一、两种靶细胞在抗体依赖细胞介导的细胞毒活性检测中的比较（论文文献综述）
林汉[1]（2021）在《基于半抗原修饰策略的新型肿瘤糖疫苗设计及免疫活性研究》文中指出肿瘤细胞表面过量表达的异常糖链,即肿瘤相关糖抗原（Tumor-associated Carbohydrate Antigens,TACAs）,在肿瘤细胞的信号传导和转移中起着重要的作用,并且与肿瘤的恶化以及患者的不良预后密切相关,是肿瘤疫苗开发的重要靶点。然而,TACAs免疫原性差,是T细胞非依赖性抗原,不能直接与主要组织相容性复合物（Major histocompatibility complex,MHCs）结合,难以激活T细胞免疫反应,给疫苗的开发造成了巨大的障碍。为了解决这个问题,传统的疫苗构建策略是将TACAs与载体蛋白偶联制备成糖蛋白疫苗,刺激机体产生特异性抗体用于肿瘤的免疫治疗。但是,TACAs是人体自身抗原,容易诱导免疫耐受和免疫抑制,进一步增加了疫苗开发的难度。因此,增强TACAs的免疫原性及打破自身免疫耐受是发展肿瘤糖疫苗的关键问题之一。内源性抗体是人类体内天然产生的抗体,如抗2,4-二硝基苯（2,4-dinitrophenyl,DNP）和抗鼠李糖（Rhamnose,Rha）抗体,占人体血清蛋白含量的3-8%。本论文利用人体中天然存在的上述两种内源性抗体增强抗原呈递和介导免疫系统杀伤靶细胞的能力,发展基于内源性半抗原修饰的新型糖类肿瘤疫苗和抗肿瘤药物。主要结果如下:（1）通过半抗原DNP修饰肿瘤相关糖抗原GM3,提高TACA的免疫原性,同时增强糖抗原呈递能力。利用化学酶法将DNP修饰到肿瘤相关糖抗原GM3末端唾液酸的C5位置,再与钥孔血蓝蛋白（Keyhole Limpet Hemocyanin,KLH）载体蛋白缀合,得到GM3-NHDNP-KLH疫苗,糖抗原负载量为6%。体内免疫活性研究表明,在高滴度抗DNP抗体小鼠模型中,可产生高滴度和高亲和力的特异性抗GM3-NHDNP IgG抗体,其抗体滴度是对照组的43倍。结合糖代谢工程手段使肿瘤细胞表面表达DNP修饰的GM3抗原后,流式细胞实验表明抗体血清可以识别糖代谢工程改造的肿瘤细胞;体外补体依赖性细胞毒实验（Complement dependent cytotoxicity,CDC）表明,抗体血清可以通过抗DNP抗体与抗GM3-NHDNP抗体发挥协同作用介导显着的CDC作用杀伤肿瘤细胞,杀伤率达到45.7%。（2）通过半抗原Rha多价修饰弱免疫原性糖蛋白结合疫苗sTn-BSA,增强TACA的免疫原性,同时减少了针对载体蛋白的免疫应答。利用化学合成法将肿瘤相关糖抗原sTn和牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin,BSA）偶联,sTn抗原负载量为7.8%,再用Rha对sTn-BSA进行修饰,得到三种不同Rha负载量的疫苗,分别为sTn-BSA-Rha1、sTn-BSA-Rha2和sTn-BSA-Rha5,Rha负载量为0.5%、1%和2.8%。体内免疫活性研究表明,在高滴度抗Rha抗体小鼠模型中,疫苗上Rha半抗原的含量越高,产生的抗sTn IgG抗体越多,其中sTn-BSA-Rha5免疫产生的抗体滴度最高,是对照组的64倍。流式细胞实验和体外CDC实验表明,抗体血清可以顺利识别表达sTn抗原的肿瘤细胞并介导显着的CDC作用以杀死癌细胞,sTn-BSA-Rha5免疫组血清引发的杀伤率达到57.3%。（3）通过多价Rha修饰的β-环糊精（β-Cyclodextrin,β-CD）和金刚烷（Adamantane,Ada）修饰的sTn-BSA自组装形成非共价糖蛋白缀合物疫苗,发现β-CD上的多价Rha能高效招募内源性抗Rha抗体来提高疫苗的免疫活性,增强糖抗原sTn的抗原呈递能力。通过主客体自主装方法制备了三种不同长度PEG连接臂的非共价键超分子疫苗,分别为sTn-BSA-Ada6/CD-PEG1-Rha7、sTn-BSA-Ada6/CD-PEG3-Rha7和sTn-BSA-Ada6/CD-PEG6-Rha7。体内免疫活性研究表明,在高滴度抗Rha抗体小鼠模型中,非共价键sTn-BSA-Ada6/CD-PEG6-Rha7疫苗产生的抗sTn IgG抗体滴度最高,是对照组的9.5倍。同时发现,在正常小鼠模型中（无抗Rha抗体）,免疫前期产生的抗Rha抗体在免疫后期可以起到自我增强免疫应答的作用,sTn-BSA-Ada6/CD-PEG6-Rha7免疫产生的sTn IgG抗体滴度是对照组的8.8倍。流式细胞实验和体外CDC实验表明,所有组别的抗体血清均可以识别表达sTn抗原的肿瘤细胞并介导高活性CDC作用杀伤肿瘤细胞。（4）通过半抗原DNP多价修饰透明质酸（Hyaluronan,HA）,增强了HA募集抗体和杀伤肿瘤的能力。化学合成了9种DNP修饰的透明质酸多价抗体募集糖聚合物（Multivalent antibody-recruiting glycopolymers,MARGs）,分别为HA-[PEG1-DNP]2、HA-[PEG1-DNP]4、HA-[PEG1-DNP]8、HA-[PEG3-DNP]2、HA-[PEG3-DNP]4、HA-[PEG3-DNP]8、HA-[PEG6-DNP]2、HA-[PEG6-DNP]4和HA-[PEG6-DNP]8。免疫荧光和流式细胞结合实验表明,这些MARGs能够将抗DNP抗体特异地募集到表达CD44的癌细胞上,并且抗体募集能力与DNP半抗原负载量呈正相关。体外细胞毒实验表明,MARGs可以通过介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC）或CDC作用杀伤靶细胞,其中HA-[PEG3-DNP]8具有最高的细胞毒作用,ADCC和CDC的裂解率分别为34.3%和50%。HA-[PEG3-DNP]8的体内抗肿瘤实验表明,治疗结束后HA-[PEG3-DNP]8组的肿瘤抑制率达到55%,是HA对照组的12倍。
赵歌[2]（2021）在《猪外周血细胞免疫流式细胞术检测方法的建立及其应用》文中研究指明细胞免疫在清除病原体并维持机体稳态方面发挥重要作用。细胞免疫的研究在小鼠和人方面较为深入,有关猪的细胞免疫应答研究相对较少,阻碍了病原微生物致病机制的研究和猪相关制剂的研发。因此,建立猪的细胞免疫应答检测技术十分必要。本研究以猪为动物模型,以新鲜抗凝血为实验对象,通过条件的优化,建立了猪细胞免疫应答流式细胞检测技术,并利用此技术分析了猪霍乱沙门菌疫苗株C500免疫仔猪后诱导的免疫应答规律;然后,通过体外感染实验分析了沙门菌诱导猪上皮细胞和单核细胞的应答情况。以上分析为猪的细胞免疫应答研究提供了技术支撑,为沙门菌与猪宿主细胞的相互作用研究提供了重要数据。1.猪外周血细胞免疫流式细胞术检测方法的建立流式细胞术可以实现单细胞水平的分析。本实验采用新鲜的猪抗凝血,通过Histopaque-1083分离液分离猪淋巴细胞,利用流式细胞术和CCK-8法分析发现,抗凝血在4℃放置3d后,凋亡细胞明显增加,说明抗凝血在4℃放置时间不能超过2d,最好当天使用;将当天采集分离的抗凝血细胞在体外培养1～4 d发现,随着培养时间的延长,虽然ConA刺激后活细胞率下降明显,而未刺激组的淋巴细胞活细胞率仅略有下降,说明分离的抗凝血细胞体外培养4 d后仍然具有良好的细胞活性。另外,细胞增殖是反映细胞免疫应答的重要指标。利用CFSE标记法流式细胞术分析表明,ConA刺激4 d后即能够明显地观察到淋巴细胞的增殖;利用BrdU ELISA法比较分析表明,在96孔板中每孔铺板1×105个细胞,培养48h是细胞增殖分析的最佳条件。此外,细胞因子的表达能够反映细胞免疫效应功能。利用流式细胞术分析淋巴细胞内细胞因子的表达情况表明,PMA和离子霉素刺激2h后,T淋巴细胞亚群中即有IFN-y的表达,并且随着刺激时间的延长而逐渐增加;qRT-PCR分析亦表明,ConA刺激1d后猪外周血细胞中即明显表达IFN-γ。除此之外,通过不同荧光抗体的标记,利用流式细胞术比较分析了 Histopaque-1083分离液分离和红细胞裂解法得到的猪外周血中不同细胞亚群的差异,为后续不同细胞的分离研究提供了重要数据。2.猪霍乱沙门菌C500疫苗株诱导猪细胞免疫应答规律分析为评价以上技术在猪细胞免疫应答检测中的应用效果,将猪霍乱沙门菌疫苗株C500肌肉注射（5×109 CFU/头）免疫24日龄仔猪,同时以未免疫组作为对照,用以上建立的技术分析猪细胞免疫应答规律。以不同免疫时间点的猪外周血细胞为研究对象,用灭活的C500体外刺激不同时间后,BrdU ELISA动态分析显示,体外刺激48 h后,免疫组的细胞增殖能力在免疫后第14 d显着高于未免疫组（P<0.05）;流式细胞术胞内染色分析表明,刺激12 h后,免疫组表达IFN-γ和IL-4的T淋巴细胞比例高于未刺激组。另外,不同免疫时间点的T淋巴细胞亚群分析结果表明,与对照组相比,免疫后第7d,CD8+T细胞、CD4+CD8+T细胞显着升高。此外,以猪外周血细胞为效应细胞,以C500感染的猪小肠上皮细胞系IPEC-J2为靶细胞,共同孵育后,CTL杀伤效应表明,免疫后第21d,免疫组的CD8+T淋巴细胞具有较强的杀伤靶细胞的能力。可见,C500能够诱导仔猪产生细胞免疫应答。3.沙门菌体外感染诱导的猪上皮细胞和单核细胞应答分析为进一步分析猪的细胞免疫机制,探索不同宿主细胞对沙门菌感染的应答情况,以猪霍乱沙门菌疫苗株C500和缺失株C500ΔrfaJ为材料,以IPEC-J2和猪外周血单核细胞为研究对象,通过体外感染实验分析表明,沙门菌感染后,IPEC-J2和单核细胞在细胞活性和细胞增殖方面的应答趋势一致。在细胞活性方面,C500ΔrfaJ感染组显着高于C500感染组;在细胞增殖方面,C500ΔrfaJ感染组显着高于C500组,说明rfaJ基因的缺失降低了沙门菌对宿主细胞活性的影响。另外,在IPEC-J2细胞模型中,C500感染组的细胞凋亡率高于未感染组,但各组之间无显着差异。此外,在猪单核细胞模型中,与未感染组相比,C500感染组和C500ΔrfaJ感染组均表达IL-1β和IL-8,并且,C500ΔrfaJ感染组IL-1β和IL-8的表达显着高于C500组。说明沙门菌的rfaJ基因具有调控宿主细胞应答的能力。以上技术的建立为猪细胞免疫应答的分析奠定了基础。
张利[3]（2021）在《CXCL13趋化型CAR-T细胞对骨肉瘤治疗及其机制的研究》文中研究说明骨肉瘤（Osteosarcoma,OS）是一种多发病于青少年的恶性肿瘤,易发生肺转移。对于转移性的骨肉瘤,手术治疗和放化疗的临床治疗效果不佳,患者的五年生存率低于30%,目前缺少有效的治疗方案。嵌合抗原受体T细胞疗法（Chimeric antigen receptor T,CAR-T）对肿瘤细胞的杀伤并不需要依赖于MHCI（Major histocompatibility complex class I molecule）类分子,可以有效的防止肿瘤逃逸。实体瘤特殊的免疫微环境使得CAR-T细胞很难浸润到肿瘤组织中,即使浸润到肿瘤组织中,也会因严峻的免疫抑制性环境而耗竭。NKG2D（Natural killer group 2D）是一种NK（Nature killer）细胞表面激活受体,当其与配体结合后通过激活下游信号通路使NK细胞释放各种细胞因子,进而发挥其杀伤肿瘤作用。在我们的研究中发现,OS组织中NKG2D配体蛋白MICA/B（MHC class I chain-related protein A/B）高表达,同时趋化因子CXCL13（chemokine C-X-C motif ligand 13）促进了骨肉瘤的转移和侵袭。CXCR5（C-X-C chemokine receptor type5）为CXCL13的受体;CXCL13可以趋化CXCR5+T淋巴细胞归巢到肿瘤组织发挥抑制肿瘤的作用。本研究制备人源和鼠源的CXCR5共表达的NKG2D-CAR-T细胞,探究CAR-T细胞的对骨肉瘤治疗作用及相关机制。第一部分共表达CXCR5的NKG2D-CAR-T细胞治疗骨肉瘤的研究制备人源对照CAR-T（Mock-CAR-T）,NKG2D-CAR-T和CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞。对比于NKG2D-CAR-T细胞,CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞向CXCL13细胞因子的趋化能力和对靶细胞的杀伤能力明显加强;CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞激活相关的分子如TNF-α（Tumor necrosis factorα）、IFN-γ（Interferonγ）、CD107a和Gzm B（Granzyme B）的表达量显着提高,体外增殖能力显着增强,并且PD-1（Programmed cell death-1）和TIM-3（T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3）的表达水平更低。RNA测序结果显示CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞在增殖、记忆性分化、抵抗免疫耗竭和NFAT通路相关的基因表达显着提高。通过Western blotting、钙信号检测和NFAT-Jurkat报告基因等方法验证显示CXCR5-NKG2D-CAR-T通过CXCL13/CXCR5/Ca2+/NFAT信号轴提高了CAR-T细胞的综合效果。体内实验使用U-2OS细胞对NSG小鼠进行皮下荷瘤,建立骨肉瘤模型,检测CAR-T细胞对荷瘤小鼠的肿瘤杀伤情况。与NKG2D-CAR-T细胞相比,CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞可以在体内存活时间更长,血液中CD8+T淋巴细胞的比例升高,实现更好的肿瘤趋化效果和对肿瘤的抑制能力。第二部分CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞对骨肉瘤肿瘤免疫微环境的影响构建鼠源的Mock-CAR-T,NKG2D-CAR-T和CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞以及鼠源的CXCL13过表达骨肉瘤细胞系。对比于鼠源的NKG2D-CAR-T细胞,CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞的体外趋化能力明显提高;并且展现出更强的骨肉瘤细胞杀伤能力;与细胞杀伤相关的分子如Gzm B,CD107a和IFN-γ的表达量明显提高;体外增殖能力得到明显的增强;并显着降低了耗竭相关的PD-1的表达量。将鼠源的骨肉瘤细胞注射到小鼠胫骨内进行原位建模。对比于鼠源的NKG2D-CAR-T细胞,鼠源的CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞在体内的存活时间、CD8+T淋巴细胞的比例和记忆性T细胞的分化方面展现出优势;并产生更好的肿瘤和淋巴结的归巢能力;产生更强肿瘤抑制效果;并显着降低了肿瘤中髓系来源的抑制性细胞（Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）、肿瘤相关的巨噬细胞（Tumor-associated macrophages,TAMs）和调节性T细胞（Regulatory T cells,Tregs）的比例;对抑制性的骨肉瘤免疫微环境有较好的改善作用。结论:CXCR5的共表达显着提高了NKG2D-CAR-T细胞的肿瘤趋化和杀伤能力,并改善了骨肉瘤免疫微环境,本研究为骨肉瘤的CAR-T细胞免疫疗法提出了一种新的方案。
崔英丽[4]（2021）在《双特异性溶瘤腺病毒Ad-VT对卵巢癌抑制作用研究》文中研究指明癌症是人类死亡的主要原因之一。2020年全球癌症确诊患者1930万例,1000万人因癌症死亡。其中卵巢癌发病率和死亡率均居女性癌症发病率和死亡率的第八位。卵巢位于盆腔深部,早期病变不易被发现,一经发现,多为晚期,目前针对卵巢癌的治疗以手术与化疗相结合的方式为主,但化疗副作用大,易产生耐药。因此,仍然需要继续寻找更有效地治疗手段。当前随着分子生物学、细胞生物学和病毒学的快速进步和不断发展,基因治疗已经逐渐发展成为一种新型治疗卵巢癌的治疗手段,其中新型溶瘤腺病毒已充分显示表现出了一种不可替代治疗优势,发挥了病毒治疗和基因治疗的双重重要作用及其功能,有望尽快使其发展成为一种治疗卵巢癌的有效治疗手段。Apoptin是一种源自于鸡贫血病毒（CAV）的凋亡诱导蛋白,在正常细胞中没有细胞毒性,而在肿瘤细胞中能够特异性诱导肿瘤细胞发生凋亡。人端粒酶逆转录酶（h TERT）的长度和生存能力与细胞衰老和永生化有关。由于端粒酶逆转录酶（h TERT）基因的限速和催化成分的紧密转录抑制作用,大多数正常人体细胞缺乏端粒酶活性。然而,在高达90%的人类恶性肿瘤中观察到h TERT表达和端粒酶激活,使其具有无限的增殖能力。本课题组前期已构建了含有凋亡素（apoptin）蛋白和h TERTp启动子的人五型腺病毒Ad-Apoptin-h TERTp-E1a（Ad-VT）,该病毒具有只在肿瘤细胞中复制并特异性杀伤多种肿瘤细胞的能力。本研究利用本课题组自行构建的双特异性溶瘤腺病毒Ad-VT以及其对照病毒Ad-T、Ad-VP3和Ad-MOCK进行了对人卵巢癌A2780和SKOV3细胞的体内外抑制作用研究。研究目的:通过体内外多种实验分析Ad-VT对人卵巢癌A2780和SKOV3细胞的抑制作用。研究方法:1.利用pGL4.51转染卵巢癌A2780和SKOV3细胞,并用G418加压筛选稳定表达荧光素酶基因的人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞,并进行生物学特性分析检测。2.通过结晶紫染色和WST-1检测等方法分析Ad-VT对人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞的杀伤作用。3.通过Hoechst染色、Annexin V流式分析、caspase酶活性检测、活性氧检测以及JC-1染色等方法分析Ad-VT杀伤人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞的主要方式。4.通过细胞划痕、Transwell小室侵袭等方法分析Ad-VT对人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞迁移和侵袭能力的影响。5.用人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞分别建立裸鼠荷瘤模型,并每周观测肿瘤发光强度、肿瘤大小以及小鼠生存情况来分析Ad-VT在体内对人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞的抑制作用。研究结果:1.构建成功了表达荧光素酶基因的人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞,并筛选出稳定表达的细胞系,且所构建的细胞与原始细胞没有明显的生物学差异。2.通过结晶紫染色和WST-1实验,显示了Ad-VT对人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞具有杀伤作用,且杀伤作用具有剂量效应和时间效应关系。3.通过Hochest染色、Annexin V流式分析、caspase酶活性检测、活性氧检测以及JC-1染色等方法表明,Ad-VT主要通过内源性凋亡途径杀伤人卵巢癌A2780-LUC和人卵巢癌SKOV3-LUC细胞。4.细胞划痕实验、Transwell小室侵袭实验等方法表明,Ad-VT对人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞的迁移和侵袭具有明显的抑制作用。5.通过构建表达荧光素酶的人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞的裸鼠肿瘤模型,Ad-VT也可以在体内显着抑制人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC,并延长裸鼠生存期。研究结论:本研究成功构建了人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞,并通过多种体内外实验证实了Ad-VT对人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞具有显着的细胞杀伤作用,表明,Ad-VT具有成为卵巢癌治疗药物的潜力。
冯廷华[5]（2021）在《基于淋巴细胞转化在流式细胞仪上的特征而建立的淋巴细胞转化试验及临床意义》文中认为背景淋巴细胞转化实验（LTT）是通过刺激淋巴细胞发生增殖,以检测某个体的免疫细胞的功能以及状态的一种方法。试验原理是T细胞表面表达有丝分裂原受体,在接触到抗原或植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA）和美洲商陆（PWM）等有丝分裂原后,T细胞受到丝裂原的刺激从而发生变化--代谢状态改变,体现在细胞蛋白质和核酸合成增多,增殖反应的发生;细胞的形态也发生了明显的变化,例如细胞变大为成熟淋巴细胞的3～4倍、细胞质增多、产生空泡,细胞染色质变疏松、核仁明显,形态总体向淋巴母细胞转变。LTT是一项广泛使用地试验项目,目前认为PHA诱导的淋巴细胞转化主要是胸腺来源的T淋巴细胞的特性,而机体的细胞免疫状态则可以通过其转化率的大小来进行评价,是为数不多的检验机体细胞免疫水平以及功能实验。本文是在形态学计数法的基础上,观察淋巴细胞转化的流式细胞仪和分子学特征,试图改进检测淋巴细胞转化的方法。并且尝试用该方法检测健康体检者、淋巴瘤、白血病的淋巴细胞转化能力,分析其临床应用意义,探究其临床应用的潜力。方法1、采用全血法用10%小牛血清的1640培养液培养全血细胞,用pha刺激实验样本在37℃5%CO2的条件下培养72h,同时设立空白对照,培养后用裂解液裂解培养液中的红细胞,将得到的白细胞重悬后用流式细胞仪观察,通过设立象限门的方法,观察经过淋巴细胞转化培养的两组淋巴细胞各象限门的百分数变化,利用SPSS软件的独立样本T检验分析实验组和空白组之间的差异,并利用均值、标准差、变化幅度比较值等分析比较找出象限门中最具有可比性的象限门数据。2、利用上述培养方法培养后的细胞液进行DNA提取,将空白组和实验组提取的DNA利用qPCR的方法进行端粒长度测定,将各空白组和实验组测出的端粒长度进行配对样本T检验,以观察淋巴细胞转化实验的分子生物学特点。3、利用上述培养方法培养后,与经典的形态学计数法进行比较。将培养后的健康体检者样本利用血细胞分析仪观察培养后的两组淋巴细胞百分数,利用SPSS的独立样本T检验的分析方法来比较实验组和空白组之间淋巴细胞百分数的差异,计算淋巴细胞转化率,计算方法为（实验组淋巴细胞百分数-空白组淋巴细胞百分数）/实验组淋巴细胞百分数,并将得到的淋巴细胞转化率同形态学计数法的正常值进行对比,以证明试验的可行性。再通过不同批次之间的对比,证明实验的稳定性。4、对血液病患者和健康人的外周血,采用新建立的方法观察两组淋巴细胞转化率的差异。然后采用t检验和正态分布检验的方法对病例组和健康组之间淋巴细胞百分数和淋巴细胞转化率进行比较,证明该方法有一定的临床价值。对全部血液病患者同健康人外周血培养后的淋巴细胞转化率作对比,观察其差异是否具有统计学意义;将不同的血液病,即白血病、淋巴瘤患者同健康人的外周血培养比较,观察其是否有统计学意义。结果1、用流式细胞计数仪观察设门后的实验数据,发现空白组和实验组实验数据具有明显的差异,可以用流式细胞计数仪观察淋巴细胞转化,并且第四象限中的"%ALL"最具有可比性,差异性最大。2、通过检测空白组和实验组之间端粒长度的测定分析,发现其配对分析两组之间的变化呈增长趋势,P值为0.023（<0.05）,差异有统计学意义。3、用血细胞分析仪可以观察到实验组淋巴细胞百分比为37.046±12.654%对比空白组的淋巴细胞百分数为15.653±9.469%,有明显的升高。SPSS分析的55例健康体检者的淋巴细胞转化率为0.543±0.269,而形态学计数法的淋巴细胞转化率的正常值为0.6-0.8,其结果也基本吻合。由于本实验样本血液无法长时间保存,因此实验选取健康正常人的血液培养标本分为五个批次用血细胞分析仪进行实验,如果五批健康正常人血液标本无显着差异,则认为实验稳定。实验结果进行方差分析,P值为0.892（>0.05）,五个批次之间无显着性差异。4、患病组44份（其中白血病组28例,恶性淋巴瘤组16例）,健康组30份同时培养,数据结果做正态分布检验Q-Q图,白血病组、淋巴瘤组和健康组的正态检验K-S检验的P值分别为0.305、0.272、0.641（P>0.05）,表明三组均呈正态分布。将患有血液病的病人样本与健康人样本的淋巴细胞转化率均值比较,结果有明显差异（P<0.05.）分别将白血病组和淋巴瘤组与健康组进行比较,白血病组的样本同健康组的淋巴细胞转化率均值比较P<0.05,患有淋巴瘤患者的样本同健康人样本的淋巴细胞转化率均值比较P<0.01,均有显着差异。结论1.证实了可以利用流式细胞仪观察淋巴细胞转化。2.成功建立了血细胞分析仪观察淋巴细胞转化试验。3.血细胞分析仪观察淋巴细胞转化试验可以应用于疾病的诊断和治疗的过程中,具有临床应用潜力。
曹韪凡[6]（2020）在《靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究》文中认为近年来,嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor,CAR）修饰的T细胞为代表的靶向免疫细胞治疗方案受到广泛关注。该技术通过在T细胞中转染并表达人工CAR,促使T细胞可以特异性靶向结合肿瘤表面抗原。同时,利用人工CAR胞内段结构域提供T细胞活化信号,使其成为具有精准靶向性、并持续维持杀伤活性的新一代细胞治疗技术,在多种肿瘤治疗领域特别是血液系统肿瘤的治疗中表现出良好的治疗效果。目前,大多数关于CAR的研究主要集中在T细胞,然而伴随而来的细胞因子风暴、脱靶效应等副作用已成为限制CAR-T细胞临床应用的重要因素。针对这些副作用或缺陷,促使我们将注意力转移到以自然杀伤（natural killer,NK）细胞与因子诱导杀伤细胞为代表的非特异性免疫细胞的人工CAR的改造研究中。NK细胞属于先天固有免疫系统中的重要组成部分,是机体天然免疫屏障中的主要承担者。NK细胞在肿瘤的免疫治疗中具有特殊优势。首先,NK细胞不受主要组织相容性复合体识别限制,并且无需抗原提呈细胞就可以激活自身免疫应答反应;其次,NK细胞在过继性细胞回输疗法中,体内存活周期短,不会诱发抗移植物宿主反应,相较于T细胞,NK细胞诱发因子风暴反应可控。然而人体肿瘤细胞可以通过多种免疫逃逸机制逃避NK细胞非特异杀伤作用,使得NK细胞在肿瘤免疫治疗中的作用受到了制约。基于以上因素和前期我们在CAR-CIK细胞研究工作中的基础与策略,本次在NK细胞中引入CAR的修饰改造,引导NK细胞对血液肿瘤细胞靶向杀伤,同时利用CAR胞内段细胞活化信号结构域的表达来增强免疫细胞自身的活性。以B淋巴细胞白血病的特异性靶标CD19为靶点,针对不同来源的NK细胞生物学特点,开展了人工CAR胞内段和跨膜区的改造工作。在胞内段优化过程中,将具有NK细胞活化功能的含有IL-15分子、4-1BB细胞共刺激信号分子、CD3 ζ链胞内区分子、CD8引导链和Kozak序列等胞内段活化结构域相关分子序列进行串联整合,融入到CAR结构中,制备特性化针对NK细胞的人工CAR重组质粒,然后通过病毒载体,在体外进行转导,成功构建出带有靶向识别杀伤功能的人工CAR修饰的NK细胞。同时,优化了 NK细胞体外培养与活化体系,为后续大剂量的细胞制备,开展体外、体内试验以及未来临床试验和应用奠定了基础。在此基础上,为了进一步检验人工CAR修饰细胞的靶向杀伤能力,采用乳酸脱氢酶法、杀伤因子检测和流式细胞检测等多种方法,对构建的CAR-CIK、CAR-NK-92、CAR-NK细胞杀伤效果进行了验证与分析评估。利用药效学,研究分析了我们构建的人工CAR修饰细胞在小鼠急性B淋巴细胞白血病模型中的靶向杀伤作用以及安全性。结果表明,构建的人工CAR修饰细胞具有明显的靶向杀伤能力和可靠的生物安全性。此外,利用单细胞转录组测序技术和基因表达水平以及生物信息学分析,研究脐血NK细胞分别在人工CAR载体转导前后以及增殖过程中基因的表达谱变化。结果显示,以CX3CR1为代表的功能成熟的NK细胞基因高表达,而且具有独特的转录特性,探讨了 NK细胞的发育生物学的分子机制,并针对CD19-CAR-NK细胞技术的临床应用研究进行了再设计与评估。本项研究的创新点在于尝试突破人工CAR细胞方法改造非特异性细胞的技术瓶颈,构建出一套创新优化的CAR-NK制备体系,为拓展人工CAR细胞治疗方案提供技术支撑;改造了 CAR胞内段细胞活化信号分子,以及验证了 CD19-CAR-NK细胞的成药性、有效性以及安全性;这将有利于CAR相关技术在免疫治疗过程中发挥更重要的作用,并为进一步的临床应用研究提供新方法和新思路。主要结果:1.构建了基于CAR-T技术的靶向CD19的CAR-CIK细胞、CAR-NK-92细胞制备体系。2.构建了基于脐血来源的NK细胞靶向CD19的新型CAR-NK细胞技术体系。3.体外实验验证了 CD19-CAR-NK具有显着的靶向细胞杀伤功能,并呈现剂量依赖性特点,特异性杀伤效果明显。4.探索了 CAR-NK细胞最佳NK细胞转导方法,可使用慢病毒载体或逆转录病毒载体对NK细胞进行转导。通过优化的培养体系培养的NK细胞可以获得更好的转导效率。5.利用单细胞测序技术,探讨了脐血NK细胞分别在CAR转导前后以及增殖过程中基因表达谱变化,以CX3CR1为代表的功能成熟NK细胞基因高表达转录特性。6.B淋巴细胞白血病小鼠模型研究结果表明,CD19-CAR-NK细胞在回输后第7天抑瘤率为61%,远高于对照组抑瘤率12%。未产生相关毒性以及致瘤致畸等不良情况,验证了 CD19-CAR-NK细胞具有良好的生物安全性及有效性。
卢珍[7]（2020）在《肿瘤AMPK活化促进NK细胞抗肿瘤免疫协同增强PD-L1阻断疗法的研究》文中指出癌症是世界范围内危害人类健康的主要死亡因素。虽然目前以程序性死亡受体-1/程序性死亡配体-1（programmed cell death protein-1/programmed death ligand-1,PD-1/PD-L1）通路阻断为代表的免疫检查点阻断疗法在临床上已经取得了令人惊喜的效果,然而,只有一部分肿瘤患者对该疗法有响应。因此,对抗肿瘤免疫的调控机制进行深入的研究、进一步提高患者对肿瘤免疫疗法的应答,具有重要的社会意义。自然杀伤细胞（natural killer cells,NK cells）是机体抗肿瘤免疫监视的重要组成部分。研究发现,肿瘤中NK细胞的浸润与患者良好的预后成正相关,并能增强机体对免疫检查点阻断疗法的应答。目前,基于NK细胞的肿瘤免疫疗法已经在恶性肿瘤的临床试验中显示出良好的效果。此外,越来越多的研究表明,肿瘤微环境代谢可能是影响抗肿瘤免疫反应和免疫治疗疗效的重要因素。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）是细胞能量代谢的感受器,在肿瘤微环境等代谢压力的诱导下可被激活,通过触发代谢重编程调控细胞的生存。AMPK已经被证明在肿瘤发展中发挥环境依赖性作用,既具有抑制肿瘤生长的作用,也能够促进肿瘤的发展。然而,肿瘤AMPK在机体抗肿瘤免疫监视以及免疫检查点阻断疗法中的作用,目前尚不清楚。本研究对肿瘤AMPK活化对NK细胞介导的肿瘤免疫监视和PD-L1阻断疗法的影响进行了研究。我们首先构建了anti-PD-L1应答的肿瘤模型和anti-PD-L1不应答的肿瘤模型,通过分析肿瘤组织的蛋白表达,我们发现,AMPK的活化水平在anti-PD-L1应答的肿瘤中显着升高、而在anti-PD-L1不应答的肿瘤中没有差异。使用药物抑制AMPK活化显着削弱PD-L1阻断疗法的治疗效果。这说明,肿瘤AMPK活化对于PD-L1阻断治疗疗效的发挥具有重要作用。同时,我们也验证了NK细胞在PD-L1阻断治疗中的作用。为了研究AMPK活化和NK细胞这两种对PD-L1阻断治疗具有重要作用的因素之间的相互关系,我们使用AMPK的激活剂—二甲双胍,也是临床治疗2型糖尿病的一线药物,来诱导AMPK活化。结果显示,二甲双胍诱导的AMPK活化以NK细胞依赖的方式显着抑制小鼠肿瘤的生长。在体外,二甲双胍诱导的AMPK活化可以促进肿瘤细胞对NK细胞介导的杀伤作用的敏感性。另外,我们通过构建肝激酶B1（liver kinase B1,LKB1）过表达的细胞系来诱导AMPK活化,进一步确认了AMPK活化对NK细胞抗肿瘤免疫的促进作用。转录组学分析结果显示,AMPK活化显着促进了模式识别受体通路相关基因的富集,并伴随着有益趋化因子基因表达的上调,这与黑色素瘤患者更高的生存率相关。进一步的机制研究表明,AMPK活化可能通过诱导错误折叠蛋白的过度积累,从而使肿瘤细胞更容易被NK细胞杀伤。更重要的是,我们的研究发现,不管是二甲双胍还是LKB1过表达诱导的AMPK活化与PD-L1阻断抗体联用时,表现出明显的协同抑制肿瘤生长的作用。综上所述,本研究首次发现细胞能量感受器AMPK的活化对PD-L1阻断治疗疗效的发挥具有关键作用。AMPK活化通过促进NK细胞介导的抗肿瘤免疫发挥抑制肿瘤生长的作用,并能协同增强PD-L1阻断疗法的治疗效果。这些结果提示,在临床治疗中增强肿瘤AMPK的活化具有提高肿瘤免疫治疗疗效的潜力。
王慧[8]（2020）在《食管癌肿瘤微环境中多核巨细胞和IgG4阳性B细胞的研究》文中进行了进一步梳理背景和目的:目前肿瘤微环境中的免疫细胞种类及功能受到越来越多的关注,基于T细胞研究发现的肿瘤免疫检测靶点阻断治疗给肿瘤的治疗带来了革新。但对其中的两种细胞即多核巨细胞（multinucleated giant cells,MGC）和B细胞却研究甚少。多核巨细胞反应常见于肉芽肿性炎症,在多种上皮类肿瘤中也有过报道,目前对于肿瘤中多核巨细胞的病理特征和生物学特点研究尚不清楚。本研究中,我们在食管癌中研究多核巨细胞的生物学特点和临床意义。B细胞介导的体液免疫是人体免疫重要组成部分。IgG4是体内含量最少的免疫球蛋白G亚类,是由成熟的B细胞分泌而来。在临床中IgG4阳性浆细胞的浸润增加主要见于IgG4相关性疾病,肿瘤组织IgG4阳性细胞的增加在胃癌,肝外胆管癌,恶性黑色素瘤中有过少量报道。目前关于食管癌中IgG4表达尚无相关研究,食管癌中IgG4相关免疫病理特征和临床特点亟待解答。材料方法:第一部分多核巨细胞的研究中运用免疫组化的方法在107例食管癌组织中检测了多核巨细胞的表达和分布,多核巨细胞的出现可以通过CD68染色结果和细胞的形态鉴别。并且通过用免疫荧光双重染色的方法鉴定了多核巨细胞的极化谱、细胞表面标志物、自分泌的酶,其中检测的指标有CD11c、HLA-DR、CD163、CD206、CD11b、CD64、CD32、CD16和MMP9等。我们联合多核巨细胞的表达情况和食管癌患者相关临床资料进行统计分析,通过Kaplan-Miere生存分析的方法,讨论多核巨细胞的表达与生存期的关系;通过单因素和多因素COX回归分析食管癌患者生存预后影响的因素,讨论多核巨细胞对生存预后是否有决定性的影响。第二部分B细胞相关的研究中,运用免疫组化和免疫荧光双重染色的方法对食管癌组织、癌旁组织、正常组织中Ig G亚类的浸润程度进行了分析统计,并且通过酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）的方法检测癌组织,正常组织和淋巴结中总Ig G、Ig G1、IgG4亚类含量。利用6色免疫荧光检测IgG4高表达样本中的免疫细胞分布特点。利用Ig G亚类亲和层析的方法提取患者血清中的Ig G1和IgG4亚类,并且将提取到的Ig G1,IgG4进行生物素标记,与同一患者的肿瘤组织进行反应,以检测Ig G1,IgG4 Fab段与肿瘤抗原反应性。通过生物标记的Ig G1和IgG4与外周血提取的单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMC）进行反应,检测Ig G1,IgG4的Fc段与PBMC的结合能力。通过蛋白质免疫印迹检测生物素化IgG4与其他亚类Ig G和其他种属Ig G之间的反应能力。利用木瓜蛋白酶酶切技术,将Ig G切割为Fab和Fc片段,检测IgG4 Fab和Fc片段的结构特点。通过分别加入Ig G1和IgG4对单核细胞进行体外培养,对比探讨Ig G1和IgG4的对单核巨噬细胞的极化功能。结果:第一部分:多核巨细胞在免疫组化的染色上均表现为CD68（+）,我们在107例食管癌组织中检测到34（31.7%）例样本有阳性表达。在免疫荧光双重染色中发现多核巨细胞表达的CD11c（+）、HLA-DR（+）、CD163（-）、CD206（-）、CD11b（+）、CD64（-）、CD32（+）、CD16（+）和MMP9（+）,提示多核巨细胞具有向M1型巨噬细胞分化的趋势,并且在其细胞表面有较多的Fc R和补体受体的表达,同时有较多基质金属蛋白酶的分泌。通过对食管癌患者的临床信息分析,我们发现多核巨细胞的表达与淋巴结转移（p=0.011）、p TNM分期（p=0.044）呈负相关,与生存期（p=0.04）呈正相关,与鳞状细胞癌的类型（p=0.020）和高组织分化（p=0.063）相关。第二部分:本课题组前期研究发现IgG4在食管癌患者的血清中有显着的增加（p<0.0001）,并且癌组织中IgG4的浓度和IgG4+浆细胞密度也是显着高于同一患者的正常组织（p<0.01,p<0.001）。通过分析高表达IgG4的组织样本发现肿瘤相关的淋巴滤泡中心高表达IL-10细胞因子,IL-10在组织样本上的表达和IgG4有一致的趋势,部分IgG4（+）IL-10（+）细胞可能属于调节性B细胞。将Ig G1和IgG4从患者血清中分离后,发现来源于自身血清提取的Ig G1能够和冰冻肿瘤组织切片发生反应,而IgG4不能反应。Ig G1反应的部位和肿瘤细胞的位置一致。说明B细胞经过类别转换后,产生的IgG4其Fab抗原识别端发生了改变,表现出和Ig G1不同的特点。经过蛋白质的凝集素层析后电泳发现:与Ig G1相比,IgG4有高水平的甘露糖化和唾液酸化糖基化修饰。IgG4的糖基化修饰发生在重链上,导致其中一条重链的分子量比另一条高2-3k Da,随后的酶切实验证明这一修饰位点在重链的Fab段。IgG4的Fab段高水平糖基化可能是IgG4和Ig G1抗原识别能力存在差别的原因之一。在IgG4和Ig G1竞争PBMC结合位点的实验中,发现IgG4可以与Ig G1竞争和PBMC的结合,说明尽管IgG4的Fc段与Fc R结合能力不如Ig G1,却能够与Ig G1竞争结合位点。另外,研究中还发现IgG4能够和Ig G1发生反应,这种反应是通过Fc-Fc反应进行的。在细胞实验中,初步将Ig G1和IgG4用于单核细胞的分化培养,发现Ig G1和IgG4具有促进单核细胞分别向M1型和M2型巨噬细胞极化的作用。讨论和结论:本研究发现多核巨细胞是一类向M1型分化的巨噬细胞,在肿瘤微环境中能够吞噬消化肿瘤细胞,清除鳞癌组织中的角化珠,有利于恶性肿瘤细胞及其相关成分的降解,有益于肿瘤患者的生存预后。多核巨细胞的出现可作为食管鳞状细胞癌的一类特征,可能作为肿瘤生物学行为和生存预后的一类判断指标,为肿瘤的治疗提供新的思路。本研究发现IgG4在食管癌患者的组织和血清中增加,并且IgG4的增加和肿瘤病理分期相关。同一患者的来源的Ig G1具有针对肿瘤组织的抗原特异性,而IgG4抗肿瘤特异性弱于Ig G1。在结构上IgG4的重链Fab段具有高水平的糖基化修饰,修饰后的IgG4的Fab段和Ig G1的Fab段相比出现了结构上的差别。在患者血液中能够检测到小片段的IgG4 Fc片段,同时IgG4的Fc段具备和其他亚类、其他种属（鼠,兔,羊）反应的能力。高浓度的IgG4还能够降低Ig G1和PBMC的结合水平。与含量最大的Ig G1相比,IgG4的Fab段和Fc段的特点是IgG4与Ig G1发挥不同的生理功能的基础,也带给我们更多关于肿瘤免疫的思考和认识,当机体内的免疫分子IgG4逐渐增加时,预示着肿瘤内B细胞功能向局部免疫抑制方向转变。这些特点也为肿瘤的免疫治疗和单克隆抗体的研发提供更多的思路和启发。
郑智航[9]（2020）在《基于病毒全蛋白组序列筛选T细胞表位研发新型寨卡病毒T细胞疫苗》文中进行了进一步梳理寨卡病毒（Zika virus,ZIKV）是一种通过蚊媒传播的黄病毒,属于黄病毒科黄病毒属,在热带、亚热带地区广泛流行。自1947年在乌干达寨卡森林首次被发现以来,在全球范围内60多年都未曾爆发流行。2007年,ZIKV在太平洋西部的雅浦岛首次爆发后,引起了部分关注;但直到2015年南美洲ZIKV疫情爆发,才受到了国际社会的广泛关注。基于该病毒对全球公共卫生安全造成的重大威胁,2016年ZIKV感染被正式列为全球公共卫生紧急事件,针对它的研究也不断深入。ZIKV表面覆盖包膜,内部核衣壳组成二十面体结构,其基因组为大小约11kb的正义单链RNA。被ZIKV感染后,患者症状一般较轻,包括发热、斑疹、关节痛和结膜炎等,也有研究发现,它与神经系统疾病（如格林-巴利综合征）存在必要关联;更严重的是,先天性ZIKV感染可能导致严重的临床疾病,包括骨骼异常、眼睛视觉病变、小头畸形、脑积水等。ZIKV可能存在的垂直传播、性传播、血液传播等诸多传播途径,也导致ZIKV的防治更为艰难,更易造成严重的公共卫生危机。在ZIKV引起了国际社会的广泛关注后,其疫苗研发也进入了“快车道”。目前,正在研发的ZIKV疫苗种类主要包括减毒活疫苗、灭活疫苗、核酸疫苗、重组疫苗等。而这些正在研发的疫苗都专注于诱导中和性抗体的产生,抗体能够通过中和病毒颗粒近而抑制病毒的复制,但所产生的抗体虽然可能有保护性,但也可能导致病毒感染过程中的抗体依赖性增强（antibody dependent enhancement,ADE）反应的发生。有实验证据显示,ZIKV的抗体能够在体外实验模型中协助登革病毒增强对机体或细胞的感染（ADE）,反之亦然。有报道发现ZIKV感染过程中的T细胞反应发挥着重要作用,ZIKV的记忆性CD4+和CD8+T细胞反应在动物模型中被证实具有针对ZIKV的保护作用,而T细胞反应本身没有ADE发生的可能性。本课题通过开发具有保护性,且无ADE风险的T细胞疫苗,研究T细胞疫苗预防病毒感染的可行性以及有效性,进而探究T细胞反应在ZIKV感染过程中所发挥的作用,以及T细胞疫苗在ZIKV感染过程中提供保护作用的机制。ZIKV T细胞表位的确定对T细胞疫苗及T细胞免疫研究有重要作用,因此本课题首先着重于在ZIKV感染小鼠中T细胞表位的确定。我们针对ZIKV的蛋白序列,设计并合成了427条重叠多肽,每条为18个氨基酸长,相邻多肽间重叠10个氨基酸,覆盖病毒蛋白序列全长。利用IFN-γELISPOT试剂盒,我们检测出了63条阳性肽段。通过FACS进一步分析不同T细胞亚群被ZIKV肽段刺激起的细胞因子分泌量,最终确定了11条包含CD4+T细胞表位的肽段,以及19条包含CD8+T细胞表位的肽段。其中7条肽段位于结构蛋白上,21条肽段位于非结构蛋白上。为了聚焦T细胞疫苗、避免抗体反应的干扰,我们利用从非结构蛋白中选择的包含T细胞表位的肽段构建了3种ZIKV T细胞疫苗,包括仅含CD4+T细胞表位的肽段NS2A（95-112）,NS2B（13-30）,NS2B（37-54）,NS2B（93-110）,NS3（43-60）。仅含CD8+T细胞表位的肽段NS1（263-280）,NS4A（66-83）,NS4B（36-53）,NS4B（76-93）,NS4B（84-101）,以及包含CD4+T细胞表位肽段NS2A（95-112）,NS2B（13-30）,NS2B（37-54）,NS2B（93-110）,NS3（43-60）与包含CD8+T细胞表位肽段NS1（263-280）,NS4A（66-83）,NS4B（36-53）,NS4B（76-93）,NS4B（84-101）的混合。然后我们通过ZIKV感染免疫后的小鼠以验证三种ZIKV T细胞疫苗的保护效果,发现三种ZIKV T细胞疫苗都能给被感染的小鼠提供保护,且同时包含CD4+与CD8+T细胞表位肽段疫苗能提供最佳保护。我们也同时发现ZIKV T细胞疫苗对于清除眼睛、脾脏、肝脏组织内的病毒有很好的效果。通过中和实验、ADE实验,我们确认利用这些T细胞表位肽段进行多次免疫后,在急性感染期既没有中和性抗体的产生,也没有ADE。在进一步的体内杀伤试验中,发现接种了这三种肽段疫苗的小鼠体内均可杀伤用相应肽段共孵育过的靶细胞。同时接种包含CD4+和CD8+T细胞表位肽段疫苗的小鼠表现出最佳的体内杀伤率,达到40.6%的特异性杀伤率。而那些单独使用CD4+或CD8+T细胞表位疫苗免疫的小鼠则分别有24.5%或19.1%的特异性T细胞杀伤率。这些数据表明,由T细胞表位疫苗产生的保护作用,部分是由T细胞介导的细胞毒作用。并且这种保护作用不依赖中和抗体,所以没有诱导ADE的风险。因此,T细胞表位具有开发前景。我们也尝试T细胞疫苗与传统抗体疫苗的组合以提供更好的疫苗功效。尤其是在黄病毒疫苗领域,通过增强保护性的T细胞免疫可以抑制体内ADE的风险,是个值得探讨的问题。在这里,我们设计了ZIKV T细胞肽段疫苗和E80蛋白疫苗的组合免疫方案,我们发现联合免疫后的小鼠在感染后的第3天,所有疫苗接种组的病毒血症水平均显着降低至检测阈值（25 PFU/ml）。但是,在仅用E80免疫的小鼠中,血液中所检测到的病毒RNA（包括血液中细胞内的病毒RNA）却并未显着降低。相反,用CD4+或CD8+T细胞疫苗免疫的小鼠血液中的病毒RNA明显降低。在感染后第7天同样观察到了这种差异。这些数据提示CD4+或CD8+T细胞疫苗的加入能够提高E80蛋白疫苗的功效。综上,本次研究首先证实了ZIKV感染在小鼠中可以引起强烈而广泛的T细胞应答,并鉴定出一系列新颖的CD4+和CD8+T细胞表位,且发现其中一些表位可以激活细胞毒性T细胞作用。随后,使用这些新鉴定的带有免疫优势表位的肽段,我们开发出一种新型ZIKV T细胞备选疫苗,证明该疫苗可赋予接种疫苗的小鼠抗ZIKV感染的能力。我们也发现与单独接种任何一种疫苗相比,T细胞表位疫苗和E80重组蛋白疫苗的联合使用可以提供更好的保护。这些结果将为开发基于CD4+和CD8+T细胞表位的ZIKV T细胞疫苗提供理论基础和先导产品。并且该发现也有助于打破其他病毒的T细胞疫苗研发的固有思路,具有重要的借鉴意义。
张鑫[10]（2020）在《吉西他滨增强肺癌免疫原性和NK细胞活性的研究》文中进行了进一步梳理研究背景肺癌是常见的恶性肿瘤之一。吉西他滨（gemcitabine,GEM）可以抑制DNA合成,其抗肿瘤活性已在临床上得到成功证实。GEM与顺铂（cisplatin,CDDP）的联合治疗,作为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）的一线化疗方案,在临床疗效、疾病进展和生存率方面均优于单用CDDP方案。虽然GEM可以有效杀死癌细胞,但许多患者在经历常规疗程化疗后仍面临癌症复发的风险。化疗药物存在多种免疫机制。因此,预防癌症复发最有效的策略可能是调动和刺激免疫系统对抗肿瘤细胞的作用。肿瘤免疫原性的定义是通过各种途径诱导肿瘤产生免疫反应以阻止其生长。在某些抗癌治疗过程中,死亡的肿瘤细胞会释放出免疫调节因子或损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns,DAMPs）。这些作为“危险信号”,增加了肿瘤细胞的免疫原性。高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protein,HMGB1）作为内源性危险信号,招募树突状细胞（dendritic cells,DCs）与Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）结合,激活T细胞免疫应答。钙网蛋白（calreticulin,CRT）可被化疗药等刺激因素诱导,从内质网腔向细胞膜转移,使细胞膜易于被DCs吞噬。自然杀伤细胞（natural killer cells,NKs）是一种重要的抗病毒和抗癌固有免疫淋巴细胞。NKG2D配体（natural killer group 2 member D ligands,NKG2DLs）属于NKs活化性受体,对于识别和清除肿瘤至关重要。NKG2DLs主要表达于肿瘤细胞,而在健康细胞中表达较低。通过上调NKG2DLs实现增加NKs杀伤活性,可以有效增强抗肿瘤免疫。研究目的本研究拟通过检测不同剂量GEM作用肿瘤细胞后诱导免疫原性的强弱,探讨抗肿瘤机制及疗效,为以GEM为基础治疗免疫功能正常的肺癌患者提供理论依据。研究方法采用免疫荧光法检测接受GEM刺激后LLC细胞和A549细胞免疫原性分子CRT、HMGB1的暴露。Dead染色法检测化疗药刺激LLC细胞和A549细胞后的存活情况。实时定量聚合酶链反应法（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）、流式细胞术分别验证GEM刺激LLC细胞和A549细胞后,NKG2DLs的mRNA水平和蛋白水平表达。在体内,构建LLC皮下荷瘤小鼠模型。监测皮下瘤的体积、小鼠的体重。GEM联合CDDP治疗小鼠肿瘤。收获小鼠后用血细胞分析仪分析血常规,用免疫荧光法观察皮下瘤的免疫原性分子CRT、HMGB1的暴露。用流式细胞术研究脾脏免疫细胞及功能分子变化。CFSE（carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester,羧基二乙酸荧光素N-琥珀酰亚胺酯）实验检测C57BL/6小鼠的脾脏NKs杀伤LLC细胞和GEM预刺激的LLC细胞。RTCA（real-time cellular analysis,实时细胞分析）实验检测化疗药治疗后荷瘤鼠脾脏纯化NKs杀伤未刺激的LLC细胞。肝脏、肾脏H&E染色,比较不同处理后的毒性作用。研究结果免疫荧光实验结果显示GEM刺激可以使LLC细胞和A549细胞的免疫原性分子CRT膜表达、HMGB1的暴露增加。低浓度的GEM相比于高浓度GEM刺激LLC细胞和A549细胞引起更强的CRT和HMGB1暴露。Dead染色观察到高剂量GEM引起更多LLC细胞与A549细胞死亡。qRT-PCR法检测到GEM刺激LLC细胞和A549细胞后诱导NKG2DLs mRNA水平表达上调,流式细胞术显示GEM刺激A549细胞后NKG2DLs的蛋白水平表达上调。体内实验中,免疫荧光法显示低剂量（30 mg/kg）GEM处理后皮下瘤CRT和HMGB1的每平方厘米平均荧光强度（MFI）高于中剂量（60 mg/kg）和高剂量（120 mg/kg）治疗组。低、中、高剂量GEM处理的小鼠血常规淋巴细胞绝对值无明显变化,但淋巴细胞百分比增加。所有化疗组血常规中性粒细胞绝对值和百分比均下降。小鼠脾脏流式细胞术结果显示,低剂量组NKs百分比增加,中、高剂量组未见增加。所有GEM组均检测到NKG2D表达上调。低剂量GEM组NKs功能分子IFN-γ表达增加。高剂量GEM组的Ki67的MFI和百分比与PBS组相比明显下降。CFSE实验结果显示,低剂量GEM刺激的LLC细胞对NKs杀伤更敏感。RTCA结果显示,所有GEM组NKs的细胞毒作用增强。低剂量GEM组的NKs杀伤功能强于中、高剂量两组。所有GEM组对LLC肿瘤的抑制作用显着高于PBS组。所有GEM组对小鼠体重无明显影响。H&E染色显示肝脏组织随着GEM剂量的增加出现空泡变性增加,但未见肾脏过度损伤。研究结论本研究观察到低剂量GEM治疗增加CRT的膜表达和HMGB1的暴露,上调了NKG2DLs的表达,活化NKs,增强抗肿瘤免疫。低剂量GEM治疗对免疫系统无明显毒性,通过增强免疫原性触发抗肿瘤作用。得出了如下结论:1.低剂量GEM可增强肺癌免疫原性分子的暴露低剂量GEM治疗可在体外肺癌细胞和荷瘤小鼠体内增强免疫原性分子CRT的膜表达、HMGB1的暴露。高剂量GEM可导致肺癌细胞死亡。2.GEM可诱导肺癌固有免疫系统相关免疫原性分子的上调GEM可上调人和小鼠肺癌细胞中NKG2DLs的表达,增加NKs抗肿瘤免疫反应。3.低剂量GEM可诱导肺癌小鼠模型中的NKs活化GEM减少小鼠血液中性粒细胞绝对值。低剂量GEM治疗小鼠脾脏NKs功能分子IFN-γ表达增加,高剂量GEM组Ki67下降。低剂量GEM可激活NKs免疫系统,而高剂量GEM则抑制NKs增殖。NKG2D+NKs表达IFN-γ水平高于NKG2D-NKs。低剂量GEM治疗可提升肺癌小鼠模型中的NKs免疫应答。4.低剂量GEM治疗的肺癌细胞对NKs杀伤更敏感NKs对低剂量GEM刺激后的LLC的杀伤作用更强。低剂量GEM治疗后的脾脏NKs杀伤肺癌细胞更敏感。GEM对小鼠脾脏NKs的Ki67、NKG2D和IFN-γ的表达无直接影响。5.低剂量GEM抑制小鼠肺癌生长低剂量GEM抑制小鼠肿瘤生长,对小鼠肝、肾组织无明显不良反应。
二、两种靶细胞在抗体依赖细胞介导的细胞毒活性检测中的比较（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、两种靶细胞在抗体依赖细胞介导的细胞毒活性检测中的比较（论文提纲范文）
（1）基于半抗原修饰策略的新型肿瘤糖疫苗设计及免疫活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 癌症及免疫疗法 |
| 1.2 糖类肿瘤疫苗简介 |
| 1.2.1 基于TACAs的疫苗 |
| 1.2.2 糖蛋白缀合疫苗的作用机制 |
| 1.2.3 糖类肿瘤疫苗构建策略 |
| 1.3 内源性抗体简介 |
| 1.3.1 内源性抗体 |
| 1.3.2 内源性抗体的应用 |
| 1.4 本论文的立题依据、研究意义和主要研究内容 |
| 1.4.1 立题依据与研究意义 |
| 1.4.2 主要研究内容 |
| 第二章 DNP修饰GM3的抗肿瘤疫苗的合成与免疫活性研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 原料与试剂 |
| 2.2.2 主要试剂配制 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.2.4 实验方法 |
| 2.2.5 间苯二酚法测定糖抗原负载量 |
| 2.2.6 动物免疫实验 |
| 2.2.7 酶联免疫吸附法(ELISA)测定效价 |
| 2.2.8 流式细胞实验 |
| 2.2.9 补体依赖的细胞毒实验 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 GM3-NHDNP-KLH疫苗的合成与表征 |
| 2.3.2 GM3-NHDNP-KLH疫苗的免疫活性分析 |
| 2.3.3 免疫产生的抗体与糖工程化肿瘤细胞的结合能力分析 |
| 2.3.4 补体依赖的细胞毒实验分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 多价鼠李糖修饰的sTn-BSA疫苗的合成与免疫活性研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 原料与试剂 |
| 3.2.2 主要试剂配制 |
| 3.2.3 主要仪器 |
| 3.2.4 实验方法 |
| 3.2.5 动物免疫实验 |
| 3.2.6 酶联免疫吸附法(ELISA)测定效价 |
| 3.2.7 流式细胞实验 |
| 3.2.8 补体依赖的细胞毒实验 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 肿瘤相关糖抗原sTn和半抗原Rha的合成与表征 |
| 3.3.2 sTn-BSA-Rha_n的合成与表征 |
| 3.3.3 sTn-BSA-Rha_n疫苗的免疫活性分析 |
| 3.3.4 免疫产生的抗体与肿瘤细胞结合能力分析 |
| 3.3.5 补体依赖的细胞毒实验分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 基于主客体自主装构建超分子糖蛋白缀合疫苗及其免疫活性研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 原料与试剂 |
| 4.2.2 主要试剂配制 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.2.4 实验方法 |
| 4.2.5 等温滴定量热实验 |
| 4.2.6 体外募集抗体能力实验 |
| 4.2.7 动物免疫实验 |
| 4.2.8 酶联免疫吸附法(ELISA)测定效价 |
| 4.2.9 酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞因子 |
| 4.2.10 流式细胞实验 |
| 4.2.11 补体依赖的细胞毒实验 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 主体分子CD-PEG_n-Rha_7合成与表征 |
| 4.3.2 客体分子sTn-BSA-Ada6合成与表征 |
| 4.3.3 sTn-BSA-Ada_6/CD-PEG_n-Rha_7疫苗的自组装与表征 |
| 4.3.4 sTn-BSA-Ada_6/CD-PEG_n-Rha_7疫苗的免疫活性分析 |
| 4.3.5 免疫产生的抗体与肿瘤细胞结合能力分析 |
| 4.3.6 补体依赖的细胞毒实验分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 多价DNP修饰的透明质酸缀合物的合成与抗肿瘤活性研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 原料与试剂 |
| 5.2.2 主要试剂配制 |
| 5.2.3 主要仪器 |
| 5.2.4 实验方案 |
| 5.2.5 细胞结合能力和抗体募集能力实验 |
| 5.2.6 体外抗体介导细胞毒实验 |
| 5.2.7 制备抗DNP血清实验 |
| 5.2.8 酶联免疫吸附法(ELISA)测定效价 |
| 5.2.9 小鼠肿瘤模型实验 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 HA-[PEG_m-DNP]_n的合成与表征 |
| 5.3.2 HA-[PEG_m-DNP]_n亲和力和特异性分析 |
| 5.3.3 HA-[PEG_m-DNP]_n缀合物体外抗肿瘤活性评估 |
| 5.3.4 HA-[PEG_3-DNP]_891的体外溶血实验分析 |
| 5.3.5 HA-[PEG_3-DNP]_891的体内抗肿瘤功效分析 |
| 5.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 附图 |
| 附录Ⅱ 化合物核磁与质谱 |
| 附录Ⅲ 作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（2）猪外周血细胞免疫流式细胞术检测方法的建立及其应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 猪抗沙门菌免疫应答的研究进展 |
| 1 猪的免疫系统 |
| 2 猪感染沙门菌的发病机制 |
| 3 沙门菌诱导的天然免疫 |
| 4 沙门菌诱导的获得性免疫 |
| 4.1 T细胞的作用 |
| 4.2 B细胞的作用 |
| 5 细胞免疫检测方法 |
| 6 猪的细胞免疫研究进展 |
| 第一章 猪外周血细胞免疫流式细胞术检测方法的建立 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 利用Histopaque-1083分离液分离猪外周血细胞 |
| 1.3 细胞活性分析 |
| 1.4 细胞增殖分析 |
| 1.5 流式细胞术检测细胞因子 |
| 1.6 qRT-PCR检测细胞因子的表达水平 |
| 1.7 流式细胞术检测细胞亚群 |
| 1.8 数据统计与分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 猪外周血细胞活性分析结果 |
| 2.2 ConA刺激猪外周血细胞增殖分析结果 |
| 2.3 细胞因子分析结果 |
| 2.4 猪外周血细胞亚群分析结果 |
| 3 讨论 |
| 第二章 猪霍乱沙门菌C500诱导仔猪细胞免疫应答分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 细菌培养 |
| 1.3 猪的免疫及样品采集 |
| 1.4 猪外周血淋巴细胞悬液的制备 |
| 1.5 BrdU ELISA法分析猪外周血淋巴细胞的增殖 |
| 1.6 流式细胞术分析猪外周血T细胞亚群 |
| 1.7 特异性CTL杀伤分析 |
| 1.8 利用流式细胞术分析胞内细胞因子分泌 |
| 1.9 数据统计与分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 免疫与采样 |
| 2.2 仔猪饲养记录 |
| 2.3 细胞增殖分析结果 |
| 2.4 胞内染色分析结果 |
| 2.5 细胞亚群分析结果 |
| 2.6 CTL效应分析结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 沙门菌体外感染诱导猪上皮细胞和单核细胞应答分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 单核细胞的制备 |
| 1.3 细菌感染 |
| 1.4 细胞活性分析 |
| 1.5 细胞增殖分析 |
| 1.6 细胞因子的表达分析 |
| 1.7 数据统计与分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 细胞活性分析结果 |
| 2.2 细胞增殖分析结果 |
| 2.3 细胞凋亡分析结果 |
| 2.4 细胞因子的mRNA水平分析结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的学术成果目录 |
| 致谢 |
（3）CXCL13趋化型CAR-T细胞对骨肉瘤治疗及其机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 研究背景及文献综述 |
| 1.骨肉瘤及其治疗现状 |
| 1.1 骨肉瘤的危害 |
| 1.2 骨肉瘤的免疫微环境 |
| 1.3 骨肉瘤的免疫治疗概况 |
| 2.NK G2D配体在骨肉瘤中的表达 |
| 3.趋化因子CXCL13与CXCR5 在肿瘤中的作用 |
| 4.肿瘤微环境 |
| 4.1 肿瘤浸润的MDSCs细胞 |
| 4.2 肿瘤浸润的巨噬细胞 |
| 4.3 肿瘤浸润的Tregs细胞 |
| 5.嵌合抗原受体T细胞免疫疗法及其研究进展 |
| 5.1 CAR-T概述 |
| 5.2 嵌合抗原受体的结构 |
| 5.3 CAR-T细胞治疗研究进展 |
| 6.NFAT信号通路及其作用机制 |
| 第二章 CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞治疗骨肉瘤的研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 CXCL13 与骨肉瘤的关系 |
| 2.3 Mock-CAR、NKG2D-CAR、CXCR5-NKG2D-CAR的构建和T细胞的感染 |
| 2.4 CAR-T细胞的制备 |
| 2.5 CAR-T细胞体外活性研究 |
| 2.6 CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞机制研究 |
| 2.7 CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞治疗骨肉瘤体内研究 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 CXCL13 的表达量与骨肉瘤病人免疫和生存期的关系 |
| 3.2 Mock、NKG2D、CXCR5-NKG2D CAR表达载体、病毒包装和T细胞的感染 |
| 3.3 Mock-CAR-T、NKG2D-CAR-T和 CXCR5-NKG2D-CAR-T体外活性 |
| 3.4 CXCR5增强NKG2D-CAR-T细胞活性的机制研究 |
| 3.5 CXCR5 增强了NKG2D-CAR-T的体内抗肿瘤活性 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第三章 mCXCR5-NKG2D-CAR-T对骨肉瘤肿瘤免疫微环境的影响 |
| 1.引言 |
| 2.实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞的体外活性研究 |
| 2.4 CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞对BALB/c骨肉瘤小鼠的治疗 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 鼠源CAR-T细胞和鼠源靶细胞的制备 |
| 3.2 mCXCR5-NKG2D-CAR-T细胞体外活性检测 |
| 3.3 mCXCR5-NKG2D-CAR-T细胞的体内活性检测 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 参考文献 |
| 简历 |
| 已发表文章 |
| 发表专利 |
| 获得奖励 |
| 致谢 |
| 附件一 RNA测序后定量PCR引物序列 |
（4）双特异性溶瘤腺病毒Ad-VT对卵巢癌抑制作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 绪论 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1.卵巢癌概述 |
| 2.溶瘤腺病毒 |
| 2.1 腺病毒的细胞进入、复制和免疫原性 |
| 2.2 肿瘤选择性复制腺病毒的研究现状 |
| 2.3 溶瘤腺病毒的临床发展 |
| 2.4 改造溶瘤腺病毒 |
| 3 凋亡素 |
| 3.1 凋亡素的序列和结构 |
| 3.2 凋亡素的IDP性质允许与细胞蛋白进行广泛的相互作用 |
| 3.3 凋亡素与DNA的相互作用 |
| 3.4 几种激酶介导凋亡素的细胞毒活性 |
| 3.5 通过细胞周期检查点感知细胞增殖状态 |
| 3.6 细胞是如何死亡的 |
| 3.7 凋亡素的传递方式 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 荧光素酶标记的人卵巢癌细胞的构建与鉴定 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 重组腺病毒Ad-VT对 A2780-LUC和 SKOV3-LUC细胞的抑制作用和抑制途径的研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 重组腺病毒Ad-VT对 A2780-LUC和 SKOV3-LUC细胞的体内抑制研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 攻读学位期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）基于淋巴细胞转化在流式细胞仪上的特征而建立的淋巴细胞转化试验及临床意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 基于流式细胞仪观察淋巴细胞转化 |
| (一)材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 标本来源 |
| 2.方法 |
| 2.1 在流式细胞仪的基础上初步建立淋巴细胞转化试验 |
| 2.1.1 配制RPMI1640 |
| 2.1.2 配制PHA |
| 2.1.3 准备 |
| 2.1.4 接种 |
| 2.1.5 培养 |
| 2.1.6 裂解红细胞 |
| 2.1.7 仪器准备 |
| 2.2 设门 |
| 2.3 分析 |
| (二)结果 |
| 1. 设门结果 |
| 2. 设门结果 |
| 3. 分析结果 |
| 4. 分析结果 |
| 5. 分析结果 |
| (三)讨论 |
| (四)小结 |
| (五)参考文献 |
| 第二章 淋巴细胞转化与端粒长度的关联 |
| (一)材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 标本来源 |
| 2.方法 |
| 2.1 健康体检者的淋巴细胞转化 |
| 2.2 待测标本全血基因组DNA提取 |
| 2.3 端粒长度测定 |
| 2.3.1 qPCR测定端粒长度 |
| 2.3.2 端粒长度计算 |
| 2.4 统计分析 |
| (二)结果 |
| (三)讨论 |
| (四)小结 |
| (五)参考文献 |
| 第三章 基于血细胞分析仪分析的淋巴细胞转化试验的方法的建立 |
| (一)材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 标本来源 |
| 2.方法 |
| 2.1 形态学计数法 |
| 2.2 在血细胞分析仪的基础上初步建立淋巴细胞转化试验 |
| 2.2.1 配制RPMI1640 |
| 2.2.2 配制PHA |
| 2.2.3 准备 |
| 2.2.4 接种 |
| 2.2.5 培养 |
| 2.2.6 仪器准备 |
| 2.2.7 处理 |
| 2.2.8 对比 |
| 2.3 稳定性实验 |
| 2.4 淋巴细胞转化试验在不同性别之间的测定 |
| 2.5 淋巴细胞转化试验在不同年龄段之间的测定 |
| 2.6 统计分析 |
| (二)结果 |
| 1.基于血细胞分析仪的淋巴细胞转化试验初步建立 |
| 2.稳定性实验结果 |
| 3.淋巴细胞转化试验在不同性别之间的测定结果 |
| 4.淋巴细胞转化试验在不同年龄段之间的测定结果 |
| (三)讨论 |
| (四)小结 |
| (五)参考文献 |
| 第四章 淋巴细胞转化试验检测方法的临床应用 |
| (一)材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 标本来源 |
| 2.方法 |
| 2.1 血液病样本与健康人样本的正态分布检验 |
| 2.2 血液病样本与健康人样本的T检验 |
| 2.3 不同血液病样本与健康人样本的T检验 |
| 2.4 统计分析 |
| (二)结果 |
| 1.血液病样本与健康人样本的正态分布检验结果 |
| 2.血液病样本与健康人样本的T检验结果 |
| 3.不同血液病样本与健康人样本的T检验 |
| (三)讨论 |
| (四)小结 |
| (五)参考文献 |
| 全文总结 |
| 工作展望 |
| 综述 细胞免疫检测技术进展及发展方向 |
| 参考文献 |
| 附录 作者简介 |
| 致谢 |
（6）靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 CAR-T的抗肿瘤研究和构建策略 |
| 1.2 人工CAR的结构 |
| 1.2.1 胞外抗原结合区 |
| 1.2.2 胞内细胞信号传导区与跨膜链接区 |
| 1.2.3 CAR-T的抗肿瘤机制及进展 |
| 1.3 CAR-T技术研究和临床应用的瓶颈 |
| 1.3.1 细胞因子风暴 |
| 1.3.2 脱靶效应 |
| 1.3.3 实体瘤应用瓶颈 |
| 1.3.4 转染载体的缺陷 |
| 1.3.5 移植物抗宿主反应与免疫细胞活性维持 |
| 1.3.6 免疫抑制作用 |
| 1.3.7 CAR-T细胞来源的限制 |
| 1.4 NK细胞为代表的非特异性免疫细胞研究 |
| 1.4.1 NK细胞的生物学特性研究 |
| 1.4.2 NK细胞对肿瘤的杀伤机理 |
| 1.5 NK细胞在治疗中的研究进展 |
| 1.5.1 针对血液肿瘤的NK细胞过继性免疫治疗研究 |
| 1.5.2 针对实体瘤的NK细胞相关免疫研究 |
| 1.6 人工CAR修饰的NK细胞构建与研究进展 |
| 1.6.1 CAR-NK分子靶点 |
| 1.6.2 CAR改造NK细胞的临床应用 |
| 1.7 CAR-NK相关的细胞因子介导的内源性NK细胞活化 |
| 1.8 非特异性免疫细胞的选择 |
| 1.8.1 CIK细胞的生物学特性和抗瘤特点研究 |
| 1.8.2 NK细胞来源与筛选 |
| 1.9 特异性分子靶点的研究与选择 |
| 1.10 本研究的目的和意义 |
| 2 CIK细胞人工CAR改造研究 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 实验细胞株与质粒 |
| 2.1.2 主要仪器与设备 |
| 2.1.3 主要实验试剂及耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 外周血单个核细胞的分离和培养 |
| 2.2.2 CAR-T细胞与CAR-CIK细胞的体外制备和体外扩增培养 |
| 2.2.3 CAR表达载体的构建及转化 |
| 2.2.4 病毒转导与检测 |
| 2.2.5 CAR-T细胞体外扩增 |
| 2.2.6 CAR-CIK细胞体外扩增 |
| 2.2.7 细胞计数及细胞形态增殖情况观察 |
| 2.2.8 CAR-CIK和CAR-T细胞免疫表型的检测 |
| 2.2.9 CAR-CIK和CAR-T细胞体外抗肿瘤活性的研究 |
| 2.2.10 统计学方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 CAR-T细胞和CAR-CIK细胞体外制备和扩大培养 |
| 2.3.2 设计并构建Psb1576-CD19-CAR重组载体 |
| 2.3.3 扩增CD19片段重组质粒构建和慢病毒的制备 |
| 2.3.4 CD19抗原过表达靶细胞稳定株构建 |
| 2.3.5 CD19-CAR在T细胞中的转导效率和免疫表型 |
| 2.3.6 CD19-CAR在CIK细胞中的转导效率和免疫表型 |
| 2.3.7 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
| 2.3.8 CIK和CAR-T细胞体外靶向细胞杀伤能力分析比较 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 NK细胞系的人工CAR改造研究 |
| 3.1 实验细胞株与材料试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 目的片段的PCR扩增和胶回收 |
| 3.2.3 表达GFP、IL-15和4-1BB基因的重组载体的构建及转化 |
| 3.2.4 病毒转导 |
| 3.2.5 流式细胞技术检测CAR阳性细胞比例以及表型分析 |
| 3.2.6 乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测CAR-NK-92细胞杀伤活性 |
| 3.2.7 细胞因子释放能力检测 |
| 3.2.8 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 CAR-NK-92重组质粒的设计 |
| 3.3.2 CAR-NK-92重组质粒的载体构建 |
| 3.3.3 CAR-NK-92重组质粒的筛选验证与载体包装和滴度测定 |
| 3.3.4 CAR-NK-92细胞的构建与免疫表型检测 |
| 3.3.5 不同浓度条件培养基对NK细胞扩增倍数的影响 |
| 3.3.6 不同浓度的条件培养基对NK细胞扩增以及活化表型的影响 |
| 3.3.7 CD19-CAR-NK-92细胞体外靶向识别杀伤能力检测 |
| 3.3.8 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 脐血来源的NK细胞人工CAR改造研究 |
| 4.1 实验用细胞材料及试剂配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 脐血单个核细胞分离方法 |
| 4.2.2 脐血NK细胞分离方法 |
| 4.2.3 脐血NK细胞体外扩增培养 |
| 4.2.4 CAR表达载体的改造 |
| 4.2.5 针对NK细胞改良的CD19-CAR载体转导 |
| 4.2.6 CAR-NK细胞体外优化培养 |
| 4.2.7 脐血CAR-NK细胞免疫表型及重要功能性分子表达检测 |
| 4.2.8 脐血CAR-NK细胞对靶细胞的细胞毒作用检测 |
| 4.2.9 细胞因子释放能力检测 |
| 4.2.10 体内动物实验 |
| 4.2.11 过氧化物酶染色法 |
| 4.2.12 细胞总RNA提取与qRT-PCR检测基因表达水平 |
| 4.2.13 免疫印迹实验 |
| 4.2.14 细胞单基因测序与生信分析 |
| 4.2.15 临床研究试验前期方案设计 |
| 4.2.16 统计学数据处理分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 CAR-NK重组质粒的构建 |
| 4.3.2 脐血来源的NK细胞筛选与扩增培养 |
| 4.3.3 重组CD19-CAR载体的转导及转导效率检测 |
| 4.3.4 CD19-CAR-NK细胞分子表达 |
| 4.3.5 NK细胞对靶细胞杀伤作用的测定 |
| 4.3.6 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
| 4.3.7 CD19-CAR-NK细胞的动物体内药效检测 |
| 4.3.8 CD19-CAR-NK细胞的动物体内安全性检测 |
| 4.3.9 CD19-CAR-NK细胞的动物模型中药代动力学 |
| 4.3.10 CD19-CAR-NK细胞的高通量测序分析 |
| 4.3.11 CD19-CAR-NK细胞的基因功能分类分析 |
| 4.3.12 CD19-CAR-NK细胞的细胞生物学调控 |
| 4.3.13 临床试验样本病理学分析 |
| 4.3.14 CD19-CAR-NK细胞临床预实验研究 |
| 4.3.15 CD19-CAR-NK细胞临床研究前患者样本分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 讨论 |
| 5.1 非特异性免疫细胞人工CAR的构建及细胞生物学研究 |
| 5.2 体外非特异性细胞扩增活化体系的优化 |
| 5.3 非特异性免疫细胞的选择与理论依据 |
| 5.3.1 CIK细胞方案 |
| 5.3.2 NK-92细胞方案 |
| 5.3.3 脐血NK细胞方案 |
| 5.4 CAR-NK的体内药效和基因表达谱分析 |
| 5.5 超越CAR-T的新型CAR-NK的优势与发展 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 博士学位论文修改情况确认表 |
（7）肿瘤AMPK活化促进NK细胞抗肿瘤免疫协同增强PD-L1阻断疗法的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 肿瘤发生、发展与免疫系统 |
| 1.1.1 肿瘤免疫监视学说 |
| 1.1.2 肿瘤免疫编辑学说 |
| 1.2 肿瘤免疫疗法 |
| 1.2.1 肿瘤免疫疗法的种类与发展 |
| 1.2.2 PD-1/PD-L1免疫检查点阻断疗法 |
| 1.3 NK细胞与肿瘤免疫 |
| 1.3.1 NK细胞简介 |
| 1.3.2 NK细胞的抗肿瘤机制 |
| 1.3.3 基于NK细胞的肿瘤免疫疗法 |
| 1.3.4 NK细胞在PD通路阻断疗法中的作用 |
| 1.4 AMPK与肿瘤发生 |
| 1.4.1 AMPK简介 |
| 1.4.2 AMPK通路在肿瘤发生发展中的作用 |
| 1.5 本文研究的目的和意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物与细胞系 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验耗材 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞系的培养与传代 |
| 2.2.2 LKB1过表达细胞系的构建 |
| 2.2.3 人原代NK细胞的制备与培养 |
| 2.2.4 小鼠脾脏NK细胞的制备与培养 |
| 2.2.5 小鼠肿瘤模型的构建 |
| 2.2.6 小鼠NK细胞清除实验 |
| 2.2.7 Anti-PD-L1 抗体体内给药实验 |
| 2.2.8 Compound C体内给药实验 |
| 2.2.9 小鼠TILs的分离与检测 |
| 2.2.10 NK细胞杀伤肿瘤细胞实验 |
| 2.2.11 NK细胞与靶细胞结合实验 |
| 2.2.12 NK细胞活化检测 |
| 2.2.13 细胞凋亡检测 |
| 2.2.14 细胞增殖检测 |
| 2.2.15 蛋白免疫印迹分析 |
| 2.2.16 转录组测序和基因富集分析 |
| 2.2.17 统计学分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 PD-L1 阻断治疗促进肿瘤AMPK的活化 |
| 3.2 二甲双胍诱导的AMPK活化使肿瘤对NK细胞介导的抗肿瘤免疫监视更敏感 |
| 3.2.1 二甲双胍诱导的AMPK活化抑制肿瘤在免疫正常小鼠体内的发展 |
| 3.2.2 二甲双胍诱导的AMPK活化不显着影响TILs的数量和功能 |
| 3.2.3 二甲双胍诱导的AMPK活化以NK细胞依赖的方式抑制肿瘤生长 |
| 3.3 二甲双胍诱导的AMPK活化促进肿瘤细胞对NK细胞介导的杀伤作用的敏感性 |
| 3.3.1 二甲双胍预处理使肿瘤细胞对NK细胞的杀伤更敏感 |
| 3.3.2 二甲双胍预处理促进NK细胞脱颗粒marker CD107a的表达 |
| 3.3.3 二甲双胍预处理促进肿瘤细胞与NK细胞的结合 |
| 3.3.4 二甲双胍增强肿瘤细胞对NK杀伤的敏感性依赖AMPK |
| 3.4 LKB1 诱导的AMPK活化促进NK细胞介导的抗肿瘤免疫监视 |
| 3.4.1 LKB1 过表达诱导的AMPK活化抑制小鼠肿瘤的生长 |
| 3.4.2 LKB1 诱导的AMPK活化对TILs的数量和功能的影响不显着 |
| 3.4.3 LKB1 过表达诱导的AMPK活化抑制肿瘤生长的作用依赖NK细胞 |
| 3.4.4 LKB1 过表达诱导的AMPK活化促进肿瘤细胞对NK细胞杀伤的敏感性 |
| 3.5 LKB1过表达促进肿瘤细胞模式识别受体和有益趋化因子的表达 |
| 3.6 AMPK活化通过诱导错误折叠蛋白的积累增强肿瘤细胞对NK细胞介导的杀伤作用的敏感性 |
| 3.7 肿瘤AMPK的激活协同增强anti-PD-L1 免疫治疗的疗效 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 攻读学位期间发表的学术论文与取得的其它研究成果 |
（8）食管癌肿瘤微环境中多核巨细胞和IgG4阳性B细胞的研究（论文提纲范文）
| 全文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 第一部分 食管癌中多核巨细胞的研究 |
| 第一章 食管癌组织中多核巨细胞的表达和极化类型研究 |
| 第二章 食管癌中多核巨细胞的表达与临床预后统计分析 |
| 第二部分 B细胞产生IgG4损伤机体的抗肿瘤免疫及对免疫治疗的启示 |
| 第一章 食管癌组织和血清中IgG4增加以及肿瘤相关免疫细胞的检测 |
| 第二章 IgG4亚类高表达病例免疫病理研究与探讨 |
| 第三章 IgG4亚类的结构和功能特点的研究 |
| 第四章 IgG4对单核巨噬细胞的极化影响的研究和探索 |
| 全文总结 |
| 综述:IgG4抑制肿瘤免疫的可能机制 |
| 参考文献 |
| 在读期间已发表的文章 |
（9）基于病毒全蛋白组序列筛选T细胞表位研发新型寨卡病毒T细胞疫苗（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 寨卡病毒的流行概况 |
| 1.1.1 寨卡病毒的发现及传播 |
| 1.1.2 寨卡病毒的全球流行 |
| 1.2 寨卡病毒的临床特征和发病机制 |
| 1.2.1 寨卡病毒的临床特征 |
| 1.2.2 寨卡病毒的细胞感染机制 |
| 1.3 疫苗的保护机制 |
| 1.4 寨卡病毒疫苗的研究现状 |
| 1.4.1 灭活疫苗 |
| 1.4.2 减毒疫苗 |
| 1.4.3 核酸疫苗 |
| 1.4.4 重组疫苗 |
| 1.5 T细胞反应在寨卡病毒感染过程中的作用 |
| 1.5.1 T细胞在寨卡病毒感染小鼠过程中的作用 |
| 1.5.2 T 细胞在寨卡病毒感染人过程中的作用 |
| 1.6 研究设计与拟解决的问题 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 肽段的设计与合成 |
| 2.2 细胞的培养、传代以及冻存 |
| 2.3 病毒培养及滴度测定 |
| 2.3.1 病毒培养 |
| 2.3.2 病毒滴度测定 |
| 2.4 Balb/c小鼠病毒感染模型的建立 |
| 2.5 细胞因子检测 |
| 2.5.1 通过ELISPOT对 IFN-γ分泌量的检测 |
| 2.5.2 通过FACS对 IFN-γ、IL-2 分泌量的检测 |
| 2.6 寨卡病毒中和试验 |
| 2.7 体外检测抗体依赖的增强感染作用 |
| 2.8 T细胞体内杀伤实验小鼠模型的建立 |
| 2.8.1 T细胞体内杀伤实验 |
| 2.8.2 样品的处理及数据的检测、分析 |
| 2.9 病毒拷贝的核酸检测法 |
| 2.9.1 检测样本RNA的抽提 |
| 2.9.2 通过qRT-PCR法检测病毒拷贝 |
| 2.10 数据的处理及分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 寨卡病毒全蛋白组的T细胞表位筛选 |
| 3.1.1 寨卡病毒感染的Balb/c小鼠能被刺激起强而广的T细胞反应 |
| 3.1.2 寨卡病毒T细胞表位的MHC限制性 |
| 3.2 寨卡病毒特异性的 T 细胞反应介导体内细胞毒作用 |
| 3.3 CpG 佐剂比铝佐剂能更好的激活 CD8+ T 细胞反应 |
| 3.4 肽段免疫的小鼠能对寨卡病毒的感染提供保护作用 |
| 3.4.1 肽段免疫策略以及免疫原性检测 |
| 3.4.2 肽段免疫诱导的保护性检测 |
| 3.4.3 肽段免疫通过T细胞杀伤提供保护作用 |
| 3.5 寨卡病毒亚单位疫苗与T细胞疫苗联合使用的协同作用分析 |
| 第四章 结论与讨论 |
| 4.1 课题结论及其意义 |
| 4.2 可以通过IFN-γELISPOT高效筛选T细胞表位 |
| 4.3 肽段免疫中CD8+T 细胞表位肽段的弱免疫原性 |
| 4.4 T细胞反应在避免ADE过程中发挥作用 |
| 4.5 进一步提高多表位疫苗免疫原性的可能方法 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（10）吉西他滨增强肺癌免疫原性和NK细胞活性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 肺癌的免疫治疗和分子靶向治疗综述 |
| 第一部分 肺癌的免疫治疗 |
| 2.1 应激反应 |
| 2.1.1 CRT |
| 2.1.2 HMGB1 |
| 2.1.3 HSPs |
| 2.1.4 ATP |
| 2.2 NKs的抗肿瘤作用 |
| 2.2.1 NKs的定义及功能 |
| 2.2.2 NKs对肿瘤的免疫监视 |
| 2.2.3 NKs清除肿瘤 |
| 2.2.4 NKG2D和抗肿瘤免疫 |
| 2.3 解除肿瘤微环境中的免疫抑制 |
| 2.4 抑制免疫逃逸 |
| 2.4.1 免疫检查点抑制剂 |
| 2.4.2 TIGIT |
| 2.4.3 TIM-3 |
| 2.4.4 LAG-3 |
| 2.5 免疫系统对化疗疗效的影响 |
| 2.6 癌症疫苗 |
| 第二部分 肺癌的分子靶向治疗 |
| 2.7 EGFR-TKIs |
| 2.8 ALK基因重排 |
| 2.9 ROS-1 基因重排 |
| 2.10 K-Ras基因突变 |
| 第3章 材料与方法 |
| 3.1 实验动物 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 细胞系 |
| 3.2.2 细胞培养相关试剂 |
| 3.2.3 细胞刺激和小鼠治疗化疗药 |
| 3.2.4 细胞分选相关试剂 |
| 3.2.5 免疫荧光相关试剂 |
| 3.2.6 流式细胞术相关试剂 |
| 3.2.7 NKG2D抗体流式细胞术相关试剂 |
| 3.2.8 RNA提取及逆转录PCR和实时荧光定量PCR相关试剂 |
| 3.2.9 小鼠组织细胞分离相关试剂 |
| 3.2.10 CFSE试剂 |
| 3.2.11 Dead染色试剂 |
| 3.3 实验仪器 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.4.1 细胞培养 |
| 3.4.2 细胞冻存与复苏 |
| 3.4.3 化疗药刺激细胞 |
| 3.4.4 LLC细胞皮下荷瘤小鼠模型 |
| 3.4.5 LLC细胞皮下荷瘤小鼠化疗药治疗 |
| 3.4.6 小鼠脾脏单个核细胞分离 |
| 3.4.7 流式细胞术检测表面分子 |
| 3.4.8 流式细胞术检测胞内分子 |
| 3.4.9 磁珠分选(MACS)NKs |
| 3.4.10 流式细胞分选 |
| 3.4.11 免疫荧光染色 |
| 3.4.12 细胞总RNA提取 |
| 3.4.13 逆转录(RT)反应 |
| 3.4.14 荧光定量PCR(q-PCR) |
| 3.4.15 血常规检测 |
| 3.4.16 NKs体外杀伤(CFSE) |
| 3.4.17 NKs体外杀伤(RTCA) |
| 3.4.18 H&E染色 |
| 3.4.19 流式细胞术检测NKG2DLs的表达 |
| 3.4.20 Dead染色 |
| 3.4.21 统计学分析 |
| 第4章 结果 |
| 4.1 第一部分低剂量GEM可增强肺癌免疫原性分子的暴露 |
| 4.1.1 GEM诱导肺癌免疫原性的体外研究 |
| 4.1.2 GEM诱导肺癌免疫原性的体内研究 |
| 4.1.3 小结 |
| 4.2 第二部分低剂量GEM治疗可增强NKs驱动的肿瘤免疫 |
| 4.2.1 GEM可诱导肺癌固有免疫系统相关免疫原性分子上调 |
| 4.2.2 小鼠血常规检测 |
| 4.2.3 GEM治疗可活化小鼠NKs |
| 4.2.4 低剂量GEM治疗增加NKs IFN-γ表达,高剂量GEM治疗损害NKs增殖 |
| 4.2.5 NKG2D+NKs表达IFN-γ水平高于NKG2D-NKs |
| 4.2.6 小鼠脾脏淋巴细胞变化 |
| 4.2.7 淋巴细胞的门控策略及典型流式图 |
| 4.2.8 CFSE杀伤实验 |
| 4.2.9 皮下荷瘤小鼠GEM治疗后脾脏NKs杀伤LLC细胞 |
| 4.2.10 RTCA杀伤实验 |
| 4.2.11 GEM对小鼠脾脏NKs Ki67,IFN-γ和 NKG2D的表达无直接影响 |
| 4.2.12 小结 |
| 4.3 第三部分低剂量GEM抑制小鼠肺癌的生长 |
| 4.3.1 LLC皮下荷瘤小鼠皮下瘤拍照及小鼠体重 |
| 4.3.2 LLC皮下荷瘤小鼠肝脏、肾脏H&E染色 |
| 4.3.3 小结 |
| 第5章 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
四、两种靶细胞在抗体依赖细胞介导的细胞毒活性检测中的比较（论文参考文献）
- [1]基于半抗原修饰策略的新型肿瘤糖疫苗设计及免疫活性研究[D]. 林汉. 江南大学, 2021(01)
- [2]猪外周血细胞免疫流式细胞术检测方法的建立及其应用[D]. 赵歌. 扬州大学, 2021(08)
- [3]CXCL13趋化型CAR-T细胞对骨肉瘤治疗及其机制的研究[D]. 张利. 华东师范大学, 2021(12)
- [4]双特异性溶瘤腺病毒Ad-VT对卵巢癌抑制作用研究[D]. 崔英丽. 吉林大学, 2021(01)
- [5]基于淋巴细胞转化在流式细胞仪上的特征而建立的淋巴细胞转化试验及临床意义[D]. 冯廷华. 大连医科大学, 2021(01)
- [6]靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究[D]. 曹韪凡. 东北林业大学, 2020
- [7]肿瘤AMPK活化促进NK细胞抗肿瘤免疫协同增强PD-L1阻断疗法的研究[D]. 卢珍. 中国科学院大学(中国科学院深圳先进技术研究院), 2020(01)
- [8]食管癌肿瘤微环境中多核巨细胞和IgG4阳性B细胞的研究[D]. 王慧. 汕头大学, 2020(01)
- [9]基于病毒全蛋白组序列筛选T细胞表位研发新型寨卡病毒T细胞疫苗[D]. 郑智航. 中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所), 2020(08)
- [10]吉西他滨增强肺癌免疫原性和NK细胞活性的研究[D]. 张鑫. 吉林大学, 2020(08)