一、反义人类端粒酶RNA逆转录病毒载体构建及其对结直肠癌细胞的抑制作用（论文文献综述）
李洪强[1]（2021）在《利用CRISPR/Cas9技术构建永生化脐带间充质干细胞系及其MYC-AS1转基因工程化外泌体抑癌功能初探》文中进行了进一步梳理人脐带间充质干细胞（UCMSC）是一种具有多向分化潜能的多能干细胞,在组织修复和某些疾病治疗的临床应用上发挥重要作用。UCMSCs的传代次数有限,超过8代后UCMSCs的活力、分化能力均明显下降,随着传代次数的增加,细胞衰老失去其生物学特性,不便进行基因编辑。SV40 LT是来自猿猴病毒SV40的一个功能蛋白,又称SV40大T抗原。SV40 LT基因通常被随机插入基因组,用于构建永生化细胞系。构建一个永生化脐带间充质干细胞系显然对其功能研究、基因编辑及其临床应用研究具有重要意义。长非编码RNA（lncRNA）是一类缺少开放阅读框,拥有更少外显子的长度大于200 nt的非编码RNA。反义RNA是与正义链上的转录产物部分或完全互补的RNA,通过碱基互补配对特定的RNA来发挥封闭、抑制靶基因表达的功能。本实验室新近鉴定的MYC基因的长非编码反义RNAMYC-AS1可以抑制原癌基因MYC的表达,具有显着的抑癌作用。本研究利用CRISPR/Cas9技术在AAVS1基因第一外显子插入具有PGK启动子和SV40-polyA的SV40 LT基因,使MSC细胞达到永生化。并利用慢病毒构建一个具有抑癌作用的反义长非编码RNA MYC-AS1转基因的间充质干细胞系,从该细胞系的培养液中分离提取外泌体。通过处理肝癌细胞HepG2,研究表达MYC-AS1的外泌体对HepG2表型的影响,为MSC及其外泌体的基础研究和临床应用研究提供依据。主要研究结果如下:1、建立SV40 LT基因敲入的脐带间充质干细胞系本研究通过CRISPR/Cas9技术介导的同源重组将具有PGK启动子和SV40-polyA的SV40 LT基因整合到AAVS1基因的第一外显子上,使MSC达到永生化。首先,针对AAVS1基因第一外显子设计并筛选出高编辑效率的gRNA位点,构建出AAVS1-Cas9-sgRNA和同源重组质粒AAVS1-Neo-SV40。通过共转染、G418筛选和鉴定等步骤,最后得到SV40 LT基因定点敲入的MSC细胞系。结果表明,与野生型MSC相比,永生化MSC-SV40 LT细胞增殖显着加快,其定向分化特性并未改变,β-半乳糖苷酶染色显示MSC-SV40 LT细胞不发生衰老,可在体外稳定传代超过40代。其增殖能力增强,但裸鼠成瘤实验未发现其具有成瘤性。2、MSC细胞永生化对MSC细胞基因表达谱的影响为了解MSC细胞永生化对其基因表达谱的影响,我们对MSC和MSC-SV40LT细胞进行了转录组测序。结果显示,SV40 LT基因敲入后,在MSC和MSC-SV40 LT细胞之间共筛选到3088个差异基因。与MSC相比,MSC-SV40 LT细胞中上调基因1675个,下调基因1413个。GO富集结果可以看出,差异基因主要富集在细胞周期、细胞黏附、细胞分裂、DNA修复、细胞外基质组织等生物学过程中。KEGG分析说明差异基因主要富集在PI3K-AKt信号、癌症、线粒体、人乳头瘤病毒感染、细胞因子受体互作、细胞衰老、细胞周期、细胞自噬等通路。从这些差异基因中分别随机挑选3个基因和3个肿瘤相关基因FOS、SET和MYC进行验证,RT-qPCR结果与测序结果一致。肝癌HepG2细胞的3个肿瘤相关基因表达水平显着高于野生型MSC细胞和永生化MSC细胞,MSC-SV40LT细胞的增殖变快可能与这些肿瘤相关基因的表达量升高相关,但在MSC-SV40 LT细胞中这些基因上调的差异不显着,结合裸鼠体内不成瘤的结果,初步认为永生化细胞是安全的。3、MYC-AS1转基因间充质干细胞外泌体对肿瘤细胞HepG2表型的影响本研究利用慢病毒系统在永生化细胞系的基础上构建一个具有抑癌作用的反义长非编码RNAMYC-AS1转基因的间充质干细胞系,分别用细胞迁移、细胞增殖和细胞凋亡试验来观察这些MYC-AS1转基因的外泌体对肿瘤细胞HepG2表型的影响。结果显示,成功构建MYC-AS1转基因的间充质干细胞系,并在其外泌体中检测出高水平的MYC-AS1基因表达,外泌体MYC-AS1能显着抑制HepG2细胞的迁移和增殖能力,并促进细胞凋亡。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas9技术定点敲入SV40 LT基因,成功构建永生化UCMSCs细胞系,并利用慢病毒系统构建MYC-AS1转基因细胞系。研究发现该转基因细胞系的外泌体具有高水平的MYC-AS1,对肝癌细胞HepG2具有明显的抑制作用。本研究结果对hMSC及其外泌体的基础研究和临床应用研究均具有重要指导意义。
韩玮[2]（2021）在《苦豆碱通过调节miR-296-5p/STAT3轴抑制结直肠癌细胞的增殖和转移及其机制研究》文中研究表明目的:观察苦豆碱（ALO）对结直肠癌（CRC）细胞生物学行为的影响,研究苦豆碱在CRC中对miR-296-5p和转导和转录激活因子3（STAT3）的表达影响,从而进一步探讨苦豆碱抗CRC的作用及其潜在机制。方法:1.用不同浓度的ALO处理细胞,MTT法检测CRC细胞增殖。2.qRT-PCR检测不同浓度的ALO处理CRC细胞中miR-296-5p的表达。3.利用生物信息网站TargetScan V7.2对基于miRNA序列的靶基因进行预测,并采用双荧光素酶报告分析（dual-luciferase reporter assay）对预测结果进行验证。4.在室温下转染或共转染miR-296-5p mimics、过表达 STAT3 质粒、miR-296-5p inhibitor、siSTAT3,并且予以 ALO 处理。采用 qRT-PCR 检测处理后CRC细胞miR-296-5p的表达情况,Western blot检测STAT3的表达情况。5.采用细胞克隆形成实验检测ALO处理后转染的HCT116和SW480细胞增殖影响情况,使用流式细胞仪检测细胞凋亡影响情况,最后采用western-blot检测细胞凋亡蛋白相关影响情况。6.采用划痕愈合实验检测ALO对采用不同转染方案的HCT116和SW480细胞迁移影响,使用Transwell侵袭试验细胞侵袭影响。7.采用western-blot检测处理后EMT相关蛋白N-cadherin和E-cadherin的表达影响况。结果:1.采用MTT法检测,结果表明ALO对不同CRC细胞增殖具有不同程度抑制作用,并且具有剂量依耐性。其中针对不同的CRC细胞抑制作用不同,以对SW480细胞增殖的抑制作用最强,但对HCT116细胞增殖的抑制作用最弱,并且SW480细胞的IC50为 0.611mmol/L,而 HCT116 细胞的 IC50 为 1.141mmol/L。2.通过 StarBasev3.0 分析比较了结直肠腺癌和正常样本miR-296-5p,明确了 miR-296-5p再结直肠腺癌中低表达,再通过 qRT-PCR 验证了 CRC 细胞系（SW480、HCT116、HT29、SW620）内 miR-296-5p 的表达低于人肠上皮细胞HIEC,并且miR-296-5p在SW480细胞表达最高,HCT116表达最低。选择SW480细胞和HCT116细胞做为代表,经过ALO处理24h后,检测两者miR-296-5p表达,结果表明ALO能够上调SW480细胞和HCT116细胞miR-296-5p的表达,并且呈现剂量依赖性。3.采用TargetScan V7.2对miR-296-5p进行靶基因预后,结果提示STAT3是靶基因,并且目标位点位于3’-UTR。构建野生型（STAT3-WT）和突变型（STAT3-MUT）基因靶点STAT3的3’UTR-荧光素酶表达载体。对miR-296-5p表达最低的HCT116细胞行miR-296-5p mimic共转染,对miR-296-5p表达最高的SW480细胞进行miR-296-5p inhibitor共转染。双荧光素酶报告基因系统分析后,结果提示与STAT3-MUT共转染的细胞相比,miR-296-5p mimic和STAT3-WT共转染的HCT116细胞的荧光素酶活性明显抑制,而与miR-296-5p inhibitor和STAT3-WT共转染的SW480细胞的荧光素酶活性增强,从而证明STAT3是miR-296-5p靶基因。4.miR-296-5p mimics和ALO都抑制了 CRC细胞中STAT3的表达,但miR-296-5p inhibitor增强了 STAT3的表达。从而得出结论:上调MIR-296-5p和ALO处理均抑制STAT3的表达。5.上调miR-296-5p和ALO抑制了 CRC细胞的增殖以及Bcl-2的表达,但促进凋亡以及Bax表达,并且这些作用都通过过表达的STAT3逆转。实验结果表明ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控CRC细胞增殖和凋亡。6.上调miR-296-5p和ALO抑制了 CRC细胞的迁移、侵袭,并且通过过表达的STAT3逆转。实验结果表明ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控CRC细胞迁移和侵袭。7.上调miR-296-5p和ALO抑制CRC细胞的N-cadherin的表达,但促进E-cadherin的表达,这些作用可以被过表达的STAT3逆转,结果表明:ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控EMT相关蛋白的表达。结论:ALO以剂量依赖性的方式抑制CRC细胞增殖。miR-296-5p在CRC组织和细胞中低表达,ALO促进miR-296-5p的表达。STAT3是mi R-296-5p的靶基因,上调miR-296-5p和ALO均抑制STAT3的表达。ALO可以通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控CRC的增殖、凋亡、迁移、侵袭和EMT。
陈前智[3]（2020）在《AGK在结直肠癌发生发展中的作用和机制探讨》文中提出甘油酰基激酶（acylglycerol kinase,AGK）是一种脂质激酶,它催化磷脂酸和溶血磷脂酸的形成,参与磷脂的合成,也可作为细胞信号分子调节各种恶性过程,如肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭和血管生成。但AGK在结直肠癌中的作用及机制研究很少,目前也少有研究对AGK在肿瘤相关表型的作用进行深入阐述。本研究以结直肠癌患者病理标本、结直肠癌细胞系、裸鼠等为研究对象,发现AGK能够抑制结直肠癌的细胞增殖、促进其细胞衰老。在结直肠癌标本中AGK在肿瘤组织的表达量显着低于相应的癌旁正常黏膜组织。AGK稳定低表达的细胞系的细胞增殖水平明显高于对照组细胞,而其细胞衰老水平显着低于对照组,并且在体内实验中亦可得到相似结果。进一步的机制研究发现,AGK可以结合p53并使其发生磷酸化,从而抑制MDM2介导的p53泛素化降解,同时AGK也可通过PINK1/Parkin信号通路抑制p53溶酶体途径的降解,进而促进了p21的转录激活,从而影响细胞增殖及细胞衰老。本研究揭示了AGK/p53/p21轴在结直肠癌细胞中的重要作用,为肿瘤的防治策略提供了新的视角和方法。
刘晓亭[4]（2020）在《新型核酸纳米载体的设计及在肿瘤细胞成像和药物递送中的应用研究》文中研究指明目前医学水平和诊断技术得到了快速的发展,但癌症的发病率和死亡率仍然处在较高水平,是威胁人类健康和生命的重大疾病之一。癌症的早期诊断和精准治疗是决定癌症能否得到成功治愈的关键因素。近年来,肿瘤标志物的不断发现为癌症早期诊断提供了保障,细胞内肿瘤标志物种类较多,表达水平也有所差异,对于一些低表达丰度的肿瘤标志物需要建立更加灵敏的分析方法。另一方面,化学治疗作为癌症治疗的经典方法之一,但化疗通常会受到化疗药物低溶解性、强的毒副作用及耐药性等问题的制约,因此,需要开发具有特定功能的纳米载体进行化疗药物的递送。本论文致力于新型核酸纳米载体的设计及在肿瘤细胞成像和药物递送方面的应用研究。通过对目前已报道的核酸纳米载体进行总结,发现随着核酸纳米载体研究的深入,仍然存在一些不足和挑战:（1）现有的核酸纳米载体多为细胞质递送化疗药物,耐药细胞中细胞膜上过表达的外排转运体会将细胞质中的药物重新泵出细胞,降低细胞内的药物浓度,限制化疗效果,因此,如何构建药物作用位点靶向的核酸纳米载体对于提高药物的作用效果具有重要意义;（2）在应对化疗过程中出现的药物耐受性的问题上,常用的策略是利用纳米载体避开外排转运体介导的药物外排,而直接抑制外排转运体的表达是一种更根本的策略来应对药物耐受性;（3）细胞内许多肿瘤标志物的表达丰度偏低,目前多数具有细胞成像和药物递送双重功能的核酸纳米载体输出方式为1:1式,极大的限制了检测的灵敏度和药物释放,构建具有信号放大特性的核酸纳米载体来实现活细胞内肿瘤标志物的灵敏检测及药物释放是一个关键问题。基于以上问题和挑战,设计了三种新型的核酸纳米载体用于活细胞内肿瘤标志物的成像及药物递送。本文主要分为以下五章内容:第一章为绪论部分,主要分析了癌症诊断和治疗上所面临的严峻挑战,介绍了用于核酸纳米载体设计的经典核酸结构单元、金纳米颗粒,概述了核酸纳米载体在癌症诊断与治疗中的研究进展,并以此为基础总结了目前核酸纳米载体在细胞成像和药物递送上存在的问题。第二章,构建了一种内源性刺激响应核靶向的纳米载体（AuNP-mRS-DSs）用于活细胞内MRP1 mRNA的成像和药物递送。纳米载体由三部分组成:（ⅰ）金纳米颗粒（AuNP）,用于装载DNA和淬灭荧光;（ⅱ）mRNA识别序列（mRS）通过金-硫键连接到AuNP表面,用于MRP1 mRNA的特异性识别;（ⅲ）可拆卸的亚单位（DS）,由Cy5标记的DNA连接链和核仁素识别基序（含AS1411适体）杂交而成,并通过DNA连接链连接到mRS上,用于装载阿霉素（Dox）、结合核仁素及荧光信号的输出。首先,纳米载体的核仁素识别基序靶向肿瘤细胞表面过表达的核仁素,然后整个纳米载体在核仁素介导的内化作用下进入细胞。随后,mRS特异性识别过表达的MRP1 mRNA,从而释放束缚的DS,被AuNP淬灭的Cy5荧光恢复。最后,利用核仁素从细胞质到细胞核穿梭的作用,DS靶向细胞核递送Dox。细胞内荧光成像可以实现耐药细胞和非耐药细胞的区分。此外,通过荧光成像可以观察到耐药细胞中释放的可拆卸亚单位的分布。与游离阿霉素（IC50>8.00 μM）相比,将 Dox 装载到 AuNP-mRS-DSs 后对 MCF-7/ADR细胞的IC50更低为2.20 μM,这表明利用核酸纳米载体载药对耐药的乳腺癌细胞具有极好的抑制效果。该纳米载体在癌症化疗敏感性预测和耐药性的规避上具有重要意义。第三章,构建了多功能分子信标（MBs）修饰的金纳米颗粒作为纳米载体（MBs-AuNP）,用于活细胞内耐药相关mRNA的协同抑制及原位成像。MBs-AuNP由两部分构成:（ⅰ）三种特殊设计的分子信标修饰到AuNP表面,用于结合耐药相关的mRNAs,装载Dox并输出荧光信号;（ⅱ）AuNP,用于装载MBs,介导MBs进入细胞并淬灭荧光。被细胞摄取后,MBs-AuNP与三种不同的耐药相关 mRNA（MDR1 mRNA、MRP1 mRNA 和 BCRP mRNA）杂交,通过抑制mRNAs的翻译过程来减少外排蛋白的表达,同时,被AuNP淬灭的荧光团远离金纳米粒,荧光恢复,实现mRNAs的原位成像。实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白印迹结果表明,经MBs-AuNP处理后耐药肿瘤细胞内耐药相关mRNA和外排蛋白的表达均有所下降。与游离Dox相比,Dox-MBs-AuNP对HepG2/ADR（IC50:0.35 vs 1.06μM）和 MCF-7/ADR（IC50:2.78 vs>5μM）具有更好的细胞毒性。通过荧光成像分析可直接观察细胞内杂交事件并实现耐药和非耐药肿瘤细胞的区分。该纳米载体能够通过基因沉默来下调多种外排蛋白的表达,实现对沉默事件的原位监测,提供了一种从基因水平应对药物耐受性的策略。第四章,构建了一种端粒酶特异性的DNAzyme驱动的DNA walker作为纳米载体（tsDNA-AuNP）用于细胞内端粒酶的活性分析及药物递送。该纳米载体由三部分构成:（ⅰ）AuNP,用于装载DNA并淬灭荧光;（ⅱ）行走链,由端粒酶引物和含DNAzyme序列的发卡结构杂交而成,用于结合端粒酶及切割底物发卡;（ⅲ）含有DNAzyme切割位点的底物发卡,用于装载阿霉素并输出荧光信号。该纳米载体内化入胞后,端粒酶引物在端粒酶的作用下发生延伸,打开含DNAzyme序列的发卡结构,释放被封闭的DNAzyme序列,然后行走链沿着三维的轨道运动,在外加Mn2+的作用下切割含DNAzyme切割位点的底物发卡,输出荧光信号并释放阿霉素,随后进行下一轮的切割反应。该方法能够实现低至10个HeLa细胞中端粒酶活性的检测,通过荧光成像的方法能够实现肿瘤细胞和正常细胞的区分,此外,该核酸纳米载体也能够用于端粒酶抑制剂的筛选。第五章为结论部分,主要总结了本论文的创新点及前景展望。
刘啸白[5]（2019）在《PIWIL3/OIP5-AS1/miR-367-3p/CEBPA以及TDP43/SNHG12/miR-195/SOX5反馈环路调控胶质瘤细胞生物学行为的机制研究》文中认为目的:胶质母细胞瘤（Glioblastoma,GBM）是神经上皮源性肿瘤,按照WHO病理分级,GBM是恶性程度最高,侵袭性最强的恶性脑胶质瘤。尽管给予积极的手术治疗,并辅助术后放疗和化疗,GBM患者的5年生存率仍小于5%,预后很差。GBM对化疗的耐药性和放疗的抵抗性是影响疗效的重要因素。目前,研究者们从基因组学、遗传学和表观遗传学等多角度研究胶质母细胞瘤的发病机制,针对胶质母细胞瘤发病机制的研究已成为诊断和靶向治疗的关键。非编码RNAs（non-coding RNAs,ncRNAs）人类基因组中的多数基因的转录产物之一。一般分为短链非编码RNAs和长链非编码RNAs（long non-coding RNAs,lncRNAs）。其中,短链非编码RNAs主要包括microRNAs（miRNAs）、short-interfering RNAs（siRNAs）和PIWI-interacting RNAs（piRNAs）。piRNAs一般通过与Argonaute蛋白家族的亚家族,即PIWIL蛋白亚家族结合,发挥基因沉默及调控和维持种系DNA稳定的功能。LncRNAs的生物学功能主要表现在转录或者转录后水平调控基因的表达。miRNAs在基因表达调控和调节细胞功能中起重要作用。RNA结合蛋白（RBPs）是一类伴随RNA的调控代谢过程,与RNA结合的蛋白质的总称。RBPs的主要作用是介导RNA的成熟、转运、定位和翻译。RBPs普遍表达于各种肿瘤细胞中,RBPs参与对肿瘤细胞生物学行为的调控。以RBPs、多种ncRNA、转录因子和靶基因组成的以ncRNA为中心的分子调控网络参与调节多种肿瘤的发生发展。本研究第一部分首先明确PIWIL3、piR-30188、OIP5-AS1、miR-367-3p、CEBPA和TRAF4的内源性表达以及对GBM生物学行为的影响,进一步探讨上述因子之间可能的作用方式以及它们对GBM的生物学行为调节的分子机制;第二部分首先明确TDP43、SNHG12、miR-195和SOX5在胶质瘤组织和细胞中的表达,以及TDP43、SNHG12、miR-195、SOX5和Gelsolin之间的调控关系和对胶质瘤细胞生物学行为的调控作用。本研究旨在揭示胶质瘤发生发展的新的分子机制,并为GBM的治疗提供新策略。研究方法:培养人源的GBM细胞系—U87、U251细胞,正常人源星型胶质细胞,和人源胚肾细胞HEK293。胶质瘤组织样本来源于中国医科大学附属盛京医院神经外科。应用Real-time PCR和原位杂交检测piR-30188、miR-367-3p、OIP5-AS1以及SNHG12和miR-195的表达。应用Western blot方法检测PIWIL3、TRAF4、CEBPA以及TDP43、SOX5和Gelsolin在人正常脑组织、脑胶质瘤组织、人正常星型胶质细胞、人脑胶质瘤细胞的表达水平。应用CCK-8法检测细胞增殖能力。采用Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力的变化。应用流式细胞仪检测细胞凋亡能力。通过细胞转染方法构建PIWIL3、piR-30188、OIP5-AS1、miR-367-3p、TRAF4、CEBPA、TDP43、SNHG12、miR-195和SOX5过表达和/或表达沉默的细胞系。Real-time PCR方法检测PIWIL3、piR-30188、OIP5-AS1、miR-367-3p、TRAF4、CEBPA以及TDP43、SNHG12、miR-195和SOX5的表达变化。放射菌素D作用下检测RNA半衰期的变化。采用RIP方法和RNA pull-down方法检测piR-30188和PIWIL3、SNHG12和TDP43的结合作用。双荧光素酶基因报告分析系统检测piR-30188和OIP5-AS1、OIP5-AS1和miR-367-3p、SNHG12和miR-195的结合作用与结合位点。应用免疫共沉淀法检测CEBPA与TRAF4、CEBPA与PIWIL3启动子的直接结合作用,以及SOX5与Gelsolin、SOX5与SNHG12启动子的直接结合作用。裸鼠移植瘤实验检测PIWIL3、OIP5-AS1、miR-367-3p,以及TDP43、SNHG12和miR-195对裸鼠移植瘤的生长和生存时间的影响。结果:1.PIWIL3和piR-30188在胶质瘤组织和细胞中低表达,过表达PIWIL3以及过表达piR-30188分别显着抑制U87和U251胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。2.OIP5-AS1在胶质瘤组织和细胞中高表达,沉默OIP5-AS1的表达显着抑制胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。3.与单独应用过表达PIWIL3、过表达piR-30188和沉默OIP5-AS1的表达组相比,三者联合应用组显着抑制胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。4.过表达PIWIL3以及过表达piR-30188分别显着抑制OIP5-AS1的表达,双过表达PIWIL3和piR-30188显着抑制OIP5-AS1的表达。5.PIWIL3与piR-30188存在靶向结合作用。6.OIP5-AS1与piR-30188存在靶向结合作用。7.miR-367-3p在胶质瘤组织和细胞中低表达,上调miR-367-3p的表达显着抑制胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡;沉默miR-367-3p的表达显着增加胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,抑制细胞凋亡。8.过表达PIWIL3、过表达piR-30188和沉默OIP5-AS1的表达分别显着增加胶质瘤细胞的miR-367-3p的表达;与单独应用过表达PIWIL3、过表达piR-30188和沉默OIP5-AS1的表达组相比,三者联合应用显着增加miR-367-3p的表达。9.过表达miR-367-3p显着降低胶质瘤细胞中OIP5-AS1的表达;沉默miR-367-3p的表达显着增加OIP5-AS1的表达。10.OIP5-AS1与miR-367-3p存在靶向结合作用,并存在于RISC复合体中。11.过表达PIWIL3、过表达piR-30188和沉默OIP5-AS1的表达分别显着抑制胶质瘤细胞CEBPA和TRAF4的蛋白表达;与单独应用过表达PIWIL3、过表达piR-30188和沉默OIP5-AS1的表达组相比,三者联合应用显着抑制CEBPA和TRAF4的蛋白表达。12.过表达miR-367-3p显着降低胶质瘤细胞的CEBPA的mRNA和蛋白的表达,沉默miR-367-3p的表达显着增加CEBPA的mRNA和蛋白的表达。13.过表达miR-367-3p显着降低胶质瘤细胞的TRAF4的蛋白表达,沉默miR-367-3p的表达显着增加TRAF4的蛋白表达。14.miR-367-3p与CEBPA的3,UTR区存在靶向结合作用,miR-367-3p通过作用于CEBPA的3,UTR调节胶质瘤细胞的增殖,凋亡,迁移和侵袭能力。15.CEBPA在人脑胶质瘤组织和细胞中高表达,沉默CEBPA的表达显着抑制胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。16.沉默OIP5-AS1的表达联合过表达miR-367-3p显着降低胶质瘤细胞的CEBPA的表达,降低细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡;而双沉默OIP5-AS1和miR-367-3p的表达,未明显改变胶质瘤细胞中CEBPA的表达,未对胶质瘤细胞的增殖,凋亡,迁移和侵袭能力产生有统计学意义的作用。17.TRAF4在人脑胶质瘤组织和细胞中高表达,沉默TRAF4的表达显着抑制胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。18.沉默CEBPA的表达显着降低胶质瘤细胞中TRAF4的mRNA和蛋白表达。19.CEBPA与TRAF4的启动子直接结合。20.沉默CEBPA显着降低PIWIL3的mRNA和蛋白表达,CEBPA与PIWIL3的启动子直接结合。21.单独过表达PIWIL3、沉默OIP5-AS1以及过表达miR-367-3p,均显着抑制了U87和U251裸鼠移植瘤的生长,并延长了裸鼠的生存期。与单独过表达PIWIL3、沉默OIP5-AS1以及过表达miR-367-3p组相比,三者联合应用组显着抑制了裸鼠移植瘤的生长,并显着延长了裸鼠的生存期。22.TDP43和SNHG12在胶质瘤组织和细胞高表达,SNHG12存在于胶质瘤细胞的细胞核和细胞浆中。沉默TDP43的表达,以及沉默SNHG12的表达分别显着抑制U87和U251胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。与单独沉默TDP43或SNHG12的表达组相比,双沉默TDP43和SNHG12的表达显着抑制胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。23.TDP43与SNHG12存在靶向结合作用。24.沉默TDP43的表达显着减少了SNHG12的半衰期。25.miR-195在胶质瘤细胞中低表达,miR-195存在于胶质瘤细胞的细胞核和细胞浆中。过表达miR-195显着抑制胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡;而沉默miR-195的表达显着增加胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,抑制细胞凋亡。26.沉默TDP43的表达,以及沉默SNHG12的表达显着增加胶质瘤细胞中miR-195的表达,与单独沉默TDP43的表达或沉默SNHG12的表达组相比,双沉默TDP43和SNHG12的表达显着增加胶质瘤细胞中miR-195的表达。27.过表达miR-195显着抑制胶质瘤细胞中SNHG12的表达,沉默miR-195的表达显着增加SNHG12的表达。28.SNHG12与miR-195存在靶向结合作用,二者结合于RISC复合体中。29.沉默SNHG12的表达联合过表达miR-195显着抑制胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡;而双沉默SNHG12与miR-195未对胶质瘤细胞的增殖,凋亡,迁移和侵袭产生有统计学意义的作用。30.SOX5在胶质瘤组织和细胞中高表达,沉默SOX5的表达显着抑制胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。31.单独沉默TDP43或SNHG12的表达显着降低SOX5的蛋白表达;与单独沉默TDP43或SNHG12的表达组相比,双沉默TDP43和SNHG12的表达显着降低SOX5的蛋白表达。32.过表达miR-195显着降低SOX5的蛋白表达;沉默miR-195的表达显着增加SOX5的蛋白表达。沉默SNHG12的表达联合过表达miR-195显着降低SOX5的蛋白表达;而双沉默SNHG12和miR-195则未对SOX5的蛋白表达产生有统计学意义的作用。33.miR-195与SOX5的3,UTR区存在靶向结合作用。miR-195通过结合SOX5的3,UTR区调节胶质瘤细胞的增殖,凋亡,迁移和侵袭能力。34.沉默SNHG12的表达、过表达miR-195分别显着降低胶质瘤细胞中Gelsolin的蛋白表达,沉默miR-195显着增加Gelsolin的蛋白表达;沉默SNHG12的表达联合过表达miR-195显着降低胶质瘤细胞中Gelsolin的蛋白表达,而双沉默SNHG12和miR-195的表达未明显改变胶质瘤细胞中Gelsolin的蛋白表达。35.沉默SOX5的表达显着降低胶质瘤细胞中Gelsolin的蛋白表达;沉默miR-195的表达显着增加胶质瘤细胞中Gelsolin的蛋白表达,双沉默miR-195和SOX5的表达未明显改变胶质瘤细胞中Gelsolin的蛋白表达。36.SOX分别与Gelsolin的启动子区和SNHG12的启动子区结合。37.过表达SOX5显着增加SNHG12的表达,而沉默SOX5的表达则显着降低SNHG12的表达。38.单独沉默TDP43的表达,沉默SNHG12的表达,以及过表达miR-195,均显着抑制了U87和U251裸鼠移植瘤的生长,并延长裸鼠的生存期。与单独沉默TDP43的表达,沉默SNHG12的表达,以及过表达miR-195组相比,三者联合应用组显着抑制了裸鼠移植瘤的生长,并显着延长了裸鼠的生存期。结论:1.piR-30188通过结合PIWIL3,发挥抑制胶质瘤细胞的恶性生物学行为的作用。piR-30188靶向结合OIP5-AS1,并负性调控其表达,调节胶质瘤细胞的生物学行为。2.OIP5-AS1靶向结合miR-367-3p,并负性调控其表达,发挥促进胶质瘤细胞的恶性生物学行为的作用。3.miR-367-3p靶向结合CEBPA的3,UTR区,发挥抑制胶质瘤细胞的恶性生物学行为的作用。4.CEBPA与TRAF4的启动子区结合,正性调控其转录,发挥促进胶质瘤细胞的恶性生物学行为的作用。5.CEBPA与PIWIL3的启动子区结合。6.PIWIL3/piR-30188/OIP5-AS1/miR-367-3p/CEBPA反馈环路在调节胶质瘤细胞生物学行为中发挥重要作用。7.TDP43靶向结合SNHG12,并增加其稳定性,上调其表达,发挥促进胶质瘤细胞的恶性生物学行为的作用。8.SNHG12靶向结合miR-195,并负性调控其表达,发挥促进胶质瘤细胞的恶性生物学行为的作用。9.miR-195靶向结合SOX5的3,UTR区,发挥抑制胶质瘤细胞的恶性生物学行为的作用。10.SOX5与Gelsolin的启动子区结合,正性调控其转录,发挥促进胶质瘤细胞的恶性生物学行为的作用。11.SOX5与SNHG12的启动子区结合,形成正反馈环路,调节胶质瘤细胞的生物学行为。12.TDP43/SNHG12/miR-195/SOX5反馈环路在调节胶质瘤细胞生物学行为中发挥重要作用。
宋扬,徐韬,杨明坤,盛伟斌[6]（2014）在《靶向端粒酶反转录酶基因短发夹RNA载体的构建》文中进行了进一步梳理背景:端粒酶反转录酶对端粒酶活化起重要作用。目的:利用pLentilox3.7.U6载体构建靶向大鼠脊髓星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的短发夹RNA干扰分子表达载体并鉴定其作用。方法:选择端粒酶反转录酶基因上两段序列体外合成RNA干扰分子的正义链和反义链模板序列,经退火成互补双链,与线性化pLentilox3.7.U6载体连接、转化大肠杆菌和序列测定,应用蛋白质印迹和免疫荧光技术,在体外培养的大鼠脊髓星形胶质细胞模型上验证构建的干扰载体抑制端粒酶反转录酶基因表达的效果。结果与结论:蛋白质印迹和免疫荧光检测结果表明,重组质粒干扰组中星形胶质细胞端粒酶反转录酶均呈低表达。结果证实,实验成功构建了针对大鼠脊髓星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的短发夹RNA质粒表达载体,此载体能有效抑制体外培养的大鼠脊髓星形胶质细胞端粒酶反转录酶的表达。
李宝玉[7]（2013）在《hTERT启动子调控腺相关病毒介导的PE38KDEL基因治疗胰腺癌的实验研究》文中进行了进一步梳理目的：人胰腺癌是临床常见高度恶性肿瘤之一,手术可切除率低,术后5年生存率不足5%；而在不可切除的病例中,化疗和放疗副反应大,且不能提高患者生存期。因此,提高治疗效果,探索胰腺癌的基因治疗有重要意义。自杀基因的靶向性及载体是限制基因治疗的瓶颈。本研究通过构建hTERT启动子调控的,腺相关病毒介导的PE38KDEL基因载体,体外观察对人胰腺癌细胞蛋白合成和诱导凋亡,体内观察对裸鼠移植瘤生长抑制情况。方法：1、hTERT启动子调控腺相关病毒介导的PE38KDEL基因载体的构建；提取人基因组DNA, PCR扩增人hTERT启动子,插入载体质粒pAAV-hrGFP的CMV启动子前方Mlu Ⅰ单克隆位点,构建成质粒pAAV-hTERT-hrGFP,通过测序选择人hTERT启动子片段正向插入的质粒pAAV-hTERT-hrGFP;通过基因合成PE38KDEL片段,然后插入pAAV-hTERT-hrGFP的hTERT启动子尾部Xba Ⅰ和Mun Ⅰ位点,构建成质粒pAAV-hTERT-PE38KDEL-hrGFP;利用磷酸钙共沉淀法将载体质粒PAAV-hTERT-PE38KDEL-hrGFP和辅助质粒pAAV-RC、pHelper共转染HEK293细胞,“氯仿处理·-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提”三步法浓缩和纯化rAAV, SDS-PAGE法检测病毒的纯度,电镜观察病毒形态和ELISA法测定病毒滴度。2体外实验：将实验分成3组：空白对照组、空病毒组和pAAV-hTERT-PE38KDEL-hrGFP组。rAAV均是以1×106v.p/ce11转染MiaPaCa2人胰腺癌细胞,用及WI-38人胚肺成纤维细胞,观察绿色荧光表达情况,检测hTERT启动子的肿瘤特异性。利用亮氨酸掺入法、caspase活性测定法、Real-Time PCR法、ELISA法、TUNEL法、MTT法分别观察病毒对人胰腺癌细胞蛋白合成、细胞凋亡、细胞增殖的影响。Western Blot法检测caspase-3,-8,-9,Bcl-2,Mcl-1,Bcl-XL的变化,初步探索PE38KDEL基因诱导细胞凋亡的机制。3、体内实验：构建将对数生长期的MiaPaCa2人胰腺癌细胞以5.0×106个接种于12只裸鼠背部皮下建立裸鼠肿瘤移植模型。通过尾静脉注射或瘤内注射方法,观察病毒载体对移植瘤生长的影响,30天后处死荷瘤裸鼠,取下肿瘤标本,备常规HE染色观察各组肿瘤细胞病理学坏死的表现；通过TUNEL方法检测肿瘤细胞中的凋亡情况；通过western blot检测PE38KDEL的表达。结果：1、构建的质粒pAAV-hTERT-hrGFP、pAAV-hTERT-PE83KEL-hrGFP通过酶切及测序鉴定结果是正确；包装的rAAV经电镜检测形态正常,SDS-PAGE法检测病毒的纯度高,ELISA法检测滴度达1.2×1012v.p/ml。2、体外实验：本实验构建的病毒转染人胰腺癌细胞MiaPaCa2和人胚肺成纤维细胞WI-38后,荧光镜下观察绿色荧光蛋白表达情况发现,MiaPaCa2人胰腺癌细胞中荧光蛋白的表达率为44.2%,WI-38人胚肺成纤维细胞中荧光蛋白表达率<5%。病毒转染后24小时,细胞蛋白合成90%受到抑制,伴随细胞活性下降。MTT方法检测发现,病毒转染后24h、48h、72h,MiaPaCa2人胰腺癌细胞凋亡率分别为：25.2%,37.4%,58.3%。caspase活性测定及Western blot检测发现病毒转染后72小时,caspase-3,-8,-9分别被激活,伴随抗凋亡蛋白Mcl-1的显着降低。3、体内实验：从肿瘤的生长曲线图中,我们发现,空白对照组与空载病毒组之间未发现有显着性差异,实验组能显着抑制肿瘤的生长。显微镜下观察实验组细胞出现明显的凋亡,且凋亡区域的面积要大于对照组。此外,western blot检测到了PE38KDEL的表达。结论1.成功构建了hTERT启动子调控腺相关病毒介导的PE38KDEL基因表达载体,为体内外试验奠定了基础。2.体外实验表明,hTERT启动子能特异性调控PE38KDEL及GFP在端粒酶阳性的MiaPaCa2人胰腺癌细胞中特异性表达;rAAV-hTERT-PE38KDEL-hrGFP能抑制MiaPaCa2人胰腺癌细胞蛋白合成及诱导其凋亡,其诱导凋亡的机制为激活caspase-3,-8,-9和抑制抗凋亡蛋白Mcl-1。3.体内实验表明,rAAV-hTERT-PE38KDEL-hrGFP能显着抑制裸鼠皮下移植瘤生长,其机制为抑制蛋白合成和诱导细胞凋亡,在MiaPaCa2人胰腺癌细胞中检测到了PE38KDEL蛋白的表达。
徐广甍[8]（2012）在《慢病毒介导的RNAi沉默HMGA2基因表达对人结肠癌HCT116细胞生物学行为的影响》文中进行了进一步梳理HMGA2基因是HMGA基因家族（包括HMGA1和HMGA2）成员，编码含109个AA的完整蛋白产物，可通过其特有的三个AT钩结构结合到众多基因DNA上的AT富集区域，通过改变这些被调节基因DNA构象，增强它们的转录活性。大量研究显示HMGA2在多种恶性肿瘤的演进过程中起重要作用，参与调控肿瘤细胞增殖、周期、转移等生物学行为，显示出HMGA2对恶性肿瘤疾病具有重要的研究价值，同时也是一个基因治疗的良好靶点。但目前对HMGA2在结直肠癌演进过程中所起的确切作用，尚缺乏研究。RNAi通过对目的基因的表达在转录后水平上进行阻断，使其功能部分或完全丧失，现已成为一种强有力的工具被广泛应用于对基因功能及肿瘤治疗的研究中。慢病毒介导的RNAi是目前最为有效的一种沉默目的基因表达的方法，可达到高水平的沉默效率，并能维持较长时间的对目的基因的沉默影响，得到普遍的应用。本实验通过免疫组化染色方法对HMGA2在人结肠癌组织中的表达情况及其与临床病理特征间关系进行了研究，结果显示结直肠癌组织中存在着HMGA2的异常表达，并且表达程度与远处转移呈正相关，显示HMGA2可能在结直肠癌侵袭及转移过程中具有重要的调控作用。在此基础上，我们设计针对HMGA2的siRNA序列并构建HMGA2shRNA慢病毒表达载体，成功包装成病毒感染高表达HMGA2的结肠癌HCT116细胞，将HCT116细胞中HMGA2的表达沉默。通过研究沉默HMGA2表达后HCT116细胞生物学行为的改变，发现HMGA2可促进结直肠癌的增殖、调控细胞周期进程、促进肿瘤细胞的侵袭。本研究为进一步深入研究HMGA2基因在结直肠癌演进过程中作用机制及应用HMGA2作为基因治疗靶点提供理论依据。
蔡艳玲[9]（2011）在《RNAi靶向人端粒酶逆转录酶基因治疗大肠癌的实验研究》文中研究表明目的构建含有小发夹RNA （shRNA）的针对hTERT基因的重组真核质粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT-shRNA,并探讨RNA干扰人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase, hTERT）的表达对大肠癌SW480细胞凋亡的影响。方法设计合成3条针对hTERT基因的siRNA,将筛选出最有效的siRNA合成shRNA寡核苷酸片段插入到真核质粒pGPU6/GFP/Neo中,进行酶切和测序鉴定。将构建好的重组真核质粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT-shRNA,采用脂质体法转染人大肠癌SW480细胞。在荧光显微镜下观察细胞转染效率及细胞形态学变化。RT-PCR法检测不同转染时间SW480细胞中hTERTmRNA的表达水平。TRAP-PCR-ELISA法检测转染48小时后SW480细胞的端粒酶活性。免疫组化法检测SW480细胞中hTERT蛋白的表达。流式细胞仪检测转染后细胞周期分布。TUNEL法检测转染后细胞凋亡状况。激光共聚焦显微镜观察细胞线粒体跨膜电位（MMP）的变化。透射电镜观察转染后细胞超微结构。结果将筛选出干扰效率较好的的siRNA序列合成shRNA片段后,将其成功插入质粒pGPU6/GFP/Neo中,构成重组真核质粒pGPU6/GFP/ Neo-hTERT-shRNA。SW480细胞以质粒与脂质体比例为1：2.5、转染48h时的转染效率较高,其转染率达59%。RT-PCR结果显示,hTERT-shRNA组的hTERTmRNA表达水平在转染48h时降低较明显,与空白组、脂质体组、NC-shRNA组比较,抑制率分别是39.20%,33.28%,27.95%。TRAP-PCR-ELISA结果示,hTERT-shRNA组SW480细胞端粒酶活性显着降低18.7%,与其它三组比较,差别均有统计学意义（P<0.05）。免疫组化结果示,hTERT-shRNA组被染色的阳性细胞明显少于其他组,经病理图像分析软件分析灰度值后得出,转染48h后hTERT-shRNA组与空白组比较,差异有明显统计学意义（P<0.05）,同时与脂质体组和NC-shRNA组比较,差异均有统计学意义（P<0.01）。流式细胞仪结果示,hTERT-shRNA组G0/G1期细胞显着增加,S期细胞减少,提示hTERT-shRNA质粒转染SW480细胞后,使进入静止状态的细胞增多,细胞增殖指数下降约14.2%,与NC-shRNA组比较,差别有显着统计学意义（P<0.05）。TUNEL结果示,与其他组比较,hTERT-shRNA组凋亡细胞数显着增多,凋亡指数为21.5%,明显比其他组增高,差异有统计学意义（P<0.01）。激光共聚焦显微镜观察结果,hTERT-shRNA组可见多个含有核分裂相的细胞,细胞Rh123荧光强度明显增强,MMP显着下降,与其他组比较,差异有统计学意义（P<0.01）。透射电镜观察结果示,SW480细胞体积明显缩小,表面突起及微绒毛减少,甚至消失,细胞核固缩,染色质不均匀地沿核膜下聚集,空泡增多。结论成功构建了针对hTERT基因的重组真核表达质粒pGPU6/GF P/Neo-hTERT-shRNA。它能有效沉默hTERT基因,因而能有效抑制人大肠癌SW480细胞增殖生长,降低端粒酶活性,最终促使肿瘤细胞凋亡。目的研究靶向hTERT基因的重组质粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT-shRNA对人大肠癌SW480细胞裸鼠移植瘤的治疗作用。方法于裸鼠右侧腋下皮下注射人大肠癌SW480细胞建立大肠癌移植瘤动物模型,待肿瘤长到一定大小时,随机分为生理盐水组（NS组）、NC-shRNA组和hTERT-shRNA组。各组连续进行相应治疗6次后,观察肿瘤的生长状况,测量肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线,HE染色观察肿瘤组织细胞形态学变化,免疫组化法检测移植瘤组织中hTERT蛋白的表达,TUNEL法检测肿瘤组织中细胞凋亡情况,RT-PCR法检测瘤组织中hTERTmRNA的表达,PCR-TRAP-ELISA法检测肿瘤组织的端粒酶活性。结果所有裸鼠在接种SW480细胞第14天后,皮下肿瘤结节直径达5-7mm,成功构建了裸鼠移植瘤模型,成瘤率为100%。荷瘤裸鼠开始治疗后,hTERT-shRNA组瘤体积增长速度慢于NS组和NC-ShRNA组,并于第18天开始明显减慢。HE染结果示,hTERT-shRNA组肿瘤组织出现局部坏死区,瘤组织细胞形态发生明显改变。免疫组化法检测结果示,hTERT-shRNA组肿瘤组织中hTERT蛋白表达水平下降,可见少量hTERT蛋白阳性细胞,细胞呈浅棕色。TUNEL法检测结果示,hTERT-shRNA组凋亡细胞数明显增多,细胞分布密集,与NS组和NC-shRNA组比较,凋亡指数分别增加29.4%和31.1%,差异有显着统计学意义（P<0.01）；RT-PCR法检测结果示,hTERT-shRNA组hTERT mRNA表达水平较NS组和NC-shRNA组分别下降52.1%和48.3%,差异具有显着性意义（P<0.01）。PCR-TRAP-ELISA法检测结果示,hTERT-shRNA组与NS组和NC-shRNA组比较,端粒酶活性降低较明显,抑制率分别为48.5%和53.0%,差异有统计学意义（P<0.05）。结论重组质粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT-shRNA通过下调hTERTmRNA和hTERT蛋白的表达,促进肿瘤细胞的凋亡,从而抑制大肠癌移植瘤的生长。
王宏芳[10]（2011）在《CRAd.pEgr1-Smac联合照射对MDA-MB-231肿瘤细胞的抑制效应》文中研究指明放射治疗是肿瘤治疗的重要的手段之一,但由于肿瘤临近部位正常组织的放射损伤和某些肿瘤的辐射抗拒性等问题,严重地影响着放疗的疗效和应用。肿瘤基因治疗是近年来新兴的一种肿瘤治疗技术,为肿瘤的彻底治愈带来了可能,但由于基因转导系统的低靶向性和治疗基因表达的不可控性,使基因治疗这把双刃剑尚不能替代传统的肿瘤治疗方法。肿瘤作为一种全身性疾病,其发生发展是一多因素、多步骤和多阶段的复杂过程,单一疗法往往难以取得满意疗效,肿瘤的综合治疗势在必行。肿瘤基因-放射治疗的提出为弥补放射治疗与基因治疗各自的弊端带来了可能,通过将辐射诱导性基因的调控序列与肿瘤杀伤基因相偶联,转染或感染肿瘤细胞后,在对肿瘤实施局部放疗的同时诱导肿瘤杀伤基因表达的增强,产生辐射和基因表达产物的协同抑瘤作用。该疗法一方面将放疗与基因治疗有机地结合,发挥协同作用；另一方面,由于辐射具有靶向性和可控性,实现了对杀伤基因表达的时空调控。利用具有肿瘤细胞靶向性的条件复制型腺病毒作为基因治疗的载体,提高治疗基因对肿瘤细胞的靶向性；利用Egr-1启动子在电离辐射诱导下可启动其下游基因表达的特性,提高治疗基因表达的可控性。本实验构建了对肿瘤细胞具有双重靶向的重组腺病毒质粒pAd.Egr1-Smac-hTert-E1A（CR2）-E1Bp-E1B55K,并在HEK293细胞内包装成携带Egr-1启动子和Smac基因的条件复制型腺病毒CRAd.pEgr1-Smac,研究其在x射线诱导下对MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响,以及CRAd.pEgr1-Smac联合照射对MDA-MB-231细胞中凋亡相关基因mRNA及蛋白水平表达的影响,探讨其抗肿瘤作用机制。实验结果表明,CRAd.pEgrl-Smac联合照射对MDA-MB-231细胞具有明显的增殖抑制和促凋亡作用,同时伴有细胞中Smac、Cyt c、caspase-9和-3 mRNA及其蛋白表达增高。这些结果提示,CRAd.pEgr1-Smac联合照射抑制MDA-MB-231肿瘤细胞增殖的促凋亡机制,涉及线粒体途径的Smac、Cyt c、caspase-9和-3的相互作用。本研究为提高肿瘤基因治疗靶向性、可控性及放射治疗的有效性,将基因-放射治疗有机地联合应用,为肿瘤基因-放射治疗的临床应用提供实验依据,为肿瘤综合治疗提供了新的思路。
二、反义人类端粒酶RNA逆转录病毒载体构建及其对结直肠癌细胞的抑制作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、反义人类端粒酶RNA逆转录病毒载体构建及其对结直肠癌细胞的抑制作用（论文提纲范文）
（1）利用CRISPR/Cas9技术构建永生化脐带间充质干细胞系及其MYC-AS1转基因工程化外泌体抑癌功能初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 脐带间充质干细胞 |
| 1.1.1 脐带间充质干细胞简介 |
| 1.1.2 脐带间充质干细胞的应用 |
| 1.2 CRISPR/Cas系统 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas系统起源 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas系统分类 |
| 1.2.3 CRISPR/Cas系统的作用机制 |
| 1.2.4 CRISPR/Cas9系统的应用 |
| 1.3 细胞永生化 |
| 1.3.1 永生化 |
| 1.3.2 永生化的方法 |
| 1.4 外泌体 |
| 1.4.1 外泌体简介 |
| 1.4.2 外泌体分离与纯化 |
| 1.4.3 脐带间充质干细胞来源的外泌体 |
| 1.4.4 脐带间充质干细胞来源的外泌体的临床应用 |
| 1.5 反义RNA |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 第二章 利用CRISPR/Cas9技术敲入SV40LT基因构建永生化脐带间充质干细胞系 |
| 前言 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞及质粒载体 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 AAVS1-Cas9-sgRNA载体构建与筛选 |
| 2.2.2 同源重组载体的构建 |
| 2.2.3 MSC细胞药筛浓度测定 |
| 2.2.4 细胞转染 |
| 2.2.5 单克隆细胞株筛选 |
| 2.2.6 筛选细胞株基因型鉴定 |
| 2.2.7 Western blot鉴定大T抗原蛋白的表达 |
| 2.2.8 β-半乳糖苷酶染色 |
| 2.2.9 流式细胞仪检测表面抗原 |
| 2.2.10 诱导分化实验 |
| 2.2.11 CCK-8法检测细胞生长曲线 |
| 2.2.12 克隆形成实验 |
| 2.2.13 裸鼠成瘤 |
| 2.2.14 转录组高通量测序 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 成功构建AAVS1-Cas9-sgRNA载体 |
| 2.3.2 成功构建AAVS1-Neo-SV40载体 |
| 2.3.3 确定MSC细胞的抗生素筛选浓度 |
| 2.3.4 成功构建SV40基因敲入的MSC细胞系 |
| 2.3.5 β-半乳糖苷酶染色结果证实MSC细胞永生化 |
| 2.3.6 永生化脐带间充质干细胞系表面抗原鉴定 |
| 2.3.7 永生化脐带间充质干细胞系定向分化 |
| 2.3.8 间充质干细胞永生化影响细胞克隆形成 |
| 2.3.9 间充质干细胞永生化对细胞增殖影响 |
| 2.3.10 SV40 LT基因敲入对基因表达谱的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 MYC-AS1转基因间充质干细胞外泌体对HepG2肿瘤细胞表型的影响 |
| 前言 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞及质粒载体 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 慢病毒相关实验 |
| 3.2.2 外泌体的分离与鉴定 |
| 3.2.3 CCK-8法测定细胞增殖 |
| 3.2.4 伤口愈合试验 |
| 3.2.5 细胞凋亡试验 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 成功构建MYC-AS1转基因间充质干细胞 |
| 3.3.2 外泌体的分离与鉴定 |
| 3.3.3 MYC-AS1转基因间充质干细胞外泌体对肿瘤细胞表型影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位论文期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（2）苦豆碱通过调节miR-296-5p/STAT3轴抑制结直肠癌细胞的增殖和转移及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献研究 |
| 祖国医学部分 |
| 1. 祖国医学对肿瘤的认识(历史沿革) |
| 2. 祖国医学对结直肠癌的认识 |
| 2.1 祖国医学对结直肠癌疾病的认识 |
| 2.2 祖国医学对结直肠癌病因病机的认识 |
| 2.3 祖国医学对结直肠癌证型的认识 |
| 2.4 祖国医学对结直肠癌辨病、辩证治疗的认识 |
| 2.5 祖国医药抗结直肠肿瘤的优势 |
| 2.6 中药治疗结直肠癌的研究进展 |
| 3. 中药苦豆子及其成分苦豆碱的研究进展 |
| 3.1 中药苦豆子的研究进展 |
| 3.2 苦豆碱的药理学作用及其机制研究进展 |
| 现代医学部分 |
| 1 现代医学对结直肠癌病因及机制的研究 |
| 1.1 结直肠癌分子标志物 |
| 1.2 结直肠癌相关信号通路 |
| 2 microRNAs与结直肠癌的研究进展 |
| 2.1 microRNAs与结直肠癌相关机制研究 |
| 2.2 microRNAs在结直肠癌临床应用 |
| 3 结直肠癌EMT的研究进展 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一部分 ALO抑制结直肠癌细胞增殖 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞株的培养 |
| 2.2 ALO处理结直肠癌细胞 |
| 2.3 MTT实验 |
| 2.4 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 不同浓度ALO对不同结直肠癌细胞增殖的抑制作用 |
| 3.2 ALO对不同结直肠癌细胞的IC50 |
| 4. 总结 |
| 第二部分 ALO对miR-296-5p在结直肠癌细胞中表达的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 利用生物信息网站StarBasev3.0分析miR-296-5p的表达 |
| 2.3 qRT-PCR检测miR-296-5p在不同人结直肠癌细胞及人肠上皮细胞中的表达 |
| 2.4 qRT-PCR检测ALO处理后SW480和HCT116细胞miR-296-5p的表达 |
| 2.5 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 StarBasev3.0分析miR-296-5p的表达 |
| 3.2 qRT-PCR检测miR-296-5p在不同人结直肠癌细胞及人肠上皮细胞中的表达 |
| 3.3 qRT-PCR检测ALO处理后SW480和HCT116细胞miR-296-5p的表达 |
| 4. 总结 |
| 第三部分 STAT3和miR-296-5p存在结合位点 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 结直肠癌细胞(SW480、HCT116)的培养 |
| 2.2 TargetScan V7.2靶基因预测 |
| 2.3 野生型(WT)和突变型(MUT)-STAT3 3'UTR片段设计和合成 |
| 2.4 质粒的建立、提取及鉴定 |
| 2.5 细胞转染 |
| 2.6 双荧光素酶报告基因分析 |
| 2.7 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 生物信息学网站TargetScan V7.2显示STAT3是miR-296-5p的靶基因 |
| 3.2 miR-296-5p mimics能够抑制STAT3-荧光素酶活性 |
| 3.3 miR-296-5p inhibitor增强STAT3-荧光素酶活性 |
| 4. 总结 |
| 第四部分 ALO和miR-296-5p对结直肠癌细胞STAT3表达的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 结直肠癌细胞(SW480、HCT116)的培养 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 ALO处理结直肠癌细胞 |
| 2.4 qRT-PCR实验 |
| 2.5 Western blot实验 |
| 2.6 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 qRT-PCR检测miR-296-5p mimics、STAT3过表达、ALO等不同处理后HCT116细胞中miR-296-5p的表达 |
| 3.2 qRT-PCR检测miR-296-5p inhibitor、siSTAT3、ALO等处理后SW480细胞中miR-296-5p的表达 |
| 3.3 Western blot检测miR-296-5p mimics、STAT3过表达、ALO等处理后HCT116细胞中STAT3的表达 |
| 3.4 Western blot检测miR-296-5p inhibitor、siSTAT3、ALO等不同处理后SW480细胞STAT3的表达 |
| 4. 总结 |
| 第五部分 ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控结直肠癌细胞增殖和凋亡 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 结直肠癌细胞(SW480、HCT116)的培养 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 细胞克隆形成实验(Clone formation assay) |
| 2.4 细胞凋亡检测(Cell apoptosis detection) |
| 2.5 Western-blot检测细胞凋亡相关蛋白 |
| 2.6 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 克隆形成实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控HCT116细胞增殖 |
| 3.2 克隆形成实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控SW480细胞增殖 |
| 3.3 细胞凋亡实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控HCT116细胞凋亡 |
| 3.4 细胞凋亡实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控SW480细胞增殖 |
| 3.5 HCT116细胞凋亡相关蛋白的检测 |
| 3.6 SW480细胞凋亡相关蛋白的检测 |
| 4. 总结 |
| 第六部分 ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控结直肠癌细胞迁移和侵袭 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 结直肠癌细胞(SW480、HCT116)的培养 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 划痕愈合实验 |
| 2.4 Transwell细胞侵袭实验 |
| 3. 结果 |
| 3.1 划痕愈合实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控HCT116细胞迁移 |
| 3.2 划痕愈合实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控SW480细胞迁移 |
| 3.3 Transwell细胞侵袭实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控HCT116细胞侵袭 |
| 3.4 Transwell细胞侵袭实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控SW480细胞侵袭 |
| 4. 总结 |
| 第七部分 ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控EMT相关蛋白的表达 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 结直肠癌细胞(SW480、 HCT116)的培养 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 Western blot实验 |
| 3. 结果 |
| 3.1 Western blot检测HCT116细胞EMT相关蛋白N-cadherin(N-cad)和E-cadherin(E-cad)的表达 |
| 3.2 Western blot检测SW480细胞EMT相关蛋白N-cadherin (N-cad)和E-cadherin (E-cad)的表达 |
| 4. 总结 |
| 第三章 讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）AGK在结直肠癌发生发展中的作用和机制探讨（论文提纲范文）
| 全文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分:AGK 对结直肠癌细胞增殖及衰老的影响 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分:AGK 通过调控p53/p21信号轴影响细胞增殖及细胞衰老 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 细胞衰老与肿瘤的治疗策略 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录一 攻读博士期间发表期刊论文 |
| 附录二 中英文缩写对照表 |
| 附录三 常用试剂配制 |
（4）新型核酸纳米载体的设计及在肿瘤细胞成像和药物递送中的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号与缩写 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 癌症的诊断与治疗 |
| 1.1.1 癌症的诊断 |
| 1.1.2 癌症的治疗 |
| 1.1.3 癌症的诊疗一体化 |
| 1.2 经典的核酸结构单元用于设计纳米载体 |
| 1.2.1 核酸适配体 |
| 1.2.2 脱氧核酶 |
| 1.2.3 分子信标 |
| 1.2.4 双链探针 |
| 1.3 金纳米颗粒 |
| 1.3.1 金纳米颗粒的理化性质 |
| 1.3.2 金纳米颗粒分布、代谢性质和毒理研究 |
| 1.3.3 金纳米颗粒在癌症诊疗中的应用研究 |
| 1.4 核酸纳米载体在癌症诊断和治疗中的研究进展 |
| 1.4.1 具有荧光特性的核酸纳米探针用于肿瘤细胞成像 |
| 1.4.2 核酸纳米载体在药物递送中的研究 |
| 1.4.3 基于核酸纳米载体的癌症诊疗一体化研究 |
| 1.5 本论文解决的科学问题及研究内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 内源性刺激响应核靶向的纳米载体用于细胞内mRNA成像及药物递送 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂和仪器 |
| 2.2.2 凝胶电泳实验 |
| 2.2.3 金纳米颗粒(AuNPs)的合成及AuNP-mRS-DSs的制备 |
| 2.2.4 金纳米颗粒表面mRS-DS的修饰量考察 |
| 2.2.5 特异性考察 |
| 2.2.6 杂交实验 |
| 2.2.7 细胞系及细胞培养 |
| 2.2.8 细胞内荧光成像实验 |
| 2.2.9 qRT-PCR对MRP1 mRNA进行分析 |
| 2.2.10 细胞摄取 |
| 2.2.11 阿霉素插入实验 |
| 2.2.12 细胞存活率考察 |
| 2.2.13 统计学分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 DNA序列设计的可行性验证 |
| 2.3.2 AuNP-mRS-DSs的表征 |
| 2.3.3 金纳米颗粒表面mRS-DS的修饰量及AuNP-mRS-DSs的特异性考察 |
| 2.3.4 AuNP-mRS-DSs的选择性考察 |
| 2.3.5 细胞内荧光成像 |
| 2.3.6 细胞摄取 |
| 2.3.7 纳米载体的载药量考察 |
| 2.3.8 细胞存活率考察 |
| 2.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 多功能分子信标修饰的金纳米颗粒作为纳米载体用于活细胞内耐药相关mRNA的协同抑制及原位成像 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂和仪器 |
| 3.2.2 凝胶电泳实验 |
| 3.2.3 金纳米颗粒(AuNPs)的合成及MBs-AuNP的制备 |
| 3.2.4 金纳米颗粒表面分子信标的修饰量考察 |
| 3.2.5 可行性与稳定性实验 |
| 3.2.6 细胞系及细胞培养 |
| 3.2.7 细胞内荧光成像 |
| 3.2.8 MDR1 mRNA、MRP1 mRNA和BCRP mRNA的相对表达水平分析 |
| 3.2.9 Western blotting实验 |
| 3.2.10 阿霉素插入实验 |
| 3.2.11 细胞毒性实验 |
| 3.2.12 统计学分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 DNA序列设计的可行性验证 |
| 3.3.2 MBs-AuNP的表征 |
| 3.3.3 金纳米颗粒表面分子信标的修饰量考察 |
| 3.3.4 可行性及稳定性考察 |
| 3.3.5 细胞内荧光成像 |
| 3.3.6 MBs-AuNP对细胞内耐药相关mRNA和蛋白水平的影响 |
| 3.3.7 纳米载体的载药量考察 |
| 3.3.8 细胞存活率实验 |
| 3.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 端粒酶特异性的DNAzyme驱动的DNA walker作为纳米载体用于活细胞内端粒酶活性分析及药物递送 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂和仪器 |
| 4.2.2 凝胶电泳实验 |
| 4.2.3 金纳米颗粒(AuNPs)的制备 |
| 4.2.4 tsDNA-AuNP的制备及其表面底物发卡修饰量的考察 |
| 4.2.5 细胞培养及HeLa细胞提取液的制备 |
| 4.2.6 HeLa细胞提取液中端粒酶活性检测 |
| 4.2.7 tsDNA-AuNP的稳定性考察 |
| 4.2.8 细胞内端粒酶活性的成像分析 |
| 4.2.9 TERT mRNA的相对表达水平分析 |
| 4.2.10 端粒酶抑制剂的筛选 |
| 4.2.11 阿霉素插入实验 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 DNA序列设计的可行性验证 |
| 4.3.2 tsDNA-AuNP的表征 |
| 4.3.3 tsDNA-AuNP的可行性和稳定性考察 |
| 4.3.4 行走链与底物发卡修饰比例的考察 |
| 4.3.5 tsDNA-AuNP检测性能的考察 |
| 4.3.6 细胞内端粒酶活性分析的条件优化 |
| 4.3.7 不同细胞内端粒酶活性分析 |
| 4.3.8 端粒酶抑制剂的筛选 |
| 4.3.9 纳米载体的载药量考察 |
| 4.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 博士期间发表论文 |
| 附录 |
| 附件 |
（5）PIWIL3/OIP5-AS1/miR-367-3p/CEBPA以及TDP43/SNHG12/miR-195/SOX5反馈环路调控胶质瘤细胞生物学行为的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 PIWIL3/OIP5-AS1/miR-367-3p/CEBPA反馈环调控胶质瘤细胞生物学行为的机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养与传代 |
| 2.2.2 细胞冻存 |
| 2.2.3 细胞计数 |
| 2.2.4 细胞增殖实验 |
| 2.2.5 细胞迁移实验 |
| 2.2.6 细胞侵袭实验 |
| 2.2.7 细胞凋亡实验 |
| 2.2.8 Trizol法提取RNA |
| 2.2.9 Real-time PCR方法分别检测OIP5-AS1、CEBPA和 TRAF4 mRNA的表达变化 |
| 2.2.10 慢病毒载体构建和感染 |
| 2.2.11 细胞转染 |
| 2.2.12 双荧光素酶报告基因分析实验 |
| 2.2.13 RNA免疫沉淀技术(RIP) |
| 2.2.14 RNA pull-down实验 |
| 2.2.15 Western blot方法 |
| 2.2.16 染色质免疫共沉淀(ChIP)实验 |
| 2.2.17 裸鼠移植瘤实验 |
| 2.3 统计方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 在胶质瘤组织和细胞中PIWIL3和piR-30188 低表达,OIP5-AS1 高表达。过表达PIWIL3、piR-30188 以及沉默OIP5-AS1 的表达抑制胶质瘤细胞的恶性生物学行为 |
| 3.2 PIWIL3 结合piR-30188,OIP5-AS1 靶向结合piR-30188 调节胶质瘤细胞生物学行为。miR-367-3p在胶质瘤组织和细胞中低表达,miR-367-3p靶向结合OIP5-AS1 调控胶质瘤细胞的恶性生物学行为 |
| 3.3 PIWIL3、piR-30188、OIP5-AS1和miR-367-3p通过调控CEBPA和TRAF4影响胶质瘤细胞的生物学行为 |
| 3.4 沉默OIP5-AS1 的表达联合过表达miR-367-3p通过降低CEBPA和 TRAF4的表达抑制胶质瘤细胞的恶性生物学行为 |
| 3.5 CEBPA与 TRAF4 的启动子结合下调其表达,调控胶质瘤细胞的生物学行为 |
| 3.6 miR-367-3p靶向结合CEBPA的3’UTR区,调控胶质瘤细胞的生物学行为 |
| 3.7 CEBPA与 PIWIL3 的启动子区直接结合 |
| 3.8 沉默OIP5-AS1 的表达与过表达PIWIL3、miR-367-3p的单独和联合应用抑制裸鼠移植瘤生长,显着延长生存期 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 TDP43/SNHG12/miR-195/SOX5 反馈环调控胶质瘤细胞生物学行为的机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 组织标本 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养与传代 |
| 2.2.2 细胞冻存 |
| 2.2.3 细胞计数 |
| 2.2.4 荧光原位杂交(FISH) |
| 2.2.5 逆转录和实时定量PCR(qRT-PCR) |
| 2.2.6 Western blot |
| 2.2.7 构建转染细胞系 |
| 2.2.8 细胞增殖实验 |
| 2.2.9 细胞迁移实验 |
| 2.2.10 细胞侵袭实验 |
| 2.2.11 细胞凋亡实验 |
| 2.2.12 双荧光素酶报告基因分析实验 |
| 2.2.13 RNA免疫沉淀技术(RIP) |
| 2.2.14 RNA pull-down实验 |
| 2.2.15 半衰期检测 |
| 2.2.16 染色质免疫共沉淀实验(ChIP) |
| 2.2.17 裸鼠移植瘤实验 |
| 2.3 统计方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 TDP43和SNHG12 在胶质瘤组织和细胞中高表达,沉默TDP43和SNHG12抑制胶质瘤细胞的恶性生物学行为,沉默TDP43 抑制SNHG12 的表达 |
| 3.2 过表达miR-195 抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,促进胶质瘤细胞凋亡 |
| 3.3 miR-195与SNHG12 靶向结合,过表达miR-195 抑制SNHG12 的表达 |
| 3.4 过表达miR-195 增强sh-SNHG12 对胶质瘤细胞恶性生物学行为的抑制作用 |
| 3.5 SOX5 在胶质瘤组织和细胞中高表达,沉默SOX5 抑制胶质瘤细胞的恶性生物学行为 |
| 3.6 miR-195 靶向结合SOX5的3'UTR并负性调控其表达 |
| 3.7 低表达SOX5 能够部分逆转沉默miR-195 的表达对胶质瘤细胞恶性生物学行为的促进作用 |
| 3.8 SOX5与Gelsolin的启动子区结合,沉默SOX5 抑制Gelsolin的表达 |
| 3.9 SOX5与SNHG12 的启动子区结合,沉默SOX5 抑制SNHG12 的表达 |
| 3.10 沉默TDP43 表达、沉默SNHG12 表达和过表达miR-195 单独以及联合应用抑制肿瘤在体内的生长并延长裸鼠生存期 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（6）靶向端粒酶反转录酶基因短发夹RNA载体的构建（论文提纲范文）
| 0 引言Introduction |
| 1 材料和方法Materials and methods |
| 2 结果Results |
| 3 讨论Discussion |
（7）hTERT启动子调控腺相关病毒介导的PE38KDEL基因治疗胰腺癌的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、hTERT启动子调控腺相关病毒介导PE38KEDL基因载体的构建及其鉴定 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 主要实验仪器 |
| 1.1.2 主要试剂及试剂盒 |
| 1.1.3 质粒 |
| 1.1.4 细菌 |
| 1.1.5 细胞 |
| 1.1.6 主要实验试剂及缓冲液的配制 |
| 1.1.7 质粒的转化 |
| 1.1.8 质粒的扩增和小量提取 |
| 1.1.9 质粒的扩增和大量提取 |
| 1.1.10 质粒DNA琼脂糖凝胶电泳 |
| 1.1.11 质粒浓度及纯度的测定 |
| 1.1.12 菌种的冻存方法 |
| 1.1.13 基因组DNA的提取 |
| 1.1.14 人hTERT启动子的扩增 |
| 1.1.15 PCR产物的检测 |
| 1.1.16 hTERT 启动子 PCR 产物的回收 |
| 1.1.17 人hTERTl启动子和pAAV-hrGFP的Mhi I酶切位点的酶切 |
| 1.1.18 人hTERT启动子和pAAV-hrGFP Mlu I酶切产物的回收 |
| 1.1.19 pAAV-hrGFPMlu I酶切回收产物的去磷酸化 |
| 1.1.20 人hTERT启动子1与pAAV-hrGFP单克隆位点的连接 |
| 1.1.21 连接产物的酶切和测序鉴定 |
| 1.1.22 质粒pAAV-hTERT-hrGFP的Xba I和Mim I酶切位点的双酶切 |
| 1.1.23 质粒pAAV-hTERT-hrGFP的双酶切产物的回收 |
| 1.1.24 载体质粒pAAV-hTERT-hrGFP和PE38KEDL基因片段的连接 |
| 1.1.25 PE38KEDL基因片段的合成 |
| 1.1.26 质粒 PE38KEDL-pUC18 小量扩增 |
| 1.1.27 Xba I 和 MunI 双酶切 PE38KEDL-PUC18 得到 PE38KDEL |
| 1.1.28 载体质粒pAAV-hTERT-hrGFP和PE38KEDL基因片段的连接 |
| 1.1.29 pAAV-hTERT-PE38KEL-hrGFP 酶切和测序鉴定 |
| 1.1.30 三质粒共转染HEK293细胞包装重组腺相关病毒 |
| 1.1.31 腺相关病毒的收集和纯化 |
| 1.1.32 AVSachTMELISA法测定腺相关病毒颗粒滴度 |
| 1.1.33 腺相关病毒纯度的检测 |
| 1.1.34 腺相关病毒的电镜观察 |
| 1.1.35 腺相关病毒转染MiaPaCa2人胰腺癌细胞及WI-38人胚肺成纤维细胞 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 质粒转化DH5 a感受态细胞后的小提质粒结果 |
| 1.2.2 人基因组DNA的提取结果 |
| 1.2.3 人hTERT启动子的扩增 |
| 1.2.4 质粒pAAV-hrGFP经Mlu I酶切电泳结果 |
| 1.2.5 质粒pAAV-hTERT-hrGFP的构建和鉴定 |
| 1.2.6 质粒 pAAV-hTERT-PE38KEL-hrGFP 的构建和鉴定 |
| 1.2.7 重组腺相关病毒在HEK293细胞中的包装 |
| 1.2.8 重组腺相关病毒的收集纯化鉴定 |
| 1.2.9 腺相关病毒的滴度测定及电镜观测 |
| 1.2.10 rAAV 转染 MiaPaCa2 及 WI-38 细胞 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 肿瘤基因治疗现状 |
| 1.3.2 端粒酶在基因治疗中的应用 |
| 1.3.3 铜绿假单胞菌外毒素在肿瘤治疗中的应用 |
| 1.3.4 腺相关病毒在肿瘤治疗中的应用 |
| 1.3.5 本课题的设计思路 |
| 1.4 小结 |
| 二、pAAV-hTERT-PE83KEL-hrGFP病毒载体对MiaPaCa2细胞凋亡的影响 |
| 前言 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 主要试验仪器 |
| 2.1.2 主要实验材料 |
| 2.1.3 细胞 |
| 2.1.4 主要实验试剂及缓冲液的配制 |
| 2.1.5 细胞培养及实验分组 |
| 2.1.6 H亮氨酸掺入法测定AAV-hTERT-PE38KDEL对人胰腺癌细胞蛋白合成的的影响 |
| 2.1.8 噻唑兰（MTT)比色法测定胰腺癌细胞MiaPaC2的增殖活性 |
| 2.1.9 DNA片段分析 |
| 2.1.10 细胞总蛋白的提取 |
| 2.1.11 BGA法蛋白定量 |
| 2.1.12 蛋白的免疫学检测 |
| 2.1.13 原位凋亡检测 |
| 2.1.14 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 MiaPaCa2人胰腺癌细胞的生长情况 |
| 2.2.2 病毒对MiaPaCa2细胞蛋白合成的抑制作用 |
| 2.2.3 MTT比色法测定MiaPaC2人胰腺癌细胞的增殖活性 |
| 2.2.4 TUNEL法检测MiaPaC2细胞凋亡的情况 |
| 2.2.5 考马斯亮蓝染色观察 |
| 2.2.6 rAAV-hTERT-PE38KDEL 病毒对 MiaPaC2 人胰腺癌细胞 caspase-3，-8，-9以及抗凋亡蛋白家族蛋白表达的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 hTERT启动子在肿瘤靶向基因治疗中的应用 |
| 2.3.2 基于PE的免疫毒素在肿瘤治疗中的应用 |
| 2.3.3 细胞凋亡与肿瘤 |
| 2.4 小结 |
| 三、rAAV-hTERT-PE8DKE治疗胰腺癌荷瘤裸鼠的实验研究 |
| 前言 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂和实验仪器 |
| 3.1.2 动物 |
| 3.1.3 裸鼠肿瘤移植模型的建立 |
| 3.1.4 实验分组 |
| 3.1.5 TUNEL检测肿瘤组织原位凋亡 |
| 3.1.6 组织标本的常规苏木精-伊红（HE)染色 |
| 3.1.7 细胞总RNA的提取 |
| 3.1.8 RNA完整性的检测（甲醛变性凝胶电泳） |
| 3.1.9 RT-PCR检测PE38KDEL的表达 |
| 3.1.10 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 不同组别的裸鼠荷瘤生长情 |
| 3.2.2 不同组别的裸鼠移植瘤组织病理学变化 |
| 3.2.3 TUNEL原位凋亡试剂盒检测不同组别细胞凋亡情况 |
| 3.2.4 细胞总RNA的提取及电泳结果 |
| 3.2.5 RT-PCR 扩增 PE38KDEL 片段 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 肿瘤移植模型在肿瘤研究中的作用 |
| 3.3.2 腺相关病毒作为载体在肿瘤研究中的作用 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 胰腺癌的靶向治疗进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）慢病毒介导的RNAi沉默HMGA2基因表达对人结肠癌HCT116细胞生物学行为的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第1章 综述 |
| 1 人类 HMGA2 基因/蛋白的结构及功能 |
| 1.1 HMGA2 基因 |
| 1.2 HMGA2 蛋白 |
| 2 HMGA2 在各种癌症组织中的表达及其与临床病理特征及预后的关系 |
| 2.1 甲状腺癌 |
| 2.2 肺癌 |
| 2.3 胃癌 |
| 2.4 结直肠癌 |
| 2.5 胰腺癌 |
| 2.6 乳腺癌 |
| 2.7 膀胱癌 |
| 2.8 卵巢癌与输卵管癌 |
| 2.9 口腔鳞状细胞癌 |
| 3 HMGA2 对癌症细胞生物学行为的影响及作用机制 |
| 3.1 HMGA2 对恶性肿瘤生物学功能的调控作用 |
| 3.2 HMGA2 参与调控肿瘤生物学行为的机制 |
| 4 HMGA2 对癌症的特异性诊断价值 |
| 5 靶向 HMGA2 基因治疗癌症的前景 |
| 第2章 HMGA2 蛋白在人结直肠癌组织的表达 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 标本来源及主要试剂、仪器设备 |
| 2 免疫组化方法检测 HMGA2 蛋白在结直肠癌中的表达 |
| 结果 |
| 1 结直肠癌中 HMGA2 的表达 |
| 2 HMGA2 表达与临床病理学资料之间的关系 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 附图 |
| 第3章 HMGA2 在结肠癌细胞中的表达 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1 主要试剂、仪器及细胞株 |
| 2 实验方法 |
| 结果 |
| 1 5株结肠癌细胞中 HMGA2mRNA 表达情况 |
| 2 5株结肠癌细胞中 HMGA2 蛋白表达情况 |
| 3 RNAi 实验靶细胞的选择 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第4章 HMGA2shRNA 慢病毒载体的构建、病毒包装及有效干扰序列的筛选 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1 主要试剂、仪器设备、质粒及细胞株 |
| 2 HMGA2shRNA 慢病毒载体的构建、鉴定及抽提 |
| 3 慢病毒的包装、收获、浓缩及滴度测定 |
| 4 慢病毒感染目的细胞及有效的干扰序列筛选 |
| 结果 |
| 1 pGLV-HMGA2shRNA1、2 重组质粒的 DNA 测序结果 |
| 2 HMGA2shRNA 慢病毒表达载体的包装及滴度测定 |
| 3 在目的细胞 HCT116 中筛选有效的 HMGA2shRNA 干扰序列 |
| 4 不同 siRNA 序列沉默效果比较及最佳 siRNA 序列的确定 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第5章 RNAi 沉默 HMGA2 基因表达对 HCT116 细胞生物学行为影响的体外实验研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1 主要试剂、仪器及细胞株 |
| 2 慢病毒介导的 RNAi 沉默 HMGA2 表达对 HCT116 细胞生物学行为的影响 |
| 3 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 RNAi 介导的 HMGA2 基因沉默对 HCT116 细胞增殖能力的影响 |
| 2 RNAi 介导的 HMGA2 基因沉默对 HCT116 细胞克隆形成能力的影响 |
| 3 RNAi 介导的 HMGA2 基因沉默对 HCT116 细胞生长周期的影响 |
| 4 RNAi 介导的 HMGA2 基因沉默对 HCT116 细胞体外侵袭能力的影响 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第6章 RNAi 沉默 HMGA2 基因表达对人结肠癌裸鼠皮下种植瘤生长的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 主要实验试剂、仪器设备及实验细胞、动物来源 |
| 2 人结肠癌HCT116 细胞的培养、慢病毒的感染及动物实验用细胞悬液的制备 |
| 3 人结肠癌裸鼠皮下种植瘤模型的建立 |
| 4 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 裸鼠皮下移植瘤生长情况的观察 |
| 2 各组裸鼠脏器转移情况观察及种植瘤组织 HE 染色 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第7章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（9）RNAi靶向人端粒酶逆转录酶基因治疗大肠癌的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要英文缩写索引 |
| 前言 |
| 第一部分 shRNA真核表达载体构建及其对大肠癌SW480细胞凋亡的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 RNAi沉默hTERT基因对人大肠癌SW480细胞荷瘤裸鼠的治疗作用 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士研究生学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（10）CRAd.pEgr1-Smac联合照射对MDA-MB-231肿瘤细胞的抑制效应（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 基因治疗的研究进展及发展前景 |
| 1.1.1 基因治疗的定义及应用 |
| 1.1.2 基因治疗面临的技术问题和挑战 |
| 1.1.3 基因治疗导入系统研究进展 |
| 1.1.4 基因治疗的前景展望 |
| 1.2 肿瘤基因治疗研究进展 |
| 1.2.1 肿瘤基因治疗原理及分类 |
| 1.2.2 肿瘤基因治疗面临的挑战 |
| 1.3 溶瘤腺病毒与肿瘤治疗 |
| 1.3.1 腺病毒基本特性 |
| 1.3.2 腺病毒载体的发展 |
| 1.3.3 条件复制型腺病毒载体 |
| 1.3.4 条件复制型腺病毒与肿瘤治疗 |
| 1.4 肿瘤基因-放射治疗 |
| 1.4.1 肿瘤基因-放射治疗种类 |
| 1.4.2 肿瘤基因放射治疗的辐射增敏机制 |
| 1.4.3 Egr-1介导的肿瘤基因-放射治疗研究进展 |
| 1.5 Smac基因与肿瘤 |
| 1.5.1 Smac的分子特性及结构特征 |
| 1.5.2 Smac的促凋亡作用 |
| 1.5.3 Smac与肿瘤的关系 |
| 1.5.4 Smac的研究前景 |
| 1.6 立题依据 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂及器材 |
| 2.1.1 试剂 |
| 2.1.2 器材 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 质粒与菌株 |
| 2.4 细胞株 |
| 2.5 照射条件 |
| 2.6 细胞生物学实验方法 |
| 2.6.1 培养液配制 |
| 2.6.2 胎牛血清制备 |
| 2.6.3 D-Hanks液的配制 |
| 2.6.4 胰酶的配制 |
| 2.6.5 细胞培养 |
| 2.6.6 细胞冻存 |
| 2.6.7 细胞复苏 |
| 2.6.8 敏感肿瘤细胞株筛选 |
| 2.6.9 细胞增殖检测 |
| 2.6.10 细胞凋亡检测 |
| 2.6.11 细胞mRNA表达水平检测 |
| 2.6.12 细胞蛋白表达水平检测 |
| 2.7 分子生物学实验方法 |
| 2.7.1 细菌培养技术 |
| 2.7.2 重组穿梭载体的构建 |
| 2.7.3 重组腺病毒的包装与鉴定 |
| 2.7.4 目的基因表达 |
| 2.8 统计学方法 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 重组质粒的构建及鉴定 |
| 3.1.1 目的基因的获得 |
| 3.1.2 重组质粒的构建及鉴定 |
| 3.2 重组腺病毒的包装及鉴定 |
| 3.2.1 重组腺病毒质粒构建 |
| 3.2.2 重组腺病毒包装 |
| 3.2.3 重组腺病毒扩增 |
| 3.2.4 重组腺病毒滴度测定 |
| 3.2.5 重组腺病毒鉴定 |
| 3.3 重组腺病毒联合照射的敏感肿瘤细胞株筛选 |
| 3.4 重组腺病毒联合照射对MDA-MB-231肿瘤细胞的抑制效应 |
| 3.4.1 重组腺病毒对MDA-MB-231细胞增殖的影响 |
| 3.4.2 重组腺病毒联合照射对MDA-MB-231细胞生长的抑制作用 |
| 3.4.3 重组腺病毒联合2.0Gy照射对MDA-MB-231细胞凋亡的影响 |
| 3.5 重组腺病毒联合照射对MDA-MB-231细胞中凋亡相关基因表达的影响 |
| 3.5.1 重组腺病毒联合照射对MDA-MB-231细胞中Smac、Cyt c、caspase-9和-3mRNA表达的影响 |
| 3.5.2 重组腺病毒联合照射对MDA-MB-231细胞中Smac、Cyt c、caspase-9和-3蛋白表达的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 目的基因的获得 |
| 4.1.1 E1A-E1Bp和E1B55K基因的克隆 |
| 4.1.2 hTert启动子的克隆 |
| 4.1.3 Smac基因的克隆 |
| 4.1.4 Egr-1启动子的克隆 |
| 4.2 条件复制型腺病毒质粒的构建及病毒的包装鉴定 |
| 4.2.1 重组腺病毒穿梭质粒的构建及鉴定 |
| 4.2.2 细菌内同源重组 |
| 4.2.3 重组腺病毒包装、滴度测定及鉴定 |
| 4.3 重组腺病毒联合照射的敏感肿瘤细胞株筛选 |
| 4.4 重组腺病毒联合照射对MDA-MB-231肿瘤细胞的抑制效应 |
| 4.4.1 重组腺病毒对MDA-MB-231肿瘤细胞增殖的影响 |
| 4.4.2 重组腺病毒联合照射对MDA-MB-231细胞生长抑制的剂量效应 |
| 4.4.3 重组腺病毒联合2.0Gy照射对MDA-MB-231细胞生长抑制的时程效应 |
| 4.4.4 重组腺病毒联合2.0Gy照射对MDA-MB-231细胞凋亡的影响 |
| 4.5 重组腺病毒联合照射对MDA-MB-231细胞中凋亡相关基因表达的影响 |
| 4.5.1 mRNA表达的变化 |
| 4.5.2 蛋白表达的变化 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的学术论文及其他成果 |
| 致谢 |
四、反义人类端粒酶RNA逆转录病毒载体构建及其对结直肠癌细胞的抑制作用（论文参考文献）
- [1]利用CRISPR/Cas9技术构建永生化脐带间充质干细胞系及其MYC-AS1转基因工程化外泌体抑癌功能初探[D]. 李洪强. 扬州大学, 2021(08)
- [2]苦豆碱通过调节miR-296-5p/STAT3轴抑制结直肠癌细胞的增殖和转移及其机制研究[D]. 韩玮. 南京中医药大学, 2021(01)
- [3]AGK在结直肠癌发生发展中的作用和机制探讨[D]. 陈前智. 华中科技大学, 2020(02)
- [4]新型核酸纳米载体的设计及在肿瘤细胞成像和药物递送中的应用研究[D]. 刘晓亭. 山东大学, 2020(08)
- [5]PIWIL3/OIP5-AS1/miR-367-3p/CEBPA以及TDP43/SNHG12/miR-195/SOX5反馈环路调控胶质瘤细胞生物学行为的机制研究[D]. 刘啸白. 中国医科大学, 2019
- [6]靶向端粒酶反转录酶基因短发夹RNA载体的构建[J]. 宋扬,徐韬,杨明坤,盛伟斌. 中国组织工程研究, 2014(07)
- [7]hTERT启动子调控腺相关病毒介导的PE38KDEL基因治疗胰腺癌的实验研究[D]. 李宝玉. 天津医科大学, 2013(01)
- [8]慢病毒介导的RNAi沉默HMGA2基因表达对人结肠癌HCT116细胞生物学行为的影响[D]. 徐广甍. 吉林大学, 2012(09)
- [9]RNAi靶向人端粒酶逆转录酶基因治疗大肠癌的实验研究[D]. 蔡艳玲. 广西医科大学, 2011(09)
- [10]CRAd.pEgr1-Smac联合照射对MDA-MB-231肿瘤细胞的抑制效应[D]. 王宏芳. 吉林大学, 2011(09)