一、突变的肝细胞生长因子受体被肝癌细胞HLA-A2分子递呈的实验研究（论文文献综述）
李萍[1]（2020）在《NLRC5对神经元中经典MHCⅠ类分子表达调控及神经元发育的影响》文中研究说明主要组织相容性复合体Ⅰ（MHCⅠ）类分子是一类细胞表面受体,广泛表达于有核细胞表面,在调节适应性细胞免疫反应中起关键作用。近年来研究证明MHCⅠ类分子表达于发育中和成年哺乳动物的大脑皮层、海马和小脑等多个部位,参与突触形成、突触可塑性以及运动、学习记忆等重要事件,发挥完全不同于免疫系统的作用。中枢神经系统（CNS）中经典MHCⅠ类分子的表达模式发育期为时空特异性组成型表达,在突触可塑性及其依赖的运动、学习等过程发挥生理功能,当突触可塑性完成后基本关闭表达;但在脑卒中等疾病状态下则出现诱导型表达,发挥不利于预后的病理作用。经典MHCⅠ类分子在CNS中的主要功能已经被证实,但是其在CNS中的表达调控机制仍不清楚。NLRC5是NLR蛋白家族中最大的成员,体外和体内研究均表明,NLRC5是免疫系统中MHCⅠ类分子表达的关键调节因子且调控具有细胞特异性。而NLRC5在神经元中是否表达、调控MHCⅠ类分子以及在神经元发育中的作用未见报道。本研究检测了NLRC5在海马神经元中的表达和定位;并从体外和体内探究NLRC5对神经元中经典MHCⅠ类分子的表达调控机制;另外,初步探究了NLRC5对神经元发育的影响。获得研究结果如下:1.小鼠出生后至成年（P0至P60）时期海马组织中经典MHCⅠ类分子的m RNA和蛋白的表达趋势不一致。P0至P60时期经典MHCⅠ类分子（H2-K和H2-D）m RNA的表达逐渐升高,而蛋白表达在P0至P15时期逐渐升高,P8至P15时期达到高峰,随后逐渐下降。P0至P15时期经典MHCⅠ类分子m RNA和蛋白的表达趋势一致,提示在此时期主要受转录水平的调控。RT-q PCR和Western blot均检测到NLRC5在海马组织中的表达,并且在P0至P15时期NLRC5的表达趋势与经典MHCⅠ类分子类似。进一步的组织免疫荧光结果显示NLRC5广泛表达于海马组织中,在海马神经元的细胞质和细胞核中都有明显表达,并且与经典MHCⅠ类分子共标。这些结果提示神经元中NLRC5很可能参与调控海马发育过程中经典MHCⅠ类分子的表达。2.体外过表达NLRC5导致经典MHCⅠ类分子的表达水平显着增加,MHCⅠ类分子轻链β2m和抗原递呈相关分子（Tap1、Tap2、Lmp2、Lmp7、Lmp10和Tapasin）的表达也都有不同程度的增加。Nlrc5-/-小鼠出生后海马发育过程中经典MHCⅠ类分子H2-K和H2-D以及轻链分子β2m的表达明显受损,而其他抗原递呈相关分子的表达未受明显影响。这些结果提示NLRC5在神经元中经典MHCⅠ类分子的组成型表达发挥重要作用。3.荧光素酶报告基因实验结果显示NLRC5的表达显着诱导Neuro-2a细胞中H2-D和H2-K基因的转录活性。当H2-D基因启动子区缺失W/S、X或Y元件后,显着减弱NLRC5对其转录活性的调控。另外,X元件上结合的RFX复合物（RFX5、RFXAP和RFXANK）和CREB1的外源性表达均能明显增强NLRC5诱导的H2-D启动子区转录激活;进一步敲低这些转录因子的表达则抑制NLRC5诱导的H2-D转录活性。这些结果表明X元件对NLRC5诱导的神经元中经典MHCⅠ类分子的转录至关重要。此外,免疫沉淀结果显示RFX5和RFXANK均与NLRC5具有相互作用,提示RFX5、RFXANK可能在神经元中招募NLRC5,并与NLRC5形成蛋白复合物进而诱导经典MHCⅠ类基因的转录。4.免疫荧光结果显示NLRC5表达于早期原代培养的海马神经元的胞体、树突和树突生长锥部位。进一步统计野生型和Nlrc5-/-小鼠原代培养3DIV、8DIV和15DIV的海马神经元树突分支,Sholl分析结果显示Nlrc5-/-小鼠在各时期树突分支复杂性明显增加。另外,RT-q PCR结果显示与野生型小鼠相比,Nlrc5-/-小鼠原代海马神经元中经典MHCⅠ类分子H2-K和H2-D的表达明显受损。利用FUGW-H2-D慢病毒挽救Nlrc5-/-小鼠原代海马神经元中H2-D的表达后,可以明显改善树突分支发育异常的表型。这些结果提示NLRC5可能通过经典MHCⅠ类分子调控树突分支发育。以上研究结果显示NLRC5广泛表达于小鼠海马神经元中,调控神经元中经典MHCⅠ类分子的表达。NLRC5通过W/S-X-Y元件诱导MHCⅠ类基因的转录激活,其中X元件上的转录因子RFX复合物和CREB1对NLRC5介导MHCⅠ类基因的转录激活至关重要,RFX复合物中的RFX5和RFXANK负责招募NLRC5到MHCⅠ类基因启动子区。除此之外,我们发现NLRC5表达于神经元的树突和树突生长锥部位,并且通过经典MHCⅠ类分子调控体外海马神经元树突分支发育。本研究解析了海马神经元中经典MHCⅠ类分子上调表达的重要调控因子及调控机制,并且初步探究了免疫分子NLRC5在中枢神经系统中的新功能,为深入了解神经元发育机制及神经—免疫机制提供重要的实验基础。
张瑶尧[2]（2019）在《人肝癌相关抗原SMP30联合HSP70L1修饰树突状细胞诱生CTL体外抗肝癌作用的研究》文中提出目的:制备负载人肝癌相关抗原SMP30和HSP70L1的DC,探讨其诱生的CTL的体外抗肝癌作用。方法:（1）用基因重组技术将SMP30、HSP70L1基因连接到慢病毒载体上,构建SMP30、HSP70L1双基因（SMP30-HSP70L1）重组慢病毒、SMP30重组慢病毒、HSP70L1重组慢病毒,用荧光稀释法对其进行滴度复检。（2）Ficoll梯度密度离心法从HLA-A2阳性健康成人外周血分离单个核细胞,细胞因子GM-CSF和IL-4诱导生成DC,用流式细胞术鉴定。（3）共分为6个组实验:分别用SMP30-HSP70L1重组慢病毒、SMP30重组慢病毒、HSP70L1重组慢病毒、空载慢病毒转染DC和肝癌组织总蛋白（经验证含SMP30、HSP70L1蛋白）致敏DC作为实验组,单纯DC作为空白对照组,即:SMP30-HSP70L1组、SMP30组、HSP70L1组、空载慢病毒组、肝癌组织总蛋白组、空白对照组。（4）对各组DC进行检测:Western blot检测SMP30蛋白和HSP70L1蛋白的表达情况,DC的表面免疫分子CD80和CD86的表达情况用流式细胞术来检测,ELISA检测各组DC细胞因子IL-1、IL-12和IFN-γ的分泌量。（5）用人CD3+T细胞磁珠分选试剂盒分离得到自体T淋巴细胞,流式细胞术检测其纯度。将T淋巴细胞与上述各组DC共培养诱导生成CTL。ELISA检测各组CTL细胞因子IFN、TNF的分泌量。CCK8检测各组CTL的增殖状况。（6）将各组CTL与人肝癌细胞SMMC7721共培养,用流式细胞术检测各组CTL的体外抗肝癌作用。结果:（1）SMP30 与 HSP70L1 融合（SMP30-HSP70L1）重组慢病毒、SMP30重组慢病毒、HSP70L1重组慢病毒构建成功,滴度复检的结果显示病毒滴度约为3×108TU/ml。（2）成功诱导培养人外周血DC,用重组慢病毒转染DC后,WB结果显示:SMP30-HSP70L1组和SMP30组DC的SMP30蛋白表达水平明显高于其他组DC,SMP30-HSP70L1组和HSP70L1组DC的HSP70L1蛋白的表达水平高于其他组DC,P<0.05,差异有统计学意义;流式细胞术结果显示SMP30-HSP70L1组DC的CD86表达率高于HSP70L1组、空载慢病毒组和空白对照组DC（P<0.05）,与肝癌组织总蛋白组DC之间没有统计学差异;各实验组DC间的表面免疫分子CD80的表达率没有统计学差异;ELISA结果显示:SMP30-HSP70L1组DC分泌细胞因子IL-1的量高于SMP30组、HSP70L1组、空载慢病毒组和空白对照组（P<0.05）,与肝癌组织总蛋白组DC无统计学差异;SMP30-HSP70L1组DC细胞因子IL-12和IFN-γ的分泌量高于HSP70L1组、空载慢病毒组和空白对照组DC（P<0.05）,与肝癌组织总蛋白组、SMP30组DC之间不存在统计学差异。（3）流式实验结果显示:通过免疫磁珠法筛选得到的T淋巴细胞的纯度为 93.1%;SMP30-HSP70L1 组 DC 诱生的 CTL 分泌的 TNF-α、IL-12 除了与肝癌组织总蛋白组无统计学差异外,均高于其他各组（P<0.05）;SMP30-HSP70L1组DC诱生的CTL分泌的IFN-α、IFN-y高于空白对照组和空载慢病毒组（P<0.05）,与另外3组无统计学差异;CCK8细胞增殖检测实验的结果发现SMP30-HSP70L1组高于空白对照组、空载慢病毒组、70慢病毒组和30慢病毒组（P<0.05）,与肝癌组织总蛋白组无统计学差异。（4）流式检测CTL的杀伤作用,结果为:①当效靶比（E/T）=15:1时,SMP30-HSP70L1组DC诱生的CTL对肝癌细胞SMMC7721的杀伤率（14.50±0.33）%高于SMP30组、HSP70L1组、空载慢病毒组以及空白对照组（P<0.05）,与肝癌组织总蛋白组（14.25±0.64）%之间没有统计学差别;②当效靶比（E/T）=30:1时,SMP30-HSP70L1组DC诱生的CTL对肝癌细胞SMMC7721的杀伤率（50.53±0.2）%高于空载慢病毒组、HSP70L1组和空白对照组（P<0.05）,与肝癌组织总蛋白组（50.38±0.48）%、SMP30组（46.42±2.14）%之间没有统计学差别。结论:除了肝癌组织总蛋白组外,与SMP30重组慢病毒、HSP70L1重组慢病毒、空载慢病毒转染DC各实验组相比,人肝癌相关抗原SMP30和HSP70L1共同修饰DC,能对DC的成熟产生更好促进作用,更有效地刺激T淋巴细胞的增殖与活化,效靶比为15:1时,CTL在体外能更好地杀伤肝癌细胞SMMC7721。
孙龙昊[3]（2014）在《AFP158-166特异性TCR转基因T细胞治疗肝癌的实验研究》文中研究指明第一部分：AFP158-166特异性TCR转基因T细胞的构建目的：构建AFP158-166特异性TCR转基因T细胞并鉴定其功能。方法：采集基因型HLA-A0201的健康志愿者单核细胞,制备负载AFP158-166表位肽的成熟树突状细胞（DC）,体外激活T细胞通过流式分选建立AFP158-166特异性T细胞克隆,获取并扩增AFP158-166特异性TCR基因,构建AFP158-166特异性TCR慢病毒载体,感染多克隆T细胞建立AFP158-166特异性TCR转基因T细胞。通过MHC五聚体检测转基因T细胞比例,以ELISPOT和细胞毒性实验进行功能鉴定。结果：（1）成功构建AFP158-166特异性TCR慢病毒载体VAT,可转染多克隆T细胞使其表达AFP158-166特异性TCR,构建AFP158-166特异性TCR转基因T细胞；（2）FCM检测Pro5AFP158-166-MHC五聚体和CD8双阳性细胞比例为1.8%；（3）ELSPOT检测显示AFP158-166特异性TCR转基因T细胞中分泌IFN-γ的细胞数是DC诱导的AFP158-166特异性T细胞中的1.8倍。（4）细胞毒性实验显示AFP158-166特异性TCR转基因T细胞较DC诱导的AFP158-166特异性T细胞对AFP+人肝癌细胞HepG2杀伤作用在效靶比10：1,20：1,30：1时分别从6.3±1.3%,17.9±5.2%,39.2±3.7%上升至11.3±2.9%,27.9±7.8%,62.7±10.4%,而对AFP-细胞无明显杀伤作用。结论：AFP158-166特异性TCR慢病毒载体VAT可转染多克隆T细胞构建AFP158-166特异性TCR转基因T细胞,对AFP+人肝癌细胞有特异性杀伤作用。第二部分：AFP158-166抗原肽与IL-15协同表达人工抗原递呈细胞的构建目的：构建AFP158-166抗原肽与IL-15协同表达人工抗原递呈细胞并鉴定其功能。方法：以AFP158-166抗原表位肽和IL-15协同表达质粒,构建慢病毒载体VA15转染人B细胞淋巴瘤细胞BJAB,以放射辐照抑制增殖,建立安全且稳定表达IL-15并递呈AFP158-166表位肽的人工抗原递呈细胞,通过ELISA、FCM和液相色谱-质谱联用分别鉴定IL-15、MHC分子、CD80、CD86、AFP158-166抗原肽的稳定表达,于体外诱导AFP158-166抗原特异性T细胞增殖,并以细胞毒性实验进行功能鉴定。结果：（1）成功构建AFP158-166抗原表位肽和IL-15协同表达慢病毒载体VA15,可转染BJAB细胞,获得协同表达AFP158-166抗原表位肽和IL-15的BJAB细胞单克隆BA15；（2）BA15可稳定表达AFP158-166抗原肽和IL-15；（3）20Gy剂量的137Csγ射线辐照可诱导凋亡有效阻滞BA15细胞增殖但不会使其迅速死亡；（4）20Gy剂量的137Csγ射线辐照不会影响BA15细胞表面MHC分子及协同刺激分子CD80、CD86的表达。（5）BA15可有效激活扩增AFP158-166抗原特异性T细胞,其功能较负载AFP158-166的DC无明显差异；（6）细胞毒性实验显示BA15诱导的AFP158-166特异性T细胞较DC诱导的AFP158-166特异性T细胞对AFP+人肝癌细胞HepG2杀伤作用在各效靶比无明显差异。结论：构建AFP158-166抗原肽与IL-15协同表达人工抗原递呈细胞可有效激活AFP158-166特异性T细胞,对AFP+人肝癌细胞有特异性杀伤作用。第三部分AFP158-166特异性转基因T细胞过继性免疫治疗的实验研究目的：以AFP158-166抗原肽与IL-15协同表达人工抗原递呈细胞BA15体外刺激AFP158-166特异性TCR转基因T细胞鉴定其功能变化。方法：体外非特异性激活HLA-0201健康志愿者淋巴细胞,以AFP158-166特异性TCR慢病毒VAT感染,制备AFP158-166特异性TCR转基因T细胞,并以本实验建立的AFP158-166抗原肽与IL-15协同表达人工抗原递呈细胞BAl5刺激扩增,通过MHC五聚体检测转基因T细胞比例变化,以细胞毒性实验进行体外实验功能鉴定。利用HepG2肝癌细胞NOD/SCID小鼠模型,进行AFP158-166特异性T细胞过继免疫治疗实验,观察治疗效果。结果：（1）经BA15刺激,AFP158-166特异性TCR转基因T细胞中Pro5AFP158-166-MHC五聚体和CD8双阳性细胞比例从1.8%上升至4.2%,CD8+T细胞/CD4+T细胞比例由0.42上升至1.10,但对AFP+人肝癌细胞HepG2的杀伤作用无明显变化。（2）AFP158-166特异性TCR转基因T细胞较负载AFP158-166表位肽DC诱导的AFP158-166特异性T细胞对于HepG2肝癌细胞NOD/SCID小鼠模型具有更好的治疗效果。结论：AFP158-166抗原肽与IL-15协同表达人工抗原递呈细胞BA15体外刺激AFP158-166特异性TCR转基因T细胞可提高转基因T细胞比例。AFP158-166特异性转基因T细胞过继性免疫治疗有效。
张振松[4]（2013）在《AFP158-166特异性T细胞的检测及体外诱导的实验研究》文中认为目的：检测肝细胞癌患者外周血AFP158-166特异性T细胞比例,并利用健康志愿者外周血淋巴细胞,体外诱导AFP158-166特异性T细胞,为肝癌的免疫治疗奠定基础。方法：1、采用FITC荧光标记的HLA-A2抗体及HLA-A2基因分型高分辨检测试剂盒（PCR-SSP）,筛选HLA-A0201患者。取外周血,密度梯度离心法分离获取外周血单个核细胞（PBMC）,流式细胞技术检测T细胞亚群；通过R-PE标记的MHC-AFP158-166肽五聚体,流式细胞技术检测患者外周血中AFP158-166特异性T细胞的比例。2、筛选HLA-A0201的健康志愿者,分离PBMC,按如下两种方法分别刺激特异性T细胞增殖。（1）培养T2杂交瘤细胞,负载HLA-A0201抗原表位肽AFP158-166,γ射线照射（75Gy）处理,与PBMC1:1混合,反复刺激,IL-2维持。（2）以含人GM-CSF、IL-4及TNF-α细胞因子的培养基培养PMBC,贴壁粘附培养法培养收获树突状细胞（DC）,将DC负载HLA-A0201表位肽AFP158-166,与新鲜淋巴细胞以1：10比例混合,含细胞因子IL-2培养液培养。待出现细胞大量增殖后收获细胞,MHC-AFP158-166肽五聚体检测AFP158-166特异性T细胞,细胞毒性实验检测其对靶细胞的特异性杀伤能力。结果：（1）28例肝细胞肝癌患者中,筛选出基因型HLA-A0201阳性者18例,2ml外周血可分离PBMC约1x107个,未能检测出CD8+五聚体+T细胞。（2）T2细胞与AFP158-166共同孵育,细胞表面HLA-A2分子表达增加,随着肽浓度增加,HLA-A2平均荧光强度及表达率逐渐增加,在抗原肽浓度为45μg/ml与60μg/ml时达到最大结合效力,90μg/ml时HLA-A2分子的表达下降。10例健康志愿者,基因型HLA-A0201阳性者3例,每20ml外周血培养的细胞中可收获DC细胞（1.94±0.79）×106个,培养至第7天检测表面抗原： CD83、CD80、CD86和HLA-DR阳性率分别为（62.6±4.2）%、（90.4±2.4）%、（98.2±0.3）%和（87.9±4.2）%。（3）DC负载AFP158-166与淋巴细胞混合培养14d左右出现大量细胞增殖,流式检测CD8+MHC-AFP158-166五聚体+细胞7.5%,与负载AFP158-166的T2细胞混合培养的淋巴细胞中,未检测到CD8+MHC-AFP158-166五聚体+细胞。（3）细胞毒性实验显示,DC激活的淋巴细胞对AFP+肝癌细胞HepG2和负载AFP的T2细胞的杀伤率显着高于对未负载AFP的T2细胞和负载Her2抗原肽的T2细胞的杀伤率,差异具有统计学意义（p<0.05）（效靶比20：1时分别为45.12±10.60%和39.06±±6.48%vs14.83±9.82%和2.51±0.14%）；T2激活的淋巴细胞依效靶比20：1对上述细胞杀伤率分别为：HepG2（14.03±11.17）%,负载AFP的T2（8.49±±7.34）%,T2（3.26±0.32）%,负载Her2的T2（3.36±2.45）%,与DC激活的淋巴细胞对HepG2、负载AFP的T2细胞的杀伤作用比较,差异具有统计学意义（p<0.05）。结论：MHC-肽五聚体检测未能从AFP+肝癌患者外周血中检出AFP158-166特异性T淋巴细胞,提示患者免疫系统对AFP产生耐受或无能。DC负载抗原肽AFP158-166可体外刺激健康志愿者外周血PBMC,获得AFP158-166特异性T淋巴细胞,可特异性杀伤AFP+肝癌细胞。本研究结果为肝癌的过继细胞免疫治疗研究提供了实验基础。
沈晗[5]（2013）在《基于点突变Survivin表位肽的TCR基因筛选及抗肝癌作用研究》文中指出原发性肝癌是目前世界上发病广泛的恶性肿瘤之一,患者死亡率很高,目前已排在所有癌症死亡率的第三位。我国是肝癌的高发区,肝癌的新发和死亡患者占全世界50%以上,每年有近30万人死于肝癌。目前临床上针对肝癌的治疗方法仍然以手术切除、化疗栓塞、局部消融和放射治疗等手段为主,但从整体研究来看,上述治疗对延长患者的中位生存期并没有显着作用,而其伴随带来的一些毒副作用还可能加重患者病情。近年来,新兴的肿瘤免疫治疗手段日益受到重视,与传统疗法相比,其优势体现在治疗的个体化和较少的毒副反应。目前,研究较多的肿瘤免疫疗法主要包括肿瘤相关抗原（Tumor-associated antigen, TAA）肽疫苗治疗和过继性免疫细胞治疗两大类,这些免疫治疗手段都是希望通过激发肿瘤患者体内有效的抗肿瘤免疫反应,进而达到杀灭肿瘤细胞的目的。具体来讲,抗肿瘤免疫反应又分为非特异性和特异性的两类,以细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine-induced killer, CIK）为代表的过继性细胞治疗发挥广泛而非特异性的杀肿瘤作用,目前已在临床上得到一定应用,对部分患者起到了治疗作用；而以TAA肽疫苗和特异性T细胞抗原受体（T cell receptor, TCR）基因修饰的细胞治疗为代表的特异性抗肿瘤治疗则是以特定的TAA为靶点,希望能激发针对性的抗肿瘤免疫反应,强调肿瘤治疗的特异性和靶向性,是目前肿瘤免疫治疗的研究热点和新方向。TAA是一类与肿瘤的发生发展密切相关的抗原分子,其通常在细胞癌变时表达明显增高,而在正常组织中不表达或微量表达,这一特性使TAA在肿瘤治疗中可能具备潜在应用价值。目前认为,能用于特异性肿瘤免疫治疗的理想TAA应该具备以下三个特征：1.在大多数肿瘤中高表达而在正常组织中表达很少；2.其抗原肽能与主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex, MHC）分子有效结合；3.其能被体内的T细胞库所识别并能有效激活特异性T细胞抗肿瘤反应。近三十年来,研究者们已从60多种人类TAA中鉴定出超过170多种抗原肽,并通过实验鉴定获知它们能被MHC分子所呈递并被相应的T细胞所识别,被认为是肿瘤治疗的潜在靶点。虽然基于多种TAA的肽疫苗已开展了临床试验,但到目前为止,美国FDA仅在2010年批准了唯一一个用于治疗前列腺癌的疫苗Provenge,而其他绝大部分TAA肽疫苗的临床试验没有取得理想的效果,使特异性肿瘤免疫治疗的研究遇到了很大困难。近年来,随着研究的不断深入,对肿瘤疫苗疗效不佳的原因有了新的认识。由于肿瘤是由机体自身细胞发生恶性转化而形成的,TAA绝大部分为自身抗原,由于机体的中枢免疫耐受机制,体内能识别这些TAA的TCR高亲和力T细胞在发育早期即被免疫清除,体内存在的识别这些TAA的成熟T细胞,绝大多数为TCR低亲和力的naive T细胞,难以被TAA肽有效激活,这可能是目前肿瘤疫苗治疗困境的重要原因之一。要解决这一问题,在用于肿瘤特异性免疫治疗的TAA肽设计上需要有新的思路。其次,我们需要认识到,由于肿瘤患者体内的自身免疫功能本身处于一种异常状态,即使TAA肽的设计符合要求,单纯依靠其激发患者体内的特异性CTL抗肿瘤免疫反应也是比较困难的。有研究发现,利用肿瘤抗原在体外活化特异性CTL克隆,经扩增后再过继性回输患者体内可能是一条新的治疗途径。但目前认为,在MHC同型个体的T细胞库中,识别某特定抗原肽的抗原特异性T细胞比例仅为10-6～10-4,要在体外迅速诱导出针对TAA的细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocyte, CTL）克隆是一个较为困难的过程,同时后续的活化扩增也需要较长时间,这是影响后续过继性抗肿瘤功效的一大障碍。目前,研究较多的用于抗肝癌研究的TAA主要包括,甲胎蛋白（a-fetoprotein, AFP）, NY-ESO1和MAGE-A等,虽然基于这些TAA的疫苗已经有部分被候选用于临床试验,但就已经报道的研究结果来看,绝大部分抗肝癌TAA疫苗的试验疗效并不突出。Survivin抗原属于凋亡抑制蛋白家族,它可以通过阻断细胞凋亡的Caspase-9途径抑制肿瘤细胞凋亡,研究发现Survivin广泛表达于各种恶性肿瘤,其中在90%的肝癌患者中高表达,但其在已分化的正常组织中几乎检测不到,因此被认为是具有较高潜在应用价值的TAA靶点。近年来,以Survivin抗原肽为背景的特异性抗肿瘤研究已在恶性黑色素瘤、乳腺癌、结肠癌和尿路上皮癌等多种恶性肿瘤中开展,部分研究取得了较好的进展,但目前还未见到基于Survivin抗原肽的特异性抗肝癌肿瘤疫苗研究的实验报道。本研究着眼于上述影响肿瘤特异性免疫治疗的相关问题开展实验设计,在综合国外相关领域的最新研究进展及本研究团队的前期研究成果基础上,我们以Survivin抗原为对象开展针对肝癌的特异性抗肿瘤实验工作,整个研究分三部分进行,首先运用生物信息学技术分析可能的Survivin抗原CTL表位,并利用抗原肽点突变技术提高Survivin抗原肽与MHC分子及TCR分子的结合力,希望解决普通TAA肽免疫原性低下的问题；接着我们利用筛选获得的突变Survivin抗原肽刺激T细胞活化,建立反应性CTLs克隆,希望能解决TAA肽难以有效激活癌症患者体内主动免疫反应的问题；最后我们对突变肽诱导反应性CTL克隆的TCR基因家族表达谱变化进行分析,鉴定并克隆出反应性CTL克隆的TCR基因,将其转染外周血来源的T细胞,希望能通过TCR转基因技术在短时间内获得较多数量的具有抗肿瘤反应性的效应T细胞,为打破肿瘤免疫耐受,提高机体抗肿瘤反应能力提供一种肿瘤特异性免疫治疗新方案。一、点突变Survivin抗原表位的生物信息学分析在抗肿瘤免疫反应中,CTLs通过其表面的TCR分子特异性识别肿瘤细胞MHC-I类分子（在人类为HLA-I类分子）递呈的抗原表位肽进而杀伤肿瘤细胞,因此在肿瘤疫苗的设计中,抗原表位设计的好坏直接决定着抗肿瘤免疫反应的效果。有研究报道,在我国肝癌高发区肝细胞癌患者中有超过50%的比例为HLA-A2分子表达阳性,表明HLA-A2基因型可能与肿瘤密切相关,而成为当地癌症发生的一个易感因素,因此本论文所设计的Survivin抗原表位为HLA-A2所递呈。在本部分研究中,我们的目的是利用生物信息学分析及实验验证寻找理想的候选点突变Survivin抗原表位肽。首先,利用两个经典的CTL抗原表位在线预测系统BIMAS（http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla bind/）和SYFPEITHI（http://www.syfpeithi.de/Scripts/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm）对野生型Survivin抗原全长氨基酸序列的HLA-A2限制性9氨基酸表位肽进行了预测评分,我们筛选了两个预测系统评分前二十位的表位肽进行分析,寻找评分较低且氨基酸残基第二位不是V、L、I、M、T等疏水性氨基酸的表位肽,最终确定Sur79（KHSSGCAFL）作为候选野生型Survivin表位肽进行氨基酸位点的人工突变,通过比较突变前后的在线评分变化情况,鉴定出两条用于实验的Survivin点突变肽Sur79L2与Sur79M2。我们接着进一步体外合成了五条Survivin表位肽,利用T2细胞进行MHC-肽结合稳定性实验,结果显示野生型表位肽经突变后与HLA-A2分子的亲和力大大提高,证实突变肽Sur79L2、Sur79M2与MHC分子的结合稳定性显着提高,与生物信息学在线预测结果相一致。该部分研究获得了用于后续实验的点突变Survivin表位肽Sur79L2和Sur79M2。二、点突变Survivin表位肽诱导的抗肝癌特异性CTLs克隆的建立CTL是具有细胞毒作用的效应性CD8+T细胞,其可以通过分泌穿孔素、颗粒酶（Granzyme B, GzmB）等物质直接杀伤靶细胞,也可以通过Fas/FasL途径诱导靶细胞凋亡。CTL杀伤力较强,可反复杀伤靶细胞,而且在杀伤靶细胞的过程中本身不受损伤,其杀伤过程具有有高效性,抗原特异性和自身MHC限制性、与自然杀伤细胞构成机体抗肿瘤免疫的重要防线。在本部分研究中,我们的目的是利用之前设计并合成的点突变表位肽Sur79L2和Sur79M2在体外诱导肽反应性CTLs,并验证其针对肝癌细胞系的细胞毒作用。我们利用密度梯度离心法从一位高表达Survivin抗原的]HLA-A2+肝癌患者腹水中分离单个核细胞,单个核细胞贴壁后体外诱导分化为树突细胞（Dendritic cell, DC）,体外诱导10天左右利用流式细胞仪检测成熟DC的表面标记分子表达情况,备用。向腹水来源的肿瘤相关淋巴细胞（tumor-associated lymphocytes, TAL）中分别加入10mM的不同合成表位肽进行首轮刺激培养14天,第二轮刺激加入10mM的抗原肽、300IU/mL的重组人IL-2及诱导成熟的DC,继续培养12天。利用ELISPOT法检测肽刺激后能有效分泌干扰素-γ（Interferon-γ, IFN-γ）的活化淋巴细胞数量；免疫磁珠法分离肽诱导的CD8+T细胞作为效应细胞,以负载合成表位肽的T2细胞作为靶细胞,进行细胞毒试验；将肽刺激的TAL与肝癌细胞系共孵育后,收集淋巴细胞上流式细胞仪检测CD8+T细胞内GzmB的表达情况,倒置相差显微镜观察肝癌细胞形态学变化情况,CytoTox96（?）试剂盒检测CTL对肝癌细胞的裂解情况。结果显示点突变肽Sur79L2和Sur79M2均能有效刺激腹水来源的TAL活化分泌IFN-γ,并能对负载野生肽及突变肽的T2细胞发挥细胞毒作用；与肝癌细胞系共孵育后,能以MHC-Ⅰ类限制性方式有效杀伤肝癌细胞,CD8+T细胞能有效分泌GzmB,肝癌细胞系出现凋亡或坏死样表型变化。该部分研究证实利用点突变Survivin表位肽可以在体外诱导出特异性杀伤肝癌细胞系的CTLs克隆。三、基于点突变Survivin表位肽的TCR基因筛选与抗肝癌功能初步研究TCR分子是T细胞表面的跨膜蛋白,其对抗原肽-MHC复合物的特异性识别为T细胞活化提供第一信号,是T细胞发挥免疫功能的最重要分子之一。根据TCR的类型不同,可分为TCRαβ+T细胞和TCRγδ+T细胞,其中TCRαβ+T细胞占T细胞总数的95%以上,而TCRαβ+CD8+T细胞是发挥重要抗肿瘤免疫功能的一类CTLs。研究发现,肿瘤患者体内可有效识别肿瘤抗原的TCRαβ+T细胞缺失是导致肿瘤免疫耐受发生的重要原因之一。近年来,有研究证实特异性TCR基因转导技术能赋予普通成熟T淋巴细胞新的特异性杀伤抗原靶细胞能力,TCR基因修饰的过继性抗肿瘤免疫治疗也成为研究热点。在本部分研究中,我们的目的是从点突变肽体外诱导的CTLs中筛选出具有显着克隆增殖特点的TCR基因,并将其转染健康人T淋巴细胞验证其对肝癌细胞系的识别杀伤能力。我们首先利用流式细胞术对前期点突变表位肽Sur79L2和Sur79M2体外刺激诱导的CTLs进行TCRVβ基因亚家族表达谱检测,与刺激前的TCRVβ基因亚家族表达谱相比较,寻找比例发生显着性升高的TCRVβ基因亚家族,接着利用GenomeLab GeXP遗传分析系统对肽刺激后CTLs的TCRVα和TCRVβ基因表达情况进行精细分析,筛选出现明显单克隆扩增的TCR基因,将单克隆扩增的TCR基因全序列通过PCR法克隆到T载体上,挑取多个克隆测序,将测序结果进行分析比对,重点比对TCR基因CDR3区的序列差异,寻找多个克隆出现相同CDR3区基因序列的TCR基因。将筛选获得的TCR基因插入腺病毒表达载体中,包装出具有感染能力的腺病毒转染HLA-A2+的健康人T淋巴细胞,利用流式细胞术检测转染后特异性TCR基因的表达水平,将TCR基因修饰的T细胞与肝癌细胞系共孵育,验证其对肝癌细胞系的细胞毒作用。结果显示,点突变表位肽Sur79L2诱导的CTLs中TCRVβ9和TCRVβ2两个基因亚家族出现比例升高,而点突变表位肽Sur79M2诱导的CTLs中TCRVβ7和TCRVβ16两个基因亚家族比例升高,进一步的GeXP检测结果显示在Sur79L2诱导的CTLs中出现一个TCRVα24和TCRVβ9基因的单克隆扩增,而在Sur79M2诱导的CTLs中未发现明显的TCR基因单克隆扩增,进一步通过测序比对鉴定出一个针对Sur79L2的TCR基因TCRa24β9,利用腺病毒传输系统将该TCR基因转染HLA-A2+健康人外周血PBMC,将TCR基因修饰的T淋巴细胞与肝癌细胞系共孵育,可观察到显着的细胞毒作用,其杀伤表现为HLA-A2限制性。该部分研究证实利用我们筛选获得突变肽特异性TCRα24β9基因转染修饰健康人T细胞能够实现对肝癌细胞系的有效杀伤。综上所述,本研究利用生物信息学分析结合试验验证筛选到两个与HLA-A2分子结合能力显着提高的点突变Survivin表位肽Sur79L2和Sur79M2,将这两个点突变肽体外刺激活化一名肝癌患者腹水来源的TAL,可获得具有特异性识别杀伤能力的CTLs,并通过进一步的筛选和鉴定获得了针对Sur79L2的特异性TCRα24β9基因,将该TCR基因转染健康人T细胞后,证实TCR基因修饰的T细胞获得了特异性杀伤肝癌细胞系的能力。本研究有望为为今后开发基于突变抗原肽的特异性T细胞过继性肿瘤治疗新方法和新型靶点治疗抗肿瘤TCR基因药物提供有益的参考与借鉴。
罗进[6]（2008）在《基于T细胞表位肽的树突细胞介导的靶向性细胞杀伤机制的研究》文中指出随着免疫识别理论、分子生物学知识和电子显微技术的不断进展与突破,大量研究证实发现T细胞对于抗原的识别是与MHC分子结合递呈的抗原短肽。有效的抗原表位肽可以通过树突细胞呈递到MHC-Ⅰ/MHC-Ⅱ途径引起机体的免疫反应。近年来又有科学家提出复合表位或改构表位可以增强单表位的功能。随着DC疫苗在临床的应用及其相关研究的进一步深入,寻找有效的T细胞表位以增强DC疫苗在抗肿瘤及治疗感染性疾病的作用受到越来越多的重视。如何使外来抗原通过MHC-Ⅰ途径诱发CD8+CTL反应是DC在临床应用中的关键。该课题的设计主要针对病因明确的病毒性疾病,拟选择以乙型肝炎病毒源性肝炎为疾病模型,以细胞免疫所攻击的乙型肝炎病毒核心蛋白为靶蛋白,通过软件预测的方法分析该蛋白的生物学特性及T细胞表位肽,将设计得到的表位修饰并合成。建立可标准化的DC培养平台;通过实验探讨表位肽对DC功能的影响以及其作用机理,为DC在临床的应用奠定基础。实验分为四部分,具体如下:第一部分T细胞表位肽的设计与筛选目的预测HBV核心蛋白的一般生物学特性及该蛋白片段上有效的HLA-2限制性CTL表位。方法从Genebank中选择B型（adw） HBV的核心蛋白,用软件CLC Protein Workbench3版本和SignalP3.0软件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/）对HBV核心抗原的编码蛋白质进行预测的一般生物学特性;采用SYFPEITHI远程预测数据库、PREDEPP数据库、基序法和多项式法共同对HBV核心抗原编码蛋白进行HLA-A2限制性CTL表位预测。结果通过软件对HBV核心蛋白进行分析,明确了该蛋白质的跨膜区,信号肽,亚细胞定位,抗原性位点。筛选了5条T细胞表位肽。结论预测方案的联合使用可以提高T细胞表位肽筛选的准确率。第二部分T细胞表位肽的鉴定、修饰与合成目的鉴定筛选出的5条肽生物学特性,修饰并合成与抗原结合性能最好的肽,为进一步探讨外源性小分子表位肽进入细胞内激发MHC1类反应奠定基础。方法用抗原性能结合实验分别从亲和力、结合稳定性和MHC-肽复合体稳定性三方面鉴定5条表位肽与抗原的结合性能,筛选出结合性能最好的两条肽,并用辅助性T细胞表位、B细胞表位和棕榈酰基修饰,Fmoc方案合成。结果筛选出2条T细胞表位肽,合成9条肽,构成11组表位肽。结论利用抗原结合性能实验和Fmoc合成方案可以完成抗原肽的鉴定与合成。第三部分人外周血单核细胞来源的树突细胞转化平台的搭建目的建立一种可标准化、规模操作DC培养、转化及鉴定平台。方法将人外周血的PBMC用CD14+磁珠标记,在磁场中分离出CD14+PBMC;将分选得到的细胞在DC培养袋中加入IL-4,GM-CSF共培养,第10天,收集细胞计数,Typanlan染色观察活性,流式细胞仪检测细胞表型,扫描电镜观察细胞形态。结果光学显微镜下,树突状细胞悬浮生长,大小不等,形态极不规则,向四周伸出不同数量的粗细不一、形态迥异的胞质突起。CD14+PBMC在初始血液中的比例为14%,而经过分离纯化后的CD14+细胞的浓度达到94.8%。在培养10天后的细胞悬液中,由于大部分细胞转化为DC,所以分子表面标志发生改变,CD14+细胞的浓度仅为0.65%;在培养出的DC细胞表面高表达HLA-I（70.43%）,HLA-Dr（0.65%）,CD80（89.45% ）,CD86（86.32%）,部分表达CD40（29.61%）。这些细胞表面分子标志都是人PBMC转化为DC后的特征性分子。扫描电镜可见被固定的树突状细胞仍保持其特征性的突起,使细胞呈星状、多角形或极不规则形。突起长短不一,分支形成1-4级的亚突起。结论从PBMC中分离纯化的CD14+细胞通过加入细胞因子可以在细胞培养袋中非贴壁式培养出高纯度的DC。第四部分DC介导的靶向性杀伤功能及机制的初步探讨目的对比负载不同表位肽的DC的生物学功能筛选出杀伤功能最佳的表位肽组合,从微分子水平探讨组合肽的功能性差异。方法用四噻唑蓝法实验检测细胞毒功能;ELISPOT实验检测负载不同表位的DC刺激T细胞分泌γ-IFN的功能;原子力显微镜分析DC经小分子肽作用后表面精细结构改变;激光共聚焦显微镜分析小分子肽进入细胞后不同时间的表现;免疫荧光显微镜观察DC摄取肽的过程。结果细胞经第T1,T1+T2,T1+Th,T1-AAA-Th,pal-KSST1,pal-KSST1AAATh,T1+B,pal-KSST1Th,T1+Th,B组短肽处理后,细胞活性较对照组有显着性升高（p<0.05）,其中第T1+B组肽则可使细胞活性呈现极显着升高（p<0.01）,而经T2,Th,T1Th短肽处理后,细胞活性较对照组有显着性降低（p<0.05）,其中第T2组肽使细胞活性呈现极显着降低。筛选出的表位肽T1可以上调DC对T细胞刺激能力（P<0.01）,而经过棕榈酰丝氨酸修饰的表位或B细胞、Th协同的T细胞表位负载DC刺激能力也有同样表现（P<0.01）,无论辅助性T细胞表位还是B细胞表位对于T1均有协同作用。将辅助性T细胞表位直接偶联到T1表位上,破坏了T1刺激DC的能力。即使在T1表位和Th内部通过AAA连接,并以棕榈酰丝氨酸修饰也不会表现出比单独的T1表位明显的功能增强。激光共聚焦的结果显示小分子肽可以在30分钟被DC快速摄取,免疫荧光显微镜发现肽的摄取是在5min内完成的;小分子肽的摄取由胞体完成后向树突传递,而且树突的肽浓度相对胞体较低。小分子肽被细胞摄取后的12h内,始终不曾进入细胞核。在透射电镜下,负载肽的DC线粒体增大,增多,核糖体和内质网丰富。而MTT活性检测实验显示这些被肽激活的DC的功能上调。结论DC经不同短肽处理后,细胞活性会产生一定程度的改变。短肽使T淋巴细胞的杀伤活性增高的原因主要是通过DC激活了细胞免疫途径,发挥了CTL效应。棕榈酰基修饰后可以上调T细胞表位的功能;B细胞表位和Th可以通过表位间的协同作用增强T细胞表位肽激活CTL的效应。AFM观察到细胞表面形貌变化受外源性小分子肽一级结构的影响,而且直接影响细胞的活性。小分子肽不作为遗传物质参与细胞的信息传递,这一现象为表位肽作为疫苗,与DC共培养后回输机体的安全性提供了理论基础。研究发现软件预测是一种可行的T细胞表位肽筛选方案,极大的缩减了实验的工作量,不同类别的表位肽之间的协同作用对于上调DC的生物学功能大于表位间的偶联效应。棕榈酰化表位肽也可以上调DC对于T细胞的刺激能力。不同的小分子肽对DC表面的精细结构的影响不一样,产生的CTL杀伤效应也不同。
陈婷[7]（2007）在《肝素酶HLA-A2.1限制性CTL表位的预测、鉴定及其抗肿瘤的免疫效应研究》文中研究指明[背景和目的]生物治疗是继手术、放疗和化疗之后临床治疗恶性肿瘤的第四种治疗模式。随着对机体抗肿瘤免疫机制的深入研究，人们已经认识到诱发体内细胞毒T淋巴细胞（Cytotic T Lymphocyte，CTL）发挥抗瘤作用的并不是整个肿瘤抗原分子，而是与MHC分子结合的短肽即CTL表位（epitopes），因此，寻找特异性肿瘤抗原及其相应的CTL表位成为肿瘤免疫治疗的关键。树突状细胞（Dendritic cells,DC）作为体内最强大的抗原提呈细胞，是免疫应答过程的始动者和调节者。负载CTL表位的DC疫苗因其免疫原性好、副作用小、便于应用等优势而成为目前抗肿瘤治疗研究的一个热点。肝素酶（Heparanase，Hpa）是近年来新发现的一个肿瘤转移相关基因，在正常组织中仅低表达于淋巴细胞和骨髓等免疫组织，但在几乎所有的转移性恶性肿瘤细胞中普遍存在，而且表达的水平与肿瘤的转移、TMN分期等临床预后不良指标明显相关，肝素酶已成为中晚期肿瘤治疗的一个良好靶位。那么肝素酶能否作为一种肿瘤相关抗原用于肿瘤的免疫治疗?我们过去的研究表明，肝素酶全长基因负载的DC体外可以诱导肝素酶特异性CTL，对肝素酶阳性且MHC相匹配的胃癌细胞具有杀伤作用，而对肝素酶阳性但MHC不相匹配的胃癌细胞不具有杀伤效应，提示肝素酶氨基酸全长序列中一定存在能诱导特异性CTL反应的抗原表位。本研究的目的在于寻找存在于肝素酶全长序列中的能够有效激发机体抗肿瘤效应的CTL表位。鉴于HLA-A2．1是中国人群中最为常见的HLAⅠ类分子的型别，阳性率高达50％，因此鉴定肿瘤转移相关抗原Hpa的HLA-A2．1限制性CTL表位将会对中国人群中肝素酶表达阳性的恶性肿瘤提供免疫治疗的基础。[方法]1、采用超基序和量化基序相结合的方法对肝素酶的HLA-A2．1限制性CTL表位进行预测，并用分子模拟技术模拟表位肽与MHC分子结合的空间构象，分析结合参数以进一步提高预测的准确性，然后从结果中选取得分较高的5条肝素酶表位肽进行合成、纯化、分子量鉴定，利用T2细胞的特点对合成的候选肽与HLA-A2．1分子的进行亲和力分析；采用标准51Cr释放实验检测上述肝素酶表位肽负载DC后诱导的肝素酶特异性CTL对KATO-Ⅲ胃癌细胞的免疫杀伤效应，从而筛选出能够有效激活CTL反应的肝素酶抗原表位。2、采用密度梯度离心法分离并得到人外周血单个核细胞，利用rhGM-CSF、rhIL-4及rhTNF-α诱导扩增人成熟树突状细胞，并从形态学、细胞表面CD分子进行鉴定；用上述筛选的候选肽负载DC诱导产生特异性CTL，采用标准51Cr释放实验检测肝素酶特异性CTL对KATO-Ⅲ胃癌细胞（Hpa+，HLA-A2．1+）、U-2OS骨肉瘤细胞（Hpa+，HLA-A2．1+）、SW480结肠癌细胞（Hpa+，HLA-A2．1+）、MCF-7乳腺癌细胞（Hpa-，HLA-A2．1+）、HepG2肝癌细胞（Hpa+，HLA-A2．1-）以及转染了肝素酶全长基因的MCF-7／Hpa乳腺癌细胞（Hpa+，HLA-A2．1+）和转染了HLA-A2．1基因的HepG2／HLA-A2．1肝癌细胞（Hpa+，HLA-A2．1+）的免疫杀伤效应；采用HLA-A2．1单克隆抗体封闭上述靶细胞的HLA-A2．1位点，或以CD8单克隆抗体封闭效应细胞的CD8位点，再用肝素酶表位特异性CTL杀伤KATO-Ⅲ胃癌细胞，以研究筛选的肝素酶表位是否受HLA-A2．1限制以及CTL效应细胞的来源；采用标准51Cr释放实验研究肝素酶特异性CTL对自体淋巴细胞的免疫杀伤活性，以确定其可能存在的毒副作用；采用ELISPOT技术检测肝素酶特异的效应细胞IFN-γ释放情况。3、将上述筛选的肝素酶候选表位负载C57BL／6-Tg（HLA-A2．1）1Enge／J小鼠骨髓来源的DC（mDC）后，免疫小鼠三次，取其脾淋巴细胞作为效应细胞，采用51Cr释放实验检测肝素酶特异性CTL对KATO-Ⅲ、U2OS、SW480、MCF-7、MCF-7／Hpa、HepG2、HepG2／HLA-A2．1细胞以及自体淋巴细胞和mDC的杀伤效应；ELISPOT技术检测肝素酶特异的效应细胞IFN-γ释放情况。[结果]1、采用超基序和量化基序方法联合预测出5条得分最高肝素酶表位肽：Hpa（525-533）（PAFSYSFFV）、Hpa（353-361）（PLLSDTFAA）、Hpa（277-285）（KMLKSFLKA）、Hpa（400-408）（PLPDYWLSL）、Hpa（405-413）（WLSLLFKKL）；T2细胞亲和力分析发现预测的5条多肽均能与T2细胞有效结合；采用标准51Cr释放实验检测上述肝素酶表位肽负载DC后诱导的肝素酶特异性CTL对KATO-Ⅲ胃癌细胞的免疫杀伤效应，结果表明，Hpa（525-533）、Hpa（277-285）、Hpa（405-413）诱导的CTL对KATO-Ⅲ胃癌细胞具有明显的杀伤效应，而Hpa（353-361）和Hpa（400-408）诱导的CTL对KATO-Ⅲ胃癌细胞的杀伤效应与阴性肽相同，提示Hpa（525-533）、Hpa（277-285）、Hpa（405-413）可能是肝素酶特异性抗原表位。2、采用密度梯度离心法分离HLA-A2．1阳性健康志愿者外周血中的单个核细胞（PBMC），用重组人细胞因子GM-CSF、IL-4及TNF-α联合诱导扩增，经形态学观察以及采用流式细胞术对细胞表面CD分子进行鉴定，成功制备了PBMC来源的成熟DC；采用标准51Cr释放实验检测Hpa（525-533）、Hpa（277-285）、Hpa（405-413）表位负载DC后诱导的肝素酶特异性CTL对不同来源肿瘤细胞的免疫杀伤效应，结果表明，肝素酶特异性CTL对肝素酶阳性且HLA-A2．1阳性的KATO-Ⅲ、U2OS和SW480细胞具有明显的杀伤效应，而对肝素酶阴性但HLA-A2．1阳性的MCF-7细胞和肝素酶阳性但HLA-A2．1阴性的HepG2细胞均不具有杀伤效应，但对转染了肝素酶全长基因的MCF-7细胞（MCF-7／Hpa）和转染了HLA-A2．1全长基因的HepG2细胞（HepG2／HLA-A2．1）重新产生明显的免疫杀伤效应，提示肝素酶抗原表位诱导的CTL反应是肝素酶特异、且受HLA-A2．1限制；用HLA-A2．1和CD8分子的单抗分别封闭靶细胞表面的HLA-A2．1位点和效应细胞表面的CD分子后再进行杀伤实验，结果表明肝素酶特异性CTL对封闭了HLA-A2．1的KATO-Ⅲ细胞无明显杀伤效应，封闭了CD8的效应细胞对KATO-Ⅲ细胞亦无明显杀伤效应，进一步提示这种杀伤效应是HLA-A2．1限制，CTL效应细胞来源于CD8阳性的T淋巴细胞；采用标准51Cr释放实验验检测上述肝素酶抗原表位诱导的肝素酶特异性CTL对自体淋巴细胞的免疫杀伤效应，结果表明肝素酶特异性CTL对自体淋巴细胞无明显杀伤效应，提示肝素酶多肽疫苗的安全性（表1）；采用ELISPOT技术检测肝素酶特异性效应细胞IFN-γ的分泌能力，结果表明，肝素酶抗原表位能促进效应细胞IFN-γ的分泌。3、用上述肝素酶表位肽负载C57BL／6-Tg（HLA-A2．1）1Enge／J小鼠骨髓来源的DC（mDC），然后免疫小鼠三次，取其脾淋巴细胞作为效应细胞，以不同来源的多种肿瘤细胞作为靶细胞，用51Cr释放法检测杀伤效应，实验结果表明，肝素酶表位特异性的CTL对肝素酶阳性且HLA-2阳性的KATO-Ⅲ、U2OS和SW480细胞具有明显的杀伤效应，而对肝素酶阴性但HLA-A2．1阳性的MCF-7细胞和肝素酶阳性但HLA-A2．1阴性的HepG2细胞均不具有杀伤效应，但对感染了肝素酶全长基因的重组腺病毒（rAd-Hpa）的MCF-7乳腺癌细胞（MCF-7／rAd-Hpa）和转染HLA-A2．1的HepG2／HLA-A2．1细胞亦重新产生明显的杀伤效应，对自体淋巴细胞和mDC亦无明显杀伤效应（表1）。ELISPOT技术检测肝素酶抗原表位能有效促进肝素酶特异性效应细胞分泌IFN-γ。[结论]1、采用超基序和量化基序法并通过体外杀伤实验从肝素酶的全长氨基酸序列中筛选出了3条HLA-A2．1限制的CTL表位，即Hpa（525-533）（PAFSYSFFV）、Hpa（277-285）（KMLKSFLKA）、Hpa（405-413）（WLSLLFKKL），以上肝素酶抗原表位与德国学者的报道不同。2、从体外及动物实验二方面证实肝素酶抗原表位Hpa（525-533）、Hpa（277-285）、Hpa（405-413）可以诱导产生肝素酶特异性CTL，对肝素酶阳性且HLA-A2．1相匹配的肿瘤细胞具有很强的免疫杀伤活性，对肝素酶阴性或HLA-A2．1阴性的肿瘤细胞不具有杀伤效应，但对转染了肝素酶或HLA-A2．1的肿瘤细胞具有杀伤效应，提示肝素酶抗原表位诱导的CTL反应是肝素酶特异且受HLA-A2．1限制，肝素酶特异性CTL主要来源于CD8阳性T淋巴细胞。3、从体外及动物实验二方面证实肝素酶特异性CTL对自体淋巴细胞和／或DC无明显的免疫杀伤活性，提示肝素酶多肽疫苗临床应用的安全性。4、从体外及动物实验二方面证实肝素酶抗原表位Hpa（525-533）、Hpa（277-285）、Hpa（405-413）负载的DC可以促进效应细胞IFN-γ释放。以上研究表明，人肝素酶特异性抗原表位[Hpa（525-533）、Hpa（277-285）、Hpa（405-413）]不仅能激发机体特异性的抗肿瘤效应，而且还能诱导一个非特异性抗肿瘤的良性循环，这种肝素酶多肽疫苗具有广谱、高效、特异、安全的优点，为肝素酶表位多肽疫苗的临床应用提供了理论依据。
杨静悦[8]（2007）在《腺病毒介导的基因修饰树突状细胞肝癌瘤苗的制备及其抗HBV相关肝癌的免疫实验的研究》文中进行了进一步梳理原发性肝癌是中国和部分亚洲地区最常见的恶性肿瘤之一,流行病学资料显示乙型肝炎表面抗原阳性人群肝癌发病率是其他人群的12-300倍。我国人群HBV的携带率在10%左右,而90%的原发性肝癌患者发现HBsAg阳性。尽管目前对原发性肝癌的治疗已取得一些进展,但对于晚期患者的治疗和预防复发及转移效果仍不理想[1～3]。因此,有必要探索一种新的、有效治疗途径。随着人类肿瘤抗原以及肿瘤抗原基因的发现和确认,为肿瘤的免疫治疗尤其是主动性免疫治疗提供了新的手段。直接作用于肿瘤特异性抗原或相关抗原的治疗性瘤苗是目前研究的热点。其抗肿瘤免疫的重要目的就是诱导针对肿瘤的特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytocoxic T lymphocyte,CTL）反应,而CTL的激活依赖于抗原提呈细胞（Antigen-presenting cell,APC）提供的抗原多肽和共刺激信号。在抗原提呈细胞中,尤以树突状细胞（Dendritic cell,DC）的抗原提呈功能最强,可启动并调节免疫应答,有效刺激T、B淋巴细胞活化,在抗肿瘤、抗感染、移植排斥以及自身免疫性疾病发病过程中起重要作用。目前DC在抗肿瘤免疫治疗方面的研究已经取得一些进展,并且在肿瘤的临床治疗上已显示其良好的治疗效果。但是由于大多数肿瘤来说,肿瘤组织中仅部分肿瘤细胞表达一种肿瘤相关抗原,针对单一肿瘤相关抗原的免疫应答无法清除所有肿瘤细胞。并且肿瘤细胞本身存在多种肿瘤相关抗原,针对单一抗原的免疫治疗有时并不能发挥其应有的作用,激发的免疫效应弱。故近来为使DC能够负载更多肿瘤抗原,发挥更大免疫治疗效应,人们研究了DC负载多种抗原的制备方法,包括:经照射的肿瘤细胞与DC共培养,肿瘤细胞来源的RNA转染DC,腺病毒介导多种肿瘤相关抗原感染DC以及多种肿瘤相关抗原肽冲击致敏DC等方法。在这些方法中以肿瘤细胞来源的RNA转染DC以及腺病毒介导多种肿瘤相关抗原感染DC最为有效,但肿瘤细胞来源的RNA具有生物活性不稳定等缺点。因此,在本研究中,我们根据中国人原发性肝癌独有的流行病学特点,应用HBV相关性肝癌中HBV病毒特异性抗原,联合肝癌相关抗原AFP作为免疫治疗靶点,制备AFP、HBsAg基因的腺病毒载体,体外转染人树突状细胞,比较HBsAg- DC、AFP-DC以及AFP / HBsAg-DC瘤苗体外对HBsAg表达的人肝癌细胞株的杀伤活性。探讨腺病毒介导的HBsAg、AFP基因共感染较单基因感染DC能否增强其体外诱导的特异性抗肿瘤免疫效应,以期选择更为有效的DC肝癌瘤苗,为原发性HBV感染肝癌的治疗寻求新的途径。第一部分:HBsAg、AFP基因重组腺病毒表达载体的构建及鉴定目的构建能高效转导HBsAg、AFP基因的重组腺病毒,进行病毒扩增和滴度测定,并检测HBsAg、AFP抗原表达,以用于DC基因治疗的实验研究。方法应用Adeno-XTM腺病毒表达载体系统分别构建表达AFP、HBsAg的重组腺病毒和对照载体Ad-GFP。目的基因首先克隆到pShuttle形成穿梭载体,用PI-SceⅠ和I-CeuⅠ双酶切后将所获HBsAg、AFP基因片段再与线性化的腺病毒载体Adeno-X连接,形成重组腺病毒质粒,再以PacⅠ酶切线性化,转染HEK293细胞包装为重组腺病毒。检测病毒滴度后,进一步对重组腺病毒分别感染HEK293和H1299细胞的结果进行IFA法检测目的基因在靶细胞中的有效表达。结果经酶切、PCR鉴定证实,穿梭质粒和重组腺病毒质粒插入片段为HBsAg、AFP基因。包装的腺病毒载体具有良好的感染性,可以在293细胞中形成病毒颗粒。滴度测定结果为Ad-S 2.65×109 PFU/ml;Ad-AFP采用同样方法测定的滴度为3.16×109 PFU/ml。重组腺病毒感染H1299细胞后IFA法检测结果显示目的基因表达于感染细胞中,表明腺病毒介导的HBsAg、AFP基因感染的有效性。结论成功构建了复制缺陷型AFP、HBsAg重组腺病毒及对照重组腺病毒Ad-GFP;重组腺病毒Ad-S、Ad-AFP能高效介导基因在被感染细胞内有效表达。第二部分:树突状细胞的体外诱导及其体外感染腺病毒效率的测定目的以经动员富集的肝癌患者外周血单个核细胞（Mono nuclear cell,MNC）为来源,建立体外诱导培养DC的方法;以健康供者MNC为对照,检测肝癌DC的形态、表型及功能;利用Ad-GFP作为研究对象,测定腺病毒介导的树突状细胞的体外转染效率。方法选择肝癌患者及正常人外周血,血细胞分离机分离富集外周血MNC,经淋巴细胞分离液梯度离心、聚苯乙烯细胞培养板贴壁纯化后,加入含GM-CSF和IL-4的X-VIVO 15培养液联合诱导DC分化,诱导d6加入TNF-α促进DC成熟。分别以倒置显微镜、电子显微镜观察DC形态变化,FCM检测细胞表型变化。利用Ad-GFP作为研究对象,测定腺病毒介导的树突状细胞的体外转染效率,MTT法检测DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力。取培养第7天的DC,按不同的MOI将重组腺病毒加入培养孔中,FCM检测细胞感染前后的表型变化以及腺病毒的感染效率。结果肝癌患者DC鉴定:诱导后,患者DC显示出典型的形态及表型特征。诱导d8（加TNF-α活化48h）,各抗原表达量明显升高,分别为:CD1a（ 71.45士4.39）%、CD11c（ 89.68士3.16）%、CD86（91.17士4.43）%、CD80 （ 91.37士4.12）%、HLA-DR（ 94.03士3.01 ）%,为典型DC表型;健康对照DC各抗原表达量为CD1a（ 68.45士5.02）%、CD11c（ 91.09士2.01）%、CD86（92.19士4.36）%、CD80 （ 90.81士3.15）%、HLA-DR（ 93.49士4.18 ）%,二者间无显着性差异（P>0.05 ）。混合淋巴细胞反应结果显示,患者DC具有高效地刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力,其刺激指数（ SI）与健康对照DC的SI无显着差异（P>0.05 ）。用Ad-GFP感染培养的DCs时,有较好的量效关系和时效关系。当感染增殖率（multiplicity of infection, MOI）为100时,感染24小时接近80.62%的DCs被转染。且转染后的DCs的形态与对照组相比无明显异常。当MOI为100,感染48小时后接近85.25%的DC被转染。并且DC经腺病毒感染DC 48小时后,FCM检测细胞表型为成熟DC表型特征。证明Ad-GFP能高效、安全感染培养的DC。结论以肿瘤患者经动员富集的外周血MNC为来源,联合应用GM-CSF、IL-4及TNF-α,在体外可诱导培养出具有典型形态、表型及免疫活性的DC。腺病毒介导的基因可感染人外周血MNC来源的DC可高效表达。第三部分:重组腺病毒介导HBsAg和AFP基因修饰树突状细胞体外诱导抗HBV相关肝癌免疫实验的研究目的以腺病毒载体介导AFP基因与HBsAg基因修饰树突状细胞,使之作为抗原呈递细胞,同时呈递HBV肝癌相关抗原AFP和HBsAg,从而诱导更强的特异性CTLs,即可对恶性肿瘤细胞发挥杀伤效应,又可诱导抗HBV免疫的作用。并探讨AFP、HBsAg基因修饰树突状细胞较单基因修饰DC瘤苗作为HBV持续感染的肝癌免疫治疗是否更具优势。方法分别以Ad-S、Ad-AFP以及Ad-S和Ad-AFP转染DC,以IFA法检测三组细胞抗原表达,以FCM检测感染后DC表型变化。以S-DC、AFP-DC与S/AFP-DC作为刺激细胞,取患者外周静脉血单个核细胞（PBMC ）中非贴壁细胞（淋巴细胞,L）,调整细胞密度为1×106/mL,以含1L-2,10%FCS的RPMI1640培养;将S-DC、AFP-DC与S/AFP-DC以5×104mL密度分别加入上述淋巴细胞中,共同孵育72h （设未致敏DC组和单独淋巴细胞组为对照）,再次加入同剂量DC孵育72h,收获细胞分别称为S/AFP-DC-L、AFP-DC-L、S-DC-L、DC-L和L。以S/AFP-DC-L、AFP-DC-L、S-DC-L、DC-L和L作为效应细胞,肝癌细胞株HepG2.2.15,SMMC-7721和人肺腺癌H1299作为靶细胞,以不同效靶比接种于96孔板,4h后LDH法测定效应细胞对各肿瘤细胞的杀伤作用。结果IFA法检测结果显示目的基因均表达于转染的三组细胞中。FCM结果显示共感染的DC细胞均高表达CD1a、CD11c、CD80、CD86和HLA-DR,表现为成熟DC表型特征。CTL结果显示S/AFP-DC-L、S-DC-L、AFP-DC-L组均显示对HepG2.2.15高效特异的杀伤活性,显着高于DC-L组和单纯L组,其杀伤能力与效应细胞数量成正比;在同一效靶比时S/AFP-DC-L对HepG2.2.15的杀伤率明显高于S-DC-L、AFP-DC-L组;而S-DC-L、AFP-DC-L组对HepG2.2.15的杀伤率无明显区别;S/AFP-DC-L、S-DC-L、AFP-DC-L刺激的T细胞组IFN-γ分泌显着高于DC刺激的L细胞组和L细胞组;但S/AFP-DC-L刺激组IFN-γ分泌显着高于S-DC-L、AFP-DC-L组;而S-DC-L、AFP-DC-L刺激组IFN-γ分泌无明显区别;对照组DC-L和L组IFN-γ分泌亦无明显区别。结论腺病毒介导AFP和HBsAg基因修饰DC,能够在体外诱导特异性CTL效应,对表达HBsAg的肝癌细胞有明显的杀伤作用,而且对HepG2.2.15细胞杀伤率大于单独转基因者。
杨晋[9]（2006）在《肝癌中HLA I类及相关分子表达研究》文中研究说明肿瘤的发病机制和机体抗肿瘤免疫效应一直是肿瘤免疫研究热点。人类白细胞抗原（HLA）在抗原递呈及细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对肿瘤细胞的识别过程中起关键作用,其中肿瘤细胞HLA I类分子表达下调或丢失是肿瘤细胞逃逸机体免疫监视的重要机制之一。研究已发现在头颈部肿瘤、乳腺癌、肺癌、结肠癌、宫颈癌、前列腺癌和黑色素瘤中存在不同程度的HLA I类分子表达的降低和缺失。本研究探讨了肝癌组织标本中HLA I类分子相关基因及蛋白的表达情况,并分析它们与临床资料间的关联性。为研究肝癌中HLA I类及相关分子的异常表达机制提供理论依据;同时还分析了肝癌细胞株中DNA甲基化与HLA I类分子异常表达的相关性。应用RT-PCR技术检测新鲜收取的肝癌和癌旁组织标本中HLA I类及相关加工分子基因表达情况;用HLA分子相关单抗,采用Western Blot及免疫组化技术检测肝癌组织中HLA I类分子重链蛋白及HLA I类分子复合物的表达情况,统计分析各相关基因和分子表达之间的关联性及其与临床资料的相关性。采用MSP技术对8株肝癌细胞系和1株肝癌癌旁细胞系的HLA I类分子重链A、B、C位点启动子区域CpG岛的甲基化状态进行分析。研究结果表明:应用半定量RT-PCR技术对36例新鲜肝癌组织及相对应癌旁组织中HLA-A、HLA-B、HLA-C、β2m、TAP-1、TAP-2、Tapasin的基因表达进行分析,癌与癌旁相比较（T/N）,各基因的表达呈上调趋势,在研究的标本中上调率分别为:47%、47%、53%、36%、44%、47%、28%,且各基因表达有显着的相关性（x2=17.63,p=0.1274）。应用精确概率统计法与临床资料相比较显示各基因表达上调与病人年龄、肿瘤大小、病理分级、是否感染乙肝病毒及丙肝病毒无显着相关性。进一步用Western Blot及免疫组化技术分析肝癌组织及相对应癌旁组织中HLA I类分子重链蛋白HLA-A、HLA-B/C及HLA I类分子复合物的表达,其表达上调趋势依然明显。上调率分别为:47%、42%、43%。用spearman等级相关分析,HLA I类复合物和相关基因的表达有显着相关性（p<0.05）。在8株肝癌细胞系中HLA I类分子重链A、C位点启动子区域CpG岛存在甲基化;将启动子区域的DNA甲基化与相关基因表达数据相比较显示二者没有关联性;在RNA干扰DNA甲基化转移酶3a或3b的肝癌细胞系SMMC7721中,比较基因干扰前后HLA I类分子重链蛋白表达无显着变化。以上研究结果提示:在肝癌组织中HLA I类分子存在着不同于其它肿瘤的异常表达模式,表达上调的比率较高。在转录水平对肝癌中HLA I类分子重链、轻链及相关加工分子基因的研究显示其表达较之癌旁有显着上调趋势,各基因表达呈高度相关性。对HLA I类分子复合物及重链蛋白的研究进一步证实肝癌中HLA I类分子上调趋势的存在,且HLA I类分子异常表达在转录水平和蛋白水平上存在显着的相关性,因此推测肝癌中对HLA I类分子异常表达的调控可能发生在相关基因转录之前。在研究的肝癌细胞系中HLA I类分子重链A、C位点启动子区域CpG岛存在甲基化,但并没有发现DNA甲基化与HLA I类分子基因表达相关性的证据,因此推测DNA甲基化没有参与调控肝癌中HLA I类分子的异常表达。
邓波[10]（2006）在《人肺腺癌细胞TGF-β1对细胞凋亡调控的实验研究》文中认为转化生长因子β1（TGF-β1）属于生长因子超家族,其生物学效应非常广泛,主要包括调节细胞增殖和分化、参与胚胎发育调节、促进细胞外基质（ECM）形成和抑制免疫反应等。TGF-β1在包括肺癌在内的多种恶性肿瘤细胞中常呈高表达,并可由癌旁基质细胞产生。目前认为,在肿瘤早期TGF-β1抑制原癌基因c-myc等,阻止细胞生长周期从G1期进入S期;而在肿瘤的中晚期（肿瘤浸润血管逐渐开始形成）,TGF-β1可通过促进血管生成、肿瘤细胞迁移、免疫抑制等途径为肿瘤的生长、浸润及转移提供适宜的微环境,使肿瘤细胞表现恶性特征。对非肿瘤细胞的观察发现,TGF-β1对细胞中Fas/FasL蛋白表达具有调控作用。Fas/FasL为重要的细胞凋亡途径,在非肿瘤细胞中TGF-β1通过上调Fas表达,从而激活Fas/FasL凋亡信息链中的凋亡蛋白酶caspase家族诱导细胞发生凋亡。另外,TGF-β1与细胞内TGF-β1受体结合后,亦能通过下游信号smad蛋白激活caspase家族引起细胞凋亡。因此,TGF-β1可看作是一个诱导细胞凋亡的细胞因子,在机体内发挥清除异常细胞的重要作用。但TGF-β1与肿瘤细胞凋亡的关系尚不明确,目前国内外鲜有肿瘤细胞中TGF-β1与Fas/FasL凋亡信号通路之间关系的研究报道。为探讨TGF-β1与肿瘤细胞凋亡的关系,本实验按如下三个部份进行研究。第一部分通过siRNA靶点序列设计软件结合Angela siRNA设计原则,设计、合成TGF-β1特异性siRNA靶点序列;再将靶点序列插入PAVU6+27质粒构建siRNA质粒;通过免疫荧光、免疫印记等方法检测转染siRNA质粒后人A549肺癌细胞株中TGF-β1的表达水平。第二部分将TGF-β1特异性小干扰RNA质粒pOligo1216和无关对照质粒pOligo Control转染肺腺癌A549细胞,检测TGF-β1 siRNA质粒转染后（即TGF-β1被静默后）,上述A549细胞中Fas/FasL分子表达与凋亡酶caspase-3、caspase-8的活性;然后通过蛋白转染剂,将TGF-β1蛋白导入A549细胞,检测细胞内TGF-β1蛋白上调后细胞中Fas/FasL分子表达与凋亡酶caspase-3、caspase-8的活性,以了解TGF-β1对人肺腺癌细胞Fas/FasL凋亡通路的影响。第三部分参照Saitoh、Crowley等学者所报告的方法,首先检测人肺腺癌A549细胞与Calu-6细胞的HLA-ABDR等位基因,再构建稳定表达HLA-A2的人肺腺癌细胞系,通过混合淋巴细胞肿瘤细胞培养（MLTC）的方法,对诱导刺激健康人PBL产生肺癌特异性CTL作了初步的研究与探索。
二、突变的肝细胞生长因子受体被肝癌细胞HLA-A2分子递呈的实验研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、突变的肝细胞生长因子受体被肝癌细胞HLA-A2分子递呈的实验研究（论文提纲范文）
（1）NLRC5对神经元中经典MHCⅠ类分子表达调控及神经元发育的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 NLRC5 在免疫调节中的作用 |
| 1 NLRC5 的结构和表达 |
| 2 NLRC5 对免疫系统中MHCⅠ类分子表达的调控 |
| 3 NLRC5 在先天免疫应答中的作用 |
| 4 NLRC5 在肿瘤免疫监视中的作用 |
| 5 小结 |
| 第二章 NLRC5 在海马神经元发育过程中的表达模式及其与经典MHCⅠ类分子的相关性 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 NLRC5 调控海马发育中经典MHCⅠ类分子的表达 |
| 第一节 NLRC5 诱导神经元中经典MHCⅠ类分子及相关分子的表达 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二节 NLRC5 调控神经元中经典MHCⅠ类分子表达的机制 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第四章 NLRC5 调控海马神经元树突分支发育 |
| 第一节 NLRC5 对海马神经元树突分支发育的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二节 NLRC5 通过经典MHCⅠ类分子调控海马神经元树突分支发育 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（2）人肝癌相关抗原SMP30联合HSP70L1修饰树突状细胞诱生CTL体外抗肝癌作用的研究（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 一、负载SMP30和HSP70L1 DC的制备和检测 |
| 1. 实验材料与设备 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞的常规培养 |
| 2.2 重组慢病毒的构建、检测 |
| 2.2.1 构建重组慢病毒 |
| 2.2.2 荧光稀释法进行病毒滴度复检 |
| 2.3 肝癌组织总蛋白的提取与检测 |
| 2.3.1 肝癌组织总蛋白的提取 |
| 2.3.2 WB检测肝癌组织中SMP30和HSP70L1蛋白表达 |
| 2.4 负载SMP30-HSP70L1 DC的制备 |
| 2.4.1 HLA-A2~+志愿者的筛选 |
| 2.4.2 DC的体外诱导培养与鉴定 |
| 2.4.3 重组慢病毒转染DC实验 |
| 2.5 肝癌组织总蛋白致敏DC |
| 2.6 各组DC的检测 |
| 2.6.1 WB检测各组DC的SMP30和HSP70L1蛋白表达 |
| 2.6.2 流式细胞术检测各组DC表面分子 |
| 2.6.3 ELISA检测各组DC细胞因子的分泌 |
| 2.7 统计学方法 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 重组慢病毒滴度复检结果 |
| 3.2 肝癌组织中SMP30和HSP70L1蛋白的表达情况 |
| 3.3 HLA-A2~+志愿者的筛选结果 |
| 3.4 人外周血DC的培养、鉴定结果 |
| 3.5 重组慢病毒转染DC的结果图 |
| 3.6 各组DC疫苗检测结果 |
| 3.6.1 各组DC的SMP30和HSP70L1蛋白的表达情况 |
| 3.6.2 各组DC表面分子的表达情况 |
| 3.6.3 各组DC细胞因子的分泌情况 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 二、CTL的体外诱导与检测 |
| 1. 实验材料与设备 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞的常规培养 |
| 2.2 T淋巴细胞的分离、培养与纯化 |
| 2.2.1 淋巴细胞的分离、培养 |
| 2.2.2 T淋巴细胞的纯化 |
| 2.2.3 流式细胞术检测T淋巴细胞的纯度 |
| 2.3 各组CTL的诱生及检测 |
| 2.3.1 CTL的激活、扩增 |
| 2.3.2 ELISA检测各组CTL细胞因子的分泌 |
| 2.3.3 CCK8法检测各组CTL的增殖 |
| 2.4 统计学方法 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 T淋巴细胞的纯度检测结果 |
| 3.2 各组CTL的检测结果 |
| 3.2.1 各组CTL细胞因子的分泌情况 |
| 3.2.2 各组CTL的增殖情况 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 三、CTL对肝癌细胞的体外杀伤实验 |
| 1. 实验材料与设备 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞的常规培养 |
| 2.2 靶细胞的准备 |
| 2.3 效应细胞的准备 |
| 2.4 CTL杀伤实验 |
| 2.5 流式细胞术检测CTL杀伤效果 |
| 2.6 统计学方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（3）AFP158-166特异性TCR转基因T细胞治疗肝癌的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、AFP_(158-166)特异性TCR转基因T细胞的构建 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 筛选基因分型HLA-A0201健康志愿者 |
| 1.2.2 建立AFP_(158-166)特异性T细胞克隆 |
| 1.2.3 克隆AFP_(158-166)特异性TCRα和TCRβ基因,构建表达特异性TCR的慢病毒载体 |
| 1.2.4 体外制备并扩增AFP_(158-166)特异性TCR转基因T细胞 |
| 1.2.5 AFP_(158-166)特异性TCR转基因T细胞功能检测 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 肝细胞肝癌的生物治疗 |
| 1.3.2 AFP在肝细胞肝癌诊治中的意义 |
| 1.3.3 人树突细胞的培养与生物学功能 |
| 1.3.4 抗原特异性T细胞的激活增殖与检测分离 |
| 1.3.5 TCR多样性及AFP_(158-166)抗原特异性TCR基因克隆 |
| 1.3.6 AFP_(158-166)特异性TCR转基因T细胞的体外制备和功能检测 |
| 1.4 小结 |
| 二、AFP_(158-166)抗原肽与IL-15协同表达人工抗原递呈细胞的构建 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 流式细胞术鉴定BJAB细胞表型 |
| 2.2.3 辐照对BJAB细胞表型,增殖及存活影响 |
| 2.2.4 质粒CS-CDF-EF-1-afpIL15-PRE(JA15)浓度 |
| 2.2.5 质粒CS-CDF-EF-1-afpIL15-PRE(JA15)的鉴定 |
| 2.2.6 质粒CCS-IL15-Lv201的鉴定 |
| 2.2.7 荧光倒置显微镜评估细胞转染情况 |
| 2.2.8 FCM评估细胞转染情况 |
| 2.2.9 ELISA检测BA15对IL-15表达 |
| 2.2.10 BA15对eGFP,IL-15与AFP158-166抗原肽的稳定表达 |
| 2.2.11 BA15体外刺激AFP特异性T细胞克隆性增殖 |
| 2.2.12 AFP特异性T细胞对AFP~+肝癌细胞特异性杀伤作用 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 人工抗原提呈细胞与肿瘤特异性T细胞过继性免疫治疗 |
| 2.3.2 IL-15与肿瘤特异性T细胞过继性免疫治疗 |
| 2.3.3 AFP抗原与IL-15协同表达人工抗原递呈细胞的构建和鉴定 |
| 2.4 小结 |
| 三、AFP_(158-166)特异性转基因T细胞过继性免疫治疗的实验研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 体外实验 |
| 3.2.2 体内实验 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 肿瘤特异性TCR转基因T细胞免疫治疗进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（4）AFP158-166特异性T细胞的检测及体外诱导的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 第一部分 肝细胞癌患者外周血AFP_(158-166)特异性T细胞的检测 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验对象和材料 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 临床资料 |
| 1.2.2 流式检测T细胞分化抗原 |
| 1.2.3 流式检测AFP_(158-166)特异性T细胞 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 肝癌流行病学 |
| 1.3.2 AFP在肝癌诊治中的意义 |
| 1.3.3 T细胞亚群与肿瘤患者机体细胞免疫 |
| 1.3.4 AFP特异性T细胞的检测 |
| 1.3.5 体外培养AFP特异性T细胞的需求 |
| 1.4 小结 |
| 第二部分 甲胎蛋白抗原表位肽AFP_(158-166)特异性T细胞的体外刺激与培养 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验对象和材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 筛选基因分型为HLA-A0201的志愿者 |
| 2.2.2 T2的培养与鉴定 |
| 2.2.3 DC的培养与鉴定 |
| 2.2.4 体外诱导的AFP特异性T细胞克隆增殖结果 |
| 2.2.5 五聚体检测激活的AFP_(158-166)特异性T细胞 |
| 2.2.6 活化淋巴细胞对靶细胞的杀伤作用 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 HLA-A0201限制性AFP_(158-166)选择的治疗意义 |
| 2.3.2 人树突状细胞(DC)体外培养与鉴定 |
| 2.3.3 致敏DC的主要方法 |
| 2.3.4 AFP抗原肽特异性T细胞的激活与增殖 |
| 2.3.5 展望 |
| 2.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文及参加科研情况 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（5）基于点突变Survivin表位肽的TCR基因筛选及抗肝癌作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 点突变Survivin抗原表位的生物信息学分析及肽-MHC的稳定性检测 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 参考文献 |
| 第二章 点突变Survivin表位肽诱导的抗肝癌特异性CTLs的建立 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 参考文献 |
| 第三章 基于点突变Survivin表位肽的TCR基因筛选与抗肝癌功能初步研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间成果 |
| 致谢 |
| 毕业论文统计学审稿证明 |
（6）基于T细胞表位肽的树突细胞介导的靶向性细胞杀伤机制的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 研究内容 |
| 第一部分 T 细胞表位肽的设计与筛选 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 T 细胞表位肽的鉴定、修饰及合成 |
| 1 材料与设备 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 人外周血单核细胞来源的树突细胞转化平台搭建 |
| 1 材料和设备 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第四部分 DC 介导的靶向性杀伤功能及机制的初步探讨 |
| 1 材料和设备 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（7）肝素酶HLA-A2.1限制性CTL表位的预测、鉴定及其抗肿瘤的免疫效应研究（论文提纲范文）
| 中英文缩写对照 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 肝素酶HLA-A2.1限制性CTL表位的预测、鉴定及其抗肿瘤的免疫效应研究 |
| 第一章 肝素酶HLA-A2.1限制性CTL表位的预测及初步鉴定 |
| 前言 |
| 第一节 肝素酶来源HLA-A2.1 CTL表位的预测 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 第二节 肝素酶来源HLA-A2.1 CTL表位的分子模拟 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 第三节 肝素酶HLA-A2.1 CTL预测表位的合成及鉴定 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 第四节 肝素酶HLA-A2.1限制性CTL表位的亲和力分析 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 第五节 肝素酶HLA-A2.1限制性CTL表位的实验鉴定 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 肝素酶CTL表位负载的树突状细胞疫苗体外免疫效应研究 |
| 前言 |
| 第一节 外周血来源树突状细胞的分离、培养及鉴定 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 第二节 肝素酶CTL表位负载的DC疫苗体外抗肿瘤免疫效应研究 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 肝素酶CTL表位负载的树突状细胞疫苗诱导小鼠体内肝素酶特异性CTL反应的研究 |
| 前言 |
| 第一节 小鼠骨髓来源的DC分离、培养及鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 第二节 肝素酶CTL表位负载的树突状细胞疫苗诱导小鼠体内肝素酶特异性CTL反应的研究 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 照片 |
| 文献综述 CTL表位多肽疫苗抗肿瘤研究进展 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表文章及专利申请情况 |
（8）腺病毒介导的基因修饰树突状细胞肝癌瘤苗的制备及其抗HBV相关肝癌的免疫实验的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言和文献回顾 |
| 正文 |
| 1 人HBsAg、AFP基因Adeno-X~(TM)腺病毒表达载体的构建及鉴定 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料 |
| 1.3 仪器设备 |
| 1.4 方法 |
| 1.5 结果 |
| 1.6 讨论 |
| 1.7 结论 |
| 2 树突状细胞的体外诱导及其体外感染腺病毒效率的测定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 3 重组腺病毒介导HBsAg和AFP基因修饰树突状细胞体外诱导抗HBV相关肝癌免疫实验的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 结 果 |
| 3.5 讨 论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历 |
| 发表论文 |
| 致谢 |
（9）肝癌中HLA I类及相关分子表达研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要英文缩写词 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述:肿瘤细胞逃逸 T 细胞免疫监视机制的研究进展 |
| 第二章 肝癌组织中 HLA I 类及相关分子表达和临床意义 |
| 第一节 肝癌组织中 HLA I 类及相关分子mRNA 表达研究 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 第二节 肝癌组织中 HLA I 类重链蛋白及复合物表达的研究 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 第三章 肝癌细胞中 HLA I 类基因表达与启动子区域甲基化相关性的初步研究 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 作者在读期间发表论文清单 |
| 致谢 |
（10）人肺腺癌细胞TGF-β1对细胞凋亡调控的实验研究（论文提纲范文）
| 缩写词表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 人肺腺癌细胞TGF-β1对细胞凋亡调控的实验研究 |
| 前言 |
| 第一部分 载体介导RNAi抑制TGF-β1在肺癌细胞株中表达 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 TGF-β1对肺癌细胞Fas/FasL凋亡通路的影响 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 构建稳定表达HLA-A2 的人肺癌细胞系诱生肺癌特异性T 淋巴细胞的初步研究与探讨 |
| 分题一 肺腺癌细胞系A549、Calu-6 的HLA-ABDR 等位基因检测 |
| 实验方法 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 分题二 HLA-A*0201 cDNA在肺腺癌细胞A549中的瞬时与稳定表达 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 分题三 肿瘤特异性T 淋巴细胞杀伤肺腺癌A549 细胞的初步研究与探讨 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 图片 |
| 参考文献 |
| 文献综述 转化生长因子β信号通路对肿瘤影响的研究进展 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表主要论文 |
四、突变的肝细胞生长因子受体被肝癌细胞HLA-A2分子递呈的实验研究（论文参考文献）
- [1]NLRC5对神经元中经典MHCⅠ类分子表达调控及神经元发育的影响[D]. 李萍. 东南大学, 2020(01)
- [2]人肝癌相关抗原SMP30联合HSP70L1修饰树突状细胞诱生CTL体外抗肝癌作用的研究[D]. 张瑶尧. 广西医科大学, 2019(08)
- [3]AFP158-166特异性TCR转基因T细胞治疗肝癌的实验研究[D]. 孙龙昊. 天津医科大学, 2014(01)
- [4]AFP158-166特异性T细胞的检测及体外诱导的实验研究[D]. 张振松. 天津医科大学, 2013(02)
- [5]基于点突变Survivin表位肽的TCR基因筛选及抗肝癌作用研究[D]. 沈晗. 南方医科大学, 2013(03)
- [6]基于T细胞表位肽的树突细胞介导的靶向性细胞杀伤机制的研究[D]. 罗进. 第四军医大学, 2008(01)
- [7]肝素酶HLA-A2.1限制性CTL表位的预测、鉴定及其抗肿瘤的免疫效应研究[D]. 陈婷. 第三军医大学, 2007(04)
- [8]腺病毒介导的基因修饰树突状细胞肝癌瘤苗的制备及其抗HBV相关肝癌的免疫实验的研究[D]. 杨静悦. 第四军医大学, 2007(04)
- [9]肝癌中HLA I类及相关分子表达研究[D]. 杨晋. 东南大学, 2006(04)
- [10]人肺腺癌细胞TGF-β1对细胞凋亡调控的实验研究[D]. 邓波. 第三军医大学, 2006(11)