一、成纤维细胞生长因子-10对3种与修复有关内源性生长因子表达的调控作用（论文文献综述）
李腾艳,聂敏海,刘旭倩[1]（2022）在《浓缩生长因子与表皮生长因子干预口腔黏膜等效细胞的增殖和衰老》文中进行了进一步梳理背景:浓缩生长因子与表皮生长因子是近年来被广泛研究的生物学材料,经研究证实其可通过影响细胞生物学行为,进而促进组织修复与损伤愈合。目的:探讨浓缩生长因子联合表皮生长因子对人牙龈成纤维细胞、上皮细胞、人正常黑色素细胞系正常人皮肤黑色素细胞增殖和衰老的影响。方法:（1）浓缩生长因子/表皮生长因子与人牙龈成纤维细胞、上皮细胞、正常人皮肤黑色素细胞体外共培养,MTT分别筛选出浓缩生长因子、表皮生长因子、浓缩生长因子+表皮生长因子的最佳作用浓度;（2）实验分组:人牙龈成纤维细胞对照组、50%浓缩生长因子组、10μg/L表皮生长因子组、50%浓缩生长因子+10μg/L表皮生长因子组;上皮细胞对照组、30%浓缩生长因子组、10μg/L表皮生长因子组、30%浓缩生长因子+10μg/L表皮生长因子组;正常人皮肤黑色素细胞对照组、30%浓缩生长因子组、20μg/L表皮生长因子组、30%浓缩生长因子+10μg/L表皮生长因子组、30%浓缩生长因子+20μg/L表皮生长因子组;（3）CCK-8检测细胞增殖,Transwell检测细胞迁移,Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡。研究通过西南医科大学附属口腔医院生物医学科学研究伦理委员会审查（申请受理号:20181008001）及患者和志愿者知情同意。结果与结论:（1）MTT结果提示,浓缩生长因子对人牙龈成纤维细胞、上皮细胞、正常人皮肤黑色素细胞增殖影响的最佳质量浓度分别为50%,30%,30%;表皮生长因子对人牙龈成纤维细胞、上皮细胞、正常人皮肤黑色素细胞增殖影响的最佳质量浓度分别是10,10,20μg/L;与既定最佳浓度浓缩生长因子协同作用,对3种细胞增殖影响最佳的表皮生长因子质量浓度为10μg/L;（2）CCK-8、Transwell、Annexin V/PI双染色法结果显示,浓缩生长因子联合表皮生长因子可促进人牙龈成纤维细胞、上皮细胞、正常人皮肤黑色素细胞增殖、迁移及抑制细胞凋亡,作用效应呈现出表皮生长因子>浓缩生长因子+表皮生长因子>浓缩生长因子的趋势;（3）浓缩生长因子联合表皮生长因子促进细胞增殖、迁移和抑制细胞凋亡的效应较浓缩生长因子单独作用强,较表皮生长因子单独作用弱。
周颐,刘笑言,向柄彦[2]（2022）在《组织修复和再生领域浓缩生长因子的应用优势》文中认为背景:浓缩生长因子作为最新一代自体血小板浓缩生物制剂,因其具有天然的纤维蛋白支架和丰富的内源性生长因子,近年来已成为组织修复和再生领域的研究热点。目的:总结浓缩生长因子在组织修复和再生领域中的研究进展,探讨目前研究阶段存在的问题,以期为浓缩生长因子的后续研究提供新的参考思路。方法:文章以"浓缩生长因子、干细胞、组织修复、组织再生"为中文检索词,以"Concentrated growth factor,CGF,Stem cells,Tissue repair,Tissue regeneration"为英文检索词,在Pub Med、EMbase、Medline和中国知网数据库进行全面检索。收集归纳近10年来浓缩生长因子在组织修复和再生领域应用的相关研究证据,根据严格纳入排除标准筛选文献,最终纳入96篇。结果与结论:（1）文章从浓缩生长因子制备和应用的具体方法,促进组织修复和再生的原理,体外对细胞增殖和分化的作用,以及体内对组织修复和重建4个方面详细总结了浓缩生长因子目前的研究进展,讨论了现阶段存在的问题和未来可能的研究发展方向。（2）浓缩生长因子是一个在组织修复和再生领域具有潜力的自体生物活性因子,制备方法简便,应用方式灵活多变,完全取自自体血液,无免疫排斥反应,生物相容性良好。（3）浓缩生长因子的核心结构包括天然的纤维蛋白支架和多种内源性生长因子,在体外能促进多种干细胞的增殖、迁移、分化,浓缩生长因子与干细胞的复合体是干细胞治疗领域一种新的策略。（4）浓缩生长因子在体内能促进骨缺损的修复,其与组织工程材料联合所构建的局部生长因子缓释系统是延长生长因子缓释时间的有效方法。（5）浓缩生长因子在促进软组织修复、抗皮肤光老化、减少术后并发症等领域呈现出良好的效果,其已成为目前自体生物活性制剂个性化治疗的优先选择之一。
田微[3]（2021）在《bFGF对3-硝基丙酸诱导的小鼠胚胎氧化应激损伤的保护作用》文中认为现如今男女平等的概念深入人心,越来越多的女性兼顾着家庭与工作,随之而来的压力也越来越大,导致由氧化应激引起的生殖系统疾病发病率越来越高。有研究表明,卵母细胞和胚胎质量由于卵巢氧化应激而被降低,早期胚胎的发育能力也被影响。因此,相关的氧化应激模型被建立对该方面的研究是意义重大的。细胞线粒体复合物Ⅱ抑制剂是3-硝基丙酸（3-NPA）,细胞线粒体提供ATP的功能可以被3-硝基丙酸抑制,细胞ATP因此而缺乏,3-硝基丙酸还可以诱导线粒体产生和释放ROS,因此细胞氧化应激被诱导而发生。本试验是通过给小鼠腹腔注射3-硝基丙酸（3-NPA）,从而建立小鼠卵巢氧化应激模型。碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）作为含155个氨基酸的促有丝分裂的阳离子多肽,对于组织细胞具有修复的作用,促进组织细胞的增殖分化。bFGF还具有一定的对抗氧化应激的作用和抑制凋亡的作用。本试验旨在研究,将碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）添加到体外培养液中会对3-硝基丙酸诱导的小鼠早期胚胎体外发育产生怎样的影响。试验分为阴性对照组（KSOM）,阳性对照组（KSOM+bFGF）,3-NPA处理组（体内注射3-NPA+KSOM）,抗氧化剂处理组（KSOM+3-NPA体内注射+bFGF）,对这四个试验组小鼠囊胚期的胚胎内活性氧含量,谷胱甘肽水平以及线粒体膜电位进行了检测及分析,然后对各试验组囊胚期胚胎内的抗氧化相关基因SOD1,SOD2,GPX3,GPX4,CAT,Nrf,还有与细胞全能性有关基因SOX2,CDX2,H19及细胞凋亡有关基因Bax,Cyt-c,Caspase-9的mRNA表达水平进行了检测。试验结果表明,浓度为100 ng/m L的bFGF处理组与对照组及其他浓度处理组相比,使4-细胞率（P﹤0.05）及囊胚率（P﹤0.05）显着提高了。同时bFGF显着降低了囊胚期胚胎内的活性氧含量（P﹤0.05）,并显着提高了囊胚期胚胎内的谷胱甘肽水平和线粒体膜电位水平（P﹤0.05）。在小鼠早期胚胎体外培养液中添加bFGF后,囊胚期胚胎内与抗氧化水平相关基因GPX3、GPX4、NRF2、SOD1、SOD2、CAT的mRNA表达水平被上调。此外,bFGF的添加还提高了囊胚期胚胎内细胞全能性相关基因SOX2、CDX2、H19的mRNA表达水平。最后发现,囊胚期胚胎内细胞凋亡相关基因Bax、Cyt-c、Caspase-9的mRNA表达水平因bFGF的添加而被降低了。综合以上结果说明,bFGF通过降低3-硝基丙酸诱导的小鼠早期胚胎氧化应激水平和改善线粒体膜电位水平,从而提高了3-硝基丙酸诱导的小鼠早期胚胎的抗氧化水平和降低了细胞凋亡水平,进而有效保护了3-硝基丙酸诱导小鼠的早期胚胎体外发育,改善了3-硝基丙酸诱导的小鼠早期胚胎质量。
王宝剑[4]（2021）在《基于“阳化气，阴成形”理论研究TGF-β1/Smads影响黄韧带肥厚的机制及模型的建立》文中研究指明黄韧带肥厚（Ligamentum flavum hypertrophy,LFH）是退行性腰椎管狭窄症（Degenerative Lumbar Spinal Stenosis,DLSS）的主要病理表现之一。黄韧带（ligamentum flavum,LF）位于上、下椎板之间,从颈椎延伸至骶椎,起到保护和稳定脊柱的作用。黄韧带在纤维化过程中一方面是其自身体积发生增厚的改变,另一方面是其自身弹性的下降在脊柱后伸时出现皱褶、折叠,使椎管容积减小,导致马尾神经、神经根的受压和缺血缺氧。与此同时,肥厚黄韧带中增多的炎性介质会透过硬脊膜而扩撒至神经根,易造成神经根的炎症及水肿。另外,炎性介质还可以激活多种纤维化因子的表达而加速纤维化的进程。因此黄韧带炎症与纤维化的病理改变共同参与、相互影响而导致了 DLSS腰腿痛、间歇性跛行的症状。在退行性脊柱疾病的促炎细胞因子中,IL-1β、TNF-α是最主要的参与者,其在肥厚黄韧带中的高表达已得到初步证实,另外TGF-β 1/Smads被认为是引起纤维化的最重要的信号传导通路,它在各种组织与器官的纤维化和瘢痕组织纤维性修复过程中有着核心的推动作用。但目前关于黄韧带炎性或纤维化信号通路的研究较少。至于Smads通路是否可以介导TGF-β1致使细胞外基质沉积而导致黄韧带的肥厚,以及IL-1β、TNF-α和TGF-β 1/Smads通路中的相关原件与黄韧带厚度、纤维化程度的具体相关性尚未见报道。而在中医机制方面,“阳化气,阴成形”理论对黄韧带肥厚的病机阐明具有重要指导作用,该理论与现代医学“炎症-纤维化”的病理机制相契合。但目前尚无从该角度探讨黄韧带肥厚的报道。黄韧带肥厚动物模型的建立是研究退行性脊柱疾病的基础,也是探索黄韧带增厚机制、发现药物潜在治疗靶点的前提。但极少数研究涉及腰椎黄韧带肥厚动物模型的制作,对于该动物模型目前仍存在争议。实验一基于“阳化气,阴成形”理论研究IL-1β、TNF-α和TGF-β1/Smads在LFH中的表达及相关性目的:通过对比增厚黄韧带与未增厚黄韧带的纤维化程度以及IL-1β、TNF-α和TGF-β 1/Smads通路相关原件的表达水平,探索黄韧带厚度与纤维化程度和以上原件表达的具体相关性,初步证实Smads通路可以介导TGF-β1致使细胞外基质沉积而导致黄韧带肥厚。从“阳化气,阴成形”理论角度阐述黄韧带肥厚的中医病机,以期为中医药干预黄韧带“炎症-纤维化”病理过程提供理论支持。方法:（1）在取得医学伦理批准和患者知情同意的前提下,在临床手术中收集废弃的DLSS组增厚黄韧带和腰椎间盘突出症（Lumbar disc herniation,LDH）组未增厚黄韧带,各25例。（2）通过MRI测量两组黄韧带的厚度并对比其差异。（3）对两组标本组织进行HE染色组织学观察。（4）进行Masson三色法染色后,通过纤维化分级标准以及弹性纤维-胶原纤维比值来对比两组黄韧带总体与各层（腹侧层、中间层、背侧层）纤维化程度的差异。（5）免疫组化法检测两组黄韧带IL-1β、TNF-α、TGF-β 1/Smads（TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7）、collagen Ⅰ（Col 1）、collagen Ⅲ（Col 3）的定位、半定量表达。（6）Real-Time PCR 法检测两组黄韧带 IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads（TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7）、Col1 和 Col 3 mRNA 的定量表达。（7）相关性研究:通过pearson相关与线性回归分析明确DLSS组黄韧带的厚度与其各层纤维化程度、mRNA表达的具体相关性。结果:（1）DLSS 组的黄韧带厚度为 5.13±0.80mm,大于 LDH 组 3.52±0.67mm（p<0.01）。（2）HE染色下,LDH组的未增厚黄韧带弹性纤维呈直线状,排列紧密且整齐,表面光滑连续,以弹性纤维为主,含有少量胶原纤维,细胞数目较少。DLSS组增厚的黄韧带纤维呈波浪状,排列紊乱、疏松,弹性纤维减少,胶原纤维含量增加,成纤维细胞增多。（3）DLSS组的总体纤维化分级为2.44±0.31级,高于LDH组的1.62±0.22级（p<0.05）;DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的纤维化分级均高于LDH组（p<0.05或p<0.01或p<0.001）;DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的纤维化分级是逐渐递增的,即腹侧层<中间层<背侧层（p<0.05或p<0.01）;DLSS组的弹性纤维-胶原纤维面积比值为1.85±0.54,低于LDH组的2.92±0.37（p<0.01）;DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的弹性-胶原纤维比值均低于LDH组（p<0.05或p<0.01）;DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的弹性-胶原纤维比值是逐渐递减的,即腹侧层>中间层>背侧层（p<0.05或p<0.01）。（4）免疫组化:DLSS 组的 IL-1 β、TNF-α、TGF-β 1、p-Smad2/3、Col 1和Col 3的蛋白表达均高于LDH组（p<0.05或p<0.01或p<0.001）。DLSS组的Smad7的蛋白表达低于LDH组（p<0.01）。（5）Real-Time PCR:DLSS 组 IL-1β、TNF-α、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col 1 和 Col 3 的 mRNA 表达高于 LDH 组（p<0.05 或 p<0.01 或 p<0.001）。DLSS 组 Smad7 的 mRNA 表达低于 LDH 组（p<0.05）;DLSS 组的 IL-1β、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col 1和Col 3的mRNA表达在背侧层最高,腹侧层最低,有从背侧层向腹侧层逐渐递减的趋势。Smad7的mRNA表达在背侧层最低,腹侧层最高,有从背侧层向腹侧层逐渐递增的趋势。（6）在DLSS组中,黄韧带腹侧层、中间层以及背侧层的纤维化分级随着黄韧带的厚度的增加而升高。各层的相关系数r分别为0.54,0.73,0.84,说明黄韧带的厚度与背侧层纤维化分级的相关程度最高。黄韧带腹侧层、中间层以及背侧层的弹性纤维-胶原纤维比随着黄韧带的厚度的增加而降低。各层的相关系数r分别为-0.62,-0.72,-0.81,说明黄韧带的厚度与背侧层弹性-胶原纤维比值的相关程度最高。（7）在DLSS组中,黄韧带厚度与背侧层TGF-β 1 mRNA表达的相关程度最高,其次依次为IL-1 β、Col 1等;黄韧带厚度与中间层IL-1 β mRNA表达的相关程度最高,其次依次为Smad7、TGF-β 1等;黄韧带厚度与腹侧层TGF-β 1 mRNA表达的相关程度最高,其次依次为为IL-1 β、Col 3等。结论:（1）相较于未增厚黄韧带,肥厚黄韧带中TGF-β1、Smad2、Smad3（或p-Smad2/3）、Col 1和Col3的mRNA和蛋白均呈高表达,Smad7的mRNA和蛋白呈低表达。初步证实Smads通路可以介导TGF-β1致使细胞外基质沉积而导致黄韧带肥厚。（2）在肥厚黄韧带中,背侧层的纤维化程度大于中间层和腹侧层。其厚度也与各层的纤维化程度呈正线性相关,且以背侧层相关性最高,中间层次之,最后是腹侧层。在肥厚黄韧带中,IL-1β、TNF-α、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col 1和Col 3 mRNA表达均高于中间层和腹侧层,Smad7 mRNA表达低于中间层和腹侧层。其厚度也与各层的mRNA表达呈正线性（或负线性）相关,且以背侧层相关性最高,中间层次之,最后是腹侧层。说明黄韧带炎症与纤维化的严重程度由背侧向腹侧逐渐递减,其病理改变可由背侧向腹侧逐渐发展。（3）结合“阳化气,阴成形”理论认为,黄韧带在增龄、急性创伤、慢性劳损等因素作用下易出现微损伤,并诱导了局部炎症反应,当机体处于“阴平阳秘”的生理状态时,这种损伤尚能引发适度的炎症反应,以及正常的纤维化修复和瘢痕的形成,而当机体处于阴阳失衡、阳不化气状态时,持续的炎症反应使细胞因子、趋化因子等代谢产物长期聚集于黄韧带局部,形成了炎症微环境,从而诱发了过度的纤维化修复和瘢痕的形成。该中医理论与现代医学中炎症反应诱发过度的纤维化修复和瘢痕形成的理论相类似。实验二基于三种造模方法诱导大鼠黄韧带肥厚动物模型的建立与评价目的:建立一种新的黄韧带肥厚大鼠模型,并将其与人肥厚黄韧带组织进行比较、评估。同时,探讨腰椎活动范围的增加所诱发黄韧带增厚的机制。方法:（1）将72只大鼠分为A假手术组（切开皮肤等组织后缝合）、B肌肉切除组（切除L5-L6椎旁肌肉）、C骨关节切除组（切除L5-L6棘突和棘上韧带,磨除L5/6双侧关节突关节的一半,关节囊不做缝合处理）以及D肌肉+骨关节切除组（B+C混合）共4组,于造模后的4w、8w、12w共3个时间点取材。（2）通过对黄韧带的HE染色和Masson染色,测量L5/6节段黄韧带总体和背侧层的厚度以及弹性纤维-胶原纤维的比值。（3）通过X线片测量屈曲和背伸位时L5/6节段的活动范围和椎间隙高度。（4）通过免疫组化、免疫印迹、Real-Time PCR法检测黄韧带中炎性因子(IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads通路相关原件和Col 1、Col 3的表达。（5）将大鼠黄韧带与人肥厚黄韧带的退变程度进行比较、评估。结果:（1）HE染色与黄韧带厚度的测量:三种造模方法均可以引起黄韧带厚度的增加,其中以肌肉+骨关节切除法最明显,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法。12w时肌肉+骨关节切除组黄韧带的整体厚度是假手术组的1.35倍,骨关节切除组是假手术组的1.14倍,肌肉切除组是假手术组的1.06倍。但三种造模方法均不能引起黄韧带宽度的额外增加。12w时肌肉+骨关节切除组黄韧带背侧层厚度是假手术组的2.09倍,骨关节切除组是假手术组的1.26倍,肌肉切除组是假手术组的0.96倍。三种造模方法中只有骨关节切除法和肌肉+骨关节切除法可以引起黄韧带背侧层厚度及其所占比例的增加,其中以肌肉+骨关节切除法最为明显,其次为骨关节切除法。（2）Masson染色与纤维化程度:三种造模方法均可以引起黄韧带的弹性-胶原纤维比值的下降,其中以肌肉+骨关节切除法最为明显,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法。12w时肌肉+骨关节切除组黄韧带的弹性-胶原纤维比是假手术组的0.43倍,骨关节切除组是假手术组的0.66倍,肌肉切除组是假手术组的0.95倍。（3）影像学测量:三种造模方法均可以造成屈曲位椎间隙后方高度和活动范围的增加,其中以肌肉+骨关节切除法最明显,骨关节切除法次之,最后是肌肉切除法。（4）免疫组化、免疫印迹、Real-Time PCR:①免疫组化结果显示,肌肉+骨关节切除组所产生的 IL-1 β、TNF-α、TGF-β 1、p-smad2/3、Col 1 和 Col 3的蛋白表达量最多,Smad7的表达量最少,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法;②免疫印迹结果显示,肌肉+骨关节切除组所产生的IL-1 β、TNF-α、TGF-β1和Col 1的蛋白表达量最多,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法;③Real-Time PCR结果显示,肌肉+骨关节切除组所产生的IL-1 β、TNF-α、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col1和Col 3的mRNA表达量最多,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法。（5）造模术后12w时假手术组的弹性-胶原纤维的比值为2.79,将其与实验一中数据比较,其退变程度类似于人未增厚的黄韧带（2.92）;肌肉切除组的弹性-胶原纤维的比值为2.65,退变程度仍接近人未增厚的黄韧带（2.92）;骨关节切除组的弹性-胶原纤维的比值为1.84,退变程度接近人轻度肥厚的黄韧带（1.66-2.23）;肌肉+骨关节切除组的弹性-胶原纤维的比值为1.19,退变程度与人中度肥厚的黄韧带相近（1.08-1.66）。结论:（1）建立了一种新的黄韧带肥厚大鼠模型,其退变程度可能类似于人类中度肥厚的黄韧带。（2）三种造模方法均能引起黄韧带退变与增厚,其程度依次为肌肉+骨关节切除法>骨关节切除法>肌肉切除法。（3）在大鼠模型中,黄韧带背侧层的增厚占比例最高,这可能是由于背侧层在屈曲位受到更大的应力导致的。说明机械应力可能是诱发或加速黄韧带增厚的重要因素。（4）腰椎屈曲范围的增加所引发的机械应力可导致黄韧带中炎性因子TNF-α、IL-1 β的高表达,并诱导TGF-β 1/Smads通路致使细胞外基质沉积而导致黄韧带肥厚。
褚新月[5]（2021）在《诱导性心脏祖细胞的生成及其3D水凝胶培养体系的构建》文中研究说明心脏疾病是造成人类死亡的主要原因之一,其发病率仅次于癌症,特别是由于冠状动脉阻塞而导致的心肌梗死（Myocardial infarction,MI）,常造成心肌细胞（Cardiomyocytes,CMs）的不可逆损伤或死亡。由于出生后CMs的再生能力很差,目前对于MI仍无有效的根治方法。移植外源性CMs治疗MI需要大量的细胞,容易造成免疫排斥反应,且细胞来源受限。胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）和诱导性多能干细胞（Induced pluripotent stem cells,i PSCs）能够分化成为心脏细胞,但由于其体内分化方向难以控制,容易产生异质细胞,甚至引发肿瘤。采用间接谱系转化技术,将体细胞重编程为诱导性心脏祖细胞（Induced cardiac progenitor cells,iCPCs）,因其具有“自我更新”和心脏谱系细胞分化潜能,能够提供大量细胞资源、有效降低致瘤性和分化细胞异质性,具有广阔的应用前景。传统二维（Two-dimension,2D）细胞培养系统因无法精确模拟体内状态,造成大量心脏疾病研究结果无法在实验动物和临床试验中复制重现。运用细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）构建的三维（Three-dimension,3D）培养体系（例如:水凝胶）能够模拟细胞的体内微环境,更有利于开展心脏疾病的研究。壳聚糖是一种由葡萄糖胺和乙酰葡萄糖胺组成的天然多糖,具有无毒、可降解、抗菌和抗真菌等特性,有望降低ECM引入的污染问题,并提升水凝胶的稳定性。因此,本研究通过过表达五种心脏转录因子（Gata4、Nkx2.5、Tbx5、Baf60c和Mesp1）,将人胚肾293T细胞（Human embryonic kidney 293T cells,HEK-293T细胞）重编程成为iCPCs;应用胶原蛋白、壳聚糖和ECM构建出3D水凝胶细胞培养体系,并探讨了iCPCs在该体系中的细胞行为和诱导分化特性,为心脏疾病的机理研究、药物筛选、模型构建和细胞治疗等奠定了基础。试验一iCPCs的生成与鉴定应用间接谱系转化技术,通过Lipofectamine LTX介导心脏转录因子Gata4、Nkx2.5、Tbx5、Baf60c和Mesp1在HEK-293T细胞中过表达,将其重编程成为iCPCs,并通过形态学观察、免疫细胞化学染色、实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR,RT-qPCR）和诱导分化等方法对所得细胞进行鉴定。结果表明:（1）HEK-293T细胞经重编程后,所得细胞具有与心脏祖细胞（Cardiac progenitor cells,CPCs）相似的形态学特征,细胞呈圆形或椭圆形,无突起;呈现出CPCs特异性标志蛋白:Gata4、Nkx2.5和Irx4的免疫细胞化学染色阳性反应,且各自的阳性细胞率分别为61.36±1.08%、60.97±1.28%和61.73±1.18%;与HEK-293T细胞相比,iCPCs中Irx4、Tbx20、Mesp1和Nkx2.5基因的相对表达量极显着上调（P<0.01）,而Fsp1和Col5A1基因的相对表达量极显着下调（P<0.01）;（2）iCPCs经心脏谱系诱导分化液处理后,能够生成呈短圆柱形、细胞核位于细胞中央的CMs,呈多边形、细胞边缘不规则的内皮细胞（Endotheliocytes,ECs）,以及呈长梭形、无横纹的平滑肌细胞（Smooth muscle cells,SMCs）;分化细胞呈现出CMs特异性标志蛋白——Cardiac actin、ECs特异性标志蛋白—CD31或SMCs特异性标志蛋白—SM-MHC的免疫细胞化学染色阳性反应,其各自的阳性细胞率分别为49.37±84%、48.61±0.74%和47.57±0.77%;分化细胞中c Tn T和Actinin-α1（CMs标志基因）、PEACAM1（ECs的标志基因）和MYL2（SMCs的标志基因）的相对表达量分别极显着高于iCPCs对照组（P<0.01）。因此,过表达Gata4、Nkx2.5、Tbx5、Baf60c和Mesp1能够将HEK-293T细胞重编程成为CPC样细胞,所得iCPCs具备分化成为CMs、ECs和SMCs的能力。试验二iCPCs的3D水凝胶培养体系构建采用胶原蛋白、壳聚糖和ECM,按照不同体积比:4:0:3（对照组）、4:1:3（壳聚糖处理组1）、4:2:3（壳聚糖处理组2）和4:3:3（壳聚糖处理组3）制备水凝胶,通过检测其形态结构、孔隙率、溶胀度和降解率,筛选细胞回收条件,探讨水凝胶对iCPCs行为和分化的影响,旨在构建iCPCs的3D水凝胶培养体系。结果表明:（1）经扫描电子显微镜观察,不同比例组成的3D水凝胶均显示出立体网络结构。对照组水凝胶显示出较大孔径的结构,胶原蛋白分布较为疏松;壳聚糖处理组1的水凝胶呈现出较为致密的结构,孔径大小均一,表面粗糙,各孔隙相互贯通;壳聚糖处理组2和3的水凝胶表现出更小的孔径结构,胶原纤维分布杂乱无序,有大小不等的隆起;（2）壳聚糖处理组1形成水凝胶的孔隙率（99±0.30%）、溶胀度（97±0.87%）、降解率（44±0.03%）以及iCPCs的增殖倍数（58±0.24）和存活率（73±0.60%）均分别极显着高于对照组、壳聚糖处理组2和3（P<0.01）;（3）0.30%胰蛋白酶和0.25%胶原蛋白酶消化同种3D水凝胶回收的细胞数之间无显着性差异（P>0.05）,但均极显着高于0.45%胃蛋白酶处理组（P<0.01）;经不同浓度的胰蛋白酶、胶原蛋白酶和胃蛋白酶消化3D水凝胶后,壳聚糖处理组1的回收细胞数均分别极显着高于其余比例组成的3D水凝胶处理组（P<0.01）;（4）在3D水凝胶中,iCPCs及其诱导分化细胞的形态学特征与2D培养细胞无明显差异,体积稍小;与2D培养体系相比,在3D水凝胶中,iCPCs来源分化细胞:Cardiac actin+CMs、CD31+ECs和SM-MHC+SMCs的数量均极显着上升（P<0.01）,分化细胞的c Tn T、actininα1、PEACAM1和SMCs基因的相对表达量也极显着上调（P<0.01）。因此,宜采用壳聚糖处理组1的方案制备水凝胶进行iCPCs的3D培养,使用0.25%胶原蛋白酶或0.30%胰蛋白酶消化水凝胶回收细胞,3D水凝胶比2D培养体系更有利于iCPCs体外分化成为CMs、ECs和SMCs。结论:利用Lipofectamine LTX介导五种心脏转录因子（Gata4、Nkx2.5、Tbx5、Baf60c和Mesp1）的过表达,可以将HEK-293T细胞重编程成为iCPCs,所得iCPCs具备分化成为CMs、ECs和SMCs的能力;宜采用胶原蛋白、壳聚糖和ECM,按照4:1:3的比例,构建出机械性能强和稳定性高的3D水凝胶,该细胞培养体系支持iCPCs的存活和增殖行为,0.25%胶原蛋白酶或0.30%胰蛋白酶适宜用于消化水凝胶回收细胞;3D水凝胶比2D培养体系更有利于iCPCs分化成为心脏谱系细胞:CMs、ECs和SMCs。iCPCs的生成和3D水凝胶培养体系的建立为解析心脏发育、损伤和修复机制,构建心脏疾病模型,筛选和开发药物,研发细胞治疗新策略等提供了研究平台。
李兆东[6]（2021）在《万通筋骨片对类风湿关节炎的抗炎机制研究及16S rDNA高通量测序和代谢组学分析》文中提出类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种慢性自身免疫性疾病,具有致残率高,治疗周期长,预后差和易复发等特点,常给患者家属和社会带来沉重负担。成纤维样滑膜细胞（rheumatoid arthritis-fibroblast-like synoviocytes,RAFLSs）是关节滑膜组织的重要组成细胞,其过度增殖可促进免疫细胞释放大量促炎因子,从而引发炎症反应,加剧RA病理进程。此外,关节腔内募集的促炎因子也会进一步激活RA-FLSs细胞。因此,抑制RA-FLSs细胞增殖或降低关节内促炎因子水平是治疗RA的一种有效手段。当前,药物治疗仍是RA的主要治疗方式,但由于化学合成药物的治疗不仅费用昂贵,且常伴有副作用,因此人们正积极寻找安全、有效和廉价的药物来治疗RA。近年来,中药以其具有的显着疗效和较少的副作用,在治疗RA方面已受到越来越多的关注。此外,中药可通过多成分、多途径、多靶点的方式参与RA的治疗过程。万通筋骨片是由25味中药组成的复方药,具有“祛风散寒、通络止痛”的功效,主要用于风湿和类风湿性关节炎等骨性疾病。由于其作用机理不明确,从而限制了它在国内外的推广和使用。因此,系统研究万通筋骨片在治疗RA中的作用和机制十分必要。首先,基于胶原诱导性关节炎（collagen-induced rheumatoid arthritis,CIA）大鼠模型,我们研究万通筋骨片对RA的抗炎作用;其次,基于RA-FLSs细胞的生物学活性,我们研究万通筋骨片对RA的抗炎机制;随后,在万通筋骨片抗炎作用的基础上,我们利用高通量测序技术继续挖掘万通筋骨片的抗炎基因靶点;最后,我们利用16S rDNA高通量测序和代谢组学分析研究万通筋骨片对肠道菌群和血清代谢物谱的影响,拟挖掘参与万通筋骨片抗炎作用的靶点微生物群和靶点代谢物。因此,本研究不仅为万通筋骨片在临床上治疗RA提供了实验依据,促进了其推广和应用,而且也为中药治疗RA的机制研究建立了新的思路。第一部分万通筋骨片对类风湿关节炎的抗炎作用首先,为了确定万通筋骨片的安全给药浓度,我们进行了急性毒性实验,血常规检测和肝脾肾功能分析。其次,为了评估CIA大鼠模型的构建效果,我们检测了大鼠的足趾肿胀度,关节内TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子水平,关节的病理结构变化,以及滑膜组织中FLSs特异性标志蛋白（Vimentin）的表达水平。最后,为了研究万通筋骨片对RA的抗炎作用,我们连续灌胃给药14天和28天后,检测了CIA大鼠足趾肿胀度,炎性关节病理结构变化,以及关节腔和关节组织中TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子水平。结果显示:万通筋骨片给药的安全有效浓度可设为150、300和600 mg/kg;CIA大鼠成模率>99.00%。当连续治疗14天时,各组CIA大鼠足趾肿胀度没有明显变化;当连续治疗28天时,300和600 mg/kg组的CIA大鼠足趾肿胀度明显降低。组织病理切片显示,连续给药14天和28天时,各组CIA大鼠的关节病理结构发生不同程度的改善,尤以600 mg/kg连续给药28天的治疗组CIA大鼠,病理结构改善效果最佳。关节腔内促炎因子的水平变化结果显示,在连续给药14天和28天时,各给药浓度均表现出不同程度的抗炎作用,尤以600 mg/kg连续给药28天的抗炎效果最佳。关节组织中促炎因子的水平变化结果显示,连续给药14天时,TNF-α和IL-1β促炎因子水平显着降低;连续给药28天时,TNF-α,IL-1β和IL-6促炎因子水平明显下调。这些结果说明,万通筋骨片对RA具有抗炎作用,且呈现一定的时间依赖性和浓度依赖性。第二部分万通筋骨片在类风湿关节炎中的抗炎机制基于万通筋骨片的抗炎作用,本研究在细胞水平和动物水平继续研究万通筋骨片的抗炎机制。首先,为了确定万通筋骨片对RA-FLSs细胞增殖的影响,我们观察了RA-FLSs细胞形态变化,并应用乳酸脱氢酶活性测定,Ed U核酸标记以及免疫组化等实验技术检测RA-FLSs细胞数目变化和滑膜组织中Vimentin蛋白表达情况。其次,我们利用蛋白免疫印迹,免疫荧光和免疫组化等技术检测了MEK、p MEK、ERK1/2和p ERK1/2蛋白在RA-FLSs细胞及CIA大鼠滑膜组织中的表达水平。同时,我们还利用ERK1/2质粒转染等相关实验,进一步验证MEK/ERK信号通路在万通筋骨片抗炎过程的作用。最后,为了研究万通筋骨片是否通过诱导滑膜细胞凋亡的方式参与抗炎作用,我们检测了RA-FLSs细胞中caspase-3/9蛋白酶活性,cleaved-caspase-3和cleaved-PARP的蛋白表达水平,以及CIA大鼠滑膜组织中Bax,Bcl-2,caspase-3和cleaved-caspase-3蛋白表达水平。结果显示:药物处理24 h和48 h后,各组RA-FLSs细胞形态均发生改变,尤以3 mg/ml和4 mg/ml药物浓度处理48 h,细胞形态变化较为明显。药物处理24 h后,各组RA-FLSs细胞数目无明显变化;药物处理48 h后,2 mg/ml、3mg/ml、4 mg/ml给药浓度可以显着抑制RA-FLSs细胞增殖。经药物处理24 h和48 h后,MEK,p MEK,ERK1/2和p ERK1/2蛋白在RA-FLSs细胞中均呈现不同程度的降低趋势,尤以3 mg/ml和4 mg/ml药物浓度处理48 h,各蛋白表达差异最为明显。同时,过表达ERK1/2显着提升RA-FLSs细胞的增殖能力,而过表达ERK1/2的RA-FLSs细胞经3 mg/ml药物浓度处理后,细胞增值能力显着下降。同时,万通筋骨片可以下调MEK,p MEK,ERK1/2和p ERK1/2蛋白在滑膜组织中的表达。此外,药物处理24 h后,4 mg/ml药物浓度显着提高RA-FLSs细胞中caspase-3/9蛋白酶活性;药物处理48 h后,3 mg/ml和4 mg/ml明显上调caspase-3/9蛋白酶活性。我们还发现,药物处理24 h和48 h后,3 mg/ml和4mg/ml药物浓度显着上调cleaved-caspase-3蛋白表达,2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml药物浓度显着上调cleaved-PARP蛋白表达。同时,万通筋骨片可以上调滑膜组织中Bax和cleaved-caspase-3蛋白表达以及下调Bcl-2和caspase-3蛋白表达。这些结果表明,万通筋骨片通过抑制RA-FLSs细胞增殖及诱导RA-FLSs细胞凋亡参与抗炎过程。第三部分基于RNA高通量测序挖掘万通筋骨片在类风湿关节炎中的抗炎靶点基于万通筋骨片对RA-FLSs细胞的影响,本研究针对药物处理后的RA-FLSs细胞进行RNA高通量测序分析。为了更加全面、准确的获得抗炎靶点,我们采用两种不同的分析方法进行筛选,即DESeq2差异分析以及STEM时间序列和WGCNA权重共表达联合分析。DESeq2差异分析:通过DESeq2差异分析,拟筛选不同组别间的差异基因;针对这些差异基因,我们随后进行功能富集过滤和蛋白互作（protein-protein interaction,PPI）网络分析,并根据PPI网络中节点连接度筛选备用核心基因。STEM时间序列和WGCNA权重共表达联合分析:基于药物处理组和未处理组之间的差异基因,我们拟筛选与时间序列具有相同表达趋势的基因。针对这些基因,我们进一步筛选具有相同表达模式的差异基因。随后通过功能富集过滤,权重共表达网络分析,PPI网络分析,以及节点连接度来筛选备用核心基因。最后,我们利用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹验证备用核心基因的表达模式,以便获得理想的抗炎靶点。结果显示:通过DESeq2差异分析,在不同比较组间,我们共获得184个差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）,且这些基因与细胞周期和同源重组等代谢通路密切相关。同时,基于PPI蛋白网络,我们共筛选出4个备选核心基因,即BRCA1,ATR,SMC3和BUB1。通过STEM时间序列和WGCNA权重共表达联合分析,我们共获得111个具有相同表达趋势和表达模式的DEGs,且这些基因显着富集于细胞周期和RNA转运等代谢通路。同时,基于WGCNA和PPI网络,我们共筛选出6个备选核心基因,即PNN,SMC3,EIF3A,BUB1,ATR和ORC4。此外,TTK,STAG2和THOC1也与细胞周期密切相关,因此TTK,STAG2和THOC1也作为备选核心基因。至此,共获得10个备选核心基因,即:BRCA1、ORC4、TTK、BUB1、SMC3、ATR、PNN、EIF3A、STAG2和THOC1。基因和蛋白验证结果显示,只有SMC3和BUB1的表达模式与测序结果一致。这些结果表明,SMC3和BUB1可能是万通筋骨片在RA中的抗炎靶点。第四部分基于16S高通量测序和代谢组学联合分析挖掘万通筋骨片在类风湿关节炎中的抗炎靶点基于万通筋骨片对CIA大鼠的抗炎作用,本研究针对CIA大鼠粪便样本和血清样本,分别进行16S高通量测序分析和代谢组学分析,拟挖掘万通筋骨片抗炎作用的肠道菌群靶点和代谢物靶点。16S高通量测序分析:基于操作单元聚类和物种多样性分析,我们拟研究万通筋骨片对肠道菌群结构的影响;基于肠道菌群差异分析,我们拟筛选相对丰度较高的差异菌群。代谢组学分析:基于样本相关性和多元统计分析,我们拟研究万通筋骨片对血清代谢物谱的影响;基于差异代谢物筛选,功能富集过滤和差异代谢物表达分析,我们拟筛选理想的差异代谢物。16S高通量测序与代谢组学联合分析:基于top10差异肠道菌属和top20差异代谢物,我们进行联合分析,拟研究肠道微生物群与血清代谢物的关系,并验证或筛选肠道菌群靶点和代谢物靶点。结果显示:通过16S高通量测序分析,我们发现万通筋骨片可以明显改变CIA大鼠的肠道菌群结构。在门水平上,拟杆菌、软壁菌和脱铁杆菌的菌群相对丰度得到显着改善。此外,拟杆菌与厚壁菌的菌群相对丰度比值（Bacteroidetes/Firmicutes）也恢复到正常水平。在属水平上,弧菌、巨型球菌和漫游球菌的菌群相对丰度下调至正常水平。通过代谢组学分析,我们发现万通筋骨片可以明显改变CIA大鼠的血清代谢物谱。其中,血清素、二硫化谷胱甘肽、N-乙酰神经氨酸、萘和血栓素B2等5种代谢物均有标准化的趋势,但不具有统计学差异。通过16S高通量测序与代谢组学联合分析,我们发现,弧菌、巨型球菌和漫游球菌都存在于top10差异肠道菌群范围内,且与这3种微生物群存在显着联系的代谢物包括5种。此外,考虑到代谢物鉴定过程中的假阳性,我们认为:在这5种代谢物中,只有微管素B是内源性代谢物。这些结果表明,万通筋骨片可能通过调节肠道菌群结构和血清代谢物谱发挥抗炎作用,且弧菌、巨型球菌和漫游球菌可能是万通筋骨片的抗炎靶点菌群;微管素B可能是万通筋骨片的抗炎靶点代谢物。
陈凯[7]（2021）在《miR-876调控POSTN促进肝癌进展和纤维化的机制研究》文中提出一、研究背景肝细胞性肝癌（HCC）是世界范围内最常见恶性肿瘤之一,目前在最致命肿瘤中致死率排名第二。在过去的几十年,针对肝癌已经有了众多治疗手段,如精准的肝段切除术,肝移植术,肝动脉栓塞化疗及肝癌射频消融术等,但是肝癌患者的预后仍然不令人满意,据统计,肝癌患者5年总生存率低于20%。肝癌起病隐匿,肿瘤进展快,容易复发和肝内转移都是导致肝癌预后较差的可能原因。因此,探究肝癌进展,转移的分子学机制有利于寻找潜在的肝癌治疗分子靶点,开发可能的早期肝癌诊断标志物对肝癌的系统治疗非常重要。微小RNA（miRNA）是以由一类进化保守的,由约22个核苷酸组成的非编码小RNA,微小RNA可结合在靶基因信使RNA（m RNA）的3?端的非翻译区（UTR区）通过降解信使RNA或抑制信使RNA翻译的方式发挥转录后调控作用。研究显示微小RNA几乎参与了肿瘤细胞发生发展的全部过程,包括细胞的干性,肿瘤发生,细胞的增殖,细胞的凋亡,细胞的迁移和侵袭,细胞的转移等等。也有越来越多的研究显示各种肿瘤中均有不同微小RNA的异常表达,包括肝癌。例如,miR-876被发现在胆管癌（CCA）中表达降低,并能通过抑制BCL-XL的表达诱导细胞的增殖;miR-589被发现在肝细胞性肝癌中表达增高并能通过STAT3信号通路来促进细胞的干性和化疗抵抗。然而,在肝细胞性肝癌中异常表达和对诊断或者预后有指示作用的miRNA仍然缺乏有待进一步研究。骨膜蛋白（POSTN）,也称为成骨细胞特异性因子2,是一大小为93.3k Da的细胞外基质（ECM）蛋白。POSTN能通过和众多其他蛋白如纤维结合蛋白,胶原蛋白及腱生蛋白等互相联系进而对细胞外基质进行改造。POSTN对胶原纤维的发生,细胞粘附,细胞迁移和上皮间质转换等都有重要作用。目前研究发现多种肿瘤中亦有POSTN的异常表达,包括头颈部肿瘤,肺癌,神经纤维瘤,乳腺癌,结直肠肿瘤及肝细胞性肝癌等,对肿瘤细胞的生存,上皮间质转换,血管生成和肿瘤微环境的形成都有重要作用。例如:研究发现胰腺癌细胞能刺激间质细胞分泌POSTN,进而促进肿瘤基质成绩和上皮间质转化进而促进肿瘤进展。然后,在肝细胞性肝癌中POSTN的表达及调控机制的研究尚少,有待进一步研究。在本文中,我们通过对TCGA数据库中异常表达的miRNA进行筛选,鉴定出了一异常表达的miRNA,即miR-876。我们还进一步探求了其细胞功能和对下游靶基因的调节机制。我们还在众多临床肝细胞性肝癌的临床组织标本中监测了miR-876和其靶基因POSTN的表达,分析了他们的表达和肝细胞性肝癌患者的临床病理参数和预后的关系。我们的研究提示miR-876及POSTN在肝细胞性肝癌中异常表达,可能作为一潜在的诊断性分子标志物和治疗靶点。二、研究方法1.分析49对肝癌及对应的癌旁样本的TCGA数据库,分析异常表达的miRNA,筛选出表达差异倍数最高的前20个微小RNA。2.收集了从2006年到2010年在西南医院肝胆科因患原发性肝细胞性肝癌而行原发性肝癌切除术的共计127例患者的组织样本,本研究说包含的所有病人术前均未接收放疗或者化疗。所有患者术后均定期性影像学（即超声或CT）即血液AFP检测。本研究团队及西南医院临床研究中心完成患者的预后随访,随访为结合到我院复查情况,定期（每2-3月）电话随访。3.采用实时定量PCR的方法检测了肝癌组织样本中miR-876和POSTN的表达水平;采用免疫组化（IHC）方法在原发性肝细胞性肝癌组织样本中检测了样本中POSTN及EMT标志物（E钙粘蛋白,N钙粘蛋白,波形蛋白）的表达情况,并在肝癌合并肝硬化样本中检测了POSTN的表达。4.采用Kaplan-Meier曲线分析（单因素）和Cox回归（多因素）方法分析了影响HCC患者预后的危险因素及独立危险因素,并进一步分析了miR-876和POSTN共表达对HCC预后的影响。5.采用了生物信息学及双荧光素酶报告基因实验研究了miR-876可能的调控靶基因,并进一步采用实时定量PCR及Western Blotting（WB）方法进行验证。6.Mi R-876的具体体内生物学行为在裸鼠实验中进行检测,最终成瘤效果以活体成像方式进行检测验证。7.采用WB方法分析了miR-876的表达对EMT标志物的影响,并在人肝星状细胞系LX-2中检测了纤维化蛋白α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）,胶原蛋白-I的表达。采用transwell小室侵袭实验研究了miR-876对肝癌细胞系的侵袭能力的影响。三、研究结果1.通过对49对肝癌患者的TCGA数据库进行分析,我们筛选出了表达差异倍数排名前20的高表达及低表达miRNA,进一步筛选鉴定出miR-876。2.我们发现miR-876在肝癌细胞系及肝癌组织中低表达。首先,我们发现miR-876在人正常肝细胞系L02中表达高,而在肝癌细胞系SMMC-7721,Hep G2,Huh-7及HCC-LM3中表达较低;接下来我们在50对肝癌及癌旁样本中检测了miR-876的表达,发现miR-876在肝癌组织/癌旁组织的比率62%有降低,16%变化不明显,而仅有22%表达升高。3.miR-876的低表达和肝硬化、癌栓及肝癌TNM分期相关。我们在127例HCC组织样本中检测了miR-876的表达,分析了其表达水平和HCC患者临床病理参数的相关性。发现miR-876的表达和肝硬化（P=0.026）、肝癌癌栓形成（P=0.031）及TNM分期（P=0.021）相关。而和其他病理参数,如患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤数量、乙肝、AFP水平、肝Child分级未发现显着相关性。我们还进一步在肝硬化及癌栓患者中检测了miR-876的表达水平,发现miR-876在肝硬化组织样本中表达较非肝硬化患者显着低（P=0.0294）,而其在有肝癌癌栓患者中表达亦显着低（P=0.0367）。4.miR-876抑制细胞侵袭、EMT及细胞纤维化。我们通过构建了miR-876过表达及干扰细胞株,通过transwell细胞侵袭实验发现过表达miR-876的肝癌细胞侵袭力减弱,而干扰miR-876后侵袭力增强,进一步通过WB实验发现过表达miR-876后N-钙粘蛋白及波形蛋白表达减弱,而干扰miR-876后E-钙粘蛋白表达亦减弱。在人星状细胞系LX-2中干扰miR-876表达后发现α-SMA及胶原蛋白-I表达减弱。5.miR-876靶向POSTN,并抑制其表达。我们通过生物信息学分析发现POSTN的3?UTR存在2个能与miR-876种子区结合的序列,进一步双荧光素酶报告基因实验发现野生型p GL3 POSTN荧光素酶质粒和miR-876共转染入293细胞后其萤火虫荧光信号/海肾荧光素酶荧光信号比值显着性降低,进一步WB实验证实当干扰miR-876后HCC细胞POSTN表达升高,而过表达组POSTN显着降低。我们进一步在127例肝癌临床组织标本中同时检测了miR-876和POSTN的表达,发现两者表达呈显着负相关,R值为-0.477,相关线性方程为y=-0.486x+0.394。6.miR-876通过POSTN抑制EMT及细胞纤维化。首先,我们发现过表达POSTN的肝癌细胞侵袭力增强,并促进了EMT标志物及纤维化标志物的表达。其次,我们在过表达POSTN的基础上转染了miR-876,发现共转染miR-876后抵消了侵袭力增加及EMT及纤维化标志物蛋白的表达。7.miR-876在体内动物实验下减弱HCC细胞肿瘤成瘤能力及抑制肿瘤进展。HCC细胞其miR-876过表达的HCC细胞被注入裸鼠肝包膜下,进行动物实验,1月后行活体成像检测,我们发现对照组（无干预的HCC细胞）成瘤数量多,活体成像荧光强度强,而实验组行miR-876过表达后,裸鼠原位肝脏成瘤明显减少,活体检测荧光信号弱,表明在体内实验条件下,miR-876能抑制HCC的成瘤及肿瘤进展。8.POSTN和肝组织EMT及肝硬化相关。我们进一步在127例肝癌组织中检测了POSTN的表达,发现同miR-876类似,POSTN表达和肿瘤数量、肝硬化、肝癌癌栓形成及TNM分期相关,而和其他临床标识物未发现明显相关性,进一步非参数检验验证了肝硬化或肿瘤癌栓组HCC患者的POSTN表达明显增高。IHC实验发现POSTN主要表达与肝癌间质,部分肝癌细胞亦有表达,POSTN高表达的样本N钙粘蛋白及波形蛋白表达增高,而E钙粘蛋白表达降低。而在肝癌伴肝硬化标本中发现POSTN亦有强表达。9.miR-876和POSTN和肝癌患者术后预后相关。进一步KM单因素生存分析发现肿瘤大小（P=0.037）、肝硬化（P=0.041）、肝癌癌栓状态（P=<0.01）、TNM分期（P=0.001）、miR-876低表达（P=0.022）及POSTN高表达（P=0.012）均是影响HCC患者预后的危险因素,多因素回归分析发现肝癌癌栓（风险比=2.530,95%CI区间=1.433-4.468,P=0.001）及POSTN的表达（风险比=1.717,95%CI区间=1.008-2.926,P=0.047）是影响肝癌预后的独立危险因素。进一步共表达分析提示miR-876低表达和POSTN高表达的HCC患者预后较之于miR-876低表达和POSTN高表达更差。四、研究结论综上所述,我们从公开的TCGA数据库中鉴定出了肝癌中一显着性低表达的miRNA,即miR-876。并探索了其对细胞的功能,即能抑制细胞侵袭,EMT和纤维化。而miR-876这些功能是通过调控POSTN的表达实现的。miR-876在体内动物实验下能抑制肝癌的成瘤及进展;我们还在众多肝癌临床标本中从m RNA及蛋白水平证明了miR-876和POSTN的异常表达和肝癌的EMT水平,纤维化水平及进展相关,而miR-876和POSTN的异常表达和HCC的预后相关,而联合miR-876和POSTN检测可能更好预测HCC的预后以及作为潜在的治疗靶点。
程敏君[8]（2021）在《海参酶解物促SD大鼠皮肤创面愈合的研究》文中研究指明海参是一种富含蛋白质的优质海产品,具有极高的营养和药用价值,已证实其在抗氧化、抗疲劳、抗凝血等方面起有效调节作用。但是针对海参富含营养且胶原含量高的这个特性,相关的应用于医疗、保健或功能食品中的功效研究较少。皮肤创伤是最常见的机体损伤之一,愈合过程中需要营养补给供能,同时胶原也是皮肤组成中必不可少的。因此,本课题在海参富含营养和胶原的基础上,验证海参酶解物（Sea cucumber hydrolysate,SCH）在促创面愈合方向的潜在功效,同时对其促创面愈合通路和吸收机理进行探究,以期为海参资源的高值化利用提供新的方向,为企业对海参资源的深度开发提供医学营养方向的理论基础和实验参考。本文首先对海参的营养组成进行测定,接着通过酶解技术获取SCH作为动物实验原料,然后进行三次动物实验考察SCH促创面愈合的功效。酶解结果显示:酶配比为水产蛋白酶﹕风味蛋白酶=6﹕4、酶添加总量10000 U/（g prot）时酶解效率较好,酶解1h的产物的分子质量<500 Da占70.73%。第一批次动物实验借助大鼠皮层切除创伤模型确认了SCH具备促创面愈合的效果,考察的动物实验组包括:模型Vehicle组、高剂量H-SCH组、中剂量M-SCH组、低剂量L-SCH组和阳性YNBY组。大鼠伤口愈合率的结果显示:SCH不影响大鼠的正常生长,且促进大鼠创面愈合;其中M-SCH组（灌胃蛋白浓度0.50 g/kg）在造模后第8天就显示愈合率显着高于Vehicle组（P<0.05）,愈合率为88.15%。苏木精伊红（Hematoxylin-eosin,H&E）和马森三色（Masson’s trichrome method,Masson）染色、炎症指标、Hyp及生长因子含量结果皆表明,SCH可以减少炎性细胞浸润现象,同时促进创面处血管新生、成纤维细胞增殖、胶原沉积和再上皮化,其调节过程可能与Hyp、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor,b FGF）和表皮细胞生长因子（Epidermal growth factor,EGF）的显着上调有关（P<0.05）。此外,M-SCH组在愈合后期表现出最优的形态特征,新生胶原排列有序紧密,瘢痕表皮最薄。确定了SCH具备促创面愈合的功效后,进一步地对酶解时间进行调整,获取高、中、低3组分子量的SCH并分析其组成差异。第二批次动物实验借助大鼠皮层切除创伤模型探究SCH的分子量对其促创面愈合功效的影响,同时测定创伤大鼠机体炎症和氧化应激,结合相关通路因子表达结果共同阐明SCH促创面愈合的作用通路。考察的动物实验组包括:空白Blank组、模型Vehicle组、高分子量H-Mw组、中分子量M-Mw组、低分子量L-Mw组和阳性YNBY组。高、中、低分子量SCH的氨基酸和矿物质组成揭示它们的主要差异在于Pro、Hyp和分子质量<500 Da的肽的含量上。大鼠创面愈合率的结果再次证实了SCH能促进创面愈合。H&E和Masson染色及Hyp结果表明,L-Mw组的促愈合效果最好,与YNBY组不存在明显差异（P>0.05）。此外,L-Mw组能显着降低白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）、白细胞介素-8（Interleukin-8,IL-8）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）和丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量（P<0.05）,提高白细胞介素-10（Interleukin-10,IL-10）、过氧化氢酶（Catalase,CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase,GSH-Px）和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）含量（P<0.05）,同时促进VEGF、EGF、b FGF分泌（P<0.05）,刺激转化生长因子-β（Transforming growth factor-β,TGF-β）、转化生长因子-β受体Ⅱ（Transforming growth factor receptor typeⅡ,TβRⅡ）、Smad家族3号蛋白（SMAD family member 3,Smad3）的m RNA表达（P<0.05）,激活TGF-β/Smad通路,由此共同作用来改善机体的炎症和氧化应激水平、促进胶原合成,加快伤口愈合。第三批次动物实验旨在探究高、低分子量SCH在动物体内吸收的差异。实验设定了6个时间点采集大鼠血浆、胃、肠道和皮肤组织,观察胃肠内容物的变化情况,测定血液和皮肤里游离态/结合态的Pro、Hyp和5个Hyp结合小肽的含量,以及肠道内寡肽转运蛋白（Oligopeptide transporter 1,Pep T1）m RNA表达情况,综合分析SCH分子量对其体内吸收的影响,进而解释SCH促创面愈合的体内吸收机理。结果显示:低分子量SCH的胃排空速率和肠吸收速率较快;低分子量SCH中含有较多的结合态Hyp和Pro;低分子量SCH中Ala-Hyp-Gly、Pro-Hyp、Gly-Pro-Hyp、Hyp-Gly和Ile-Hyp的吸收速率较快,且含量均高于高分子量SCH;低分子量SCH能更快诱导十二指肠内Pep T1表达,同时刺激空肠中Pep T1在2 h内持续表达。综上,对比高、中、低分子量SCH促多雷（Sprague Dawley,SD）大鼠创面愈合效果,得出L-Mw-S的作用效果最优。其中L-Mw-S的制备条件为:底物浓度20%,酶添加量10000 U/（g prot）,酶配比为水产蛋白酶﹕风味蛋白酶=6﹕4,酶解温度55℃,p H为7.0,酶解时间5 h。结合动物实验结果,可知SCH促大鼠创面愈合的吸收机理与SCH中的活性Hyp结合小肽被肠道完全吸收有关。这些小肽经小肠上皮的Pep T1途径被完整吸收,进而抑制机体炎症反应和氧化应激、促进生长因子分泌,同时激活TGF-β/Smad通路,诱导前胶原合成,从而加速伤口愈合。
张波[9]（2021）在《神经肽Y在骨折愈合中的作用及成骨机制研究》文中研究表明研究背景随着全球老龄化进程的加快,骨质疏松带来的骨折及社会、家庭负担逐渐加重。此外,严重的创伤性骨折、肿瘤切除、先天性疾病会导致巨大的节段性骨缺损,给临床工作带来很多困难。生长因子（growth factors）、多肽（peptides）及小分子（small molecules）联合人造骨移植材料（Synthetic bone graft substitutes）可以明显诱导成骨细胞的转移、分化和成熟。研究表明超过2cm的骨折后缺损就需要生物活性因子的介入,否则将难以愈合。因此,生长因子、多肽及小分子正成为国内外研究骨折缺损修复的热点。神经肽Y（neuropeptide Y,NPY）是位于大脑和周围神经系统的重要神经递质。NPY具有促进骨折愈合、改善膝关节骨性关节炎、治疗骨质疏松脆性骨折的多重作用,是一种重要的骨骼神经营养因子。NPY在周围组织骨细胞、成骨细胞、破骨细胞中可通过直接和间接激活多个通路来促进骨合成及代谢。NPY可能会参与增强成骨细胞介导的骨合成、抑制破骨细胞介导的骨吸收,是骨折愈合的关键因子。此外,NPY对关节软骨修复、维护骨代谢均衡也具有关键的作用。研究表明,关节滑膜、关节软骨、半月板和软骨下骨等关节组织都含有丰富的神经肽。NPY是重要的交感神经肽,其对髋、膝等关节的神经滋养作用正受到越来越多的关注,并被认为是改善骨性关节炎（osteoarthritis,OA）的潜在治疗靶点。同时,NPY是治疗绝经后骨质疏松症（Postmenopausal osteoporosis,PMO）的重要神经营养因子。在人体及啮齿类动物模型中,NPY通过NPY Y1受体（NPY receptor Y1,NPY1R）和 NPYY2 受体（NPY receptor Y2,NPY2R）调节体内骨量平衡。NPY沉默的小鼠在面对冷刺激时表现为体内皮质酮水平升高,骨量丢失,其骨丢失速度是野生型小鼠的3倍;其分子生物学机制是沉默NPY的小鼠体内中枢和外周组织缺乏NPY,不能通过其相应的NPY2R受体抑制皮质酮的产生,继而对抗应激反应造成的骨量丢失。换言之,NPY具有在应激状态下促进体内骨合成的作用。然而,NPY通过什么信号通路调控骨折后骨代谢及骨形成,仍有待于进一步研究。综上所述,探究NPY与机体成骨的相应分子生物学机制,对改善骨折后巨大骨缺损的预后具有重要意义及研究价值。本研究体内实验中,通过建立C57BL/6小鼠胫骨骨折模型,探究了 NPY及成骨相关基因在骨折初期的细胞分布及表达情况,揭示出NPY可参与骨折早期炎症反应,可能起到骨诱导的作用;在体外实验中,我们合成了 NPY小干扰RNA（siRNA）及NPY过表达质粒,并将其转染入小鼠前成骨MC3T3-E1细胞,进一步检测了 MC3T3-E1细胞成骨相关基因和蛋白的表达情况,揭示了 NPY基因通过上调Runx2、Osterix基因表达促进细胞成骨的分子生物学机制。第一部分神经肽Y在小鼠骨折愈合中的作用及相关机制研究研究目的:1.检测小鼠胫骨闭合骨折愈合过程中NPY在小鼠血清中的表达情况。2.检测小鼠骨折组织愈合过程中成骨相关因子NPY,NPY1R,Runx2,Osterix mRNA及蛋白表达情况。3.分析NPY在小鼠骨折愈合中的生物学效应。研究方法:1.建立C57BL/6小鼠的闭合胫骨骨折模型以18只SPF级C57BL/6雄性小鼠为实验对象,在异氟醚诱导麻醉下人工掰断一侧胫骨建立小鼠胫骨闭合骨折模型,密切监测小鼠饮食及饮水情况。2.动态观察小鼠骨折过程中骨痂形成、重塑分别于建模后第0、1、7、14天,随机取3只小鼠,进行IVIS（?）SpectrumCT检测,观察骨折部位骨痂形成情况。3.检测小鼠骨折愈合过程中血清NPY的表达情况分别于建模后第1、7、14天,随机取出3只小鼠,取血后,采用酶联免疫吸附测定法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检验 C57BL/6 小鼠血清中NPY的表达水平。4.检测小鼠骨折愈合过程中成骨相关基因及蛋白的表达分别于建模后第1、7、14天,随机取出3只小鼠处死,并取骨折处组织提取RNA,应用RT-PCR技术检测组织样本中NPY,NPY1R,Runx2,Osterix mRNA的表达。取上述小鼠骨折处组织,切片石蜡包埋,行苏木精/伊红染色（hematoxylin-eosin staining,HE）或固定在 70%乙醇中分别行 NPY,NPY1R,Runx2,Osterix 的免疫组织化学染色（Immunohistochemical staining,IHC）。利用AI图像分析系统（Alpathwell）自动读取石蜡切片免疫染色区域图像,分析测定阳性染色的灰度值。研究结果:1.成功建立了 C57BL/6小鼠胫骨闭合骨折模型通过大体观察小鼠生活状态,术后第1天,小鼠运动较少,可能小鼠患处有轻微疼痛,但不影响进食和饮水。术后第2天,小鼠可逐渐活动。术后2周,小鼠患肢即可负重行走,有时可见双侧肢体同时站立的情况。提示患肢术后2周有足够强度及硬度支撑体重。2.宏观及微观角度观察动物模型中骨折愈合良好从宏观角度,我们应用IVIS（?）SpectrumCT三维成像系统动态观测小鼠骨折愈合情况。CT显示术后14天骨折线模糊不清,骨折端骨性骨痂形成,提示建模成功。从微观角度我们应用HE染色,观察建模第14天骨折处出现初级骨化中心,并可见新生骨小梁结构,骨性骨痂形成提示建模成功。3.动物模型中血清NPY表达情况应用ELISA法检测了小鼠骨折后14天细胞外血清中NPY的表达情况。NPY不同时间点（建模后第1、7、14天）浓度范围为925.35pg/ml-1055.2pg/ml。NPY浓度在检测的14天的时间段内有一过性下降后逐渐增高趋势,但整体差异无明显统计学意义（P=0.152）。4.小鼠骨折愈合过程中成骨相关基因及蛋白表达情况应用RT-PCR法检测了小鼠骨折愈合过程中成骨相关基因mRNA表达情况,结果显示:NPY mRNA在骨折早期纤维性骨痂组织中高表达,在软骨痂中中等表达,在骨痂中低表达。建模后第7、14天NPY mRNA的表达量分别是第1天的27%和9%,差异具有统计学意义（P<0.001）。NPY1R mRNA表达总体差异性不显着（P=0.133）。建模后第7、14天NPY1R mRNA的表达量分别是第1天NPY1R mRNA的1.6倍和3.8倍。建模后第7、14天Runx2 mRNA的表达量分别是第1天Runx2 mRNA的7.9倍和65.6倍。建模后第7、14天OsterixmRNA的表达量分别是第1天Osterix mRNA的124.0倍和775.1倍。应用蛋白免疫组化染色和AI图像分析系统做了小鼠骨折愈合过程中成骨相关蛋白分析,结果表明:NPY蛋白在骨折早期纤维性骨痂组织中高表达,建模后第7、14天NPY蛋白表达量分别是第1天NPY蛋白的37%和55%,差异有统计学意义（P<0.05）。NPY1R蛋白在小鼠骨折早期组织中高表达。建模后第7、14天NPY1R蛋白表达量分别是第1天NPY1R蛋白的8.2%和21%,差异有统计学意义（P<0.001）。建模后第7、14天Runx2蛋白表达量分别是第1天Runx2蛋白的15%和19%,差异具有统计学意义（P<0.001）。建模后第7、14天的Osterix蛋白表达量分别是第1天Osterix蛋白的12%和10%,差异有统计学意义（P<0.001）。研究结论:1.NPY基因及蛋白共同参与骨折早期炎症反应,可能起到骨诱导的作用。2.骨折愈合相应成骨因子NPY、NPY1R、Runx2和Osterix的表达存在时间及空间特异性。第二部分神经肽Y在小鼠前成骨细胞MC3T3-E1中的表达和生物学功能研究目的:1.检测过表达或干扰NPY后在MC3T3-E1细胞中NPY mRNA和蛋白的表达情况。2.观测NPY对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。研究方法:1.构建3种NPY siRNA序列构建针对 NPY 基因的 siRNA1、siRNA2、siRNA3 序列。应用 RFect siRNA转染试剂法转染后,应用反转录定量（RT-qPCR法）检测转染3种siRNA 48小时后细胞NPY mRNA的表达情况,筛选出干扰效率最高的NPY siRNA序列。2.构建NPY过表达质粒并测序验证构建NPY过表达质粒,测序验证后应用RFect DNA转染试剂将NPY过表达质粒及对照质粒载体转染入MC3T3-E1细胞,验证NPY细胞内表达情况。3.检测不同干预组MC3T3-E1细胞中NPY mRNA的表达情况将NPY siRNA、scrambled siRNA、NPY过表达质粒、空白质粒分别转染入MC3T3-E1细胞中,应用RT-qPCR法于第4、7天检测NPY mRNA的表达情况。4.检测过表达或干扰NPY后MC3T3-E1细胞中NPY蛋白的表达情况按照分组分别于MC3T3-E1细胞中加入对应的干扰或过表达质粒,应用半定量蛋白检测（Western blot）法于第4、7天检测各组中NPY的蛋白表达情况。5.观察过表达或干扰NPY后MC3T3-E1细胞成骨变化复苏MC3T3-E1细胞,加入成骨诱导培养液培养,按照分组分别加入对应的干扰或过表达质粒,14天后,分别行茜素红、碱性磷酸酶（ALP）、β-catenin免疫荧光染色后镜下观察细胞成骨情况。研究结果:1.成功筛选出干扰效率最佳的NPY siRNA成功制备三种包含目的基因NPY的siRNA1、siRNA2、siRNA3,验证NPY siRNA3在胞内干扰效率最高,为75%。因此,选用siRNA3做后续实验。2.成功制备NPY过表达质粒NPY过表达质粒构建成功后,测序验证符合NPY序列。3.过表达及干扰NPY后检测细胞NPY基因表达的影响过表达NPY可显着促进细胞NPY mRNA的表达,第4天增加了 3.9倍,第7天增加了 4.3倍（P<0.001）。应用siRNA干扰NPY后,可显着减低NPY mRNA的表达,在第4天下降了 75%（P<0.05）,第7天下降了 55%。4.过表达及干扰NPY后检测细胞NPY蛋白表达的影响过表达NPY可显着促进细胞NPY蛋白的表达,第4、7天,NPY蛋白分别增加了 1.2倍和1.5倍（P<0.05）。应用siRNA干扰NPY后,可显着降低细胞NPY蛋白的表达,第4、7天,NPY蛋白分别降低了 45%和35%（P<0.05）。5.过表达及干扰NPY后检测细胞成骨分化的影响茜素红染色显示过表达NPY后MC3T3-E1细胞数目增多,体积较大,核染色较深,胞内粒子增多,可见较多的紫红色钙结节;应用siRNA干扰NPY后,细胞数目较少,核染色较浅,可见较少的紫红色钙结节。ALP染色显示过表达NPY后细胞数目增多,体积较大,核染色较深,胞内黄色钙盐沉积较多,可见较多蓝色颗粒或块状沉淀。应用siRNA干扰NPY后,细胞数目较少,核染色较浅,蓝色颗粒较少。β-catenin免疫荧光细胞染色显示过表达NPY后细胞核数目增多,细胞质内绿色荧光较多,应用siRNA干扰NPY后,细胞核数目较少,胞质内绿色荧光较少。研究结论:1.干扰NPY可抑制MC3T3-E1细胞成骨分化。2.过表达NPY可促进MC3T3-E1细胞成骨分化。第三部分神经肽Y上调Runx2、Osterix表达促进小鼠前成骨细胞MC3T3-E1成骨的机制研究研究目的:揭示NPY上调MC3T3-E1细胞成骨特异性转录因子Runx2、Osterix表达,促进MC3T3-E1细胞成骨分化的机制。研究方法:1.过表达及干扰NPY后检测MC3T3-E1细胞中Runx2、Osterix、ALP、OCN mRNA的表达情况将NPY siRNA和NPY过表达质粒分别转染入MC3T3-E1细胞中,应用RT-qPCR 法于第 4、7 天观察 Runx2、Osterix、ALP、OCN mRNA 的表达情况。2.过表达及干扰NPY后检测MC3T3-E1细胞中Runx2、Osterix、ALP、OCN蛋白的表达情况将NPY siRNA和NPY过表达质粒分别转染入MC3T3-E1细胞中应用Western blot法于第4、7天检测各组中Runx2、Osterix、ALP、OCN的表达情况。研究结果:1.NPY上调MC3T3-E1细胞Runx2、Osterix基因的表达1.1过表达或干扰NPY后检测细胞Runx2和Osterix基因表达的影响过表达NPY可明显上调MC3T3-E1细胞Runx2和Osterix基因的表达,Runx2 mRNA较对照组在第4、7天分别增加了 5.4倍和6倍。Osterix mRNA在第4、7天分别增加了 2.7倍和3倍。应用siRNA干扰NPY后,Runx2 mRNA在第4、7天分别下降了 50%和35%。Osterix mRNA在第4、7天分别下降了 80%（P<0.001）和 55%。1.2过表达或干扰NPY后检测细胞Runx2和Osterix蛋白表达的影响过表达NPY可显着上调MC3T3-E1细胞Runx2和Osterix蛋白的表达,Runx2蛋白较对照组第4、7天分别增长了 1.6和1.2倍;Osterix蛋白表达第4、7天分别增长了 1.6和2.1倍（P<0.05）。应用siRNA干扰NPY后,Runx2蛋白表达第4、7天分别下降了 40%和55%;Osterix蛋白表达第4、7天分别下降了 60%和55%（P<0.05）。2.NPY促进MC3T3-E1细胞成骨分化2.1 过表达或干扰NPY后检测细胞ALP和OCN基因表达的影响过表达NPY显着上调MC3T3-E1细胞ALP和OCN基因的表达,ALP mRNA较对照组第4、7天分别增加了 3.7倍和4.9倍,OCN mRNA在第4天和第7天分别增加了 4.0倍和4.3倍（P<0.001）。应用siRNA干扰NPY后,ALP mRNA在第4、7天分别降低了 56%（P<0.05）和26%,OCN mRNA第4天和第7天分别降低了 60%（P<0.05）和 35%。2.2过表达或干扰NPY后检测细胞ALP和OCN蛋白表达的影响过表达NPY明显上调MC3T3-E1细胞ALP和OCN蛋白的表达,ALP蛋白较对照组第4、7天均增加了 1.6倍;OCN蛋白第4、7天分别增加了 1.4和1.6倍（P<0.05）。应用siRNA干扰NPY后,ALP蛋白第4天和第7天分别减少了 60%和60%;OCN蛋白第4、7天分别减少了 64%和78%（P<0.05）。研究结论:1.NPY通过上调Runx2、Osterix基因的表达促进MC3T3-E1细胞成骨。2.NPY有望成为创伤后促进骨折愈合的靶点。课题的创新性和局限性课题的创新性:（1）本课题系统阐述了小鼠骨折愈合早、中期不同细胞NPY、NPY1R、Runx2和Osterix的mRNA及蛋白分布表达情况,并部分揭示了 NPY可参与骨折早期炎症反应,可能起到骨诱导的作用。（2）本课题成功筛选出干扰效率最高NPY siRNA并制备了 NPY过表达质粒,验证了 NPY在小鼠前成骨细胞MC3T3-E1中的表达和生物学功能,从而为深入研究NPY的分子生物学机制创造了条件。（3）本课题揭示了 NPY可上调Runx2和Osterix表达促进小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的生长、分化,阐明了 NPY调控前成骨细胞成骨分化的潜在生物学机制。课题的局限性:（1）体外细胞学实验研究了单一成骨细胞系,后续可增加人体原代培养成骨细胞系,来进一步阐述NPY的生物学效应。（2）本研究仅建立了创伤性骨折模型,而未建立骨质疏松脆性骨折模型,今后可行进一步的研究来阐述NPY在不同类型骨折中的作用及相关机制。
蒋云霞[10]（2021）在《荔枝核总黄酮对HSC-T6的作用和差异蛋白质组学的研究》文中提出目的:以大鼠肝星状细胞T6细胞株（HSC-T6）为受试对象,探讨并完善荔枝核总黄酮（total flavonoids from Litchi Seed,TFL）拮抗肝纤维化的作用靶点与作用机制。方法:常规培养HSC-T6,分别观察TFL在不同时间和不同浓度对HSC生长增殖率的影响,从中选择最佳的TFL药物浓度进行后续实验;将HSC-T6分为细胞对照组和TFL实验组,细胞对照组的HSC-T6常规培养,TFL实验组采用上述最佳的TFL药物浓度干预HSC-T6,分别使用透射电子显微镜和ELISA方法检测各组HSC-T6的超微结构和基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、Ⅰ型胶原（ColⅠ）、Ⅲ型胶原（ColⅢ）含量的变化。制备肝纤维化模型大鼠,在大鼠腹部皮下注射40%四氯化碳橄榄油混悬液0.3 ml/100 g,2次/周,共8周。造模完成后,行肝组织病理染色检测,证实造模成功。将肝纤维化造模完成的大鼠分为模型对照组和TFL实验组,模型对照组大鼠在肝纤维化造模完成后常规饲养,TFL实验组大鼠予灌胃TFL 100 mg/（kg·d）,4周后收集模型对照组和TFL实验组的大鼠血清。检测各组血清对HSC-T6的最大无毒浓度,以最大无毒浓度为最佳诱导剂量孵育HSC-T6,诱导分化14天后提取全蛋白,通过DDA/DIA技术筛选出模型对照组和TFL实验组血清干预后的差异表达蛋白,并对差异蛋白进行GO、KOG、PPI、PATHWAY和亚细胞定位等生物信息学分析。结果:1.透射电镜结果显示TFL干预后HSC-T6的超微结构发生变化,细胞间隙变大,胞膜四周纤毛脱落,多角伪足减少,膜表面不平整,细胞浆内线粒体明显变形,线粒体嵴断裂或消失,粗面内质网扁池扩张,核糖体脱落,核内染色质浓缩或边聚,核膜皱缩,可见凋亡小体形成。2.ELISA 结果显示,TFL 干预后 HSC-T6 的 MMP-2、Col Ⅰ、Col Ⅲ含量下降。3.生物信息学分析结果显示,模型对照组和TFL实验组的差异蛋白共177个,其中上调蛋白84个,下调蛋白93个。GO分析显示,差异蛋白参与分子功能共10个条目,主要为分子结合和催化活性;细胞组分共18个条目,主要为细胞质和细胞器;生物过程共24个条目,主要为细胞过程、代谢过程、生物调节等。4.KOG注释分析显示,差异蛋白比对到KOG数据库共有23个子类和192条蛋白注释信息,其中细胞过程和信号传递是获得注释信息最多的分类,其次为信息存储与处理、新陈代谢作用和缺乏注释的蛋白等。5.PPI分析结果显示,存在互作关系的上调蛋白28个:SELENOH、C1QC、C1QB、APOE、ANGPTL4、NF1、GPX3、CLU、DMAP1、VTN、MYH14、SELENOM、HRG、PF4、HMOX1、IGH1A、IGG2A、IGHG、PGK2、PLIN2、KDM4C、ITIH4、BAZ2A、C9、ADH7、MGST1、GSTA1、ATP9B等。存在互作关系的下调蛋白42个:RAD51、HELZ2、PBK/TOPK、HMGCS1、UBE2T、UBE2C、DLGAP5、LOC100911660、PTEN、BLM、CYP51A1、MDC1、LRRK1、MVD、NSDHL、IDI1、SPC24、CDCA8、KNSTRN、CCNB2、FAM83D、HMGXB4、STARD4、HLTF、LIPG、UHRF1、KAT8、PCSK9、UBE2S、AMMECR1L、WDR76、ZNRD2、DDX10、MAP3K3、PIMREG、SMAD1、MCL1、MPRIP、FIGNL1、RPAP1、STMN1、SPP1 等。6.PATHWAY富集分析结果显示,KEGG代谢通路分为6个分支,共注释38项条目,分支包括细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、人类疾病、代谢和有机系统等,其中差异蛋白占比前三的分支为人类疾病、新陈代谢和有机系统。代谢通路主要包括原发性免疫缺陷、金黄色葡萄球菌感染、补体和凝血级联、系统性红斑狼疮、哮喘产生IgA的肠道免疫网络、免疫系统、萜类骨架的生物合成、自身免疫性甲状腺疾病、同种异体移植排斥、范可尼贫血途径、造血细胞谱系、非洲锥虫病、胆固醇代谢、类风湿关节炎、矿物质吸收、细胞色素P450对异生物的代谢、病毒性心肌炎、利什曼病、阿米巴病、癌症中的转录失调、扩张型心肌病、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、FcεRI信号通路、B细胞受体信号通路、磷脂酶D信号通路、NF-κB信号通路、酮体的合成与降解、PI3K-Akt信号通路、肝细胞癌、药物代谢-细胞色素P450等。7.亚细胞定位结果发现这些差异蛋白主要位于细胞核、细胞质或细胞外,其余则较平均散布于胞质内膜、线粒体、过氧化物酶体、内质网、胞质网丝以及细胞骨架上。结论:1.荔枝核总黄酮（TFL）可下调HSC-T6的MMP-2、ColⅠ和ColⅢ的表达水平,对HSC-T6的生长增殖具有抑制作用。2.本实验基于DDA/DIA模式并通过GO、KOG、PPI、PATHWAY以及亚细胞定位等生物信息学技术分析后发现C1QC、C1QB、C9、SELENOH、SELENOM、GPX3、APOE、CLU、ANGPTL4、NF1、HRG、PF4、ITIH4、ADH7、RAD51、BLM、FIGNL1、MDC1、SPC24、KNSTRN、CDCA8、HELZ2、HMGCS1、MVD、IDI1、CYP51A1、NSDHL、LIPG、PBK/TOPK、FAM83D、DLGAP5、UBE2T、UBE2C、UBE2S、UHRF1、MAP3K3、LRRK1、SMAD、、MCL、等差异蛋白与肝纤维化疾病具有密切相关性;PI3K/Akt通路、NF-κB信号通路、胆固醇代谢、补体和凝血级联、细胞色素P450可能是TFL抑制HSC-T6生长增殖并诱导HSC-T6死亡的主要信号转导途径。3.TFL可能通过调控多个蛋白和参与多种信号传导通路抑制ECM的形成和诱导HSC-T6死亡,发挥拮抗肝纤维化的生物学效应。
二、成纤维细胞生长因子-10对3种与修复有关内源性生长因子表达的调控作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、成纤维细胞生长因子-10对3种与修复有关内源性生长因子表达的调控作用（论文提纲范文）
（1）浓缩生长因子与表皮生长因子干预口腔黏膜等效细胞的增殖和衰老（论文提纲范文）
| 0引言Introduction |
| 1 材料和方法Materials and methods |
| 1.1 设计 |
| 1.2 时间及地点 |
| 1.3 材料 |
| 1.3.1 细胞 |
| 1.3.2 主要试剂 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 细胞分离培养及扩增 |
| 1.4.2 制备浓缩生长因子 |
| 1.4.3 MTT法筛选浓缩生长因子、表皮生长因子最佳作用浓度 |
| 1.4.4 浓缩生长因子联合表皮生长因子3种细胞增殖、迁移和凋亡的影响 |
| 1.5主要观察指标 |
| 1.6 统计学分析 |
| 2 结果Results |
| 2.1 人牙龈成纤维细胞、上皮细胞、正常人皮肤黑色素细胞形态学观察 |
| 2.2 人牙龈成纤维细胞鉴定结果 |
| 2.3 浓缩生长因子、表皮生长因子最佳作用浓度的筛选 |
| 2.3.1 浓缩生长因子最佳作用浓度的筛选 |
| 2.3.2 表皮生长因子最佳作用浓度的筛选 |
| 2.3.3浓缩生长因子+表皮生长因子最佳作用浓度的筛选 |
| 2.4浓缩生长因子联合表皮生长因子3种细胞增殖的影响 |
| 2.5 浓缩生长因子联合表皮生长因子对3种细胞迁移的影响 |
| 2.6 浓缩生长因子联合表皮生长因子对3种细胞凋亡的影响 |
| 3 讨论Discussion |
（3）bFGF对3-硝基丙酸诱导的小鼠胚胎氧化应激损伤的保护作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 早期胚胎氧化应激的研究进展 |
| 1.2 3-硝基丙酸 |
| 1.3 碱性成纤维细胞生长因子的概述 |
| 1.4 NRF2 抗氧化分子调控机制 |
| 1.5 本试验的研究目的及意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试剂及仪器 |
| 2.3 主要溶液配制 |
| 2.4 试验设计 |
| 2.5 试验方法 |
| 2.6 数据统计分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 确立3-硝基丙酸诱导的小鼠氧化应激模型的成立 |
| 3.2 bFGF最适浓度的筛选(bFGF对体外培养小鼠早期胚胎发育的影响) |
| 3.3 bFGF添加对3-NPA诱导小鼠胚胎早期发育的影响 |
| 3.5 线粒体膜电位的检测及量化分析 |
| 3.6 bFGF对3-硝基丙酸诱导小鼠早期胚胎内部谷胱甘肽相关基因的表达分析 |
| 3.7 bFGF对3-硝基丙酸诱导小鼠早期胚胎内部NRF2 及其相关基因的表达分析 |
| 3.8 bFGF对3-硝基丙酸诱导小鼠早期胚胎内部细胞全能性基因的表达分析 |
| 3.9 bFGF对3-硝基丙酸诱导小鼠早期胚胎内部凋亡相关基因的表达分析 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 bFGF提高3-硝基丙酸诱导的小鼠早期胚胎发育率 |
| 4.2 bFGF对3-硝基丙酸诱导的小鼠早期胚胎内部活性氧含量的影响 |
| 4.3 bFGF对3-硝基丙酸诱导的小鼠早期胚胎内部谷胱甘肽含量的影响 |
| 4.4 bFGF对3-硝基丙酸诱导的小鼠早期胚胎内部线粒体膜电位水平的影响 |
| 4.5 bFGF对3-硝基丙酸诱导的小鼠早期胚胎内部细胞全能性相关基因表达的影响 |
| 4.6 bFGF对3-硝基丙酸诱导的小鼠早期胚胎氧化还原基因表达的影响 |
| 4.7 bFGF对3-硝基丙酸诱导的小鼠早期胚胎凋亡相关基因表达的影响 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）基于“阳化气，阴成形”理论研究TGF-β1/Smads影响黄韧带肥厚的机制及模型的建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 黄韧带肥厚的机制及动物模型建立的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 TGF-β1/Smads信号通路与纤维化 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 基于“阳化气,阴成形”理论研究IL-1β、TNF-α和TGF-β1/Smads在LFH中的表达及相关性 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 标本收集 |
| 1.2 纳入与排除标准 |
| 1.3 影像学测量 |
| 1.4 主要器械、设备、试剂等 |
| 1.5 手术方式 |
| 1.6 标本的取材、运输等标准操作规程 |
| 1.7 HE染色与组织形态学观察 |
| 1.8 Masson染色与纤维化观察 |
| 1.9 免疫组化法检测两组黄初带IL-lp、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7)、Col1和Col3蛋白的定位、半定量表达 |
| 1.10 实时焚光聚合酶链式反应（Real-Time PCR)检测IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7)、Col1、Col3&mRNA表达 |
| 1.11 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 一般资料 |
| 2.2 HE染色结果 |
| 2.3 Masson染色结果 |
| 2.4 免疫组化结果 |
| 2.5 Real-Time PCR结果 |
| 2.6 DLSS组内黄韧带厚度和各层纤维化分级的相关性分析 |
| 2.7 DLSS组内黄韧带厚度和各层弹性-胶原纤维比的相关性分析 |
| 2.8 DLSS组内黄韧带厚度和各层mRNA表达的相关性分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 炎症与纤维化是黄韧带肥厚的主要病理机制 |
| 3.2 黄韧带背侧层是退变的起点 |
| 3.3 基于“阳化气,阴成形”理论探讨黄韧带“炎症-纤维化”病理过程 |
| 3.4 基于“阳化气,阴成形”理论探讨DLSS的中医药治疗 |
| 3.5 其他 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 基于三种造模方法诱导大鼠黄韧带肥厚动物模型的建立与评价 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要器械、设备、试剂等 |
| 1.3 实验动物的分组与取材 |
| 1.4 实验动物的造模 |
| 1.5 影像学测量 |
| 1.6 HE染色与大鼠黄韧带厚度的测量 |
| 1.7 Masson染色与大鼠黄韧带纤维化观察 |
| 1.8 免疫组化法检测各组黄初带IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7)、Col1、Col3蛋白的定位、半定量表达 |
| 1.9 免疫印迹法定性、半定量分析IL-1β、TNF-α、TGF-β1和Coll蛋白在各组黄韧带内表达 |
| 1.10 Real-Time PCR检测 IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7)、Col1、Col3的mRNA表达 |
| 1.11 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 HE染色与大鼠黄韧带厚度的结果 |
| 2.2 Masson染色与大鼠黄韧带纤维化的结果 |
| 2.3 影像学测量结果 |
| 2.4 免疫组化结果 |
| 2.5 免疫印迹结果 |
| 2.6 Real-Time PCR结果 |
| 2.7 大鼠黄韧带与人增厚黄韧带的比较 |
| 2.8 模型成功率 |
| 3 讨论 |
| 3.1 大鼠黄韧带肥厚模型的建立方法 |
| 3.2 大鼠黄韧带肥厚的病理表现 |
| 3.3 机械应力是诱发或加速黄韧带肥厚的重要因素 |
| 3.4 基于“阳化气,阴成形”理论探讨大鼠黄韧带增厚模型的建立 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 不足与展望 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 附件 |
（5）诱导性心脏祖细胞的生成及其3D水凝胶培养体系的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.iCMs的生成 |
| 1.1 体外重编程 |
| 1.2 体内重编程 |
| 2.iCPCs的生成 |
| 2.1 体外重编程 |
| 2.2 体内重编程 |
| 2.3 转录因子 |
| 2.3.1 Gata4 |
| 2.3.2 Nkx2.5 |
| 2.3.3 Tbx5 |
| 2.3.4 Mesp1 |
| 2.3.5 Baf60c |
| 3.壳聚糖-3D水凝胶 |
| 3.1 壳聚糖的结构和理化性质 |
| 3.2 壳聚糖的生物学特性及应用 |
| 3.3 壳聚糖-3D水凝胶在心脏组织工程中的应用 |
| 4.总结和展望 |
| 第2章 试验部分 |
| 引言 |
| 试验一 iCPCs的生成与鉴定 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 主要仪器与设备 |
| 1.3 主要药品与试剂 |
| 1.4 主要溶液配制 |
| 2.方法 |
| 2.1 HEK-293T细胞的培养 |
| 2.1.1 HEK-293T细胞的复苏 |
| 2.1.2 HEK-293T细胞的传代培养 |
| 2.1.3 HEK-293T细胞的冻存 |
| 2.2 免疫细胞化学染色 |
| 2.3 质粒构建 |
| 2.4 质粒DNA的提取 |
| 2.5 质粒DNA的酶切验证 |
| 2.5.1 1 %琼脂糖凝胶的制备 |
| 2.5.2 样品准备 |
| 2.5.3 酶切及琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 2.6 细胞转染 |
| 2.7 iCPCs的鉴定 |
| 2.7.1 形态学观察 |
| 2.7.2 免疫细胞化学染色 |
| 2.7.3 RT-qPCR |
| 2.8 iCPCs的体外分化和鉴定 |
| 2.8.1 形态学观察 |
| 2.8.2 免疫细胞化学染色 |
| 2.8.3 RT-qPCR |
| 2.9 数据统计分析 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 HEK-293T细胞的体外培养 |
| 3.1.1 形态学观察 |
| 3.1.2 免疫细胞化学染色 |
| 3.2 质粒DNA提取 |
| 3.2.1 菌液电泳 |
| 3.2.2 酶切验证 |
| 3.2.3 HEK-293T细胞的转染 |
| 3.3 iCPCs的鉴定 |
| 3.3.1 形态学观察 |
| 3.3.2 免疫细胞化学染色 |
| 3.3.3 RT-qPCR |
| 3.4 iCPCs的体外诱导分化 |
| 3.4.1 形态学观察 |
| 3.4.2 免疫细胞化学染色 |
| 3.4.3 iCPCs及其体外诱导分化所得细胞的阳性率 |
| 3.4.4 RT-qPCR |
| 4.讨论 |
| 4.1 iCPCs的体外生成 |
| 4.2 iCPCs的体外诱导分化 |
| 5.小结 |
| 试验二 iCPCs的3D水凝胶培养体系构建 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 主要仪器与设备 |
| 1.3 主要药品与试剂 |
| 1.4 主要溶液配制 |
| 2.方法 |
| 2.1 3D水凝胶的构建及性能表征 |
| 2.1.1 3D水凝胶的制备 |
| 2.1.2 3D水凝胶支架的电镜观察 |
| 2.1.3 3D水凝胶支架孔隙度的测定 |
| 2.1.4 3D水凝胶溶胀率的测定 |
| 2.1.5 3D水凝胶体外降解率的测定 |
| 2.2 3D水凝胶的细胞培养 |
| 2.2.1 不同比例组成3D水凝胶对iCPCs增殖的影响 |
| 2.2.2 不同比例组成3D水凝胶对iCPCs存活的影响 |
| 2.2.3 3D水凝胶培养iCPCs回收条件的研究 |
| 2.3 iCPCs在3D水凝胶中的形态学观察 |
| 2.4 iCPCs在3D水凝胶中的诱导分化 |
| 2.4.1 形态学观察 |
| 2.4.2 免疫细胞化学染色 |
| 2.4.3 RT-qPCR |
| 2.5 数据统计分析 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 3D水凝胶支架的超微结构 |
| 3.2 3D水凝胶支架孔隙率、溶胀率和降解率的测定 |
| 3.2.1 孔隙率的测定 |
| 3.2.2 溶胀率的测定 |
| 3.2.3 降解率的测定 |
| 3.3 不同比例组成3D水凝胶对iCPCs细胞行为的影响 |
| 3.3.1 细胞增殖 |
| 3.3.2 存活率 |
| 3.4 3D水凝胶中iCPCs回收条件的研究 |
| 3.5 3D水凝胶中iCPCs的形态学观察 |
| 3.6 iCPCs在3D水凝胶中的诱导分化 |
| 3.6.1 形态学观察 |
| 3.6.2 免疫细胞化学染色 |
| 3.7 3D水凝胶中iCPCs诱导分化所得细胞的比率 |
| 3.8 RT-qPCR |
| 4.讨论 |
| 4.1 不同凝胶比例组成对3D水凝胶物理特性的影响 |
| 4.2 不同比例组成3D水凝胶对iCPCs行为的影响 |
| 4.3 3D水凝胶支架中iCPCs回收条件的研究 |
| 4.4 3D水凝胶对iCPCs诱导分化的影响 |
| 5.小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略词表 |
| 在读期间发表论文及参加课题参研情况一览表 |
| 致谢 |
（6）万通筋骨片对类风湿关节炎的抗炎机制研究及16S rDNA高通量测序和代谢组学分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 类风湿关节炎概述 |
| 1.2 类风湿关节炎发病机制 |
| 1.2.1 触发阶段 |
| 1.2.2 成熟阶段 |
| 1.2.3 靶向阶段 |
| 1.2.4 爆发性阶段 |
| 1.3 类风湿性关节炎现代药物疗法 |
| 1.3.1 传统DMARDs |
| 1.3.2 生物DMARDs |
| 1.3.3 小分子DMARDs |
| 1.4 肠道微生物群与类风湿关节炎 |
| 1.4.1 肠道菌群与免疫调节细胞 |
| 1.4.2 肠道菌群介导炎症性关节炎 |
| 1.4.3 肠道菌群介导类风湿关节炎治疗 |
| 1.4.4 益生菌 |
| 1.5 中草药对RA-FLSs细胞凋亡的影响及机制 |
| 1.5.1 RA-FLSs细胞凋亡 |
| 1.5.2 死亡受体介导的凋亡途径 |
| 1.5.3 线粒体依赖性凋亡途径 |
| 1.5.4 .NF-κB介导的凋亡途径 |
| 1.5.5 MAPK介导的凋亡途径 |
| 1.5.6 .其他凋亡途径 |
| 1.6 万通筋骨片研究进展 |
| 1.7 技术路线 |
| 第2章 万通筋骨片在类风湿性关节炎中的抗炎作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验试剂与耗材 |
| 2.2.3 实验细胞与实验动物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 大鼠急毒实验 |
| 2.3.2 CIA大鼠模型建立 |
| 2.3.3 动物分组与给药 |
| 2.3.4 酶联免疫吸附试验 |
| 2.3.5 HE染色 |
| 2.3.6 免疫组化分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 万通筋骨片安全给药浓度 |
| 2.4.2 CIA大鼠模型 |
| 2.4.3 万通筋骨片对RA具有抗炎作用 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 万通筋骨片在类风湿性关节炎中的抗炎机制 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验试剂与耗材 |
| 3.2.3 实验细胞与实验动物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 万通筋骨片溶液配制 |
| 3.3.2 RA-FLSs细胞培养 |
| 3.3.3 细胞形态观察 |
| 3.3.4 RA-FLSs细胞增殖检测 |
| 3.3.5 蛋白免疫印迹分析 |
| 3.3.6 实时荧光定量PCR分析 |
| 3.3.7 细胞免疫荧光 |
| 3.3.8 质粒转染 |
| 3.3.9 Caspase-3/9蛋白酶活性检测 |
| 3.3.10 免疫组化分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 万通筋骨片乙醇提取物对RA-FLSs细胞的影响 |
| 3.4.2 MEK/ERK信号通路介导万通筋骨片的抗炎作用 |
| 3.4.3 万通筋骨片乙醇提取物促进RA-FLSs细胞凋亡 |
| 3.4.4 线粒体依赖性凋亡途径介导万通筋骨片的抗炎作用 |
| 3.5 讨论 |
| 第4章 基于RNA高通量测序挖掘万通筋骨片对RA的抗炎靶点 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验仪器 |
| 4.2.2 实验试剂与耗材 |
| 4.2.3 实验分析软件 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 RA-FLSs细胞培养与分组 |
| 4.3.2 样品收集和准备 |
| 4.3.3 数据分析 |
| 4.3.4 实时荧光定量PCR |
| 4.3.5 蛋白免疫印迹 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 DESeq2差异分析 |
| 4.4.2 差异基因功能注释分析 |
| 4.4.3 KEGG富集通路提取及蛋白互作网络分析 |
| 4.4.4 STEM时间聚类分析 |
| 4.4.5 权重共表达网络分析及功能富集分析 |
| 4.4.6 基因共表达网络分析及蛋白互作网络分析 |
| 4.4.7 核心基因筛选与验证 |
| 4.5 讨论 |
| 第5章 基于16S高通量测序和代谢组学联合分析挖掘万通筋骨片对RA的抗炎靶点 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验仪器 |
| 5.2.2 实验试剂 |
| 5.2.3 实验分析软件 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 16S rDNA扩增子测序 |
| 5.3.2 16S rDNA扩增子信息分析 |
| 5.3.3 代谢物提取 |
| 5.3.4 色谱条件 |
| 5.3.5 质谱条件 |
| 5.3.6 代谢物鉴定 |
| 5.3.7 肠道菌群与代谢物联合分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 万通筋骨片改变CIA大鼠肠道菌群结构 |
| 5.4.2 万通筋骨片作用特定肠道菌群 |
| 5.4.3 万通筋骨片改变CIA大鼠血清代谢物谱 |
| 5.4.4 差异代谢物筛选 |
| 5.4.5 靶点代谢物筛选 |
| 5.4.6 16S rDNA高通量测序与代谢物组学联合分析 |
| 5.5 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 附表 |
（7）miR-876调控POSTN促进肝癌进展和纤维化的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 HCC中抑癌miR-876从TCGA数据库的筛选鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 miR-876在HCC细胞及组织中低表达 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 miR-876 的异常表达和HCC进展及纤维化相关 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 miR-876 抑制HCC的 EMT及纤维化 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 miR-876 靶向调控POSTN |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 miR-876 通过POSTN抑制HCC的 EMT及纤维化 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.2 结果 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 第八章 POSTN高表达和HCC组织EMT及肝硬化相关 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.2 结果 |
| 8.3 讨论 |
| 8.4 小结 |
| 第九章 miR-876及POSTN的异常表达和HCC预后相关 |
| 9.1 材料与方法 |
| 9.2 结果 |
| 9.3 讨论 |
| 9.4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 骨膜蛋白(POSTN)的结构功能及其在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（8）海参酶解物促SD大鼠皮肤创面愈合的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 海参的研究进展 |
| 1.1.1 海参的概述 |
| 1.1.2 海参的营养和药用价值 |
| 1.1.3 海参的加工现状 |
| 1.1.4 海参酶解的研究进展 |
| 1.2 创面愈合的研究进展 |
| 1.2.1 创面愈合的概述 |
| 1.2.2 影响创面愈合的因素 |
| 1.2.3 创面愈合的实验模型 |
| 1.3 蛋白酶解物在促创面愈合方向的研究现状 |
| 1.4 肽消化吸收的研究进展 |
| 1.4.1 肽的概述 |
| 1.4.2 肽的消化机制 |
| 1.4.3 肽的吸收机制 |
| 1.5 立题背景、意义和研究内容 |
| 1.5.1 立题背景和意义 |
| 1.5.2 主要研究内容 |
| 1.5.3 主要技术路线 |
| 第二章 海参酶解物不同剂量组促SD大鼠皮肤创面愈合的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料和主要仪器 |
| 2.2.1 材料与试剂 |
| 2.2.2 实验主要仪器和设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 酶解条件的确定 |
| 2.3.2 海参酶解物(SCH)的制备 |
| 2.3.3 营养组成测定方法 |
| 2.3.4 分子量分布测定方法 |
| 2.3.5 实验动物分组及处理 |
| 2.3.6 伤口愈合率测定方法 |
| 2.3.7 组织切片染色分析方法 |
| 2.3.8 血液中炎症因子的Elisa分析 |
| 2.3.9 组织中Hyp和生长因子的Elisa分析 |
| 2.3.10 数据处理 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 海参营养成分分析 |
| 2.4.2 酶解条件的分析 |
| 2.4.3 SCH分子质量分布情况 |
| 2.4.4 SCH不同剂量组对大鼠体质量的影响 |
| 2.4.5 SCH不同剂量组对大鼠伤口愈合率的影响 |
| 2.4.6 SCH不同剂量组对大鼠伤口组织切片病理染色的影响 |
| 2.4.7 SCH不同剂量组对大鼠伤口组织中Hyp含量的影响 |
| 2.4.8 SCH不同剂量组对大鼠炎症指标的影响 |
| 2.4.9 SCH不同剂量组对大鼠伤口组织生长因子含量的影响 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 海参酶解物不同分子量组促SD大鼠皮肤创面愈合的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料和主要仪器 |
| 3.2.1 材料与试剂 |
| 3.2.2 实验主要仪器和设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 不同分子量SCH的制备 |
| 3.3.2 氨基酸和矿物质组成测定方法 |
| 3.3.3 分子量分布测定方法 |
| 3.3.4 实验动物分组及处理 |
| 3.3.5 伤口愈合率测定方法 |
| 3.3.6 组织切片染色分析方法 |
| 3.3.7 血液中炎症因子的测定方法 |
| 3.3.8 血液和组织中氧化应激指标的测定方法 |
| 3.3.9 组织中Hyp、生长因子和通路相关因子的Elisa分析 |
| 3.3.10 组织中通路相关因子m RNA的 RT-PCR分析 |
| 3.3.11 数据处理 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 SCH不同分子量组样品的分子质量分布差异 |
| 3.4.2 SCH不同分子量组样品的氨基酸和矿物质组成差异 |
| 3.4.3 SCH不同分子量组对大鼠体质量的影响 |
| 3.4.4 SCH不同分子量组对大鼠伤口愈合率的影响 |
| 3.4.5 SCH不同分子量组对大鼠伤口组织切片病理染色的影响 |
| 3.4.6 SCH不同分子量组对大鼠伤口组织中Hyp含量的影响 |
| 3.4.7 SCH不同分子量组对大鼠炎症指标的影响 |
| 3.4.8 SCH不同分子量组对大鼠氧化应激的影响 |
| 3.4.9 SCH不同分子量组对大鼠伤口组织生长因子含量的影响 |
| 3.4.10 SCH不同分子量组对TGF-β/Smad信号通路的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 海参酶解物不同分子量组的体内吸收差异 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料和主要仪器 |
| 4.2.1 材料与试剂 |
| 4.2.2 实验主要仪器和设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 实验动物分组及处理 |
| 4.3.2 胃肠内容物质量测定 |
| 4.3.3 血浆中游离态和结合态的Hyp、Pro含量测定 |
| 4.3.4 组织中游离态和结合态的Hyp、Pro含量测定 |
| 4.3.5 Hyp结合小肽标准曲线的建立 |
| 4.3.6 血浆中5 种Hyp结合小肽含量测定 |
| 4.3.7 组织中5 种Hyp结合小肽含量测定 |
| 4.3.8 十二指肠和空肠中Pep T1的RT-PCR分析 |
| 4.3.9 数据处理 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 大鼠胃肠的吸收情况 |
| 4.4.2 结合态和游离态Hyp的含量变化 |
| 4.4.3 结合态和游离态Pro的含量变化 |
| 4.4.4 大鼠血浆中5 种Hyp结合小肽的含量变化 |
| 4.4.5 大鼠组织中5 种Hyp结合小肽的含量变化 |
| 4.4.6 大鼠十二指肠和空肠中Pep T1的m RNA表达水平 |
| 4.4.7 SCH促大鼠创面愈合的体内吸收机理 |
| 4.5 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1:实验数据附图 |
| 附录2:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（9）神经肽Y在骨折愈合中的作用及成骨机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 研究背景 |
| 第一部分 神经肽Y在小鼠骨折愈合中的作用及相关机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 第二部分 神经肽Y在小鼠前成骨细胞MC3T3-E1中的表达和生物学功能 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 第三部分 神经肽Y上调Runx2、 Osterix表达促进小鼠前成骨细胞MC3T3-E1成骨的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 综述 神经肽Y在骨与能量合成中的生物学功能及研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文文章一 |
| 英文文章二 |
（10）荔枝核总黄酮对HSC-T6的作用和差异蛋白质组学的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂与耗材 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞培养及传代 |
| 2.2 检测TFL药物对HSC-T6增殖的影响 |
| 2.3 透射电子显微镜观察HSC-T6的超微结构 |
| 2.4 ELISA检测MMP-2、ColⅠ、ColⅢ的含量变化 |
| 2.5 肝纤维化动物造模分组及含药血清的制备 |
| 2.6 检测含药血清对HSC-T6增殖的影响 |
| 2.7 含药血清干预后蛋白质的收集与提取 |
| 2.8 DDA检测 |
| 2.9 DIA检测 |
| 2.10 主要数据库和数据指标 |
| 2.10.1 NR数据库和UniProt蛋白数据库 |
| 2.10.2 STRING蛋白互作数据库 |
| 2.10.3 GO数据库 |
| 2.10.4 KOG数据库 |
| 2.10.5 KEGG数据库 |
| 2.11 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 TFL药物对HSC-T6生长抑制率的影响 |
| 3.2 TFL药物对HSC-T6超微结构的影响 |
| 3.3 TFL药物对HSC-T6的MMP-2、ColⅠ、ColⅢ含量的影响 |
| 3.4 肝纤维化动物造模结果 |
| 3.5 不同浓度的含药血清对HSC-T6增殖的影响 |
| 3.6 肽段与蛋白的定量质控分析 |
| 3.7 DDA/DIA检测结果 |
| 3.8 GO富集分析 |
| 3.9 KOG注释分析 |
| 3.10 PPI分析 |
| 3.11 PATHWAY富集分析 |
| 3.12 亚细胞定位分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 理论基础 |
| 4.1.1 肝纤维化与肝星状细胞的理论基础 |
| 4.1.2 差异蛋白质组学的理论基础 |
| 4.1.3 中医药对肝纤维化认识的理论基础 |
| 4.1.4 荔枝核总黄酮(TFL)治疗肝纤维化的理论基础 |
| 4.2 TFL对HSC-T6生长增殖的影响 |
| 4.3 TFL对HSC-T6的ECM形成相关因子的影响 |
| 4.3.1 基质金属蛋白酶2(MMP-2) |
| 4.3.2 Ⅰ型胶原(ColⅠ) |
| 4.3.3 Ⅲ型胶原(ColⅢ) |
| 4.4 TFL对HSC-T6部分差异蛋白功能的讨论 |
| 4.4.1 上调蛋白 |
| 4.4.2 下调蛋白 |
| 4.5 TFL对HSC-T6差异蛋白部分信号通路的分析 |
| 4.5.1 PI3K/Akt通路 |
| 4.5.2 NF-κB信号通路 |
| 4.5.3 胆固醇代谢与合成 |
| 4.5.4 补体和凝血级联 |
| 4.5.5 细胞色素P450 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 综述 荔枝核总黄酮防治肝纤维化相关细胞因子及信号通路的进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介及攻读学位期间获得的科研成果 |
四、成纤维细胞生长因子-10对3种与修复有关内源性生长因子表达的调控作用（论文参考文献）
- [1]浓缩生长因子与表皮生长因子干预口腔黏膜等效细胞的增殖和衰老[J]. 李腾艳,聂敏海,刘旭倩. 中国组织工程研究, 2022(20)
- [2]组织修复和再生领域浓缩生长因子的应用优势[J]. 周颐,刘笑言,向柄彦. 中国组织工程研究, 2022(10)
- [3]bFGF对3-硝基丙酸诱导的小鼠胚胎氧化应激损伤的保护作用[D]. 田微. 延边大学, 2021(02)
- [4]基于“阳化气，阴成形”理论研究TGF-β1/Smads影响黄韧带肥厚的机制及模型的建立[D]. 王宝剑. 中国中医科学院, 2021(02)
- [5]诱导性心脏祖细胞的生成及其3D水凝胶培养体系的构建[D]. 褚新月. 西南大学, 2021
- [6]万通筋骨片对类风湿关节炎的抗炎机制研究及16S rDNA高通量测序和代谢组学分析[D]. 李兆东. 吉林大学, 2021(01)
- [7]miR-876调控POSTN促进肝癌进展和纤维化的机制研究[D]. 陈凯. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [8]海参酶解物促SD大鼠皮肤创面愈合的研究[D]. 程敏君. 江南大学, 2021(01)
- [9]神经肽Y在骨折愈合中的作用及成骨机制研究[D]. 张波. 山东大学, 2021(11)
- [10]荔枝核总黄酮对HSC-T6的作用和差异蛋白质组学的研究[D]. 蒋云霞. 广西中医药大学, 2021(01)