酶链锁反应技术（Quantitative real time polymerase chain reaction,q-PCR）检测Th1细胞、Th2细胞分泌的细胞因子IFN-γ、IL-4表达水平,使用免疫比浊法检测超敏C反应蛋白（Hypersensitive C-reactive protein,hs-CRP）水平,使用循环酶法检测同型半胱氨酸（Homocysteine,Hcy）水平,使用葡萄糖氧化酶法检测空腹血糖水平。结果（1）200例脑卒中患者完成随访者120例,其中PSD组57例,男30例（52.63%）,女27例（47.37%）;非PSD组63例,男39例（61.90%）,女24例（38.10%）;（2）PSD组与非PSD组相比,两组在性别、年龄、高血压病史、糖尿病史、病灶部位、同型半胱氨酸、超敏C反应蛋白、空腹血糖、NHISS评分、MMSE评分、MoCA评分、Barthel评分等,差异无统计学意义（P>0.05）;两组HAMD评分比较,差异有统计学意义（P<0.05）;（3）两组IFN-γ、IL-4表达水平比较,PSD组IFN-γ的表达水平显着高于非PSD组,差异具有统计学意义（P<0.05）;PSD组IL-4的表达水平低于非PSD组（P<0.05）,差异具有统计学意义;（4）IL-4、IFN-γ表达水平和抑郁量表评分的相关性,IFN-γ水平与抑郁评分呈现正相关（r=0.398,P=0.011,95%CI:0.68,4.90）;IL-4水平与抑郁评分呈现负相关（r=0.324,P=0.042,95%CI:-0.57,-0.11）。结论1.PSD患者外周血中IFN-γ的表达水平升高,IL-4的表达水平降低,且IFN-γ的高表达与抑郁正相关,IL-4的低表达与抑郁负相关。2.Th1细胞分泌的IFN-γ高表达,Th2细胞分泌的IL-4低表达,证实Th1/Th2细胞功能失衡参与PSD的发生发展。
二、诱导Th1细胞定向分化的新转录因子T-bet（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、诱导Th1细胞定向分化的新转录因子T-bet（论文提纲范文）
（2）白细胞介素-27在支气管哮喘气道炎症和气道重构中的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 引言 |
| 第一部分 预防性IL-27处理对哮喘模型小鼠气道炎症、气道高反应和气道重构的影响及相关的信号通路研究 |
| 一、材料及方法 |
| (一) 实验材料 |
| 1. 主要仪器 |
| 2. 主要试剂 |
| 3. 主要配制试剂极其配制方法 |
| 4. 实验动物 |
| (二) 实验方法 |
| 1. 哮喘动物模型的建立 |
| 2. 气道反应性测定 |
| 3. 支气管肺泡灌洗液中细胞计数及分类 |
| 4. ELISA法测定BALF的上层清液和血清中细胞因子的含量 |
| 5. 实时定量PCR(Quantitative real-time PCR)法检测肺组织中STAT1、STAT3、T-bet和GATA3 mRNA的表达 |
| 6. Wester blot检测肺组织中STAT1、 pSTAT1、 STAT3、 pSTAT3、 T-bet和GATA3蛋白的表达 |
| 7. 组织病理 |
| 8. 技术路线图 |
| (三) 统计学处理 |
| 二 结果 |
| 1. OVA诱导的哮喘模型小鼠症状及体征变化 |
| 2. 三组小鼠BALF中细胞总数和分类 |
| 2.1 IL-27降低小鼠BALF中细胞总数 |
| 2.2 IL-27降低小鼠BALF中不同的白细胞数量 |
| 3. IL-27改善小鼠的AHR |
| 4. IL-27减少急性哮喘模型三组小鼠BALF上清中IL-4、IL-5、IL-13、L-17含量,提高IFN-y含量 |
| 5. IL-27降低急性哮喘模型三组小鼠血清中IL-4、IL-5、IL-13、IL-17含量,提高IFN-γ水平 |
| 6. IL-27提高小鼠肺组织STAT1、STAT3、T-bet mRNA的表达,减低GATA3 mRNA的表达 |
| 6.1 STAT1 mRNA PCR定量分析 |
| 6.2 STAT3 mRNA PCR定量分析 |
| 6.3 GATA3 mRNA PCR定量分析 |
| 6.4 T-bet mRNA PCR定量分析 |
| 7. IL-27提高小鼠肺组织STAT1、p-STAT1、STAT3、p-STAT3和T-bet蛋白的表达,降低GATA3的表达 |
| 7.1 STAT1和磷酸化STAT1(p-STAT1)蛋白的表达 |
| 7.2 STAT3和磷酸化STAT3(p-STAT3)蛋白的表达 |
| 7.3 GATA3蛋白的表达 |
| 7.4 T-bet蛋白的表达 |
| 8. IL-27改善慢性小鼠哮喘模型的气道重构 |
| 8.1 IL-27改善小鼠基底膜增厚和气道平滑肌细胞增生程度 |
| 8.2 IL-27改善小鼠杯状细胞增生程度 |
| 8.3 IL-27减少小鼠上皮下纤维化程度 |
| 8.4 IL-27降低小鼠纤维母细胞的激活程度 |
| 8.5 IL-27改善小鼠血管生成状况 |
| 第二部分 治疗性IL-27处理对哮喘模型小鼠气道炎症、气道高反应和气道重构的影响 |
| 一、材料及方法 |
| (一) 实验材料 |
| 1. 主要仪器 |
| 2. 主要试剂 |
| 3. 主要配制试剂极其配制方法 |
| 4. 实验动物 |
| (二) 实验方法 |
| 1. 哮喘动物模型的建立 |
| 2. 气道反应性测定 |
| 3. 支气管肺泡灌洗液中细胞计数及分类 |
| 4. ELISA法测定BALF的上层清液和血清中细胞因子的含量 |
| 5. 实时定量PCR法检测肺组织中STAT1、STAT3、T-bet和GATA3 mRNA的表达 |
| 6. Wester blot检测肺组织中STAT1、pSTAT1、STAT3、pSTAT3、T-bet和GATA3蛋白的表达 |
| 7. 组织病理 |
| 8. 技术路线图 |
| (三) 统计学处理 |
| 二、结果 |
| 1. 哮喘模型小鼠症状及体征变化 |
| 2. 三组小鼠BALF中细胞总数和分类 |
| 2.1 IL-27不能降低小鼠BALF中细胞总数 |
| 2.2 IL-27对小鼠BALF中不同类型的白细胞含量无影响 |
| 3. IL-27不能改善小鼠的AHR |
| 4. IL-27对急性哮喘模型小鼠BALF上清中IL-4、IL-5、IL-13、IL-17和IFN-γ含量没有影响 |
| 5. IL-27不影响急性哮喘模型小鼠血清中IL-4、IL-5、IL-13、IL-17和IFN-y水平 |
| 6. IL-27不影响小鼠肺组织STAT1、STAT3、T-bet和GATA3 mRNA的表达. |
| 6.1 STAT1 mRNA PCR定量分析结果 |
| 6.2 STAT3 mRNA PCR定量分析结果 |
| 6.3 GATA3 mRNA的表达 |
| 6.4 T-bet mRNA PCR定量分析 |
| 7. IL-27对小鼠肺组织STAT1、p-STAT1、STAT3、p-STAT1、T-bet和GATA3蛋白的表达没有作用 |
| 7.1 STAT1和p-STAT1蛋白的表达 |
| 7.2 STAT3和p-STAT3蛋白的表达 |
| 7.3 GATA3蛋白的表达 |
| 7.4 T-bet蛋白的表达 |
| 8. IL-27对慢性小鼠哮喘模型气道重构没有影响 |
| 8.1 IL-27不改善模型小鼠基底膜增厚和气道平滑肌细胞增生 |
| 8.2 IL-27不影响模型小鼠杯状细胞增生状况 |
| 8.3 IL-27不能减少模型小鼠上皮下纤维化 |
| 8.4 IL-27不影响模型小鼠纤维母细胞的激活 |
| 8.5 IL-27不改善模型小鼠血管增生状况 |
| 讨论 |
| 1. 支气管哮喘是一种慢性气道炎症性疾病 |
| 2. 预防性给予IL-27抑制OVA诱导的急性BA模型小鼠气道炎症和AHR |
| 3. 预防性给予IL-27可以改善OVA诱导的慢性哮喘模型小鼠气道重构 |
| 4. IL-27通过STAT1/STAT3信号途径改善OVA诱导的哮喘小鼠气道炎症、AHR和气道重构 |
| 5. 治疗性给予IL-27不能改善OVA诱导的BA小鼠气道炎症、AHR以及气道重构 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 白细胞介素-27在T淋巴细胞免疫中的作用 |
| 1. IL-27的分子组成 |
| 2. IL-27的来源 |
| 3. IL-27的受体 |
| 4. IL-27的信号转导 |
| 5. IL-27在T细胞免疫中的作用 |
| 5.1 IL-27在Th1细胞免疫中的作用 |
| 5.2 IL-27在Th2细胞免疫中的作用 |
| 5.3 IL-27在Th17细胞免疫中的作用 |
| 5.4 IL-27在Treg免疫中的作用 |
| 5.5 IL-27在滤泡辅助T细胞(Tfh)免疫中的作用 |
| 5.6 IL-27在Th22细胞免疫中的作用 |
| 5.7 IL-27在Th9细胞免疫中的作用 |
| 5.8 IL-27在CD8~+T细胞免疫中的作用 |
| 6. 结语 |
| 7. 参考文献 |
| 附图表 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的学术成果 |
| 外文论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（3）桦褐孔菌多糖对小鼠炎症性肠病模型的治疗作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 炎症性肠病 |
| 1.1.1 炎症性肠病流行病学 |
| 1.1.2 IBD的致病因素及病理学改变 |
| 1.1.3 IBD相关的发病机制 |
| 1.1.4 IBD的药物治疗 |
| 1.1.5 IBD的天然药物治疗 |
| 1.2 CD4~+T细胞与IBD |
| 1.2.1 Th1/Th2细胞平衡与IBD |
| 1.2.2 Th17/Treg细胞平衡与IBD |
| 1.3 DC与IBD |
| 1.3.1 DC的分类及功能 |
| 1.3.2 DC在IBD发病中的作用 |
| 1.3.3 DC回输治疗IBD |
| 1.4 桦褐孔菌及桦褐孔菌多糖 |
| 1.4.1 桦褐孔菌的生长环境及药用价值 |
| 1.4.2 桦褐孔菌多糖的生物活性 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 IOP的提取及对DSS诱导的慢性炎症性肠病的治疗作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 实验动物 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 IOP的提取与高效液相色谱检测 |
| 2.3.2 DSS诱导慢性结肠炎模型的建立及DAI评估 |
| 2.3.3 结肠的组织学检测及评分 |
| 2.3.4 结肠组织中TJ蛋白及JAK-STAT信号通路蛋白的免疫组织化学检测 |
| 2.3.5 结肠组织中TJ蛋白及JAK-STAT信号通路蛋白的蛋白质免疫印迹检测 |
| 2.3.6 CD4~+T细胞相关细胞因子及转录因子的检测 |
| 2.3.7 小鼠脾脏及肠系膜淋巴结中CD4~+T细胞亚群的检测 |
| 2.3.8 统计分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 IOP单糖组成分析 |
| 2.4.2 IOP对DSS诱导的慢性炎症性肠病的病理进展的影响 |
| 2.4.3 IOP对DSS诱导的慢性结肠炎小鼠结肠组织损伤程度的影响 |
| 2.4.4 IOP对结肠组织中CD4~+T细胞亚群细胞因子及转录因子表达情况的影响 |
| 2.4.5 IOP对DSS诱导的慢性结肠炎小鼠脾脏及MLN中Th1/Th2细胞平衡的影响 |
| 2.4.6 IOP对DSS诱导的慢性结肠炎小鼠脾脏及MLN中Th17/Treg细胞平衡的影响 |
| 2.4.7 IOP对DSS诱导的慢性结肠炎小鼠结肠组织中JAK-STAT信号通路的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 IOP对CD4~+T细胞体外分化的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 实验动物 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 小鼠脾脏中CD4~+T细胞的分离及活化 |
| 3.3.2 Th1细胞、Th17细胞及Treg细胞的分化 |
| 3.3.3 细胞上清液中细胞因子的检测 |
| 3.3.4 体外活化的CD4~+T细胞相关的细胞因子及转录因子的检测 |
| 3.3.5 CD4~+T细胞的活化、增殖、定向分化检测 |
| 3.3.6 统计学分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 IOP对CD4~+T细胞的活化及增殖过程的影响 |
| 3.4.2 IOP对抗鼠CD3ε和抗鼠CD28抗体活化的CD4~+T细胞分化的影响 |
| 3.4.3 IOP对抗鼠CD3ε和抗鼠CD28抗体活化的CD4~+T细胞分化的影响 |
| 3.4.4 IOP对Th1细胞、Th17细胞、Treg细胞分化的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 IOP对BMDC成熟度及功能的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 主要试剂 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 实验动物 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 BMDC的分离与培养 |
| 4.3.2 BMDC与CD4~+T细胞的MLR反应体系的建立 |
| 4.3.3 BMDC成熟度及CD4~+T细胞亚群分化情况的检测 |
| 4.3.4 细胞培养上清液中细胞因子检测 |
| 4.3.5 统计学分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 IOP对炎症环境下BMDC的耐受状态的影响 |
| 4.4.2 IOP对BMDC_(LPS)细胞因子分泌的影响 |
| 4.4.3 IOP对MLR体系中Th1细胞分化的影响 |
| 4.4.4 IOP对MLR体系中Th17细胞的分化的影响 |
| 4.4.5 IOP对MLR体系中Treg细胞的分化的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 IOP_L-BMDC对DSS诱导的急性结肠炎的治疗作用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料 |
| 5.2.1 主要试剂 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.2.3 实验动物 |
| 5.3 方法 |
| 5.3.1 BMDC回输治疗DSS诱导的急性结肠炎 |
| 5.3.2 结肠组织组织学检测及组织学评分 |
| 5.3.3 结肠组织中TJ蛋白的检测 |
| 5.3.4 急性结肠炎小鼠脾脏及MLN中CD4~+T细胞亚群群分化的检测 |
| 5.3.5 统计分析 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 IOP_L-BMDC对DSS诱导的急性结肠炎的治疗作用 |
| 5.4.2 IOP_L-BMDC对结肠组织中TJ蛋白表达量的影响 |
| 5.4.3 IOP_L-BMDC对脾脏中Th1细胞、Th17细胞分化的影响 |
| 5.4.4 IOP_L-BMDC对MLN中Th1细胞、Th17细胞分化的影响 |
| 5.4.5 IOP_L-BMDC对脾脏及MLN中Treg细胞分化的影响 |
| 5.4.6 IOP_L-BMDC对结肠组织中CD4~+T细胞相关细胞因子的分泌的影响 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（4）右美托咪定通过STAT1/T-bet途径促使Th1细胞漂移的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 右美托咪定促使Th1细胞分化及剂量相关性 |
| 1.1 材料方法 |
| 1.1.1 实验仪器及耗材 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 实验动物 |
| 1.1.4 纯化CD4~+T 细胞 |
| 1.1.5 CD4~+T细胞的活化及药物刺激 |
| 1.1.6 使用流式细胞仪检测细胞含量 |
| 1.1.7 使用ELISA试剂盒检测细胞因子IFN-γ和 IL-4 的含量 |
| 1.1.8 PCR检测IL-4、IFN-γ的表达 |
| 1.1.9 数据统计与分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 右美托咪定诱导CD4~+T细胞向Th1 细胞分化,且在药物浓度为0.1 nM时效果最显着 |
| 1.2.2 右美托咪定增加CD4~+T细胞中Th1 细胞相关的细胞因子表达和分泌且在药物浓度为0.1nM时达到峰值 |
| 1.2.3 α2受体抑制剂(atipamezole)阻断右美托咪定诱导Th1 漂移及相关细胞因子表达和分泌 |
| 1.3 讨论 |
| 第二部分 STAT1-T-bet途径在右美托咪定促使Th1 细胞漂移中的作用 |
| 2.1 材料方法 |
| 2.1.1 实验仪器及耗材 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.1.4 CD4~+T 细胞的获取 |
| 2.1.5 CD4~+T 细胞的活化及右美托咪定,atipamezole和 fludarabine药物刺激 |
| 2.1.6 STAT1 蛋白磷酸化水平的检测 |
| 2.1.7 PCR检测IL-4,IFN-γ、GATA3、T-bet表达 |
| 2.1.8 ELISA检测细胞因子IFN-γ和 IL-4 的表达 |
| 2.1.9 流式细胞仪检测Th细胞含量 |
| 2.1.10 数据统计与分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 右美托咪定在诱导Th1 细胞分化过程中增加STAT1 磷酸化和T-bet表达的水平 |
| 2.2.2 α2受体抑制剂阻断右美托咪定诱导的STAT1 磷酸化和T-bet表达增加 |
| 2.2.3 STAT1 抑制剂逆转右美托咪定诱导Th1 细胞漂移和T-bet表达增加 |
| 2.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 转录因子在CD4~+T辅助细胞分化中的作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表学术论文 |
（5）T-bet、GATA-3在膀胱尿路上皮癌组织中的检测及临床意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 绪论 |
| 第1章 资料与方法 |
| 1.1 研究资料的选取 |
| 1.2 实验主要仪器和试剂 |
| 1.2.1 实验主要仪器设备 |
| 1.2.2 实验主要试剂 |
| 1.3 免疫组化检测 |
| 1.3.1 免疫组化原理 |
| 1.3.2 载玻片的处理 |
| 1.3.3 免疫组化实验步骤 |
| 1.3.4 免疫组化染色结果判定 |
| 1.4 实验数据的统计学分析 |
| 第2章 结果 |
| 2.1 T-bet、GATA-3 在癌组织和正常膀胱组织中的表达 |
| 2.1.1 T-bet在癌组织和正常膀胱组织中的表达 |
| 2.1.2 GATA-3 在癌组织和正常膀胱组织中的表达 |
| 2.2 T-bet、GATA-3 的表达和临床病理特征的关系 |
| 2.2.1 T-bet的表达和临床病理特征的关系 |
| 2.2.2 GATA-3 的表达和临床病理特征的关系 |
| 2.3 癌组织中T-bet与 GATA-3 表达的相关性 |
| 第3章 讨论 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（6）全反式维甲酸治疗再生障碍性贫血的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 全文中英文缩略词对照表 |
| 第一章 ATRA治疗再生障碍性贫血的作用研究 |
| 1.1 国内外研究进展 |
| 1.2 研究目标和意义 |
| 1.3 主要研究内容 |
| 1.4 主要技术路线 |
| 1.5 主要实验材料 |
| 1.5.1 主要药品与试剂 |
| 1.5.2 主要实验仪器与耗材 |
| 1.5.3 抗体列表 |
| 1.6 实验方法 |
| 1.7 实验结果 |
| 1.7.1 ATRA 可以增加骨髓内有核细胞数量和外周血细胞数量 |
| 1.7.2 ATRA可以保存骨髓内重要成分以及延长再障小鼠生存时间 |
| 1.8 本章小结 |
| 第二章 ATRA治疗再生障碍性贫血的机制研究 |
| 2.1 国内外研究进展 |
| 2.2 研究目标和意义 |
| 2.3 主要研究内容 |
| 2.4 主要技术路线 |
| 2.5 主要实验材料 |
| 2.5.1 主要药品与试剂 |
| 2.5.2 主要实验仪器与耗材 |
| 2.5.3 抗体列表 |
| 2.6 实验方法 |
| 2.7 实验结果 |
| 2.7.1 ATRA可以抑制T细胞体内增殖、激活、迁移和效应功能 |
| 2.7.2 ATRA可以有效抑制T细胞的代谢 |
| 2.7.3 Treg细胞移植不能改善再障小鼠的预后 |
| 2.7.4 ATRA可以维持T细胞亚群在较高的水平保持平衡 |
| 2.7.5 ATRA通过上调Jun B转录因子从而促进Th2 细胞分化 |
| 2.7.6 ATRA通过抑制NFAT1 通路从而促进Th1向Th2 细胞分化 |
| 2.8 本章小结 |
| 全文讨论和结论 |
| 参考文献 |
| 科研成果 |
| 致谢 |
（7）髓样树突状细胞中cofilin 1在重型再生障碍性贫血发病机制中作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、重型再生障碍性贫血患者髓样树突状细胞中cofilin1表达水平研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 试剂与仪器 |
| 1.1.3 实验方法 |
| 1.1.4 统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 FACS检测SAA患者及健康对照者外周血mDC内cofilin1水平 |
| 1.2.2 SAA患者外周血mDC内cofilin1水平与疾病严重程度及患者免疫状态相关 |
| 1.2.3 mDC体外诱导分化过程的显微镜形态观察 |
| 1.2.4 mDC体外诱导分化效率及分选效率 |
| 1.2.5 WB检测SAA患者及健康对照者mDC内cofilin1水平 |
| 1.2.6 qRT-PCR方法检测SAA患者及健康对照者mDC内cofilin1 mRNA水平 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、重型再生障碍性贫血患者cofilin1对mDC增殖凋亡及功能的影响及机制 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 试剂与仪器 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.1.4 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 mDC体外诱导分化、磁珠分选及纯度检测 |
| 2.2.2 流式细胞术转染效率验证,筛选最适细胞及转染试剂比例 |
| 2.2.3 qRT-PCR检测mRNA水平转染效率 |
| 2.2.4 Western Blot验证转染效果 |
| 2.2.5 CCK-8方法检测cofilin1-siRNA转染前后mDC增殖情况变化 |
| 2.2.6 FACS检测cofilin1-si RNA转染前后mDC凋亡情况变化 |
| 2.2.7 FACS及免疫荧光检测cofilin1-siRNA转染前后mDC吞噬功能变化 |
| 2.2.8 Transwell实验检测cofilin1-siRNA转染前后mDC迁移能力的变化 |
| 2.2.9 FACS检测cofilin1-siRNA转染前后mDC共刺激分子CD80/CD86表达水平变化 |
| 2.2.10 免疫荧光检测cofilin1-siRNA转染前后mDC内F-actin的变化 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、重型再生障碍性贫血患者cofilin1对mDC刺激CD4~+T淋巴细胞功能的影响 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 研究对象 |
| 3.1.2 试剂与仪器 |
| 3.1.3 实验方法 |
| 3.1.4 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 mDC体外诱导分化、分选、纯度检测 |
| 3.2.2 mDC质粒转染及效果验证 |
| 3.2.3 CD4~+T淋巴细胞分选纯度检测 |
| 3.2.4 mDC与CD4~+T淋巴细胞共培养形态观察 |
| 3.2.5 转染前后mDC刺激CD4~+T淋巴细胞产生细胞因子能力变化 |
| 3.2.6 转染前后mDC刺激Treg细胞Foxp3表达水平变化 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 树突状细胞对CD4~+T淋巴细胞的的影响 |
| 3.3.2 树突状细胞与CD4~+T淋巴细胞之间的相互作用与细胞骨架密切相关 |
| 3.3.3 Cofilin1影响mDC对CD4~+T淋巴细胞的作用 |
| 3.4 小结 |
| 四、重型再生障碍性贫血患者cofilin1对mDC刺激CD8~+T淋巴细胞功能的影响 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 研究对象 |
| 4.1.2 试剂与仪器 |
| 4.1.3 实验方法 |
| 4.1.4 统计学分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 mDC体外诱导分化、分选、纯度检测 |
| 4.2.2 mDC质粒转染及效果验证 |
| 4.2.3 CD8~+T淋巴细胞分选纯度检测 |
| 4.2.4 mDC与CD8~+T淋巴细胞共培养形态观察 |
| 4.2.5 CFSE检测转染前后mDC刺激CD8~+T淋巴细胞增殖能力变化 |
| 4.2.6 FACS检测转染前后mDC刺激CD8~+T淋巴细胞杀伤功能变化 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 获得性再生障碍性贫血发病机制及遗传学异常研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）WAS蛋白在急性LCMV感染中对CD4辅助T细胞和生发中心B细胞分化的影响研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 |
| 前言 |
| 1 实验材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 结论 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 PI3Kδ过度活化对脾脏前体B细胞发育的影响研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 结论 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 一例RAC2基因自发突变患儿临床研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
（9）探讨hUC-MSCs调节HBV肝硬化患者免疫功能的可能机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 乙肝肝硬化的现状及治疗概况 |
| 1.2 细胞免疫在乙肝肝硬化中的作用 |
| 1.2.1 T淋巴细胞免疫应答与乙肝肝硬化 |
| 1.2.2 Tc细胞与乙肝肝硬化 |
| 1.2.3 Th细胞与乙肝肝硬化 |
| 1.2.4 TCR多样性与乙肝肝硬化 |
| 1.3 hUC-MSCs移植治疗乙肝肝硬化的原理及研究进展 |
| 1.4 本研究的主要工作与创新 |
| 第二章 脐带间充质干细胞移植治疗乙肝肝硬化 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验试剂与仪器 |
| 2.1.2 研究对象 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 标准内科治疗 |
| 2.2.2 hUC-MSCs的输注 |
| 2.2.3 样本采集 |
| 2.2.4 PBMCs的分离 |
| 2.2.5 TCR免疫图谱分析 |
| 2.2.6 流式细胞分析 |
| 2.2.7 ELISA检测 |
| 2.2.8 时荧光定量PCR检测 |
| 2.3 统计学方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 患者基本资料比较 |
| 2.4.2 hUC-MSCs移植治疗安全性探讨 |
| 2.4.3 生化和凝血指标及肝功能评分改善情况 |
| 2.4.4 T细胞受体多样性D50 比较 |
| 2.4.5 TCRVβ与 Jβ基因片段分布及使用频率分析 |
| 2.4.6 T淋巴细胞亚群分群计数分析 |
| 2.4.7 免疫功能指标与肝功能相关指标相关性分析 |
| 2.4.8 血清中相关细胞因子的浓度ELISA结果分析 |
| 2.4.9 相关转录因子mRNA表达RealTime-PCR结果分析 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 总结与展望 |
| 3.1 全文总结 |
| 3.2 本研究存在三点不足 |
| 3.3 未来的工作与建议 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 附录3 |
（10）Th1/Th2细胞功能失衡与脑卒中后抑郁的相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述:T淋巴细胞在脑卒中后抑郁发病机制中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 附录B |
| 附录C |
| 附录D |
| 附录E |
| 附录F |
| 附录G |
| 附录H |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、诱导Th1细胞定向分化的新转录因子T-bet（论文参考文献）
- [1]原发性免疫性血小板减少症患者外周血microRNAs的表达及与Th1/Th2失衡的关系[J]. 孙妍,王明镜,曹新甜,刘为易,谌海燕,丁晓庆,肖海燕,许勇钢,全日城,胡晓梅. 中国实验血液学杂志, 2021(05)
- [2]白细胞介素-27在支气管哮喘气道炎症和气道重构中的作用[D]. 鲁德玕. 山东大学, 2020(04)
- [3]桦褐孔菌多糖对小鼠炎症性肠病模型的治疗作用及其机制研究[D]. 陈一方. 延边大学, 2020(05)
- [4]右美托咪定通过STAT1/T-bet途径促使Th1细胞漂移的机制研究[D]. 雷道赟. 江苏大学, 2020(02)
- [5]T-bet、GATA-3在膀胱尿路上皮癌组织中的检测及临床意义[D]. 朱匡政. 西北民族大学, 2020(08)
- [6]全反式维甲酸治疗再生障碍性贫血的作用及机制研究[D]. 唐大斌. 上海交通大学, 2020(01)
- [7]髓样树突状细胞中cofilin 1在重型再生障碍性贫血发病机制中作用的研究[D]. 孙莹莹. 天津医科大学, 2020(06)
- [8]WAS蛋白在急性LCMV感染中对CD4辅助T细胞和生发中心B细胞分化的影响研究[D]. 张良. 重庆医科大学, 2020(01)
- [9]探讨hUC-MSCs调节HBV肝硬化患者免疫功能的可能机制[D]. 严胡铃. 电子科技大学, 2020(07)
- [10]Th1/Th2细胞功能失衡与脑卒中后抑郁的相关性研究[D]. 张林丽. 新乡医学院, 2020(12)