一、人类TAP2基因克隆及其核表达质粒的构建（论文文献综述）
曹增国[1]（2021）在《SARS-CoV-2编码蛋白抑制宿主Ⅰ型干扰素应答机制研究》文中提出新型冠状病毒病（Coronavirus disease 2019,COVID-19）,又称新型冠状病毒肺炎,是由新型冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）感染引起的、以肺炎为主要临床症状的、严重威胁人类健康及公共卫生安全的重要人兽共患传染病。时至今日,其感染人数和流行区域的空间范围已遍及全球,并演变为全球大流行。SARS-CoV-2在病毒分类学上属于冠状病毒科β冠状病毒属,该属病毒还包括在2002年出现的严重急性呼吸系统综合征冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV）和在2012年出现的中东呼吸系统综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV）,此三种病毒均可感染多种动物以及人类,并引起致死性呼吸系统疾病,这也使得冠状病毒成为21世纪严重影响全人类公共健康发展的主要阻力之一。此外,亦有4种地方流行性冠状病毒（分别为OC43、229E、NL63和HKU1）可感染人类,引起感冒等呼吸道疾病。SARS-CoV-2基因组为单股正链RNA,长约29.9 kb,被包装于直径约80 nm的病毒内腔中,可编码16个非结构蛋白（NSP1-16）、4个结构蛋白（S、E、M和N）以及若干个辅助蛋白（如ORF3a、ORF3b、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8及ORF10等）。在SARS-CoV-2的生命周期中,非结构蛋白构成病毒复制酶参与病毒复制及RNA合成;结构蛋白负责形成病毒粒子并参与病毒感染;辅助蛋白与病毒毒力及致病机制密切相关,并参与调控病毒感染和免疫应答。作为宿主天然免疫的重要组成部分,干扰素应答参与构成了宿主机体抗病原微生物（如病毒）感染的第一道防线。干扰素是一类具有强大功能的细胞因子,可通过控制炎症反应、协调免疫应答直接诱导机体的抗病原微生物免疫应答,从而抵抗外来病原的入侵和感染。病毒感染诱导产生的干扰素可经由不同的信号转导途径,最终导致数百种干扰素刺激基因（IFN-stimulated genes,ISGs）的转录和表达,并进一步发挥抗病毒感染的作用。为阐明SARS-CoV-2编码蛋白在宿主I型干扰素应答（包括I型干扰素的产生及I型干扰素的信号转导）中的作用,并解析其作用的分子机制,本研究分别将SARS-CoV-2编码蛋白克隆至真核表达载体,转染HEK293T细胞,以体外表达病毒编码蛋白。随后逐一检测SARS-CoV-2各编码蛋白对宿主I型干扰素产生及信号转导通路的影响。随后,以对宿主I型干扰素应答具有抑制作用的SARS-CoV-2编码蛋白为研究对象,从“病毒-宿主”相互作用的角度,简单解析了其发挥抑制作用的分子机制。结果如下:（1）在I型干扰素产生通路中,3个非结构蛋白（NSP1、NSP6和NSP13）和1个辅助蛋白（ORF6）具有显着的抑制作用。其中,NSP6通过结合TANK结合激酶1（TANK binding kinase 1,TBK1）而下调干扰素调节因子3（Interferon Regulatory Factor 3,IRF3）的磷酸化水平,最终抑制IFN-β的产生通路,但NSP6与TBK1的结合并不会影响TBK1的磷酸化;NSP13通过结合TBK1并下调其磷酸化的方式,抑制IRF3的磷酸化激活,进而导致IFN-β的产生通路受到抑制;ORF6通过结合核转运受体蛋白KPNA2而抑制IRF3的入核转运,最终导致IFN-β的产生通路受到抑制。（2）在I型干扰素信号转导通路中,NSP1、NSP6、NSP7、NSP13、NSP14、ORF3a、M、ORF6、ORF7a、ORF7b均可显着抑制I型干扰素的信号转导通路。其中,NSP1、NSP6、NSP13、ORF3a、M及ORF7b通过下调信号转导和转录激活因子1（Signal transducer and activator of transcription proteins 1,STAT1）的磷酸化以抑制I型干扰素的信号转导通路;NSP6、NSP13、ORF7a及ORF7b通过下调STAT2磷酸化以抑制I型干扰素的信号转导通路;ORF6通过结合核转运受体蛋白KPNA2以限制STAT1的入核,并最终导致I型干扰素信号转导通路受到抑制。泛素作为重要的宿主因子,参与先天免疫的调节。而蛋白质泛素化是一种蛋白质翻译后修饰方式,在许多生物学过程中发挥着重要作用。以上述具有抑制宿主I型干扰素应答功能的SARS-CoV-2编码蛋白作为研究对象,研究泛素化在其抑制宿主I型干扰素应答中的作用。结果发现:NSP13、ORF3a和ORF7a均存在泛素化修饰。通过对ORF7a泛素化修饰特性分析可得,SARS-CoV-2 ORF7a主要在第119位赖氨酸残基处发生K63多聚泛素化修饰。随后经过点突变,以丙氨酸（Alanine,A）替代第119位赖氨酸（Lysine,K）,构建ORF7a泛素化缺陷型突变（ORF7a-K119A）。并比较其与野生型ORF7a（ORF7a-WT）在抑制I型干扰素信号转导方面的差异,最终证明SARS-CoV-2 ORF7a通过泛素化修饰增强其抑制STAT2磷酸化的能力,从而加强其对宿主I型干扰素信号转导通路的抑制作用。基于SARS-CoV-2反向遗传学系统,通过分子生物学手段将海肾荧光素酶（Renilla luciferase,Rluc）基因插入并替换SARS-CoV-2（毒株2019-n CoV/USAWA1/2020）全基因组第21,563-28,259位核苷酸（包括结构蛋白基因S、M、E及辅助蛋白基因ORF3a、ORF3b、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8）,成功构建了SARS-CoV-2复制子系统。随后使用可有效抑制SARS-CoV-2复制的药物瑞德西韦（Remdesivir）验证了该复制子系统的实用性,结果证明该复制子系统可以作为一种有效的工具,在抗病毒药物筛选及评价不同环境下病毒复制能力中的实用性。最后本研究将该复制子系统应用于比较三种高致病性冠状病毒（SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV）NSP1和NSP6抑制宿主I型干扰素信号转导活性对病毒复制效率的影响中,证明了SARS-CoV-2非结构蛋白NSP1、NSP6在抑制宿主I型干扰素信号转导中具有较高的活性,而这可能最终导致了SARS-CoV-2具有比SARS-CoV和MERS-CoV更强的复制能力。综上所述,本研究筛查了SARS-CoV-2对宿主I型干扰素应答具有抑制作用的蛋白,并从“病毒-宿主”相互作用的角度,分别解析了各个病毒蛋白在I型干扰素产生和信号转导中发挥抑制作用的分子机制,为冠状病毒疫苗研发及抗病毒药物筛选提供了理论依据。此外,本研究还建立了携带海肾荧光素酶报告基因的复制子系统,降低了相关研究的安全等级,有利于相关研究在普通实验室的开展。
蔡梦露[2]（2021）在《牛肠道病毒非结构蛋白3C单抗的制备及其检测病毒抗原的应用》文中研究表明肠道病毒（Enterovirus,EV）属于小RNA病毒科肠道病毒属的成员,它所引起的感染严重危害人类的健康和养殖业的发展。目前,肠道病毒分为12个肠道病毒种和3个鼻病毒种;其中,E种和F种肠道病毒主要感染牛,引起牛临床上呈现发热、咳嗽、严重腹泻、黏膜炎症以及繁殖障碍等症状。HY12毒株是由本实验室于2012年从吉林省某牛场的病牛体内分离到的国内首株E种肠道病毒,其研究虽然取得了较多进展,但有关该病毒编码的非结构蛋白的研究较为缺乏。本研究应用RT-PCR技术扩增出HY12毒株非结构蛋白3C的基因序列,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1,构建了重组表达质粒pGEX-4T-1-3C,通过IPTG诱导表达和尿素纯化包涵体的方法纯化得到重组蛋白,并以此作为抗原免疫健康的BALB/c小鼠,经3次免疫后,采集其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经过筛选和亚克隆等过程获得了能够稳定表达3C单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株,将其命名为3C9。对该单克隆抗体进一步的鉴定结果表明,该单克隆抗体具有较好的反应原性和反应特异性。以获得的3C单克隆抗体为基础,建立了检测牛肠道病毒抗原的免疫过氧化物酶单层细胞试验（Immunoperoxidase monolayer assay,IPMA）,确定出该方法的最佳反应条件:一抗最佳稀释倍数为1:150及最佳反应时间为60 min、酶标二抗的最佳稀释倍数为1:1500及最佳反应时间为60 min。特异性、敏感性和重复性的实验结果表明,本研究所建立的IPMA方法具有特异、敏感、快速、重复性好和操作简单等优点,且与间接免疫荧光试验（Indirect immunofluorescence assay,IFA）有较高的符合率。以建立的IPMA方法对本实验室现有的E种、F种和G种肠道病毒进行了检测,结果表明本方法可用于检测E种、F种肠道病毒。综上,本研究基于3C单克隆抗体建立的IPMA方法为今后牛肠道病毒感染的检测、检疫及防控提供了一种新的有效手段。
洪素娟[3]（2021）在《微囊藻碱性磷酸酶PhoX的鉴定及其基因工程抗体的筛选》文中进行了进一步梳理
陈浩田[4]（2021）在《鸭Mx基因转录本的鉴定及鸭甲型肝炎病毒1/3型诱导鸭胚Mx基因表达模式的分析》文中提出
梁玫岩[5]（2021）在《新疆南部地方品种绵羊KAP13.3和KRT17基因的表达分析》文中研究表明【目的】本研究旨在对KAP13.3和KRT17基因在和田羊和卡拉库尔羊中进行初步的探究,为后续开展基因调控蛋白,改善南疆地方品种绵羊羊毛品质打下基础。【方法】本试验提取和田羊和卡拉库尔羊的总RNA,反转录获得模板c DNA;（1）用实时荧光定量PCR的方法对KAP13.3和KRT17基因在和田羊和卡拉库尔羊中表达量的差异进行分析;（2）设计KAP13.3和KRT17基因的原核引物进行PCR,胶回收产物连接p MD19-T载体,构建重组克隆质粒p MD19-T-KAP13.3和p MD19-T-KRT17,与pET-28a载体连接构建原核重组表达质粒pET-28a-KAP13.3和pET-28a-KRT17,在构建的原核表达系统中通过IPTG诱导表达蛋白,对蛋白进行Western Blot的检测;（3）设计KAP13.3和KRT17基因的真核引物,PCR克隆目的基因,与表达载体pEGFP-N1连接构建真核重组表达质粒pEGFP-N1-KAP13.3和pEGFP-N1-KRT17,将其转染哺乳动物HEK293细胞,观察荧光,Western Blot对蛋白进行检测分析。【结果】（1）KAP13.3基因在平原型和田羊和山区型和田羊之间表达差异显着（P<0.05）,在平原型和田羊和卡拉库尔羊之间表达差异不显着（P>0.05）,在山区型和田羊和卡拉库尔羊之间表达差异显着（P<0.05）。KRT17基因在平原型和田羊和山区型和田羊之间表达差异显着（P<0.05）,在平原型和田羊和卡拉库尔羊之间表达差异显着（P<0.05）,在山区型和田羊和卡拉库尔羊之间表达差异不显着（P>0.05）;（2）KAP13.3基因原核表达蛋白约为17.27 KDa;KRT17基因原核表达蛋白约为48.62 KDa;（3）KAP13.3基因真核表达蛋白约为46.09 KDa;KRT17基因真核表达蛋白约为77.76 KDa。【结论】（1）KAP13.3基因在山区型和田羊中表达量最多,平原型和田羊和卡拉库尔羊中表达量相差不大。KRT17基因在山区型和田羊和卡拉库尔羊中表达量相差不大,在平原型和田羊中表达量最少;（2）KAP13.3和KRT17基因在和田羊和卡拉库尔羊中构建的原核表达系统能够表达出目的蛋白;（3）KAP13.3和KRT17基因构建的真核重组表达质粒转染HEK293细胞观察到绿色荧光,并且在和田羊和卡拉库尔羊中构建的真核表达系统中表达出蛋白。
谢晶莹[6]（2021）在《IFITM2抑制PRV增殖及PRV US3对其产生的拮抗机制研究》文中研究表明伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）可以感染不同年龄段的猪,并导致母猪繁殖障碍。妊娠母猪感染后常发生流产、产木乃伊胎和死胎等,给养猪业带来极大危害。通过对89个猪流产胎儿进行PRV g E基因的检测,结果发现PRV感染率高达12.4%,而且春冬季的感染率较高,说明PRV与流产关系巨大。但PRV的感染机制以及致流产的机制仍不清楚,因此有必要深入研究PRV引起母猪繁殖障碍的机制,降低胎儿及仔猪的死亡率,确保养猪的经济收益。干扰素诱导的跨膜蛋白（Interferon-induced Transmembane proteins,IFITMs）是一类小分子蛋白,可帮助宿主抵抗病原微生物的感染,并在此过程中发挥生物活性。近年来已有多个研究证明人源和鼠源的IFITMs可以抵御多种RNA病毒的感染,但对于猪源IFITM蛋白抑制病毒感染方面研究较少。因此,本研究主要为了探索猪源IFITM2蛋白在PRV感染宿主细胞过程中扮演的角色,以及PRV US3蛋白拮抗IFITM2抗病毒作用的相关机制。经过一系列研究,获得了如下研究结果:（1）猪源IFITM2蛋白对PRV增殖的影响。在PK15细胞中,IFN-α2a刺激可有效诱导猪源IFITM1、IFITM2和IFITM3蛋白的表达。以刺激后PK15细胞的c DNA为模板,成功扩增得到IFITM1、IFITM2和IFITM3基因,并构建表达载体p CMV-Myc-IFITMs。表达质粒可在PK15细胞中瞬时过表达,然后进行PRV感染实验,做进一步的抗病毒研究。结果发现IFITM蛋白可有效抑制病毒在PK15细胞内的增殖。在对干扰素抗病毒作用研究中,采用RNAi技术下调IFN-α2a诱导的IFITM2蛋白表达,然后进行PRV感染实验,发现病毒感染增强,即IFN的抗病毒作用减弱。这些结果进一步说明猪源IFITM2蛋白可有效抑制PRV在宿主细胞内增殖,同时与IFN的抗病毒作用相关。（2）IFITM2蛋白抑制PRV增殖的机制研究。为了探索IFITM2蛋白抑制PRV增殖的相关机制,进一步研究了IFITM蛋白对PRV吸附和进入过程的影响,发现IFITM1、IFITM2和IFITM3蛋白均可显着抑制PRV的进入过程,其中IFITM2对病毒的吸附过程也发挥抑制作用。RNAi IFITM2蛋白表达对细胞活力无影响,但病毒的吸附和进入过程明显增强,提示IFITM2蛋白在病毒感染时维持细胞的抗病毒活性方面发挥一定的作用。胆固醇消耗剂MβCDX以及抑制剂PF429242处理细胞后,PRV感染降低,说明PRV感染细胞与胆固醇途径有关。应用PF429242处理过表达IFITM2细胞,然后验证对病毒的抑制作用,研究发现IFITM2对病毒吸附、进入以及复制过程的抑制作用明显减弱,说明IFITM2抑制PRV增殖与胆固醇途径有关。（3）PRV及其US3蛋白对I型干扰素信号通路的影响。在PK15细胞中,研究发现PRV对稳定表达的IFITM2无影响,但会抑制IFN-α2a诱导的IFITM2表达,说明PRV可能干扰I型干扰素信号通路。通过对转染poly（I:C）并感染PRV的PK15细胞进行RT-q PCR检测发现PRV感染会抑制poly（I:C）激发的IFN-β的活化。进一步筛选可能抑制IFN-β转录的病毒蛋白,发现病毒蛋白ICP0、UL24、UL26、UL41和US3均对IFN-β转录有明显的抑制作用,其中US3蛋白抑制作用最强。PRV感染宿主细胞,病毒核酸可被c GAS-STING信号通路相关蛋白识别,本研究进一步验证US3蛋白对c GAS、STING、TBK1和IRF3基因以及蛋白水平表达的影响,发现US3可以抑制c GAS、STING和IRF3的m RNA水平和蛋白水平表达。（4）US3蛋白抑制I型干扰素信号通路的机制研究。通过瞬时过表达US3蛋白发现US3抑制c GAS-STING、TBK1和IRF3介导的IFN-β活化,这一结果说明US3靶向IRF3或者IFR3下游因子拮抗IFN-β活化。进一步分析US3是如何抑制IFN-β活化的,Co-IP实验证明US3与IRF3之间存在相互作用,而且核质分离实验发现US3会抑制IRF3入核的过程。IRF3入核需与输入蛋白KPNA3和KPNA4互作,首先验证了US3是否影响输入蛋白的表达,发现US3对KPNA3和KPNA4的表达无影响。Co-IP实验证实IRF3蛋白与KPNA3和KPNA4之间存在相互作用,但在US3存在的情况下,这种相互作用减弱,更有趣的是US3与KPNA4之间存在相互作用。这些结果证实了以下猜想:US3通过与IRF3竞争结合KPNA4抑制IRF3入核进而抑制IFN-β活化以及下游一系列ISGs的表达。综上所述,本研究证明了猪源IFITM1、IFITM2和IFITM3蛋白具有抗病毒作用,并参与IFN-α2a介导的抗病毒防御,而且IFITM2蛋白的抗病毒作用与胆固醇途径相关。并初步探讨了PRV US3蛋白逃逸IFITM2抗病毒的机制,PRV US3蛋白可通过降解c GAS、STING和IRF3抑制c GAS-STING通路介导的IFN-β活化;US3与IRF3竞争结合KPNA4抑制IRF3入核,阻碍I型干扰素的表达。这些结果有助于探讨IFITM2蛋白作为抗病毒药物的潜在应用价值,同时为预防和控制猪繁殖障碍性疾病提供科学资料。
郑慧军[7]（2021）在《鸭E3泛素连接酶TRIM35调控鸭RLRs信号通路的机制研究》文中认为TRIM35（Tripartite motif protein 35,TRIM35）是E3泛素连接酶三方基序家族蛋白的成员,也称为HLS5或MAIR,具有E3泛素连接酶的功能,在调控RIG-I信号通路中发挥着重要作用。TRIM家族蛋白中的许多成员已被报道是天然免疫和抗病毒反应中的重要调节因子,在诱导干扰素和促炎细胞因子的过程中起着重要作用。哺乳动物的TRIM35已被证明在癌症、细胞死亡和先天性抗病毒免疫反应中起着至关重要的作用,它不仅诱导转染细胞凋亡,而且抑制肿瘤细胞的生长、克隆形成和致瘤性。然而禽TRIM35在抗病毒天然免疫反应中的作用仍不清楚,本研究通过克隆鸭TRIM35（du TRIM35）基因,揭示了du TRIM35在调节鸭抗病毒天然免疫反应中的作用,丰富了鸭源病毒逃逸天然免疫反应的分子机制。主要内容如下:1.Du TRIM35的克隆及其对VSV和DTMUV增殖的影响本研究首次克隆得到了du TRIM35的全长c DNA,采用氨基酸序列比对和遗传进化分析,发现du TRIM35与鹅的亲缘关系最近。通过荧光定量RT-PCR分析发现du TRIM35在鸭的肝脏、心脏、小脑和胰腺中表达丰度较高。采用荧光定量RT-PCR、Western Blot和TCID50等方法发现Se V、VSV和DTMUV感染鸭胚成纤维细胞（DEFs）后,du TRIM35的表达水平显着上调;超表达du TRIM35显着提高VSV和DTMUV在DEFs中的增殖水平,而干扰内源性的du TRIM35则显着降低VSV、DTMUV在DEFs中的增殖滴度。2.Du TRIM35抑制Se V和du RIG-I诱导的IFN-β产生通过双荧光素酶和荧光定量RT-PCR分析发现du TRIM35显着抑制Se V诱导的IFN-β产生及Viperin、PKR和CCL5等ISG的表达。为了进一步筛选du TRIM35抑制RLRs信号通路的关键靶点,将du TRIM35真核表达质粒与RLRs信号通路中关键信号分子（du RIG-I、du MDA5、du MAVS、du TBK1、du IKKε、du IRF7）的真核表达质粒共转染DEFs,发现du TRIM35显着抑制鸭RIG-I（du RIG-I）诱导的IFN-β、IRF7和NF-κB启动子的活性,并呈剂量依赖性。3.Du TRIM35通过靶向du RIG-I抑制IFN-β产生通过免疫共沉淀实验发现du TRIM35与du RIG-I相互作用,通过构建du TRIM35和du RIG-I各结构域的截短突变体,发现du TRIM35蛋白N端的RING结构域与du RIG-I的CARD结构域是它们相互作用的关键结构域。4.Du TRIM35通过干扰du RIG-I与ds RNA结合,从而拮抗IFN-β的产生本研究将du TRIM35真核表达质粒分别与RLRs信号通路中关键信号分子（du RIG-I、du MDA5、du MAVS、du TBK1、du IKKε、du IRF7）的真核表达质粒共转染293T细胞,通过Western Blot检测发现du TRIM35不通过泛素-蛋白酶体途径降解du RIG-I。然而RNA结合实验发现du TRIM35蛋白能够干扰du RIG-I与ds RNA的结合,抑制du RIG-I诱导的IFN-β产生。综上所述,本研究首次揭示了du TRIM35在调控鸭天然免疫反应中的作用,发现du TRIM35可以促进VSV和DTMUV等病毒的增殖;du TRIM35通过靶向du RIG-I抑制Se V和du RIG-I诱导的IFN-β产生;du TRIM35通过干扰du RIG-I与ds RNA结合,从而拮抗IFN-β产生。本研究揭示了du TRIM35在调节鸭抗病毒天然免疫反应中的作用,丰富了鸭源病毒逃逸天然免疫反应的分子机制。
陈芸[8]（2021）在《弓形虫抗氧化损伤基因的筛选及功能研究》文中研究表明刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种专性胞内寄生的顶复门原虫,可感染几乎所有温血动物的有核细胞,严重危害人和其他动物的健康。当受到弓形虫感染时,宿主启动天然免疫并激活免疫细胞产生大量活性氧（ROS）,通过诱导氧化应激发挥抗弓形虫作用。弓形虫的抗氧化系统在抵御宿主氧化应激过程中发挥重要作用。但目前对抗氧化系统的研究仍不全面,对抵抗活性氧应激反应中起作用的关键基因仍然知之甚少。本试验利用CRISPR/Cas9全基因组筛选技术筛选并鉴定与抗氧化相关的新基因,并初步探索新基因的生物学功能,为进一步研究弓形虫抵抗氧化应激的作用机制提供依据。为确定H2O2对细胞及弓形虫的最佳作用浓度及时间,本研究用含不同浓度H2O2（100、200、300、400、500、600、800μM）的完全培养基培养Vero细胞,利用CCK-8测定H2O2对Vero细胞的毒性,并通过DCFH-DA荧光探针测定安全浓度下Vero细胞内的活性氧水平,确定了H2O2对Vero细胞的最佳作用浓度为200μM。以RH株,ROP5基因缺失株及TR基因缺失株为试验虫株,评估H2O2对弓形虫活力的影响,以确定H2O2对弓形虫的最佳孵育时间,结果显示30 min为H2O2最佳作用时间。在培养基中添加H2O2,评估H2O2对细胞内弓形虫增殖能力的影响,结果表明200μM H2O2可显着抑制细胞内TR-KO株的增殖。因此以200μM H2O2孵育弓形虫30 min,并在培养基中添加H2O2作为筛选抗氧化相关基因的条件。利用CRISPR/Cas9全基因组筛选技术筛选并鉴定抗氧化基因。本研究通过共转染p Cas9-CAT和p Cas9-decoy至弓形虫RH株体内,成功构建持续表达Cas9的RH/Cas9虫株。将sg RNA质粒文库电转至RH/Cas9虫株,经息疟定筛选后,获得弓形虫基因缺失株库;按照上述筛选条件,利用200μM H2O2筛选与抗氧化功能相关的基因。分析sg RNA的富集与丢失情况,选择5个编码假定蛋白（HPs）的基因进行验证。以RH/Cas9虫株为亲本虫株,构建了5个未知基因的基因缺失株（HPs-KO）,验证其对H2O2的敏感性,并测定各虫株的抗氧化能力、入侵及增殖能力,对小鼠的毒力。结果表明,HPs的缺失均不同程度地增加弓形虫对H2O2的敏感性,且与其他缺失株相比,HP1-KO对H2O2最敏感。各缺失株的抗氧化能力、入侵及增殖能力、对小鼠的毒力均降低于RH株。为进一步研究HP1的功能,构建了HP1的原核表达质粒p ET-32a-HP1,并制备多克隆抗体。利用间接免疫荧光对HP1进行定位分析,并利用鼠多抗体进行Co-IP和质谱分析。以RH株构建HP1基因缺失株（HP1-KO）,并构建HP1互补株（HP1-CO）,利用RNA-seq技术分析HP1缺失对虫体内相关基因表达量的影响。结果表明,HP1定位于弓形虫细胞膜上;质谱结果发现与HP1相关的蛋白主要参与核糖体及多种代谢途径,如糖酵解/糖异生、磷酸戊糖途径、谷胱甘肽代谢等。RNA-seq测序结果表明,与RH株相比,HP1缺失株中有710基因差异表达,其中上调的基因有48个,下调的基因有662个,且差异基因主要富集于细胞过程、代谢过程、催化活性和结合,KEGG分析发现,差异基因主要参与Jak-STAT信号通路、磷脂酰肌醇信号系统、细胞衰老、脂肪酸生物合成等。由上述结果表明HP1主要影响弓形虫的代谢过程,与CAT分解H2O2的能力不同。因此,在HP1-KO株基础上,构建HP1与CAT的双基因缺失株（HP1/CAT-KO）,测定HP1/CAT-KO对H2O2的敏感性,分析其在小鼠体内的增殖情况及对小鼠的毒力。结果表明HP1/CAT-KO对H2O2的敏感性显着高于单缺失株,在小鼠体内的增殖速度显着低于RH株和单缺失株,延长感染小鼠的存活时间。最后,本研究还对CRISPR/Cas9全基因组筛选中发现的AKHP基因进行初步功能研究。生物信息学分析发现AKHP具有典型的2-Cys-Prx的结构域;经定位分析发现该蛋白定位于弓形虫胞质中;利用CRISPR/Cas9基因敲除技术构建了AKHP基因缺失株（AKHP-KO）及互补株（AKHP-CO）,测定不同的虫株的入侵及增殖能力,对H2O2敏感性、抗氧化能力,并通过荧光定量PCR测定AKHP-KO中其他抗氧化基因的m RNA表达情况。结果表明,AKHP-KO的增殖能力显着降低,对H2O2的敏感性显着增加,抗氧化能力降低;与RH株相比,AKHP基因缺失株中Prx2的表达量显着升高。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas9全基因组筛选技术成功筛选并鉴定5个未知的抗氧化基因和一个具有典型2-Cys-Prx结构域的AKHP基因,并对两个基因进行初步功能研究,为进一步研究弓形虫抵抗氧化应激的作用机制提供依据
龚文孝[9]（2021）在《G蛋白通路抑制因子2（GPS2）抑制A型流感病毒复制的分子机制研究》文中研究指明A型流感病毒（Influenza A virus,IAV）是造成人和动物感冒的重要病原,一直是兽医学、病毒学和预防医学等关注的焦点。IAV核输出蛋白（Nuclear Export Protein,NEP）也叫NS2,是由IAV的第8片段通过mRNA可变性剪接后编码。NEP在所有亚型的IAV毒株中高度保守,其主要功能是在病毒复制后期作为接头分子介导v RNPs的出核转运。也有文章报道,NEP能调控聚合酶活力和病毒RNA的复制,然而却没有更多的研究来解释NEP调控聚合酶活力的具体机制。筛选与NEP相互作用的宿主蛋白,一方面可以更多的揭示NEP在病毒复制过程中的生物学功能;另一方面,鉴于NEP氨基酸序列的保守性,挖掘新的生物学功能并阐述分子细节可为抗流感病毒药物的研发提供理论基础。研究表明G蛋白通路抑制因子2（G protein Pathway Suppressor 2,GPS2）通过与病毒蛋白互作,参与并调控乳头瘤病毒和丙肝病毒等基因组的复制。本研究表明GPS2是IAV增殖的抑制因子,它通过抑制PB1和PB2之间的相互作用干扰成熟v RNP的装配,进而抑制病毒基因组RNA的复制过程。此外,IAV NEP与GPS2作用并介导GPS2的核输出,从而激活GPS2蛋白的降解。因此,NEP-GPS2相互作用致弱了GPS2对病毒聚合酶活性的抑制,有利于病毒复制。本论文主要研究内容如下:1.NEP与GPS2互作免疫共沉淀实验结果表明,在瞬时转染过表达条件下IAV NEP蛋白与人源GPS2蛋白发生相互作用,且这种相互作用通过GST-Pull down实验得到证实。在病毒感染A549细胞中,Co-IP实验证实NEP与GPS2之间的相互作用是真实存在的。综合以上实验结果表明,IAV NEP与宿主蛋白GPS2之间存在生物学的相互作用,且这种相互作用是直接的,在流感病毒感染细胞内是真实存在的。2.GPS2抑制IAV的复制在本研究中,siRNA沉默宿主基因GPS2能显着提高细胞培养上清中A型流感病毒WSN/H1N1和DW/H5N1病毒增殖滴度,病毒蛋白NP的合成显着提高;而过表达GPS2的细胞中病毒增殖滴度显着降低,表明GPS2是IAV在细胞上增殖的负调控因子。在进一步的研究中,构建了GPS2敲除的A549细胞系,证实GPS2敲除显着提高病毒增殖滴度。综合以上实验结果表明,GPS2是IAV复制增殖的负调控因子。3.IAV感染促进GPS2蛋白降解在IAV感染细胞中,随着WSN/H1N1或者DW/H5N1感染剂量的增加,细胞中GPS2蛋白水平逐渐降低,而mRNA水平变化不显着,提示病毒感染可能会影响蛋白稳定性。蛋白质半衰期测定实验结果表明病毒感染显着缩短了GPS2蛋白在细胞内的半衰期,且MG132能抑制IAV感染引起的蛋白水平降低。而另一方面,NEP的过表达或者病毒感染均能引起核内GPS2蛋白的出核。进一步的研究表明,病毒感染或者过表达NEP引起的GPS2蛋白的降解与其出核转运相关,LMB处理细胞后能起阻断作用。综合以上实验结果表明,IAV感染促进GPS2蛋白的降解,且这种降解与NEP介导的出核转运相关。4.GPS2抑制IAV聚合酶活性在本实验室建立的WSN/H1N1病毒的聚合酶活性检测系统中考察了GPS2蛋白对聚合酶活力的影响,结果表明在不影响聚合酶亚基蛋白表达的前提下,GPS2的过表达能显着抑制IAV聚合酶活性,且呈剂量依赖性。进一步的研究结果表明,在病毒感染细胞中GPS2能与vRNP组份（PB1、PB2和NP）结合,且能抑制病毒RNA聚合酶Rd Rp组装过程中PB1与PB2间的相互作用,进而影响v RNPs的正常装配。综合以上实验结果表明,GPS2干扰IAV聚合酶的组装,进而抑制聚合酶活性。5.GPS2抑制IAV基因组RNA的合成为了进一步探究GPS2抑制病毒增殖的机制,考察了GPS2对病毒RNA合成的影响。与转染对照siRNA组相比,在A549细胞中沉默GPS2基因能显着增加流感病毒vRNA、cRNA和mRNA的水平;为了排除因复制差异带来的影响,我们考察了IAV感染后一个复制周期内3种病毒RNA水平,进一步证实GPS2抑制流感病毒RNA的合成。为了明确GPS2对流感病毒基因组复制的影响,细胞使用放线菌酮（Cycloheximide,CHX）处理后再测定其对3种RNA合成的影响,表明GPS2并不参与流感病毒基因组RNA的初始转录,即mRNA的合成,但沉默GPS2基因能显着抑制基因组的复制,即vRNA和cRNA的合成。综合以上实验结果表明,GPS2抑制IAV基因组RNA复制过程中的RNA合成,而不影响初始转录。6.NEP致弱了GPS2对IAV聚合酶活性的抑制在本研究中,考察了NEP对GPS2介导的流感病毒聚合酶活性抑制作用的影响。在HEK293T细胞中,转染HA-GPS2（100ng）前提下,NEP的过表达会显着影响双荧光素酶的活性,这就表明NEP 100ng的转染剂量能缓解GPS2对聚合酶活性的抑制,当培养基中加入11nM的LMB处理细胞时,聚合酶活力受到显着影响。而使用MG132处理细胞时聚合酶活力改变不显着。综合以上实验结果表明,NEP通过与GPS2相互作用介导GPS2的核输出来致弱GPS2对病毒聚合酶活性的抑制。
李双洁[10]（2021）在《猪RIG-I样受体家族RIG-I、MDA5和LGP2信号功能、相互关系和抗病毒作用研究》文中研究指明天然免疫在宿主抵御病原微生物入侵中的作用非常关键。天然免疫RIG-I样受体家族（RLR）在识别病毒感染,诱导宿主干扰素反应,抵御病毒过程中发挥重要作用。RLR家族包括RIG-I、MDA5和LGP2三个成员。RIG-I和MDA5在识别病原相关分子模式（PAMP）后,通过其信号活性域CARDs向下游传递信号,与同样含有CARD结构域的接头分子线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）发生同源相互作用,最终激活转录因子IRF3和NF-κB,促进I型干扰素（IFN）和促炎性细胞因子的表达,并启动干扰素信号级联反应,抵抗病毒的感染。LGP2无信号活性域CARDs,不能向下游传递信号,主要通过调控RIG-I和MDA5活性发挥作用。尽管对人和小鼠RLR有广泛研究,但目前对家畜RLR缺乏系统的研究。本研究分离鉴定了猪RLR家族成员RIG-I、MDA5和LGP2,对其信号功能、相互关系及抗病毒作用进行了系统研究。1、猪RIG-I样受体RIG-I、MDA5和LGP2功能分析及其抗病毒作用研究本研究通过基因克隆,从猪肺泡巨噬细胞（PAM）中分离出了猪RIG-I样受体成员RIG-I、MDA5和LGP2基因,将基因片段连接至pENTR4-MCS中间载体,再通过LR位点特异性重组反应,分别构建出pRIG-I、pMDA5和pLGP2的pcDNA真核表达质粒。经Western-blotting验证,pRIG-I、pMDA5和pLGP2表达的蛋白大小分别为120 kDa、140kDa 和 80kDa。将 pRIG-I、pMDA5 和 pLGP2 分别转染 HEK293T 细胞,发现pRIG-I、pMDA5均有组成性活性,且pMDA5的信号更强,而pLGP2无信号活性。pRIG-I和pMDA5对不同的双链RNA（dsRNA）和病毒刺激有相似的应答信号活性。CRISPR/Cas9方法制备三种猪RLR敲低的PAM和PK15细胞。在pRIG-I和pMDA5敲低PAM和PK15细胞中,与对照细胞相比,dsRNA类似物低分子量poly I:C刺激和病毒VSV、EMCV感染后诱导表达下游基因IFNp、ISG56、ISG60和IL8的转录水平均显着降低。pLGP2虽然无信号活性,但在pLGP2敲低PAM和PK15细胞中,感染或刺激诱导下游基因的转录水平也降低。为进一步确认猪RLR的功能,分别构建pRIG-/-、pMDA5-/-和pLGP2-/-PAM细胞。上述细胞中,低分子量或高分子量polyI:C刺激诱导的IFNβ、ISG56、IL1β、IL8和TNFα的转录水平均显着降低;病毒VSV、EMCV、SeV、H9N2、HSV1复制和基因表达均增加,而病毒诱导下游细胞因子IFNβ、ISG56、IL1β、IL8和TNFα基因的转录水平显着降低;此外,EMCV感染刺激下游转录因子IRF3磷酸化水平和ISG56蛋白表达也显着下调。这些结果表明:ⅰ pRIG-I和pMDA5能感受识别不同RNA和病毒并激活相似细胞信号,与人和小鼠RIG-I/MDA5的选择性识别不同;ⅱ pRIG-I、pMDA5和pLGP2可能都有广谱的抗病毒功能;ⅲ pLGP2可能对pRIG-I和pMDA5信号有相似的调控作用。分别在PAM和Marc-145细胞中过表达pRIG-I、pMDA5和pLGP2,结果表明猪流感病毒H9N2、猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒（JXA1-R株）在三种RLR过表达细胞中的复制与蛋白表达受到显着抑制。pRIG-I和pLGP2在IPEC-J2细胞中过表达也能抑制猪流行性腹泻病毒（YC2014株）的复制。这些结果表明,猪的RIG-I样受体具有广泛抗病毒效应,在抵抗猪流行性病毒感染中发挥着重要作用。2、猪RIG-I样受体LGP2对RIG-I和MDA5信号的调控作用研究猪的LGP2没有信号活性,但我们发现,在pLGP2转染的PAM细胞中,低分子量poly I:C刺激或VSV病毒感染诱导下游基因IFNβ、ISG60、IL8以及TNFα的转录水平升高,且呈LGP2剂量依赖性,表明pLGP2对pRIG-I/pMDA5信号具有正调控作用。pLGP2敲低细胞（PAM和PK15）以及pLGP2-/-PAM中RNA刺激和病毒感染诱导下游基因表达降低也提示pLGP2对pRIG-I/pMDA5信号的正调控作用。为解析pLGP2对pRIG-I和pMDA5信号的单独调控作用,将pLGP2分别转染pRIG-/-和pMDA5-/-PAM细胞,结果显示病毒VSV感染诱导下游IFNβ和ISG56基因转录水平都升高,证明pLGP2对pRIG-I和pMDA5信号均具有相似的正调控作用。机制层面,激光共聚焦显微镜观察和免疫共沉淀试验结果显示,pLGP2在细胞激活后可以与pRIG-I和pMDA5发生相互作用。通过原核表达与蛋白纯化,我们获得了pRIG-I、pMDA5和pLGP2纯化蛋白;体外RNA结合试验结果显示,pLGP2能够促进pRIG-I 和 pMDA5 与 RNA 配体 poly I:C 的结合。为探究 pLGP2 对 pRIG-I 和 pMDA5调控的活性位点,我们构建了猪LGP2结构域及其缺失体,ATP酶和dsRNA结合缺陷的点突变体。有趣的是,我们发现大部分猪LGP2突变体均表现出组成性活性,尤其是ATP酶活性位点突变体MIIa和MIII以及结构域L1、L2组成性活性尤其明显。激光共聚焦显微镜观察结果显示,点突变体MIIa和结构域L1、L2还表现出明显的核定位现象。所有pLGP2突变体在pRIG-/-和pMDA5-/-PAM转染表达,与对照PAM相比,pLGP2突变体组成性活性有不同程度下降,提示pLGP2突变体组成性活性可能与RIG-I和MDA5信号有关。pLGP2全长和MIII点突变体回补pLGP2-/-PAM细胞均可以拯救抗病毒作用和病毒诱导下游IFNp和ISG56转录水平。3、猪RIG-I和MDA5信号结构域CARDs的信号活性及抗病毒功能研究虽然RIG-I和MDA5有类似的分子结构,但它们的激活机制稍有不同。猪RIG-I和MDA5N端信号活性域串联CARD（CARDs）的氨基酸同源率非常低,不到20%。因此我们想知道猪RIG-I和MDA5的CARDs在信号活化和抗病毒功能方面是否有差异。我们分离表达了猪RIG-I和MDA5的CARDs,其蛋白分子量在30 kDa左右,且MDA5的CARDs明显比RIG-I的CARDs分子量大。由于二者的CARDs均为200氨基酸,所以猪RIG-I和MDA5的CARDs可能存在不同的翻译后修饰。分别将猪RIG-I和MDA5的CARDs转染PAM细胞发现,猪RIG-I和MDA5的CARDs均有组成性活性,且比相应全长组成性活性更强。激光共聚焦显微镜观察结果显示,猪RIG-I和MDA5的CARDs均有核定位现象,这可能是其组成性活性更高的一个原因。猪MDA5 CARDs信号活性显着高于猪RIG-I CARDs,这与猪全长MDA5的信号活性高于RIG-I结果相一致。在抗病毒试验中,猪RIG-I和MDA5的CARDs表现出了相似的广谱抗病毒活性,不仅能显着抑制VSV、EMCV、SeV和流感病毒H9N2、H1N1系列RNA病毒的复制,还能抵抗HSV1 DNA病毒的感染。转录组测序分析表明pMDA5 CARDs在调节下游差异表达基因方面比pRIG-I CARDs表现出更高活性。PAM细胞过表达pMDA5 CARDs,诱导下游有511个上调和240个下调基因,而pRIG-I CARDs仅诱导了 266个上调和33个下调基因。这一结果与pMDA5 CARDs具有更高的信号活性相一致。但在H9N2病毒感染时,两种CARDs诱导相似数量的上调和下调差异表达基因,与两者相似抗病毒作用一致。这些结果表明,猪RIG-I和MDA5的CARDs在信号活性与抗病毒功能方面既有不同,也有相似。
二、人类TAP2基因克隆及其核表达质粒的构建（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人类TAP2基因克隆及其核表达质粒的构建（论文提纲范文）
（1）SARS-CoV-2编码蛋白抑制宿主Ⅰ型干扰素应答机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 新型冠状病毒 |
| 1 新型冠状病毒的出现与疫情的发展 |
| 2 SARS-CoV-2 的“溢出”与传播 |
| 3 SARS-CoV-2 的基因组结构 |
| 4 SARS-CoV-2 编码蛋白在病毒生活史中的主要作用 |
| 5 冠状病毒与宿主因子的互作及对先天免疫应答的抑制 |
| 6 结语 |
| 第2章 宿主先天免疫与病毒逃逸 |
| 1 宿主抗病毒先天免疫 |
| 2 干扰素应答 |
| 3 蛋白泛素化 |
| 4 结语 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 SARS-CoV-2 编码蛋白对Ⅰ型干扰素产生通路的抑制作用 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 SARS-CoV-2 编码蛋白对Ⅰ型干扰素信号转导通路的抑制作用 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 ORF7a泛素化修饰增强其抑制Ⅰ型干扰素信号转导活性 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 高致病性冠状病毒NSP1/6抑制Ⅰ型干扰素信号转导通路的差异 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）牛肠道病毒非结构蛋白3C单抗的制备及其检测病毒抗原的应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 肠道病毒的概况 |
| 1.2 肠道病毒的形态特征及基因组结构 |
| 1.3 肠道病毒感染的流行病学 |
| 1.4 肠道病毒感染的检测方法研究 |
| 1.5 单克隆抗体的研究进展 |
| 第二章 牛肠道病毒3C蛋白的原核表达及纯化 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 牛肠道病毒3C蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及纯化 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 检测牛肠道病毒抗原IPMA方法的建立及初步应用 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（5）新疆南部地方品种绵羊KAP13.3和KRT17基因的表达分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 绵羊角蛋白和角蛋白关联蛋白的研究进展 |
| 1.1.1 角蛋白和角蛋白关联蛋白的结构 |
| 1.1.2 角蛋白和角蛋白相关蛋白国内外研究现状 |
| 1.2 绵羊角蛋白和角蛋白关联蛋白基因的表达 |
| 1.2.1 原核表达 |
| 1.2.2 真核表达 |
| 1.3 实验技术 |
| 1.3.1 实时荧光定量技术 |
| 1.3.2 Western Blot技术 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 第2章 绵羊KAP13.3和KRT17 基因实时荧光定量PCR分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 引物设计 |
| 2.1.5 毛囊总RNA提取 |
| 2.1.6 提取毛囊总RNA反转录成cDNA |
| 2.1.7 18S扩增验证cDNA |
| 2.1.8 使用梯度PCR选择最适合的退火温度 |
| 2.1.9 实时荧光定量PCR反应程序 |
| 2.1.10 数据分析 |
| 2.2 结果分析 |
| 2.2.1 毛囊总RNA的提取 |
| 2.2.2 18S扩增验证cDNA |
| 2.2.3 使用梯度PCR选择最适合的退火温度 |
| 2.2.4 实时荧光定量扩增曲线和熔解曲线 |
| 2.2.5 毛囊KAP13.3和KRT17 基因表达量的分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 绵羊KAP13.3和KRT17 基因的原核表达 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 实验试剂配制 |
| 3.1.5 引物设计 |
| 3.1.6 毛囊总RNA提取 |
| 3.1.7 提取毛囊总RNA反转录成cDNA |
| 3.1.8 毛囊KAP13.3和KRT17 基因的PCR扩增 |
| 3.1.9 毛囊KAP13.3和KRT17 基因的PCR产物回收 |
| 3.1.10 重组克隆质粒pMD19-T-KAP13.3和pMD19-T-KRT17 的构建 |
| 3.1.11 重组克隆质粒pMD19-T-KAP13.3和pMD19-T-KRT17 的提取 |
| 3.1.12 重组克隆质粒pMD19-T-KAP13.3和pMD19-T-KRT17 的双酶切鉴定 |
| 3.1.13 原核重组表达质粒pET-28a-KAP13.3和pET-28a-KRT17 的构建 |
| 3.1.14 原核重组表达质粒pET-28a-KAP13.3和pET-28a-KRT17 的双酶切鉴定与测序分析 |
| 3.1.15 毛囊KAP13.3和KRT17 基因的原核表达与检测 |
| 3.2 结果分析 |
| 3.2.1 毛囊总RNA的提取 |
| 3.2.2 18S PCR扩增 |
| 3.2.3 毛囊KAP13.3和KRT17 目的基因的PCR扩增 |
| 3.2.4 重组克隆质粒pMD19-T-KAP13.3和pMD19-T-KRT17 的双酶切鉴定 |
| 3.2.5 重组表达质粒pET-28a-KAP13.3和pET-28a-KRT17 的双酶切鉴定 |
| 3.2.6 毛囊KAP13.3和KRT17 基因的原核表达 |
| 3.2.7 基因测序分析 |
| 3.2.8 毛囊KAP13.3和KRT17 肽链一级结构分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 绵羊KAP13.3和KRT17 基因的真核表达 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 实验试剂配制 |
| 4.1.5 引物设计 |
| 4.1.6 提取毛囊总RNA反转录成cDNA |
| 4.1.7 毛囊KAP13.3和KRT17 基因的PCR扩增及回收 |
| 4.1.8 重组克隆质粒pMD19-T-KAP13.3和pMD19-T-KRT17 的构建 |
| 4.1.9 重组克隆质粒pMD19-T-KAP13.3和pMD19-T-KRT17 的提取 |
| 4.1.10 重组克隆质粒pMD19-T-KAP13.3和pMD19-T-KRT17 的双酶切鉴定 |
| 4.1.11 真核重组表达质粒pEGFP-N1-KAP13.3和pEGFP-N1-KRT17 的构建 |
| 4.1.12 真核重组表达质粒pEGFP-N1-KAP13.3和pEGFP-N1-KRT17 的双酶切鉴定与测序分析 |
| 4.1.13 真核重组表达质粒pEGFP-N1-KAP13.3和pEGFP-N1-KRT17转染HEK293 细胞 |
| 4.1.14 毛囊KAP13.3和KRT17 基因的真核表达与Western Blot检测 |
| 4.2 结果分析 |
| 4.2.1 18S PCR扩增 |
| 4.2.2 毛囊KAP13.3和KRT17 基因的PCR扩增 |
| 4.2.3 重组克隆质粒pMD19-T-KAP13.3和pMD19-T-KRT17 的双酶切鉴定 |
| 4.2.4 真核重组表达质粒pEGFP-N1-KAP13.3和pEGFP-N1-KRT17 的双酶切鉴定 |
| 4.2.5 真核重组表达质粒pEGFP-N1-KAP13.3和pEGFP-N1-KRT17 转染HEK293细胞的检测 |
| 4.2.6 毛囊KAP13.3和KRT17 基因真核表达蛋白的Western Blot检测 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）IFITM2抑制PRV增殖及PRV US3对其产生的拮抗机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 英文缩略表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 伪狂犬病病毒概述 |
| 1.1 伪狂犬病病毒基因组结构 |
| 1.1.1 衣壳蛋白 |
| 1.1.2 皮层蛋白 |
| 1.1.3 包膜蛋白 |
| 1.2 伪狂犬病病毒的复制周期 |
| 1.3 伪狂犬病的流行情况 |
| 1.4 伪狂犬病病毒检测技术 |
| 1.4.1 病毒分离鉴定 |
| 1.4.2 血清学检测 |
| 1.4.3 分子生物学检测 |
| 1.5 伪狂犬病病毒免疫逃逸相关机制研究 |
| 2 固有免疫 |
| 2.1 TLR信号通路 |
| 2.2 RLR信号通路 |
| 2.3 c GAS-STING信号通路 |
| 3 干扰素诱导的抗病毒蛋白 |
| 3.1 Viperin |
| 3.2 ISG15 |
| 3.3 IFITs |
| 3.4 IFITM蛋白 |
| 4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 猪源IFITM2 蛋白抑制PRV增殖作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品采集及处理 |
| 1.2 细胞和毒株 |
| 1.3 载体与引物 |
| 1.4 试剂与设备 |
| 1.5 PRV的检测 |
| 1.5.1 各样品组织DNA的提取 |
| 1.5.2 PCR扩增 |
| 1.6 Myc-IFITM载体构建及蛋白表达验证 |
| 1.6.1 细胞总RNA的提取 |
| 1.6.2 Myc-IFITM载体的构建 |
| 1.6.3 p CMV-Myc-IFITM质粒转染PK15 细胞 |
| 1.6.4 IFITM蛋白表达验证 |
| 1.7 荧光定量PCR检测PRV基因组DNA拷贝数 |
| 1.8 IFN诱导对内源性IFITM表达的影响 |
| 1.9 PRV感染对IFITM表达的影响 |
| 1.9.1 病毒感染实验 |
| 1.9.2 RT-q PCR检测IFITM m RNA转录 |
| 1.10 过表达IFITM蛋白对PRV吸附和进入的影响 |
| 1.11 细胞基因组DNA提取 |
| 1.12 TCID_(50)测定病毒滴度 |
| 1.13 CCK-8 实验 |
| 1.14 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 病原检测结果 |
| 2.2 IFITM基因的扩增与Myc-IFITM载体鉴定 |
| 2.3 IFITM蛋白在PK15 细胞内表达验证 |
| 2.4 IFN-α2a诱导下内源IFITM蛋白的表达 |
| 2.5 PRV感染对IFITM基因转录的影响 |
| 2.6 IFITM2 蛋白抑制PRV增殖效果初探 |
| 2.7 IFITM对 PRV吸附和进入的影响 |
| 2.8 IFITM对 IFN-β表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 猪源IFITM2 蛋白抑制PRV增殖机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞和毒株 |
| 1.2 试剂与设备 |
| 1.3 PRV对 IFN-α2a敏感性实验 |
| 1.4 siRNA干扰实验 |
| 1.5 RNAi IFITM2 表达对IFN抗病毒作用的影响 |
| 1.6 RNAi IFITM2 蛋白表达对PRV吸附和进入的影响 |
| 1.7 MβCDX处理PK15 细胞对PRV增殖的影响 |
| 1.8 PF429242 处理PK15 细胞对PRV增殖的影响 |
| 1.9 PF429242 处理对IFITM2 抗病毒作用的影响 |
| 1.10 荧光定量PCR检测PRV基因组DNA拷贝数 |
| 1.11 TCID_(50)测定病毒滴度 |
| 1.12 CCK-8 实验 |
| 1.13 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 PRV对 IFN-α2a敏感性实验 |
| 2.2 靶向IFITM2 基因的si RNA敲低效果检测 |
| 2.3 RNAi IFITM2 蛋白对IFN-α2a抗病毒作用的调节 |
| 2.4 RNAi IFITM2对PRV吸附和进入的影响 |
| 2.5 MβCDX处理PK15 细胞抑制PRV增殖 |
| 2.6 PF429242 处理对IFITM2 抗病毒作用的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 PRV US3蛋白对I型干扰素信号通路的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞和毒株 |
| 1.2 载体与引物 |
| 1.3 试剂与设备 |
| 1.4 PRV感染对IFN诱导的IFITM2 表达的影响 |
| 1.5 PRV感染对I型 IFN表达的影响 |
| 1.6 PRV编码蛋白对I型 IFN表达的影响 |
| 1.7 US3对c GAS-STING信号通路相关因子m RNA表达的影响 |
| 1.8 US3 对内源性c GAS-STING信号通路相关因子表达的影响 |
| 1.9 PRVUS3 蛋白对c GAS-STING、TBK1和IRF3(5D)激活的IFN-β表达的影响 |
| 1.10 细胞RNA提取及RT-q PCR检测 |
| 1.10.1 细胞总RNA的提取 |
| 1.10.2 RT-q PCR |
| 1.11 CCK-8 实验 |
| 1.12 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 PRV感染对I型 IFN诱导的IFITM2 表达的影响 |
| 2.2 PRV感染对poly(I:C)激活的I型干扰素表达的影响 |
| 2.3 PRV编码蛋白对poly(I:C)激活的I型干扰素表达的影响 |
| 2.4 US3 蛋白对PK15 细胞活力的影响 |
| 2.5 US3对poly(d A:d T)激活的I型 IFN表达的影响 |
| 2.6 US3 对内源性c GAS-STING信号通路相关因子表达的影响 |
| 2.7 US3 抑制c GAS-STING、TBK1和IRF3(5D)介导的IFN-β表达 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 US3 蛋白拮抗I型干扰素信号通路的机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞和毒株 |
| 1.2 载体与引物 |
| 1.3 试剂与设备 |
| 1.4 US3 抑制IRF3 表达的验证 |
| 1.5 细胞核蛋白与胞质蛋白的分离 |
| 1.6 Co-IP |
| 1.7 细胞总蛋白提取及免疫印迹检测 |
| 1.7.1 细胞总蛋白的提取 |
| 1.7.2 Western blot |
| 1.8 细胞RNA提取及RT-q PCR检测 |
| 1.8.1 细胞总RNA的提取 |
| 1.8.2 RT-q PCR |
| 1.9 US3 蛋白对下游ISGs m RNA表达的影响 |
| 1.10 CCK-8 实验 |
| 1.11 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 US3 与IRF3 之间互作验证 |
| 2.2 蛋白酶体途径参与US3 诱导的IRF3 蛋白水平降低 |
| 2.3 US3 对IRF3 入核的影响 |
| 2.4 US3 对核输入蛋白KPNA3和KPNA4 表达的影响 |
| 2.5 US3 与核输入蛋白KPNA3和KPNA4 之间的互作验证 |
| 2.6 US3 对下游ISGs转录的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 博士期间发表论文情况 |
| 导师简介 |
（7）鸭E3泛素连接酶TRIM35调控鸭RLRs信号通路的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 1 文献综述 |
| 1.1 抗病毒天然免疫概述 |
| 1.1.1 天然免疫简介 |
| 1.1.2 干扰素简介 |
| 1.1.3 RLRs与抗病毒天然免疫 |
| 1.1.3.1 RLRs家族成员分类及结构 |
| 1.1.3.2 RLRs介导的抗病毒天然免疫信号通路 |
| 1.2 TRIM家族研究进展 |
| 1.3 TRIM35的功能 |
| 2 研究目的与意义 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株、毒株、细胞和实验动物 |
| 3.1.2 质粒与载体 |
| 3.1.3 引物和干扰分子 |
| 3.1.4 工具酶及主要试剂 |
| 3.1.5 培养基及相关试剂配制 |
| 3.1.5.1 LB培养基和抗生素及其配制 |
| 3.1.5.2 细胞培养相关试剂的配制 |
| 3.1.6 主要缓冲液和试剂及其配制 |
| 3.1.6.1 琼脂糖凝胶电泳试剂 |
| 3.1.6.2 大肠杆菌感受态细胞制备用试剂 |
| 3.1.6.3 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂及缓冲液 |
| 3.1.6.4 Western Blot缓冲液及试剂 |
| 3.1.6.5 蛋白纯化相关试剂 |
| 3.1.7 主要实验仪器及设备 |
| 3.1.8 分子生物学分析软件 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞样品总RNA的提取和cDNA的合成 |
| 3.2.2 目的基因的PCR扩增 |
| 3.2.2.1 目的基因的引物设计 |
| 3.2.2.2 PCR扩增 |
| 3.2.2.3 PCR产物或酶切产物的电泳检测 |
| 3.2.2.4 PCR产物或酶切产物的回收与纯化 |
| 3.2.3 外源DNA片段与质粒载体的连接反应 |
| 3.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) |
| 3.2.5 连接产物的转化 |
| 3.2.6 质粒的制备与鉴定 |
| 3.2.6.1 质粒的小量制备 |
| 3.2.6.2 质粒的中量制备 |
| 3.2.7 原核蛋白诱导表达和纯化 |
| 3.2.7.1 重组蛋白的原核表达和SDS-PAGE分析 |
| 3.2.7.2 原核表达重组蛋白的纯化 |
| 3.2.8 单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 3.2.8.1 抗原制备 |
| 3.2.8.2 动物免疫 |
| 3.2.8.3 SP2/0 骨髓瘤细胞的活化 |
| 3.2.8.4 细胞融合 |
| 3.2.8.5 间接ELISA方法检测杂交瘤细胞上清 |
| 3.2.8.6 杂交瘤细胞的克隆化(有限稀释法) |
| 3.2.8.7 单克隆腹水的制备与纯化 |
| 3.2.9 间接免疫荧光(IFA) |
| 3.2.10 质粒转染(脂质体介导转染法) |
| 3.2.11 双荧光素酶报告实验 |
| 3.2.12 荧光定量RT-PCR检测基因m RNA水平 |
| 3.2.12.1 组织或细胞总RNA提取及cDNA合成 |
| 3.2.12.2 SYBR Green I实时定量PCR |
| 3.2.13 半数细胞培养物感染量(TCID_(50))的测定 |
| 3.2.14 Western Blot样品准备 |
| 3.2.15 Co-IP样品准备 |
| 3.2.16 RNA结合实验 |
| 3.2.17 统计学方法 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 DuTRIM35基因的克隆与组织差异表达研究 |
| 4.1.1 DuTRIM35基因的克隆与序列比对分析 |
| 4.1.2 DuTRIM35基因的组织差异表达 |
| 4.2 DuTRIM35单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 4.2.1 DuTRIM35蛋白的原核表达及纯化 |
| 4.2.2 DuTRIM35单克隆抗体制备 |
| 4.3 DuTRIM35在SeV、VSV和 DTMUV感染后表达量上调 |
| 4.4 DuTRIM35 促进病毒的增殖 |
| 4.4.1 过表达duTRIM35促进VSV和DTMUV的增殖 |
| 4.4.2 干扰内源性duTRIM35抑制病毒增殖 |
| 4.5 DuTRIM35抑制IFN-β的产生 |
| 4.5.1 DuTRIM35抑制SeV诱导的IFN-β产生 |
| 4.5.2 DuTRIM35抑制SeV激活的ISGs表达水平 |
| 4.5.3 DuTRIM35抑制duRIG-I/duMDA5诱导的IFN-β产生 |
| 4.6 DuTRIM35通过靶向duRIG-I抑制IFN-β产生 |
| 4.7 DuRIG-I的CARD功能域及du TRIM35的RING结构域相互作用 |
| 4.8 DuTRIM35通过干扰duRIG-I与dsRNA的结合拮抗IFN-β产生 |
| 4.8.1 DuTRIM35不通过泛素-蛋白酶体途径降解duRIG-I |
| 4.8.2 DuTRIM35减弱duRIG-I与dsRNA的结合 |
| 5 讨论与结论 |
| 5.1 讨论 |
| 5.1.1 DuTRIM35基因的克隆及其对VSV和 DTMUV增殖的影响 |
| 5.1.2 DuTRIM35抑制IFN-β和ISGs产生的研究 |
| 5.1.3 DuTRIM35抑制IFN-β产生的机制研究 |
| 5.2 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）弓形虫抗氧化损伤基因的筛选及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 弓形虫概述 |
| 1.1.1 弓形虫与弓形虫病 |
| 1.1.2 弓形虫的生活史 |
| 1.1.3 弓形虫的基因型和毒力 |
| 1.2 弓形虫入侵宿主细胞的机制 |
| 1.3 宿主对弓形虫的识别及免疫应答作用 |
| 1.4 弓形虫的主要毒力因子及逃逸机制 |
| 1.5 弓形虫的氧化还原系统及研究进展 |
| 1.6 CRISPR/Cas9基因敲除技术在弓形虫研究领域的应用 |
| 1.6.1 CRISPR/Cas9 的工作原理 |
| 1.6.2 CRISPR/Cas9 基因敲除技术在弓形虫上的研究进展 |
| 1.6.3 基于CRISPR/Cas9 系统高通量筛选技术 |
| 1.7 选题的目的意义 |
| 第二章 氧化应激模型的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验试剂与耗材 |
| 2.1.2 试验仪器 |
| 2.1.3 Vero细胞的复苏及培养 |
| 2.1.4 弓形虫的培养 |
| 2.1.5 CCK-8 测定Vero细胞的活力 |
| 2.1.6 细胞内ROS水平的测定 |
| 2.1.7 H_2O_2对弓形虫的影响 |
| 2.1.8 H_2O_2对细胞内弓形虫增殖的影响 |
| 2.1.9 数据分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 H_2O_2对Vero细胞形态的影响 |
| 2.2.2 H_2O_2对Vero细胞活力的影响 |
| 2.2.3 H_2O_2对细胞内ROS水平的影响 |
| 2.2.4 体外孵育时间对弓形虫活力的影响 |
| 2.2.5 H_2O_2对细胞内弓形虫增殖的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 RH/CAS9 株的构建及敲除效率的验证 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验试剂与耗材 |
| 3.1.2 试验仪器 |
| 3.1.3 试剂配制 |
| 3.1.4 质粒pCas9-CAT和 pCas9-decoy的扩大培养及提取 |
| 3.1.5 RH/Cas9 虫株的构建 |
| 3.1.6 RH/Cas9 虫株的PCR鉴定 |
| 3.1.7 pU6-sgSAG1-DHFR质粒的构建及鉴定 |
| 3.1.8 SAG1 缺失株的构建 |
| 3.1.9 RH/Cas9 株敲除效率的PCR鉴定 |
| 3.1.10 间接免疫荧光鉴定RH/Cas9 株敲除效率 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 RH/Cas9 虫株的PCR鉴定 |
| 3.2.2 pU6-sgSAG1-DHFR质粒的构建 |
| 3.2.3 pU6-SAG1-DHFR质粒的鉴定 |
| 3.2.4 RH/Cas9 虫株敲除效率的验证 |
| 3.2.5 间接免疫荧光验证RH/Cas9 虫株的敲除效率 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 抗氧化相关基因的筛选及鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验试剂与耗材 |
| 4.1.2 试验仪器 |
| 4.1.3 Vero细胞的准备 |
| 4.1.4 质粒文库的准备 |
| 4.1.5 RH/Cas9 虫株的准备 |
| 4.1.6 弓形虫基因缺失株库的构建 |
| 4.1.7 H_2O_2筛选弓形虫抗氧化相关基因 |
| 4.1.8 全基因组sg RNAs的 Illumina测序 |
| 4.1.9 测序数据分析 |
| 4.1.10 构建pU6-sgHPs-DHFR质粒 |
| 4.1.11 pU6-sgRNA-DHFR质粒的扩增及提取 |
| 4.1.12 HPs单克隆缺失株的筛选 |
| 4.1.13 基因敲除虫株的PCR鉴定 |
| 4.1.14 不同缺失株对H_2O_2的敏感性试验 |
| 4.1.15 H_2O_2对细胞内弓形虫增殖的影响 |
| 4.1.16 虫体活性氧检测 |
| 4.1.17 虫体MDA水平检测 |
| 4.1.18 虫体总抗氧化能力检测 |
| 4.1.19 入侵试验 |
| 4.1.20 增殖试验 |
| 4.1.21 噬斑试验 |
| 4.1.22 对小鼠的毒力试验 |
| 4.1.23 数据分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 sgRNA文库质粒的转化及扩大 |
| 4.2.2 利用H_2O_2进行全基因组筛选 |
| 4.2.3 抗氧化基因的筛选 |
| 4.2.4 pU6-sgRNA-DHFR质粒构建 |
| 4.2.5 单基因缺失株的构建 |
| 4.2.6 不同缺失株对H_2O_2的敏感性试验 |
| 4.2.7 H_2O_2对弓形虫增殖能力的影响 |
| 4.2.8 虫体内ROS、T-AOC和 MDA水平的测定 |
| 4.2.9 弓形虫感染巨噬细胞后对巨噬细胞ROS的影响 |
| 4.2.10 HPs-KO株的入侵和增殖能力 |
| 4.2.11 噬斑试验 |
| 4.2.12 对小鼠的毒力试验 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 HP1 的表达、鉴定及与相关的虫体蛋白的筛选 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验试剂与耗材 |
| 5.1.2 试验仪器 |
| 5.1.3 HP1 的生物信息学分析 |
| 5.1.3.1 HP1 序列分析 |
| 5.1.3.2 蛋白理化性质分析 |
| 5.1.3.3 蛋白信号肽及跨膜区预测 |
| 5.1.3.4 结构域及基序分析 |
| 5.1.3.5 同源分析 |
| 5.1.4 HP1 的原核表达 |
| 5.1.4.1 虫体收集及RNA的提取 |
| 5.1.4.2 HP1 基因克隆 |
| 5.1.4.3 原核表达载体pET-32a-HP1 的构建及验证 |
| 5.1.4.4 重组蛋白HP1 的诱导表达及鉴定 |
| 5.1.4.5 重组蛋白HP1 的大量表达及纯化 |
| 5.1.5 多克隆抗体的制备 |
| 5.1.6 HP1 的定位分析 |
| 5.1.7 HP1 蛋白酶活性的测定 |
| 5.1.8 免疫共沉淀 |
| 5.1.8.1 虫体蛋白的准备 |
| 5.1.8.2 去除非特异性结合 |
| 5.1.8.3 免疫共沉淀 |
| 5.1.8.4 质谱分析 |
| 5.1.8.5 数据库检索 |
| 5.1.8.6 生物信息学分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 生物信息学分析 |
| 5.2.1.1 HP1 基因结构 |
| 5.2.1.2 蛋白理化性质分析 |
| 5.2.1.3 蛋白信号肽及跨膜区预测 |
| 5.2.1.4 结构域及基序分析 |
| 5.2.1.5 多物种氨基酸序列比对及同源进化分析 |
| 5.2.2 HP1 的表达及鉴定 |
| 5.2.2.1 HP1 的扩增 |
| 5.2.2.2 重组质粒pET-32a-HP1 的鉴定 |
| 5.2.3 HP1 重组蛋白的表达及纯化 |
| 5.2.4 HP1 的定位分析 |
| 5.2.5 HP1 蛋白酶活性测定 |
| 5.2.6 与相互作用蛋白的筛选及鉴定 |
| 5.2.6.1 SDS-PAGE鉴定免疫产物 |
| 5.2.6.2 质谱分析及数据库检索结果 |
| 5.2.6.3 质谱数据分析 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 弓形虫HP1-KO株的构建及转录组分析 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 试验试剂与耗材 |
| 6.1.2 试验仪器 |
| 6.1.3 CRISPR/Cas9 基因敲除质粒和同源重组质粒的构建及鉴定 |
| 6.1.4 HP1 缺失株的构建 |
| 6.1.5 HP1 缺失株的PCR验证 |
| 6.1.6 HP1 互补株的构建 |
| 6.1.7 弓形虫HP1-KO虫株的转录组分析 |
| 6.1.7.1 样品收集 |
| 6.1.7.2 RNA提取 |
| 6.1.7.3 转录组测序及序列比对分析 |
| 6.1.7.4 差异基因的GO分析及KEGG富集分析 |
| 6.1.8 荧光定量PCR验证差异基因 |
| 6.1.9 数据分析 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 HP1 敲除质粒的构建与鉴定 |
| 6.2.2 HP1 缺失株的PCR鉴定 |
| 6.2.3 HP1 互补株的构建 |
| 6.2.4 弓形虫HP1-KO虫株的转录组分析 |
| 6.2.4.1 数据质控 |
| 6.2.4.2 样本关系分析 |
| 6.2.4.3 差异基因分析 |
| 6.2.4.4 GO分析 |
| 6.2.4.5 KEGG分析 |
| 6.2.5 荧光定量PCR验证差异基因 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 HP1 与CAT的双基因缺失株的构建及表型研究 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 试验试剂与耗材 |
| 7.1.2 试验仪器 |
| 7.1.3 CAT基因敲除质粒和同源重组质粒的构建及鉴定 |
| 7.1.4 HP1 与CAT双基因缺失株的构建及验证 |
| 7.1.5 H_2O_2对HP1/CAT双缺失株的影响 |
| 7.1.6 小鼠体内增殖试验 |
| 7.1.7 对小鼠的毒力试验 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 HP1 与CAT双基因缺失株的构建及验证 |
| 7.2.2 HP1/CAT-KO对 H_2O_2的敏感性试验 |
| 7.2.3 小鼠体内试验 |
| 7.3 讨论 |
| 第八章 AKHP的原核表达、敲除及功能研究 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.1.1 试验试剂与耗材 |
| 8.1.2 试验仪器 |
| 8.1.3 AKHP的生物学信息分析 |
| 8.1.4 AKHP的原核表达 |
| 8.1.5 WB验证 |
| 8.1.6 AKHP定位分析 |
| 8.1.6.1 定位质粒pMD-18T-AKHP的构建 |
| 8.1.6.2 定位分析 |
| 8.1.7 CRISPR/Cas9 基因敲除质粒和同源重组质粒的构建及AKHP缺失株的构建 |
| 8.1.8 互补株的构建 |
| 8.1.9 间接免疫荧光分析 |
| 8.1.10 AKHP缺失株的表型分析 |
| 8.1.10.1 入侵试验 |
| 8.1.10.2 增殖试验 |
| 8.1.11 AKHP缺失株株对H_2O_2的敏感性 |
| 8.1.12 抗氧化能力测定 |
| 8.1.13 AKHP的缺失对其他抗氧化基因的影响 |
| 8.1.14 AKHP缺失株对巨噬细胞ROS的影响 |
| 8.1.15 数据分析 |
| 8.2 结果 |
| 8.2.1 生物信息学分析 |
| 8.2.1.1 AKHP的基因结构 |
| 8.2.1.2 AKHP理化性质分析 |
| 8.2.1.3 蛋白信号肽及跨膜区预测 |
| 8.2.1.4 AKHP氨基酸序列对比 |
| 8.2.1.5 三级结构预测 |
| 8.2.1.6 蛋白互作关系分析 |
| 8.2.2 AKHP蛋白表达 |
| 8.2.2.1 AKHP的编码全长扩增 |
| 8.2.2.2 重组质粒pET-28a-AKHP的鉴定 |
| 8.2.2.3 AKHP重组蛋白的表达及纯化 |
| 8.2.3 AKHP的 WB验证 |
| 8.2.4 AKHP的定位分析 |
| 8.2.5 AKHP敲除质粒的构建及鉴定 |
| 8.2.6 AKHP缺失株的PCR鉴定 |
| 8.2.7 AKHP互补株的PCR鉴定 |
| 8.2.8 AKHP缺失株的间接免疫荧光鉴定 |
| 8.2.9 表型分析 |
| 8.2.10 AKHP缺失株对H_2O_2敏感性试验 |
| 8.2.11 抗氧化指标的测定 |
| 8.2.12 AKHP基因对其他抗氧化基因表达量的影响 |
| 8.2.13 AKHP缺失对巨噬细胞ROS水平的影响 |
| 8.3 讨论 |
| 第九章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）G蛋白通路抑制因子2（GPS2）抑制A型流感病毒复制的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(abbreviation) |
| 1 前言 |
| 1.1 流感病毒概述 |
| 1.2 流感病毒编码蛋白质 |
| 1.3 vRNP的结构 |
| 1.4 vRNP转运入核 |
| 1.4.1 脱壳 |
| 1.4.2 依赖IMPα–IMPβ1途径入核 |
| 1.5 IAV基因组的转录 |
| 1.5.1 RdRP与宿主mRNA帽结构的结合 |
| 1.5.2 抢帽机制 |
| 1.5.3 转录起始延伸和终止 |
| 1.6 IAV基因组的复制 |
| 1.6.1 病毒RNA从头合成 |
| 1.6.2 启动子结合 |
| 1.6.3 反式作用或反式激活的顺式RNP |
| 1.6.4 宿主蛋白ANP32与vRNA复制 |
| 1.6.5 新合成cRNA的稳定 |
| 1.7 子代vRNP的装配 |
| 1.7.1 RdRP的组装 |
| 1.7.2 影响RdRP组装的宿主因子 |
| 1.7.3 NP蛋白分子伴侣及翻译后修饰 |
| 1.7.4 影响vRNP组装宿主因子 |
| 1.8 NEP与vRNP转运出核 |
| 1.9 抗流感病毒药物的开发与应用 |
| 1.9.1 针对M2离子通道的抗病毒策略 |
| 1.9.2 针对神经氨酸酶NA的抗病毒策略 |
| 1.9.3 针对血凝素HA的抗病毒策略 |
| 1.9.4 针对RdRP的抗病毒策略 |
| 1.10 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞与病毒 |
| 2.1.2 抗体和小分子化合物 |
| 2.1.3 分子相关试剂 |
| 2.1.4 质粒和小干扰RNA |
| 2.1.5 主要培养基和缓冲液的配制 |
| 2.1.6 主要实验仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 基因克隆 |
| 2.2.2 质粒提取(去内毒素质粒提取) |
| 2.2.3 细胞传代培养、转染和病毒感染 |
| 2.2.4 细胞活力测定 |
| 2.2.5 稳定表达细胞系及基因敲除细胞系的构建 |
| 2.2.6 流感病毒半数细胞培养物感染剂量(TCID_(50))测定 |
| 2.2.7 细胞RNA提取、反转录及定量PCR |
| 2.2.8 细胞总蛋白提取、定量和Western blot分析 |
| 2.2.9 哺乳动物细胞基因双杂交 |
| 2.2.10 聚合酶活性检测 |
| 2.2.11 GST Pull-Down |
| 2.2.12 免疫共沉淀 |
| 2.2.13 间接免疫荧光 |
| 2.2.14 细胞核细胞质分离提取 |
| 2.2.15 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 流感病毒核输出蛋白NEP与宿主蛋白GPS2产生相互作用 |
| 3.2 GPS2是IAV增殖的抑制因子 |
| 3.3 A型流感病毒感染促进GPS2蛋白的降解 |
| 3.3.1 病毒感染致GPS2蛋白降解 |
| 3.3.2 流感病毒感染通过蛋白酶体途径降解GPS2蛋白 |
| 3.4 GPS2的降解与核输出相关 |
| 3.4.1 MG132处理后细胞质中GPS2蛋白量增加 |
| 3.4.2 GPS2蛋白降解与相互作用引起的出核相关联 |
| 3.4.3 LMB抑制流感病毒感染引起的GPS2蛋白降解 |
| 3.5 病毒感染致GPS2出核由NEP介导 |
| 3.5.1 NEP上相互作用区域的确定 |
| 3.5.2 NEP介导GPS2出核 |
| 3.6 GPS2延迟病毒vRNP的出核 |
| 3.7 GPS2抑制IAV聚合酶活性 |
| 3.7.1 GPS2上相互作用区域的确定 |
| 3.7.2 GPS2抑制流感病毒聚合酶活性 |
| 3.7.3 GPS2与聚合酶亚基间的相互作用 |
| 3.7.4 GPS2抑制流感病毒RNA合成 |
| 3.8 GPS2 抑制流感病毒聚合酶组装 |
| 3.8.1 GPS2抑制PB1与PB2间的相互作用 |
| 3.8.2 GPS2抑制聚合酶的组装 |
| 3.9 NEP致弱GPS2对病毒聚合酶活性的抑制 |
| 4 讨论 |
| 4.1 GPS2抑制A型流感病毒复制的分子机制 |
| 4.2 GPS2抑制vRNA的合成 |
| 4.3 NEP促进GPS2蛋白降解 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（10）猪RIG-I样受体家族RIG-I、MDA5和LGP2信号功能、相互关系和抗病毒作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述: 天然免疫RNA感受器RIG-I样受体功能与信号调控 |
| 1. RIG-I样受体概述 |
| 2. RLR识别的配体RNA |
| 2.1 RLR识别的配体RNA特征 |
| 3. RIG-I样受体的结构与信号活化 |
| 3.1 RIG-I样受体的结构 |
| 3.2 RIG-I样受体的信号活化 |
| 3.3 RIG-I样受体的信号通路 |
| 4. RLR信号的调节 |
| 4.1 泛素化修饰的调控 |
| 4.2 磷酸化修饰的调控 |
| 4.3 其他病毒或细胞蛋白对RIG-I和MDA5的调节 |
| 4.4 LGP2对RIG-I和MDA5的调控 |
| 5. RLR的抗病毒作用 |
| 5.1 RLR抵抗RNA病毒的感染 |
| 5.2 RLR抵抗DNA病毒的感染 |
| 6. 总结与展望 |
| 第1章 猪RIG-I样受体RIG-I、MDA5和LGP2功能分析及其抗病毒作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 pRIG-I、pMDA5、pLGP2蛋白表达 |
| 2.2 pRIG-I、pMDA5和pLGP2的信号功能鉴定分析 |
| 2.3 gRNA敲除效率的验证 |
| 2.4 PAM-pRIG-I、pMDA5和pLGP2单克隆纯合敲除细胞的鉴定 |
| 2.5 pRIG-I、pMDA5和pLGP2敲低PAM/PK15稳定细胞功能鉴定 |
| 2.6 pRIG-I~(-/-)、pMDA5~(-/-)和pLGP2~(-/-) PAM细胞系功能鉴定 |
| 2.7 pRIG-I、pMDA5和pLGP2的抗猪病毒功能研究 |
| 3 讨论 |
| 第2章 猪RIG-I样受体LGP2对RIG-I和MDA5的正向调控作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 RT-qPCR检测pLGP2对pRIG-I/MDA5信号介导下游基因转录的影响 |
| 2.2 RT-qPCR分析pLGP2对pRIG-I信号和pMDA5信号的单独调控作用 |
| 2.3 激光共聚焦显微镜分析pLGP2与pRIG-I和pMDA5的共定位情况 |
| 2.4 免疫共沉淀方法(Co-IP)分析pLGP2与pRIG-I和pMDA5的相互作用 |
| 2.5 dsRNA结合试验分析pLGP2对pRIG-I和pMDA5结合配体dsRNA的影响 |
| 2.6 pLGP2突变体的构建与蛋白表达 |
| 2.7 pLGP2突变体的信号功能分析 |
| 2.8 pLGP2突变体在细胞中的定位 |
| 2.9 pLGP2突变体对pRIG-I和pMDA5功能的影响 |
| 3 讨论 |
| 第3章 猪RIG-I和MDA5N端结构域CARDs信号活性及抗病毒功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 pRIG-I-CARDs和pMDA5-CARDs蛋白表达 |
| 2.2 pRIG-I-CARDs和pMDA5-CARDs的信号功能鉴定 |
| 2.3 pRIG-I-CARDs和pMDA5-CARDs在PAM细胞中的定位 |
| 2.4 pRIG-I-CARDs和pMDA5-CARDs的抗病毒功能研究 |
| 2.5 转录组测序分析猪RIG-I和MDA5 CARDs下游的差异表达基因 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
四、人类TAP2基因克隆及其核表达质粒的构建（论文参考文献）
- [1]SARS-CoV-2编码蛋白抑制宿主Ⅰ型干扰素应答机制研究[D]. 曹增国. 吉林大学, 2021(01)
- [2]牛肠道病毒非结构蛋白3C单抗的制备及其检测病毒抗原的应用[D]. 蔡梦露. 吉林大学, 2021(01)
- [3]微囊藻碱性磷酸酶PhoX的鉴定及其基因工程抗体的筛选[D]. 洪素娟. 南京师范大学, 2021
- [4]鸭Mx基因转录本的鉴定及鸭甲型肝炎病毒1/3型诱导鸭胚Mx基因表达模式的分析[D]. 陈浩田. 东北农业大学, 2021
- [5]新疆南部地方品种绵羊KAP13.3和KRT17基因的表达分析[D]. 梁玫岩. 塔里木大学, 2021(08)
- [6]IFITM2抑制PRV增殖及PRV US3对其产生的拮抗机制研究[D]. 谢晶莹. 甘肃农业大学, 2021
- [7]鸭E3泛素连接酶TRIM35调控鸭RLRs信号通路的机制研究[D]. 郑慧军. 华中农业大学, 2021
- [8]弓形虫抗氧化损伤基因的筛选及功能研究[D]. 陈芸. 中国农业科学院, 2021(01)
- [9]G蛋白通路抑制因子2（GPS2）抑制A型流感病毒复制的分子机制研究[D]. 龚文孝. 华中农业大学, 2021
- [10]猪RIG-I样受体家族RIG-I、MDA5和LGP2信号功能、相互关系和抗病毒作用研究[D]. 李双洁. 扬州大学, 2021