一、国人正常睾丸组织定向克隆表达cDNA文库的构建及意义（论文文献综述）
李讨讨[1]（2021）在《基于转录组学的藏绵羊睾丸功能基因鉴定及其表达调控》文中指出绵羊睾丸发育和精子发生直接决定着公羊的繁殖力。藏绵羊作为我国青藏高原及其毗邻地区最重要的家畜品种之一,具有繁殖力低、性成熟晚等生殖特点。因此,研究其睾丸发育和精子发生的调控机理对绵羊生殖生物学研究具有重要意义。然而目前在绵羊（尤其藏绵羊）上有关睾丸功能维持的分子生物学认识仍然非常欠缺。本研究以3月龄（性成熟前）、1岁龄（性成熟后）、3岁龄（成年）藏绵羊睾丸组织作为研究材料,进行如下研究:1)借助RNA-seq技术及生物信息学分析对3个发育阶段睾丸组织中的m RNA、circ RNA和mi RNA表达谱进行分析,并进行差异表达分析和功能富集分析;2)根据“ce RNA假说”及circ RNAs、mi RNAs和m RNAs的表达变化趋势,构建ce RNA调控网络;3)基于3月龄和1岁龄组的睾丸转录组数据,对潜在的免疫稳态维持相关候选基因进行鉴定,并对这些基因所富集的mi RNA-m RNA模块及circ RNA-mi RNA-m RNA调控网络进行分析;4)原代分离培养绵羊睾丸支持细胞,以研究精子发生关键基因及相关的circ RNA-mi RNA-m RNA轴在绵羊睾丸细胞中的生物学作用。研究的主要结果如下:1.在3月龄vs 1岁龄、1岁龄vs 3岁龄、3月龄vs 3岁龄睾丸中,分别鉴定到26084（10247个上调,15837个下调）、57个（27个上调,30个下调）、25535个（10017个上调,15518个下调）差异表达m RNAs;分别鉴定到3982（2079个上调,1903个下调）、414（201个上调,213个下调）和4060个（2107个上调,1953个下调）差异表达circ RNAs;分别鉴定到715个（561个上调,154个下调）、57个（46个上调,11个下调）、790个（628个上调,162个下调）差异表达mi RNAs。随机选择的10个m RNAs、10个circ RNAs和12个mi RNAs的RT-q PCR验证结果表明RNA-seq获得的转录组数据是可靠的。差异表达m RNAs、差异表达circ RNAs来源基因、及二者共享基因的GO和KEGG分析结果均显示,它们主要参与生长、发育、生殖、免疫、代谢等相关生物学过程;显着富集在m TOR、TGFβ等生殖相关,以及紧密连接、减数分裂等细胞连接或细胞发育密切相关的信号通路上。2.基于circ RNAs、mi RNAs和m RNAs共表达ce RNA网络分析发现,差异表达circ RNAs的靶基因主要涉及细胞发育、生殖等生物学过程以及粘附连接、局部粘附、ECM-受体相互作用、肌动蛋白细胞骨架调节、MAPK、Wnt、TGFβ等信号通路。在此基础上,构建了睾丸功能（如精子发生、生殖细胞发育、细胞周期、减数分裂、血-睾屏障等）密切相关基因的ce RNA调控网络;通过RT-q PCR、Western blot、免疫荧光染色和双荧光素酶分析发现,BOLL基因主要表达于减数分裂后的圆形和长形精子细胞中,并且其表达受到circ＿029155/mi R-760-3p信号轴的调控。3.基于性成熟前、后藏绵羊睾丸的转录组测序和功能富集数据,共筛选出1118个免疫相关差异表达m RNAs（包括873个下调和245个上调的m RNAs）。GO和KEGG富集分析结果显示,它们主要富集在免疫系统发育、细胞粘附/连接、刺激反应调节、免疫反应调节等生物学过程,以及细胞粘附、T细胞和B细胞受体信号通路、白细胞跨内皮迁移、趋化因子、NF-κB、PI3K/Akt等信号通路上。在此基础上,构建了与睾丸免疫稳态维持相关候选基因的潜在mi RNA-m RNA网络和circ RNA-m RNA-m RNA网络。此外,双荧光素酶分析证实了ITGB1/circ＿013761/circ＿014236与mi R-29b以及ITGB1/circ＿001254与mi R-1185-3p间存在靶向关系。4.由构建的ce RNA网络可知,IGF1基因受到oar-mi R-29b和circ＿026259的潜在调控。RT-PCR、RT-q PCR、荧光原位杂交和免疫荧光分析显示,它们在发育的藏绵羊睾丸中具有相似的RNA分布模式:广泛分布于生殖细胞、间质细胞和支持细胞中。随后,采用两步酶消化法成功分离获得了绵羊睾丸支持细胞。RNase R酶消化法、PCR和Sanger测序证实了circ＿026259的环化特征,即由绵羊KLHL5基因第2-5个外显子产生,且由第2和第5个外显子反向剪接形成环化结构（将circ＿026259命名为circ KLHL5）。通过一系列双荧光素酶、过表达、敲低、CCK-8、Ed U染色、细胞流式分析发现,circ KLHL5可通过靶向oar-mi R-29b促进支持细胞中IGF1基因的表达,进而诱导支持细胞的增殖并抑制其凋亡。综上所述,转录组测序结合相关分子生物学方法揭示了许多差异表达基因在发育的藏绵羊以年龄依赖的表达模式参与生殖细胞发育、减数分裂、血-睾屏障、免疫稳态等生物学过程,并且这些基因中的大多数表达可能受到mi RNAs和/或circ RNAs的调控,以响应不断发育的睾丸内环境及持续的精子发生过程。同时,鉴定到一个由绵羊KLHL5基因产生的新的环状RNA circ KLHL5,并证实其通过靶向oar-mi R-29b调节IGF1基因的表达和睾丸支持细胞的发育。这些发现填补了有关绵羊睾丸组织circ RNAs认识的空白,丰富了现有的绵羊转录组信息,并为进一步理解绵羊及其他高原哺乳动物睾丸发育和精子发生机制提供了理论依据。
靳锴[2]（2021）在《鸡性别决定过程中SMAB2可变剪切体(SMAD2WΔ11)功能及其调控机制的研究》文中指出性别决定（Sex Determination）是一个复杂且可塑的发育过程,一直以来都是生物学,医学和畜牧学等领域的研究热点。研究性别决定的机制不仅对于理解生物的发育和分化具有重要意义,而且能够有效的提高经济动物的生产效率。尤其是鸡的性别与生产力关系极大,在家禽生产中,商品蛋禽中雌禽的生产效益远高于公禽;而在肉禽生产中,雄禽生长快,产肉多,饲料报酬均显着地高于雌禽。因此如果能够有效的控制鸡的性别,能够大幅提高其生产效率,并能够避免在出生时对雏鸡进行淘汰而带来的资源浪费和相关的伦理问题,其重要性和意义不言而喻。因此一直以来,建立高效和准确的性别控制方法都是家禽生产研究中的热点。然而,迄今为止鸡性别决定的具体机制仍不清楚,极大的制约了性别控制技术在家禽生产中的研究与开发,与此同时也影响了鸡作为模型在病毒学,胚胎学,发育生物学和转化医学等领域的应用,所以迫切的需要对其性别决定的机制进行深入的探索。近年来,研究表明可变剪切作为一种重要的调控方式不仅广泛的参与生物的生命活动,同时也深入的参与了性别决定过程,果蝇中Sxl和小鼠中Sry基因性别决定过程中均发现存在可变剪切的调控。虽然目前有研究指出在鸡胚胎发育过程中存在可变剪切事件,表明可变剪切事件参与了鸡胚胎的性别决定过程,然而可变剪切在鸡（或鸟类）性别决定过程中的作用与功能仍需进一步的探究。基于此,本研究利用最新的单分子实时测序技术PacBio Sequel Ⅱ与传统的二代测序技术Illumina HiSeq系统的研究了鸡胚胎性别决定过程中关键时间点的基因表达和两性可变剪切差异,发现并鉴定出鸡性染色体同源基因SMAD2在W染色体上存在特异性可变剪切表达SMAD2W△11,并通过体内外实验证明其在性别决定中的生物学功能,并对其机制进行了探究。为鸡（鸟类）性别决定机制的研究提供参考依据,并为后续深入研究鸡性别决定过程中其他基因可变剪切事件的功能和机制提供了了理论支撑。具体的研究结果如下:（1）多组学测序显示W染色体基因SMAD2在鸡胚的性别决定过程中存在特异表达的转录本对性别决定不同时期的雌雄胚胎（E0,HH Stage 1）,生殖腺（E3.5-E6.5,HH Stage 21-HH Stage 30）和性腺（E18.5,HH Stage 44）的组织样本进行二代测序,实验结果发现整体样本间的整体转录水平差异较小,进一步的分析显示两性之间在胚胎期（E0,HHStage 1）存在84个差异基因,其中在雄性中高表达基因37个,雌性中高表达基因47个,性染色体上基因62个（Z:30,W:32）;两性在生殖腺组织的决定过程中差异表达基因数目分别为122（E3.5,雄性40,雌性82）,59（E4.5,雄性14,雌性45）,59（E5.5,雄性22,雌性37）和124（E6.5,雄性46,雌性78）,其中性染色体上的差异基因分别为65个（E3.5,Z:27,W:38）,44 个（E4.5,Z:8,W:36）,22 个（E5.5,Z:1,W:21）和 53 个（E6.5,Z:16,W:37）;在性腺组织（E18.5,HHStage44）中存在 3000个差异基因,在雄性中高表达基因有1952个,雌性中高表达基因有1048个,其中性染色体上基因243个（Z:206,W:37）。对性别决定不同时期的雌雄胚胎（E0,HHStage 1）,生殖腺（E3.5-E6.5,HH Stage21-HHStage30）和性腺（E18.5,HH Stage 44）的组织样本进行混样,根据性别分为雌性和雄性两组进行建库和三代单分子实时测序（SMRT）。雄性SMRT文库共产生了共检测出56,844,862条Subreads,雌性SMRT文库共检测出53,056,064条Subreads。进一步的处理后获得26,089条雄性非冗余转录本,雌性23,889条非冗余转录本。对两性差异分析的结果显示两性全长转录本在性别决定过程中的常染色体上差异较小,但是在性染色体上差异较大,其中在雄性在Z染色体上的特异表达转录本为417条,W为0,而雌性在Z染色体上特异表达的转录本为208条,在W染色体上为60条,分析结果显示有12个基因在W染色体上存在雌性特异表达的转录本,分别是UBP2,UBE2R2,ZSWIM6,SPIN和SMAD2等基因。将三代测序结果与二代测序中不同时期和性别中的转录本表达量进行联合分析,发现W染色体上SMAD2基因存在特异的可变剪切,且在两性性别决定过程中存在表达差异。在胚胎发育的0天,两性Z染色体上SMAD2转录本的表达无差异,而在性别分化阶段（3.5天,4.5天,5.5天和6.5天）,雄性中SMAD2Z的转录本表达均高于雌性,与此同时,结果显示18.5天的生殖腺中雄性SMAD2Z的表达显着高于雌性。相反的是,在整个发育阶段,雄性中均未检测到SMAD2W的表达,在雌性中,SMAD2W在3.5天-6.5天均存在表达,在18.5天转录本的表达量较高。这些结果表明SMAD2Z和SMAD2W可能在鸡胚胎雌性发育中扮演不同的作用。（2）体内外研究SMAD2Z和SMAD2W可变剪切在鸡胚性别决定过程中的功能分别鉴定和克隆SMAD2Z和SMAD2W的全长及对应的可变剪切体,qRT-PCR结果发现在早期两性胚胎发育过程中两性SMAD2Z和雌性SMADW中的均存在可变剪切表达,其中两性中SMAD2Z的mRNA表达以SMAD2ZFL和SMAD2ZΔ3为主,雌性中SMAD2W的mRNA表达则是以SMAD2WFL,SMAD2W△3 和 SMAD2W△11 为主。进一步的 Northern Blot 结果证明 SMAD2W 可变剪切体SMAD2W△11在卵巢中真实存在且特异表达。在此基础上针对SMAD2Z和SMAD2W全长及其可变剪切体的序列成功构建对应的慢病毒过表达载体并验证活性,与此同时依据其共有序列部分构建了 3条SMAD2的干扰载体,并验证活性后选择干扰效率最好的载体进行慢病毒包裹。在体外成功分离了两性CEF细胞系并进行了进一步的培养和鉴定,分别在DF-1细胞和两性CEF细胞上对SMAD2Z全长和SMAD2W△11的功能验证,发现无论是在DF-1细胞上,还是在两性CEF细胞中,干扰SMAD2后,雄性相关基因的表达出现下降,而雌性相关的基因上升,过表达SMAD2Z后,出现了相反的现象。与此同时,过表达SMAD2W△11能够引起雌性相关基因的表达上升,而雄性相关基因的表达出现下降。通过在鸡胚上建立高效的鸡胚体内注射模型并进行功能验证,组织学观察的结果发现干扰SMAD2能够诱发性腺由雄性向雌性表型的性别反转（7/34,20.59%）,而过表达SMAD2W△11也会诱发性腺由雄性向雌性反转（10/46,21.73%）,而同时干扰SMAD2和过表达SMAD2W△11则能够进一步促进这种现象（23/41,56.10%）,与此相反的是单独过表达SMAD2Z,则会诱发性腺由雌性向雄性反转（21/44,47.73%）。Western Blot和qRT-PCR对性别相关基因的检测结果进一步验证了表型变化的准确性。这些结果共同表明SMAD2Z能够诱导胚胎向雄性决定,而SMAD2W△11则会诱导胚胎向雌性方向决定。（3）SMAD2W△11调节鸡胚雌性性别决定的分子调控机制探究分别构建SMAD2Z和SMAD2W△11的His标签原核融合表达载体,诱导表达和纯化后进行鉴定,通过His-Pulldown和质谱（MS）技术分别鉴定SMAD2Z和SMAD2W△11在卵巢和睾丸中的结合蛋白差异,发现差异蛋白集中在分化发育相关通路,激素合成和蛋白后修饰过程相关通路中,其中性激素合成通路关键基因CYP19A1在卵巢中与SMAD2W△11存在特异结合。通过Co-IP技术进一步验证了 His-Pulldown互作的准确性,并进一步的对CYP19A1在鸡胚性别决定过程中的功能进行验证。体内的验证结果表明,CYP19A1的过表达能够有效的促进鸡胚向雌性方向决定,而干扰则会导致鸡胚向雄性方向决定。综合上述结果可以得出推论,W染色体上特异的可变剪切体SMAD2△11能够通过结合CYP19A1促进鸡胚雌性性别决定过程,其具体的机制仍然有待进一步的研究。
袁硕[3]（2020）在《精子相关抗原6（SPAG6）及其结合蛋白在调控精子发生中的作用》文中提出目的:研究精子相关抗原6（SPAG6）与多种蛋白的相互作用,探讨SPAG6对小鼠精子发生过程的调控作用。方法:首先以小鼠睾丸组织cDNA文库为对象,使用酵母双杂交实验筛选出几种最可能与SPAG6相结合的蛋白,随后采用直接酵母双杂交实验证实这些蛋白与SPAG6产生相互作用;以野生型雄性小鼠为对象,选择第一波精子发生阶段,即小鼠出生后第6、8、12、16、20、24、28、30、35和42天的睾丸组织样本,Western blotting实验研究SPAG6、Snapin及COPS5的表达。以CHO细胞为对象,体外将pTarget/SPAG6分别和pEGFP-N2/Snapin、pEGFP-N2/COPS5以及pEGFP-N2/TCTE3表达质粒转染到细胞中,免疫荧光实验观察SPAG6与这三种蛋白是否在体细胞中存在共定位。以COS-1细胞为对象,体外将SPAG6/GFP分别和Snapin/Flag、COPS5/Flag以及TCTE3/Flag表达质粒转染到细胞中,免疫共沉淀实验（Co-IP）验证SPAG6与这三种蛋白间的相互作用。以Spag6基因敲除雄性小鼠为实验组,野生型雄性小鼠为对照组,H&E染色观察两组小鼠形态学上的差异;免疫荧光实验观察两组小鼠睾丸组织的生精细胞中SPAG6、Snapin及SPAG16L的定位;免疫荧光实验观察两组睾丸组织石蜡切片中SPAG6、Snapin和COPS5的定位。结果:酵母双杂交实验筛选出了多种具有不同功能的蛋白质,包括Snapin、COPS5、TCTE3、SPAG16L等。Snapin在雄性生殖细胞中具有与SPAG6相类似的定位,SPAG6与Snapin的C末端存在相互作用,进一步研究发现是SPAG6的199到280位氨基酸序列介导了SPAG6与Snapin之间的相互作用。Snapin在CHO细胞中定位于细胞质中,当其和SPAG6共表达时,两者有部分产生共定位;Flag抗体可将Snapin和SPAG6从细胞裂解液中共同沉淀,表示这两种蛋白之间存在相互作用。COPS5在CHO细胞中存在于整个细胞质,与SPAG6共表达时,则聚集在核膜附近;Co-IP实验发现Flag抗体可分别将COPS5和TCTE3与SPAG6从细胞裂解液中共同沉淀,表明COPS5和TCTE3与SPAG6之间存在相互作用。SPAG16L存在于圆形精子细胞的细胞质和长形精子细胞的精子领中,在Spag6基因敲除小鼠中,SPAG16L仍存在于圆形精子细胞的细胞质中,但在长形精子细胞中仅存在痕量的SPAG16L,表示它在精子领中的定位消失。在野生型雄性小鼠中,SPAG6存在于精母细胞的胞浆囊泡、圆形精子和长形精子的顶体以及长形精子的精子领（manchette）中。比较Spag6基因敲除雄性小鼠（实验组）和野生型雄性小鼠（对照组）的睾丸组织结构形态,发现实验组小鼠睾丸组织中精子发生的晚期阶段受到干扰,生精小管的管腔发育迟缓,长形期精子细胞头部畸形,生精周期13-16阶段发生混乱,有细胞质裂片和残留体的异常形成。结论:SPAG6可能通过与其结合蛋白如Snapin、COPS5等形成复合物,影响雄性小鼠不同发育阶段生殖细胞以调控精子的发生。
伍仕鑫[4]（2019）在《犏牛精子发生阻滞相关lncRNA的鉴定与功能分析》文中进行了进一步梳理犏牛的雄性不育由精子发生阻滞引起,由此阻碍了牦牛育种中对杂交种犏牛优良基因的有效固定。多年来针对犏牛生精阻滞的产生机理进行了诸如组织形态学、细胞遗传学、内分泌学和分子生物学等多方面的探究,但是针对犏牛及其亲本牦牛之间睾丸长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）的比较研究还未见报道。随着lncRNA在哺乳动物包括精子发生的众多生命活动过程中通过时空动态表达所发挥的重要生物学功能被一一挖掘,对犏牛和牦牛睾丸组织进行初步的lncRNA鉴定及功能初探则可能为犏牛雄性不育的分子机制探究带来新的见解。本研究利用二代高通量测序仪Hiseq 2500对源自同一生长条件下的12月±1月龄牦牛和犏牛的睾丸组织进行转录组测序和生物信息学分析;随后对lncRNANONBT-258进行克隆和表达分析;最后采用STA-PUT法对牦牛和犏牛进行生精细胞的分离,并用siRNA转染牦牛生精细胞后对lncRNANONBT-258进行功能初探。主要研究结果如下:1.转录组测序筛选到604个差异表达的lncRNAs（|Fold Change|≥2,P<0.05）,其中大部分（469个）在犏牛睾丸中低表达,且差异表达倍数极大和显着性极高的大部分lncRNAs也下调表达。这些lncRNAs转录本的平均长度和表达水平均显着不及mRNAs。2.差异表达lncRNAs靶基因的富集分析分别鉴定得到83个和32个显着富集的GO条目（P<0.01）和KEGG通路（P<0.05）,这些靶基因参与犏牛生精过程中细胞分裂的起始,细胞周期负性调控和相变调控,细胞周期进程的检控,DNA复制的损伤检测及修复,同源重组和细胞的内吞、程序性死亡、生长、分化和凋亡,以及细胞物质代谢等重要的信号通路和生物学过程。3.差异表达lncRNAs和靶基因在牦牛和犏牛睾丸组织中的定量表达分析,以及生精细胞标记基因和细胞周期相关基因在牦牛和犏牛生精细胞中的qRT-PCR分析均表明这些分子在犏牛中的表达与测序数据具有一致性,证实了转录组测序数据的可靠性。4.LncRNANONBT-258在牦牛和犏牛个体中较高的同源性（98.29%）表明其在同属异种下具有较高的保守性,并可能在犏牛睾丸组织中发挥重要的功能作用。生信分析进一步预测出lncRNANONBT-258的低编码能力和其与靶基因BRCA1强的互作能力。5.使用STA-PUT装置可以从牦牛和犏牛睾丸组织中分离获得生精细胞（包括精原细胞和精母细胞）。特异siRNA转染牦牛的生精细胞后未能成功降低lncRNANONBT-258的表达水平,需对细胞转染条件进行优化。本实验表明,犏牛和牦牛睾丸组织之间存在大量差异表达的lncRNAs。这些lncRNAs的靶基因在与细胞周期进程、DNA复制、同源重组、细胞异常增殖的矫正、细胞粘附、迁移、免疫、代谢、程序性死亡和凋亡等相关的重要的生物学过程和信号通路上的富集程度存在显着的差异性,表明lncRNA可能通过调控靶基因的表达后参与生精细胞的生长、增殖和分化过程,进而影响犏牛的精子发生过程。
李志明[5]（2018）在《多芯片联合解析ZCCHC13和PLCXD3基因在无精症、肝细胞癌中的表观遗传调控机理》文中进行了进一步梳理睾丸组织高表达的基因不仅对生殖细胞的生物学过程非常重要,而且与多种肿瘤的发生密切相关,其中最有代表性的就是癌睾抗原。miRNA和DNA甲基化是调控基因表达的两个主要的表观遗传因素。为了发现睾丸组织高表达基因在miRNA和DNA甲基化方面的表观遗传调控机制,本课题以非梗阻性无精症（Non-obstructive azoospermia,NOA）和梗阻性无精症（Obstructive azoospermia,NOA）患者的睾丸组织为样本,首先运用基因表达谱、miRNA表达谱和DNA甲基化表达谱芯片筛查了差异表达的基因、miRNA和甲基化位点,然后通过荧光定量PCR技术对芯片结果进行了实验验证,发现两个功能未知的基因PLCXD3和ZCCHC13,它们在生精功能正常的OA睾丸组织中呈强阳性表达,而在精子生成障碍的NOA睾丸组织中未见表达,推测二者对精子生成有重要作用。接着结合生物信息学预测信息,在生殖细胞系和肿瘤细胞系中对着两个基因的靶miRNA,以及ZCCHC13基因的甲基化调控进行了深入研究。本课题的主要研究结果如下:1.建立了 NOA和OA的睾丸组织的基因表达谱、miRNA表达谱和DNA甲基化表达谱,发现OA睾丸组织的基因表达和表观遗传组数据（miRNA和DNA甲基化）与NOA明显不同。2.对差异表达基因和差异表达miRNA进行了关联分析,构建了 miRNA-基因调控网路,软件预测和实验验证结果都证明PLCXD3与miR-34c-3p,ZCCHC13与miR-369-3p有负调控关系。3.在小鼠、OA和NOA的睾丸组织中检测了 PLCXD3和ZCCHC13蛋白定位,首次发现小鼠和OA患者（生精功能正常）的睾丸有PLCXD3和ZCCHC13蛋白的强免疫阳性信号,而在NOA睾丸组织中表达非常弱;正常肝脏组织的PLCXD3和ZCCHC13基因的表达水平都非常低。4.对差异表达基因和差异表达DNA甲基化位点进行了关联分析,发现ZCCHC13基因启动子存在甲基化修饰位点,甲基化转移酶抑制剂诱导的去甲基化能上调其mRNA和蛋白的表达。5.ZCCHC13基因启动子DNA低甲基化修饰是肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）组织和细胞系过表达ZCCHC13蛋白的表观遗传原因,而ZCCHC13过表达能激活AKT/ERK/c-MYC信号通路,上调周期蛋白CDK1和CKD4蛋白表达,进而促进肿瘤细胞增殖。综上所述,本课题以睾丸组织为样本建立了芯片联合分析的方法,应用该方法筛选得到了两个关键基因PLCXD3和ZCCHC13,以及分别对应的靶miRNA:miR-34c-3p和miR-369-3p。此外,在生殖细胞和肿瘤细胞中发现ZCCHC13表达水平受DNA甲基化修饰的影响,基因组的去甲基化可以上调ZCCHC13蛋白表达。本研究首次在生殖细胞和肿瘤细胞中揭示了 PLCXD3和ZCCHC13的表观遗传调控方式,为探索无精症和癌症的分子机制提供了重要的实验依据。
刘京鸽[6]（2017）在《大白猪出生前后肝脏组织microRNA和mRNA深度测序分析及IGF-1基因差异表达调控机制研究》文中提出肝脏是分泌产生IGF1的主要场所。大量研究发现,类胰岛素样生长因子1（Insulin-like growth factor 1,IGF1）与其受体（IGF1R）以及相关结合蛋白（IGFBPs 1-6）组成的系统对动物的生长发育及代谢具有关键的调控作用。本项目组前期选择了出生前三个时期（妊娠50日胎龄、妊娠70日胎龄及妊娠90日胎龄）及出生后5个时期（出生当天、20日龄、70日龄、120日龄、180日龄）猪肝脏组织为试验材料,对IGF1在出生前后猪的肝脏中的表达模式进行了检测,研究结果显示,IGF1出生前的表达水平相对较低,出生后的表达量即出现了显着性的增加。尽管如此,IGF1在出生前后表达量的显着性变化是发生在妊娠90日龄至出生当天这段时间中的某一个节点,以及造成IGF1出生前后表达模式差异的分子调控机制仍不清楚。因此,本试验新增了妊娠110日龄阶段的猪肝脏组织,完善了IGF1在妊娠90日龄至出生当天的表达模式,并初步研究了 IGF1出生前后表达差异的分子调控机制。作为哺乳动物体内最大的内脏器官之一,肝脏表现出分泌多种激素的内分泌及外分泌的特质,在多种代谢的过程中发挥重要的作用。肝脏可合成分泌载脂蛋白及脂蛋白、脂代谢酶,表达脂蛋白受体摄取脂质等方式,维持机体的脂肪平衡状态,是研究机体脂代谢的合适靶器官。然后,妊娠时期及出生后的肝脏在脂代谢功能中所发挥的作用存在明显的差异,目前对不同动物的肝脏组织microRNA（miRNA）及mRNA的表达差异及功能鉴定已经有部分研究报道,但针对猪出生前后不同发育期肝脏组织差异表达的miRNA、mRNA,以及其所参与的生物学过程及通路的研究却鲜见报道。MiRNA是一种长约22bp的非编码RNA,通过表观遗传调控的方式参与了生物体一系列的生物学过程,包括细胞生长、细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、糖代谢、脂肪成与分解及蛋白质的合成与分解等,因而受到了诸多科研工作者的关注。转录组高通量测序能够针对某一特定时期的某一特定组织或者是细胞挖掘出所有的基因及miRNA,对二者的整合分析可以准确的、深入的鉴定出影响猪肝脏组织发育相关及参与脂代谢的关键miRNA及基因,可以帮助我们更全面的了解肝脏发育及脂代谢等调控的分子机理。因此,本研究以大白猪妊娠70日龄及出生后70日龄猪的肝脏组织为试验材料,每个时期选取4个个体,共计8个样本进行了如下内容的研究:（1）通过RNA-Seq技术,对大白猪出生前后两个时期的肝脏组织进行高通量测序,通过数据分析鉴定出出生前后肝脏组织中差异表达的miRNA和mRNA,并对两个转录组的数据进行联合分析。所获得的研究结果为进一步了解miRNA对肝脏组织发育及脂代谢的调控提供坚实有力的理论基础;（2）研究了转录因子C/EBPβ影响IGF1表达的转录调控机制;（3）研究C/EBPβ在猪肝脏中的表达规律及其表达的调控,并探讨其出生前后表达水平显着性变化的机制;（4）从表观调控的角度,探讨IGF1启动子区甲基化差异对其表达的影响;（5）根据miRNA及mRNA测序结果、从表观调控的角度探究了潜在调控IGF1表达的miRNA。根据以上研究内容所获得的研究结果如下:1.大白猪妊娘70日龄胎猪（P70）及70日龄仔猪（D70）肝脏组织miRNA测序分析本研究共构建了 8个miRNA文库（每个发育期分别建立了 4个肝脏样本测序文库）,平均获得约28M（百万）的raw reads。去掉无效数据后,分别获得约20M（百万）、可用于后续分析的clean reads。长度统计分析显示,肝脏组织的miRNA主要分布在21-23nt范围内,符合miRNA的长度分布特点。进一步,对所获得的miRNA进行表达差异分析、聚类分析、GO富集分析以及KEGG通路富集分析。差异表达分析的结果显示:本试验gong共鉴定了 116个差异表达的miRNA,较70日龄仔猪（D70）而言,61个是表达上调的,55个是表达下调的。而聚类分析的结果显示,同一生长发育期的4个样本可以很好的聚到一起,说明样本的整齐度较高,后续进行的一系列生物信息学分析更加可靠。另外,GO功能注释及KEGG通路富集分析发现,主要富集的GO条目有细胞分化过程、发育过程、代谢过程、信号传导过程及生物学调节等条目;主要富集的KEGG条目有cAMP信号通路、Wnt信号通路、Notch信号通路、PI3K-Akt、MAPK信号通路、FoxO信号通路、脂肪细胞因子信号通路、甲状腺激素信号通路等。这些通路对动物肝脏的发育及脂代谢的过程具有重要的作用。在此基础上,随机挑选10个差异表达的的miRNA进行qRT-PCR验证,结果表明,荧光定量结果同高通量测序获得的结果一致,表明测序结果真实可靠。2.大白猪妊娘70日龄胎猪（P70）及70日龄仔猪（D70）肝脏组织mRNA测序分析本研究gong共构建了 8个mRNA文库（每个发育阶段分别选取4个肝脏样本）,测序分析共鉴定了25323个已知的基因、9986个新的转录本。差异表达分析显示,两个不同发育期共存在4916个差异表达的mRNA,较70日龄仔猪（D70）而言,2502个基因是表达上调的,2414个基因是表达下调的。其中126个基因仅在P70样本中表达,75个基因仅在D70样本中表达,4715个基因在两个生长期的样本中均有表达。对差异表达的miRNA进行层次聚类分析,结果显示同一生长发育的4个样本可以很好的聚到一起,说明统一阶段重复样本的整齐度较高。进一步,对差异表达的mRNA进行GO功能注释及KEGG通路富集分析发现,分析结果显示,主要富集的GO条目包括代谢、应激和免疫反应等;KEGG条目包括DNA复制、细胞周期、脂肪酸代谢、糖代谢、药物代谢、氨基酸降解、PPAR信号通路、类固醇激素合成等过程。随机挑选10个差异表达的的mRNA进行qRT-PCR验证,结果显示,荧光定量结果同高通量测序所获的的结果一致,说明了本次测序结果真实可靠。3.MiRNA及mRNA测序结果的整合分析在高通量转录组测序基础上,本研究使用miRanda及TargetScan等软件对差异显着上调的的miRNA进行靶基因预测,并与mRNA测序中获得的差异显着性下调的基因进行交集分析,以此获得“表达量上调的miRNA-表达量下调的mRNA对”,本研究共获得60对“上调miRNA-下调mRNA”;对差异显着下调的的miRNAs进行靶基因预测,并与mRNA测序中获得的差异显着性上调的基因进行交集分析,以此获得55对“下调miRNA-上调mRNA”。进一步GO及KEGG富集分析结果显示,主要富集的GO条目为血小板生成素受体活性及抗原结合等;主要富集的KEGG条目为TNF及免疫系统等信号通路上。4.双荧光素酶报告系统研究潜在转录因子C/EBPβ对IGF1的表达调控荧光定量PCR结果显示,不同发育期C/EBPβ mRNA水平的表达模式同IGF1 mRNA表达模式相似:出生后的表达量显着的高于出生前的表达量。双荧光素酶报告试验显示,C/EBPβ可以显着性的增加野生型的IGF1启动子区的荧光素酶活性,位点2突变后,荧光酶活性较野生型而言,有了极显着性的下降;位点1突变后,荧光素酶活性有了细微的下降,但差异并不显着;位点1、2同时突变后,其荧光素酶活性较野生型而言有了极显着性的下降。以上结果说明C/EBPβ主要通过作用于IGF1启动子区的位点2处,从而调控IGF1基因的表达。5.猪出生前后肝脏组织IGF1不同型启动子甲基化模式的研究针对大白猪IGF1基因的潜在Ⅰ型及Ⅱ型启动子区序列进行甲基化测序,结果分析显示,大白猪妊娠70日龄（P70）、妊娠110日龄（P110）、出生当天（D0）及出生70日龄（D70）的肝脏组织、共16个样本中,IGF1的两个潜在的启动子区域的甲基化水平并没有显着性的变化,而只是在个别位点存在细微差异,但这种差异并不显着。研究结果表明IGF1在出生前后肝脏中的急剧变化并不是由其启动子区的甲基化差异所导致。6.miR-18b及miR-130b可以直接靶向IGF1的3,-UTR区,从而调控其表达MiRNA及mRNA测序联合分析结果显示,IGF1是miR-1 8b和miR-130b直接靶向基因,且miR-18b和miR-130b与IGF1呈现相反的表达模式。在此基础上,本研究采用qRT-PCR技术对他们的表达模式进行了检测,结果表明,荧光定量结果与测序结果完全一致。进一步,本研究利用双荧光素酶报告系统对它们之间的调控关系进行了验证,结果表明miR-18b及miR-130b可以通过直接靶向IGF1 3’-UTR区抑制IGF1的表达。7.猪出生前后肝脏组织C/EBPβ上游潜在转录因子表达模式研究生物信息学分析显示,C/EBPβ上游调控区域存在多个潜在的转录位子结合位点,因此本研究利用荧光定量PCR对C/EBPβ上游潜在转录因子在猪出生前后肝脏组织中的表达模式进行了检测,荧光定量PCR结果显示,不同发育期C/EBPβ的潜在转录因子STAT3,CALR,CUGBP1,Sβl的mRNA水平的表达模式同C/EBPβmRNA表达模式相似,即出生后的表达量显着的高于出生前的表达量;而Myb,RARA及SREBP mRNA水平的表达同C/EBPβmRNA表达模式相反,即出生前的表达量显着的高于出生后。
双超凡[7]（2017）在《利用酵母双杂交筛选与IFT20发生相互作用的蛋白研究》文中研究指明目的:鉴定IFT20蛋白在雄性小鼠中的表达情况;运用酵母双杂交试验筛选出可能与IFT20蛋白有相互作用的蛋白,为IFT20参与精子发生的机制研究提供理论依据。方法:分别提取昆明种成年雄性小鼠脑、肺、肾、肝、脾、睾丸及小鼠不同发育时期睾丸组织的总蛋白,Western Blot检测IFT20表达,睾丸组织切片及生精细胞分离,免疫荧光染色观察IFT20蛋白的定位;运用PubMed数据库,根据小鼠Ift20的编码序列（CDS区）设计特异性引物;RT-PCR扩增小鼠睾丸总RNA,Ift20 cDNA经TA克隆后与pGBKT7载体构建Ift20/pGBKT7重组质粒,酶切和测序鉴定筛选出正确的目的质粒;将Ift20/pGBKT7重组质粒转入制备好的AH109感受态细胞中,与Clontech公司提供的已提前转入Y187感受态细胞中预转化的小鼠文库重组质粒进行酵母双杂交筛选试验,挑取800个样品初步筛选,经酵母质粒小提后测序,分析重复检出次数在8次以上的蛋白,并挑选关键性蛋白进行进一步分析。结果:Western Blot结果表明IFT20在肺、肾、肝、脾、睾丸组织中均有表达,但在睾丸组织中的表达最丰富,且在睾丸中IFT20的表达随着精子发生过程逐渐增加,在精子发生的第三阶段（出生后第30天及之后）表达丰富,免疫荧光染色显示IFT20在睾丸组织表达量丰富,在生精细胞中,IFT20蛋白在精子发生的第三阶段定位于精子领部位;酶切和测序鉴定Ift20/pGBKT7重组质粒构建成功。酵母双杂交筛选试验测序结果显示共248个蛋白被筛选出可能与IFT20相互作用,其中SPATA1出现次数46次为最多,其次是IFT81、WAC、HAUS1、TEX12、SNAPIN等。选择性研究IFT20与SNAPIN的相互作用,结果显示与IFT20一样,SNAPIN也在雄性小鼠出生后第30天表达量开始明显增加,在精子发生第三阶段也定位于精子领部位;酵母双杂交转化、体外细胞转染和免疫共沉淀试验证实SNAPIN与IFT20之间存在直接相互作用,IFT20可募集SNAPIN从胞浆抵达到囊泡表达,IFT20与SNAPIN存在于同一蛋白复合物中。结论:酵母双杂交试验初步筛选出SPATA1、IFT81、WAC、HAUS1、TEX12、SNAPIN很大可能与IFT20相互作用,进一步分析证实了IFT20与SNAPIN存在于同一复合物中。
徐海霞[8]（2015）在《Hnrnpk及Dnmts在哺乳动物雄性生殖细胞发育过程中的表达及功能研究》文中研究说明哺乳动物雄性生殖细胞发育是一个复杂的生物学过程。这一过程受到体内外多层次的精确调控,其中精子发生过程相关基因的正确表达对整个生精过程起着至关重要的作用。对这些基因在哺乳动物雄性生殖细胞发育过程中的表达及相关功能的研究,将有助于我们深入阐明精子发生的分子调控机理,从而有针对性地为解决家畜繁殖障碍及雄性不育问题提供新的思路。异质性胞核核糖核蛋白K（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K,Hnrnpk）作为一个多功能蛋白,广泛参与了染色体包装、转录调控、选择性剪接和翻译等过程,有着重要的生物学功能,与生殖细胞发育和精子发生关系密切。而精子发生过程伴随着生殖细胞基因组DNA甲基化的重建,由DNA甲基化酶（DNA methyltransferases,Dnmts）介导的DNA甲基化异常会影响生殖细胞发育和精子发生。本研究选择生殖细胞发育相关基因Hnrnpk和Dnmts作为研究的切入点,从克隆猪Hnrnpk基因着手,进一步对其分子结构特征、表达定位模式、生物学功能展开系统研究并对其相关作用机理进行了初步探索;同时建立了不同发育时期大鼠Dnmts的动态表达谱,并对其调控因素进一步探寻;这些研究结果将为揭示其在精子发生过程中的重要作用奠定基础。取得的主要研究结果如下:（1）克隆得到猪的Hnrnpk基因,其c DNA全长为2712 bp,包含1392 bp的开放阅读框,编码463个氨基酸,起始密码子位于230-232 bp处,终止密码子位于1622-1624 bp处,5’端非翻译区共229 bp,3’端非翻译区共1091 bp。根据序列比对及基因结构分析,推测出猪的Hnrnpk基因全长约为12.3 kb,包含17个外显子和16个内含子,该基因的外显子与内含子相连碱基符合GT/AG法则。通过RACE和进一步的PCR扩增发现猪上至少存在8种不同的转录本,主要是由于外显子1、8及17的选择性剪接引起,且8种不同的转录本对应4种蛋白。（2）Hnrnpk在猪睾丸、骨骼肌及脂肪等组织中相对高表达,肺、肾、卵巢及大脑等组织中次之,心和肝组织中表达相对较低;而在猪睾丸组织发育早期Hnrnpk表达量较高,这一结果在不同发育时期大鼠睾丸组织也得到进一步验证。定位分布结果表明三个不同发育时期猪睾丸组织曲细精管中Hnrnpk主要定位于精原细胞、精母细胞胞核与精子细胞胞浆,在支持细胞和肌样细胞也有分布。提示Hnrnpk可能在生殖细胞发育过程中发挥重要作用。（3）设计并合成3对si RNA,转染C18-4及GC-1spg细胞,筛选得到si RNA-1100干扰效率在80%以上。与si RNA-NC及Mock转染组相比较,si RNA-Hnrnpk转染组细胞数量明显减少,离散分布在视野中,且有较多漂浮细胞。通过细胞计数及Cell Titer-Glo?细胞增殖检测发现转染48 h细胞数量显着低于对照组（P<0.05）,而凋亡检测显示TUNEL阳性细胞数显着高于对照组（P<0.05）;结果表明Hnrnpk的敲低减少了细胞数量,促进了细胞凋亡。（4）转录组测序分析发现敲低的GC-1spg差异表达的基因中24个基因与细胞增殖有关,15个基因参与调控细胞凋亡。Icmt、Oaz1、Nanog、Fntb等正向调控增殖基因表达下调,Nos2、Ptpn6、Serpine1、Spry1等负调控增殖的基因则表达上调。此外,Xiap、Rap1GAP1、Sirt1等抗凋亡基因表达下调,Caspase2、Caspase3等促凋亡基因则表达上调。这些结果表明Hnrnpk可能通过调控上述增殖凋亡相关基因的表达来发挥其生物学功能。（5）不同发育时期大鼠Dnmts的动态表达谱表明:在大鼠胚胎期睾丸组织中Dnmt3a表达量较高,其中在18.5胚龄达到最高水平,出生后逐渐降低,Dnmt3l的表达模式与Dnmt3a较为相似。而Dnmt3b出生前表达量较低,出生后逐渐升高。与Dnmt3相比,不同发育时期Dnmt1表达量相对较低,其表达趋势与Dnmt3b相似。结果提示大鼠睾丸组织发育过程中,Dnmt3a与Dnmt3l可能相互协调在DNA甲基化重建过程发挥作用,而Dnmt3b与Dnmt1可能作用于DNA甲基化维持。（6）出生后不同发育时期大鼠mi R29的动态表达谱与Dnmt3a和Dnmt3b相反,mi R29 inhibitor转染实验证实mi R29能够负调控Dnmt3a和Dnmt3b。结果提示mi R29可能通过介导Dnmts在出生后大鼠睾丸组织发育过程中发挥重要作用。综上所述,Hnrnpk在雄性生殖细胞发育过程中表达,并通过调控增殖与凋亡相关基因的表达决定细胞的命运。在大鼠睾丸组织发育过程中Dnmts呈现动态表达模式,Dnmt3a和Dnmt3l可能相互作用协调建立DNA甲基化模式,而Dnmt3b和Dnmt1可能参与DNA甲基化维持。同时,在这个过程中mi R29可能通过负调控Dnmts的表达而发挥作用。
孟亮[9]（2014）在《半滑舌鳎精子发生相关基因的研究及大菱鲆免疫相关EST的筛选》文中认为半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）是我国特有的优质海水养殖鱼类，其雄性个体比雌性个体小2到4倍，且生长速度也比雌性个体慢很多。另外，半滑舌鳎的性别决定系统为ZZ/ZW型，存在自然性逆转现象。这些原因都导致了在自然养殖条件下雄性比例过高，从而严重阻碍了半滑舌鳎养殖产业的进一步发展。为了提高后代雌性比例，在育种中我们尝试用半滑舌鳎伪雄鱼为父本，结果却发现伪雄鱼后代中的雌性比例并没有提高。因此我们检测了伪雄鱼精子的基因型，发现只有Z型精子而没有W型精子。结合半滑舌鳎基因组测序结果发现，W染色体虽然比Z染色体大很多，但携带的基因数目却远远少于Z染色体，所包含的遗传信息也少很多。本文对3个半滑舌鳎Z染色体特异的、与精子发生相关的基因进行了初步的研究，推测了这些基因在精子发生过程的功能，为揭示半滑舌鳎W型精子缺失的原因，及高雌乃至全雌育种提供理论依据。主要结果如下：1.克隆得到了半滑舌鳎tesk1全长cDNA序列和基因组序列。利用定量PCR检测了该基因的表达特征，结果表明：tesk1在半滑舌鳎精巢中的表达最高，在脑、肝脏、肾脏中有少量表达；在正常雄鱼和伪雄鱼精巢中表达，而三倍体雄鱼的精巢中不表达；在116天前几乎不表达，5个月开始表达，1年时表达急剧上升并达到最大。原位杂交结果表明，tesk1主要在半滑舌鳎精巢中的精子细胞和成熟精子中表达。因此我们推测，tesk1可能在精子形成阶段起作用。通过染色体原位杂交将该基因定位到了半滑舌鳎Z染色体上。通过Genome Walking获得了部分上游调控序列，通过分析发现了HSF、SRY、C/EBP、CRE-BP等转录因子结合位点。甲基化分析表明，该基因的表达水平与甲基化水平没有关系。2.克隆得到了半滑舌鳎neurl3全长cDNA序列和基因组序列。利用定量PCR检测了该基因的表达特征，结果表明：在半滑舌鳎各组织中，精巢的表达量最高；在孵化后116天，开始大量表达并达到最高。原位杂交结果表明，neurl3主要在半滑舌鳎精巢中的精子细胞和成熟精子中表达。染色体原位杂交结果表明，neurl3位于半滑舌鳎Z染色体上。成功构建了原核表达载体，通过IPTG诱导，能够表达出大小符合预期分子量的蛋白。3.获得了半滑舌鳎strbp的全长cDNA序列和基因组序列，利用Real-timePCR检测了半滑舌鳎strbp在转录水平的表达情况。发现该基因主要在成熟半滑舌鳎的性腺中表达（精巢和卵巢都有表达），虽然在脑和脾脏中也检测到了该基因的表达，但与性腺相比要低很多。原位杂交结果表明半滑舌鳎strbp主要在精子细胞变态开始形成精子的阶段大量表达，可能在这一时期发挥一定的作用。大菱鲆（Scophthalmus maximus）是从欧洲引进的优良海水养殖鱼类。频繁暴发的疾病严重影响了大菱鲆养殖产业的发展。使用药物能够减少疾病造成的损失，但药物不但使病原菌产生抗药性，更为重要的是，药物残留也会造成环境污染以及对人类健康造成威胁。因此，利用分子生物技术来提高养殖鱼类的抗病力势在必行。我们构建了大菱鲆脾脏和头肾cDNA文库，2个文库的库容分别达到2.26x106和1.45x106。通过测序共获得了3656条EST序列，经生物信息学分析，鉴定了149个新的大菱鲆基因，其中免疫抗病相关的基因45个，均首次在大菱鲆中被发现。
王浩[10]（2014）在《NESG1相互作用蛋白的筛选、验证及其功能机制的研究》文中研究指明研究背景和目的鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma）是发生于鼻咽粘膜上的恶性肿瘤,其发生是一个多阶段、多途径、多机制的过程。该疾病主要高发于我国南方省份、香港、台湾及东南亚一些国家和地区,具有明显的种族聚集性和地域性。 EBV感染、各种环境因素共同累积、遗传易感性及表观遗传学的改变最终导致了一些关键性的癌基因过表达及抑癌基因表达下调或缺失表达等,导致鼻咽粘膜产生病理性变化,在经过癌前病变后最终发生鼻咽癌并不断进展,最后由于肿瘤细胞发生转移而导致患者死亡。由于鼻咽癌发生非常复杂,涉及了多因素参与、多基因异常表达调控,多信号途径改变等,因此,完全弄清楚其具体发病的机理一直是一个亟待解决的难题,也成为了防治鼻咽癌和改善鼻咽癌预后的中心问题,需要众多学者们不断努力的探索和解决。原NESG1基因（Genbank AF094758）,官方名字叫CCDC19（NM012337.1）,是由本实验室姚院士指导的黎仲奎博士生在1999年利用mRNA差异显示法并结合3’-RACE和5’-RACE技术,扩增出来的长约1.4kb和0.7kb的片段（其中包含了一段174bp的重叠产物以确认扩增的特异性）,拼接后发现了一个连续的全长大约1850bp cDNA片段（由于当时人类基因组序列还没有公布以及测序技术水平的局限性,对于新克隆的序列完全正确与否很难判断）。进一步分析发现,NESG1基因位于1q22,预测编码框长1161bp,编码386个氨基酸,分子量为46252Da,蛋白质等电点为9.99,通过PSORT Ⅱ和SOSUI网上预测,发现它是可溶性核蛋白。BLAST比对发现,NESG1的cDNA序列与婴儿肺组织cDNA文库和Stratagene肺癌cDNA文库中的两个EST序列同源。通过对多种组织（包括鼻咽粘膜、食管、气管、膀胱、肝脏、大脑、心脏、肺脏、胸腺、肾脏、胃和大肠）进行Northern杂交显示,发现该基因特异性的表达于鼻咽和气管纤毛柱状上皮。在原NESG1基因克隆后,本课题组曾尝试着研究其功能,但一直未有进展。2005年下半年,我们对该基因原编码区重新进行了克隆并测序分析时发现,测序结果与原提呈的AF094758（NM012337.1）序列存在两处差异：CDS区第1181碱基由A替代了G,第905位点处由A碱基填补了原来的缺失突变,从而导致氨基酸编码框改变。新序列与人类基因组序列比对分析显示了完全的一致性。由于新序列1181碱基由A替代了G以及905位点A碱基的插入,导致NESG1基因的编码序列较前发生了变化。编码框重新预测,结果显示NESGl基因全长为1656bp,编码551个氨基酸。这与食蟹猴睾丸CDNA中克隆出的NESG1基因（AB168450）的编码框预测长度结果一致。向NCBI参考序列部提交修改申请后,Genbank数据库接收了修改意见,使其版本由最初的NM012337.1升级为NM012337.2。随后本课题组刘真博士对新校正抑癌候选基因NESG1在鼻咽癌中功能及分子机制进行了进一步的研究,发现NESG1基因极有可能在鼻咽癌中发挥抑癌基因的角色,介导了重要的抑制性信号转导通路。尽管NESG1与鼻咽癌发生发展的关系已经明确,但是NESG1参与的信号通路并不清楚。因此本研究我们选定NESG1基因的相互作用蛋白为研究对象,通过大量实验明确证实与NESG1相互作用的蛋白,重点探讨NESG1相互作用蛋白对鼻咽癌增殖、转移和侵袭的影响和作用机制,阐明NESG1相互作用蛋白在鼻咽癌发生发展中的生物学功能及其分子机制。最终希望能够揭示NESG1参与的信号通路,从而阐明NESG1蛋白及其相关的信号通路在鼻咽癌发生发展中的作用,并为鼻咽癌的早期诊断和治疗提供理论基础。方法：1.NESG1相互作用蛋白的预测与筛选（1）NESG1相互作用蛋白的生物信息学预测首先利用在线分析软件和数据库对NESG1可能的相互作用蛋白进行生物信息学预测,然后对NESG1及其可能的相互作用蛋白的进行分析。（2）酵母双杂交筛选NESG1相互作用蛋白克隆人NESGI基因CDS序列,构建pGBKT7-NESG1酵母表达载体,以NESG1蛋白为“诱饵蛋白”,筛选人正常组织CDNA文库,寻找NESG1相互作用蛋白。2.NESG,1相互作用蛋白的验证及其生物信息学分析运用基于蛋白质水平的免疫共沉淀和共定位分析等技术对酵母双杂交系统初步筛选的结果进行验证。（1）免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitat ion）分别构建带有MYC和HA蛋白表达标签的NESG1和VPS33B的真核表达载体,两种载体共转染HEK293A细胞,通过protein A/G-beads+Anti-MYC和protein A/G-beads+Anti-HA分别进行免疫复合物共沉淀,再以抗HA和抗MYC的抗体行Western blot检测，确定外源性的NESG1和VPS33B是否存在相互作用。（2）共定位分析构建真核表达载体PCMV-HA-VPS33B和PCMV-MYC-NESG1,将两种载体共转染HEK293A细胞。转染48h后,利用不同种属来源的抗MYC和抗HA抗体进行免疫荧光双标记,分别在正置荧光显微镜下观察外源性的NESG1和VPS33B在细胞体内是否存在共定位现象。（3）VPS33B的生物信息学分析利用在线分析软件和数据库对VPS33B蛋白的结构特点、表达特征及其可能的相互作用蛋白网络进行生物信息学的初步分析预测。3.VPS33B基因在鼻咽癌组织中的表达检测及其临床意义分析应用荧光定量PCR和免疫组化技术从mRNA和蛋白水平检测VPS33B在鼻咽癌组织和非鼻咽癌组织的表达,初步探讨VPS33B与鼻咽癌发生发展的关系。4.VPS33B基因在鼻咽癌中功能与分子机制的初步研究克隆人VPS33B基因CDS序列,构建含VPS33B的CDS慢病毒载体,将慢病毒载体质粒与辅助质粒共转染293FT细胞包装慢病毒,收集病毒上清,进行病毒滴度测定。用含VPS33B基因的慢病毒感染鼻咽癌细胞系5-8F和HONE-1,空载体的病毒作为阴性对照。流式细胞仪分选出GFP+细胞,Western blot检测各细胞株中VPS33B基因表达情况,以此做为下一步实验的研究对象。利用MTT法、平板克隆形成实验及流式细胞术检测VPS33B基因过表达后对细胞体外增殖的影响；利用Boyden小室进行体外侵袭实验,检测VPS33B基因过表达后对鼻咽癌癌侵袭能力的影响；在裸鼠体内观察VPS33B基因过表达后对鼻咽癌细胞致瘤能力的影响。利用Western blot检测VPS33B基因导入前后,与细胞周期进展相关的一些重要蛋白及其它重要信号通路蛋白的表达情况,初步探讨VPS33B基因抑制鼻咽癌发生发展的分子机制.化学合成靶向VPS33B的siRNA干扰片段,瞬时干扰过表达VPS33B基因的鼻咽癌细胞,荧光定量PCR和Western blot检测各干扰细胞中VPS33B基因干扰效率,以干扰效率最高的片段为下一步实验的研究对象。以通用型阴性片段作为阴性对照,利用MTT法、流式细胞术及Boyden小室侵袭实验等观察VPS33B表达抑制后细胞生长及侵袭能力的变化,进一步探讨VPS33B基因在鼻咽癌细胞中的基本功能。本课题所采用统计方法：采用GraphPad Prism5和SPSS16.0统计软件进行统计学处理和分析,计量资料用x±s表示。免疫组化组间的比较采用卡方检验,荧光定量比较鼻咽癌组织与非癌鼻咽组织样本之间VPS33B的表达水平用两独立样本t检验,如方差不齐,采用Welch值；细胞体外生长实验采用析因设计的方差分析；平板克隆形成实验、细胞周期检测、侵袭实验和裸鼠皮下成瘤实验采用独立样本t检验,如方差不齐,采用Welch值,组间的多重比较采用LSD检验。以P<0.05为差异有统计学意义。结果：1.NESG1相互作用蛋白的预测与筛选（1）NESG1相互作用蛋白的生物信息学分析利用在线数据库,发现人NESG1与果蝇CG11449-PA同源,进而发现果蝇CG11449-PA蛋白是GG1135-PA、CG1487-PA等15个蛋白间的重要交汇点。应用保守的蛋白间相互作用方法,初步预测人UBR4、ARRB1等6个蛋白为NESG1相互作用蛋白。（2）酵母双杂交筛选NESG1相互作用蛋白以NESG1蛋白为“诱饵蛋白”,筛选人正常组织CDNA文库,共获得九个与NESG1诱饵蛋白相互作用的阳性克隆,经过测序证实均为ENKUR、CCDC65、VPS33B、 RNF2、NUP155、TEX2、ZRANB1、SPATA22、GOSR1。2.NESG1相互作用蛋白的验证及其生物信息学分析（1）免疫共沉淀免疫共沉淀结果显示protein A/G-beads+Anti-MYC沉淀MYC-NESG1蛋白的同时,HA-VPS33B也一同被沉淀。而用protein A/G-beads+Anti-HA沉淀HA-VPS33B蛋白的同时,外源蛋白MYC-NESG1也一同被沉淀,实验说明外源性的NESG1和VPS33B在体内环境中存在相互作用关系。（2）共定位分析共转染外源性NESG1和VPS33B的表达,正置荧光显微镜下观察到的实验结果证实NESG1与VPS33B两种蛋白在细胞内确切存在相互作用。酵母双杂交的初步筛选,免疫共沉淀和共定位分析验证方法的实验结果最终明确证实NESG1蛋白与VPS33B蛋白之间存在直接相互作用。（3）VPS3B的生物信息学分析根据VPS33B的序列特征,初步证实VPS33B属于Sec-1结构域家族的一员。虚拟Northern杂交的结果发现VPS33B在在甲状腺和肺癌中表达较低。利用生物信息学对VPS33B相互作用蛋白的初步分析发现Ras癌基因家族成员RAB11A蛋白可能与VPS33B存在相互作用关系。3.VPS33B基因在鼻咽癌中的表达检测及其临床意义分析荧光定量PCR的检测结果发现VPS33B mRNA在鼻咽癌组织和非鼻咽癌组织的表达明显不同,差异具有显着性（t=-2.412，P=0.029）。免疫组化结果显示,VPS33B表达主要定位在细胞胞浆内,在鼻咽癌组织和非鼻咽癌组织的表达明显不同,差异具有显着性（x2=18.721,p<0.001）,结果与mRNA水平的检测结果具有一致性。VPS33B蛋白的表达与鼻咽癌患者的临床分期密切相关,临床分期越早,VPS33B表达越强；而临床分期越晚,VPS33B表达越弱或阴性。4.VPS33B基因在鼻咽癌中功能与分子机制的初步研究（1）利用慢病毒建立了稳定表达外源性VPS33B基因的鼻咽癌细胞株构建含有VPS33B的CDS慢病毒载体,包装慢病毒后,含VPS33B基因的慢病毒感染5-8F和HONE-1细胞株,流式细胞仪分选出GFP+细胞,建立了稳定表达外源性VPS33B的细胞株,Western blot技术检测各细胞的VPS33B的表达情况,做为下一步实验的研究对象。（2）VPS33B过表达在鼻咽癌中功能与分子机制的初步研究MTT法观察VPS33B基因过表达后体外细胞的增殖情况,与5-8F-NC和HONE-1-NC细胞相比,5-8F-VPS33B和HONE-1-VPS33B细胞的增殖速度明显减慢,并且呈时间依赖关系（5-8F:F=134.393,P<0.001:HONE.1:F:134.761,P<0.001）；平板克隆形成实验显示5-8F-VPS33B和HONE-1-VPS33B细胞的活力显着下降（5-8F:t=6.037,P=0.004；HONE-1:t=7.846,P:=0.001）；利用流式细胞术检测各组细胞的细胞周期的结果显示5-8F-VPS33B和HONE-1-VPS33B细胞G1期比率增多,S期比率减少,表明VPS33B过表达后细胞增殖缓慢（5-8F:t=5.695,P=0.005； HONE-1:t=054,P=0.015）；综合结果表明VPS33B表达水平升高后,肿瘤细胞体外生长被显着抑制。体外侵袭小室实验检测VPS33B基因过表达后细胞侵袭能力的改变,结果显示,与5-8F-NC’和HONE-1-NC细胞相比，5-8F-VPS33B和HONE-1-VPS33B细胞侵袭能力无显着变化（5-8F-VPS33B:t=0.263, P=0.805; HONE-1-VPS33B: t=0.697, P=0.524;均P>0.05）,说明VPS33B过表达后并没有抑制鼻咽癌细胞的体外侵袭能力。将VPS33B基因过表达的鼻咽癌细胞和对照细胞接种于裸鼠的皮下,通过2-3周连续的观察,我们发现VPS33B基因过表达后,显着性地抑制了鼻咽癌细胞的体内增殖能力。与5-8F-NC和HONE-1-NC细胞相比,5-8F-VPS33B和HONE-1-VPS33B细胞皮下成瘤重量（5-8F:t=5.695, P=0.005; HONE-1:t=6.520,P=0.003）和体积（5-8F:t=5.119, P=0.007; HONE-1:t=10.536, P<0.001）的生长速度显着减慢。运用Western blot技术检测VPS33B基因导入后与细胞周期相关的几个重要基因的表达,发现c-myc, CDK4, CCND1, CCDE1, p-Rb and E2F1表达下调,P16表达上调,而总的Rb表达不变。同时检测了PTEN, p-AKT, AKT, p-PI3K and PI3K的表达,发现PTEN, AKT and PI3K表达不变,p-AKT and p-PI3K的表达下调。最后我们检测了与EMT相关的几个重要调控因子的变化情况,发现E-cadherin、 N-cadherin和Vimentin表达不变。（3）抑制VPS33B表达对鼻咽癌细胞的生物学功能影响利用阳离子脂质体将化学合成siRNA转染至鼻咽癌细胞5-8F-VPS33B和HONE-1-VPS33B,荧光定量PCR和western blot检测沉默效果,结果显示,设计合成的3对siRNA序列中,03号干扰效果最佳,以其作为后续功能研究。采用MTT法观察对VPS33B基因沉默后5-8F-VPS33B和HONE-1-VPS33B细胞体外增殖能力变化,与5-8F/VPS33B/NC和HONE-1/VPS33B/NC细胞相比,5-8F/VPS33B/si-VPS33B和HONE-1/VPS33B/si-VPS33B细胞的增殖速度明显加快（5-8F：F=56.419,P<0.001; HONE-1:F=51.638, P＜0.001）.结论：1.NESG1蛋白与VPS33B蛋白在体内存在直接相互作用,NESG1-VPS33B相关信号途径参与了鼻咽癌的发生发展。2.VPS33B与鼻咽癌发生发展密切相关,是促进鼻咽癌增殖的重要基因。本研究的创新之处1.利用酵母双杂交系统结合基于蛋白质水平的免疫共沉淀和共定位分析方法,筛选并鉴定出鼻咽癌相关基因NESG1的新型相互作用蛋白VPS33B,提出NESG1-VPS33B相关信号途径参与鼻咽癌发生发展的设想,为研究鼻咽癌的信号通路机制提供新的思路；2.利用慢病毒载体建立了稳定的过表达VPS33B基因的鼻咽癌细胞株,为进一步阐明NESG1-VPS33B相关信号途径调节结鼻咽癌发生发展的机制提供新的实验手段；3.初步证实VPS33B与鼻咽癌的增殖密切相关,而与转移无关。
二、国人正常睾丸组织定向克隆表达cDNA文库的构建及意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、国人正常睾丸组织定向克隆表达cDNA文库的构建及意义（论文提纲范文）
（1）基于转录组学的藏绵羊睾丸功能基因鉴定及其表达调控（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Summary |
| 第一章 文献综述 |
| 1 睾丸的生物学功能概述 |
| 1.1 精子发生 |
| 1.2 睾丸支持细胞的生物学功能 |
| 1.3 免疫豁免特性 |
| 1.3.1 血-睾屏障 |
| 1.3.2 免疫抑制 |
| 2 非编码RNAs及其在雄性动物生殖系统中的研究进展 |
| 2.1 miRNAs及其在哺乳动物睾丸中的研究进展 |
| 2.2 CircRNAs及其在雄性动物生殖系统中的研究进展 |
| 3 转录组测序技术在哺乳动物生殖系统中的应用研究进展 |
| 4 研究目的及意义 |
| 第二章 不同发育期藏绵羊睾丸circRNA/miRNA/mRNA表达谱特征分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物及样品收集 |
| 1.2 试验仪器与试剂 |
| 1.2.1 试验仪器 |
| 1.2.2 试验试剂 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 组织形态学分析 |
| 1.3.2 总RNA提取及质检 |
| 1.3.3 cDNA文库和小RNA文库的构建及测序 |
| 1.3.4 数据质控及mRNA、circRNA、miRNA的鉴定 |
| 1.3.5 差异表达分析 |
| 1.3.6 功能富集分析 |
| 1.3.7 RT-qPCR验证 |
| 1.3.8 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同发育阶段藏绵羊睾丸组织形态学特征比较分析 |
| 2.2 mRNA、circRNA和miRNA测序数据概述 |
| 2.3 差异表达分析 |
| 2.3.1 差异表达mRNA分析 |
| 2.3.2 CircRNA表征及差异表达分析 |
| 2.3.3 差异表达miRNA分析 |
| 2.4 测序结果验证 |
| 2.4.1 mRNA测序结果验证 |
| 2.4.2 CircRNA测序结果验证 |
| 2.4.3 miRNA测序结果验证 |
| 2.5 功能注释与富集分析 |
| 2.5.1 差异表达mRNAs功能注释与富集分析 |
| 2.5.2 差异circRNAs来源基因功能注释与富集分析 |
| 2.5.3 差异circRNAs来源基因与差异mRNAs共享基因的功能富集分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 CircRNA-miRNA-mRNA整合分析及睾丸功能维持相关基因的ceRNA调控网络鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物及样品 |
| 1.2 试验仪器与试剂 |
| 1.2.1 主要试验仪器 |
| 1.2.2 试验试剂 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 CircRNA-miRNA-mRNA关联性分析 |
| 1.3.2 功能注释与富集分析 |
| 1.3.3 荧光素酶报告基因载体构建及鉴定 |
| 1.3.4 细胞转染及双荧光素酶活性检测 |
| 1.3.5 RT-qPCR检测 |
| 1.3.6 Western blot分析 |
| 1.3.7 组织免疫荧光染色(间接法) |
| 1.3.8 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 CircRNA/miRNA/mRNA关联性分析 |
| 2.2 ceRNA网络中mRNAs的功能富集分析 |
| 2.3 CircRNA-miRNA-mRNA网络构建 |
| 2.4 Circ_015256/circ_029155-miR-760-3p-BOLL靶向关系验证 |
| 2.5 Circ_029155/miR-760-3p/BOLL在睾丸中的表达特征 |
| 2.6 BOLL蛋白在绵羊睾丸中的表达与分布特征 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 睾丸免疫特权维持相关基因的鉴定及其ceRNA调控网络研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物及样品 |
| 1.2 试验仪器与试剂 |
| 1.2.1 主要试验仪器 |
| 1.2.2 试验试剂 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 免疫相关差异表达基因鉴定与筛选 |
| 1.3.2 免疫相关miRNA-mRNA对及ceRNA共表达网络构建 |
| 1.3.3 RT-qPCR分析 |
| 1.3.4 Western blot分析 |
| 1.3.5 免疫荧光染色 |
| 1.3.6 双荧光素酶报告试验 |
| 1.3.7 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 性成熟前、后睾丸差异基因功能分类 |
| 2.2 免疫相关基因鉴定及表达特征分析 |
| 2.3 免疫相关差异基因的RT-qPCR验证 |
| 2.4 免疫相关基因编码蛋白的表达与定位 |
| 2.5 免疫相关基因功能注释分析 |
| 2.6 免疫相关基因的miRNA-mRNA调控网络分析 |
| 2.7 免疫相关差异miRNAs的RT-qPCR验证 |
| 2.8 免疫相关基因的circRNA-miRNA-mRNA互作网络分析 |
| 2.9 免疫相关差异表达circRNAs的RT-qPCR验证 |
| 2.10 靶向关系验证 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 CircKLHL5靶向miR-29b/IGF1信号轴对绵羊睾丸支持细胞发育的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物及样品采集 |
| 1.2 试验仪器与试剂 |
| 1.2.1 试验仪器 |
| 1.2.2 试验试剂 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 藏绵羊睾丸支持细胞的体外分离与纯化 |
| 1.3.2 支持细胞纯度鉴定 |
| 1.3.3 载体构建、细胞培养与转染 |
| 1.3.4 支持细胞核质分离 |
| 1.3.5 CircHLHL5成环鉴定 |
| 1.3.6 CCK-8分析 |
| 1.3.7 EdU染色 |
| 1.3.8 RT-qPCR |
| 1.3.9 Western blot |
| 1.3.10 细胞免疫荧光染色(间接法) |
| 1.3.11 酪胺信号放大-荧光原位杂交(TSA-FISH) |
| 1.3.12 流式检测细胞凋亡 |
| 1.3.13 双荧光素报告基因检测 |
| 1.3.14 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 Circ_026259/miR-29b/IGF1轴的组织表达特征 |
| 2.2 绵羊睾丸支持细胞形态及免疫荧光鉴定 |
| 2.3 睾丸支持细胞中circKLHL5的鉴定 |
| 2.4 CircKLHL5转染效率检测 |
| 2.5 CircKLHL5可促进绵羊睾丸支持细胞增殖并抑制其凋亡 |
| 2.6 CircKLHL5与miR-29b靶向关系验证 |
| 2.7 Oar-miR-29b对睾丸支持细胞增殖和凋亡的影响 |
| 2.8 Oar-miR-29b与IGF1基因间靶向关系验证 |
| 2.9 IGF1转染效率检测 |
| 2.10 IGF1基因对支持细胞增殖和凋亡的影响 |
| 2.11 Oar-miR-29b可逆转circKLHL5对支持细胞表型的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第六章 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（2）鸡性别决定过程中SMAB2可变剪切体(SMAD2WΔ11)功能及其调控机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 鸡性别决定研究进展 |
| 1.1.1 鸡性别决定概述 |
| 1.1.2 鸡性别决定相关基因研究进展 |
| 1.1.3 激素参与鸡性别决定研究进展 |
| 1.1.4 鸡早期性别鉴定和控制技术研究进展 |
| 1.2 测序技术及其在鸡性别决定研究中的进展 |
| 1.2.1 测序技术简介 |
| 1.2.2 测序技术在鸡性别决定研究中的应用 |
| 1.3 可变剪切的研究进展 |
| 1.3.1 可变剪切研究概述 |
| 1.3.2 可变剪切参与性别决定研究进展 |
| 1.3.3 测序技术应用于可变剪切的研究 |
| 1.3.4 家鸡可变剪切的研究进展 |
| 1.4 本课题前期新发现 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第2章 鸡胚性别决定过程中雌雄性腺组织的多组学分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 |
| 2.1.4 鸡胚胎决定过程中的性腺组织收集和分离 |
| 2.1.5 转录组文库的构建与测序 |
| 2.1.6 组学数据的分析和验证 |
| 2.2 实验结果与分析 |
| 2.2.1 样品的收集和质检 |
| 2.2.2 二代转录组分析 |
| 2.2.3 三代全长转录组分析 |
| 2.2.4 联合分析显示性染色体同源基因SMAD2表达差异 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 鸡SMAD2全长(SMAD2_(FL))及SMAD2可变剪切体(SMAD2_(△11))在胚胎性别决定过程中的功能研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 主要仪器和设备 |
| 3.1.4 SMAD2可变剪切的鉴定与克隆 |
| 3.1.5 SMAD2可变剪切在不同组织中的的表达检测 |
| 3.1.6 SMAD2可变剪切体的功能验证 |
| 3.2 实验结果与分析 |
| 3.2.1 SMAD2可变剪切体的鉴定与克隆 |
| 3.2.2 SMAD2可变剪切体在不同组织中的表达 |
| 3.2.3 SMAD2可变剪切体外功能验证 |
| 3.2.4 SMAD2可变剪切体内功能验证 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 SMAD2_(△11)通过与CYP19A1结合激活胚胎雌性决定和分化通路 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 主要仪器和设备 |
| 4.1.4 基于His Pulldown技术筛选SMAD2和SMAD2_(△11)的互作蛋白 |
| 4.1.5 免疫共沉淀验证蛋白互作 |
| 4.1.6 CYP19A1在鸡胚胎性别决定过程中的功能 |
| 4.2 实验结果与分析 |
| 4.2.1 基于His Pulldown技术筛选SMAD2Z和SMAD2W_(△11)的互作蛋白 |
| 4.2.2 Co-IP验证SMAD2W_(△11)与CYP19A1的结合关系 |
| 4.2.3 CYP19A1在鸡胚胎性别决定过程中的功能 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 结论和创新点 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 论文有待改进之处及下一步计划 |
| 论文有待改进之处 |
| 下一步计划 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一: 附表 |
| 附录二: 附图 |
| 附录三: 氨基酸序列 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（3）精子相关抗原6（SPAG6）及其结合蛋白在调控精子发生中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写对照表 |
| 前言 |
| 第1章 材料与方法 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 小鼠睾丸组织的形态学观察 |
| 1.2.1 小鼠睾丸组织的包埋切片 |
| 1.2.2 H&E染色观察小鼠睾丸组织的形态结构 |
| 1.3 直接酵母双杂交实验验证SPAG6与多种蛋白间的相互作用 |
| 1.3.1 实验蛋白的筛选及质粒构建 |
| 1.3.2 将混合质粒转化入酵母感受态细胞 |
| 1.4 直接酵母双杂交实验验证SPAG6与Snapin的作用区域 |
| 1.4.1 SPAG6五段质粒的构建 |
| 1.4.2 将混合质粒转化入酵母感受态细胞 |
| 1.5 细胞内共定位实验验证SPAG6与Snapin、COPS5、TCTE3 之间的相互作用 |
| 1.5.1 重组质粒转染入CHO细胞 |
| 1.5.2 CHO细胞的免疫荧光染色 |
| 1.6 免疫共沉淀实验验证SPAG6与Snapin、COPS5 以及TCTE3 之间的相互作用 |
| 1.6.1 小鼠睾丸组织总RNA的提取 |
| 1.6.2 质粒构建及细胞转染 |
| 1.6.3 免疫共沉淀实验验证蛋白间的相互作用 |
| 1.7 Western blotting检测小鼠睾丸组织总蛋白及酵母融合蛋白中SPAG6、Snapin、COPS5 等蛋白的表达 |
| 1.7.1 小鼠睾丸组织总蛋白的提取和测定 |
| 1.7.2 小鼠睾丸组织中SPAG6、Snapin、COPS5及SPAG16L的表达 |
| 1.7.3 酵母融合蛋白的提取及表达 |
| 1.8 免疫荧光染色观察SPAG6、Snapin、SPAG16L在生精细胞中的定位 |
| 1.8.1 小鼠生精细胞的分离 |
| 1.8.2 生精细胞免疫荧光染色 |
| 1.9 免疫荧光染色观察Spag6 基因敲除小鼠和野生型小鼠睾丸中SPAG6 的定位 |
| 1.10 统计学处理 |
| 第2章 结果 |
| 2.1 SPAG6在不同发育阶段生精细胞中的定位 |
| 2.2 在精子发生过程中,Spag6基因敲除小鼠的睾丸组织出现形态学缺陷 |
| 2.3 酵母双杂交实验证实,伴侣蛋白SPAG6有多种结合蛋白 |
| 2.4 酵母双杂交实验验证SPAG6与Snapin的结合部位 |
| 2.5 在体细胞中验证SPAG6和Snapin蛋白间的相互作用 |
| 2.6 Snapin蛋白在野生型小鼠雄性生殖细胞的表达和定位 |
| 2.7 体外实验验证SPAG6与COPS5、TCTE3 也存在相互作用 |
| 2.8 Snapin和 COPS5在Spag6 基因敲除小鼠睾丸中的表达 |
| 2.9 SPAG16L在精子领上的定位依赖于SPAG6 的表达 |
| 第3章 讨论 |
| 第4章 结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录1 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 附录2 攻读硕士学位期间参加的科研项目 |
（4）犏牛精子发生阻滞相关lncRNA的鉴定与功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 犏牛的基本概况及其雄性不育研究现状 |
| 1.1.1 犏牛的基本概况 |
| 1.1.2 犏牛雄性不育的研究现状 |
| 1.2 长链非编码RNA的概述及其与精子发生 |
| 1.2.1 LncRNA的生物学功能 |
| 1.2.2 LncRNA与哺乳动物精子发生 |
| 1.3 犏牛雄性不育研究的目的和意义 |
| 第二章 犏牛和牦牛睾丸组织中差异表达lncRNA分析 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 动物样品的采集 |
| 2.1.2 试验试剂 |
| 2.1.3 试验主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 转录组测序 |
| 2.2.2 RNA提取及质检 |
| 2.2.3 cDNA文库构建 |
| 2.2.4 数据分析 |
| 2.2.5 差异表达lncRNAs及其靶基因的表达验证分析 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 测序数据预处理 |
| 2.3.2 基因组比对分析 |
| 2.3.3 表达相关性分析 |
| 2.3.4 犏牛和牦牛睾丸lncRNA的测序分析 |
| 2.3.5 差异表达lncRNAs靶基因的GO富集分析 |
| 2.3.6 差异表达lncRNAs靶基因的KEGG富集分析 |
| 2.3.7 差异表达lncRNAs及其靶基因的表达鉴定 |
| 2.3.8 LncRNAs和 mRNAs的表达比较 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 LncRNA测序方法的选择 |
| 2.4.2 转录组测序的整体评估 |
| 2.4.3 lncRNA和其靶基因的筛选与比较 |
| 2.4.4 差异表达lncRNA靶基因的GO与 KEGG富集分析 |
| 2.4.5 差异lncRNA与靶基因表达的验证分析 |
| 2.4.6 LncRNA靶基因的下调表达对有丝分裂的影响 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 差异表达LncRNANONBT-258 的克隆分析 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 动物样品的采集 |
| 3.1.2 试验试剂 |
| 3.1.3 试验主要仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 牦牛和犏牛睾丸组织RNA的制备 |
| 3.2.2 长链非编码RNA lncRNANONBT-258 的扩增 |
| 3.2.3 PCR产物的胶回收纯化 |
| 3.2.4 T载体连接和细胞转化 |
| 3.2.5 蓝白斑筛选重组质粒 |
| 3.2.6 重组质粒的提取 |
| 3.2.7 DNA测序 |
| 3.2.8 LncRNANONBT-258 编码潜力预测及与靶基因BRCA1 的互作分析 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 犏牛和牦牛睾丸组织RNA的提取 |
| 3.3.2 LncRNANONBT-258 的克隆和载体构建 |
| 3.3.3 测序序列比对 |
| 3.3.4 LncRNANONBT-258 生信分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 阳性克隆的筛选 |
| 3.4.2 LncRNANONBT-258 序列的比较分析 |
| 3.4.3 LncRNANONBT-258 编码能力的预测和分析 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 犏牛和牦牛生精细胞的分离与细胞转染 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 动物样品的采集 |
| 4.1.2 试验试剂 |
| 4.1.3 试验主要仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 牦牛与犏牛生精细胞的分离与鉴定 |
| 4.2.2 细胞转染和lncRNANONBT-258 表达分析 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 生精细胞的鉴定和差异基因的表达验证 |
| 4.3.2 细胞转染后lncRNANONBT-258 及其靶基因BRCA1 的表达分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 生精细胞分离方法的选择 |
| 4.4.2 生精细胞标记基因的表达分析 |
| 4.4.3 生精细胞的siRNA转染分析 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
（5）多芯片联合解析ZCCHC13和PLCXD3基因在无精症、肝细胞癌中的表观遗传调控机理（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词及中英文对照表 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 无精症的分类 |
| 1.1.1 精子生成 |
| 1.1.2 OA的病因,诊断和治疗 |
| 1.1.3 NOA的病因,诊断和治疗 |
| 1.2 精子生成和癌症的关系 |
| 1.2.1 癌睾抗原的发现 |
| 1.2.2 癌睾抗原的表达 |
| 1.3 表观遗传学在疾病中作用 |
| 1.3.1 DNA甲基化 |
| 1.3.2 miRNA |
| 1.3.3 组蛋白修饰 |
| 1.4 立项背景 |
| 第2章 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂药品和仪器设备 |
| 2.1.1 主要试剂药品 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.2 病人样本收集 |
| 2.3 组织学实验方法 |
| 2.4 高通量芯片实验方法 |
| 2.5 分子生物学实验方法 |
| 2.6 细胞生物学实验方法 |
| 第3章 miRNA表达谱和基因表达谱联合分析方法的建立 |
| 3.1 实验结果 |
| 3.1.1 总RNA提取和检测 |
| 3.1.2 miRNA表达谱芯片结果和PCR验证 |
| 3.1.3 基因表达谱芯片结果和PCR验证 |
| 3.1.4 联合分析miRNA表达谱和基因表达谱的数据 |
| 3.2 结果讨论 |
| 第4章 miRNA-靶基因验证 |
| 4.1 实验结果 |
| 4.1.1 miR-34c-3p抑制PLCXD3基因的mRNA和蛋白表达 |
| 4.1.2 miR-369-3p抑制ZCCHC13基因的mRNA和蛋白表达 |
| 4.2 结果讨论 |
| 第5章 DNA甲基化和基因表达谱联合分析方法的建立 |
| 5.1 实验结果 |
| 5.1.1 基因甲基化芯片结果 |
| 5.1.2 联合分析DNA甲基化和基因表达谱的数据 |
| 5.2 结果讨论 |
| 第6章 ZCCHC13基因甲基化修饰与NOA病理机制的相关性研究 |
| 6.1 实验结果 |
| 6.1.1 ZCCHC13基因高甲基化抑制蛋白表达 |
| 6.1.2 ZCCHC13调控AKT/ERK/c-MYC信号通路 |
| 6.1.3 甲基化失调抑制生殖细胞的增殖 |
| 6.2 结果讨论 |
| 第7章 肝癌组织ZCCHC13基因低甲基化上调蛋白表达 |
| 7.1 实验结果 |
| 7.1.1 肝癌组织和细胞高表达ZCCHC13蛋白 |
| 7.1.2 ZCCHC13重组蛋白表达、纯化及ZCCHC13抗体的检测 |
| 7.1.3 肝癌组织和细胞ZCCHC13基因呈低甲基化修饰 |
| 7.1.4 肝癌细胞ZCCHC13基因去甲基化上调mRNA和蛋白表达 |
| 7.1.5 ZCCHC13蛋白过表达促进肝癌细胞生长 |
| 7.2 结果讨论 |
| 全文总结 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 发表论文及学术成果 |
| 项目支持 |
（6）大白猪出生前后肝脏组织microRNA和mRNA深度测序分析及IGF-1基因差异表达调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表(Abbreviations) |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 MiRNA的研究进展 |
| 1 MiRNA的生物合成及作用机制 |
| 1.1 MiRNA的发现及生物合成 |
| 1.2 MiRNA的功能及作用机制 |
| 1.3 MiRNA靶基因的预测及鉴定 |
| 2 MiRNA的检测技术 |
| 2.1 基因克隆 |
| 2.2 Northern blotting |
| 2.3 实时荧光定量PCR (qRT-PCR) |
| 2.4 基因芯片法 |
| 2.5 高通量测序 |
| 3 MiRNA与肝脏脂肪代谢 |
| 3.1 miRNAs对脂代谢过程中相关转录因子的调控 |
| 3.2 miRNAs对脂生成过程中相关酶的调控 |
| 3.3 miRNAs对脂氧化过程中相关酶的调控 |
| 第二章 转录组学的研究进展 |
| 1 转录组研究的概述 |
| 2 转录组研究的意义 |
| 3 转录组测序技术在猪上的应用 |
| 3.1 转录组技术在猪肌肉研究上的应用 |
| 3.2 转录组技术在猪脂肪研究上的应用 |
| 3.3 转录组技术在猪肝脏研究上的应用 |
| 4 MiRNA和mRNA的整合分析 |
| 第三章 IGF1基因的研究进展 |
| 1 IGF1基因的发现及作用机制 |
| 2 IGF1的基因结构、定位及可变剪切 |
| 3 IGF1对动物生长发育的调节及其在肝脏中表达模式的变化 |
| 4 IGF1基因的表达调控 |
| 4.1 转录因子对IGF1表达的调控 |
| 4.2 表观遗传对IGF1表达的调控 |
| 第二篇 试验部分 |
| 第四章 RNA-seq鉴定分析大白猪不同发育期肝脏miRNA |
| 1 引言 |
| 2 试验材料 |
| 2.1 试验动物和样品采集 |
| 2.2 试验主要仪器设备 |
| 2.3 试验主要试剂及配制 |
| 2.4 试验主要数据库及分子生物学分析软件 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 总RNA的提取及质量检测 |
| 3.2 miRNA文库构建、检测及测序 |
| 3.3 原始测序数据的过滤、基因组比对及miRNA分类注释 |
| 3.4 差异表达miRNA的筛选及其靶基因预测 |
| 3.5 差异表达miRNA靶基因GO和KEGG分析 |
| 3.6 qRT-PCR验证测序结果 |
| 4 技术路线 |
| 5 结果与分析 |
| 5.1 总的RNA质量检测 |
| 5.2 测序原始数据的整体评价 |
| 5.3 miRNA的分类注释及新的miRNA的鉴定 |
| 5.4 差异表达miRNA的筛选及靶基因预测 |
| 5.5 GO和KEGG富集分析 |
| 5.6 差异表达miRNA的qRT-PCR验证结果 |
| 6 讨论 |
| 6.1 测序平台的选择、测序质量的评估及测序结果的验证 |
| 6.2 差异表达miRNA的筛选及靶基因预测 |
| 6.3 差异miRNA靶基因的GO、KEGG富集分析 |
| 第五章 RNA-seq鉴定分析大白猪不同发育期肝脏mRNA |
| 1 引言 |
| 2 试验材料 |
| 2.1 试验动物和样品采集 |
| 2.2 试验主要仪器设备 |
| 2.3 试验主要试剂及配制 |
| 2.4 试验主要数据库及分子生物学分析软件 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 总RNA的提取及质量检测 |
| 3.2 cDNA文库的构建及测序 |
| 3.3 测序原始数据的过滤、比对及组装 |
| 3.4 保守、新转录本及可变剪切体的鉴定 |
| 3.5 转录本表达水平的确定 |
| 3.6 差异表达转录本的鉴定及其GO和KEGG富集分析 |
| 3.7 PPI(protein-protein-interaction)相互作用网络分析 |
| 3.8 qRT-PCR验证转录本测序结果 |
| 3.9 差异表达的转录本及小RNA的联合分析 |
| 4 技术路线 |
| 5 结果与分析 |
| 5.1 总RNA的提取及质量检测 |
| 5.2 原始测序数据的质量评估及过滤 |
| 5.3 测序数据的比对分析 |
| 5.4 已知、新转录本及可变剪切体的鉴定与分析 |
| 5.5 差异表达转录本分析 |
| 5.6 GO及KEGG功能富集分析 |
| 5.8 PPI蛋白网络互作分析 |
| 5.9 差异表达转录本的荧光定量PCR验证结果 |
| 5.10 差异miRNA及mRNA的联合分析 |
| 6 讨论 |
| 6.1 测序质量的评估 |
| 6.2 差异转录本的分析 |
| 第六章 肝脏IGF1的表达调控研究 |
| 1 引言 |
| 2 试验材料与方法 |
| 2.1 试验动物和样本采集 |
| 2.2 试验主要仪器设备 |
| 2.3 试验主要试剂 |
| 2.4 试验主要数据库及分子生物学软件 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 组织DNA及RNA的提取 |
| 3.2 实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析各基因在不同时期表达模式变化 |
| 3.3 载体的构建 |
| 3.4 293T细胞的培养及质粒的转染 |
| 3.5 双荧光素酶活性的检测 |
| 3.6 甲基化分析 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 出生前后肝脏组织IGF1、C/EBP家族成员的表达模式 |
| 4.2 IGF1启动子区转录因子的预测 |
| 4.3 启动子区双荧光素酶活性检测 |
| 4.4 出生前后肝脏组织IGF1不同型启动子区甲基化模式 |
| 4.5 靶向调控IGF1基因表达的miRNA鉴定 |
| 4.6 出生前后肝脏组织C/EBPβ潜在转录因子的表达模式 |
| 5 讨论 |
| 5.1 DNA甲基化水平对基因表达的影响 |
| 5.2 IGF1在大白猪肝脏不同发育期的表达差异及C/EBPβ对其的调控 |
| 5.3 miRNA对IGF1的表达调控 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 本文创新点与有待进一步解决的问题 |
| 致谢 |
（7）利用酵母双杂交筛选与IFT20发生相互作用的蛋白研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第1章 材料与实验器材 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验主要仪器 |
| 1.3 实验溶液配置方法 |
| 1.3.1 LB培养液 |
| 1.3.2 LB固体培养基 |
| 1.3.3 SD选择性培养基 |
| 1.3.4 0.5 ×、1×、2×YPDA培养液 |
| 1.3.5 YPDA固体培养基 |
| 1.3.6 RIPA裂解液 |
| 1.3.7 转膜缓冲液 |
| 第2章 方法 |
| 2.1 Western BLOT观察IFT20 在小鼠各组织中的表达 |
| 2.1.1 小鼠脑、肺、肾、肝、脾、睾丸组织蛋白提取 |
| 2.1.2 BCA法测定组织中蛋白浓度 |
| 2.1.3 Western Blot观察IFT20 在雄性小鼠各组织及不同发育时期睾丸组织中的表达 |
| 2.2 IFT20在小鼠睾丸及分离的生精细胞中的定位 |
| 2.2.1 小鼠睾丸组织免疫染色切片制作 |
| 2.2.2 小鼠生精细胞免疫染色制作 |
| 2.3 扩增Ift20 cDNA的引物设计 |
| 2.4 小鼠睾丸组织总RNA的提取及cDNA的合成 |
| 2.4.1 小鼠睾丸组织总RNA提取 |
| 2.4.2 各组织RNA逆转录成cDNA |
| 2.5 Ift20 CDS区的PCR扩增 |
| 2.5.1 聚合酶链式反应(Polumerase Chain Reaction,PCR) |
| 2.5.2 PCR产物凝胶电泳鉴定 |
| 2.6 PCR产物纯化 |
| 2.7 Ift20的TA克隆及连接产物转化DH5α感受态细胞 |
| 2.7.1 Ift20的TA克隆 |
| 2.7.2 Ift20/pClone007 连接产物转化感受态细胞 |
| 2.8 DNA质粒小提 |
| 2.9 Ift20/pClone007 重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.10 Ift20/pGBKT7 重组质粒的构建 |
| 2.10.1 Ift20/pClone007 重组质粒与pGBKT7 载体的双酶切 |
| 2.10.2 Ift20与pGBKT7 酶切产物的重组连接 |
| 2.11 Ift20/pGBKT7 连接产物的酶切鉴定 |
| 2.12 酵母双杂交实验 |
| 2.12.1 制备AH109酵母感受态细胞 |
| 2.12.2 以IFT20 为诱饵,采用Yeast Mating方法对小鼠的cDNA文库进行双杂交筛选 |
| 2.12.3 酵母筛选单克隆菌落的酵母质粒小提 |
| 2.12.4 酵母转化试验验证IFT20与SNAPIN的直接相互作用 |
| 2.13 SNAPIN在小鼠睾丸中的表达与生精细胞中的定位 |
| 2.14 CHO细胞和COS-1 细胞的培养 |
| 2.15 质粒转染CHO细胞 |
| 2.15.1 将Snapin/Flag、Ift20/pEGFP-N_2以及Ift20/pEGFP-N2+Snapin/Flag分别转染至CHO细胞 |
| 2.15.2 转染Ift20/pEGFP-N_2的CHO细胞免疫荧光染色 |
| 2.15.3 转染Snapin/Flag、Ift20/pEGFP-N_2+Snapin/Flag的 CHO细胞免疫荧光染色 |
| 2.16 Snapin/Flag与 Ift20/pEGFP-N_2 的免疫共沉淀 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 小鼠体内IFT20蛋白表达情况 |
| 3.2 NCBI搜索的Ift20 序列全长 |
| 3.3 Ift20引物设计 |
| 3.4 PCR扩增Ift20 的琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.5 双酶切鉴定Ift20/pClone007 连接成功 |
| 3.6 Ift20质粒测序结果 |
| 3.7 Ift20/pClone007 重组质粒与pGBKT7 载体的双酶切 |
| 3.8 双酶切鉴定Ift20/pGBKT7 重组质粒构建成功 |
| 3.9 小鼠cDNA文库筛选酵母质粒测序结果 |
| 3.10 酵母转化试验表明IFT20与SNAPIN可发生直接相互作用 |
| 3.11 SNAPIN蛋白在雄性生精细胞中的表达和定位 |
| 3.12 IFT20和SNAPIN蛋白共定位于CHO细胞的囊泡 |
| 3.13 IFT20和SNAPIN可能存在于同一复合物中 |
| 第4章 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 纤毛内IFT与荷载蛋白的相互作用及蛋白转运 |
| 参考文献 |
| 附录1 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 附录2 攻读硕士学位期间参与的科研项目 |
（8）Hnrnpk及Dnmts在哺乳动物雄性生殖细胞发育过程中的表达及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 哺乳动物雄性生殖生物学研究概况 |
| 1.1.1 睾丸组织结构及功能 |
| 1.1.2 精子发生与生精上皮周期 |
| 1.1.3 雄性生殖细胞发育 |
| 1.1.4 精原干细胞 |
| 1.2 Hnrnpk基因结构及功能研究概况 |
| 1.2.1 Hnrnpk蛋白结构 |
| 1.2.2 Hnrnpk的表达及调控 |
| 1.2.3 Hnrnpk的翻译后修饰 |
| 1.2.4 Hnrnpk的生物学功能 |
| 1.2.5 Hnrnpk与生殖发育 |
| 1.2.6 展望 |
| 1.3 精子发生过程中DNA甲基化的研究概况 |
| 1.3.1 精子发生过程中DNA甲基化酶的研究概况 |
| 1.3.2 精子发生过程中DNA甲基化酶调控的研究概况 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 第二章 Hnrnpk基因的克隆及表达研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 主要实验仪器 |
| 2.2.3 主要化学药品及试剂 |
| 2.2.4 主要溶液配方 |
| 2.2.5 猪Hnrnpk基因的克隆 |
| 2.2.6 实时荧光定量PCR |
| 2.2.7 Western blotting分析 |
| 2.2.8 免疫组织荧光分析 |
| 2.2.9 载体构建 |
| 2.2.10 细胞培养 |
| 2.2.11 质粒转染 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 总RNA的提取和检测结果 |
| 2.3.2 猪Hnrnpk基因的克隆和序列分析 |
| 2.3.3 猪Hnrnpk基因及其缺失体的亚细胞定位 |
| 2.3.4 猪Hnrnpk基因的时空表达分析 |
| 2.3.5 Hnrnpk在不同发育阶段猪睾丸组织中的表达及定位 |
| 2.3.6 Hnrnpk在不同发育阶段大鼠睾丸组织中的表达及定位 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 Hnrnpk基因对小鼠精原细胞增殖与生存的调节作用 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 主要方法 |
| 3.2.3 转录组测序 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 Hnrnpk在GC-1spg和C18-4 中的表达 |
| 3.3.2 siRNA- Hnrnpk干扰效率检测 |
| 3.3.3 siRNA-Hnrnpk干扰后对GC-1spg细胞表型的影响 |
| 3.3.4 siRNA- Hnrnpk干扰后对GC-1spg细胞增殖影响 |
| 3.3.5 siRNA- Hnrnpk干扰后对GC-1spg细胞凋亡的影响 |
| 3.3.6 siRNA- Hnrnpk干扰后细胞增殖分化凋亡相关基因检测 |
| 3.3.7 转录组测序 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 雄性大鼠睾丸发育过程中Dnmts的表达研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 主要溶液配方 |
| 4.2.3 miRNA29 inhibitor及探针合成 |
| 4.2.4 主要方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 Dnmts在大鼠不同发育时期睾丸组织中mRNA水平的表达 |
| 4.3.2 Dnmts在大鼠不同发育时期睾丸组织中蛋白水平的表达 |
| 4.3.3 免疫组化检测Dnmts在不同发育时期大鼠睾丸组织中的表达 |
| 4.3.4 miR29 在不同发育时期大鼠睾丸组织中的表达 |
| 4.3.5 miRNA29 inhibitor转染GC-1spg细胞 |
| 4.4 讨论 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 下一步研究工作 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）半滑舌鳎精子发生相关基因的研究及大菱鲆免疫相关EST的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前沿综述 |
| 1.性别决定和性别分化 |
| 1.1 性染色体和性别决定系统 |
| 1.2 性别决定基因 |
| 1.2.1 两栖动物的性别决定基因 |
| 1.2.2 鸟类的性别决定基因 |
| 1.2.3 哺乳动物的性别决定基因 |
| 1.2.4 鱼类的性别决定基因 |
| 1.3 环境性别决 |
| 1.3.1 温度对鱼类性别分化的影响 |
| 1.3.2 外源激素对鱼类性别分化的影响 |
| 1.4 性逆转 |
| 2.精子发生 |
| 2.1 精子发生 |
| 2.2 鱼类的精子发生 |
| 2.2.1 鱼类的精巢结构 |
| 2.2.2 鱼类的精巢发育 |
| 2.2.3 鱼类精子发生的特点 |
| 3.精子发生相关基因 |
| 3.1 转录因子基因 |
| 3.1.1 cAMP 应答元件结合蛋白 |
| 3.1.2 cAMP 应答元件调节因子 |
| 3.1.3 TATA 结合蛋白及 TBP 相似因子 |
| 3.1.4 OVOL1 |
| 3.1.5 SOX |
| 3.1.6 DMRT1 |
| 3.1.7 HOX |
| 3.1.8 锌指蛋白 |
| 3.2 细胞周期蛋白基因 |
| 3.3 原癌基因 |
| 3.4 细胞凋亡相关基因 |
| 3.5 热休克蛋白基因 |
| 3.6 生殖细胞特异基因与 DNA 甲基化 |
| 3.7 DNA 甲基转移酶基因 |
| 第二章 半滑舌鳎精子发生相关基因的研究 |
| 1.前言 |
| 1.1 半滑舌鳎是研究鱼类性别决定机制的理想模型 |
| 1.2 半滑舌鳎性别决定和分化机制的研究现状和存在的问题 |
| 1.3 本研究的目的意义 |
| 2.样品制备与实验方法 |
| 2.1 不同基因型半滑舌鳎个体的获得 |
| 2.2 实验材料的收集 |
| 2.3 生理性别和遗传性别的鉴定 |
| 2.3.1 生理性别的鉴定 |
| 2.3.2 遗传性别的鉴定 |
| 2.4 半滑舌鳎总 RNA 的提取和第一链 cDNA 的合称 |
| 2.4.1 总 RNA 的提取 |
| 2.4.2 cDNA 的合成 |
| 2.5 实时定量 PCR（Real-time PCR） |
| 2.6 基因组 walking |
| 2.7 PCR 产物的克隆与测序 |
| 2.8 原位杂交（In situ hybridization，ISH） |
| 2.8.1 合成 RNA 探针 |
| 2.8.2 预杂交 |
| 2.8.3 切片原位杂交 |
| 2.9 染色体荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH） |
| 2.9.1 染色体的制备 |
| 2.9.2 阳性 BAC 克隆质粒的制备 |
| 2.9.3 Cot-1 DNA 的制备 |
| 2.9.4 探针的制备及变性 |
| 2.9.5 标本变性及杂交 |
| 2.10 甲基化位点预测与甲基化分析 |
| 3.半滑舌鳎 tesk1 基因的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 tesk1 全长 cDNA 的克隆 |
| 3.2.2 tesk1 基因组 DNA 序列的扩增 |
| 3.2.3 Real-time PCR 检测 tesk1 的表达情况 |
| 3.2.4 原位杂交 |
| 3.2.5 染色体荧光原位杂交 |
| 3.2.6 基因组 walking 扩增 tesk1 启动子区域及启动子的分析 |
| 3.2.7 甲基化检测与分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 半滑舌鳎 tesk1 全长 cDNA 序列及基因组 DNA 序列的分析 |
| 3.3.2 tesk1 多重序列比对及多基因分析 |
| 3.3.3 tesk1 在半滑舌鳎不同组织中的表达分析 |
| 3.3.4 tesk1 在半滑舌鳎性腺不同发育时期的表达分析 |
| 3.3.5 tesk1 在不同基因型半滑舌鳎性腺中的表达分析 |
| 3.3.6 原位杂交结果与 tesk1 在半滑舌鳎性腺中的细胞定位 |
| 3.3.7 tesk1 的染色体定位 |
| 3.3.8 tesk1 上游调控序列分析 |
| 3.3.9 甲基化分析 |
| 3.4 讨论 |
| 4.半滑舌鳎 neurl3 基因的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 neurl3 全长 cDNA 的克隆和基因组 DNA 序列的扩增 |
| 4.2.2 Real-time PCR 检测 neurl3 的表达情况 |
| 4.2.3 原位杂交及染色体荧光原位杂交 |
| 4.2.4 原核表达的初步研究 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 半滑舌鳎 nuerl3 全长 cDNA 序列及基因组 DNA 序列的分析 |
| 4.3.2 nuerl3 在半滑舌鳎不同组织中的表达分析 |
| 4.3.3 nuerl3 在半滑舌鳎性腺不同发育时期的表达分析 |
| 4.3.4 原位杂交结果与 neurl3 在半滑舌鳎性腺中的细胞定位 |
| 4.3.5 nuerl3 的染色体定位 |
| 4.3.6 半滑舌鳎 Neurl3 原核表达初步研究 |
| 4.4 讨论 |
| 5.半滑舌鳎 strbp 基因的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 半滑舌鳎 strbp 全长 cDNA 序列及基因组 DNA 序列的分析 |
| 5.2.2 Real-time PCR 检测 strbp 的表达情况 |
| 5.2.3 原位杂交 |
| 5.2.4 基因组 walking 扩增 strbp 启动子区域 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 半滑舌鳎 strbp 全长 cDNA 序列及基因组 DNA 序列的分析 |
| 5.3.2 strbp 在半滑舌鳎不同组织中的表达分析 |
| 5.3.3 strbp 在半滑舌鳎性腺不同发育时期的表达分析 |
| 5.3.4 strbp 在半滑舌鳎性腺中的细胞定位 |
| 5.3.5 strbp 上游调控序列的分析 |
| 5.4 讨论 |
| 第三章 大菱鲆脾脏、头肾 cDNA 文库的构建，EST 测序及免疫相关基因的筛选 |
| 1.前言 |
| 1.1 鱼的免疫 |
| 1.1.1 鱼类的免疫组织和器官 |
| 1.1.2 鱼类的免疫细胞 |
| 1.1.3 鱼类的体液免疫 |
| 1.2 表达序列标签（EST）及其应用 |
| 1.3 本研究的目的意义 |
| 2.大菱鲆脾脏、头肾 cDNA 文库的构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 大菱鲆头肾、脾脏总 RNA 的提取 |
| 2.1.2 mRNA 的分离 |
| 2.1.3 逆转录合成双链 cDNA |
| 2.1.4 双链 cDNA 末端补平及加 EcoR I 接头 |
| 2.1.5 双链 cDNA 末端的磷酸化及 Xho I 酶切 |
| 2.1.6 双链 cDNA 和载体的连接 |
| 2.1.7 电转化 |
| 2.1.8 cDNA 文库库容量的估算及文库扩增 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 总 RNA 和 mRNA 质量的检测 |
| 2.2.2 第一链和双链 cDNA 的合成 |
| 2.2.3 插入片段大小的检测 |
| 2.2.4 库容量的估算 |
| 2.3 讨论 |
| 3.EST 测序及免疫相关基因的筛选 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 EST 测序 |
| 3.1.2 EST 序列分析及基因注释 |
| 3.1.3 免疫抗病相关基因的筛选 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 序列测定 |
| 3.2.2 EST 序列分析及免疫抗病相关基因的筛选 |
| 3.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 学习期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（10）NESG1相互作用蛋白的筛选、验证及其功能机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 前言 |
| 一.NESG1基因的研究进展 |
| 二.蛋白相互作用研宄技术 |
| 三.本课题研宄思路 |
| 四.参考文献 |
| 五.技术路线 |
| 第一章 NESG1相互作用蛋白的预测与筛选 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 NESG1相互作用蛋白的验证及其生物信息学分析 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 VPS33B在鼻咽癌组织中的表达检测及其临床意义分析 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 VPS33B基因在鼻咽癌中功能与分子机制的初步研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 中英文缩略词表 |
| 博士期间发表论文 |
| 致谢 |
| 统计学证明 |
四、国人正常睾丸组织定向克隆表达cDNA文库的构建及意义（论文参考文献）
- [1]基于转录组学的藏绵羊睾丸功能基因鉴定及其表达调控[D]. 李讨讨. 甘肃农业大学, 2021(01)
- [2]鸡性别决定过程中SMAB2可变剪切体(SMAD2WΔ11)功能及其调控机制的研究[D]. 靳锴. 扬州大学, 2021
- [3]精子相关抗原6（SPAG6）及其结合蛋白在调控精子发生中的作用[D]. 袁硕. 武汉科技大学, 2020
- [4]犏牛精子发生阻滞相关lncRNA的鉴定与功能分析[D]. 伍仕鑫. 西南科技大学, 2019(12)
- [5]多芯片联合解析ZCCHC13和PLCXD3基因在无精症、肝细胞癌中的表观遗传调控机理[D]. 李志明. 厦门大学, 2018(08)
- [6]大白猪出生前后肝脏组织microRNA和mRNA深度测序分析及IGF-1基因差异表达调控机制研究[D]. 刘京鸽. 南京农业大学, 2017(07)
- [7]利用酵母双杂交筛选与IFT20发生相互作用的蛋白研究[D]. 双超凡. 武汉科技大学, 2017(01)
- [8]Hnrnpk及Dnmts在哺乳动物雄性生殖细胞发育过程中的表达及功能研究[D]. 徐海霞. 西北农林科技大学, 2015(01)
- [9]半滑舌鳎精子发生相关基因的研究及大菱鲆免疫相关EST的筛选[D]. 孟亮. 中国海洋大学, 2014(01)
- [10]NESG1相互作用蛋白的筛选、验证及其功能机制的研究[D]. 王浩. 南方医科大学, 2014(07)