轴突损伤距离对成年金地鼠正常或塌陷周围神经移植物视网膜神经节细胞轴突再生的影响

一、轴突损伤距离对成年金黄地鼠视网膜节细胞轴突在正常或预先溃变周围神经移植物中再生的影响（论文文献综述）

齐士斌^[1]（2020）在《NF-κB/STAT3信号通路调控成年神经元的轴突再生及相互关系》文中进行了进一步梳理目的临床上,周围神经损伤后的轴突生长不仅扮演着重要的角色,也是目前面临的难题。周围神经损伤后,主要表现为轴突连续性的中断,导致了神经炎症反应和神经轴突信号传递的缺失,最终致使患者感觉和运动功能的丧失。众所周知,炎症反应是调控神经轴突再生的重要因素之一。核因子κB（nuclearfactorkappa-B,NF-κB）作为经典的炎症因子参与到许多的炎症反应,并在其中起着重要的调控作用。然而,NF-κB在成年哺乳动物的感觉神经元轴突再生作用却是未知的。信号转导转录因子3（signal transductionoftranscriptionfactor,STAT3）同样具有调控炎症因子的合成及释放,在神经轴突再生具有一定的作用。在此,我们发现周围神经损伤后,NF-κB和STAT3均在成年感觉神经元中激活。此外,药物抑制NF-κB和STAT3的表达均可阻碍周围感觉神经元在体外及体内的轴突生长;相反,激活NF-κB后,体外轴突再生未表现出明显促进作用,而激活STAT3则可促进神经轴突的再生。此外我们还发现STAT3的激活显着促进视神经的体内再生,并在一定程度上提高了视网膜神经节细胞的存活率。更重要的是,激活STAT3可以逆转由于NF-κB受抑所引起的轴突生长受阻。综上所述,本研究表明NF-κB通过STAT3调节成年感觉神经元轴突生长。方法1.本课题研究采用外周神经损伤模型,于损伤1、3、7天后取背根神经节（dorsal rootganglion,DRG）,对感觉神经元中NF-κB及STAT3的蛋白表达进行蛋白质免疫印迹（Western Blot）定量检测。2.体外应用DRG感觉神经元培养模型,通过特异性的化学药物及小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）抑制NF-κB及STAT3的蛋白表达,体外培养3天后,经特异性神经元标记抗体进行免疫荧光染色,标记神经元再生轴突并统计测量其长度,以此检测NF-κB及STAT3对轴突再生的功能作用。3.体外DRG感觉神经元培养,通过特异性化学激活剂激活NF-κB及STAT3的活性表达,体外培养2天后,使用特异性神经元标记抗体通过免疫荧光染色标记再生轴突并统计测量其长度,以此检测NF-κB及STAT3对轴突再生的功能作用。4.体内DRG电穿孔转染特异性siRNA与绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）混合溶液至腰椎4、5（Lumbar4～5,L4～5）抑制NF-κB及STAT3的活性,2天后行坐骨神经夹伤,5天后取出夹伤侧坐骨神经进行压片,统计测量被GFP转染标记的神经元再生轴突,以此检测两者在体内对轴突再生的功能作用。5.利用玻璃体注射及视神经损伤模型,将20%乙醇或STAT3特异性激活剂注射进入玻璃体并同时进行视神经损伤。术后12天再次注射Alexa-488标记的霍乱毒素B（Alexa-488-CTB）进入眼球玻璃体内顺行标记再生轴突。术后14天使用4%多聚甲醛固定视神经并通过10%、20%、30%蔗糖梯度脱水处理。冰冻切片后,测量统计视网膜神经节细胞的存活率及视神经轴突再生情况。6.利用视神经损伤模型,于损伤后14天,取出视网膜,冰冻切片后,通过特异性神经元免疫荧光染色统计视网膜神经节细胞的存活率,以此确定激活STAT3在一定程度上促进节神经元的存活。结果1.NF-κB调控感觉神经元轴突再生。1)外周神经损伤后,DRG神经元内p-p65蛋白表达逐渐升高,且在第3、7天最为明显。2)药物PDTC抑制NF-κB活性,或转染p65小干扰RNA敲减其蛋白,阻碍了体外培养的DRG感觉神经元轴突的生长。3)p65小干扰RNA体内电转染至L4/L5 DRG内,敲减NF-κB蛋白后,坐骨神经轴突再生受到抑制。4)相反,药物VP16虽促进了磷酸化p65表达升高,但体外感觉神经轴突的生长未表现出明显的增长。2.STAT3调控感觉神经元轴突再生。1)外周神经损伤后,DRG神经元内磷酸化STAT3表达在第一天达到高峰,此后呈现逐渐降低趋势。2)药物S3I-201抑制STAT3活性,或转染siRNA敲减其蛋白,体外培养的DRG感觉神经元轴突再生受到阻碍。3)特异性STAT3小干扰RNA电转染至L4/L5 DRG感觉神经元中,坐骨神经轴突的生长受抑。4)药物CLN不仅促进了磷酸化STAT3表达明显升高,还可显着促进成年感觉神经元的轴突再生。5)玻璃体内注射CLN激活STAT3活性,既促进视神经轴突的生长,也提高了视网膜神经节细胞的存活率。3.NF-κB通过STAT3调控感觉神经元轴突再生。1)通过PDTC抑制NF-κB活性后,不仅能降低p-p65,还能致使p-STAT3表达降低。2)使用CLN激活STAT3活性,可在一定程度上逆转NF-κB抑制剂所带来的阻碍感觉神经元轴突再生的作用。结论外周神经损伤后轴突再生的过程比较复杂,它受体内多种基因严格的联合调控。一般情况下,神经损伤后常伴随炎症反应及相关转录因子的激活,以此来调控损伤后轴突再生所需的必要物质。本研究结果表明,NF-κB及STAT3均具有调控感觉神经轴突再生的功能,且揭示了 NF-κB能通过调节STAT3进一步调控轴突再生。更为重要的是,激活STAT3不仅能促进视神经受损后的轴突再生,还可在一定程度上提高视网膜神经节细胞的存活率。

王能^[2]（2013）在《黄芪甲苷对视网膜节细胞存活和再生的影响》文中研究说明研究背景神经再生一直以来都是神经科学研究的重点和难点。神经再生是指特定条件下神经元轴突再生，包括轴突出芽，生长和延伸，与靶细胞重建突触关系，实现神经支配，恢复功能。低等脊髓动物如鱼类及两栖动物的中枢神经和周围神经都能够再生，而哺乳动物只有周围神经可以再生，中枢神经系统损伤后则无有效再生（Cajal1928）。视网膜是中枢神经系统的外延，且由于视网膜的视神经节细胞（retinalganglioncells,RGCs）的轴突集中成视神经（opticnerve,ON），易于操作，便于对RGCs的再生进行定量分析，所以视网膜及视神经广泛运用于中枢神经系统再生的研究。影响视神经再生的因素包括：视网膜节细胞自身的再生潜力、周围的抑制因素和促进因素的影响。视网膜神经节细胞的再生主要围绕这三个方面来实现，上调促进基因来重新启动自身潜力，去除抑制因子的影响，清除瘢痕，增加神经营养因子来促进再生。目前研究表明，神经营养因子和钙通道阻滞剂等对视神经损伤后视网膜节细胞的存活和再生有促进作用。中药对促进视网膜节细胞存活以及对中枢神经系统神经元存活和再生的研究具有重要意义。黄芪甲苷（astragalosideIVAST）是中药黄芪的主要有效成分之一，是一种Ca2+内流拮抗剂，具有舒张血管、抑制自由基生成、清除自由基、抗炎、抗氧化等作用。本实验拟研究腹腔注射AST对轴突损伤后RGCs存活和再生的影响。第一部分黄芪甲苷对视网膜节细胞存活的影响目的研究黄芪甲苷对视神经损伤后视网膜节细胞存活的影响。方法选用SD大鼠，体重200～250g，动物随机分组：正常组（n=5）、单纯视神经切断组、视神经切断后AST处理组和生理盐水处理的对照组，后三组又分为5、7、14d组（n=5）。量效关系组分4个AST剂量组10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg组（n=5）。荧光金（fluorogold,FG）逆行标记：正常对照组：上丘和外侧膝状体注射1.5ulFG逆行标记RGCs，并且于左眼眶内暴露视神经，分层缝合，5d后取材。视神经损伤模型操作：损伤各组：经FG逆行标记RGCs5d后的大鼠，在手术显微镜下眶内暴露视神经，在球后2mm处切断视神经，分层缝合，于各时间点取材。视网膜铺片和计数：各观察时间点，处死大鼠取出眼球，固定后剥离视网膜分鼻上、鼻下、颞上、颞下四部分铺片，在荧光显微镜下，距视盘0.5、1.5、2.5mm处各拍摄200×的荧光照片各3张。用image-pro6.0软件对照片上标记的RGCs进行计数，求平均值，4个部分RGCs数量累加转化成单位面积RGCs密度。结果经黄芪甲苷处理的动物，切断视神经5、7、14d后的存活节细胞的平均密度为（1359±193）/mm2，（1046±175）/mm2和（514±67）/mm2，与正常视网膜节细胞密度相比，其存活率分别为60.94%、46.90%和23.04%。5、7d、14d组的节细胞存活率增加了9.59%、11.27%、11.32%。经方差分析，黄芪甲苷处理组与视神经切断组和生理盐水对照组相比在视神经切断后不同时间段其P值均小于0.05，表明它们存在显着性差异。结论黄芪甲苷对视神经损伤后视网膜节细胞存活有促进作用。第二部分黄芪甲苷对视网膜节细胞再生的影响目的研究黄芪甲苷对视网膜节细胞再生的影响。方法选用SD大鼠，体重200～250g，动物随机分组：生理盐水对照组、AST处理组（各组又分为21、28d组）以及量效关系组（21d）n=5。视神经再生模型操作：动物麻醉后手术显微镜下眶内暴露视神经，距球后1mm切断视神经，移植一段2cm自体坐骨神经，取材前3d修剪移植的自体坐骨神经为1.5cm并放置FG逆行标记再生的视网膜节细胞，于21、28d取材。视网膜铺片的RGCs计数同前。结果经黄芪甲苷处理组，术后3、4周再生视网膜节细胞平均密度为（978±99）/mm2和（546±61）/mm2，与生理盐水对照组相比较，t检验，存在显着性差异（p<0.05）。结论黄芪甲苷对视神经损伤后视网膜节细胞再生有促进作用。

武明媚^[3]（2012）在《嗅鞘细胞移植和锂剂对损伤视网膜节细胞的修复作用》文中进行了进一步梳理视神经横断造成视网膜神经节细胞（节细胞）不可逆的死亡，导致视觉功能丧失。神经损伤修复的前提是损伤神经元的存活，所以损伤节细胞的存活是视觉功能恢复的先提条件。尽管移植嗅神经鞘细胞（olfactory ensheating cells, OECs）对损伤的节细胞有促进神经再生的作用，但迄今没有报道嗅鞘细胞对损伤的节细胞是否有神经保护作用。因为损伤处距胞体距离的不同，神经元的反应程度也不同，距细胞体越近的损伤，神经元死亡越多。在第一部分实验中我们眶内横断视神经，移植嗅鞘细胞到视神经眶内断端，观察嗅鞘细胞是否对距胞体近距离损伤的节细胞有神经保护作用。实验证明，移植嗅鞘细胞在视神经横断后7天，延迟了节细胞的死亡。但在损伤的2、14天节细胞的存活无明显变化。在第二部分实验中，我们应用实时定量PCR及免疫印迹的方法检测了视网膜及视神经断端内神经营养因子BDNF、 NGF和NT-3及其它因子GDNF、CNTF和LIF的mRNA及BDNF蛋白质的表达。探讨移植嗅鞘细胞保护损伤节细胞的可能机制。结果显示只有BDNF mRNA的水平在移植嗅鞘细胞后7天与对照组相比有显着提高，免疫印迹结果显示移植嗅鞘细胞的BDNF蛋白质表达在同一时间点有显着增加。这表明移植到视神经断端的嗅鞘细胞是通过分泌的BDNF发挥神经保护作用的。锂剂一直被作为精神科用药而长期应用于临床，近年陆续发现长期应用锂剂还具有促进损伤中枢神经系统（包括脑、脊髓和视神经）神经元存活和轴突再生的作用。锂剂这种促进视神经损伤后修复的作用和上调BDNF和cAMP反应元件结合蛋白密切相关。我们不但可以利用锂剂促进中枢神经系统修复作用来修复损伤的视神经，更可借助锂剂上调BDNF表达水平的特性而长期维持移植嗅鞘细胞后视网膜内BDNF的表达水平，进而促进损伤的节细胞长期存活。因此，在第三部分实验中，锂剂和移植嗅鞘细胞联合应用，观察二者用是否对视神经横断后14天的节细胞有神经保护作用。而实验结果表明单独应用锂剂（30mg/kg）或和嗅鞘细胞联合应用都没有促进视神经横断后14天节细胞的存活。即使增加锂剂剂量（85mg/kg），也不能促进损伤的节细胞存活。然而，单独应用锂剂（30mg/kg）却能促进损伤的节细胞轴突再生进入外周神经移植物。

尹小磊^[4]（2010）在《视网膜Nogo氨基末端信号通路的初步研究》文中研究表明数目众多的各种先天和后天性疾病可使中枢神经系统受累,而损伤对神经元及其轴突造成的破坏几乎不可逆,因为在中枢神经绝大多数区域内成年哺乳动物几乎没有更换丢失或濒死神经元的能力,而仅有极其微弱的神经纤维修复作用。故此区域内的创伤性或血管性损伤,和因慢性退行性疾病造成的神经元丢失、神经纤维束损伤,破坏神经回路的完整性,将造成长期的功能障碍。中枢神经损伤后的再生修复,特别是在损伤较重,或慢性损伤的情况下,尤为困难。目前的研究普遍认为,中枢神经损伤后再生受限,主要是因为受到了其髓磷脂中Nogo蛋白的抑制。nogo基因编码三种异构体,Nogo-A,Nogo-B和Nogo-C。三种异构体的羧基端结构相同,由188个氨基酸组成,含有两个长疏水结构域,和位于这两个疏水结构域之间的一个短的66个氨基酸构成的环状结构域,Nogo-66。在多种神经元都有广泛表达的糖蛋白NgR,被认为是Nogo-66结构域的受体。NgR是一种细胞表面GPI链接蛋白,但因缺乏细胞内结构域需要p75或TROY作为共受体介导通过细胞膜的信号转导,后两者均是属于肿瘤坏死因子受体家族的跨膜蛋白。另一共受体,LINGO-1,作为衔接蛋白也是Nogo信号传递过程中所必须的。而另外两种髓磷脂抑制因子,MAG和OMgp对NgR也有很强的亲和力。说明三种不相关的髓磷脂抑制因子,Nogo、MAG和OMgp,经由同一复合受体,并共享相同的细胞内信号途径。虽然目前广为接受Nogo及其受体NgR的相互作用,对成年哺乳动物损伤后中枢神经轴突的再生发挥了主要的抑制作用,但仍有众多的疑问。因为有资料证实脊髓损伤后,NgR基因敲出的小鼠皮质脊髓束神经元仍然不能再生;在不结合NgR的情况下,Nogo-A氨基末端也可抑制神经元轴突的生长。此外,运动神经元NgR的表达很弱,其他脊髓神经元根本不表达。各种初级感受神经元均无NgR的高表达,有些甚至不表达。如果在中枢神经,NgR是Nogo发挥轴突生长抑制作用的基本神经元受体,那么各种神经元NgR显着的表达差异,将限制对Nogo-66生长抑制作用敏感神经元的范围,实际情况又非如此。关于NgR在小脑浦肯野神经元是否表达,以及脊髓中NgR的分布情况也一直存在争议。而中和Nogo-66活性结构域作用仅获得损伤轴突的有限再生,即便2008年及2009年又分别发现了两个新的作用于Nogo-66结构域的受体,PirB和GPR50,使得Nogo发挥轴突生长抑制作用的途径,仍然存在未解之谜。此外,Nogo及其Nogo-66活性结构域经典受体NgR在视觉系统的表达研究也寥寥无几。而视觉系统因具有:视网膜神经解剖明确的,有已被研究较为透彻的七种主要细胞和一条通路;节细胞通过玻璃体腔内注射就能被直接定向;网膜的功能可通过无创定量技术评估;视神经是源于白质中央部分的分离束,在眼眶内就能被接触到;损伤后,节细胞的存活情况和轴突再生的数量易定量;由于其特征性的解剖和功能构成,可通过检测再生节细胞轴突的连接和形态,评估神经塑形和修复后的功能等优势,广泛被用于损伤中枢神经的再生修复研究。因此对视觉通路Nogo及NgR的分布研究,不仅有助于研究中枢神经损伤后的再生修复,对探讨Nogo-NgR作用也有极大的帮助。2008年Yale大学Hu等对多种细胞的研究结果表明, Nogo-A另一个不同于Nogo-66结构域的活性位点,氨基末端结构域（Nogo氨基末端）极有可能通过整合素对细胞发挥作用,并鉴定出对Nogo氨基末端敏感的整合素为αv,α5,和α4,但在他们的实验中,仅涉及鸡的背根神经节神经元,并未对其他种类神经元进行研究,虽然,整合素αv和α5在CNS是存在广泛表达的,但鸡视网膜中没有整合素α5的表达,而人类的视网膜中没有整合素αv的表达,这些又对Nogo氨基末端信号通路产生了新的疑问。因此,本研究的目的在于,探讨视觉通路Nogo及其Nogo-66活性结构域经典受体NgR的分布情况,为研究中枢神经损伤后的再生修复,及Nogo-NgR作用奠定理论基础;对视网膜Nogo氨基末端是否存在整合素结合位点进行初步探讨,推测是否可能存在新的Nogo信号途径,从而为临床中枢神经损伤后的修复研究提供新的思路。据此,本课题进行了以下两个方面的研究:1、对大鼠双眼视神经横断前后视觉通路中Nogo与NgR的分布及表达的变化进行研究;2、通过共区域化表达、免疫共沉淀等研究,初步探讨了视网膜Nogo氨基末端是否存在整合素结合位点。主要结果与结论如下:1、在新生大鼠视网膜、外侧膝状体和视皮质区都存在Nogo蛋白及NgR蛋白的表达,这为Nogo蛋白可能参与视觉通路的建立,轴突的塑形、导向提供了证据。由于在没有NgR的情况下,Nogo仍然可发挥相应的作用,例如可直接作用于细胞的内质网,通过调控内质网内钙离子的浓度改变局部微环境影响细胞的迁移、轴突的延长以及对生长锥进行导向。因此在Nogo和NgR共同出现时,Nogo是否一定通过共区域化的NgR发挥作用,尚需进一步的研究。2、包括视网膜、视神经、视交叉、视束、外侧膝状体和视皮质在内的成年大鼠视觉通路内都存在Nogo和NgR的表达。视束和外侧膝状体在视神经横断伤后Nogo的变化规律相近,伤后升高并保持该高水平直至伤后14d,而两者及视神经的NgR在损伤后的改变相似,基本不发生变化。双眼视神经完全横断后视网膜中几乎观察不到Nogo和NgR的表达。视神经在损伤后Nogo蛋白呈现出逐渐持续升高的趋势。视交叉直到损伤后的14d才观察到有Nogo的减少,而NgR在损伤后就下降并一直保持在此低水平直至伤后14d。视皮质内的Nogo虽然在损伤后会一直较多,但伤后14d的水平要明显低于伤后7d,NgR伤后虽一直较少,但伤后14d较7d相比要显着增多。因此我们推测,在视神经、视束、外侧膝状体由于Nogo和NgR两种蛋白的变化规律似乎和Nogo-NgR作用不冲突,此三个区域内的Nogo有可能部分通过NgR受体发挥作用,而其他区域内Nogo的作用机制可能更加复杂。3、通过共区域化表达、免疫共沉淀等研究结果表明,在成年哺乳动物的视网膜中,Nogo-A氨基末端结构域,即Nogo氨基末端存在整合素αv的结合位点。这说明Nogo作用的发挥,不仅可通过Nogo-NgR信号途径,还有可能通过整合素αv信号途径。这为治疗成熟神经系统缺陷疾病,开发新的刺激轴突生长和功能恢复的方法提供了新的思路,但Nogo-整合素αv信号途径设想的提出,仍需大量深入的研究。

赵海生^[5]（2007）在《LEDGFp52对大鼠视网膜神经节细胞作用研究》文中指出【背景】提高损伤后视网膜神经节细胞（RGCs）存活和再生能力的研究是眼科和神经生物学科共同关注的热点和焦点。具有神经保护性效能的神经营养因子是实现视觉系统中枢神经修复基因治疗和移植的前提和物质基础。然而,既往的研究多集中在某种生长和营养因子的单一研究,迄今为止,还未能找到一种因子能对RGC提供持续的营养支持作用足以克服其周围的再生抑制环境而促进损伤的轴突再生。如果能寻找到某种在转录水平或转录前作用的因子,则该因子有可能启动RGC生长的极链式反应,轴突再生的难题也就迎刃而解了。晶状体来源的上皮生长因子（lens epithelium derived growth factor, LEDGF）是2000年新发现的一种新的生长、粘附、分化、抗凋亡和存活因子,它能提高多数细胞生长粘附能力、促进其分化、延长其存活。LEDGF基因位于人类染色体9p21,该基因选择性的剪切而产生两种蛋白,即LEDGFp75和LEDGFp52蛋白。相比LEDGFp52而言,LEDGFp75只是一个弱的转录辅活化子。最近的研究表明LEDGFp75能促进多种细胞的生长与存活,譬如对晶状体上皮细胞、视网膜光感受器细胞、视网膜色素上皮细胞所发挥的生长刺激和促进存活效应。进一步的研究发现LEDGF在脑内的发育及区域表达,提示其参与神经上皮干细胞分化及神经发生。因此,有专家提议将LEDGF作为视网膜疾病的治疗性蛋白和神经营养因子转染的候选分子。基于LEDGFp75具有一定的眼部保护作用的研究前提、联系LEDGFp52可能比LEDGp75生物学作用更强的生物信息学预测、结合国际上对LEDGFp52这一转录活化子研究很少的事实和视神经再生研究中积极寻找具有神经保护和生长促进效能神经营养因子的要求,我们选择LEDGFp52作为研究的目标。那么,LEDGFp52作为一个新发现的因子,它是否能对RGC起到神经保护和生长促进作用呢?它对RGC神经元生长相关基因和蛋白又有什么影响呢?这有待于我们通过实验研究来明确。【目的】在原代大鼠RGCs培养的基础上进行LEDGFp52基因和蛋白两个水平正负双向调控实验,观察它们对大鼠RGCs突起数目及轴突长度、RGC神经元特异性相关基因和蛋白的调控,全面了解LEDGFp52基因和蛋白对大鼠RGCs生长的影响,为研发更有效的RGC生长和营养因子奠定基础,为探索视神经损伤修复的新途径提供实验依据。【方法】NEUROBASALTM Media无血清体系培养RGCs,采用RT-PCR和细胞免疫荧光化学检测LEDGFp52基因和蛋白在RGCs表达;构建rhLEDGFp52基因原核表达载体、诱导表达及纯化蛋白;细菌内同源重组法构建LEDGFp52基因腺病毒载体、体外表达及制备病毒;构建siRNA-LEDGFp52真核表达载体、鉴定该载体并检测其对LEDGFp52蛋白的抑制率。1、LEDGFp52基因和蛋白对大鼠RGCs的突起数目及轴突长度调控作用的观察:分为实验组和对照组,实验组在大鼠RGCs培养36h后分别将LEDGFp52（2×10-4g/L）和Ab-LEDGF（2.5×10-4g/L）加入RGCs的无血清培养基中,在LipofectamineTM2000介导下将Ad-LEDGFp52（2.5×10-4g/L）（3×10-4pfu/L）和siRNA-LEDGFp52（6×10-4g/L）转染进RGC,分别在处理后12h、24h、36h、48h、72h和96h在相差显微镜下观察。设阳性对照组（CNTF10-4g/L）和空白对照组（不加处理因素）,观察时相点同上。对照组及实验组的每组观察孔数为12孔,重复3次。检测指标:RGCs轴突长度和单个细胞的突起数目。分析软件:IPP图像分析系统。2、LEDGFp52基因和蛋白对RGC神经元生长相关基因和蛋白调控效应的研究:处理因素及分组同上。检测指标:主要采用RT-PCR和细胞免疫荧光化学检测技术进一步研究LEDGFp52对RGC神经元生长相关的GAP-43、NF-L和MAP-2基因与蛋白的调控。分析软件:Quantity One程序半定量分析各个目的基因在mRNA水平的相对含量,以待测基因与相应内参照光密度比值计算相对系数;LSM510-Meta-Expert程序半定量分析各个目的蛋白的平均荧光强度相对数值。【结果】1、无血清的NEUROBASALTM Media培养基是一种较好的RGCs培养体系;LEDGFp52基因及其蛋白在RGCs均有表达。2、利用基因重组技术将rhLEDGFp52基因构建于原核表达载体pET30a（+）中,经酶切、测序鉴定证实构建完全正确,通过IPTG诱导其在大肠杆菌BL21（DE3）中获得可溶性形式表达,rhLEDGFp52蛋白表达量占菌体蛋白总量的34.63%。Western Blot结果显示rhLEDGF2蛋白能够特异性与LEDGF-ab结合。Ni-NTA His.Bind.Resin方法进行纯化后的rhLEDGFp52,终浓度达520μg.mL-1,分析其纯度达87.93%。3、成功将LEDGFp52基因片段亚克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上构建腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-LEDGFp52,并将腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-LEDGFp52与5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共转染BJ5183细菌,经细菌内同源重组产生携带LEDGFp52基因重组腺病毒载体pAd-LEDGFp52,将pAd-LEDGFp52经脂质体法转化293细胞包装产生重组腺病毒Ad-LEDGFp52,滴度可达5×1012 pfu.L-1。将Ad-LEDGFp52体外转染293细胞,在该细胞中有效表达目的基因LEDGFp52,CPE法及Westernblot均证实了该目的基因表达。4、成功构建LEDGFp52基因RNA干扰（RNAi）的真核细胞表达载体,重组质粒转染HeLa细胞48小时,Westernblotting检测到LEDGFp52蛋白表达的改变,Quantity One程序半定量分析LEDGFp52蛋白明显下调了70%。5、LEDGFp52在基因水平和蛋白水平均可调控RGCs生长,表现为正向调节RGCs轴突显着增长,负向调节RGCs轴突显着缩短,而且正向调控时有高峰效应。6、LEDGFp52是RGC树突化因子,同时也是RGC轴突延伸因子。7、LEDGFp52在基因和蛋白两个水平对RGC神经元生长相关的基因/蛋白GAP-43、NF-L和MAP-2的表达均有显着的调控作用,表现为正向调节RGCs神经元生长相关基因/蛋白表达升高,负向调节RGCs神经元生长相关基因/蛋白表达降低。【结论】1.首次确立了LEDGFp52基因及其蛋白在RGCs的表达。2.利用基因重组技术成功获得rhLEDGFp52蛋白,终浓度达520μg.mL-1,纯度达87.93%;经细菌内同源重组成功制备LEDGFp52的重组腺病毒,滴度可达5×1012 pfu.L-1,并能够在真核细胞中获得高效稳定的表达;利用RNAi技术可成功构建抑制LEDGFp52表达的小干扰RNA重组体,该重组体使LEDGFp52蛋白明显下调70%。3. LEDGFp52基因和蛋白能显着调控大鼠RGCs单个细胞突起数目及轴突平均长度,其作用强于CNTF。4. LEDGFp52是RGC树突化因子,也是RGC轴突延伸因子。5. LEDGFp52基因和蛋白通过调控RGC神经元生长相关的基因/蛋白GAP-43、NF-L和MAP-2的表达促进RGC生长。6. LEDGFp52基因在调控RGC树突化时有其它树突化因子的参与。

武明媚,罗娜,杨浩,焦西英,游思维^[6]（2007）在《移植含嗅鞘细胞和体外溃变的周围神经对成年大鼠视网膜神经节细胞轴突再生作用的比较》文中提出目的比较含嗅鞘细胞（OEC）或（和）体外溃变的周围神经移植对成年大鼠视网膜神经节细胞（RGC）轴突再生的影响。方法将24只成年雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为4组,每组各6只大鼠:A组（周围神经对照组）:将取出的一段自体坐骨神经与眶内切断的左侧视神经近侧断端吻合;B组（OEC注入周围神经组）:自取出的坐骨神经两端注入10μlOEC悬液后移植于视神经断端。C组（周围神经体外溃变组）:将取出的坐骨神经在体外单独培养5d后植于视神经断端;D组（OEC-周围神经共培养组）:将取出的坐骨神经与OEC共培养5d后植于视神经断端。移植术后4周处死动物,计数各组以5%荧光金逆行标记的再生RGC数量。结果B、C、D三组RGC均数1481±268、1235±266和1464±285显着高于A组799±109（P值分别为0.0002、0.0010和0.0003）;B、C、D三组间差异无统计学意义（P值分别为0.3644、0.9167和0.4344）。结论OEC具有促进RGC轴突在新鲜周围神经移植物中再生的作用,但这种作用与体外溃变的周围神经相比无明显差异,二者亦无协同作用。

柳浩然^[7]（2006）在《神经干细胞移植治疗视神经损伤的实验研究》文中指出视神经损伤（optic nerve injury，ONI）是颅底骨折的常见并发症，也是致盲的重要因素之一，由于视神经是中枢神经系统的一部分，其损伤后的再生能力非常有限，目前临床尚缺乏行之有效的治疗手段，为此寻找促进神经再生和修复的有效方法成为治疗视神经损伤也是现代神经生物领域的热点。近年来，随着对视神经损伤机制的深入研究，其治疗方法逐渐多样化，周围神经、嗅鞘细胞、雪旺细胞移植及神经营养因子注射等已见较多实验研究报道，虽取得了一定进展，但由于来源限制或组织移植物引起免疫排斥反应、疗效持续性短暂等问题，限制了其临床应用。 神经干细胞（neural stem cells，NSCs）移植目前在许多中枢神经系统疾病的治疗研究中显示了其巨大的潜力和优势，其中，干细胞移植治疗脑血管疾病、肌萎缩侧索硬化、帕金森综合征、脊髓损伤、青光眼及缺血引起的视力下降等疾病已取得了可喜的成果，由于NSCs具有不断更新、自我增殖和多向分化潜能等特性，使之成为较为理想的移植细胞源。本课题组在以往几年对NSCs培养和移植的相关研究的基础上，采用玻璃体下腔注射NSCs移植治疗视神经部分损伤的动物模型，观察NSCs在视网膜内的存活、迁移与分化，通过研究NSCs移植后视网膜节细胞的变化及其对视觉电生理的影响，即形态学及功能恢复两个方面来探讨NSCs对ONI的治疗保护作用，并且进一步深入探讨了NSCs对视神经损伤保护功能的机理。由于视神经损伤后神经营养因子的剥夺是导致节细胞凋亡的根本原因之一，而有研究表明NSCs在体外体内均可分泌神经营养因子，那么移植的NSCs是否通过在视网膜内分泌神经营养因子来保护受损视神经呢?本研究对此进行了验证。论文各部分均进行了较为详细的时间分段比较，

焦文文^[8]（2006）在《嗅鞘细胞在冻融的周围神经移植物中的存活及对成年大鼠视神经损伤后再生的影响》文中研究指明成年哺乳动物中枢神经系统（CNS）损伤，常导致神经元的死亡和轴突不可逆性退化，再生困难，众多的试验性研究用来促进损伤的神经元存活和轴突再生。视神经、视网膜是脑的衍生物，属于CNS的一部分，视神经由视网膜节细胞（RGCs）的轴突组成。因为RGCs的胞体和有髓轴突可以分开处理，全视网膜平铺技术便于研究、分析整个视网膜中的节细胞，所以视网膜和视神经是广泛应用于CNS再生研究的方便而实用的模型。 周围神经移植被认为是促进视神经再生的有效方法之一，但异体移植物引起的免疫排斥反应不可避免，自体移植则移植物来源困难。冻融的周围神经丧失了所有活性细胞，仅保留了基本板层结构，具有较低的免疫元性，可为神经元损伤后轴突再生提供利于生长的支架，并作为容纳其它移植细胞或因子的载体，具有异体移植修复神经损伤的潜在临床意义。嗅鞘细胞（OECs）是正

苏颖^[9]（2006）在《重组腺相关病毒介导NgR～（DN）基因促进视神经损伤后再生的实验研究》文中认为与周围神经系统不同，成年哺乳动物的中枢神经系统（central nervous system，CNS）损伤后不能成功再生，造成的功能缺失也是不可逆的。视神经作为中枢神经系统的一部分，高眼压、炎性病变、创伤、缺血及肿瘤压迫等均能严重损伤视神经，造成视力严重丧失，预后不良。视神经损伤后的再生修复一直是困扰医学界的世界性难题。在神经科学领域，使受损的视神经修复再生，牵涉到中枢神经再生以及神经活动基本过程和神经损伤的一系列重要问题。因此，加强视神经损伤后修复的研究，对于视神经损伤的治疗乃至中枢神经系统损伤后的治疗具有极其重要的意义。 鼻、眼由于解剖的相关性，在外伤、炎症、肿瘤等疾病的发生、发展和转归紧密联系，形成一门新兴的边缘学科：鼻眼相关外科学。国内学者卜国铉、韩德民、王继群等对该领域进行较为深入的研究。鼻腔、鼻窦与眼眶在解剖结构上有着细微而复杂的毗邻关系。在构成上眼眶包括在额骨、颧骨、筛骨、蝶骨等颅面骨，而且骨壁相对较薄如纸板样。额骨、筛骨、蝶骨同时又是构成鼻腔和鼻窦的主要颅面骨，如筛窦外侧壁约80％为眼眶的内侧壁，后筛及蝶窦又与眶尖及视神经关系密切。此部位病变如筛、蝶窦骨折、炎症、囊肿及肿瘤等极易累及到视神

游思维,郑拱秋,叶嘉勋,苏国辉^[10]（2003）在《MK-801和L-NA对成年仓鼠视网膜节细胞轴突损伤后存活与再生的影响》文中研究表明目的 研究NMDA受体阻断剂MK 80 1和一氧化氮合酶抑制剂L NA对成年仓鼠视网膜节细胞 （下称节细胞 ）轴突切断后存活和再生的影响。 方法 切断动物左侧视神经后分两组 :存活组存活 2、7或 14d ;再生组视神经眶侧断端同一段坐骨神经吻合后存活 2 8d。所有实验动物自视神经切断前 1d开始 ,每日接受腹腔注射MK 80 1和 或L NA直至处死。 结果 存活节细胞均数在MK 80 1组与对照组间无显着性差异 ,但L NA组在术后 2和 7d节细胞数较对照组显着增加 ,合用MK 80 1 L NA较单用MK 80 1或L NA使更多节细胞存活。而MK 80 1或L NA对节细胞轴突在周围神经移植物内的再生均无明显作用。 结论 1mg/kg剂量的MK 80 1对节细胞的存活无明显作用 ,但同时阻断NMDA受体和抑制一氧化氮合酶比单纯抑制一氧化氮合酶对节细胞有更强的神经保护作用。 1 0mg/kgMK 80 1或 4 5mg/kgL NA对节细胞轴突的再生无明显促进作用。

二、轴突损伤距离对成年金黄地鼠视网膜节细胞轴突在正常或预先溃变周围神经移植物中再生的影响（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、轴突损伤距离对成年金黄地鼠视网膜节细胞轴突在正常或预先溃变周围神经移植物中再生的影响（论文提纲范文）

（1）NF-κB/STAT3信号通路调控成年神经元的轴突再生及相互关系（论文提纲范文）

（2）黄芪甲苷对视网膜节细胞存活和再生的影响（论文提纲范文）

（3）嗅鞘细胞移植和锂剂对损伤视网膜节细胞的修复作用（论文提纲范文）

（4）视网膜Nogo氨基末端信号通路的初步研究（论文提纲范文）

（5）LEDGFp52对大鼠视网膜神经节细胞作用研究（论文提纲范文）

（7）神经干细胞移植治疗视神经损伤的实验研究（论文提纲范文）

（8）嗅鞘细胞在冻融的周围神经移植物中的存活及对成年大鼠视神经损伤后再生的影响（论文提纲范文）

（9）重组腺相关病毒介导NgR～（DN）基因促进视神经损伤后再生的实验研究（论文提纲范文）

（10）MK-801和L-NA对成年仓鼠视网膜节细胞轴突损伤后存活与再生的影响（论文提纲范文）

四、轴突损伤距离对成年金黄地鼠视网膜节细胞轴突在正常或预先溃变周围神经移植物中再生的影响（论文参考文献）

• [1]NF-κB/STAT3信号通路调控成年神经元的轴突再生及相互关系[D]. 齐士斌. 苏州大学, 2020(02)
• [2]黄芪甲苷对视网膜节细胞存活和再生的影响[D]. 王能. 蚌埠医学院, 2013(S1)
• [3]嗅鞘细胞移植和锂剂对损伤视网膜节细胞的修复作用[D]. 武明媚. 第四军医大学, 2012(01)
• [4]视网膜Nogo氨基末端信号通路的初步研究[D]. 尹小磊. 第三军医大学, 2010(12)
• [5]LEDGFp52对大鼠视网膜神经节细胞作用研究[D]. 赵海生. 第三军医大学, 2007(03)
• [6]移植含嗅鞘细胞和体外溃变的周围神经对成年大鼠视网膜神经节细胞轴突再生作用的比较[J]. 武明媚,罗娜,杨浩,焦西英,游思维. 中华眼底病杂志, 2007(02)
• [7]神经干细胞移植治疗视神经损伤的实验研究[D]. 柳浩然. 中南大学, 2006(01)
• [8]嗅鞘细胞在冻融的周围神经移植物中的存活及对成年大鼠视神经损伤后再生的影响[D]. 焦文文. 第四军医大学, 2006(12)
• [9]重组腺相关病毒介导NgR～（DN）基因促进视神经损伤后再生的实验研究[D]. 苏颖. 暨南大学, 2006(06)
• [10]MK-801和L-NA对成年仓鼠视网膜节细胞轴突损伤后存活与再生的影响[J]. 游思维,郑拱秋,叶嘉勋,苏国辉. 解剖学报, 2003(05)

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