一、PCR扩增产物凝胶电泳与微孔板反相杂交技术比较（论文文献综述）
张丽萌[1]（2020）在《FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞功能的影响及机制研究》文中研究指明FHL2（four and a half LIM domains protein 2）属于 LIM-Only 蛋白家族中的一员,其作为转录调节子参与基因表达、细胞增殖分化、细胞迁移和凋亡等诸多生理过程,当前研究多集中于人和小鼠。本课题组对连续产多羔和产单羔的绵羊卵巢组织转录组数据分析发现,FHL2在两组中的表达差异显着,推测FHL2对绵羊卵泡发育具有重要调控作用。为证实此推测,本文开展了绵羊不同组织中FHL2基因表达、绵羊卵巢中FHL2基因克隆及生物信息学分析、FHL2基因在绵羊卵巢及颗粒细胞中的表达及定位研究;通过构建FHL2过表达和siRNA干扰两种颗粒细胞模型,研究FHL2对绵羊颗粒细胞生长、类固醇激素分泌及相关基因表达的影响;通过构建绵羊卵巢组织的酵母双杂交CDNA文库,筛选与FHL2互作的宿主蛋白,并进行初步验证。旨在揭示FHL2调控绵羊卵泡发育的分子机制。本研究采用Real-time PCR（RT-PCR）方法检测FHL2基因在绵羊不同组织部位的表达水平;利用分子克隆技术获得绵羊FHL2基因的编码序列,生物信息学分析比较不同物种间序列同源性和进化关系;利用免疫组化技术检测FHL2蛋白在绵羊卵巢组织中的表达分布;采用细胞免疫荧光检测FHL2蛋白在卵巢颗粒细胞中的定位。结果表明:绵羊卵巢中FHL2表达水平高于其它组织,克隆得到的绵羊卵巢FHL2基因CDS为 837bp,编码 279 aa,与GenBank预测序列一致,未发生氨基酸突变,绵羊氨基酸序列与人、牛、猪、马、鸡、狗、猴同源性分别为86%、98.3%、91.7%、89.3%、76.5%、88.2%、86.2%;FHL2主要分布在绵羊卵巢的卵泡（有腔卵泡和无腔卵泡）中,亚细胞定位于卵泡颗粒细胞的细胞质和细胞核中。利用分子克隆技术构建真核过表达载体pcDNA3.1-FHL2,设计合成siRNA 靶向siRNA的干扰序列,转染颗粒细胞后摸索干扰效率,在体外分离培养的绵羊卵巢颗粒细胞中建立超表达和干扰两种卵巢颗粒细胞模型。结果表明:（1）成功构建真核表达载体pcDNA3.1-FHL2,转染至绵羊颗粒细胞后24 h显着提高FHL2的表达;（2）成功合成3条FHL2基因的siRNA,通过RT-PCR和Western Blot检测摸索最佳转染时间和干扰效果,显示siFHL2-2在转染后72 h能够显着降低FHL2的表达。利用AlamarBlueTM HS检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期,ELISA方法检测颗粒细胞雌激素和孕酮分泌变化,RT-PCR检测细胞凋亡（Bcl-2,Bax,p53和Caspase3）、细胞周期（CyclinD1,CyclinB1和p21）以及激素分泌（StAR,3β-HSD,CYP11,CYP19）相关基因的mRNA表达水平。结果表明:通过FHL2过表达模型证实:细胞转染后24 h,与对照组相比,FHL2过表达抑制绵羊卵巢颗粒细胞生长（P<0.01）;正常细胞比例显着降低（P<0.05）,细胞晚期凋亡率升高（P<0.05）,检测细胞凋亡相关基因表达水平,Bcl-2表达水平显着下调（P<0.05）,Bax和Caspase3表达水平上调（P<0.05）,Bcl-2/Bax的比值下调（P<0.01）,促进细胞凋亡;细胞周期G0/G1期和S期细胞的比例降低（P<0.001）,细胞周期因子Cyclin B1表达水平显着下调（P<0.05）;检测生殖激素分泌量及相关基因表达水平,E2和P的分泌量显着降低（P<0.05）,CYP19Al、3β-HSD基因表达水平下调（P<0.05）。通过siRNA干扰模型证实:细胞转染后72 h,与对照组相比,干扰FHL2的表达能够促进绵羊卵巢颗粒细胞生长（P<0.01）,检测细胞凋亡和凋亡相关基因的表达水平,正常细胞比例升高（P<0.05）,细胞晚期凋亡率降低（P<0.05）,Caspase3表达水平下调（P<0.05）,Bcl-2/Bax的比值上调（P<0.05）,抑制细胞凋亡;细胞周期S期和G2/M期细胞的比例升高（P<0.05）,细胞周期因子Cyclin D1和p21表达上调（P<0.05）;检测生殖激素分泌量及相关基因表达水平,E2分泌量升高（P<0.05）,CYP19A1、CYP11A1和StAR基因表达上调（P<0.05）。通过酵母双杂交技术构建绵羊卵巢组织细胞的酵母双杂交文库,构建酵母诱饵质粒pGBKT7-FHL2,利用酵母双杂交文库筛选与FHL2蛋白互作的宿主蛋白。结果表明:成功构建了含有3×108个重组子的绵羊卵巢组织cDNA的酵母双杂交文库,文库滴度为2×107 cfu/mL,以及诱饵载体pGBKT-FHL2,检测诱饵载体无毒性及自激活活性。利用pGBKT7-FHL2诱饵质粒,在酵母文库中筛选出与FHL2互作的蛋白共 1 1 个（RPL31、RPS20、RPS12、COMMD1、AP-1、PLCD1、FOXO1、β-catenin、CREB、NF-κB、CYLD）,Blast比对分析发现这些蛋白主要参与蛋白质合成、基因转录、细胞增殖分化、细胞凋亡及信号通路调控等过程。通过添加外源生长因子TGF-β1,研究在卵巢颗粒细胞中对FHL2的表达水平变化。利用TGF-β1蛋白及几个重要信号通路的抑制剂PI3K（Deguelin）、MEK（Combimetinib）、NF-κB（BAY11-7082）、JNK（SP600125）、MAPK（SB202190）处理体外培养的绵羊颗粒细胞,开展FHL2作用信号通路的试验验证。结果表明:外源添加TGF-β1蛋白使FHL2表达水平上调（P<0.05）,在此基础上,分别添加上述的信号通路抑制剂,结果显示添加PI3K和MARK信号通路抑制剂,导致FHL2表达水平下调（P<0.05）,证实PI3K和MAPK是TGF-β1调控FHL2表达的信号通路。综上所述,绵羊FHL2基因CDS序列全长837 bp,编码279个氨基酸,在卵巢组织中高表达,定位于卵泡颗粒细胞;FHL2影响颗粒细胞的增殖、凋亡、周期和类固醇激素（E2和P）分泌及相关基因表达;筛选获得与其互作蛋白有RPL31、RPS20、RPS12、COMMD1、AP-1、PLCD1、FOXO1、β-catenin、CREB、NF-κB、CYLD共计11个,在绵羊卵泡发育中可能通过互作参与细胞的增殖、凋亡等信号通路过程;PI3K和MAPK是TGF-β1调控FHL2表达的细胞信号通路。
徐欣[2]（2020）在《利用酵母双杂交文库初筛陆地棉DAD基因不同转录本的互作蛋白》文中指出细胞程序性死亡（Programmed Cell Death,PCD）是生物体为维持内环境稳定而产生的一种特殊的细胞死亡机制,是基本的生物学现象。PCD过程由多种基因控制,此类基因在多种动植物之间都非常保守。抗细胞凋亡基因（Defender against Apoptotic Death,DAD）就是其中之一。该基因编码寡糖基转移酶（OST）复合物中的一个亚基,是内质网中催化N-糖基化的主要核心成分,负向调控PCD过程的进行,在植物正常发育和抵御各类胁迫中发挥作用。本课题组前期的研究发现,在异源四倍体陆地棉（Gossypium hirsutum L.,基因组为AADD）中,DAD基因由于多倍化和选择性剪接等原因共产生3个转录本,分别命名为Dt1,Dt2和At,这3个转录本间具有明显表达分化。为了进一步揭示这3个转录本在陆地棉内的并存方式和抗凋亡机制,本研究从蛋白互作的角度,对陆地棉DAD基因3个转录本编码蛋白的互作谱进行了初步筛查,主要结果如下:1、成功构建了3个转录本的诱饵载体以异源四倍体陆地棉叶片组织的cDNA为模板,利用特异性引物与分子克隆技术得到了Dt1、Dt2和At转录本的编码区全长序列;分别构建了用于酵母双杂交的诱饵载体Dt1-p GBKT7、Dt2-p GBKT7和At-p GBKT7;诱饵载体转化Y2H Gold菌株后酵母生长结果表明这3个转录本编码蛋白均对酵母细胞无毒性且无自我激活活性。2、成功构建了酵母双杂交cDNA表达文库以陆地棉的叶片、花和棉纤维组织为样品,构建了一个用于蛋白互作网络筛选的高质量c DNA表达文库。初级文库库容量大于2.6×106 cfu,平均插入片段长度大于1.0 kb,百万级扩增文库质粒浓度为1.0 mg/m L。3、初筛3个转录本编码蛋白的互作蛋白诱饵载体Dt1-pGBKT7、Dt2-pGBKT7和At-pGBKT7分别与cDNA表达文库共转化Y2H Gold菌株。共转化效率在7.15×104-1.25×105 cfu/μg之间。通过酵母菌落PCR和测序鉴定,初步筛选到与Dt1互作的蛋白5个,与Dt2互作的蛋白4个,与At互作的蛋白3个。筛选到的蛋白中有5个蛋白分别参与植物体内不同组织关于PCD调控的机制,另外发现DUF538 family protein能够与Dt1和Dt2互作。而Dt1、Dt2与At转录本编码蛋白之间目前还未筛选到共享互作蛋白。这暗示陆地棉DAD基因的3个转录本可能参与不同的代谢途径并出现功能分化。
李璐一[3]（2019）在《核酸可视化检测技术在细菌性血流感染检测中的应用》文中指出血流感染（Bloodstream infection,BSI）是指细菌、病毒、真菌等病原菌侵入血液,并在血液中快速繁殖,造成机体全身系统性的血液感染疾病,是临床上重症患者死亡的重要原因,具有很高的发病率和死亡率。其中,细菌性血流感染约占血流感染病原菌的90%。血培养目前是临床诊断细菌性血流感染的金标准,且为最常用的检测手段,但传统血培养耗时太长,易受多种因素的影响,阳性率低。细菌的16S rRNA为所有细菌共有,存在于所有细菌的基因组中,具有高度保守性和特异性。针对细菌16S rRNA的检测技术得到广泛应用,但都需通过电泳进行产物检测,操作复杂;实时荧光PCR技术直接对扩增产物进行实时监测避免使用电泳,但其成本较高,在基层应用具有一定局限性。发展快速准确、简便易操作诊断细菌性血流感染的检测方法具有重要意义。近些年来,针对细菌16S r RNA的可视化核酸检测技术快速发展起来,可视化核酸检测技术不需要昂贵的仪器设备,操作简便易行,结果清晰可见,具有非常大的优势。本研究中,针对细菌共有的16S rRNA中的高度保守区域设计细菌PCR通用引物,实现细菌性血流感染快速简便检测。引入生物素-链霉亲和素（Biotin-Avidin—System,BAS）特异亲和系统,结合微球富集技术,通过镜检,建立基于通用置换荧光引物和微球富集技术的快速简便镜检检测细菌性血流感染新方法;引入结晶紫-无色结晶紫内酯（CV-LCV）体系,建立基于无色结晶紫内酯的快速简便可视化检测细菌性血流感染的方法。主要研究内容及结果如下:1、细菌通用引物的设计,进行检测。基于多种细菌的16S rRNA序列进行序列比对,寻找细菌的高度保守区域,针对高度保守区域设计多对细菌PCR通用引物,并对设计的引物进行Blast特异性分析,证明设计的两对引物（P1与P2、F1与F2）具有高特异性。通过凝胶成像系统观察电泳结果,证明设计的两对引物均能进行细菌PCR扩增反应。筛选出最佳细菌通用引物,实现细菌与非细菌检测。2、微球富集荧光镜检法检测细菌性血流感染。针对细菌16S rRNA设计的通用引物P1与P2,探针P1*为P1的互补序列。在引物P1的5’修饰猝灭基团,探针P1*的3’端修饰荧光基团,5’端修饰生物素基团。进行PCR扩增反应,在没有细菌靶标存在时,P1*与P1中的荧光基团与猝灭基团接触,荧光被熄灭;在有细菌靶标存在时,带有猝灭基团的P1参与反应,释放出带有荧光基团的探针P1*,释放出的荧光被微球捕获并富集,在显微镜下显示出强烈的荧光信号,从而实现样品检测,检测限低至103 cfu/mL。建立PCR-显微镜快速简便镜检检测细菌性血流感染体系,实现细菌性血流感染的检测。3、结晶紫可视化PCR法检测细菌性血流感染。针对细菌16S rRNA设计通用引物,进行PCR扩增反应。反应产物中的dsDNA的主要沟槽与结晶紫-无色结晶紫内脂体系中以微量存在的结晶紫结合,使平衡向生成结晶紫方向移动,体系显示出明显的蓝紫色,从而实现细菌性血流感染的可视化检测,检测限低至103cfu/mL。建立无色结晶紫内酯快速简便可视化检测细菌性血流感染体系,实现细菌性血流感染的检测。
宋贤冲[4]（2019）在《广西猫儿山土壤微生物群落时空变化特征研究》文中进行了进一步梳理本文以中国广西壮族自治区猫儿山国家级自然保护区不同海拔的植被带为研究对象,选取不同海拔高度的4种典型植被带:中亚热带常绿阔叶林（Evergreen broad-leaved forest,EBF）、水青冈天然林（Fagus longipetiolata natural forest,NF）、常绿落叶阔叶混交林（Evegreen deciduous broad-leaved mixed forest,DBF）和针叶阔叶混交林（Coniferous broad-leaved mixed forest,CBF）设置固定样地,采用常规化学分析技术、Biolog-Eco平板技术和Illumina Hiseq 2500高通量测序技术从土壤酶活性、土壤微生物碳源利用特征和土壤微生物群落组成3方面研究猫儿山土壤微生物群落的时空变化特征。比较分析了土壤微生物群落功能多样性和群落组成结构的时空变化,并就气候、土壤和植被因子等环境因子对土壤微生物群落的影响进行了分析。主要研究结果如下:（1）猫儿山典型植被带土壤理化性质和酶活性的时空变化具有异质性。土壤含水量、有机质、全氮、速效氮、有效磷和速效钾含量在高海拔地带最高;不同季节土壤理化性质没有明显的变化规律。不同海拔全年平均酸性磷酸酶和过氧化氢酶活性随海拔上升而单调上升;脲酶和蔗糖酶活性单调下降;多酚氧化酶活性呈现单峰趋势。海拔与土壤脲酶、蔗糖酶活性为极显着负相关关系;除了全钾外,其他土壤养分与脲酶和蔗糖酶之间为显着或极显着负相关关系;p H与土壤过氧化氢酶之间呈显着的负相关关系;土壤含水量与蔗糖酶和脲酶之间为显着或极显着的负相关关系;年平均气温与酸性磷酸酶和脲酶的相关性达到显着水平。年平均降水量与过氧化氢酶活性之间为极显着的负相关关系,与多酚氧化酶为极显着正相关关系。（2）猫儿山土壤微生物群落功能多样性沿海拔大体上呈单调下降趋势。春季、秋季和冬季土壤微生物群落功能多样性随海拔上升呈下降趋势;夏季呈现单峰模式。不同季节的土壤微生物功能多样性变化为土壤微生物多样性指数大体上与土壤平均颜色变化率（Average well color development,AWCD）呈现相同的变化规律。不同海拔植被带土壤微生物群落对氨基酸类、胺类和酯类碳源利用程度相对较高,而对碳水化合物类和醇类利用程度相对较低。不同海拔样地土壤微生物碳源利用模式的变化与土壤AWCD的变化一致。土壤微生物碳源代谢多样性的垂直地带性差异主要体现在羧酸类、碳水化合物类和氨基酸类碳源的利用上。不同海拔植被带的各样地土壤AWCD有季节性差异,所有样地均表现为:夏季>秋季>春季>冬季。土壤微生物香农指数的季节变化与土壤AWCD一致。辛普森优势度指数的季节变化排序为秋季>夏季>春季>冬季。碳源利用模式的季节变化与土壤AWCD一致。土壤微生物碳源代谢多样性的季节差异主要体现在氨基酸类、酯类和羧酸类碳源的利用上。冗余分析、蒙特卡罗检验、分类变异分析和偏曼特尔检验均表明,年平均气温是猫儿山土壤微生物群落功能多样性时空变化最主要的影响因子。（3）土壤微生物群落物种多样性随海拔上升呈下降趋势;不同季节的土壤微生物群落物种多样性变化不明显。可操作分类单元（Operational taxonomic units,OTUs）数量随着海拔上升呈现出单调下降的趋势,即EBF>NF>DBF>CBF;Chao1评估量、香农多样性指数和辛普森样性指数沿海拔的变化趋势与OTUs丰度不同。不同海拔土壤微生物群落中变形菌门、酸杆菌门和放线菌门为优势类群,占所有分类细菌序列的75%以上。不同分类水平下的优势类群相同均为酸杆菌类。不同海拔样品之间的共有OTUs数量占40%左右,表明不同海拔之间土壤细菌群落组成存在较大差异。无度量多维标定法分析结果发现除了EBF和NF样地分异不明显外,其他不同海拔样品间有明显的分异。通过多种响应置换过程分析、多元方差分析、相似性分析和分子生物学方差分析的结果,进一步证明了EBF和NF样地的群落组成有较大的相似性。Jaccard和Bray-Curtisβ多样性指数分析发现猫儿山微生物群落组成相似性存在距离-衰减模式。不同季节猫儿山土壤微生物群落OTUs数量大体上秋季最高,夏季最低;而香农指数和辛普森指数大体上夏季最高,秋季最低;Chao1指数大体上夏季最高,春季最低。不同季节样品之间的共有OTUs数量占30%左右,表明不同季节之间土壤细菌群落组成存在较大差异。无度量多维标定法分析结果发现猫儿山夏季和其他季节的样品间也有明显的分异;但多种响应置换过程和相似性分析的结果表明不同季节之间差异均不显着。主成分分析结果表明土壤微生物群落组成的季节差异主要体现在放线菌门、酸杆菌门、绿弯菌门和WD272的相对丰度上。典范对应分析、蒙特卡罗检验和回归分析结果表明,土壤有效磷含量和土壤含水量是猫儿山土壤细菌群落结构时空变化的主要影响因子。本研究表明猫儿山典型植被带土壤理化性质和酶活性、土壤微生物群落功能多样性和物种多样性的时空分布具有异质性。年平均气温是土壤微生物群落功能多样性时空变化最主要的影响因子,土壤有效磷含量和土壤含水量是土壤细菌群落结构时空变化最主要的影响因子。
张贝贝[5]（2018）在《基于滚环扩增和CRISPR辅助PCR的核酸检测新技术研究》文中研究说明本研究一共探讨了四种检测核酸的新技术,其中包含两种滚环扩增检测方法和两种PCR检测方法。结合滚环扩增和近红外荧光等技术,开发了两种滚环扩增检测技术。将CRISPR基因编辑应用到PCR技术中,从而发展了两种CRISPR辅助PCR检测技术。1.NM-NIRF-spRCA核酸检测技术通过静电吸附和紫外交联,带正电荷的尼龙膜（Nylon membrane,NM）可以简单方便地固定核酸分子。因此,它是一种常用于核酸检测的固相载体。滚环扩增（Rolling circle amplification,RCA）是广泛用于核酸检测的等温DNA扩增技术。近红外荧光（Near infrared fluorescence,NIRF）是一种新的荧光技术,具有背景低、信噪比高、灵敏度高等优点。本章将NM、RCA和NIRF等材料及技术相结合,开发了一种在尼龙膜上检测核酸的简单方法,命名为基于近红外荧光的尼龙膜固相滚环扩增技术（NM-NIRF-spRCA）。该方法只需要两种核酸分子:滚环（RC）和3′末端带有RCA引物的靶特异性探针（-PP）。检测程序由四个步骤组成:（ⅰ）通过紫外交联将靶核酸固定在NM上;（ⅱ）RC和NM上固定的靶核酸与特异性探针杂交;（ⅲ）进行含有Biotin-dUTP的RCA扩增;（ⅳ）用NIRF标记的链霉亲和素温育NM并用NIRF成像仪成像。通过检测寡核苷酸、质粒中的各种HPV亚型的L1片段和大肠杆菌基因组DNA,充分验证了该方法。因此该研究为检测核酸分子提供了一种新的简便方法。2.SLP-RCA核酸检测技术本章介绍了一种使用茎环引物（Stem-loop primer,SLP）进行滚环扩增的新技术。该技术能够在固相和液相中通过线性或超分支滚环扩增（SLP-1RCA或SLP-HRCA）检测靶DNA。对于固相检测,SLP-HRCA分四步检测核酸:（ⅰ）将各种捕获探针（Capture probe,CP）共价结合在固相载体上形成CP阵列;（ⅱ）将CP阵列与DNA样品杂交;（ⅲ）用含有SLP1、SLP2和Biotin-dUTP的反应液在CP阵列上进行RCA反应;（ⅳ）将CP阵列成像。在液相中,SLP-HRCA检测核酸只需一步:进行包含DNA样品、SLP1和SLP2的实时RCA反应。液相和固相检测都采用通用的滚环模板、SLP2和特异于靶DNA的SLP1。在液相和固相上通过检测寡核苷酸和六种不同的人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）,初步验证了该技术。还在宫颈癌细胞（HeLa和SiHa）和临床样品中检测到了两种高危型HPV（HPV16和HPV18）,这充分验证了该技术的可行性。本研究为RCA核酸检测提供了新的途径。3.Cas9/sgRNA辅助反向PCR核酸检测技术本章开发了一种基于Cas9核酸酶检测靶DNA的新方法,该方法被命名为CARP（Cas9/sgRNA-assistant reverse PCR）即Cas9/sgRNA辅助反向PCR。该技术可以简单、快捷、特异和灵敏地检测靶DNA。该技术分三步来检测靶DNA:（ⅰ）Cas9与一对特异的sgRNA结合后切割靶DNA;（ⅱ）用DNA连接酶连接切割产物;（ⅲ）用PCR扩增靶DNA。在连接步骤中,Cas9切割的靶DNA可以在分子内连接成环状或在分子间连接成线形DNA。最后用一对反向引物通过PCR扩增连接产物。通过在9种不同人乳头状瘤病毒（HPV）亚型中检测HPV16和HPV18 L1基因验证了该技术。该技术还在两个HPV阳性宫颈癌细胞（HeLa和SiHa）的基因组DNA中检测到了两个高危型HPV（HPV16和HPV18）的L1和E6-E7基因,在HPV阴性宫颈癌细胞C-33a中没有检测到这两个基因。通过这些概念验证,本研究提供了一种新的基于CRISPR的DNA检测和分型的方法。特别是本研究验证的CARP方法已进行了HPV临床检测,成功地检测了一批临床样品。4.CRISPR分型PCR核酸检测技术本章发展了一种利用CRISPR技术检测目标DNA的新方法,即CRISPR或Cas9/sgRNA分型PCR（CRISPR-or Cas9/sgRNA-typing PCR,ctPCR）。该技术检测目标DNA只需一步反应:用荧光定量PCR（qPCR）扩增检测Cas9/sgRNA切割后的DNA样品。直接在qPCR反应程序之前额外加一段恒温孵育时间,使Cas9/sgRNA切割反应合并到qPCR反应中。这样就可以用仅仅2个小时的时间来均相检测目标DNA。在整个检测过程中无需打开检测管,ctPCR的全部检测过程可以通过常用的核酸检测设备（荧光定量PCR仪）在较短的时间内完成。通过检测十种不同的人乳头瘤病毒（HPV）亚型的L1基因验证了该技术。该技术在两种HPV阳性宫颈癌细胞（HeLa和SiHa）中成功地检测了两种高危HPV（HPV16和HPV18）的L1和E6-E7基因,在HPV阴性的宫颈癌细胞中没有检测到HPV的L1和E6-E7基因。最后,通过检测临床样品中的HPV进一步验证了ctPCR方法。因此,本研究提供了一种基于CRISPR的检测和分型DNA的新方法。
夏庆兵[6]（2016）在《邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯对土壤微生物群落结构多样性的影响》文中研究指明酞酸酯是一种典型的环境激素类污染物,也具有持久性有机污染物的属性。酞酸酯类化合物作为重要的增塑剂在工农业上应用广泛。目前,酞酸酯在土壤、海洋、大气、饮用水及动植物体内均被不同程度检出,对生态环境造成日益严重的污染。目前,关于酞酸酯的生物毒性研究主要集中在人体和动物毒理效应方面,对土壤微生物的生态毒性研究较少,特别是对土壤微生物群落结构研究十分匮乏。本研究以典型酞酸酯DEHP为污染物,在室内模拟条件下采用平板计数、Biolog、T-RFLP、PCR-DGGE和构建克隆文库等方法研究了不同浓度(0、0.1、1、10、50mg·kg-1)DEHP对土壤微生物功能、遗传和结构多样性的影响,揭示了DEHP对土壤微生物的作用规律,并初步分析其作用机制,为客观评价DEHP对土壤微生物的生态风险提供一定的科学依据。主要研究结果如下:（1）典型酞酸酯DEHP对土壤中细菌、真菌和放线菌的数量有不同程度的影响:在染毒前期DEHP对细菌、真菌和放线菌均表现为抑制作用,且表现出良好的“剂量-效应”关系即DEHP浓度越高抑制作用最明显。在染毒中期高浓度DEHP依然对微生物数量有抑制效应,染毒后期微生物数量由波动逐渐恢复到正常水平。（2）DEHP对土壤中微生物的功能多样性及代谢活动有一定的抑制作用。在染毒前期DEHP对AWCD、Shannon指数、Simpson指数和Mc Intosh指数均产生了不同程度的抑制效应,说明DEHP进入土壤后微生物的活性、丰度、物种优势度及均一度都呈下降的趋势;染毒中后期DEHP对土壤微生物总体活性和功能多样性抑制效应逐渐减弱,并恢复至正常水平。DEHP胁迫下,土壤微生物对糖类、脂肪类、氨基酸类和代谢物类的利用效率有明显影响,在不同染毒时间不同浓度处理对碳源的利用率影响不同,处理后期其碳源的利用率相对稳定。（3）通过PCR-DGGE和T-RFLP相结合的方式研究了DEHP对土壤微生物遗传多样性的影响。结果发现,在DEHP污染土壤中Proteobacteria菌群占所有菌群的比例最高,其优势较为明显。通过对T-RFs峰面积和多样性指数的分析发现,不同时间内的土壤微生物菌群的相对丰度变化明显,其随时间呈先增加后下降的趋势。处理前期Shannon指数受到激活,而Simpson指数和McIntosh指数受到抑制,处理后期土壤微生物的物种丰度、优势度及均一度基本稳定。（4）通过对DEHP处理第14天的土壤样品构建克隆文库发现,在这一时期处理组中微生物的种类略有下降。在高浓度(10～50mg·kg-1)处理组中占主导地位的细菌为Proteobacteria菌群,并且其种群优势较为突出。Acidobacteria菌群在所有处理组土壤中均占有较高的比重,其在低浓度处理组(0.1～1mg·kg-1)的菌群占比最高。说明在本实验所设的浓度范围内,Acidobacteria菌群对DEHP均有良好的适应力。
丁森[7]（2016）在《HPV16 RNA非扩增型核酸杂交捕获检测技术的体系研究》文中研究指明HPV（Human papilloma virus,人乳头瘤病毒）可导致人类多种恶性肿瘤,包括头颈癌、口咽癌、肺癌、呼吸道癌及肛门生殖器癌等。根据HPV的致癌潜力不同可以将目前已发现的100多种HPV划分为高危型、中等危害型及低危型。高危型中的HPV16和HPV18的持续感染是人类多种生殖器癌尤其是子宫颈癌的直接诱因。其中,HPV16又是最常见、更容易传播、危害程度最大的高危HPV型。由于高危HPV所致宫颈癌治疗难度很大并且临床预后不佳,导致女性罹患子宫颈癌后的存活率极低。因此,临床上有效的HPV16早期检测不仅能够及时筛查出潜在的患病个体,还能够为有效的控制HPV的传播提供可靠的依据,更能够使患者得到及时有效的治疗并以此提高其生存几率。由于针对HPV病毒蛋白的检测方法的特异性和灵敏度不够,FDA目前批准的HPV检测方法主要针对的靶标是HPV的核酸（DNA及RNA）。这些检测方法有杂交捕获信号放大法如HC2（Qiagen/Digene）,实时定量PCR法如Cobas HPV（Roche）,酶切信号放大法如 Cervista（Hologic）,NASBA 法如 Aptima（Gen-Probe）等。但是,这些检测手段都存在诸多缺陷。一方面,由于HPV存在一过性、反复性感染的特性,针对HPVDNA的检测方法出现假阳性、假阴性的几率较大,容易造成误诊和漏诊;另一方面,由于目前针对HPVDNA或RNA的检测方法都需要对靶序列进行扩增以增强检测信号,因而需要高规格的操作环境及高性能的核酸扩增仪器,这不仅大大提高了其成本投入、延长了检测时间,而且还不能反映真实的病毒载量,故不能用于临床HPV感染所致疾病的准确分期。因此,研发能够突破现行检测方法瓶颈的HPV检测手段显得尤为重要。本论文叙述了两种以酶联免疫吸附分析技术为基础的新检测体系的建立过程,开展了以HPV RNA为靶标的新型核酸免疫检测方法的研究,探讨其优势及待改进之处,为开发的针对HPV核酸的免疫检测平台奠定了基础。该技术的设计策略是:以HPV16 RNA为检测对象（该靶标可作为判断是否存在活病毒的依据从而反映感染状态）,设计、筛选特异性探针组合,该探针组合可与HPV16 RNA退火杂交形成能够被抗体特异性识别的DNA-RNA杂合体（DNA-RNA Hybrid）,最终通过酶促反应介导的显色或化学发光显示信号以达到对HPV准确、灵敏检测的目的并可真实反映样本中的活HPV的病毒载量。针对上述设计思想,本研究对检测体系中的每个环节进行了具体的设计、筛选及优化。在体系构建环节上,本研究以人工合成的互补DNA-RNA杂合体片段为模型,确定了两种高效的固定核酸抗原的方法——抗体捕获法及多聚L赖氨酸（PLL）固定法并优化了检测条件,包括抗体浓度、退火缓冲液离子强度、探针长度及数量等;在探针应用环节上,本研究根据HPV基因组结构特征,大量设计并筛选出了数条具有自主知识产权的特异性识别HPV16 RNA特征序列的DNA探针,并成功应用于该检测体系中;在终端信号输出及读取环节上,通过抗DNA-RNA杂合体的单克隆抗体捕获待检抗原,进一步采用化学发光、显色技术体系显示检测信号,实现了对微量HPV病毒检测的目的。结果显示,该核酸免疫检测技术对人工合成的DNA-RNA杂合体片段的检测灵敏度可达到10-11 M;对HPV16 E6、E7体外转录片段的检测灵敏度分别为9.23 pg/mL、4.24 pg/mL;对细胞株或临床样本中提取的HPV16 RNA的检测灵敏度能达到10万级病毒拷贝数。在与国际公认的高危HPV检测方法——Q-PCR法的比较中,该方法与Q-PCR法的检测结果一致,从而证实了该核酸免疫检测方法的准确性与可靠性。本论文相关研究工作的创新点及技术优势主要体现在以下几方面:1.成功构建了针对HPV16 RNA的酶联免疫分析技术,该技术属独创性质,具有自主知识产权;2.以该酶联免疫分析技术为基础,该研究探索出了两种高效结合核酸抗原的固相载体表面处理方法——抗体捕获法及PLL固定法;3.运用该酶联免疫分析技术,该研究以HPV16RNA为检测对象,不仅可以准确地得到HPV活病毒的载量信息,而且可以为HPV感染后所致疾病的临床分期提供依据;4.该酶联免疫分析技术通过运用特异性的探针组合,提高了检测特异性与灵敏度,与针对HPV基因组的全长的RNA探针相比,极大降低了检测成本;5.该酶联免疫检测法免除了其它HPV核酸检测过程中的扩增步骤,简化了检测流程,节约了分析时间。综上所述,通过本研究工作,不仅成功研发了可用于临床的准确、快速、实时、高效的HPV定性、定量检测新技术,而且构建的技术平台可为下一步工作中研制针对HPV检测的系列产品及研发其它核酸分析技术提供关键技术支撑。
马春华[8]（2015）在《高危型HPV基因型检测、分流及HPV16型变异体在宫颈癌及癌前病变中的分布研究》文中研究指明目的:评价高危型HPV基因型检测在宫颈癌筛查中的可行性及应用价值。P16/Ki-67细胞学双染在HPV阳性、宫颈不同病变脱落细胞中的表达和意义。探讨新疆地区感染HPV16变异体谱系分布及E6、E7、LCR基因突变研究,分析HPV16变异体在宫颈癌及癌前病变发生发展中的作用。方法:应用高危型HPV基因检测系统,对2014年09月2015年8月在新疆自治区人民医院住院及门诊就诊行HC2、TCT检测、并有病理结果的564位女性的宫颈细胞标本进行HPV基因型检测,对其中59例HC2阳性患者的液基细胞学涂片用免疫细胞化学法检测P16/Ki-67蛋白在宫颈脱落细胞中的表达。对HPV16阳性的宫颈癌及癌前病变患者,提取基因组DNA,利用PCR扩增HPV16 DNA E6、E7基因及LCR区核苷酸片段,正反向测序。与HPV16基因序列分析比对,确定HPV16谱系分布,分析核苷酸突变位点。结果:（1）高危型HPV基因型检测在诊断CIN2+病变时优于HC2、TCT、Hybr Miax分型检测,差异具有统计学意义（P<0.05）,不同液基细胞学分级及组织病理分级中HR-HPV感染率不同,差异具有统计学意义（P<0.05）,随细胞学及病理学诊断级别升高,HR-HPV感染率上升（P<0.05）,HPV16型感染率上升（P<0.05）。各级别宫颈病变以HPV16型及合并HPV16型感染为主,HP16型分布在维吾尔族和汉族妇女之间无统计学差异（P>0.05）。各年龄段高危型HPV的构成比无统计学差异（P>0.05）。高危型HPV基因型检测对ASCUS分流优于HC2。（2）P16/Ki-67细胞学双染检测诊断CIN2+病变时具有高灵敏度（92%）和总符合率（78%）,P16/Ki-67细胞学双染检测与组织病理学结果符合率较一致（Kappa=0.569,P<0.05）,在对ASCUS/ASC-H进行P16/Ki-67细胞学双染检测更能发现宫颈高级别病变（P<0.05）,不同宫颈病变P16/Ki-67细胞学双染检测阳性率:炎症39.13%（9/23）CIN1 20%（2/10）,CIN2-3 91.30%（21/23）,宫颈癌100%（2/2）差异具有统计学意义（P<0.05）,随病变程度的加重,P16/Ki-67细胞学双染阳性率呈上升的趋势。（3）E6基因突变率为80.00%（92/115）主要突变位点T350G（58.78%）,T178G（18.47%）,E7突变率为54.78%（63/115）主要突变位点A647G（33.33%）,T846C（26.98%）,LCR突变率为23.48%（27/115）,主要突变位点为C24T（74.07%）,C13T（25.92%）。维吾尔族妇女与汉族妇女之间比较,维吾尔族T350G突变率显着高于汉族,汉族A647G、T846C、C24T突变率显着高于维吾尔族,差异具有统计学意义（P<0.05）。维吾尔族宫颈癌组T350G突变率显着高于炎症组（P<0.05）,且随病变严重程度增加突变率上升,汉族T350G、A647G、T846C、C24T突变率炎症组、宫颈病变组显着高于宫颈癌组（P<0.05）,维吾尔族C24T突变率炎症组显着高于宫颈癌组（P<0.05）,差异均具有统计学意义（P<0.05）。新疆汉族人中感染的HPV16主要为亚洲型,新疆维吾尔族感染的HPV16主要为欧洲型。结论:高危型HPV感染是宫颈癌前病变和宫颈癌的主要致病因素;宫颈各级别病变中以HPV16型及合并HPV16型感染为主;随细胞学及病理学诊断级别升高HR-HPV感染率上升;高危型HPV基因型检测对ASCUS诊断分流优于HC2。P16/Ki-67细胞学双染阳性率随着宫颈病变程度加重呈上升趋势;P16/Ki-67细胞学双染检测可以有效对ASCUS及HPV阳性者进行诊断分流,具有临床应用价值。HPV16E6、E7突变可能与宫颈病变进展有关,T350G突变可能是维吾尔族宫颈癌高发的原因之一;新疆汉族人中感染的HPV16型主要为亚洲型,新疆维吾尔族感染的HPV16型主要为欧洲型。
胡盼[9]（2013）在《石房蛤毒素及其抗体适配子的制备与检测方法的建立》文中认为石房蛤毒素（Saxitoxin，STX）是一种毒性极强的胍胺类神经毒素，是有害赤潮发生过程海水中一种重要的致害因子。STX主要来源于海水或淡水中某些有害浮游生物的二次代谢产物，并通过食物链蓄积于贝类、蟹类等水产品中。当人类或动物摄食被毒素污染的水产品，就会引起麻痹、死亡等中毒反应。近年来，海洋污染问题日益严重，有害藻华（HAB）和赤潮频繁发生，致使有毒水产品中毒事件在世界范围内时有发生。为了保障公众的身体健康不受毒素隐患的威胁，必须加强对STX等贝类毒素的检测和监管工作。目前，STX的检测方法主要有生物毒性试验法、高效液相色谱分析法，细胞毒性试验法，免疫学测定法等，这些检测方法都存在一定的缺陷和不足。如试验不够灵敏，需要昂贵的设备仪器及高素质的操作人员，毒素标准品价格昂贵等。为解决以上问题迫切需要寻找一种灵敏、特异、方便、无毒的STX检测方法。本研究旨在利用STX和STX单抗为靶标分子，通过SELEX技术筛选STX和STX单抗的特异性适配子，建立基于适配子的STX无毒ELISA检测方法，为深化我国海洋环境学研究和开发具有自主知识产权的无毒快速检测试剂盒提供试验基础。为了筛选STX特异性适配子，我们设计并合成了一个长度为81个核苷酸的ssDNA文库，文库的中间含有40个碱基的随机序列，两端为固定序列。同时，设计一段与ssDNA文库固定序列部分互补的固定探针，该核酸分子的末端依据微孔板表面的化学基团进行相应化学修饰，以便连接固定到微孔板表面。利用固定探针将ssDNA文库固定在微孔板上，以STX为靶标分子，采用靶标诱导变构解离SELEX技术筛选STX的适配子。经过15轮的反复筛选、富集过程，获得与STX高亲和力的适配子富集文库。对富集文库进行PCR扩增、连接、转化和克隆测序。通过DNAMAN软件和mfold网站对获得的适配子序列进行一级结构同源性分析及二级结构预测。通过间接ELISA和竞争ELISA方法对获得的适配子序列进行亲和力和特异性分析，最终获得3个具有较高特异性和亲和力的STX适配子。同时，我们采用微孔板SELEX技术对STX抗体F（ab′）2片段适配子进行了筛选。经过16轮的反复筛选、富集过程，获得与STX抗体F（ab′）2片段高亲和力的适配子富集文库。对富集文库进行PCR扩增、连接、转化和克隆测序。通过DNAMAN软件和mfold网站对获得的适配子序列进行一级结构同源性分析及二级结构预测。通过间接ELISA和竞争ELISA方法对获得的适配子序列进行亲和力和特异性分析，并采用超滤和竞争ELISA方法对以上鉴定的优势适配子的复合物形成能力和特异性进一步分析，最终成功获得了一个能够模拟STX与STX抗体结合的适配子。基于靶标诱导变构解离SELEX筛选模式，我们设计了一种适配子变构解离的STX无毒ELISA检测方法。利用STX与STX适配子能够特异性结合而发生构象改变的原理，结合微孔板核酸杂交技术和生物素-亲和素-辣根过氧化物酶显色系统实现对STX的无毒检测。并对该检测方法中固定探针长度、适配子浓度、洗涤缓冲液中盐离子浓度等条件进行了优化，完成标准工作曲线绘制，得到线性回归方程为y=-6.4916x+99.006，相关系数R2=0.9959，线性检测范围为3.92～1600ng/mL，最低检测限为3.92ng/mL。此外，我们对STX与STX抗体适配子对应关系进行了线性回归分析，分析表明STX标准品浓度与STX抗体适配子浓度之间有相关性，为建立STX抗体适配子替代STX的ELISA检测方法奠定基础。
孙晓红[10]（2011）在《真菌感染的流行病学分析及主要病原真菌检测方法的研究》文中指出本研究收集假丝酵母感染患者标本及相关资料进行流行病学分析,并对分离的病原菌进行药物敏感性研究;建立了微卫星PCR、实时荧光定量PCR、PCR-纳米金标记-微孔板杂交三种方法,用于临床常见假丝酵母及曲霉的检测。流行病学分析结果表明,标本主要来源于呼吸内科（61.2%）;以痰标本的真菌分离率最高（82.8%）;分离出的病原菌中白假丝酵母所占比例最高（72.2%）;感染人数以60岁以上老年人居多（83.7%）。白假丝酵母仅对伊曲康唑表现为耐药,耐药率为1.4%,但药物依赖性敏感率高达34.4%。本研究利用三种微卫星单一引物,建立了检测假丝酵母的微卫星方法,对209株临床假丝酵母进行鉴定,根据特异性带型,能鉴别白假丝酵母、热带假丝酵母、光滑假丝酵母、克柔假丝酵母,该方法简单实用,具有较好的特异性、稳定的多态性。本研究基于真菌COⅠ、COⅡ基因序列,首次设计丝状真菌通用引物;对测序获得的曲霉COⅠ、COⅡ基因序列进行比对,曲霉COⅡ基因序列具有一定的种间变异性及较高的种内稳定性,选择COⅡ基因用于真菌的检测。本研究对所获得的23种曲霉和假丝酵母COⅡ基因序列进行比对,设计特异性引物,建立检测烟曲霉和白假丝酵母的Real-time PCR方法。结果表明所设计引物特异性强、敏感性高、可对靶DNA进行定量分析,该检测方法的灵敏度为1×102copies/μl。本研究基于23种曲霉COⅡ基因序列,设计烟曲霉、黒曲霉及土曲霉的种特异性探针,通过5’端巯基修饰进行纳米金标记,建立了PCR-纳米金标记-微孔板杂交检测方法。可特异性检测烟曲霉、黒曲霉及土曲霉,对靶DNA的最低检测浓度为0.01pg/μl。利用靶DNA浓度在0.01pg/μl～1000pg/μl和吸光度值之间具有一定的线性关系,可对靶DNA进行半定量分析,结果可直接观察亦可通过检测吸光度值进行客观评价,该方法可同时检测多个样本,为临床样本的高通量检测奠定基础。
二、PCR扩增产物凝胶电泳与微孔板反相杂交技术比较（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、PCR扩增产物凝胶电泳与微孔板反相杂交技术比较（论文提纲范文）
（1）FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞功能的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 颗粒细胞在哺乳动物卵泡发育中的作用 |
| 1.1.1 哺乳动物卵泡发育的特点 |
| 1.1.2 卵泡发育的调控 |
| 1.1.3 颗粒细胞的功能 |
| 1.1.4 颗粒细胞对卵泡发育的影响 |
| 1.1.5 颗粒细胞对卵泡闭锁的影响 |
| 1.2 FHL2基因的研究进展 |
| 1.2.1 FHL2基因的结构 |
| 1.2.2 FHL2基因的表达与细胞定位 |
| 1.2.3 FHL2基因的主要生物学功能 |
| 1.2.4 FHL2影响卵巢颗粒细胞的功能研究 |
| 1.3 蛋白质互作研究进展 |
| 1.3.1 酵母双杂交技术 |
| 1.3.2 酵母双杂交技术的特点 |
| 1.3.3 酵母双杂交技术的应用 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 2 绵羊FHL2基因的克隆鉴定及表达和定位 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 实验主要溶液配制 |
| 2.1.5 主要生物信息学分析软件 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 FHL2基因在绵羊不同组织中的表达量分析 |
| 2.2.2 绵羊FHL2基因的克隆鉴定及生物信息学分析 |
| 2.2.3 免疫组化分析 |
| 2.2.4 绵羊卵巢颗粒细胞的原代培养及鉴定 |
| 2.2.5 FHL2在绵羊卵巢颗粒细胞中的表达分析 |
| 2.2.6 细胞定位 |
| 2.2.7 数据统计 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 FHL2基因在绵羊不同组织中的表达量分析 |
| 2.3.2 绵羊FHL2基因CDS序列克隆及生物信息学分析 |
| 2.3.3 FHL2在绵羊卵巢组织中的表达定位 |
| 2.3.4 绵羊卵巢颗粒细胞体外培养的形态与特征 |
| 2.3.5 FHL2在体外培养的绵羊卵巢颗粒细胞中的表达定位 |
| 2.3.6 Western Blot检测绵羊卵巢颗粒细胞中FHL2的表达 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 体外分离培养绵羊原代卵巢颗粒细胞 |
| 2.4.2 FHL2的表达及细胞定位研究 |
| 2.5 小结 |
| 3 绵羊FHL2基因过表达及siRNA干扰效果研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 样品来源 |
| 3.1.2 主要试剂与耗材 |
| 3.1.3 试验主要仪器设备 |
| 3.1.4 主要溶液的配置 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 真核表达载体pcDNA3.1-FHL2载体的构建与鉴定 |
| 3.2.2 过表达载体pcDNA3.1-FHL2转染绵羊卵巢颗粒细胞 |
| 3.2.3 siRNA的设计合成和干扰效果检测 |
| 3.2.4 数据统计 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 真核表达载体pcDNA3.1-FHL2重组质粒的构建与鉴定 |
| 3.3.2 过表达质粒转染对FHL2mRNA和蛋白表达水平的影响 |
| 3.3.3 mRNA水平上检测siFHL2的干扰效果 |
| 3.3.4 蛋白水平上检测siFHL2的干扰效果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 FHL2基因对绵羊卵巢颗粒细胞功能的影响研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 样品来源 |
| 4.1.2 主要试剂与耗材 |
| 4.1.3 试验主要仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 FHL2基因过表达对绵羊卵巢颗粒功能的影响 |
| 4.2.2 干扰FHL2基因对绵羊卵巢颗粒细胞功能的影响 |
| 4.2.3 数据统计 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 过表达和干扰FHL2表达后对绵羊颗粒细胞形态变化的影响 |
| 4.3.2 FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞增殖的影响 |
| 4.3.3 FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞凋亡的影响 |
| 4.3.4 FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞周期的影响 |
| 4.3.5 FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞激素分泌的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 FHL2对细胞周期的影响 |
| 4.4.2 FHL2对细胞凋亡的影响 |
| 4.4.3 FHL2对激素分泌水平的影响 |
| 4.5 小结 |
| 5 绵羊卵巢组织细胞酵母双杂交CDNA文库的构建及FHL2互作蛋白的筛选 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要溶液配制 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 绵羊卵巢组织细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定 |
| 5.2.2 绵羊FHL2基因酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定 |
| 5.2.3 利用所构建酵母双杂交系统筛选与FHL2互作的蛋白 |
| 5.2.4 FHL2与筛选宿主蛋白的一对一互作验证 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 绵羊卵巢酵母双杂交文库的构建 |
| 5.3.2 pGBKT7-FHL2酵母诱饵质粒的构建 |
| 5.3.3 酵母双杂交互作蛋白对照实验 |
| 5.3.4 筛选与FHL2相互作用的蛋白 |
| 5.3.5 候选克隆质粒测序结果分析 |
| 5.3.6 FHL2与筛选宿主蛋白互作的验证 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 酵母双杂交cDNA文库的构建 |
| 5.4.2 酵母诱饵质粒的构建 |
| 5.4.3 利用酵母双杂交筛选互作蛋白研究 |
| 5.5 小结 |
| 6 FHL2在TGF-β信号通路中对绵羊卵巢颗粒细胞的调控作用 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 样品来源 |
| 6.1.2 试验主要溶液配制 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 绵羊TGF-β1蛋白的构建和表达 |
| 6.2.2 添加外源蛋白TGF-β1 |
| 6.2.3 FHL2表达对TGF-β1及TGF-βR基因的影响 |
| 6.2.4 TGF-β1抑制剂处理颗粒细胞 |
| 6.2.5 TGF-β1调控FHL2在不同信号通路中的作用研究 |
| 6.2.6 数据统计 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 真核表达载体pFUSERTL1-TGF-β1重组质粒的构建与鉴定 |
| 6.3.2 Western Blot鉴定TGF-β1蛋白的表达 |
| 6.3.3 TGF-β1促进卵巢颗粒细胞中FHL2的表达 |
| 6.3.4 FHL2对TGF-β1、TGF-βR基因表达的影响 |
| 6.3.5 TGF-β信号通路对FHL2、TGF-β1和TGF-βR表达的影响 |
| 6.3.6 TGF-β1参与调控FHL2基因表达的信号通路研究 |
| 6.4 讨论 |
| 6.4.1 TGF-β1调控颗粒细胞中FHL2的表达 |
| 6.4.2 TGF-β1调控FHL2基因的信号通路研究 |
| 6.5 小结 |
| 7 结论 |
| 8 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
| 附件 |
（2）利用酵母双杂交文库初筛陆地棉DAD基因不同转录本的互作蛋白（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词(Abbreviations) |
| 第一章 综述 |
| 1.1 蛋白质互作概况 |
| 1.1.1 蛋白质互作研究意义 |
| 1.1.2 酵母双杂交的发现及原理 |
| 1.1.3 酵母双杂交的应用 |
| 1.2 选择性剪接概述 |
| 1.2.1 选择性剪接的定义 |
| 1.2.2 选择性剪接的类型 |
| 1.2.3 选择性剪接异构体的定义 |
| 1.3 细胞程序性死亡概述 |
| 1.3.1 细胞程序性死亡简介 |
| 1.3.2 DAD基因研究进展 |
| 1.4 棉花概述 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 陆地棉DAD基因不同转录本诱饵载体的构建 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株和载体 |
| 2.1.3 实验用药品和试剂 |
| 2.1.4 实验用主要仪器设备 |
| 2.1.5 实验用主要溶液、培养基配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 陆地棉栽培种叶片总RNA的提取 |
| 2.2.2 总RNA的完整度、浓度以及纯度检测 |
| 2.2.3 RNA反转录为cDNA |
| 2.2.4 DAD基因转录本Dt1,Dt2,At的引物设计 |
| 2.2.5 DAD基因3 个转录本CDS全长的PCR扩增 |
| 2.2.6 DAD基因3个转录本的纯化回收 |
| 2.2.7 DAD基因3 个转录本连接T-Vector pMD19(Simple) |
| 2.2.8 Dt1-T、Dt2-T、At-T连接产物转化大肠杆菌 |
| 2.2.9 菌液PCR检测及测序验证 |
| 2.2.10 重组质粒Dt1-T、Dt2-T、At-T质粒的提取 |
| 2.2.11 陆地棉DAD基因转录本Dt1、Dt2、At诱饵载体的构建 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 陆地棉总RNA提取 |
| 2.3.2 DAD基因3 个转录本Dt1、Dt2和AtCDS全长的PCR扩增及测序结果 |
| 2.3.3 转录本Dt1、Dt2和At的克隆结果分析 |
| 2.3.4 Dt1-T、Dt2-T、At-T质粒的提取及鉴定 |
| 2.3.5 Dt1、Dt2和At诱饵载体的构建及鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 陆地棉酵母双杂交cDNA表达文库构建 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 菌株和载体 |
| 3.1.3 实验用主要试剂 |
| 3.1.4 实验用主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 陆地棉混合样品总RNA的提取与检测 |
| 3.2.2 陆地棉混合样品cDNA表达文库构建 |
| 3.2.2.1 cDNA的合成 |
| 3.2.2.2 均一化处理及合成cDNA |
| 3.2.2.3 均一化cDNA的纯化、酶切处理及去除短片段 |
| 3.2.2.4 初级cDNA表达文库的构建、库容及插入片段检测 |
| 3.2.2.5 初级cDNA表达文库的百万克隆扩增及质粒提取 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 陆地棉混合样品总RNA质量及完整度检测 |
| 3.3.2 全长双链cDNA的合成结果检测 |
| 3.3.3 全长双链cDNA的均一化处理检测 |
| 3.3.4 均一化后dscDNA的纯化、酶切及过柱去除短片段检测 |
| 3.3.5 初级表达文库的库容计算、插入片段检测 |
| 3.3.6 96克隆测序结果 |
| 3.3.7 初级表达文库的百万克隆扩增及质粒提取结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 利用酵母双杂交文库初筛DAD的互作蛋白 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌株与载体 |
| 4.1.2 实验用主要药品和试剂 |
| 4.1.3 实验用主要仪器设备 |
| 4.1.4 实验用主要溶液及酵母培养基配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 目的基因诱饵质粒和pGADT7-文库质粒共转化酵母感受态细胞 |
| 4.2.2 阳性克隆鉴定及测序验证 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 共转化效率计算 |
| 4.3.2 阳性克隆的初步显色筛选 |
| 4.3.3 Dt1阳性克隆生物学功能分析 |
| 4.3.4 Dt2阳性克隆生物学功能分析 |
| 4.3.5 At阳性克隆生物学功能分析 |
| 4.3.6 Dt1、Dt2、At阳性克隆的蛋白质三级结构预测 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文及研究成果 |
| 致谢 |
（3）核酸可视化检测技术在细菌性血流感染检测中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 血流感染研究进展 |
| 1.1.1 血流感染发病机制 |
| 1.1.2 细菌高度保守序列 |
| 1.2 血流感染常见检测方法 |
| 1.2.1 病原学检测 |
| 1.2.2 血液检查 |
| 1.2.3 血清学反应 |
| 1.2.4 生物传感器 |
| 1.2.5 核酸检测技术 |
| 1.3 核酸检测技术发展历程 |
| 1.4 常见的PCR扩增技术 |
| 1.4.1 逆转录PCR |
| 1.4.2 实时荧光PCR |
| 1.4.3 巢式PCR |
| 1.4.4 不对称PCR |
| 1.4.5 多重PCR |
| 1.4.6 反向PCR |
| 1.4.7 重组PCR |
| 1.4.8 数字PCR |
| 1.4.9 传统PCR |
| 1.5 本文拟开展的工作 |
| 第2章 PCR通用引物设计 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 引物设计方法 |
| 2.3.1 序列对比 |
| 2.3.2 引物设计 |
| 2.3.3 特异性评估 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.5 结果与讨论 |
| 2.5.1 序列比对 |
| 2.5.2 设计引物 |
| 2.5.3 特异性评估 |
| 2.5.4 电泳检测 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 通用荧光引物检测细菌性血流感染 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 细菌培养基配制及培养 |
| 3.4 通用荧光引物设计 |
| 3.5 试验方法 |
| 3.5.1 核酸提取 |
| 3.5.2 微球活化及富集 |
| 3.5.3 反应体系及反应条件 |
| 3.5.4 可行性分析 |
| 3.5.5 条件优化 |
| 3.5.6 灵敏度 |
| 3.5.7 特异性 |
| 3.5.8 细菌血液样品检测 |
| 3.5.9 统计学处理 |
| 3.6 实验原理 |
| 3.7 实验结果与讨论 |
| 3.7.1 可行性实验 |
| 3.7.2 实验条件优化 |
| 3.7.3 灵敏度 |
| 3.7.4 特异性 |
| 3.7.5 细菌血液样品检测 |
| 3.8 本章小结 |
| 第4章 结晶紫可视化检测细菌性血流感染 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 细菌培养基及细菌培养 |
| 4.4 通用引物设计 |
| 4.5 实验方法 |
| 4.5.1 核酸提取 |
| 4.5.2 反应体系 |
| 4.5.3 结晶紫检测体系 |
| 4.5.4 可行性分析 |
| 4.5.5 条件优化 |
| 4.5.6 灵敏度 |
| 4.5.7 特异性 |
| 4.5.8 稳定性 |
| 4.5.9 细菌血液样品 |
| 4.5.10 统计学分析 |
| 4.6 实验原理 |
| 4.7 实验结果 |
| 4.7.1 可行性实验 |
| 4.7.2 条件优化 |
| 4.7.3 灵敏度 |
| 4.7.4 特异性 |
| 4.7.5 稳定性 |
| 4.7.6 细菌血液样品 |
| 4.8 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附件1 攻读学位期间所发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
（4）广西猫儿山土壤微生物群落时空变化特征研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 项目来源和经费支持 |
| 1.3 国内外研究综述 |
| 1.3.1 土壤微生物多样性 |
| 1.3.2 土壤微生物群落功能多样性 |
| 1.3.3 土壤微生物物种多样性分布格局 |
| 1.4 关键的科学问题 |
| 1.5 研究目标 |
| 1.6 主要研究内容 |
| 1.7 研究技术路线 |
| 第二章 研究区域概况与研究方法 |
| 2.1 研究区域概况 |
| 2.2 样地概况 |
| 2.3 样地设置和样品采集 |
| 2.4 土壤样品理化性质的测定 |
| 2.5 土壤酶活性的测定 |
| 2.6 气象数据的采集 |
| 2.7 植物多样性的测定 |
| 2.8 微生物群落功能多样性的测定 |
| 2.9 土壤样品总DNA提取和目的片段PCR扩增、测序 |
| 2.9.1 土壤样品DNA提取 |
| 2.9.2 PCR扩增及产物纯化 |
| 2.9.3 文库构建和上机测序 |
| 2.9.4 测序数据处理 |
| 2.9.5 OTU聚类和物种注释 |
| 2.9.6 数据统计分析方法简介 |
| 第三章 猫儿山不同海拔植被带土壤理化性质和酶活性的时空变化特征 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 统计分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 土壤理化性质的时空变化情况 |
| 3.3.2 土壤酶活性的时空变化情况 |
| 3.3.3 土壤理化性质、气候因子与土壤酶活性的相关性 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 土壤理化性质的时空变化 |
| 3.4.2 土壤酶活性的时空变化 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 猫儿山不同海拔植被带土壤微生物群落功能多样性的时空变化特征 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 统计分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 不同季节土壤平均颜色变化率沿海拔的变化情况 |
| 4.3.2 各样地土壤平均颜色变化率的季节变化情况 |
| 4.3.3 不同海拔植被带土壤微生物群落功能多样性指数 |
| 4.3.4 不同季节土壤微生物碳源利用强度沿海拔的变化情况 |
| 4.3.5 相同季节不同海拔各样地土壤微生物群落的代谢差异 |
| 4.3.6 同一海拔不同季节各样地土壤微生物群落的代谢差异 |
| 4.3.7 不同海拔土壤微生物碳源利用的主要影响因子 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 不同海拔对土壤微生物碳源利用的影响 |
| 4.4.2 不同季节对土壤微生物碳源利用的影响 |
| 4.4.3 环境因子对土壤微生物群落功能多样性的影响 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 猫儿山不同海拔植被带土壤微生物群落组成和结构的时空变化特征 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 统计分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 土壤微生物群落组成和结构沿海拔的变化情况 |
| 5.3.2 土壤微生物群落组成和结构的季节变化情况 |
| 5.3.3 微生物群落的海拔分布模式 |
| 5.3.4 微生物群落的季节分布模式 |
| 5.3.5 微生物群落沿海拔梯度的距离-衰减模式 |
| 5.3.6 微生物群落组成与环境因子的关系 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 海拔变化对土壤微生物群落的影响 |
| 5.4.2 季节更替对土壤微生物群落的影响 |
| 5.4.3 土壤微生物群落结构时空变化与环境因子的关系 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 主要创新点和展望 |
| 6.2.1 主要创新点 |
| 6.2.2 展望 |
| 参考文献 |
| 在读期间的学术研究 |
| 致谢 |
（5）基于滚环扩增和CRISPR辅助PCR的核酸检测新技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 滚环扩增技术 |
| 1.1.1 滚环扩增技术的原理 |
| 1.1.2 滚环扩增技术的分类 |
| 1.1.3 滚环扩增技术的优缺点 |
| 1.1.4 滚环扩增技术的应用 |
| 1.2 近红外荧光技术 |
| 1.3 PCR扩增技术 |
| 1.4 基因编辑技术 |
| 1.4.1 基因组编辑核酸酶 |
| 1.4.2 CRISPR-Cas9 |
| 1.4.3 CRISPR核酸检测技术 |
| 1.5 本文主要研究内容 |
| 第二章 NM-NIRF-sp RCA核酸检测技术 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 制备探针和滚环 |
| 2.2.2 制备HPV L1质粒DNA |
| 2.2.3 制备大肠杆菌DH5α 和BL21基因组DNA |
| 2.2.4 靶DNA在尼龙膜上的固定 |
| 2.2.5 用固相RCA检测核酸分子 |
| 2.3 结果和讨论 |
| 2.3.1 NM-NIRF-sp RCA实验方法示意 |
| 2.3.2 滚环制备及质量检测 |
| 2.3.3 尼龙膜近红外固相RCA系统的构建 |
| 2.3.4 检测质粒中的多种HPV亚型 |
| 2.3.5 定量检测HPV质粒DNA |
| 2.3.6 检测DH5α 基因组DNA |
| 2.4 结论 |
| 第三章 SLP-RCA核酸检测技术 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 茎环和滚环的制备 |
| 3.2.2 捕获探针阵列的制备 |
| 3.2.3 lpSLP-HRCA检测寡核苷酸 |
| 3.2.4 spSLP-HRCA检测寡核苷酸 |
| 3.2.5 spSLP-HRCA检测HPV质粒DNA |
| 3.2.6 lpSLP-HRCA检测HPV质粒DNA |
| 3.2.7 lpSLP-HRCA在宫颈癌细胞中检测HPV DNA |
| 3.2.8 mbSLP-HRCA检测HPV DNA |
| 3.2.9 热变性处理lpSLP-HRCA产物 |
| 3.2.10 mbSLP-HRCA检测HPV临床样品 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 SLP-HRCA检测方法示意 |
| 3.3.2 lpSLP-HRCA检测合成的寡核苷酸 |
| 3.3.3 spSLP-HRCA检测合成的寡核苷酸 |
| 3.3.4 spSLP-HRCA检测HPV质粒DNA |
| 3.3.5 lpSLP-HRCA检测HPV质粒DNA |
| 3.3.6 mbSLP-HRCA检测HPV DNA |
| 3.3.7 热变性处理lpSLP-HRCA产物 |
| 3.3.8 mbSLP-HRCA检测HPV临床样品 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 Cas9/sgRNA辅助反向PCR核酸检测技术 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 制备sgRNA |
| 4.2.2 制备HPV L1基因片段 |
| 4.2.3 Cas9/sgRNA切割HPV 16 and 18 L1基因 |
| 4.2.4 CARP检测HPV16和HPV18 L1基因 |
| 4.2.5 CARP检测HPV16 L1基因的灵敏度 |
| 4.2.6 CARP在9个HPV亚型中检测HPV16或 18 L1基因 |
| 4.2.7 CARP检测宫颈癌细胞中HPV L1和E6-E7基因 |
| 4.2.8 CARP检测临床样品中的HPV L1基因 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 CARP检测方法示意 |
| 4.3.2 Cas9/sgRNA切割HPV 16 和 18 L1基因 |
| 4.3.3 CARP检测HPV16和18的L1基因 |
| 4.3.4 CARP检测HPV16和 18 L1基因的灵敏度 |
| 4.3.5 CARP检测9个HPV亚型中的HPV16或 18 L1基因 |
| 4.3.6 CARP检测宫颈癌细胞中的HPV L1和E6-E7基因 |
| 4.3.7 CARP检测临床样品中的HPV L1基因 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 CRISPR分型PCR(ctPCR)核酸检测技术 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 sgRNA的制备 |
| 5.2.2 Cas9/sgRNA切割10种HPV质粒 |
| 5.2.3 ctPCR检测HPV亚型质粒中的L1基因 |
| 5.2.4 ctPCR在宫颈癌细胞中检测HPV L1和E6-E7基因 |
| 5.2.5 ctPCR检测临床样品中的HPV L1基因 |
| 5.2.6 ctPCR检测临床样品中的HPV E6-E7基因 |
| 5.2.7 ctPCR检测临床样品中HPV E6-E7基因的灵敏度 |
| 5.2.8 单酶切ctPCR检测临床样品中的HPV基因 |
| 5.2.9 ctPCR检测的灵敏度 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 ctPCR检测方法示意 |
| 5.3.2 Cas9/sgRNA切割HPV L1基因 |
| 5.3.3 ctPCR检测10种HPV亚型的HPV L1基因 |
| 5.3.4 ctPCR检测He La和Si Ha细胞中HPV18和16基因 |
| 5.3.5 ctPCR检测临床样品中的HPV L1基因 |
| 5.3.6 ctPCR检测临床样品中的HPV E6-E7基因 |
| 5.3.7 ctPCR检测的灵敏度 |
| 5.3.8 单酶切ctPCR检测临床样品中的HPV基因 |
| 5.3.9 ctPCR检测的灵敏度 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 第六章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 个人履历 |
| 攻读博士学位期间参与的科研项目 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（6）邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯对土壤微生物群落结构多样性的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 Abstract 1 前言 |
| 1.1 酞酸酯概述 |
| 1.2 酞酸酯的国内外研究进展 |
| 1.2.1 酞酸酯对动物的毒性效应 |
| 1.2.2 酞酸酯对植物的毒性效应 |
| 1.2.3 酞酸酯对土壤微生物的生态毒性 |
| 1.3 典型酞酸酯DEHP概述 |
| 1.4 土壤微生物群落结构研究方法 |
| 1.4.1 传统微生物平板培养法 |
| 1.4.2 生化方法 |
| 1.4.3 分子生物技术 |
| 1.4.4 生物信息学技术 |
| 1.5 小结 2 材料与方法 |
| 2.1 药品试剂 |
| 2.1.1 典型酞酸酯DEHP |
| 2.1.2 土壤材料及其染毒方法 |
| 2.1.3 其他药品试剂 |
| 2.2 仪器设备 |
| 2.3 平板计数 |
| 2.3.1 土壤稀释液的制备 |
| 2.3.2 细菌的计数 |
| 2.3.3 真菌的计数 |
| 2.3.4 放线菌的计数 |
| 2.3.5 土壤含菌量的计算 |
| 2.3.6 数据处理 |
| 2.4 微生物功能多样性测定 |
| 2.4.1 土壤稀释液的制备 |
| 2.4.2 ELISA反应 |
| 2.4.3 数据处理 |
| 2.5 末端限制性片段长度多样性 |
| 2.5.1 土壤总DNA的提取 |
| 2.5.2 细菌16sRNA片段的PCR扩增 |
| 2.5.3 16s片段的酶切 |
| 2.5.4 T-RFLP检测及数据分析 |
| 2.6 变性梯度凝胶电泳（DGGE） |
| 2.6.1 土壤总DNA的提取 |
| 2.6.2 细菌16sRNA片段的PCR扩增 |
| 2.6.3 细菌16sRNA V3区的PCR扩增 |
| 2.6.4 变性梯度凝胶电泳 |
| 2.6.5 切胶回收及重新PCR扩增 |
| 2.6.6 连接转化 |
| 2.6.7 阳性鉴定与测序 |
| 2.6.8 数据处理 |
| 2.7 构建克隆文库 |
| 2.7.1 土壤总DNA的提取 |
| 2.7.2 细菌16sRNA片段的PCR扩增 |
| 2.7.3 PCR产物的连接转化 |
| 2.7.4 阳性克隆的筛选 |
| 2.7.5 ARDRA分型 |
| 2.7.6 序列分析 3 结果与分析 |
| 3.1 DEHP对土壤微生物数量的影响 |
| 3.1.1 DEHP对细菌数量的影响 |
| 3.1.2 DEHP对真菌数量的影响 |
| 3.1.3 DEHP对放线菌数量的影响 |
| 3.1.4 小结 |
| 3.2 DEHP对微生物功能多样性的影响 |
| 3.2.1 土壤中微生物总体活性的变化 |
| 3.2.2 土壤微生物功能多样性差异 |
| 3.2.3 土壤微生物碳源利用强度变化 |
| 3.2.4 主成分变化 |
| 3.2.5 小结 |
| 3.3 DEHP对土壤微生物群落的T-RFLP指纹分析 |
| 3.3.1 T-RFLP的图谱处理 |
| 3.3.2 DEHP对土壤中微生物群落相对丰度变化影响 |
| 3.3.3 DEHP对土壤中微生物多样性指数的影响 |
| 3.3.4 T-RFLP图谱主要片段的定性分析 |
| 3.3.5 主成分变化 |
| 3.3.6 小结 |
| 3.4 变性梯度凝胶电泳 |
| 3.4.1 DGGE电泳结果 |
| 3.4.2 DGGE切胶条带分析 |
| 3.5 构建克隆文库 |
| 3.5.1 16S rRNA文库的覆盖率 |
| 3.5.2 16S rRNA文库的构建 4 讨论 |
| 4.1 DEHP对土壤微生物数量的影响 |
| 4.2 DEHP对土壤微生物功能多样性的影响 |
| 4.3 DEHP对土壤微生物遗传多样性的影响 |
| 4.4 DEHP对土壤微生物结构多样性的影响 5 结论 6 本论文创新及有待改进之处 7 参考文献 8 致谢 9 攻读学位期间发表论文 |
（7）HPV16 RNA非扩增型核酸杂交捕获检测技术的体系研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 概述 |
| 1.1. 乳头瘤病毒 |
| 1.1.1. 分类 |
| 1.1.2. 形态及基因组结构 |
| 1.1.3. 编码蛋白 |
| 1.1.4. 病毒复制 |
| 1.1.5. 感染自然史 |
| 1.2. 乳头瘤病毒与癌症 |
| 1.2.1. 乳头瘤病毒致瘤潜能 |
| 1.2.2. HPV感染与子宫颈癌 |
| 1.3. HPV感染的检测方法 |
| 1.3.1. 培养法 |
| 1.3.2. 细胞与组织学法 |
| 1.3.3. 血清学法 |
| 1.3.4. 基于DNA的检测方法 |
| 1.3.5. 基于RNA的检测方法 |
| 第二章 抗体捕获免疫检测法的建立 |
| 2.1. 引言 |
| 2.2. 材料与方法 |
| 2.2.1. 设计、合成互补的DNA、RNA寡核苷酸探针 |
| 2.2.2. 人工合成DNA、RNA片段的退火杂交 |
| 2.2.3. 抗体包被浓度的优化 |
| 2.2.4. 退火缓冲液离子强度的优化 |
| 2.2.5. 对人工合成片段的检测及其灵敏度的分析 |
| 2.2.6. HPV16、18型E6、E7基因片段的克隆 |
| 2.2.7. 克隆HPV16 E6、E7基因片段的条件优化 |
| 2.2.8. 克隆HPV18 E6、E7基因片段的条件优化 |
| 2.2.9. 设计针对HPV16 E6、E7基因片段的寡核苷酸探针 |
| 2.2.10. 体外转录HPV16 E6、E7基因片段制备RNA |
| 2.2.11. 对体外转录RNA片段的检测及灵敏度的分析 |
| 2.2.12. 对体外转录RNA片段的检测及其特异性分析 |
| 2.2.13. 检测体外转录RNA片段的条件优化 |
| 2.2.14. HPV16各mRNA片段的DNA探针的合成 |
| 2.2.15. 检测CaSki细胞株中total RNA (Trizol法提取) |
| 2.2.16. 检测CaSki及SiHa mRNA的条件优化 |
| 2.2.17. 检测细胞株中tota RNA(试剂盒提取) |
| 2.2.18. 检测试剂盒提取细胞株total RNA(化学发光法) |
| 2.2.19. Q-PCR定量细胞株HPV拷贝数 |
| 2.2.20. 检测试剂盒提取临床样本total RNA(化学发光法) |
| 2.2.21. Q-PCR定量临床样本中HPV病毒拷贝 |
| 2.3. 实验结果 |
| 2.3.1. 人工合成DNA、RNA寡核苷酸片段的退火杂交 |
| 2.3.2. 检测方案的建立和检测条件的优化 |
| 2.3.3. 检测人工合成DNA-RNA寡核苷酸片段 |
| 2.3.4. HPV16、HPV18型E6、E7基因片段的克隆 |
| 2.3.5. 克隆HPV16 E6、E7基因片段条件优化 |
| 2.3.6. 克隆HPV18 E6、E7基因片段条件优化 |
| 2.3.7. 体外转录HPV16 E6、E7基因片段制备RNA |
| 2.3.8. 对体外转录RNA片段的检测及灵敏度分析 |
| 2.3.9. 对体外转录RNA片段的检测及特异性分析 |
| 2.3.10. 检测体外转录RNA片段的条件优化 |
| 2.3.11. 检测细胞株提取total RNA (Trizol法提取) |
| 2.3.12. 检测CaSki及SiHa mRNA(磁珠法纯化) |
| 2.3.13. 检测试剂盒提取细胞株total RNA (TMB显色法) |
| 2.3.14. 检测试剂盒提取细胞株total RNA(化学发光法) |
| 2.3.15. 抗体捕获免疫检测法与Q-PCR法检测细胞株中HPV结果比较 |
| 2.3.16. 抗体捕获免疫检测法与Q-PCR法检测临床样本中HPV结果比较 |
| 2.4. 讨论 |
| 第三章 PLL固定免疫检测法的建立 |
| 3.1. 引言 |
| 3.2. 材料与方法 |
| 3.2.1. 设计、合成互补的DNA、RNA寡核苷酸片段 |
| 3.2.2. 人工合成DNA、RNA探针的退火杂交 |
| 3.2.3. 检测方案具体实施步骤 |
| 3.2.4. 检测方案的条件优化 |
| 3.2.5. 检测人工合成DNA-RNA寡核苷酸片段 |
| 3.2.6. 检测体外转录RNA片段的灵敏度分析 |
| 3.2.7. 检测体外转录RNA片段的特异性分析 |
| 3.2.8. 检测细胞株total RNA (Trizol法提取) |
| 3.2.9. 检测细胞株及临床样本total RNA (Trizol法提取) |
| 3.2.10. 检测细胞株及临床样本total RNA的条件优化 |
| 3.2.11. 检测细胞株mRNA(磁珠法纯化) |
| 3.2.12. 检测临床样本mRNA(磁珠法纯化) |
| 3.2.13. 检测细胞株及临床样本mRNA的条件优化 |
| 3.2.14. 临床样本mRNA的检测及灵敏度分析 |
| 3.2.15. 细胞株及临床样本mRNA的检测及特异性分析 |
| 3.2.16. 探究检测结果无特异性的原因 |
| 3.2.17. 单条探针信号情况探索 |
| 3.2.18. 新探针组合的筛选及其特异性分析 |
| 3.3. 实验结果 |
| 3.3.1. 人工合成DNA、RNA片段退火杂交 |
| 3.3.2. 探索检测方案的实施步骤 |
| 3.3.3. 检测方案的条件优化 |
| 3.3.4. 人工合成片段的检测及灵敏度分析 |
| 3.3.5. 体外转录片段的检测及灵敏度分析 |
| 3.3.6. 体外转录片段的检测及特异性分析 |
| 3.3.7. 检测细胞株total RNA (Trizol法提取) |
| 3.3.8. 检测临床样本及细胞株total RNA (Trizol法提取) |
| 3.3.9. 检测细胞株mRNA(磁珠法纯化) |
| 3.3.10. 检测细胞株及临床样本mRNA(磁珠法纯化) |
| 3.3.11. 检测细胞株及临床样本mRNA的条件优化 |
| 3.3.12. 临床样本mRNA的检测及灵敏度分析 |
| 3.3.13. 细胞株及临床样本mRNA的检测及特异性分析 |
| 3.3.14. 检测结果无特异性的原因探索 |
| 3.3.15. 单条探针信号情况探索 |
| 3.3.16. 新探针组合的筛选及特异性分析 |
| 3.4. 讨论 |
| 第四章 总结与展望 |
| 4.1. 论文总结 |
| 4.2. 论文的创新点 |
| 4.3. 展望 |
| 参考文献 |
| 已发表与待发表的论文 |
| 致谢 |
| 附录1: 主要试剂的配制方法 |
| 附录2: 主要实验操作方法 |
（8）高危型HPV基因型检测、分流及HPV16型变异体在宫颈癌及癌前病变中的分布研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 高危型HPV基因型检测在宫颈癌筛查中应用 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要试剂及仪器设备 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.4 宫颈液基薄层细胞学检查 |
| 1.5 细胞学分类方法 |
| 1.6 COBAS HPV检测实验（高危型HPV基因型检测实验） |
| 1.7 HybrMiax HPV分型检测实验 |
| 1.8 阴道镜检查及宫颈活检 |
| 1.9 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分P16/Ki-67细胞学双染42在HPV阳性、宫颈不同病变脱落细胞中的表达和意义 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要仪器设备和试剂 |
| 1.3 细胞学检查 |
| 1.4 细胞学分类及诊断方法 |
| 1.5 HC-2 HPV病毒检测 |
| 1.6 阴道镜检查及宫颈活检 |
| 1.7 P16/Ki-67免疫细胞化学双染检测（CINTEC PLUS） |
| 1.8 COBAS高危型HPV检测 |
| 1.9 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 HPV16变异体在宫颈癌及癌前病变中的分布研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象的纳入和排除标准 |
| 1.2 研究对象基本情况 |
| 1.3 实验所需试剂及仪器设备 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.5 质量控制 |
| 1.6 PCR产物序列测定及DNA数据分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 宫颈癌筛查研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（9）石房蛤毒素及其抗体适配子的制备与检测方法的建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 石房蛤毒素的研究进展 |
| 1.1 STX 的来源及分布 |
| 1.2 STX 及其类似物的结构及性质 |
| 1.3 STX 的提取 |
| 1.4 STX 的合成 |
| 1.5 STX 的代谢动力学 |
| 1.6 STX 的检测方法 |
| 1.7 STX 的作用机制及应用 |
| 1.8 展望 |
| 第2章 适配子在诊断学、食品安全及环境中的应用 |
| 2.1 适配子及 SELEX 技术 |
| 2.2 Aptamer 在环境分析和食品控制中的应用 |
| 2.3 Aptamer 在诊断中的应用 |
| 2.4 展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 STX 适配子的筛选 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 STX 适配子的鉴定及二级结构分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 STX 抗体适配子的筛选 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 STX 抗体适配子的鉴定及二级结构分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 适配子在 STX 无毒检测方法中的初步应用 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（10）真菌感染的流行病学分析及主要病原真菌检测方法的研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 真菌感染现状 |
| 1.1.1 真菌感染的病原真菌种类及特点 |
| 1.1.2 真菌感染的治疗与耐药现状 |
| 1.2 真菌感染的检测方法研究进展 |
| 1.2.1 PCR 技术为基础的方法 |
| 1.2.2 PCR 技术与其他技术结合的方法 |
| 1.2.3 DNA 探针技术 |
| 1.2.4 DNA 指纹分析为基础的方法 |
| 1.2.5 DNA 芯片为基础的方法 |
| 1.3 纳米金粒子在医学检验中的应用 |
| 1.3.1 纳米金粒子及特点 |
| 1.3.2 生物分析化学检测中常用的标记物 |
| 1.3.3 纳米金粒子在免疫分析中的应用 |
| 1.3.4 纳米金粒子在DNA 检测中的应用 |
| 1.4 本研究目的意义和主要内容 |
| 1.4.1 目的意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第2章 真菌感染的流行病学分析及药物敏感性研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 临床真菌感染的流行病学分析 |
| 2.2.2 临床分离假丝酵母的药物敏感性分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 微卫星标记用于临床假丝酵母的鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 SSR-PCR 反应体系的优化及反应条件的确立 |
| 3.2.2 SSR 引物用于临床假丝酵母的鉴定 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 实时荧光定量PCR 检测方法的建立 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 丝状真菌通用引物的设计及测序结果分析 |
| 4.2.2 Real-time PCR 检测方法的建立 |
| 4.3 讨论 |
| 第5章 PCR-纳米金标记-微孔板杂交检测方法的建立 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 纳米金粒子、纳米金标记探针的制备及表征结果分析 |
| 5.2.2 纳米金标记探针的有效性验证 |
| 5.2.3 PCR-纳米金标记-微孔板杂交检测方法的建立 |
| 5.3 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
四、PCR扩增产物凝胶电泳与微孔板反相杂交技术比较（论文参考文献）
- [1]FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞功能的影响及机制研究[D]. 张丽萌. 河北农业大学, 2020(01)
- [2]利用酵母双杂交文库初筛陆地棉DAD基因不同转录本的互作蛋白[D]. 徐欣. 曲阜师范大学, 2020(01)
- [3]核酸可视化检测技术在细菌性血流感染检测中的应用[D]. 李璐一. 湖南大学, 2019(01)
- [4]广西猫儿山土壤微生物群落时空变化特征研究[D]. 宋贤冲. 中国林业科学研究院, 2019
- [5]基于滚环扩增和CRISPR辅助PCR的核酸检测新技术研究[D]. 张贝贝. 东南大学, 2018(03)
- [6]邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯对土壤微生物群落结构多样性的影响[D]. 夏庆兵. 山东农业大学, 2016(03)
- [7]HPV16 RNA非扩增型核酸杂交捕获检测技术的体系研究[D]. 丁森. 南京大学, 2016(06)
- [8]高危型HPV基因型检测、分流及HPV16型变异体在宫颈癌及癌前病变中的分布研究[D]. 马春华. 新疆医科大学, 2015(03)
- [9]石房蛤毒素及其抗体适配子的制备与检测方法的建立[D]. 胡盼. 吉林大学, 2013(08)
- [10]真菌感染的流行病学分析及主要病原真菌检测方法的研究[D]. 孙晓红. 吉林大学, 2011(09)