一、酵母海藻糖合成酶基因植物表达载体的构建（论文文献综述）
石国新[1]（2021）在《谷氨酸棒杆菌抗高渗元件的挖掘和功能表征》文中研究说明拥有优良抗逆表型的工程微生物是工业化发酵生产中提升生物发酵产品产量和质量的重要保障。谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）是一种重要的传统工业微生物,已经被用来生产各种氨基酸,如谷氨酸、赖氨酸、精氨酸等和其他化合物。而在发酵过程中,高盐、酸碱和渗透压等环境胁迫严重影响菌体生长及代谢,从而降低菌株的生物制造效率。目前,谷氨酸棒杆菌抵御高渗透压胁迫的潜在机制仍然不清晰,因此,解析谷氨酸棒杆菌高渗透压胁迫生理适应机制并挖掘和鉴定参与菌株耐高渗透压过程的功能元件和代谢途径,将为工业菌株的遗传改造和生理性能优化提供新思路。本文以野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌株,研究了长期和短期高渗透压胁迫对谷氨酸棒杆菌基因表达水平的影响以及代谢通路的变化情况。此外,通过对显着上调/下调基因或代谢通路进行分析验证,挖掘到谷氨酸棒杆菌抵御高渗透压胁迫的潜在靶点。本文主要研究内容及结果如下:（1）为了确定抗渗元件的筛选压力,测试了谷氨酸棒杆菌在0 g/L、80 g/L、120 g/L、160 g/L、180 g/L和200 g/L赖氨酸盐酸盐压力下的菌体量,最终确定160 g/L赖氨酸盐酸盐压力为抗渗元件的筛选压力。在160 g/L赖氨酸盐酸盐选择压力下,测试了多种抗渗元件,包括大肠杆菌（Escherichia coli）的c AMP磷酸二酯酶、响应调节因子、热激蛋白、伴侣蛋白、周质酸应激伴侣蛋白和多重胁迫抗性外膜蛋白;谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）的热激蛋白、DNA保护蛋白、分子伴侣以及极端嗜热球菌（Thermococcus kodakarensis）的膜蛋白、吡哆醛生物合成裂解酶、氧化还原酶、乙酸-Co A连接酶、NADP氧化还原酶、锌依赖性蛋白酶、t RNA乙酰转移酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、果糖-1,6-二磷酸酶、转录调节因子和渗透诱导蛋白。研究结果表明,过表达大肠杆菌热激蛋白Hspq可使谷氨酸棒杆菌在高渗透压下菌体量提升20-30%,过表达极端嗜热球菌的抗渗元件对谷氨酸棒杆菌渗透压耐受能力无显着提升。（2）通过转录组分析,分析了谷氨酸棒杆菌在长期高渗透压和短期高渗透压条件下菌体内显着变化的代谢通路,包括糖酵解、TCA循环、氧化磷酸化、磷酸戊糖途径、氨基酸的生物合成、硫代谢、精氨酸的生物合成、信号转导途径和叶酸合成途径。基于转录组分析的结果,过表达验证表达上调显着的基因:cg0074、ssi F、cg0767、cg2313、lys E、cg0785、cg0362、cg0928、cg3329、叶酸代谢途径中的基因fol A和fol C、硫代谢途径基因tht R和热激蛋白Grpe。验证DNA修复代谢途径中基因敲除菌株、氧化磷酸化途径中的基因ndh敲除菌株和活性氧清除转录调节因子Oxy R敲除菌株。验证结果表明,谷氨酸棒杆菌热激蛋白Grpe在载体p XMJ19下过表达可以在高渗透压下使谷氨酸棒杆菌的生物量提30-40%,当热激蛋白Grpe在载体p EC-XK99E下过表达可以使谷氨酸棒杆菌的生物量提高26.5%,而Grpe在p TRCmob质粒上过表达后生物量却下降10.1%。对于DNA修复途径,大部分敲除菌株的生物量在高渗透压下相比对照菌株有不同程度的下降,其中（？）Uvr A、（？）Uvr D、（？）Nei、（？）Nth、（？）Mut T、（？）Uncs和（？）Rec J菌株生物量下降相对显着,分别是14.5%、20.7%、19.6%、10%、30%、23%和12.8%。另外,对于（？）Mut T菌株,通过回补试验,将（？）Mut T菌株在载p EC-XK99E上过表达谷氨酸棒杆菌mut T基因后,（？）Mut T菌株的生物量回补34.2%。氧化磷酸化途径基因敲除菌株（？）Ndh在各种渗透压下的生物量相比于对照菌株有不同程度的下降,尤其是160 g/L赖氨酸盐酸盐压力下,生物量相比对照菌株下降90%,随后通过回补试验,将菌株（？）Ndh在载体p EC-XK99E上过表达谷氨酸棒杆菌ndh基因后,（？）Ndh菌株的生物量回补231.8%。活性氧清除转录调节因子基因敲除菌株（？）Oxy R1、（？）Oxy R3和（？）Oxy R5在高渗透压下生物量相比对照菌株分别下降15.6%、10.4%和25.5%。综上,通过验证分析,DNA修复途径、活性氧清除转录调节因子Oxy R、氧化磷酸化途径和热激蛋白在高渗透压下是谷氨酸棒杆菌抵御高渗透压胁迫的重要靶点。
林杉[2]（2021）在《共表达ZxNHX1-VP1-1紫花苜蓿的分子鉴定及ZxNHX1-PcCLCg紫花苜蓿的耐盐性评价》文中认为紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是主要的饲用牧草之一,因其具有高蛋白、低纤维、适口性好等特点,被誉为“牧草之王”。但紫花苜蓿的抗逆性较弱,在我国西北干旱半干旱地区及盐渍环境中难以获得高产,将荒漠植物的优异抗逆基因转入紫花苜蓿中有望改良其抗逆性。多浆旱生植物霸王（Zygophyllum xanthoxylum）兼具较强的抗旱耐盐性,其液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白编码基因ZxNHX1和H+-焦磷酸酶编码基因ZxVP1-1是提高其抗逆性的关键基因。本课题组前期克隆了霸王ZxNHX1和ZxVP1-1,与抗除草剂基因Bar聚合转入紫花苜蓿中,获得了共表达ZxNHX1-VP1-1紫花苜蓿,但对其分子特征尚不清楚。此外,盐渍环境中,除Na+外,Cl-在植物细胞质中积累过多也会产生毒害作用,但目前大多数研究主要关注Na+,对Cl-的研究较少。荒漠植物沙芥（Pugionium cornutum）是一种典型的积氯植物,本课题组前期研究表明,液泡膜Cl-通道基因PcCLCg是沙芥耐氯的关键基因,将PcCLCg与ZxNHX1聚合共同转入紫花苜蓿中并获得了抗性植株,但对其耐盐性尚未进行评定。本研究采用PCR、RT-PCR、Southern Blot、Western Blot和ELISA对共表达ZxNHX1-VP1-1紫花苜蓿的分子特征进行鉴定;并对共表达ZxNHX1-PcCLCg与超表达ZxNHX1紫花苜蓿的耐盐性进行比较分析。取得如下主要结果:1.经PCR鉴定,共筛选到8株共表达ZxNHX1-VP1-1紫花苜蓿阳性株系。经Southern Blot检测,其中8号株系的目的基因ZxNHX1、ZxVP1-1和标记基因Bar均为单一拷贝;Western Blot和ELISA检测结果显示,ZxNHX1和ZxVP1-1蛋白在8号株系整株水平上均能正常表达,叶片中蛋白表达量最高,茎和根中次之。表明外源目的基因ZxNHX1、ZxVP1-1已整合至紫花苜蓿基因组中并在蛋白水平表达。2.经PCR鉴定得到16株共表达ZxNHX1-PcCLCg紫花苜蓿阳性株系,对其和超表达ZxNHX1紫花苜蓿阳性株系进行RT-PCR检测,筛选得到ZxNHX1和PcCLCg基因表达量较高和较低的共表达株系各1株（NC-1和NC-2）,以及与NC-1中ZxNHX1表达量相对一致的超表达ZxNHX1株系1株（N-1）,用于后续耐盐性分析。3.50和200 mmol/L NaCl处理10 d后,NC-1株系的株高及地上部鲜干重显着高于N-1株系、空载体及野生型,表明ZxNHX1和PcCLCg的共表达能够显着增强紫花苜蓿的耐盐能力。4.盐处理下,各株系体内的Na+和Cl-含量逐渐增加,K+含量逐渐降低。50mmol/L NaCl处理下,NC-1株系叶片和根中Na+含量分别显着高于NC-2和N-1株系;NC-1株系叶片和茎中Cl-含量显着高于N-1株系、空载体及野生型。200mmol/L NaCl处理下,NC-1株系叶片和茎中Na+含量显着高于NC-2、N-1株系、空载体及野生型,NC-1和N-1株系根中Na+含量均显着高于NC-2株系、空载体及野生型;NC-1株系叶片、茎和根中Cl-含量分别显着高于NC-2和N-1株系。表明共表达ZxNHX1和PcCLCg增强了紫花苜蓿中Na+和Cl-的积累能力。5.对照条件下（0 mmol/L NaCl）,所有株系中Na+对叶片渗透势的贡献较低且无明显差异。50和200 mmol/L NaCl处理下,NC-1株系中Na+对叶片渗透势的贡献分别显着高于NC-2和N-1株系。与Na+一致,对照条件下所有株系中Cl-对叶片渗透势的贡献较低。50 mmol/L NaCl处理下,NC-1株系中Cl-对叶片渗透势的贡献分别显着高于NC-2和N-1株系。200 mmol/L NaCl处理下,NC-1和NC-2株系中Cl-对叶片渗透势的贡献显着高于空载体和野生型。表明共转ZxNHX1-PcCLCg紫花苜蓿通过积累Na+和Cl-有助于增加转基因植株在盐胁迫下的渗透调节能力。6.盐处理下,N-1株系、空载体及野生型叶片相对质膜透性随着盐浓度的增加而逐渐升高,NC-1和NC-2株系的叶片相对质膜透性保持稳定。200 mmol/L NaCl处理下,NC-1株系的叶片渗透势显着低于NC-2、N-1株系、空载体及野生型。
宋龙祥[3]（2021）在《MTSase和MTHase在枯草芽孢杆菌中的异源表达及其固定化应用研究》文中进行了进一步梳理海藻糖具有良好的化学稳定性和独特的生物学特性,被广泛应用于食品加工、生物大分子保护等方面。目前海藻糖的生产以双酶法为主,该方法以麦芽糊精为底物,利用麦芽寡糖基海藻糖合成酶（Maltooligosyl trehalose synthase,MTSase,EC5.4.99.15）和麦芽寡糖基海藻糖水解酶（Maltooligosyl trehalose trehalohydrolase,MTHase,EC 3.2.1.141）协同催化生成海藻糖。虽然海藻糖已经实现工业化生产,但生产菌以大肠杆菌为主,其含内毒素,不利于低内毒素的高品质海藻糖的制备。本研究以不含内毒素的安全级菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis为宿主菌,分别异源表达嗜酸热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909来源的MTSase和MTHase。分别对MTSase和MTHase酶学性质、MTSase和MTHase重组菌发酵培养基优化、海藻糖转化条件优化等进行探究。由于MTSase和MTHase酶学性质稳定,为提高酶的利用率、降低生产成本、便于海藻糖的分离,制备了经一步反应即可实现对Spy Tag-MTSase和Spy Tag-MTHase重组酶的纯化和固定化的Spy Catcher固定化载体,通过固定化条件优化,实现了Spy Tag-MTSase和Spy Tag-MTHase重组酶的多次循环利用。本文主要工作如下:（1）分别将S.acidocaldarius ATCC 33909来源的MTSase和MTHase在B.subtilis WB800N/Δamy E::Spc中异源表达。确定MTSase最适温度为65℃,最适p H为5.5,在最适条件下比酶活为106.7 U/mg;MTHase最适温度为75℃,最适p H为6.0,在最适条件下的比酶活为243.9 U/mg。（2）通过重组菌发酵培养基优化,确定12 g/L蔗糖为碳源、18 g/L安琪酵母浸粉FM888为氮源、磷酸盐浓度为1 mmol/L、流加葡萄糖维持还原糖浓度为5g/L,MTSase和MTHase酶活分别达到6652.68 U/g和5543.23 U/g。（3）通过海藻糖转化条件优化,确定麦芽糊精DE值为8.8、Promozyme D2添加量为5.0 U/g、转化温度为60℃、维持p H 6.0、MTSase添加量为95.0 U/g、MTHase添加量为35.0 U/g、CGTase添加量为1.0 U/g、以200 g/L麦芽糊精为底物、转化时间48 h,经糖化酶糖化处理后,海藻糖转化率达到74.7%。（4）以微晶纤维素为基质,制备纤维素微球;根据碳水化合物结合域（CBM）可吸附纤维素的原理,将Spy Catcher与CBM融合蛋白Spy Catcher-CBM固定到纤维素微球上,制备获得Spy Catcher固定化载体;依据Spy Catcher和Spy Tag可自发形成异肽键的原理,分别对Spy Tag-MTSase和Spy Tag-MTHase重组酶进行纯化和固定化。（5）通过固定化条件优化,确定固定化温度25℃、p H 7.4、目的酶与Spy Catcher固定化载体摩尔比为1:1.4、固定化时间20 min时,对目的酶固定化率为76.6%。在固定化条件优化的基础上,分别对粗酶液中Spy Tag-MTSase和Spy Tag-MTHase进行纯化和固定化,固定化率分别为68.9%和68.0%。（6）在海藻糖转化条件优化基础上,添加Spy Tag-MTSase固定化酶95.0 U/g、添加Spy Tag-MTHase固定化酶35.0 U/g进行海藻糖转化,固定化酶循环利用3次,海藻糖转化率均高于50%以上。
杨洁[4]（2021）在《丹参SmMYB36与SmCSN5蛋白的互作关系鉴定及其作用分析》文中研究说明丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）为唇形科多年生草本植物,是我国传统的以根茎入药的中药材,其次生代谢物丹参酮类和酚酸类物质决定了丹参的药用价值。研究记载,丹参药材多用于活血化瘀、消炎除菌、扩张血管等治疗,对心脑血管疾病、肺动脉高压、动脉粥样硬化等疾病具有显着的疗效。本研究围绕丹参次生代谢物合成途径关键调节因子SmMYB36转录因子展开,以SmMYB36为诱饵蛋白,利用酵母双杂交筛选与其互作的蛋白,为后续初步探讨转录因子蛋白质翻译后修饰方式间接参与调控丹参酚酸类和酮类物质的合成奠定基础。本研究取得结果如下:1、以SmMYB36为诱饵蛋白,构建pGBKT7-SmMYB36诱饵载体,通过酵母双杂交对丹参均一化酵母文库进行筛选实验,共获得236个克隆?对这些克隆进行测序比对,获得有意义的互作蛋白28个,分类整理发现磷酸化类相关蛋白2个,转录因子类蛋白2个,泛素化类相关蛋白5个,其他酶类蛋白质若干个。2、对筛选出的互作蛋白进行基础生信分析,明确其相关功能。其中一个编号为190413-2-2的泛素化相关蛋白,通过BLASTx比对及丹参数据库比对、进化树分析等确定为丹参SmCSN5蛋白。3、对SmMYB36与SmCSN5蛋白之间的相互作用进行验证分析,利用Y2H回复验证、双分子荧光互补技术Bi FC、萤火虫荧光素酶互补技术LCI、Pull-down技术等体内体外实验,证实SmMYB36与SmCSN5之间确实存在互作关系。对互作结构域鉴定分析,SmCSN5与SmMYB36互作区域在SmCSN5的第1-99位氨基酸区域（JAMM基序）和SmMYB36的第112-153位氨基酸区域。4、对SmCSN5作用影响SmMYB36功能定位分析,使用农杆菌介导的烟草瞬时表达体系对SmMYB36与SmCSN5蛋白进行亚细胞共定位,SmMYB36与SmCSN5相互作用后可能在细胞核中发挥功能。
陈汉钦[5]（2021）在《糖代谢相关基因Matps与Mapepck对高山被孢霉脂质积累的作用研究》文中指出高山被孢霉具有优异的多不饱和脂肪酸合成能力,是一株具有广阔发展前景的产油丝状真菌,为了适应工业化生产多不饱和脂肪酸需要进一步提高其脂质积累能力。以海藻糖为主的糖类合成是高山被孢霉中除脂质外另一主要的碳储备方式,与脂质合成途径竞争碳通量,而糖异生途径会造成脂肪酸合成所需的丙酮酸分流并将碳通量导入糖类合成中。本研究以改善碳通量在糖类与脂质合成中的重新分配以促进脂质积累为目的,对海藻糖合成关键步骤中的海藻糖-6-磷酸合成酶编码基因（Matps）与糖异生关键步骤中的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因（Mapepck）进行RNA干扰,对重组菌基因转录水平、酶活水平以及生长与糖类、脂质代谢等进行分析,研究高山被孢霉糖代谢相关基因在氮限制下对其糖、脂代谢的作用,并分别对干扰菌株在环境胁迫中的响应情况以及发酵罐放大培养中糖、脂积累差异进行研究。本文为解析干扰高山被孢霉中的Matps基因与Mapepck基因在脂质积累过程中对碳源进行分配的影响以及提高菌株的脂质积累能力提供了理论依据,主要研究内容如下。1、建立高山被孢霉中糖类的提取与分析方法,比较3种加热浸提与3种循环冻融提取方法,确定盐酸加热浸提结合苯酚-硫酸法测定总糖,乙腈-水循环冻融提取后通过高效液相色谱法结合蒸发光散射检测器对糖类成分进行分析,使用上述两种方法对高山被孢霉发酵过程分析,结果表明高山被孢霉在脂质积累过程中可同步积累高水平糖类物质,总糖含量最高可达菌体干重的26%,主要糖类成分海藻糖比重超过总糖的20%。糖类的合成是脂质合成的主要竞争途径,其中含量最高的海藻糖或许能够作为干扰糖类积累的有效靶点,此外为总糖积累提供碳源的糖异生途径可能是另一个有效的干扰目标。2、通过生物信息学分析了高山被孢霉中海藻糖合成相关的Matps基因与糖异生相关的Mapepck基因,通过根癌农杆菌介导转化法与RNA干扰技术构建Matps基因与Mapepck基因的重组菌。Matps基因干扰菌株中Matps基因转录水平下降约60%,Mapepck基因干扰菌株中Mapepck基因转录水平下降约41%,Ma PEPCK蛋白酶活水平下降约45%,表明RNA干扰成功在基因和蛋白水平削弱了相关途径的表达。3、在发酵后期,Matps基因的干扰导致高山被孢霉中主要糖类成分海藻糖的含量下调37%,而脂肪酸含量最大提高了20%,但后期ARA产量提高30%。说明在氮限制条件下通过RNAi下调Matps基因的表达可以降低海藻糖积累量,并且将一部分碳代谢流转移至脂肪酸合成;在面对轻微胁迫条件时,Matps基因主要起到控制碳通量分流作用,而在严重胁迫条件下,由于海藻糖抵抗胁迫的能力不可忽视,Matps基因的正常表达对胁迫状态下维持菌株活性有重要作用。4、脂质积累过程中,干扰高山被孢霉的Mapepck基因导致胞内总糖含量下调17%～28%,脂质含量提高了17%～26%,后期ARA产量提高近42%。与干扰Matps不同,干扰Mapepck基因虽然改变了碳代谢流在胞内糖、脂代谢途径中的分布,但未影响海藻糖在总糖中的比重,说明干扰Mapepck基因降低了糖异生水平并导致总糖水平下降从而促进脂质的积累;对重组菌株的代谢物分析表明,Mapepck基因表达下调了除了减少糖异生向糖类合成输送碳流,还加速了丙酮酸-柠檬酸循环促使脂肪酸合成前体的产生;最后在发酵罐放大培养过程中验证了Mapepck基因干扰菌株的脂质积累能力,结果表明干扰Mapepck基因不仅提高了脂肪酸产量,还能使菌株提前到达脂质最大积累时间,相比于出发菌株更具有产脂优势。对糖、脂积累的解析有利于优化高山被孢霉中碳代谢流的分配,为通过调控高山被孢霉糖类合成来促进脂质合成提供理论依据。
曹嘉健[6]（2021）在《依赖于ATG6的自噬在番茄氮胁迫中的作用及其机制研究》文中研究说明氮素是植物生长发育的所需的重要元素。目前世界各国面临氮素缺乏、氮肥不合理施用、利用率不高等问题,严重制约蔬菜等农作物的产量与品质。自噬在营养缺乏的情况下,可以将细胞内容物运输到液泡中降解,促进营养的重吸收与再利用。然而自噬与氮素吸收及利用的关系以及上下游调控网络尚不清楚。本文以蔬菜作物番茄（Solanum lycopersicum）为研究材料,主要开展了自噬关键基因ATG6在低氮胁迫中的功能研究,主要取得如下结果:1.明确了番茄自噬在低氮胁迫中发挥重要作用。低氮处理诱导可使番茄叶部及根部ATGs基因上调;atg6、atg10和atg18a自噬突变体植株对低氮胁迫敏感,叶绿素含量、生物量均低于野生型,植株含氮量减少;atg6、atg10和atg18a自噬突变体不论是在叶部还是根部,低氮诱导的自噬都无法形成。以上结果表明,番茄叶片与根系的自噬可受低氮胁迫诱导,自噬关键基因的缺失会抑制低氮诱导的自噬产生,自噬在番茄植株应对低氮胁迫时发挥重要作用。2.研究了依赖于ATG6的自噬对番茄氮吸收及同化的影响。低氮胁迫下,atg6突变体生物量、氮积累量均较野生型减少;而ATG6过表达植株促进了低氮诱导的自噬体的形成,以及生物量积累;ATG6过表达植株通过调节氮转运基因NRT1.1、NRT2.1在根中的表达,提高了根中氮含量。此外,依赖于ATG6的自噬增强了番茄叶片氮同化效率和蛋白质的产生。低氮胁迫下,atg6突变体植株中氮同化关键酶NR与Ni R的活性被显着抑制;而ATG6过表达植株中提高了被低氮抑制的NR与Ni R活性。以上结果表明,依赖于ATG6的自噬可以提高低氮胁迫下番茄根系的氮吸收,同时也可增强番茄叶片的氮同化。3.研究了依赖于ATG6的自噬在低氮胁迫下对番茄碳氮代谢的影响。低氮胁迫下,atg6突变体植株中碳积累量下降、光合速率减弱、光合相关蛋白积累受到抑制;而ATG6过表达植株中提高了被低氮抑制的光合作用和光合相关蛋白的积累。我们通过嫁接实验进行了进一步验证,低氮胁迫下,光合CO2同化效率不论在以atg6为砧木、还是以atg6为接穗的嫁接植株中都被抑制。以上结果表明,依赖于ATG6的自噬可以增强光合相关蛋白的积累从而缓解低氮对光合作用及植物生长的抑制。低氮胁迫下,自噬除了可以提高营养物质的循环与再利用,还对氮吸收与同化以及碳同化具有重要作用。4.发现了BZR1介导的油菜素内酯可以调控番茄自噬,且在缺氮胁迫中发挥重要作用。外源施加油菜素内酯（Brassinosteroid,BR）可以提高番茄在缺氮胁迫下的抗性,诱导自噬体的形成、降低泛素化蛋白的积累。BR信号下游重要的转录因子BZR1（Brassinazole resistance 1）参与了BR诱导的自噬,外源施加BR可以诱导去磷酸化BZR1蛋白的积累。BZR1过表达（BZR1OE）植株中,BR处理可以诱导自噬体的形成与ATGs的表达;而BZR1沉默（TRV-BZR1）植株中,BR诱导的自噬受到抑制。酵母单杂交与染色质免疫共沉淀实验结果表明BZR1可以与ATG2、ATG6的启动子结合,BR诱导的自噬在ATG2、ATG6沉默（TRV-ATG2、TRV-ATG6）番茄植株中受到抑制。TRV-BZR1植株与BR合成突变体d^im中缺氮诱导的叶片黄化严重、叶绿素降低;而BZR1OE与BZR1高度去磷酸化bzr1-1DOE植株则表现出缺氮胁迫抗性提高,并伴随着自噬水平的提高。以上结果表明,BR激活下游信号转导级联,去磷酸化的BZR1入核调控ATGs的表达,诱导自噬体的形成;且BR诱导的BZR1介导的自噬在番茄植株应对缺氮胁迫时发挥重要作用。5.研究了SnRK1.1在番茄低氮胁迫中的作用。我们鉴定了番茄SnRK1.1与ATGs的相互作用;并验证了SnRK1.1可以体外磷酸化ATG6;番茄SnRK1.1过表达植株提高低氮胁迫抗性,低氮下诱导的自噬体增加,叶绿素含量及生物量高于野生型,而snrk1.1突变体表型则相反;此外,还发现了SnRK1.1介导了低氮胁迫中依赖于ATG6的自噬形成,低氮诱导的自噬在番茄SnRK1.1OE-TRV-ATG6沉默植株中受到抑制。以上结果表明,番茄SnRK1.1与ATG6互作并磷酸化ATG6,SnRK1.1介导了低氮下依赖于ATG6的自噬体形成,提高番茄的低氮胁迫抗性。
吴丹丹[7]（2021）在《小桐子PP2C、CP及cystatin基因家族和相应miRNAs的鉴定及其在低温响应与适应中的作用》文中研究表明小桐子（Jatropha curcas）又名麻疯树,是一种多用途的能源植物,也是热带亚热带起源的冷敏感植物（Chilling-sensitive plants）,低温是限制小桐子生长分布和生产的主要因素。本实验室研究结果表明,12℃冷锻炼可以显着提高小桐子幼苗在1℃低温胁迫下的耐冷性。已知蛋白磷酸酶2C（Protein phosphatase 2C,PP2C）,半胱氨酸蛋白酶（Cysteine protease,CP）和半胱氨酸蛋白酶抑制剂（Cystatin）家族在调控植物可逆蛋白磷酸化及蛋白质的有序降解中起重要作用,进而调控植物的生长发育和对逆境胁迫的响应与适应。但在小桐子中,上述3个基因家族及其与之相互作用的miRNAs的鉴定以及它们在小桐子低温响应与适应过程中的作用尚未见报道。基于本实验室近期完成的小桐子低温响应过程中转录组、mi RNA组和降解组数据,本研究在全基因组水平上对小桐子蛋白磷酸酶2C、半胱氨酸蛋白酶和cystatin基因家族及靶向该家族成员的miRNAs进行了鉴定,对这三个基因家族的系统进化、保守结构域、染色体定位、表达特性及成员基因与miRNAs互作参与调控小桐子对低温的响应进行了解析,并对部分重要的基因进行了克隆和初步的功能验证,主要结果如下:1.PP2C基因家族及对应的miRNAs的全基因组解析及其在小桐子对低温响应与适应中的作用从小桐子基因组中共鉴定到60个PP2C基因,定位到11条染色体上,可分为12个亚家族（A～J,L,M）,编码136～1094个氨基酸,理论等电点4.73～9.76,蛋白序列比对和结构域分析结果表明,该家族成员都具有PP2C蛋白保守结构域,基因结构分析显示,同一亚家族成员外显子与内含子在数量上基本保持一致。表达分析显示,该家族的基因不同组织及器官在受到盐、干旱和激素胁迫处理时,具有差异化的表达。基于mi RNA组和降解组测序结果,发现有1186个miRNAs靶向调控小桐子PP2C基因家族的32个成员。对靶向JcPP2C9和JcPP2C14的miRNAs在低温处理过程中的共表达分析表明,mi R164-x、mi R395-y和novelm0284-3p与JcPP2C14;mi R3699-y、mi R5371-y、mi R7741-y、novel-mo238-5p和novel-m0294-5p与JcPP2C9在低温胁迫下呈明显的负相关,表明miRNAs与JcPP2C基因家族的某些成员的互作可能在小桐子对低温胁迫的响应与适应中起重要作用。根据上述的结果,本研究挑选了在低温下响应明显的JcPP2C9、JcPP2C14和JcPP2C29三个基因进行了克隆及酵母表达验证和烟草的过表达验证。结果表明,JcPP2C14的过表达可以提高酵母菌对盐胁迫的耐受性,但是该基因的过表达对低温耐受性的提高不是很明显;JcPP2C29的过表达明显提高了酵母菌在低温下的耐受性,但是对盐胁迫耐受性的提高不显着,表明PP2C家族的不同成员对不同逆境胁迫响应的作用不同。2.小桐子半胱氨酸蛋白酶家族和相应的miRNAs的鉴定及其对低温锻炼的响应从小桐子基因组中共鉴定到39个半胱氨酸蛋白酶基因,定位到11条染色体上,可分为6个亚家族（C1A、C2、C12、C13、C14、C15）,编码181～2158个氨基酸,理论等电点4.66～9.49,蛋白结构域分析表明,该家族都具有半胱氨酸蛋白酶Cys和His的活性位点。表达分析显示,该家族的基因在种子、花蕾、叶片、茎端具有差异化的表达。基于mi RNA组和降解组测序结果,发现有283个miRNAs靶向调控小桐子半胱氨酸蛋白酶基因家族的14个成员。对靶向JcDEK1、JcRD21B和JcXBCP3L的miRNAs在低温锻炼过程中的共表达分析表明,mi R1314-y和mi R5156-x与JcDEK1、mi R1151-y与JcRD21B及mi R6483-y与JcXBCP3L在低温锻炼期间呈明显负相关,暗示着这些miRNAs参与了半胱氨酸蛋白酶基因表达的调控,且这种调控可能与低温锻炼诱导的小桐子耐冷性增强有关。基于上述的结果,挑选对低温下高响应的JcRD19C和JcUCH2进行了基因克隆及酵母过表达验证。结果表明,JcRD19C的过表达可以增强酵母菌在低温下的抗冻性,但对盐胁迫下的耐受性不明显。JcUCH2的过表达可以提高酵母菌在低温下的耐性,但对盐胁迫耐受性的提高不显着。表明半胱氨酸蛋白酶家族的不同成员对不同逆境胁迫的响应具有差异。3.小桐子cystatin家族基因和相应miRNAs的鉴定及其在低温响应中可能的作用从小桐子基因组中共鉴定到5个cystatin基因,定位到6、8和10号染色体,可分为3个亚家族（A、B、C）,编码106～242个氨基酸,理论等电点4.97～9.17,序列比对发现cystatin的结构域基本保守且位于N端。表达分析显示,JcCYS1在种子、花蕾、叶子、茎端表达量较高,而JcCYS2在授粉期间表达量高。基于mi RNA组和降解组测序结果,发现有10个miRNAs可能靶向调控cystatin基因家族的3个成员JcCYS1、JcCYS2和JcCYS5。q RT-PCR分析表明,小桐子cystatin家族的5个基因的表达水平在12°C冷锻炼期间总体呈现出显着响应,尤其是在冷锻炼早期（12～24 h）。此外,对靶向JcCYS2和JcCYS5的miRNAs在冷锻炼过程中的表达分析表明,mi R11036-y、mi R396-z与JcCYS2;mi R8154-x与JcCYS5在冷锻炼期间呈明显负相关,暗示着这些miRNAs的确参与了cystatin基因的调控,且这种调控应该与冷锻炼诱导的小桐子耐冷性有关。根据以上结果,挑选对低温下响应强烈的JcCYS2基因进行了克隆及酵母表达验证。结果表明,JcCYS2基因的过表达在一定程度上提高了酵母对低温的抵抗能力,但是在耐盐胁迫下对盐的耐受性的提高不显着。综上所述,这些研究结果有助于更好了解小桐子PP2C、半胱氨酸蛋白酶和cystatin基因家族的功能及其与相应miRNAs的互作、以及这种互作如何调控小桐子对低温胁迫的响应与适应。
彭新红[8]（2021）在《绿木霉菌GV29-8厚垣孢子形成分子机制研究》文中提出木霉菌是一种广泛应用的生防真菌,能够防治多种植物病害。厚垣孢子是许多真菌在逆境下产生的一种繁殖体,具有细胞壁厚、抗逆性强等优点。与木霉菌分生孢子制剂相比,厚垣孢子制剂的货架期更长,防治效果也更好。但大规模生产真菌厚垣孢子非常困难。前期我们研究出了诱导木霉菌大量产生厚垣孢子的培养基和发酵新工艺,本研究通过对木霉菌厚垣孢子形成过程中不同生长发育阶段的转录组的比较分析,解析影响木霉菌厚垣孢子形成的关键基因及调控途径,为木霉菌厚垣孢子形成分子机制的解析,菌株遗传改良和发酵工艺控制提供理论指导。取得如下主要研究结果:1.通过多次系统地观察绿木霉菌GV29-8厚垣孢子形成过程,最终选择8个代表性时间点的24个样本进行转录组测序:产孢前期（20h/TVS1、24h/TVS2和26h/TVS3）;产孢初期（28h/TVS4和32h/TVS5）;产孢中期（38h//TVS6）;产孢盛期（45h/TVS7）;产孢后期（56h/TVS8）。24个样本共获得约206.07 Gb的可用数据（clean bases）,Q30均大于90.85%,总体mapping ratios为79.34%～85.96%。共获得19,737个基因,其中7332个是由stringtie软件预测的新基因。根据PCA分析,8个采样时间点样本被分为4个阶段:菌丝生长阶段S1（TVS1～TVS2）、厚垣孢子形成早中期阶段S2（TVS3～TVS6）,厚垣孢子形成盛期阶段S3（TVS7）,厚垣孢子形成后期和菌丝开始自溶阶段S4（TVS8）。2.将相邻阶段样本的转录组数据比较,共获得6462个差异基因（DEGs）。GO富集分析表明,S2比S1,DEGs主要显着富集到有机氮化合物代谢过程（GO:1901564）,共包含126个DEGs,下调表达的114个DEGs主要与有机氮化合物合成过程相关。S3比S2,DEGs主要显着富集到与次级代谢相关的四吡咯结合（GO:0046906）和血红素结合（GO:0020037）过程,共包含52个DEGs,主要是P450家族基因,且大部分参与有毒次级代谢产物的合成。S4比S3,DEGs则显着富集到脂质代谢过程（GO:0006629）,共包含54个DEGs,主要与磷脂、甘油酯以及脂肪酸代谢相关。KEGG富集分析表明,S2比S1,DEGs主要显着富集到核糖体（tre03010）途径。S3比S2,N-聚糖生物合成（tre00510）途径也被显着富集,包含14个DEGs,其中10个上调表达的DEGs参与甘露聚糖合成,3个下调表达的DEGs则与甘露聚糖的降解有关。将相邻时间点样本转录组数据比较,共获得5699个DEGs。KEGG富集分析表明TVS5比TVS4以及TVS6比TVS5,DEGs主要显着富集到细胞周期（tre04111）途径。WGCNA分析显示,与S1高度正相关的pink模块中主要是核糖体蛋白基因,显着富集到核糖体通路（tre03010）。与S2正相关的orange模块中主要是与氧化还原和跨膜运输过程相关基因,苯丙氨酸代谢（tre00360）、谷胱甘肽代谢（tre00480）、色氨酸代谢（tre00380）和次生代谢产物生物合成（tre01110）途径均被富集。与S4呈高度正相关的black和purple模块中主要是参与代谢、氧化还原和运输过程的基因,脂肪酸代谢（tre01212）、不饱和脂肪酸生物合成（tre01040）、氨基糖和核苷酸糖代谢（tre00520）以及淀粉和蔗糖代谢过程相关基因均被富集。其中,氨基糖和核苷酸糖代谢（tre00520）通路中共有16个基因发生差异表达,主要与几丁质代谢相关。与S4呈负相关的dark red和green模块中代谢和氧化还原基因占主导,脂肪酸降解（tre00071）通路在该模块中被富集。3.根据转录组数据分析,发现氨基糖和核苷糖代谢通路富集到较多的差异基因,其中几丁质酶Ech2基因、几丁质合成酶Chs1＿7926和Chs1＿8917基因表达量变化比较大。添加25g/L和45g/L几丁质代谢的一种中间代谢产物N-乙酰-D-氨基葡萄糖（Glc NAc）均显着抑制绿木霉菌GV29-8厚垣孢子形成。为了研究氨基糖和核苷糖代谢通路中几丁质酶和几丁质合成酶基因对绿木霉菌厚垣孢子形成的影响,构建了Ech2、Chs1＿7926和Chs1＿8917基因的敲除、过表达和回复株系。结果表明,Ech2基因敲除突变株的厚垣孢子产量较野生型菌株显着提高,同时生长速度和分生孢子产量也增加,但菌丝生物量减少。Chs1＿7926和Chs1＿8917基因敲除突变株无法正常形成厚垣孢子,且菌丝形态异常。同时菌株的生长速率、生物量、分生孢子产量及分生孢子萌发率均显着降低。添加25 g/L Glc NAc后突变株在厚垣孢子诱导培养基中培养的菌丝异常程度有所恢复但仍无法形成完整的厚垣孢子,其生长速率和分生孢子产量均有所增加。综上所述,通过对绿木霉菌GV29-8厚垣孢子形成过程中不同阶段样本转录组数据进行GO、KEGG、STC和WGCNA分析,初步明确了可能在厚垣孢子形成的各阶段中具有重要作用的代谢通路和基因。推测有机氮化合物代谢过程中的DEGs可能参与菌株生长早期（S1）菌丝的同化吸收作用,消耗培养基中的大量外源氮素,导致氮素缺乏（S2）;同时,在菌丝生长过程中与次级代谢相关的DEGs差异表达伴随着次级代谢产物和活性氧自由基的累积;由此产生的缺氮和不利培养条件可能使菌株启动细胞周期基因,调控细胞分化,诱导菌丝向厚垣孢子形态的转化。在厚垣孢子形成盛期（S3）和后期（S4）,甘露聚糖、几丁质、糖原和脂质合成代谢途径DEGs高表达,可能有利于厚垣孢子细胞壁的构建和能量储存。通过构建几丁质酶和几丁质合成酶基因的敲除、过表达和回复株系,初步明确了氨基糖和核苷糖代谢通路关键基因对绿木霉GV29-8菌株厚垣孢子形成的影响。我们的研究结果为解析影响木霉菌厚垣孢子形成的相关途径和基因提供了理论依据。
张静[9]（2021）在《新型Zn（Ⅱ）2Cys6调控因子BbTpc1在球孢白僵菌中的生物学功能研究》文中指出球孢白僵菌作为昆虫病原真菌的典型代表,被广泛应用于害虫的生物防治。但是它在感染昆虫宿主过程中,容易受到环境因素如温度、湿度、化学药剂等影响,致使真菌杀虫速度慢,防治效果不稳定等问题产生。因此,探索生防真菌抗逆境胁迫的生理机制,对以提高生防潜能为目标的菌株遗传改良及菌剂的合理应用具有重要意义。本研究围绕这一目标,采用农杆菌转化法构建了敲除菌株ΔBbTpc1和回补菌株ΔBbTpc1/BbTpc1,通过与球孢白僵菌野生型菌株（WT）比较,探究球孢白僵菌的Zn（II）2Cys6转录因子BbTpc1的功能,揭示了它对真菌细胞生长发育和抗逆性,尤其是几丁质合成方面发挥重要作用。本文的主要研究和结果如下:（1）球孢白僵菌BbTpc1的生物学功能1)BbTpc1缺失对营养生长造成了影响,在营养丰富的SDAY、1/4SDAY和营养缺乏的CZA培养基上,基因敲除菌株的菌落生长面积明显要比对照菌株（野生型和回补型）的要小,分别减少40.1%、52.5%和66.8%。与对照菌株相比,BbTpc1敲除菌株的间隔更加密集而且细胞更加短小。检测真菌菌丝中自噬过程的变化,在所有的菌株中均检测到自噬体,而在BbTpc1敲除菌株中观察到较大的溶酶体。上述结果显示BbTpc1敲除影响了球孢白僵菌的营养生长和菌丝细胞的分化。2)ΔBbTpc1菌株的产孢能力显示出严重的缺陷,在SDAY培养基上生长的第5 d到第7 d,分生孢子产率分别下降了68.5%,50.5%和48.8%。同时BbTpc1敲除菌株的芽生孢子产量也显着降低,在培养72 h和96 h时分别降低了34.2%和75%。最后经过流式细胞仪检测,BbTpc1敲除菌株的分生孢子和芽生孢子大小分别减少了12.3%和39.6%。但是BbTpc1敲除菌株与对照菌株在萌发的比率和速度方面没有差异。这些结果表明BbTpc1在分生孢子和芽生孢子的产生中起着重要的调控作用。3)ΔBbTpc1菌株抗逆性在高渗透压（NaCl）中降低了45.6%,杀菌剂（Carbendazim,CAR）中降低了32.8%,细胞壁干扰剂（Sodium dodecyl sulfate,SDS和Congo red,CR）中降低了39.8%和52.6%,在氧化剂（H2O2）中降低了18.2%。在耐热实验中,45℃湿热条件下敲除菌株的半致死时间(LT50)比野生菌株降低了11.8%。这些结果表明BbTpc1在维持球孢白僵菌对多种化学胁迫和高温的耐受性中起着重要作用。4)分别将WT菌株和ΔBbTpc1菌株的分生孢子采用浸泡和注射方法侵染大蜡螟（Galleria mellonella）的3龄幼虫,ΔBbTpc1菌株的半致死时间分别延迟了36.3%和66.7%,被ΔBbTpc1菌株感染的幼虫血腔中几乎没有形成菌丝体,并且虫尸身体表面真菌生长稀疏,说明BbTpc1是球孢白僵菌毒力的必要因素。（2）BbTpc1对真菌转录组的调控作用BbTpc1的缺失导致了1553个基因的表达水平显着改变（|log2FC|>1）,包括1166个下调基因和387个上调基因。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes）富集分析显示1553个差异基因主要富集在fatty acid degradation,amino sugar,nucleotide sugar metabolism和MAPK signaling pathway-yeast。对1553个差异基因的GO（Gene Ontology）分析表明BbTpc1的敲除主要影响膜相关基因,BbTpc1通过不同的遗传途径调控真菌的无性繁殖。BbTpc1的敲除显着影响了球孢白僵菌的转录图谱。（3）BbTpc1对真菌细胞壁完整性的影响通过透射电镜观察分生孢子细胞壁的厚度,敲除菌株的分生孢子细胞壁比对照菌株的分生孢子厚度减少,用酸解法对细胞壁成分进行测量,敲除菌株细胞壁中几丁质含量降低,而葡聚糖的含量没有明显差异。对几丁质合成酶家族基因的转录水平进行q RT-PCR（Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR）定量,结果显示在敲除菌株中,7个几丁质合成酶基因的表达量均下调。这些结果表明BbTpc1能够调控几丁质合成酶的表达,从而影响细胞壁中几丁质的含量,造成敲除菌株的细胞壁比对照菌株薄的结果。最后,通过酵母单杂技术,证明了BbTpc1并不能直接对几丁质合成酶基因进行调控。
陈春[10]（2021）在《Arthrobacter ramosus MTSase/MTHase分子改造及其制备海藻糖研究》文中研究说明海藻糖由两个葡萄糖基通过α-1,1糖苷键连接形成,其作为一种安全、稳定的天然二糖,素有“生命之糖”的美誉,被广泛应用于食品、化妆品和医药等行业。麦芽寡糖基海藻糖合酶（MTSase）和麦芽寡糖基海藻糖水解酶（MTHase）是以淀粉为底物制备海藻糖的两个关键酶。MTSase通过分子内转糖苷反应将底物还原端的α-1,4糖苷键异构为α-1,1糖苷键,生成麦芽寡糖基海藻糖,MTHase作为协同酶专一性水解麦芽寡糖基海藻糖中与α-1,1糖苷键相邻的α-1,4糖苷键,生成产物海藻糖。其中,MTSase催化的转糖苷反应对海藻糖转化率更为重要。目前,海藻糖主要通过中温MTSase/MTHase催化制备,其反应温度一般在45℃左右,容易造成生产过程中淀粉底物老化以及微生物污染,降低海藻糖转化率。高温MTSase/MTHase耐热性能好但存在可溶性表达差、酶活低问题,应用成本高。针对以上问题,本研究首先选取具有高表达量优势的来源于Arthrobacter ramosus的中温MTSase（Ar MTSase）进行研究,首次解析该酶晶体结构,揭示该酶与高温MTSase热稳定性差异的结构基础,为该酶热稳定性改造提供理论依据,之后通过分子改造提高该酶的热稳定性。同时,因为MTSase对海藻糖转化率具有重要的影响,通过分子改造提高该酶海藻糖转化率。在此基础上,通过分子改造来源于A.ramosus的中温MTHase（Ar MTHase）,提高其热稳定性并与Ar MTSase优势突变体复配应用,实现了在高温条件下高产量制备海藻糖。本研究主要结果如下:（1）Ar MTSase晶体结构解析。通过优化蛋白纯化方法和筛选蛋白结晶条件获得适合X-ray衍射的晶体,通过分子置换解析Ar MTSase的晶体结构。阐释Ar MTSase“漏斗型”催化中心和“侧沿协助效应”在该酶独特的催化特点和对高分子量麦芽寡糖底物的偏好性方面所发挥的重要作用。结构分析表明,该酶芳香族氨基酸、二硫键、盐桥键参与的分子内相互作用力显着低于高温MTSase,可能是影响该酶与高温MTSase热稳定性差异的主要因素。此外,分子动力学模拟结果表明,相对高温MTSase,该酶在温度升高时,整体氨基酸残基波动增强以及催化残基E261和D475难以维持正常催化构象,是Ar MTSase热稳定性较差的分子层面原因。（2）Ar MTSase分子改造提高热稳定性。通过定向进化获得G415P突变体,摇瓶发酵酶活与野生型酶差异不明显,60℃半衰期是野生型酶的3.0倍。通过Ar MTSase晶体结构分析以及与高温MTSase的序列比对,设计引入盐桥键的S361R/S444E突变体,摇瓶发酵酶活是野生型酶的1.1倍,半衰期是野生型酶的3.2倍。叠加后的S361R/S444E/G415P（M3）突变体,摇瓶发酵酶活与野生型酶差异不明显,半衰期是野生型酶的19.7倍,说明M3热稳定性显着提高。以野生型酶晶体结构为模板,同源建模分析发现,该突变体的361、444和415氨基酸位点空间位置靠近,促使“脯氨酸效应”与盐桥键具有协同作用,从而促进M3热稳定性显着提高。（3）Ar MTSase分子改造提高海藻糖转化率。建立提高海藻糖转化率高通量筛选的方法,通过定向进化获得S44P突变体。其对麦芽五糖的Km相比野生型酶降低47%,kcat/Km是野生型酶的2.2倍。以葡萄糖当量（DE）值为16的大米淀粉为底物在45℃制备海藻糖,突变体因更能充分利用底物中的低分子量麦芽寡糖,促使海藻糖转化率由野生型酶的70.3%提高到76.9%。同时解析S44P突变体的晶体结构,发现Pro44加强了底物通道入口处Loop E41-D51与底物的结合,促进了底物的利用,提高了海藻糖转化率。基于Loop E41-D51上氨基酸残基保守性分析,针对位点Ser47设计相应的突变体,探究其与底物之间疏水、氢键作用和位阻效应对海藻糖转化率的影响。其中S47A具有较高的海藻糖转化率,但其热稳定性降低。之后将S44P、S47A分别与M3叠加,分别得到M4P和M4A。60℃保温15 min,M4A的残留酶活相比M3下降16.6%,表明其热稳定性降低,M4P的残留酶活相比M3无明显差异,同时其海藻糖转化率由M3的71.6%提高到75.0%。（4）Ar MTSase优势突变体与MTHase的复配应用。MTSase制备海藻糖需要MTHase的协同作用,为了验证M4P是否可以满足高温应用条件,选取不同来源的高温MTHase进行研究。结果表明,M4P和Sulfolobus acidocaldarius ATCC 35092来源的MTHase复配具有最高的海藻糖转化率74.7%,相同条件下野生型Ar MTSase转化率为32.1%,表明M4P可以满足高温应用条件。Ar MTHase相比上述高温MTHase具有外源表达量高、用酶成本低的优势,更具有工业应用前景,但热稳定性差。通过定向进化改造Ar MTHase提高其热稳定性,获得L137M和A216T突变体,两个突变体摇瓶发酵酶活与野生型酶无明显差异,半衰期分别为野生型酶1.3和1.5倍。但双突变体L137M/A216T不具有协同作用。经酶反应条件优化,突变体A216T和M4P在57℃下复配制备海藻糖,转化率最高为75.3%,相比野生型Ar MTSase/Ar MTHase复配的最适应用温度为45℃,转化率最高为70.3%,二者复配应用将反应体系温度提高了12℃,海藻糖转化率提高了5%,实现了在高温条件下高产量制备海藻糖。
二、酵母海藻糖合成酶基因植物表达载体的构建（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、酵母海藻糖合成酶基因植物表达载体的构建（论文提纲范文）
（1）谷氨酸棒杆菌抗高渗元件的挖掘和功能表征（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 微生物细胞抵御高渗胁迫的耐受与响应机制 |
| 1.1.1 高渗胁迫下的离子平衡 |
| 1.1.2 高渗胁迫下的信号转导途径 |
| 1.1.3 高渗胁迫下的相溶溶质的摄取和积累 |
| 1.2 高渗透压对微生物发酵的影响 |
| 1.2.1 高渗透压对细胞生长及发酵产物合成的影响 |
| 1.2.2 高渗透压胁迫对微生物体内代谢平衡的影响 |
| 1.2.3 高渗透压胁迫对微生物细胞形态的影响 |
| 1.3 微生物抗高渗研究现状 |
| 1.3.1 适应性实验室进化 |
| 1.3.2 代谢工程 |
| 1.3.3 外源添加相溶溶质 |
| 1.4 抗渗元件的筛选 |
| 1.4.1 活性氧的清除 |
| 1.4.2 DNA修复 |
| 1.4.3 转录调控因子 |
| 1.4.4 热激蛋白 |
| 1.4.5 能量代谢 |
| 1.4.6 细胞膜基因 |
| 1.5 谷氨酸棒杆菌简介 |
| 1.5.1 谷氨酸棒杆菌主要特征 |
| 1.5.2 谷氨酸棒杆菌主要应用 |
| 1.5.3 谷氨酸棒杆菌在环境压力下的选育 |
| 1.6 立题背景与意义 |
| 1.7 主要研究内容 |
| 1.8 技术路线 |
| 1.9 论文创新点 |
| 第2章 与耐高渗透压有关功能元件的测试 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 菌株和质粒 |
| 2.2.2 试验仪器和试剂 |
| 2.2.3 培养基 |
| 2.2.4 主要溶液 |
| 2.2.5 本研究所用的引物 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 菌种培养 |
| 2.3.2 谷氨酸棒杆菌感受态制备 |
| 2.3.3 谷氨酸棒杆菌感受态细胞的电转化方法 |
| 2.3.4 重组质粒的构建方法 |
| 2.3.5 大肠杆菌感受态的制备 |
| 2.3.6 大肠杆菌感受态细胞化学转化法 |
| 2.3.7 菌种基因组提取 |
| 2.3.8 质粒提取 |
| 2.3.9 胶回收 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 谷氨酸棒杆菌在不同赖氨酸盐酸盐压力下生长测试 |
| 2.4.2 抗渗元件的构建 |
| 2.4.3 抗渗元件的挖掘与鉴定 |
| 2.4.4 抗渗元件在无压力培养基中的生长测试 |
| 2.4.5 异源表达热激蛋白Hspq对谷氨酸棒杆菌耐高渗透压的影响 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 谷氨酸棒杆菌高渗透压胁迫转录组分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 菌株和质粒 |
| 3.2.2 试验仪器和试剂 |
| 3.2.3 培养基 |
| 3.2.4 主要溶液 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.4 转录组数据组分析流程 |
| 3.4.1 RNA的提取 |
| 3.4.2 文库的构建与质检 |
| 3.4.3 上机测序 |
| 3.4.4 信息分析流程 |
| 3.5 结果与分析 |
| 3.5.1 谷氨酸棒杆菌转录组概述 |
| 3.5.2 富集分析 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 基于转录组分析的耐高渗元件挖掘 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.2.1 菌株和质粒 |
| 4.2.2 试验仪器和试剂 |
| 4.2.3 培养基 |
| 4.2.4 主要溶液 |
| 4.2.5 本研究所用引物 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 耐高渗基因元件的筛选 |
| 4.4.2 DNA修复基因敲除验证分析 |
| 4.4.3 能量代谢基因敲除验证分析 |
| 4.4.4 OxyR转录调控因子基因敲除验证分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）共表达ZxNHX1-VP1-1紫花苜蓿的分子鉴定及ZxNHX1-PcCLCg紫花苜蓿的耐盐性评价（论文提纲范文）
| 缩写词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 国内外研究进展 |
| 1.1 液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白 |
| 1.1.1 液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白概述 |
| 1.1.2 液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白在植物耐盐性中的作用 |
| 1.2 液泡膜H~+-焦磷酸酶 |
| 1.2.1 液泡膜H~+-焦磷酸酶概述 |
| 1.2.2 液泡膜H~+-焦磷酸酶在植物耐盐性中的作用 |
| 1.3 液泡膜Cl~-通道蛋白 |
| 1.3.1 液泡膜Cl~-通道蛋白概述 |
| 1.3.2 液泡膜Cl~-通道蛋白在植物耐盐性中的作用 |
| 1.4 多基因聚合改良植物抗逆性的研究进展 |
| 1.4.1 抗非生物胁迫 |
| 1.4.2 抗生物胁迫 |
| 1.5 转基因紫花苜蓿研究进展 |
| 1.5.1 抗非生物胁迫 |
| 1.5.2 抗生物胁迫 |
| 1.6 外源基因在受体植物中的整合检测 |
| 1.6.1 PCR检测 |
| 1.6.2 外源基因拷贝数检测 |
| 1.7 外源基因表达产物检测 |
| 1.7.1 Western Blot检测 |
| 1.7.2 酶联免疫吸附法 |
| 1.7.3 免疫试纸条法 |
| 第二章 共表达ZxNHX1-VP1-1 紫花苜蓿的分子鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 植物DNA及质粒DNA提取 |
| 2.1.3 PCR检测 |
| 2.1.4 Southern Blot检测 |
| 2.1.5 植物总RNA提取及cDNA制备 |
| 2.1.6 RT-PCR检测 |
| 2.1.7 植物总蛋白提取 |
| 2.1.8 Westhern Blot检测 |
| 2.1.9 ELISA检测 |
| 2.1.10 数据分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 共表达ZxNHX1-VP1-1 紫花苜蓿的PCR检测结果 |
| 2.2.2 共表达ZxNHX1-VP1-1 紫花苜蓿的Southern Blot检测结果 |
| 2.2.3 共表达ZxNHX1-VP1-1 紫花苜蓿的Western Blot检测结果 |
| 2.2.4 共表达ZxNHX1-VP1-1 紫花苜蓿的ELISA检测结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 共表达ZxNHX1-PcCLCg紫花苜蓿的耐盐性评价 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 PCR检测 |
| 3.1.2 RT-PCR检测 |
| 3.1.3 盐处理方案 |
| 3.1.4 生长指标的测定 |
| 3.1.5 生理指标及测定方法 |
| 3.1.6 数据分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 共表达ZxNHX1-PcCLCg紫花苜蓿的分子检测 |
| 3.2.2 盐胁迫对共表达ZxNHX1-PcCLCg紫花苜蓿长势的影响 |
| 3.2.3 盐胁迫对共表达ZxNHX1-PcCLCg紫花苜蓿生物量的影响 |
| 3.2.4 盐胁迫对共表达ZxNHX1-PcCLCg紫花苜蓿叶片相对质膜透性的影响 |
| 3.2.5 盐胁迫对共表达ZxNHX1-PcCLCg紫花苜蓿叶片渗透势的影响 |
| 3.2.6 盐胁迫对共表达ZxNHX1-PcCLCg紫花苜蓿Na~+、K~+、Cl~-的影响 |
| 3.2.7 盐胁迫对共表达ZxNHX1-PcCLCg紫花苜蓿根部Na~+和Cl~-净吸收速率的影响 |
| 3.2.8 盐胁迫下共表达ZxNHX1-PcCLCg紫花苜蓿中Na~+、K~+和Cl~-对叶片渗透势的贡献 |
| 3.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（3）MTSase和MTHase在枯草芽孢杆菌中的异源表达及其固定化应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 海藻糖的概述 |
| 1.1.1 海藻糖的简介 |
| 1.1.2 海藻糖的性质 |
| 1.1.3 海藻糖生物学功能 |
| 1.1.4 海藻糖的应用 |
| 1.1.5 海藻糖的生产 |
| 1.2 MTSase和 MTHase概述 |
| 1.2.1 MTSase和 MTHase的性质 |
| 1.2.2 MTSase和 MTHase的研究进展 |
| 1.3 Bacillus subtilis表达系统 |
| 1.3.1 B.subtilis概述 |
| 1.3.2 B.subtilis宿主与载体 |
| 1.3.3 B.subtilis的应用 |
| 1.4 固定化酶概述 |
| 1.4.1 固定化介绍 |
| 1.4.2 固定化的优缺点 |
| 1.4.3 固定化的方法 |
| 1.4.4 固定化的研究进展 |
| 1.5 SpyCatcher/SpyTag体系概述 |
| 1.5.1 SpyCatcher/SpyTag体系介绍 |
| 1.5.2 SpyCatcher/SpyTag体系的应用 |
| 1.6 立题背景和研究内容 |
| 1.6.1 立题背景 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 第2章 MTSase和 MTHase在 B.subtilis中的表达 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株和载体 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 主要仪器设备 |
| 2.2.4 培养基及溶液 |
| 2.2.5 引物核苷酸序列 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 B.subtilis感受态制备和转化 |
| 2.3.2 载体和菌株构建 |
| 2.3.3 重组酶在B.subtilis的表达 |
| 2.3.4 重组酶的分离纯化 |
| 2.3.5 重组酶活力测定 |
| 2.3.6 酶学性质研究 |
| 2.3.7 重组B.Subtilis培养基优化 |
| 2.3.8 海藻糖浓度测定 |
| 2.3.9 海藻糖转化条件优化 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 目的基因的克隆与载体构建 |
| 2.4.2 MTSase和 MTHase的酶学性质 |
| 2.4.3 重组菌培养基优化 |
| 2.4.4 海藻糖转化条件优化 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 MTSase和 MTHase固定化研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株和载体 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 主要仪器设备 |
| 3.2.4 培养基及溶液 |
| 3.2.5 引物核苷酸序列 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 分子操作 |
| 3.3.2 载体和菌株构建 |
| 3.3.3 重组酶在B.subtilis的表达 |
| 3.3.4 SpyCatcher固定化载体的制备 |
| 3.3.5 SpyCatcher固定化载体的测定 |
| 3.3.6 酶固定化率的测定 |
| 3.3.7 固定酶化酶学性质研究 |
| 3.3.8 固定化条件优化 |
| 3.3.9 粗酶液中重组酶的固定 |
| 3.3.10 固定化酶循环利用研究 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 重组酶纯化与固定化 |
| 3.4.2 目的基因的克隆与载体构建 |
| 3.4.3 重组酶的分离纯化 |
| 3.4.4 固定化载体的制备 |
| 3.4.5 重组酶的固定化 |
| 3.4.6 固定酶化酶学性质研究 |
| 3.4.7 固定化条件优化 |
| 3.4.8 粗酶液中重组酶的固定化 |
| 3.4.9 固定化酶循环利用研究 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 论文创新点 |
| 4.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要科研成果 |
（4）丹参SmMYB36与SmCSN5蛋白的互作关系鉴定及其作用分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 丹参药用成分的国内外研究进展 |
| 1.2 MYB转录因子调控丹参活性成分的研究进展 |
| 1.3 MYB转录因子泛素化修饰研究进展 |
| 1.4 COP9 信号复合体的国内外研究 |
| 1.4.1 COP9 信号复合体的生物学功能 |
| 1.4.2 COP9 信号复合体参与植物泛素化途径 |
| 1.5 COP9 信号复合体5 亚基(CSN5)研究进展 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 1.7 研究内容和技术路线 |
| 1.7.1 研究内容 |
| 1.7.2 技术路线 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌种 |
| 2.1.3 载体质粒 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 融合表达载体构建 |
| 2.2.2 SmMYB36 互作蛋白的筛选 |
| 2.2.3 蛋白原核表达、纯化及Western blot免疫检测 |
| 2.2.4 Pull-down蛋白互作技术 |
| 2.2.5 植物材料的种植 |
| 2.2.6 植物总RNA的提取及荧光定量PCR技术 |
| 2.2.7 拟南芥原生质体相关技术 |
| 2.2.8 双分子荧光互补技术Bi FC |
| 2.2.9 农杆菌介导烟草瞬时表达体系 |
| 2.2.10 双荧光素酶互补技术LCI |
| 2.2.11 亚细胞共定位 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 丹参转录因子SmMYB36 互作蛋白筛选 |
| 3.1.1 诱饵蛋白表达载体的构建 |
| 3.1.2 酵母双杂交筛库 |
| 3.2 丹参SmCSN家族基因生信分析 |
| 3.2.1 SmCSN蛋白理化性质预测 |
| 3.2.2 SmCSN蛋白的亚细胞定位预测 |
| 3.2.3 SmCSN5 生物信息学分析 |
| 3.3 SmCSN5 基因时空表达分析 |
| 3.4 SmMYB36与SmCSN5 互作关系分析 |
| 3.4.1 Pulldown验证SmMYB36与SmCSN5 体外互作 |
| 3.4.2 SmCSN5与SmMYB36 酵母双杂交回复验证 |
| 3.4.3 Bi FC验证SmMYB36与SmCSN5 体内互作 |
| 3.4.4 LCI验证SmMYB36与SmCSN5 体内互作 |
| 3.4.5 SmMYB36与SmCSN5 互作结构域鉴定 |
| 3.6 SmMYB36与SmCSN5 亚细胞共定位分析 |
| 3.6.1 荧光蛋白标签融合载体的构建 |
| 3.6.2 蛋白表达共定位 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 丹参SmMYB36 转录因子互作蛋白的筛选 |
| 4.2 SmMYB36与SmCSN5 蛋白的互作关系分析 |
| 4.3 SmCSN5对SmMYB36 蛋白作用分析 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）糖代谢相关基因Matps与Mapepck对高山被孢霉脂质积累的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 微生物油脂及高山被孢霉相关简介 |
| 1.1.1 微生物油脂及产油微生物简介 |
| 1.1.2 高山被孢霉产多不饱和脂肪酸概述 |
| 1.1.3 氮限制下胞内脂质积累特征 |
| 1.2 微生物中的糖代谢概述 |
| 1.2.1 中心碳代谢 |
| 1.2.2 糖类合成与碳通量分流 |
| 1.2.3 糖异生与碳通量“逆流” |
| 1.3 高山被孢霉中糖类合成关键基因的相关研究 |
| 1.3.1 高山被孢霉中影响碳通量分配的潜在因素分析 |
| 1.3.2 海藻糖-6-磷酸合成酶基因tps相关研究 |
| 1.3.3 磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pepck相关研究 |
| 1.4 立题背景与意义 |
| 1.5 课题研究内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株及质粒 |
| 2.1.2 主要培养基 |
| 2.1.3 主要试剂及配制 |
| 2.1.4 实验设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 菌株活化及培养 |
| 2.2.2 目的基因的基本生物信息学分析 |
| 2.2.3 目的基因RNA干扰载体及菌株的构建 |
| 2.2.4 生物量及发酵液残糖残氮测定 |
| 2.2.5 脂肪酸测定 |
| 2.2.6 胞内糖类测定 |
| 2.2.7 基因转录水平测定 |
| 2.2.8 磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶活测定 |
| 2.2.9 代谢产物的提取分析 |
| 2.2.10 菌体还原力测定 |
| 2.2.11 数据处理及分析 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 高山被孢霉发酵过程糖类与脂质变化趋势 |
| 3.1.1 高山被孢霉胞内糖类的提取与测定 |
| 3.1.2 氮限制下高山被孢霉发酵过程中胞内糖类与脂质积累特点 |
| 3.2 高山被孢霉干扰重组菌株的构建及筛选 |
| 3.2.1 高山被孢霉Matps基因与Mapepck基因生物信息学分析 |
| 3.2.2 高山被孢霉Matps基因与Mapepck基因干扰表达载体及菌株的构建 |
| 3.2.3 高山被孢霉Matps基因与Mapepck基因干扰重组菌株的筛选 |
| 3.3 高山被孢霉Matps基因在糖类合成与脂质积累的作用分析 |
| 3.3.1 干扰Matps基因对菌株转录水平的影响 |
| 3.3.2 干扰 Matps基因对菌株生长及胞内糖类与脂质积累的影响 |
| 3.3.3 环境胁迫下干扰Matps基因对菌株的影响 |
| 3.4 高山被孢霉Mapepck基因在生长代谢及糖、脂积累的作用分析 |
| 3.4.1 干扰Mapepck基因对菌株转录水平与酶活的影响 |
| 3.4.2 干扰 Mapepck 对菌株生长及胞内糖类与脂质积累的影响 |
| 3.4.3 干扰Mapepck基因对菌株代谢产物的影响 |
| 3.4.4 高山被孢霉Mapepck RNA干扰菌株的发酵罐放大培养 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 附录 B:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（6）依赖于ATG6的自噬在番茄氮胁迫中的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 引言 |
| 1.1 植物自噬的形成及其调控 |
| 1.1.1 植物自噬形成的分子机制及其分类 |
| 1.1.2 植物自噬起始的激酶调控 |
| 1.1.3 植物激素在自噬中作用 |
| 1.1.4 植物自噬的转录调控 |
| 1.2 植物自噬在生长及逆境胁迫中的作用 |
| 1.2.1 植物自噬在生长发育的作用 |
| 1.2.2 植物自噬在非生物胁迫中的作用 |
| 1.2.3 植物自噬在生物胁迫中的作用 |
| 1.3 植物NO_3~-的吸收与同化 |
| 1.3.1 植物根系NO_3~-的吸收机制 |
| 1.3.2 植物NO_3~-的同化及转运机制 |
| 1.4 BRs的信号转导及功能 |
| 1.4.1 BRs的信号转导 |
| 1.4.2 BRs在逆境胁迫及作物生产中的作用 |
| 1.5 植物的碳、氮平衡 |
| 1.6 本文的研究目的与意义 |
| 2 番茄自噬在低氮胁迫中发挥重要作用 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料与处理 |
| 2.1.2 atg突变体材料构建 |
| 2.1.3 总RNA提取与基因表达分析 |
| 2.1.4 植物干鲜重及氮含量测定 |
| 2.1.5 叶绿素含量测定 |
| 2.1.6 MDC染色 |
| 2.1.7 TEM分析 |
| 2.1.8 GFP-ATG8f发根实验及荧光观测 |
| 2.1.9 蛋白提取与免疫印记 |
| 2.1.10 数据统计与方差分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 低氮处理诱导番茄叶部及根部ATGs基因的表达 |
| 2.2.2 自噬突变体对低氮胁迫敏感 |
| 2.2.3 自噬在低氮胁迫中发挥重要作用 |
| 2.3 讨论 |
| 3 依赖于ATG6 的自噬对番茄氮吸收及同化的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料与处理 |
| 3.1.2 ATG6 过表达材料构建 |
| 3.1.3 根系活力检测 |
| 3.1.4 总RNA提取与基因表达分析 |
| 3.1.5 氮同化酶活检测 |
| 3.1.6 植物干鲜重测定 |
| 3.1.7 叶绿素含量测定 |
| 3.1.8 植物氮含量测定 |
| 3.1.9 MDC染色 |
| 3.1.10 TEM分析 |
| 3.1.11 GFP-ATG8f发根实验及荧光观测 |
| 3.1.12 蛋白提取与免疫印记 |
| 3.1.13 总蛋白提取与考马斯亮蓝染色 |
| 3.1.14 游离氨基酸检测 |
| 3.1.15 数据统计与方差分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 依赖于ATG6 的自噬在低氮胁迫中发挥重要作用 |
| 3.2.2 低氮胁迫下依赖于ATG6 的自噬参与氮吸收 |
| 3.2.3 低氮胁迫下依赖于ATG6 的自噬调节氮同化与蛋白质积累 |
| 3.3 讨论 |
| 4 依赖于ATG6 的自噬在低氮胁迫下对番茄碳氮代谢的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料与处理 |
| 4.1.2 光合速率测定 |
| 4.1.3 叶绿素荧光的测定 |
| 4.1.4 蛋白提取与免疫印记 |
| 4.1.5 总RNA提取与基因表达分析 |
| 4.1.6 植物干鲜重与碳、氮含量测定 |
| 4.1.7 叶绿素含量测定 |
| 4.1.8 MDC染色 |
| 4.1.9 TEM分析 |
| 4.1.10 GFP-ATG8f发根实验及荧光观测 |
| 4.1.11 光合氮利用率计算 |
| 4.1.12 数据统计与方差分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 低氮胁迫下依赖于ATG6 的自噬在CO_2同化中发挥重要作用 |
| 4.2.2 根系中的依赖于ATG6 的自噬对低氮胁迫至关重要 |
| 4.2.3 依赖于ATG6 的自噬在氮从根系向上部分配中的作用 |
| 4.2.4 依赖于ATG6 的自噬提高低氮下番茄光合氮利用率 |
| 4.3 讨论 |
| 5 BZR1 介导的BR调控番茄自噬及在缺氮胁迫中的作用 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料与处理 |
| 5.1.2 BZR1 过表达材料构建 |
| 5.1.3 病毒诱导的基因沉默(VIGS)载体构建与农杆菌侵染 |
| 5.1.4 总RNA提取与基因表达分析 |
| 5.1.5 叶绿素含量测定 |
| 5.1.6 MDC染色 |
| 5.1.7 TEM分析 |
| 5.1.8 蛋白提取与免疫印记 |
| 5.1.9 酵母单杂交实验 |
| 5.1.10 染色质免疫共沉淀(ChIP-qPCR) |
| 5.1.11 数据统计与方差分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 BR诱导的自噬在缺氮胁迫中发挥重要作用 |
| 5.2.2 BZR1 介导了BR的信号转导 |
| 5.2.3 BZR1 转录调控ATGs基因 |
| 5.2.4 BZR1 介导的自噬在缺氮胁迫中发挥重要作用 |
| 5.3 讨论 |
| 6 SnRK1.1 在番茄低氮胁迫中的作用 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验材料与处理 |
| 6.1.2 SnRK1.1 过表达与突变体材料构建 |
| 6.1.3 病毒诱导的基因沉默(VIGS)载体构建与农杆菌侵染 |
| 6.1.4 总RNA提取与基因表达分析 |
| 6.1.5 酵母双杂实验 |
| 6.1.6 双分子荧光互补(Bi FC)实验以及与m Cherry-ATG8f共定位 |
| 6.1.7 荧光素酶互补(split-luciferase assay,LUC)成像实验 |
| 6.1.8 体外GST pull-down实验 |
| 6.1.9 体内免疫共沉淀(Co-IP)实验 |
| 6.1.10 体外磷酸化实验 |
| 6.1.11 蛋白提取与免疫印记 |
| 6.1.12 植物鲜重测定 |
| 6.1.13 叶绿素含量测定 |
| 6.1.14 MDC染色 |
| 6.1.15 TEM分析 |
| 6.1.16 数据统计与方差分析 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 SnRK1.1与ATGs互作介导自噬体的形成 |
| 6.2.2SnRK1.1 磷酸化调控ATG6 |
| 6.2.3 SnRK1.1 在低氮胁迫中的作用 |
| 6.2.4 SnRK1.1 介导了ATG6 诱导的低氮胁迫抗性 |
| 6.3 讨论 |
| 7 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 附表 |
| 个人简介 |
（7）小桐子PP2C、CP及cystatin基因家族和相应miRNAs的鉴定及其在低温响应与适应中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略表 |
| 第一章 研究背景 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 冷敏植物冷害、冷锻炼的现象及过程 |
| 1.2.1 低温对冷敏植物形态结构的影响 |
| 1.2.2 低温对冷敏植物光合作用和呼吸作用的影响 |
| 1.2.3 冷敏植物的冷锻炼现象 |
| 1.3 冷敏植物对低温的响应及信号转导 |
| 1.3.1 Ca~(2+)与冷锻炼信号转导 |
| 1.3.2 CBF与冷锻炼信号转导 |
| 1.3.3 ABA参与植物冷锻炼信号转导 |
| 1.3.4 MAPK、BIN2、CRPK |
| 1.4 冷敏植物冷锻炼的生化途径及分子机制 |
| 1.4.1 膜系统 |
| 1.4.2 氧化系统 |
| 1.4.3 渗透胁迫 |
| 1.4.4 冷诱导蛋白的基因表达 |
| 1.5 研究展望 |
| 1.6 植物中miRNAs研究进展 |
| 1.6.1 植物中miRNA的合成 |
| 1.6.2 植物miRNA的调控机制 |
| 1.6.3 miRNA在植物抗逆中的作用 |
| 1.7 本研究的目的及科学意义 |
| 1.8 本研究的内容 |
| 1.9 本研究技术路线 |
| 第二章 PP2C基因家族及对应的miRNAs的全基因组解析及其在小桐子对低温响应与适应的作用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 植物材料的培养 |
| 2.2.2 冷锻炼与低温处理 |
| 2.2.3 大肠杆菌和克隆载体 |
| 2.2.4 酵母菌和过表达载体 |
| 2.2.5 农杆菌和烟草过表达载体 |
| 2.2.6 所需培养基 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 转录组、miRNA组和降解组测序 |
| 2.3.2 小桐子PP2C家族成员的鉴定 |
| 2.3.4 系统发育关系、基因结构和蛋白质结构域分析 |
| 2.3.5 JcPP2C基因家族在染色体上定位 |
| 2.3.6 PP2C家族基因的差异表达 |
| 2.3.7 靶向PP2C家族的miRNAs的筛选 |
| 2.3.8 小桐子低温下m RNA和 miRNA的 qRT-PCR验证 |
| 2.3.9 小桐子JcPP2C14和JcPP2C29 基因的克隆及酵母表达验证 |
| 2.3.10 JcPP2C9、JcPP2C14和JcPP2C29 基因克隆及烟草过表达验证 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 小桐子PP2C基因家族中鉴定到的家族成员 |
| 2.4.2 进化树分析 |
| 2.4.3 JcPP2C家族的基因结构分析 |
| 2.4.4 JcPP2C家族的蛋白结构域分析 |
| 2.4.5 JcPP2C基因的染色体定位和复制 |
| 2.4.6 干旱、盐、GA3、BA和冷锻炼条件下小桐子基因表达谱分析 |
| 2.4.7 低温胁迫下小桐子PP2C家族基因的数字化表达谱及qRT-PCR分析 |
| 2.4.8 低温下micro RNA参与JcPP2C的调控分析 |
| 2.4.9 靶向JcPP2C的 miRNAs的数字表达谱分析 |
| 2.4.10 miRNAs及靶基因qRT-PCR验证 |
| 2.4.11 JcPP2C9、JcPP2C14和JcPP2C29 基因的克隆 |
| 2.4.12 JcPP2C9、JcPP2C14和JcPP2C29 基因生物信息学分析 |
| 2.4.13 酵母表达载体构建与转化及抗逆性分析 |
| 2.4.14 JcPP2C9、JcPP2C14、JcPP2C29 转基因烟草的再生 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 小桐子半胱氨酸蛋白酶家族和相应的miRNAs的鉴定及其对低温锻炼的响应 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 植物材料的培养 |
| 3.2.2 低温锻炼处理 |
| 3.2.3 转录组、miRNA组和降解组测序 |
| 3.2.4 小桐子半胱氨酸蛋白酶家族成员的鉴定 |
| 3.2.5 小桐子半胱氨酸蛋白酶家族的系统发育关系、多序列比对、染色体定位和蛋白质结构域分析 |
| 3.2.6 小桐子半胱氨酸蛋白酶家族基因及相应的miRNAs的数字表达谱分析 |
| 3.2.7 筛选和鉴定靶向小桐子半胱氨酸蛋白酶家族基因的miRNAs |
| 3.2.8 低温锻炼过程中小桐子半胱氨酸蛋白酶基因及相关的 miRNAs表达的 qRT-PCR分析 |
| 3.2.9 JcRD19C和 JcUCH2 基因的克隆 |
| 3.2.10 酵母表达载体JcRD19C-p YES2和JcUCH2-p YES2 载体的构建 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 小桐子半胱氨酸蛋白酶基因家族成员的鉴定 |
| 3.3.2 系统发育进化树分析 |
| 3.3.3 小桐子半胱氨酸蛋白酶家族的蛋白结构域分析 |
| 3.3.4 染色体定位及基因重复事件分析 |
| 3.3.5 小桐子半胱氨酸蛋白酶家族基因在不同器官中的表达谱分析 |
| 3.3.6 低温锻炼期间小桐子半胱氨酸蛋白酶家族基因的数字表达谱分析 |
| 3.3.7 小桐子靶向半胱氨酸蛋白酶家族基因的miRNAs的鉴定 |
| 3.3.8 低温锻炼期间靶向小桐子半胱氨酸蛋白酶家族基因的miRNAs数字表达谱及qRT-PCR分析 |
| 3.3.9 JcRD19C和 JcUCH2 基因的克隆 |
| 3.3.10 JcUCH2和JcRD19C基因信息分析 |
| 3.3.11 JcRD19C和 JcUCH2 同源性及进化树分析 |
| 3.3.12 JcRD19C和 JcUCH2 酵母表达载体的构建 |
| 3.3.13 JcRD19C-p YES2和JcUCH2-p YES2 重组质粒抗逆性分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 小桐子cystatin家族基因和相应miRNAs的鉴定及其在低温响应中可能的作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 植物材料的培养 |
| 4.2.2 冷锻炼与低温处理 |
| 4.2.3 转录组、miRNA组和降解组测序 |
| 4.2.4 小桐子cystatin家族成员的鉴定 |
| 4.2.5 小桐子cystatin家族的系统发育关系、多序列比对、染色体定位、基因结构和蛋白质结构域分析 |
| 4.2.6 小桐子cystatin家族基因及相应的miRNAs的数字表达谱分析 |
| 4.2.7 筛选和鉴定靶向小桐子cystatin家族的miRNAs |
| 4.2.8 冷锻炼过程中小桐子cystatin基因及相关的 miRNAs表达的 qRT-PCR分析 |
| 4.2.9 JcCYS2 基因的克隆 |
| 4.2.10 酵母表达载体JcCYS2-p YES2 载体的构建 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 小桐子cystatin基因家族成员的鉴定 |
| 4.3.2 小桐子cystatin家族系统发育进化树分析 |
| 4.3.3 小桐子cystatin家族的氨基酸序列比对与蛋白结构域分析 |
| 4.3.4 小桐子cystatin基因的染色体定位及重复性分析 |
| 4.3.5 小桐子cystatin家族基因在不同组织中及逆境胁迫下的表达谱分析 |
| 4.3.6 冷锻炼期间小桐子cystatin家族基因的数字表达谱及qRT-PCR分析 |
| 4.3.7 小桐子靶向cystatin家族基因的miRNAs的鉴定 |
| 4.3.8 冷锻炼期间靶向小桐子cystatin 家族基因的miRNAs数字表达谱及qRT-PCR 分析 |
| 4.3.9 JcCYS2 基因全长克隆 |
| 4.3.10 JcCYS2-p YES2 酵母表达载体的构建 |
| 4.3.11 JcCYS2 蛋白二级结构及三级结构分析 |
| 4.3.12 JcCYS2 多序列比对 |
| 4.3.13 JcCYS2 的进化分析 |
| 4.3.14 靶向JcCYS2的miRNAs的筛选与靶位点预测 |
| 4.3.15 JcCYS2与miRNAs的 qRT-PCR分析 |
| 4.3.16 JcCYS2 重组酵母的抗逆性分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 研究结论与展望 |
| 5.1 研究结论 |
| 5.2 本研究主要创新点 |
| 5.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 项目资助 |
| 攻读学位期间发表的学术论文和研究成果 |
| 致谢 |
（8）绿木霉菌GV29-8厚垣孢子形成分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 木霉菌及其生物防治应用现状和存在的问题 |
| 1.1.1 木霉菌概述 |
| 1.1.2 木霉菌的生物防治作用机制 |
| 1.1.3 木霉菌的生物防治应用现状 |
| 1.1.4 木霉菌生防制剂种类及其在生产应用中存在的问题 |
| 1.2 真菌厚垣孢子形成的相关研究 |
| 1.2.1 真菌厚垣孢子概述 |
| 1.2.2 培养条件对真菌厚垣孢子形成的影响 |
| 1.2.3 真菌厚垣孢子形成的相关分子机制的研究 |
| 1.2.4 木霉菌厚垣孢子形成的相关研究 |
| 1.3 转录组测序技术在真菌厚垣孢子形成机制研究中的应用 |
| 1.4 真菌几丁质代谢途径的功能研究 |
| 1.4.1 真菌几丁质的功能 |
| 1.4.2 真菌几丁质代谢途径 |
| 1.5 研究的目的和意义 |
| 1.6 研究技术路线 |
| 第二章 绿木霉GV29-8 菌株厚垣孢子形成的转录组学研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 菌株培养 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 仪器 |
| 2.1.4 取样 |
| 2.1.5 c DNA文库的构建及转录组测序 |
| 2.1.6 测序数据的生物信息学分析 |
| 2.1.7 使用RT-q PCR验证转录组数据 |
| 2.1.8 绿木霉菌GV29-8 厚垣孢子形成过程中糖原、脂质和几丁质的含量分析 |
| 2.1.9 统计分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 绿木霉GV29-8 菌株厚垣孢子的形成过程观察及转录组测序时间点的确定 |
| 2.2.2 转录组数据统计分析 |
| 2.2.3 厚垣孢子形成过程中各样本之间的相关性分析 |
| 2.2.4 厚垣孢子形成过程中差异基因表达分析 |
| 2.2.5 相邻阶段比较DEGs的 GO和 KEGG富集分析 |
| 2.2.6 相邻时间点比较DEGs的 GO和 KEGG富集分析 |
| 2.2.7 相邻时间点比较DEGs的 STC分析 |
| 2.2.8 厚垣孢子形成过程中表达基因加权共表达网络(WGCNA)分析 |
| 2.2.9 绿木霉菌GV29-8 在厚垣孢子形成过程中糖原、脂质和几丁质含量的变化 |
| 2.2.10 RNA-seq基因表达的验证 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 氨基糖和核苷糖代谢通路关键基因对绿木霉GV29-8 厚垣孢子形成的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试菌株、质粒和引物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 N-乙酰-D-氨基葡萄糖对绿木霉GV29-8 菌株厚垣孢子形成的影响 |
| 3.1.5 Ech2 基因敲除突变株的获得 |
| 3.1.6 Ech2 基因回复突变株的获得 |
| 3.1.7 Ech2 基因过表达突变株的获得 |
| 3.1.8 Ech2 基因对绿木霉GV29-8 菌株厚垣孢子形成的影响 |
| 3.1.9 Chs1_7926和Chs1_8917 基因敲除突变株的获得 |
| 3.1.10 Chs1_7926和Chs1_8917 基因回复突变株的获得 |
| 3.1.11 Chs1_7926和Chs1_8917 基因过表达突变株的的获得 |
| 3.1.12 Chs1_7926和Chs1_8917 基因对绿木霉GV29-8 菌株厚垣孢子形成的影响 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 N-乙酰-D-氨基葡萄糖影响绿木霉GV29-8 菌株厚垣孢子的形成 |
| 3.2.2 Ech2 基因对绿木霉GV29-8 菌株厚垣孢子形成的影响 |
| 3.2.3 Chs1_7926和Chs1_8917 基因对绿木霉GV29-8 菌株厚垣孢子形成的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 4.1 主要结论 |
| 4.2 主要创新点及研究成果 |
| 4.3 存在的问题和展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）新型Zn（Ⅱ）2Cys6调控因子BbTpc1在球孢白僵菌中的生物学功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 球孢白僵菌的研究现状 |
| 1.2.1 球孢白僵菌 |
| 1.2.2 影响球孢白僵菌毒力的基因和作用机制 |
| 1.3 几丁质的功能和结构 |
| 1.4 Zn(Ⅱ)_2Cys_6转录因子的研究现状 |
| 1.4.1 Zn(II)2Cys6 蛋白 |
| 1.4.2 Tpc1 的研究现状 |
| 1.5 研究意义和研究内容 |
| 1.5.1 本文主要研究意义 |
| 1.5.2 本文主要研究内容 |
| 1.5.3 本文主要技术路线 |
| 第2章 BbTpc1的生物信息学分析与突变菌株构建 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 BbTpc1的生物信息学分析 |
| 2.2.2 基因组的提取 |
| 2.2.3 BbTpc1突变载体的构建 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 第3章 BbTpc1 影响真菌生长发育和生物防治潜能 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株及培养条件 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 营养生长与抗逆生长测定 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 BbTpc1 影响营养生长和分化 |
| 3.3.2 BbTpc1 影响真菌的无性发育 |
| 3.3.3 BbTpc1 影响真菌的抗逆性 |
| 3.3.4 BbTpc1 影响球孢白僵菌的毒力 |
| 第4章 BbTpc1 对转录组的调控 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 送检样品处理 |
| 4.1.2 样本分析方法 |
| 4.1.3 菌株的RNA提取 |
| 4.1.4 RNA反转录c DNA第一链的合成 |
| 4.2 结果分析与讨论 |
| 4.2.1 BbTpc1 的缺失影响了球孢白僵菌的转录图谱 |
| 第5章 BbTpc1 对几丁质合成的影响 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 菌株与载体 |
| 5.1.2 培养基和试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 分生孢子细胞壁厚度测定 |
| 5.2.2 分生孢子细胞壁主要成分含量变化测定 |
| 5.2.3 荧光定量PCR验证 |
| 5.2.4 酵母单杂载体构建 |
| 5.2.5 制备酵母感受态细胞 |
| 5.2.6 酵母感受态细胞的转化 |
| 5.3 实验结果与讨论 |
| 5.3.1 BbTpc1 影响分生孢子细胞壁厚度 |
| 5.3.2 BbTpc1影响分生孢子细胞壁成分 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（10）Arthrobacter ramosus MTSase/MTHase分子改造及其制备海藻糖研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 海藻糖概述 |
| 1.1.1 海藻糖的结构和性质 |
| 1.1.2 海藻糖的生物功能 |
| 1.1.3 海藻糖的应用 |
| 1.1.4 海藻糖的制备 |
| 1.2 MTSase概述 |
| 1.2.1 MTSase的来源和性质 |
| 1.2.2 MTSase的分子改造 |
| 1.3 MTHase概述 |
| 1.4 蛋白质结构解析方法 |
| 1.5 酶分子改造策略 |
| 1.6 本课题的立题依据和研究意义 |
| 1.7 本论文的主要研究内容 |
| 第二章 ArMTSase晶体结构解析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株与质粒 |
| 2.2.2 试剂和仪器 |
| 2.2.3 培养基 |
| 2.2.4 突变体的构建 |
| 2.2.5 酶的摇瓶发酵 |
| 2.2.6 酶的分离纯化 |
| 2.2.7 蛋白浓度的测定及SDS-PAGE |
| 2.2.8 蛋白结晶条件的筛选和优化 |
| 2.2.9 蛋白晶体的衍射和数据处理 |
| 2.2.10 分子动力学模拟 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 ArMTSase蛋白晶体的获得 |
| 2.3.2 ArMTSase蛋白晶体衍射及数据处理 |
| 2.3.3 ArMTSase的结构分析 |
| 2.3.4 ArMTSase和高温MTSase热稳定性差异的原因分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 ArMTSase分子改造提高热稳定性 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株与质粒 |
| 3.2.2 试剂和仪器 |
| 3.2.3 培养基 |
| 3.2.4 突变体的构建 |
| 3.2.5 突变文库的构建 |
| 3.2.6 转化子的挑取和培养 |
| 3.2.7 酶的摇瓶发酵 |
| 3.2.8 高通量筛选以及摇瓶发酵酶活的测定 |
| 3.2.9 酶的分离纯化 |
| 3.2.10 蛋白浓度的测定及SDS-PAGE |
| 3.2.11 动力学稳定性测定 |
| 3.2.12 热动力学稳定性测定 |
| 3.2.13 酶的最适温度和最适p H测定 |
| 3.2.14 酶动力学参数测定 |
| 3.2.15 海藻糖的制备 |
| 3.2.16 海藻糖的检测 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 理性设计提高ArMTSase的热稳定性 |
| 3.3.2 定向进化和理性设计结合提高ArMTSase的热稳定性 |
| 3.3.3 野生型及突变体的分离纯化 |
| 3.3.4 野生型及突变体的酶学性质 |
| 3.3.5 野生型及突变体制备海藻糖 |
| 3.3.6 突变体热稳定性提高的原因分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 ArMTSase分子改造提高海藻糖转化率 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株与质粒 |
| 4.2.2 试剂和仪器 |
| 4.2.3 培养基 |
| 4.2.4 突变体的构建 |
| 4.2.5 突变文库的构建 |
| 4.2.6 转化子的挑取和培养 |
| 4.2.7 酶的摇瓶发酵 |
| 4.2.8 阳性突变体的筛选 |
| 4.2.9 酶活的测定 |
| 4.2.10 酶的分离纯化 |
| 4.2.11 蛋白浓度的测定及SDS-PAGE |
| 4.2.12 酶的热稳定性检测 |
| 4.2.13 酶的最适温度和最适p H以及酶动力学参数测定 |
| 4.2.14 海藻糖的制备和检测 |
| 4.2.15 晶体结晶条件的筛选、优化、衍射和数据处理 |
| 4.2.16 酶的分子对接和结合自由能计算 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 ArMTSase定向进化提高海藻糖转化率 |
| 4.3.2 ArMTSase理性设计提高海藻糖转化率 |
| 4.3.3 海藻糖转化率提高突变体和热稳定性提高突变体的组合 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 ArMTSase优势突变体与MTHase的复配应用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株与质粒 |
| 5.2.2 试剂和仪器 |
| 5.2.3 培养基 |
| 5.2.4 突变体文库的构建 |
| 5.2.5 转化子的挑取和培养 |
| 5.2.6 酶的摇瓶发酵 |
| 5.2.7 阳性突变体的筛选 |
| 5.2.8 酶活的测定 |
| 5.2.9 酶的分离纯化 |
| 5.2.10 蛋白浓度的测定及SDS-PAGE |
| 5.2.11 酶的半衰期测定 |
| 5.2.12 酶的最适温度和最适p H测定 |
| 5.2.13 酶的动力学参数测定 |
| 5.2.14 海藻糖的制备 |
| 5.2.15 海藻糖的检测 |
| 5.2.16 突变体和野生型的同源建模 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 不同来源高温MTHase的选择 |
| 5.3.2 不同来源高温MTHase的克隆表达 |
| 5.3.3 不同来源高温MTHase和 M4_P复配制备海藻糖 |
| 5.3.4 Ar MTHase的定向进化提高热稳定性 |
| 5.3.5 Ar MTHase突变体的分离纯化 |
| 5.3.6 Ar MTHase突变体的酶学性质 |
| 5.3.7 Ar MTHase突变体热稳定性提高的原因分析 |
| 5.3.8 ArMTHase突变体和M4_P复配制备海藻糖 |
| 5.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读博士学位期间发表论文 |
四、酵母海藻糖合成酶基因植物表达载体的构建（论文参考文献）
- [1]谷氨酸棒杆菌抗高渗元件的挖掘和功能表征[D]. 石国新. 吉林大学, 2021(01)
- [2]共表达ZxNHX1-VP1-1紫花苜蓿的分子鉴定及ZxNHX1-PcCLCg紫花苜蓿的耐盐性评价[D]. 林杉. 兰州大学, 2021(12)
- [3]MTSase和MTHase在枯草芽孢杆菌中的异源表达及其固定化应用研究[D]. 宋龙祥. 齐鲁工业大学, 2021(10)
- [4]丹参SmMYB36与SmCSN5蛋白的互作关系鉴定及其作用分析[D]. 杨洁. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [5]糖代谢相关基因Matps与Mapepck对高山被孢霉脂质积累的作用研究[D]. 陈汉钦. 江南大学, 2021(01)
- [6]依赖于ATG6的自噬在番茄氮胁迫中的作用及其机制研究[D]. 曹嘉健. 浙江大学, 2021(01)
- [7]小桐子PP2C、CP及cystatin基因家族和相应miRNAs的鉴定及其在低温响应与适应中的作用[D]. 吴丹丹. 云南师范大学, 2021(08)
- [8]绿木霉菌GV29-8厚垣孢子形成分子机制研究[D]. 彭新红. 中国农业科学院, 2021
- [9]新型Zn（Ⅱ）2Cys6调控因子BbTpc1在球孢白僵菌中的生物学功能研究[D]. 张静. 齐鲁工业大学, 2021(10)
- [10]Arthrobacter ramosus MTSase/MTHase分子改造及其制备海藻糖研究[D]. 陈春. 江南大学, 2021(01)