一、骨髓成纤维细胞条件培养液对体外巨核系细胞生成的促进作用（论文文献综述）
姜玲玲[1]（2021）在《激活素A与TNF-α在成纤维细胞活化调控中的相互拮抗作用研究》文中研究表明肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是公认的致炎细胞因子,可作用于多种细胞。激活素A属于转化生长因子-β（TGF-β）超家族成员,被认为是诱导组织纤维化的重要细胞因子,可促进M2型巨噬细胞活化,并抑制细菌脂多糖（LPS）活化M1型巨噬细胞。成纤维细胞是机体参与炎症应答的重要细胞,也是组织创伤修复的主要功能细胞,其异常活化则会导致组织瘢痕形成或纤维化。在机体炎症应答时,组织中TNF-α和激活素A水平均升高。然而,激活素A能否作为TNF-α的天然拮抗剂发挥抗炎作用,以及激活素A与TNF-α能否协同调控成纤维细胞活化,仍不清楚。因此,本研究首先选用TNF-α活性测定靶细胞L929细胞（小鼠成纤维细胞系）探讨激活素A与TNF-α调控小鼠成纤维细胞活化的联合作用及相关机制,并进一步应用原代培养细胞确定激活素A与TNF-α对人成纤维细胞活性的联合调控作用。一、研究方法1.小鼠成纤维细胞活性检测CCK-8法和实时细胞分析（RTCA）检测小鼠L929细胞增殖和黏附;流式细胞术检测细胞凋亡;ELISA检测细胞分泌白细胞介素-6（IL-6）和TGF-β1水平;RT-PCR和Western blotting检测细胞外基质及相关蛋白酶mRNA和蛋白表达水平;Transwell小室法和微流控技术分析细胞迁移能力。2.小鼠成纤维细胞活化机制分析流式细胞术检测L929细胞内钙离子水平及细胞膜相关受体表达水平;RT-PCR和Western blotting检测Smad和MAPK信号通路相关分子mRNA和蛋白表达水平。3.人牙周韧带成纤维细胞培养体外组织块贴壁法培养人牙周韧带细胞（hPDLCs）;采用免疫细胞化学染色鉴定细胞。4.人成纤维细胞活性检测CCK-8法和RTCA分析hPDLCs增殖和黏附;ELISA检测细胞分泌IL-6和TGF-β1水平;RT-PCR和Western blotting检测细胞外基质及相关蛋白酶mRNA和蛋白表达水平;Transwell小室法和微流控技术分析细胞迁移能力。5.人成纤维细胞活化机制分析RT-PCR和Western blotting检测hPDLCs的Smad和MAPK信号通路相关分子mRNA和蛋白表达水平。二、研究结果1.激活素A与TNF-α对小鼠L929成纤维细胞活性影响1.1 TNF-α抑制L929细胞增殖并诱导其凋亡,而激活素A拮抗TNF-α上述作用。1.2 TNF-α诱导L929细胞分泌炎性介质NO和IL-6,但激活素A抑制TNF-α此作用。1.3激活素A促进L929细胞分泌TGF-β1,TNF-α则抑制激活素A诱导的TGF-β1分泌。1.4激活素A上调L929细胞FN、Col I及MMP-2 mRNA表达,而TNF-α下调激活素A诱导的FN和MMP-2 mRNA高表达;TNF-α促进MMP-9 mRNA表达,而激活素A抑制TNF-α诱导的MMP-9 mRNA表达升高。Western blotting证实激活素A上调L929细胞MMP-2蛋白表达,TNF-α则抑制激活素A诱导的MMP-2蛋白表达升高;TNF-α上调L929细胞MMP-9蛋白表达,而激活素A下调TNF-α诱导的MMP-9蛋白高表达。1.5激活素A与TNF-α单独应用均可增强L929细胞黏附能力,两者联合具有协同增强作用。1.6激活素A诱导L929细胞迁移,TNF-α则抑制L929细胞向激活素A趋化迁移。2.激活素A与TNF-α调控小鼠成纤维细胞活化机制2.1激活素A诱导L929细胞内钙离子水平升高,而TNF-α可削弱其作用。2.2激活素A对L929细胞膜TNFR1和TNFR2表达无明显影响,但TNF-α下调细胞膜ActRⅡA表达。2.3激活素A对L929细胞Smad信号相关分子表达无显着影响,但显着上调L929细胞p-ERK1/2蛋白水平;TNF-α上调p-ERK1/2和p-JNK蛋白水平,但激活素A与TNF-α联合作用后,p-ERK1/2蛋白水平较TNF-α单独作用明显降低。2.4 ERK抑制剂FR180204不仅抑制激活素A引起的L929细胞p-ERK1/2蛋白水平升高,也显着削弱激活素A诱导的L929细胞迁移。3.激活素A与TNF-α对人成纤维细胞活性影响3.1体外组织块贴壁法成功培养hPDLCs,免疫细胞化学染色显示细胞抗角蛋白染色呈阴性,抗波形丝蛋白染色呈阳性,符合成纤维细胞特征。3.2 TNF-α抑制hPDLCs增殖并促进其分泌IL-6,而激活素A拮抗TNF-α上述作用。3.3激活素A促进hPDLCs分泌TGF-β1,但此效应可被TNF-α抑制。3.4激活素A促进hPDLCs的FN、Col I和MMP-9 mRNA表达,而TNF-α下调激活素A诱导的MMP-9 mRNA高表达。Western blotting结果同样显示激活素A上调hPDLCs的MMP-9蛋白表达,而TNF-α则下调激活素A诱导的MMP-9蛋白表达升高。3.5激活素A与TNF-α均可提高hPDLCs黏附活性,两者联合具有协同增强作用。3.6激活素A诱导hPDLCs迁移,而TNF-α抑制激活素A诱导的hPDLCs迁移。4.激活素A与TNF-α调控人成纤维细胞活化机制4.1激活素A对hPDLCs的Smad信号相关分子表达无显着影响,而TNF-α下调ActRⅡA表达。4.2激活素A上调hPDLCs的p-ERK1/2和p-p38蛋白水平,而TNF-α拮抗激活素A引起的ERK1/2和p38磷酸化水平升高。三、结论综上所述,激活素A属于新的成纤维细胞趋化因子,并且激活素A与TNF-α对成纤维细胞活性调控作用不同,两者联合作用成纤维细胞主要表现为相互拮抗效应,其拮抗作用不通过经典Smad信号通路,而是通过ERK信号介导。上述结果提示,激活素A可能作为TNF-α的天然拮抗剂在炎症活动期发挥抗炎作用,而TNF-α可能通过拮抗激活素A作用发挥抗纤维化效应,两者的作用平衡可能是影响成纤维细胞活性的关键因素。本研究不仅揭示激活素A与TNF-α共同调控成纤维细胞活化具有重要的生物学意义,也为进一步探索成纤维细胞介导疾病的治疗药物靶点提供新的思路和研究基础。
商玲玲[2]（2021）在《脯氨酸羟化酶抑制剂DMOG在牙周组织再生中生物学效应的研究》文中进行了进一步梳理背景与目的:慢性牙周炎是最常见的细菌感染性口腔疾病之一,通常伴随着牙龈炎症、附着丧失、牙槽骨吸收,最终导致牙齿松动、移位和脱落。在去除局部刺激因素控制炎症之后,牙周炎治疗的终极目标是实现牙周组织的再生。近年来,牙周组织工程取得了显着疗效,局部应用生长因子是促进牙周组织再生的有效方法。然而,这些大分子蛋白质有效半衰期短,蛋白稳定性差,剂量要求高,成本高等特点限制了其临床应用。而生物活性的小分子化合物除了具有优越的生物学效应之外,还具有良好的稳定性、剂量要求低、成本低等优点。因此,基于小分子化合物的相关研究对实现牙周组织再生具有重要意义。二甲基乙二酰基甘氨酸（dimethyloxalylglycine,DMOG）是一种细胞渗透性的小分子化合物,为脯氨酸羟化酶（prolyl hydroxylases,PHDs）的竞争性抑制剂。DMOG具有多种生物学效应,其在多种炎症性疾病如炎症性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）中能够发挥保护作用。作为PHDs的抑制剂,DMOG可以间接激活乏氧诱导因子（hypoxia-inducible factor 1,HIF-1）,从而模拟乏氧状态,并可以促进新生血管形成,改善缺血-再灌注损伤。控制局部炎症和实现组织再生是治疗牙周炎的关键环节,而DMOG在牙周组织再生中的生物学效应尚未明确。因此,本课题研究了 DMOG在脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的牙龈成纤维细胞（human gingival fibroblasts,HGFs）体外炎症模型中的调控作用及相关的作用机制;为进一步明确DMOG的炎症调控作用,探究了 DMOG在具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum,F.nucleatum）诱导的HGFs体外炎症模型中对炎症因子表达的影响;制备负载DMOG的静电纺丝纤维膜并研究其在体内牙周组织创伤修复过程中的免疫炎症调控作用;为进一步完善DMOG的再生潜能,将生物活性的二维纳米材料Nanosilicate（nSi）与DMOG结合,制备负载DMOG和nSi的静电纺丝纤维膜并进行相关的材料表征;研究复合纤维膜在体外对成骨成血管分化,体内对干细胞募集,新生血管形成,骨组织改建以及功能性牙周组织再生的影响,从而为牙周炎的再生性治疗建立新的治疗策略。材料与方法:1.DMOG在LPS诱导的体外炎症模型中的调控作用和相关机制研究首先,通过细胞活性实验筛选出不具有细胞毒性的DMOG浓度用于后期实验;其次,用不同浓度的DMOG（10、50和100 μmol/L）预处理HGFs 24 h,用浓度为5 μg/mL的牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis）LPS分别处理HGFs 2、6、12和24 h,建立体外炎症模型。通过实时荧光定量聚合酶链式反应和酶联免疫吸附实验评估炎症因子在基因和蛋白水平的表达。利用蛋白免疫印迹技术（western blot）及细胞免疫荧光实验检测相关信号通路的表达情况。利用小干扰技术将PHDs的不同表型敲低,然后通过qRT-PCR检测LPS诱导的炎症因子表达情况以确定DMOG调控效应的PHD表型特异性。2.DMOG在F.nucleatum诱导的体外炎症模型中调控作用首先,通过聚合酶链式反应实验（polymerase chain reaction,PCR）对F.nucleatum ATCC 25586（源自山东省口腔组织再生重点实验室）进行鉴定。用不同感染复数（multiplicity of infection,MOI）的F.nucleatum（MOI=10、50 和 100）感染HGFs 12 h,通过结晶紫染色实验观察细菌感染对细胞形态和数目的影响。然后,用不同浓度的DMOG（10、50和100 μmol/L）预处理HGFs 24 h,用MOI为100的F.nucleatum分别感染牙龈成纤维细胞2、6和12 h,建立体外炎症模型。通过qRT-PCR和ELISA检测炎症因子在基因和蛋白水平的表达。3.负载DMOG的静电纺丝纤维膜在体内牙周创伤早期的免疫炎症调控效应首先,制备负载DMOG的静电纺丝纤维膜,将一定量的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly（lactic acid-co-glycolic acid）,PLGA）（LA:GA=75:25,MW=90,000）溶解于六氟异丙醇（hexafluoroisopropanol,HFIP）中,制备出20%（w/v,质量/体积）浓度的溶液。然后,将DMOG按照与PLGA质量比为1%（w/w,质量/质量）的剂量加入到PLGA溶液中,制备成均一的纺丝液。进一步通过静电纺丝技术,制备出PLGA纤维膜（PLGA）和负载DMOG的PLGA纤维膜（DMOG-PLGA）。通过扫描电镜（scanning electronic microscope,SEM）和傅里叶变换红外光谱（fourier transformed infrared spectrum,FTIR）对制备的材料进行相关的表征;通过细胞骨架染色实验和CCK-8（cell counting kit-8）实验评价材料的生物相容性。其次,建立Wistar大鼠下颌骨牙周缺损模型,将纤维膜材料植入到牙周缺损中,通过苏木素-伊红（hehematoxylin and eosin,H&E）染色、免疫组化染色及免疫荧光染色评价其在损伤早期免疫炎症反应中的调控作用。4.负载DMOG和nSi的静电纺丝纤维在牙周组织再生中的效应利用静电纺丝技术制备负载DMOG（1%w/w）和nSi（5%w/w）的复合纤维膜（DMOG/nSi-PLGA）,通过SEM、FTIR以及拉伸-断裂试验对材料进行表征;检测复合纤维膜中DMOG和Si的体外释放;将牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells,PDLSCs）接种在材料表面,利用SEM评价细胞在纤维膜上的粘附和生长;通过CCK-8实验检测材料浸提液对PDLSCs增殖的影响;将细胞接种在不同的纤维膜表面,通过碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性实验和qRT-PCR评价纤维膜的促体外成骨分化作用;通过小管形成实验和qRT-PCR评价纤维膜的促体外成血管能力;将材料植入Wistar大鼠的下颌骨缺损模型当中,通过免疫荧光双染,检测体内CD90+CD34-干细胞的募集情况;通过免疫组化染色检测成血管相关标记物的表达;通过H&E染色,抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP）染色,免疫组化染色以及micro-CT评价纤维膜的体内骨改建效应;通过H&E染色评价新生牙周膜纤维的角度。结果:1.DMOG通过TLR4/MyD88介导的Akt/NF-κB和MAPK信号道路调控LPS诱导的炎症因子表达不同浓度的 DMOG（10、50、100、250、500 和 1000 μmol/L）分别处理 HGFs 24 和 48h。CCK-8 实验表明,高浓度的 DMOG（250、500 和 1000 μmol/L）明显抑制细胞增殖,而低浓度的DMOG（10、50和100μmol/L）对细胞增殖没有显着影响,因此,将10、50、和100 μmol/L的DMOG用于后续实验。流式细胞术也表明,10、50和100 μmol/L的DMOG不会引起细胞的凋亡。qRT-PCR和ELISA实验表明,DMOG抑制LPS诱导的炎症因子白介素-6（interleukin-6,IL-6）和IL-8在基因和蛋白水平的表达,并下调炎症因子肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis growth factor-α,TNF-α）和 IL-1β,及细胞表面 Toll 样受体-4（Toll like receptor,TLR-4）和下游连接蛋白骨髓分化主要响应蛋白88（myeloid differentiation primary response protein 88,MyD88）在基因水平的表达。Western blot和免疫荧光染色实验证实,DMOG抑制LPS诱导的Akt/NF-κB和MAPK信号通路的激活。此外,通过小干扰技术将PHD1和PHD2敲低之后,LPS诱导的炎症因子表达在PHD2敲低的细胞中有所降低。2.DMOG调控F.nucleatum诱导的HGFs炎症因子表达琼脂糖凝胶电泳成像结果显示,F.naucleatum的PCR扩增产物DNA条带位于100到250 bp之间,片段大小约为146 bp。结晶紫染色实验结果表明,不同MOI 的 F.nucleatum（MOI=10、50 和 100）感染 HGFs 12 h 之后,细胞的形态和数目均未发生明显改变,因此,选用MOI为100的F.nucleatum用于后续实验。qRT-PCR结果表明,DMOG抑制Fnucleatum诱导的炎症因子IL-6、IL-8、TNF-α和IL-1β在基因水平的表达。然而,在蛋白水平,F.nucleatum并未引起IL-1β的分泌,DMOG对F.nucleatum刺激的IL-6和IL-8早期（2和6 h）分泌有抑制效应,而对12 h的表达作用不显着。3.负载DMOG的静电纺丝纤维膜调控牙周创伤早期免疫炎症反应SEM结果表明,制备的静电纺丝膜呈现交错的纤维状结构,纤维的形态光滑无断裂,直径分布均匀;FTIR显示,掺入DMOG后纤维膜表面的官能团未发生明显变化。细胞骨架染色结果证明,PDLSCs可以在材料表面正常粘附和生长;CCK-8实验证明,DMOG-PLGA纤维膜对细胞增殖无明显细胞毒性,表明材料具备良好的生物相容性。将材料植入大鼠牙周缺损后,术后早期（1周和2周）,H&E染色结果表明,缺损区内的炎症细胞浸润明显减少;骨组织的体积稍有增加。免疫组化以及免疫荧光染色结果显示,iNOS阳性M1型巨噬细胞数目减少,CD206阳性M2型巨噬细胞数目有所增加;免疫炎症相关指标CD11b,CD40L阳性细胞数明显减少。4.负载DMOG和nSi的成骨/成血管双功能纤维膜促进牙周组织再生通过SEM观察到,所制备的各组纤维膜具有相似的纤维状结构,纤维直径分布较为均匀,表面光滑;掺入DMOG和nSi之后,材料表面官能团未发生明显变化;拉伸-断裂试验证明,掺入nSi之后,纤维膜的机械性能有所增强;并且复合纤维膜能缓慢持续释放DMOG和Si至30天左右。SEM证明,细胞接种在材料表面之后,能够粘附在材料表面生长;CCK-8证明材料浸提液对细胞增殖没有明显的细胞毒性。成骨诱导之后,接种在复合纤维膜表面的牙周膜干细胞成骨分化能力明显增强,表现为ALP活性增强以及成骨相关指标表达升高。同时,复合纤维膜能显着促进细胞的体外成小管能力和成血管相关指标的表达。材料植入大鼠牙周缺损之后,能明显促进CD90+CD34-干细胞的募集;H&E染色,TRAP染色,免疫组化染色以及micro-CT结果表明,纤维膜能明显促进牙周骨改建;促进成血管相关标记物的表达;并能够获得牙骨质再生及优化牙周膜纤维的排列。结论:1.DMOG在LPS诱导的HGFs体外炎症模型中发挥负向调控作用,通过TLR4/MyD88介导的Akt/NF-κB和MAPK信号通路抑制炎症因子表达,并且,这种负向调控作用依赖于PHD-2。2.F.nucleatum感染的HGFs炎症因子表达明显增高,DMOG能够明显抑制F.nucleatum诱导的炎症因子在基因水平的表达。3.负载DMOG的PLGA静电纺丝纤维膜能够调控牙周创伤修复过程中的免疫炎症反应,调节炎症免疫相关指标的表达。4.负载DMOG和nSi的静电纺丝纤维膜能够增强体外成骨/成血管分化,促进体内干细胞募集、骨组织改建、新生血管的形成以及功能性牙周组织再生。
刘鹏[3]（2021）在《含稀土碳酸化羟基磷灰石材料的制备及其应用于骨修复的实验研究》文中进行了进一步梳理由口腔颌面部肿瘤、创伤、先天性疾病以及炎症导致的骨组织缺损是口腔诊疗中的常见问题,同时也是口腔医生修复骨缺损时所面临的难题之一。颌骨缺损严重影响咀嚼、吞咽、语言等重要生理功能,骨缺损治疗效果不佳或骨缺损修复失败都会直接影响患者的生活质量。口腔种植修复是目前牙列缺失和牙列缺损的主要治疗方式。充足的骨量是保证种植成功的关键之一,但在复杂的咬合关系及不同的口腔环境影响下,牙齿缺失患者往往伴有不同程度的缺牙区牙槽骨萎缩,易引发种植失败的问题。自体骨虽被临床认为是骨移植的“金标准”,但第二术区的开辟造成的创伤较为严重,来源限制,无法随意塑形,且自体骨移植后会发生一定的并发症。异体骨也受限于原料需求和排异反应等造成价格昂贵,并且存在修复风险。“骨组织工程”概念的提出即是针对以上问题,提出的以种子细胞、细胞因子、支架为媒介代替传统的骨移植的治疗方法。利用骨修复材料与种子细胞及细胞因子的相互配合,实现骨缺损的高水平修复是针对较大骨缺损量的骨缺损治疗的必由之路。近年来随着细胞工程和基因编辑技术的发展,组织工程中种子细胞和细胞因子的研究取得了很大进展,骨组织工程里可选用的支架体系种类繁多,但其各自存在的无法避免的问题使得其应用仍然非常受限。例如,金属支架的生物惰性、力学不匹配、高分子材料降解速率可控性差、引发排异反应、传统陶瓷支架的脆性、较差的骨传导性等问题。寻找合适的材料体系,设计并制备出符合不同成骨需求的个性化支架,是骨组织工程在口腔颌骨修复从理念走向临床应用的关键。羟基磷灰石（hydroxyapatite,HA）是骨骼和牙齿组织中天然存在的无机矿物成份,由HA制备成的支架一直被骨组织工程修复领域所推崇。然而,实验室中常用的HA主要是Ca10（PO4）6（OH）2及其它形式的磷酸钙材料,这与骨组织中的HA结晶性差、存在多种离子的梯度取代、在不同骨位置的成份差异等的实际需求相差较大。在文献里已报道的应用中,未掺杂的纯HA存在脆性大、降解效果差、与新生骨组织存在界面等问题,仍然是限制其作为骨组织工程支架的瓶颈之一。如何设计并制备出具有与人体骨组织中的矿物相类似的仿生HA骨粉材料,并且根据不同部位的骨缺损需求,个性化订制骨修复材料,是推动骨组织工程在临床应用的关键。在骨骼和牙齿中的HA主要为存在金属离子梯度掺杂的碳酸根取代的HA,碳酸根的质量分数为3-8wt%,其中碳酸根主要取代磷酸根的晶体学位置,称为B-型羟基磷灰石。碳酸根取代可以使HA结晶度变差,结构更松散,从而有利于破骨和骨重建,其松散的结构更利于与胶原及其它蛋白的结合从而降低材料的脆性,使之具有更强的塑性。因此,开发出碳酸根取代的HA材料,实现碳酸根的浓度可控取代,对于从支架方面推动骨组织工程应用于口腔临床骨缺损治疗具有重要意义。稀土元素由于其特征的光谱性质,可作为生物材料的荧光标记物,尤其是其离子半径与Ca2+离子接近,有很多文献已将其应用于骨植入材料在体内演化情况的荧光标记。另外,也有文献报道低剂量的稀土离子掺杂不但可以调节HA的结晶度,而且还能通过缓释的稀土离子激活钙通道,从而促进间充质细胞向成骨细胞的分化。基于以上关于HA应用于骨组织工程支架的研究现状,我们提出以碳酸根的可控取代和稀土的可控掺杂为源头,制备出系列具有不通碳酸根和稀土离子含量的B-型羟基磷灰石仿生骨粉材料,采用3D打印的方式,将其制备成支架,在细胞和动物水平上评价其促成骨效果,为骨组织工程研究提供更接近于骨组织的可个性化订制的支架体系,从而推动解决口腔颌骨修复所面临的的复杂的成骨环境和特异性成骨需求的问题。本论文主要分为（1）材料设计与可控制备,（2）细胞水平评价小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1）的增殖、分化与关键蛋白表达,（3）动物水平评价新生骨组织形成、钙化及新骨在支架中的生长等三个部分,分别简述如下:（1）碳酸化及稀土掺杂的HA仿生骨粉的制备根据在生理环境下的钙离子、磷酸根离子、碳酸根离子的热力学平衡条件,利用Pourbaix计算并得到了B-型羟基磷灰石的矿化条件及调节参数,制备出了系列碳酸根取代的羟基磷灰石（carbonated hydroxyapatite,CHA）纳米材料,通过控制反应条件和初始碳酸根浓度,可调节产物HA中碳酸根的比例。在此基础上,将与Ca2+离子具有相近离子半径但是不同电荷的稀土离子掺杂进入HA及CHA晶格中,从而制备出系列稀土离子掺杂的HA及CHA材料。结构分析表明具有三角形构象的碳酸根阴离子在取代具有四面体构象的磷酸根离子时,以相对于c-轴呈30 o角的方式扭曲叠加在磷酸根四面体的一个较长P-O键参与的面上。随着碳酸化程度的增加,纳米棒的长径比从3.6降为2.9。稀土离子的种类可以影响B-型羟基磷灰石纳米棒的形貌,并且碳酸化并不会影响稀土在HA中的配位环境及发光性质。采用该方法得到的B-型羟基磷灰石材料与人体骨组织中的矿化成份接近,并且稀土元素可以均匀地掺杂在材料的晶格中,既可以利用其特征荧光光谱标记其在体内的变化过程,又可以作为潜在的成骨细胞分化促进剂来激活成骨过程,以实现更好的促成骨效果。（2）细胞实验检测稀土掺杂及碳酸根取代的HA材料的生物学性能选取HA、1mol%铕（europium,Eu）掺杂的HA（Eu-HA）、1mol%铽（terbium,Tb）掺杂的HA（Tb-HA）、碳酸根取代度为3.3wt%的羟基磷灰石（CHA）、1mol%Eu-掺杂的CHA（Eu-CHA）、1mol%Tb-掺杂的CHA（Tb-CHA）六组材料为代表,研究了它们对于MC3T3-E1细胞的形态、增殖及成骨分化的影响。采用三维打印机将以上材料打印成支架,通过系统的细胞增殖、分化及蛋白表达测试,评价其作为骨修复材料应用于骨组织工程的潜力。六组材料都是潜在的骨修复材料,其中Tb的掺入可促进MC3T3-E1细胞的黏附增殖,尤其是Tb-CHA,在ALP染色和定量、茜素红染色、成骨相关蛋白表达实验结果中,表现出了最佳的促成骨效果,明显优于Tb-HA、HA和CHA;Eu的掺入减缓了MC3T3-E1细胞的增殖、黏附及成骨分化。（3）稀土掺杂及碳酸根取代的HA支架促大鼠颅骨缺损修复的实验研究通过以上研究,我们发现在体外促进成骨细胞增殖、黏附和成骨分化方面,掺杂Tb的材料优于掺杂Eu的材料,CHA优于HA,故我们采用大鼠颅骨缺损模型,分别植入HA支架、Tb-HA支架、CHA支架和Tb-CHA支架材料,评价骨缺损的修复。经影像学及HE染色分析结果可知,术后4周,各组对骨缺损的修复均不明显。术后8周,空白对照组缺损处仅表现为少量的新骨形成,HA组未见明显愈合,Tb-HA可见缺损部位实现了一部分修复,HE染色切片可见新生骨;与HA组相比,CHA组对骨缺损进行了一定程度的修复;Tb-CHA组显示出最强的成骨效果,且可降低局部炎症反应。综上所述,本论文从应用于骨组织工程修复骨缺损支架的源头出发,通过对HA材料矿化机制的深入分析,设计并制备出了系列与人体骨组织成份最为接近的CHA材料,并且将稀土离子选择性地标记在HA结构的Ca1晶体学位置;采用3D打印技术,将模型材料打印成支架,分别在细胞水平上和动物水平上,通过系列实验手段检测了材料对MC3T3-E1细胞的增殖、分化能力、蛋白表达水平和新骨生长情况的影响,发现了碳酸根取代和稀土Tb3+离子掺杂都可促进HA材料的骨缺损修复效果。本论文的研究将从源头上把以HA为主的骨组织工程支架材料引导为碳酸根取代的HA和异价金属离子掺杂HA,利用这种碳酸根和稀土离子调控的成骨性能差异,借助3D打印设备,根据不同位置的成骨需要个性化的设计支架,订制具有不同成骨需求的支架材料,从而为像口腔颌面部骨组织这种复杂的骨缺损疾病提供个性化的修复植入材料。
陈玥琦[4]（2021）在《DC细胞来源IFN-λ1对炎性骨丢失保护效应的机制探讨》文中研究说明研究背景骨感染能够导致进行性骨质破坏、异常骨形成和全身炎症反应等多种并发症。从骨感染患者中分离出的众多细菌种类中,金黄色葡萄球菌作为流行的细菌亚型中所占比例最多的一类。现如今,尽管在骨感染的病理生理学和治疗方面的探索取得了显着进展,但它仍是骨科医生在临床诊疗过程中所遇到的难题,其中开放性骨折引起的骨感染病例较为严重。骨骼系统的骨基质动态平衡依赖于微环境中的成骨细胞、破骨细胞和其他功能细胞共同维持调控。随着年龄的增长和雌激素水平的降低,骨吸收逐渐占据主导地位,导致全身骨骼破坏。严重创伤应激和感染后炎症状态能够加快骨破坏进程。有效的抗骨质疏松治疗能够帮助减少骨折的发生。同时,涉及炎症相关的骨疾病如类风湿性关节炎、脓毒症关节炎和创伤性骨髓炎,也会影响骨骼系统的正常功能。当感染发生在骨骼周围时,炎症反应引起的局部组织破坏,给临床治疗带来巨大的挑战。目前,进一步了解不同类型的骨破坏病理过程,对实行有效的预防和治疗同样至关重要。免疫系统和骨骼系统处于骨骼微环境中,这两个系统紧密联系,相互配合。免疫细胞及其代谢产物参与影响成骨细胞、破骨细胞的活性来调节骨代谢稳态。许多研究表明,细胞因子如TNF-α,IL-1β和IL-17对炎症性骨丢失能够产生积极的促进作用。同时,这些细胞因子的特异性拮抗剂也逐渐被开发出来,为创伤性骨感染的防治提供新的视角。骨感染所致炎性骨溶解在骨科手术中较为常见。破骨细胞过度融合和分化破坏“骨形成和骨吸收”之间的动态平衡,导致严重的骨基质丢失。抑制破骨细胞的形成和骨溶解功能是预防炎性骨侵蚀的有效方法。本研究首次证实树突状细胞来源的IFN-λ1在体内抑制炎性骨破坏,并在体外探讨其在破骨细胞形成中的作用机制。研究目的1.探讨IFN-λ1在感染性骨组织和非感染性骨组织中的差异表达;2.探讨骨感染状态下IFN-λ1的来源;3.探讨外源性IFN-λ1对体外破骨细胞生成的影响及其机制;4.探讨外源性IFN-λ1对小鼠颅骨炎性骨溶解模型的影响;研究方法1.应用RNA-Seq方式检测感染性骨组织和非感染性骨组织中IFN-λ1的表达差异。2.破骨细胞与LPS预处理树突状细胞共培养实验证实,IFN-λ1来源于炎症微环境中的树突状细胞。3.外源性重组IFN-λ1蛋白干预条件下对两种破骨细胞诱导过程的影响以及其潜在机制。4.采用LPS局部注射的小鼠颅骨炎性溶解模型,通过显微CT、组织学分析和ELISA检测,分析重组IFN-λ1蛋白对炎性骨溶解的体内作用效果。研究结果1.RNA-Seq结果提示IFN-λ1在感染性骨组织中的表达高于非感染性骨组织,并利用免疫组织化学染色的方式得出相一致的结果。2.LPS预处理树突状细胞后可高表达IFN-λ1。3.TRAP染色结果显示,LPS预处理的树突状细胞条件培养液对破骨细胞分化有明显的抑制作用。在同时加入IFN-λ1单克隆抗体后,这种抑制的作用效果可被逆转。4.外源性重组IFN-λ1蛋白对NF-κB信号通路以及NLRP3炎症小体的形成为明显的负向调控作用,并正向促进激活JAK-STAT信号通路,进而达到抑制破骨细胞生成、骨吸收活性、F-肌动蛋白环形成、破骨细胞特异性基因表达、促炎因子释放、NF-κB p65和NFATc1细胞核易位。5.体内实验表明,IFN-λ1通过抑制破骨细胞过度融合和骨吸收活性来缓解脂多糖诱导的炎性骨质丢失。6.综上所述,研究结果证实树突状细胞来源的IFN-λ1在体外和体内均能抑制破骨细胞的形成和骨吸收活性。研究结论IFN-λ1的表达情况在感染骨组织中更高,其有助于激活炎症反应。LPS诱导的颅骨炎性骨丢失模型显示,颅骨局部注射重组IFN-λ1蛋白可通过调节感染所致炎性微环境,减少促炎因子的释放显着保护骨丢失。外源性IFN-λ1通过正向促进JAK-STAT信号通路负向调控NF-κB p65核转位以及NLRP3形成进一步抑制破骨细胞的形成和骨吸收功能。IFN-λ1为破骨细胞过度激活相关的骨感染疾病的治疗提供了新的靶点与理论基础。
黄韦华[5]（2021）在《ABA、高脂血浆及PKA在人iPSC分化巨核细胞中的作用及机制探讨》文中提出第一部分脱落酸促进体外人iPSC分化巨核细胞在临床上,血小板的供应经常难以满足血液输注的需求。为解决这一问题,建立并优化从CD34+细胞或人多能干细胞（human pluripotent stem cell,h PSC）分化功能性血小板的方法势在必行。我们发现植物激素脱落酸（abscisic acid,ABA）可以增加人诱导PSC（hiPSC）分化的巨核细胞（megakaryocyte,MK）和血小板的生成。在血小板产生过程中,ABA处理不仅在第14天促进了CD41+MK的生成,而且在第19天增加了CD41+/CD42a+和CD41+/CD42b+MK和血小板的生成。其中第0-14天ABA作用更关键。此外,MK生成过程中的ABA与其受体LANCL2及GRP78的结合介导PKA级联的Akt和ERK1/2信号通路活化在MK成熟和血小板生成过程中起重要作用。第二部分高脂血浆在体外人iPSC分化巨核细胞中的作用及机制初探在临床上发现高血脂病人发生脑卒中的比例远比非高血脂的高,并且高血脂和高的血小板数量相关,推测高血脂有可能与血小板的形成相关。为此我们统计分析了2010年9月至2019年12月中国人民解放军海军军医大学第一附属医院神经内科的317例脑梗患者及健康体检中的381例健康或单独被诊断为高脂血症的患者,研究两组人群中血脂对血小板、红细胞、白细胞计数的影响。研究结果表明,在健康人群中,高甘油三酯血症与粒系-巨核细胞系的形成相关,高胆固醇血症与巨核细胞系形成相关。高脂亦在脑梗患者体内与血小板水平的升高相关。在分化培养基APEL的基础上添加不同浓度的血浆可促进体外人iPSC向造血-MK分化进程。研究表明,高脂血浆中的脂质成分更能够促进体外人iPSC向造血-MK分化,该过程可能通过脂肪酸转位酶CD36进行的脂肪酸转移促进TPO介导的JAK2,AKT,ERK1/2（MAPK1/2）,STAT3信号通路的激活水平增强,参与MK体外分化进程。第三部分PKA在体外iPSC分化巨核细胞中的作用初探蛋白激酶A（Protein kinase A,PKA）作为血小板内c AMP信号通路最为重要的效应器,可以磷酸化血小板激活的多种蛋白。PKA可调控血小板凋亡,影响血小板的寿命和体内外存活时间。PKA能否影响人iPSC分化MK及血小板的进程目前尚缺乏证据。在本部分研究中,我们构建了PKA过表达及敲除的人外周血源i PS细胞系。同时,我们的初步研究结果表明,PKA的敲除能促进体外人iPSC向MK的分化。
李昊[6]（2019）在《Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究》文中进行了进一步梳理肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）是一种生长因子,属于TGF-β超家族,主要在骨骼肌细胞中表达,对肌肉的生长具有负调控作用。MSTN基因的过表达可引起肌肉萎缩,而MSTN基因发生突变或被敲除时则会使动物的肌肉量增加,产生双肌现象。本研究利用克隆获得的绵羊MSTN基因构建真核表达载体,同时设计合成MSTN干涉序列并构建RNA干涉载体,共转染293GP细胞后经荧光定量PCR检测获得干涉效率最佳的载体;将其线性化后转染绵羊成纤维细胞后,经G418筛选获得MSTN敲低转基因细胞系;以MSTN敲低转基因细胞为核供体,利用细胞核移植的方法获得MSTN敲低转基因绵羊克隆胚和转基因绵羊,以期建立获得肌肉丰满绵羊新品系的方法。此外,本研究利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,为后续利用CRIISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。本研究的结果与结论如下:1、绵羊MSTN基因RNA干涉载体构建和活性分析（1）绵羊Myostatin基因的克隆:参照GenBank中绵羊MSTN基因序列（AF019622.1）,采用RT-PCR扩增技术,克隆绵羊肌肉生长抑制素基因,将其连接到pcDNA3.1（+）载体,获得肌肉抑制素基因真核表达载体;（2）RNA干涉表达载体的构建:参照绵羊MSTN基因的mRNA序列,设计合成RNA干涉序列并与pRNAT-U6载体连接,获得RNA干涉表达载体。与真核表达载体共转染293GP细胞后,通过实时定量PCR检测干涉效率,获得干涉效果最佳序列。（3）RNA干涉载体表达活性检测:将筛选获得的RNA干涉载体线性化,采用显微注射的方式,注射到小鼠原核时期的胚胎中,注射后的胚胎可以分裂为2细胞,经体外培养最终获得表达绿色荧光蛋白的囊胚,表明所构建的RNA干涉载体可以在胚胎中正常表达并支持胚胎的发育。2、绵羊MSTN敲低转基因成纤维细胞系的建立通过脂质体转染法将线性化的RNA干涉载体转染到绵羊成纤维细胞中,经G418筛选,获得转基因阳性细胞;PCR结果显示,构建的基因已整合到细胞基因组中;对获得的转基因阳性细胞的形态学特征、生长曲线以及冷冻复苏后特征的检测结果表明,转基因细胞具有正常细胞的生物学特征。3、绵羊MSTN敲低转基因胚胎的获得（1）供体细胞的修饰和处理:来源于成纤维细胞的核移植胚胎的卵裂率为44.6%,高于MSTN敲低转基因细胞的33.0%,且差异显着,但两者的桑/囊胚率差异不显着（分别为24.1%和15.6%）;供体细胞不需进行血清饥饿处理,使用接触抑制方法可以达到相同效果。（2）重构胚的融合、激活和培养:采用逐个融合（一次一个）的融合方式能显着提高融合效率,但融合后的胚胎发育能力和批量融合（一次多个）方法比差异不显着;采用A23187+6-DMAP激活卵母细胞与采用Ionomycin+6-DMAP激活方法之间的效果差异不大;重构胚融合后培养34 h后再进行激活可有效提高胚胎卵裂和囊胚发育率。KSOM和SOFaa都可以用来进行绵羊克隆胚的体外培养。4、转基因核移植胚胎的移植和胎儿鉴定（1）重构胚的移植:采用输卵管移植方法,将原核期或2-细胞期的核移植胚胎（242枚）移植到同步发情的受体绵羊（23只）体内,以检验其在体内的发育能力。（2）转基因胎儿鉴定:在23只受体中,最终只有1只受体妊娠,但妊娠期间发生流产,未能获得成活个体,获得流产胎儿1只;对流产胎儿进行PCR鉴定,结果显示,胎儿基因组中整合有目的基因。5、肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得（1）Rosa26基因sgRNA的设计和体外验证:根据小鼠Rosa26基因序列设计sgRNA,体外编辑试验表明,所设计的sgRNA可以对Rosa26位点发生编辑作用;（2）肌肉特异打靶载体的构建:通过PCR和同源重组连接,成功构建了肌肉特异表达Cas9蛋白的同源打靶载体Donor-SP-Cas9-DsRed;（3）Rosa26基因编辑胚胎和小鼠的获得:注射Rosa26 sgRNA和Cas9到小鼠胚胎,注射后的胚胎可以正常卵裂并支持囊胚发育,通过PCR和测序结果显示,获得的胚胎为基因编辑胚胎,注射的胚胎经胚胎移植后,获得了 Rosa26基因编辑小鼠;（4）通过将同源打靶载体与Rosa26 sgRNA和Cas9联合注射的方式,获得肌肉特异表达Cas9蛋白的基因打靶胚胎;综上所述,通过构建MSTN基因RNA干涉载体、转染绵羊成纤维细胞建立MSTN敲低转基因细胞系和转基因细胞核移植等程序,可以获得MSTN敲低的绵羊转基因克隆胚,胚胎移植后获得流产胎儿且携带外源基因,表明获得的重构胚具有体内发育能力,可以通过该方法获得MSTN敲低的转基因绵羊。本研究结果为培育MSTN敲低的绵羊新品系提供了依据。此外,通过利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,初步在小鼠上建立了基因编辑和基因打靶体系,为后续利用CRISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。
赖满香[7]（2018）在《梓醇促进BMSCs增殖分化及Hedgehog信号通路的研究》文中提出目的骨质疏松（Osteoporosis,OP）是一种以骨强度下降,骨微观结构改变和骨脆性增加为特征的慢性全身性骨骼系统疾病,是生理衰老在骨骼方面的一种特殊表现。随着我国社会老龄化进程的加快和我国平均寿命的延长,OP的发病率不断上升,预计到2020年我国将成为世界上拥有OP患者最多的国家,因此,寻求其发病机理和安全有效的防治药物显得尤为重要。骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cells,BMSCs）是来源于骨髓的一类多潜能成体干细胞,其向成骨细胞（Osteoblasts,OB）分化能力下降是造成OB生成不足,骨形成降低,发生OP的主要病机之一。中医学认为“肾藏精,主骨,生髓”,即骨髓由肾精所化生,肾精充足,骨髓生化有源,骨骼得养,则骨骼生长发育正常,强健有力,若肾精亏虚,则骨髓生化乏源,不能充养骨骼则致骨髓空虚,发为OP,这一理论与现代医学BMSCs向成骨分化能力下降造成OP的发生极其相似,因此,现代医学认为BMSCs可能是肾精在细胞水平上的表现形式,并多从补肾中药入手,寻找能够促进BMSCs的增殖及诱导其向成骨分化的有效药物,以促进骨的形成,延缓OP的发生。梓醇是传统补肾滋阴中药地黄的有效活性成分,研究表明,其对神经系统疾病,糖尿病、心血管疾病,骨质疏松等多种疾病均体现出一定的防治作用。本研究观察梓醇对BMSCs增殖、骨向分化的影响,以及观察它对分化相关的Hedgehog信号通路的影响,明确梓醇作用于BMSCs而影响防治OP的具体靶点,从一条新途径阐明梓醇对OP的调节机制,对评价梓醇防治OP的有效性提供细胞分子学依据,另一方面丰富中医学理论“肾藏精,主骨,生髓”理论的现代科学内涵,也为中医养生本草的现代研究提供实验依据。方法1.采用全骨髓贴壁法分离和培养BMSCs;2.通过倒置显微观察BMSCs形态学特性、电子显微镜观察BMSCs微观结构,CCK-8法检测BMSCs生长曲线,流式细胞仪检测BMSCs的细胞周期及细胞表面标志分子CD29、CD90、CD45、CD80,ALP染色和茜素红染色鉴定其成骨分化特性,油红O染色鉴定其成脂特性;3.CCK-8方法检测不同浓度梓醇（1×10T3mol/L～1×10-9mol/L）对BMSCs的增殖活性的影响;4.pNPP法检测不同浓度梓醇（1×10-3mol/L～1 ×10-9mol/L）对BMSCs碱性磷酸酶活性的影响,以确定梓醇最佳的促BMSCs骨向分化浓度;5.以最佳促骨向分化浓度的梓醇对BMSCs进行干预,实验分四组:对照组（control group）:BMSCs细胞以含15%胎牛血清的α-MEM完全培养液培养;梓醇组（catalpol group）:含15%胎牛血清的α-MEM完全培养液培养的BMSCs细胞中加入最佳浓度的梓醇;经典组（classic group）:BMSCs细胞中加含15%胎牛血清的成骨诱导液;联合组（combination group）:BMSCs细胞中加含15%胎牛血清的成骨诱导液+梓醇最佳作用浓度。6.ALP试剂盒检测各实验组对BMSCs ALP活性的影响,茜素红染色计数矿化结节的方法评价梓醇对BMSCs细胞矿化的影响,ELISA法检测梓醇对BMSCs BGP的影响;7.QPCR技术检测各实验组干预BMSCs骨向分化过程中Hedgehog信号分子Shh、IhhmRNA 的表达;8.Western blotting技术检测各实验组干预BMSCs骨向分化过程中Hedgehog信号传导通路中跨膜受体Ptch1、Smo蛋白的表达和下游核转录因子Gli1蛋白的表达。结果1.分离培养的细胞符合BMSCs的生物学特性,流式细胞仪检测大鼠BMSCs表面标志抗原CD90、CD29表达阳性,CD45及CD80表达阴性,BMSCs经诱导能向成骨细胞、脂肪细胞分化。2.CCK-8方法检测结果显示:细胞培养第1、3、5 d,1×10-3mol/L～1×10-9mol/L浓度范围的梓醇组OD值与空白组比较均有显着升高（P<0.05）;第7 d,1×10-4mol/L～1×10-9 mol/L梓醇组OD值与空白组比较均有显着升高（P<0.05）,而1×10-3mol/L梓醇组OD值与空白组无显着性差异（P>0.05）;第9 d,1 ×10mol/L～1 ×10-9 mol/L梓醇组OD值与空白组比较均有显着升高（P<0.05）,而1×10-3mol/L、1×10-4mol/L梓醇组OD值与空白组比较无显着性差异（P>0.05）;第 11 d,1×10-5mol/L 和 1×10-6mol/L 的梓醇组 OD 值与空白组比较显着升高（P<0.05）,其它各浓度梓醇组OD值无显着性差异（P>0.05）。3.pNPP法检测结果显示:第3、18、21 d,不同浓度的梓醇组的ALP活性与空白组相比均无显着性差异（P>0.05）;第6 d,1×10-4mol/L浓度的梓醇与空白组相比能显着提高 BMSCs ALP 活性（P<0.05）;第 9 d,1 × 1 0-3mol/L～1 × 1 0-5mol/L浓度的梓醇与空白组相比能显着提高BMSCs ALP活性（P<0.05）;第 12、15 d,1×10-3mol/L、1×10-4mo1/L 浓度的梓醇与空白组相比均能显着提高BMSCs ALP活性（P<0.05）,且以1×10-4mol/L作用最显着,故以1×10-4 mol/L的梓醇浓度为后续实验的最佳给药剂量。4.ALP试剂盒检测结果显示:梓醇组、经典组和联合组的ALP活性与对照组比较均显着升高（P<0.05）,但梓醇组的ALP活性低于经典组（P<0.05）,联合组的ALP活性与经典组比较均无显着差异（P>0.05）。5.茜素红染色计数结果显示:梓醇组、经典组和联合组的矿化结节数量与对照组比较显着升高（P<0.05）,但梓醇组的ALP矿化结节数量低于经典组（P<0.05）,联合组的矿化结节数量与经典组比较无显着差异（P>0.05）。6.ELISA法检测结果显示:梓醇组、经典组和联合组的BGP含量与对照组比较显着升高（P<0.05）,但梓醇组的BGP含量低于经典组（P<0.05）,联合组的BGP含量与经典组比较无显着差异（P>0.05）。7.QPCR检测结果显示:梓醇组、经典组和联合组的Shh mRNA表达与对照组比较显着升高（P<0.05）,梓醇组的Shh mRNA表达低于经典组（P<0.05）,联合组与经典组的Shh mRNA表达无显着差异（P>0.05）;梓醇组、经典组和联合组的Ihh mRNA表达与对照组比较均无显着差异（P>0.05）。8.Western blotting检测结果显示:梓醇组、经典组和联合组的Ptch1、Smo和Gli1蛋白表达与对照组比较显着升高（P<0.05）;梓醇组和联合组的Ptch1、Smo和Gli1蛋白表达均低于经典组（P<0.05）;梓醇组的Ptch1、Smo和Gli1蛋白表达与联合组无显着性差异（P>0.05）。结论1.采用全骨髓贴壁法可获得增殖能力强,纯度高的BMSCs;2.不同浓度的梓醇对BMSCs的增殖具有明显的促进作用;3.一定浓度范围（1 ×10-3～1 ×10-5mol/L）的梓醇可以诱导BMSCs向成骨分化,尤以1 × 10-4mol/L作用明显,并能提高BMSCs ALP活性、矿化结节数目和BGP的含量;4.梓醇促BMSCs的骨向分化过程中Hedgehog信号传导通路上游Ihh信号分子可能不参与调控;5.梓醇可通过上调Hedgehog信号传导通路中上游Shh信号分子、膜受体Ptch1、Smo和核转录因子Gli1来促进BMSCs的骨向分化,从而防治OP。
陈苹[8]（2012）在《诱导小鼠ES/iPS细胞向角膜内皮细胞定向分化的研究》文中认为目的:通过在体外分阶段的序贯诱导途径,探索小鼠胚胎干细胞（ES）及诱导型多潜能干细胞（i PS）向角膜内皮样细胞定向分化的潜能,探究化学分子RA,细胞因子（b FGF、BMP4）联合体细胞共培养诱导的具体条件和方案,以期阐明其定向分化中的关键机制,并验证ES和i PS细胞作为角膜组织工程种子细胞的可行性,为组织工程角膜内皮层重建寻找来源充足,安全可靠的新型种子细胞奠定基础。方法:1.体外撕膜法分离消化新西兰大白兔的角膜内皮细胞及晶状体上皮细胞,建立培养扩增体系,并对其活力和特异性表达的标志物进行免疫荧光细胞化学（ICC）鉴定。收集晶状体上皮细胞的条件培养液,采用MTT法、Ki67的免疫荧光检测角膜内皮细胞在条件培养液中的增殖能力,用Western blot评估其表型标记物表达的变化。2.应用mef制备feeder,联合ES培养液维持和扩增小鼠ES细胞及i PS细胞系,并鉴定其全能性指标。去除lif因子及feeder,在低黏附培养皿中悬浮培养拟胚体EB,EB形成第四天加入不同浓度RA,并在不同时间点用定量PCR检测神经脊分化的指标。选择和比较不同的细胞外基质包括纤维连接蛋白、层粘蛋白、明胶、多聚赖氨酸和组织液房水作培养板的包被对神经脊（neural crest,NC）细胞迁出分化的影响,并采用ICC法对分化标志物进行检测。3.用P2-P3的兔角膜内皮细胞和兔晶状体上皮细胞分别进行如下共培养处理,包括:（1）条件培养液收集;（2）微胶囊包裹隔离共培养;（3）作为transwell小室隔离共培养的细胞;（4）丝裂霉素C处理制备饲细胞铺层;（5）活性细胞铺层。将初步诱导的NC样细胞序贯进入共培养阶段,比较并确定合适的共培养方法。应用ICC对分化后内皮样细胞进行表面标记关键分子的鉴定,定量PCR对分化后细胞m RNA表达谱的分析。4.采用b FGF+BMP4单层贴壁法诱导ES细胞向神经脊干细胞分化,后续条件培养液诱导向角膜内皮样细胞分化,并用ICC鉴定分化标记物的表达情况,用定量PCR分析基因表达的变化。结果:1.兔角膜内皮细胞、晶状体上皮细胞在体外可以稳定地培养增殖,并表达其组织特异性的标记物。晶状体的条件培养液对角膜内皮细胞的增殖没有明显影响,但能上调角膜内皮细胞中ZO-1,N-cadherin和Vimentin的表达。2.ES/i PS细胞在lif和feeder的培养条件下表达全能性的标记物Oct4,SSEA-1,AP（+）;去除lif和feeder后,在悬浮培养过程中形成拟胚体EB,第四天添加RA继续培养,随后的第四天获得一组神经脊分化标记物最高的表达。EB重新贴壁后继续培养时有大量细胞迁出,ICC检测显示有Nestin,P75,AP-2α,SOX10等的表达。3.Transwell小室,微胶囊包裹的实验组,EB细胞迁出生长,但不能维持良好的长势;在活性细胞做铺层的接触共培养组,EB细胞迁出受阻,出现大量的细胞凋亡;在晶状体上皮细胞及角膜内皮细胞条件培养液诱导7-8天后,诱导细胞形成紧密的铺路石结构,表达AQP1,ZO-1,Na+-K+-ATPase,N-cadherin等内皮标记。在长时间明胶铺层及Fn、Ln、多聚赖氨酸和兔房水铺层中,长时间明胶铺层能较好地维持EB贴壁生长并促进向内皮样细胞的分化。4.在单层细胞贴壁分化中,b FGF+BMP4诱导ES-cells表达神经脊细胞的标记物,继续晶状体条件培养液诱导6d出现角膜内皮样细胞标记物的表达。结论:1通过撕膜法可以建立稳定的兔角膜内皮细胞和晶状体上皮细胞的培养体系。晶状体上皮细胞条件培养液能更好地维持角膜内皮细胞的表型包括中ZO-1、N-cadherin、Vimentin,对细胞增殖没有明显影响。2.小鼠ES/i PS细胞可以通过EB途径经RA诱导向神经脊多潜能间充质干细胞分化。在定向分化中,长时间的明胶铺层效果更优于Laminin和Fibronectin所做的铺层。3.条件培养液是一种简单、可行、可控的共培养模式。在序贯法诱导方案中,角膜内皮细胞条件培养液和晶状体上皮细胞的条件培养液均能有效促进ES/i PS细胞来源的神经脊间充质干细胞向角膜内皮细胞的分化。4.单层细胞贴壁分化联合b FGF+BMP4因子诱导ES细胞向神经脊多潜能间充干细胞分化,后续应用晶状体上皮细胞条件培养液能更高效地诱导ES细胞分化成角膜内皮样细胞。
汤喜兰,黄立新,曾治君,张启云,单义民,徐国良[9]（2009）在《血小板相关抗体对巨核细胞增殖的实验研究》文中研究说明目的:探讨血小板相关抗体（platelet-associated antibody,PAIgG）对巨核细胞体外增殖的影响。方法:制备骨髓成纤维细胞无血清条件培养液,采用小鼠骨髓巨核细胞原代培养的方法,探讨PAIgG对巨核细胞体外增殖的影响。结果:50倍和100倍稀释的PAIgG能够显着抑制巨核细胞的增殖。结论:PAIgG对巨核细胞的体外增殖有抑制作用。
郭志林[10]（2008）在《小鼠、兔和牛胚胎干细胞分离培养及其向神经样细胞的分化》文中指出胚胎干细胞能在体外维持未分化状态与正常核型、具有无限增殖能力,注入囊胚可形成嵌合体,可分化为来自三个胚层的各种细胞类型。ES细胞被广泛应用于生产转基因动物和克隆动物,构建医学动物模型,研究人类基因功能。利用ES细胞可研究真核细胞的基因表达和调控,寻求细胞分化和细胞修复的机制,研究细胞、组织、器官移植。ES细胞的研究应用已成为生命科学的热点之一。目前哺乳动物ES细胞建系仍存在着品种单一、建系效率低等许多问题,严重影响了ES细胞的研究与应用。本研究比较了不同种属、胚龄、取材、分离、传代方法及消化液、培养液对ES细胞分离培养的效果,对影响ES细胞分离建系的各种因素进行了研究,以求完善小鼠、兔、牛ES细胞的建系方法,提高建系效率。建立了一种不经类胚体阶段直接诱导小鼠EG细胞定向分化为神经细胞的方法,为小鼠EG细胞向神经细胞的体外分化研究提供参考。1.采用分离5日龄小鼠胚胎外胚层进行昆明小鼠ES细胞分离培养,与传统分离ICM的方法相比显着提高了昆明小鼠ES细胞的建系效率（12%&3.3%）;大鼠心肌细胞条件培养液与添加10ng/mL LIF的ES培养液相比,使分离ICM的胚胎传至F1代的比例显着提高（52%&36%）,传至F2代的比例极显着提高（40%&16%）;采用0.125%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化液连续消化法进行ES细胞分离传代,ICM形成ES细胞克隆的比例提高到50%,ICM获得传至第5代的ES细胞的比例提高至20%;昆明小鼠和BALB/C小鼠胚胎用于ES细胞分离时在胚胎贴壁率、ICM贴壁率、F1和F2代ES细胞出现率上无显着差异;用丝裂霉素C处理MEF 1h适合作为ES细胞培养的饲养层,添加10ng/mL LIF的ES培养液能有效抑制昆明小鼠ES细胞的分化。证实用改进的建系方法可有效地建立昆明小鼠ES细胞系。2.从11.5～12.5日龄昆明小鼠胚胎生殖嵴分离培养PGCs,获得了能连续传9～11代的EG细胞系;用0.125%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化液多次消化生殖嵴,可有效地保持小鼠PGCs的活力;用差速贴壁法、与胎儿成纤维细胞共培养法分离PGCs,获得了较多的PGCs原代克隆,所得的F1代EG细胞集落百分率显着高于穿刺生殖嵴和取胎儿后1/3部位组织（21%、30%&7%、16%）;2株EG细胞系传代达到11～13代,在第10代时检测AKP呈阳性,第5代时在体外可分化为多种细胞。3.对兔囊胚进行蛋白酶消化和机械切割分离出ICM,在MEF饲养层培养,提高了ICM的贴壁率（60%）,获得了较多的ES细胞集落,而用全胚或离散胚培养不能获得可传代培养的兔类ES细胞集落;应用大鼠心肌细胞条件培养液提高了ICM贴壁率（59%）,能有效抑制兔类ES细胞的分化。证实了经胚胎切割分离兔囊胚ICM在MEF饲养层上用大鼠心肌细胞条件培养液培养,能有效地建立兔类ES细胞系。4.从14～18天兔胚胎生殖嵴及其周围组织分离PGCs的过程中,用酶消化液加机械吹打,能获得有增殖能力的兔PGCs;用0.125%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化液进行兔类EG细胞分离与传代,所得到的EG细胞集落多,传代数高于0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA浓度消化液组;采用兔PGCs与同源胎儿组织成纤维细胞共培养适合兔类EG细胞分离培养,将兔类EG细胞克隆与成纤维细胞饲养层一起消化进行传代,获得了能连续传代的兔类EG细胞系。5.对5～13周龄牛胎儿生殖嵴分离PGCs时,用percoll液离心和差速贴壁法纯化PGCs,与穿刺生殖嵴法和酶液消化法相比所得的PGCs集落数无差别,但前者后期培养中EG细胞传代数高于后两种方法（13, 7 & 5, 3）;大鼠心肌细胞条件培养液用于牛EG细胞培养时,所得PGCs集落数和EG细胞传代数高于添加LIF的EG细胞培养液组（13&7）;牛胎儿成纤维细胞饲养层可支持牛EG细胞的增殖,并能有效抑制分化;冷冻保存不影响牛PGCs和EG细胞的活力;体外分化试验和AKP染色证实了所分离的牛EG细胞具有多能性。证实了对牛PGCs进行纯化后在牛胎儿成纤维细胞饲养层上用大鼠心肌细胞条件培养液进行培养能有效地建立牛EG细胞系。6.用不经过类胚体阶段的诱导分化方法,对小鼠EG细胞在老化饲养层上长期培养使其达到高密度起动了EG细胞的神经分化,获得了较高比例的神经细胞样集落（62.9%（78/124））,用RA进一步进行诱导可产生TH+阳性神经元细胞。经检测EG细胞源神经细胞样集落外层细胞以及从集落中迁出的细长细胞均表达神经前体细胞标志nestin,应用高浓度的RA对神经细胞样克隆诱导,可获得2.3±0.2%的TH+神经元细胞。应用不同浓度的RA对离散后的神经细胞样集落进行诱导,TH+阳性细胞的比例在一定范围内随着RA浓度升高和分化时间的延长而上升;对EG细胞源神经前体细胞进行冷冻保存,解冻后细胞存活率83.2%,继续培养仍具有增殖和分化能力,冷冻不影响EG源神经前体细胞的活力。在不更换饲养层连续增殖达到高密度的情况下培养小鼠EG细胞,建立了一种简单而有效的小鼠EG细胞体外分化为神经细胞的培养体系,能有效产生TH+神经细胞。
二、骨髓成纤维细胞条件培养液对体外巨核系细胞生成的促进作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、骨髓成纤维细胞条件培养液对体外巨核系细胞生成的促进作用（论文提纲范文）
（1）激活素A与TNF-α在成纤维细胞活化调控中的相互拮抗作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第1章 文献回顾 |
| 1.1 激活素 |
| 1.1.1 激活素分子特征 |
| 1.1.2 激活素受体及信号转导 |
| 1.1.3 激活素生物学作用 |
| 1.2 肿瘤坏死因子-α |
| 1.2.1 TNF-α来源 |
| 1.2.2 TNF-α受体及信号转导 |
| 1.2.3 TNF-α生物学活性 |
| 1.3 成纤维细胞 |
| 1.3.1 成纤维细胞形态 |
| 1.3.2 成纤维细胞功能 |
| 1.3.3 成纤维细胞原代培养 |
| 1.4 本课题研究内容和意义 |
| 1.4.1 研究内容 |
| 1.4.2 研究意义 |
| 第2章 激活素A与TNF-α调控小鼠成纤维细胞活化 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 主要试剂的配制 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞增殖分析 |
| 2.2.2 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.2.3 细胞形态学分析 |
| 2.2.4 RTCA检测细胞黏附 |
| 2.2.5 NO含量分析 |
| 2.2.6 ELISA |
| 2.2.7 RT-PCR |
| 2.2.8 Western blotting |
| 2.2.9 细胞迁移分析 |
| 2.2.10 钙离子流量分析 |
| 2.2.11 细胞膜受体表达分析 |
| 2.2.12 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 激活素A与TNF-α对L929细胞增殖的影响 |
| 2.3.2 激活素A与TNF-α对L929细胞凋亡的影响 |
| 2.3.3 激活素A与TNF-α对L929细胞形态的影响 |
| 2.3.4 激活素A与TNF-α对L929细胞NO产生的影响 |
| 2.3.5 激活素A与TNF-α对L929细胞IL-6产生的影响 |
| 2.3.6 激活素A与TNF-α对L929细胞分泌TGF-β1 的影响 |
| 2.3.7 激活素A与TNF-α对L929细胞生成细胞外基质的影响 |
| 2.3.8 激活素A与TNF-α对L929细胞黏附的影响 |
| 2.3.9 激活素A与TNF-α对L929细胞迁移的影响 |
| 2.3.10 激活素A与TNF-α对L929细胞内钙信号的影响 |
| 2.3.11 激活素A与TNF-α对L929细胞膜相关受体表达的影响 |
| 2.3.12 激活素A与TNF-α对L929细胞Smad通路相关信号分子表达的影响 |
| 2.3.13 激活素A与TNF-α对L929细胞MAPK信号通路蛋白表达的影响 |
| 2.3.14 ERK抑制剂对激活素A诱导L929 细胞迁移的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 激活素A与TNF-α对L929细胞的生物学作用 |
| 2.4.2 激活素A与TNF-α调控L929细胞活性的信号转导机制 |
| 第3章 激活素A与TNF-α调控人成纤维细胞活化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 hPDLCs体外培养 |
| 3.2.2 hPDLCs的增殖分析 |
| 3.2.3 hPDLCs的形态学分析 |
| 3.2.4 RTCA检测hPDLCs黏附活性 |
| 3.2.5 ELISA |
| 3.2.6 RT-PCR |
| 3.2.7 Western blotting |
| 3.2.8 细胞迁移分析 |
| 3.2.9 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 体外培养hPDLCs生长、形态及鉴定 |
| 3.3.2 激活素A与TNF-α对hPDLCs增殖的影响 |
| 3.3.3 激活素A与TNF-α对hPDLCs形态学变化的影响 |
| 3.3.4 激活素A与TNF-α对hPDLCs产生IL-6 的影响 |
| 3.3.5 激活素A与TNF-α对hPDLCs分泌TGF-β1 的影响 |
| 3.3.6 激活素A与TNF-α对hPDLCs生成ECM的影响 |
| 3.3.7 激活素A与TNF-α对hPDLCs黏附的影响 |
| 3.3.8 激活素A与TNF-α对hPDLCs迁移的影响 |
| 3.3.9 激活素A与TNF-α对hPDLCs的Smad通路相关信号分子表达的影响 |
| 3.3.10 激活素A与TNF-α对hPDLCs的MAPK信号通路蛋白表达的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 人牙周韧带细胞的体外培养及实验细胞的选择 |
| 3.4.2 激活素A与TNF-α对hPDLCs的生物学作用 |
| 3.4.3 激活素A与TNF-α调控hPDLCs活性的信号转导机制 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）脯氨酸羟化酶抑制剂DMOG在牙周组织再生中生物学效应的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略语对照表 |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 第一部分 DMOG通过TLR4/MyD88介导的Akt/NF-κB和MAPK信号通路调控LPS诱导的炎症因子表达 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 DMOG调控具核梭杆菌诱导的牙龈成能纤维细胞炎症因子的表达 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 负载DMOG的静电纺丝纤维膜对牙周创伤早期免疫炎症反应的调控效应 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 负载DMOG/Nanosilicates的成骨/成血管双功能纤维膜在牙周组织再生中的作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 攻读学位期间发表的论文和申请的专利 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（3）含稀土碳酸化羟基磷灰石材料的制备及其应用于骨修复的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 口腔颌面部骨的形成和缺损修复 |
| 1.1.1 口腔颌面部骨的形成与自修复过程 |
| 1.1.2 口腔颌面部骨缺损疾病的治疗方法 |
| 1.2 口腔颌面部骨组织工程概述 |
| 1.2.1 骨组织工程中的种子细胞 |
| 1.2.2 骨组织工程中常用的生长因子及其功能简介 |
| 1.2.3 骨组织工程中常用的支架体系 |
| 1.3 骨缺损修复材料简介 |
| 1.3.1 骨修复材料的研究现状及性能要求 |
| 1.3.2 天然及人工合成的骨修复材料 |
| 1.3.3 骨组织中的羟基磷灰石 |
| 1.3.4 用于骨再生的支架材料 |
| 1.3.5 稀土在生物医学材料中的作用 |
| 1.4 本论文的设计思路和技术路线 |
| 1.4.1 设计思路 |
| 1.4.2 技术路线 |
| 第二章 碳酸化及稀土掺杂的羟基磷灰石仿生骨粉的制备 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验仪器与试剂 |
| 2.2.1 仪器 |
| 2.2.2 试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 钙-磷-碳酸体系的热力学平衡相图计算 |
| 2.3.2 碳酸化羟基磷灰石纳米骨粉的制备 |
| 2.3.3 碳酸化羟基磷灰石纳米骨粉的结构表征 |
| 2.3.4 碳酸根取代度的确定 |
| 2.3.5 形貌与化学组成分析 |
| 2.3.6 碳酸化羟基磷灰石纳米骨粉的稀土荧光标记检测 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 模拟生物矿化环境下的钙-磷-碳酸根热力学平衡相图与矿化因素 |
| 2.4.2 碳酸化羟基磷灰石材料的结构 |
| 2.4.3 碳酸化及矿化环境调控对羟基磷灰石形貌的影响 |
| 2.4.4 碳酸根取代度的确定 |
| 2.4.5 稀土离子标记的碳酸化羟基磷灰石可控制备及光谱性质 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 小鼠胚胎成骨细胞前体细胞实验检测稀土掺杂及碳酸根取代的羟基磷灰石材料的生物学性能 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 MC3T3-E1 细胞培养 |
| 3.3.2 使用荧光染色观察细胞形态 |
| 3.3.3 使用CCK-8 法检测细胞增殖 |
| 3.3.4 使用活细胞/死细胞染色检测细胞的生长活性 |
| 3.3.5 使用碱性磷酸酶染色检测ALP活性 |
| 3.3.6 使用ALP定量检测试剂盒检测ALP活性 |
| 3.3.7 茜素红染色检测细胞形成的钙结节 |
| 3.3.8 Western blot检测各组材料对细胞成骨分化的影响 |
| 3.3.9 使用三维打印机打印支架 |
| 3.3.10 支架的形貌及成份表征 |
| 3.3.11 扫描电镜检测细胞在支架上的黏附 |
| 3.3.12 使用CCK-8 检测细胞在支架上的增殖 |
| 3.3.13 使用活细胞/死细胞染色检测细胞在支架上的生长活性 |
| 3.3.14 使用ALP染色检测支架上细胞的ALP活性 |
| 3.3.15 统计学分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 MC3T3-E1 细胞的培养 |
| 3.4.2 各组材料浸提液对细胞形态的影响 |
| 3.4.3 各组材料浸提液对细胞增殖的影响 |
| 3.4.4 各组材料浸提液对细胞生长活性的影响 |
| 3.4.5 各组材料浸提液对细胞ALP染色的影响 |
| 3.4.6 各组材料浸提液对细胞ALP活性影响的定量分析 |
| 3.4.7 各组材料浸提液对细胞体外矿化的影响 |
| 3.4.8 各组材料浸提液对细胞分泌成骨特异性蛋白的影响 |
| 3.4.9 三维打印支架的宏观外形 |
| 3.4.10 三维打印支架的微观形貌、组分表征 |
| 3.4.11 细胞在各组三维打印支架上的黏附 |
| 3.4.12 细胞在各组三维打印支架上的增殖 |
| 3.4.13 细胞在各组三维打印支架上的生长活性 |
| 3.4.14 细胞在各组三维打印支架上的ALP活性 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 稀土掺杂及碳酸根取代的羟基磷灰石支架促大鼠颅骨缺损修复的实验研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 试剂 |
| 4.2.2 仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 大鼠颅骨缺损模型建立及分组 |
| 4.3.2 术后大体观察 |
| 4.3.3 术后影像学观察 |
| 4.3.4 组织学观察染色 |
| 4.3.5 Masson染色 |
| 4.3.6 体内生物安全性评价 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 大鼠临界骨缺损模型的建立 |
| 4.4.2 动物处死后标本的获取 |
| 4.4.3 动态Micro-CT观察缺损颅骨的修复 |
| 4.4.4 术后组织学检测 |
| 4.4.5 Masson染色表征 |
| 4.4.6 支架促血管再生 |
| 4.4.7 支架的体内安全性结果分析 |
| 4.4.8 支架促成骨性能讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 本论文的主要创新点 |
| 5.2 全文结论 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
（4）DC细胞来源IFN-λ1对炎性骨丢失保护效应的机制探讨（论文提纲范文）
| 中英文词汇缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 破骨细胞不同诱导体系的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 IFN-λ1的筛选与来源确定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 IFN-λ1抑制破骨细胞融合,分化与骨吸收功能 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 IFN-λ1负向调控破骨细胞分化与功能的机制探讨 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 IFN-λ1保护LPS诱导的颅骨炎性骨丢失 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.2 实验结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 IFN家族在炎性骨丢失相关疾病的重要角色 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（5）ABA、高脂血浆及PKA在人iPSC分化巨核细胞中的作用及机制探讨（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 脱落酸促进体外人i PSC分化巨核细胞 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 第二部分 高脂血浆在体外人iPSC分化巨核细胞中的作用及机制初探 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 第三部分 PKA在体外i PSC分化为巨核细胞中的作用初探 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 总结 |
| 综述 小分子在体外干细胞分化巨核细胞及血小板中的作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文目录 |
| 致谢 |
（6）Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN) |
| 1.1.1 MSTN基因的发现 |
| 1.1.2 MSTN基因和蛋白结构 |
| 1.1.3 MSTN基因的表达 |
| 1.1.4 MSTN的作用机制 |
| 1.1.5 MSTN的表达调控机制 |
| 1.1.6 MSTN基因的应用前景 |
| 1.2 RNA干涉 |
| 1.2.1 RNA干涉现象的发现 |
| 1.2.2 RNA干涉的作用机制 |
| 1.2.3 RNA干涉的作用特点 |
| 1.2.4 siRNA和shRNA技术优缺点 |
| 1.2.5 哺乳动物的RNA干涉 |
| 1.2.6 RNA干涉的应用前景 |
| 1.3 卵母细胞的体外成熟 |
| 1.3.1 卵母细胞的成熟 |
| 1.3.2 卵母细胞的成熟调控机制 |
| 1.3.3 卵母细胞成熟的特征 |
| 1.3.4 卵母细胞成熟的影响因素 |
| 1.4 哺乳动物细胞核移植 |
| 1.4.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展 |
| 1.4.2 哺乳动物胚胎干细胞核移植研究进展 |
| 1.4.3 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1.4.4 哺乳动物转基因细胞核移植研究进展 |
| 1.4.5 影响细胞核移植结果的因素 |
| 1.4.6 核移植存在的问题 |
| 1.5 CRISPR/Cas9 |
| 1.5.1 CRISPR/Cas9的发现 |
| 1.5.2 Cas9蛋白的结构 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas9的作用机制 |
| 1.5.4 CRISPR/Cas9面临的问题和挑战 |
| 1.6 研究的目的与意义 |
| 2 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体构建与活性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物、细胞和菌株 |
| 2.1.2 实验载体信息 |
| 2.1.3 药品和试剂 |
| 2.1.4 溶液的配制 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 绵羊Myostatin基因克隆与序列分析 |
| 2.2.2 绵羊Myostatin真核表达载体的构建 |
| 2.2.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的构建 |
| 2.2.4 293GP细胞的复苏和传代培养 |
| 2.2.5 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体效率检测 |
| 2.2.6 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的显微注射 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 绵羊Myostatin基因的克隆与序列分析 |
| 2.3.2 绵羊Myostatin基因真核表达载体的构建 |
| 2.3.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体测序 |
| 2.3.4 293GP细胞复苏传代与转染 |
| 2.3.5 RNA干涉效率结果与分析 |
| 2.3.6 RNA干涉载体表达活性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 绵羊Myostatin基因敲低成纤维细胞系的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要药品和试剂 |
| 3.1.3 溶液配制 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 RNA干涉载体的线性化 |
| 3.2.2 绵羊皮肤成纤维细胞的培养 |
| 3.2.3 G418浓度的筛选 |
| 3.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的转染及筛选 |
| 3.2.5 绵羊MSTN敲低转基因细胞系的鉴定 |
| 3.2.6 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻保存 |
| 3.2.7 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻复苏 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 绵羊皮肤成纤维细胞的原代培养 |
| 3.3.2 最适G418浓度的筛选 |
| 3.3.3 转基因细胞的生物学特征 |
| 3.3.4 转基因阳性细胞的PCR鉴定 |
| 3.3.5 冷冻复苏的转基因细胞的生物学特征 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 绵羊Myostatin基因敲低细胞核移植 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 药品试剂 |
| 4.1.3 溶液配制 |
| 4.1.4 仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 绵羊卵母细胞的获取 |
| 4.2.2 绵羊卵母细胞的体外成熟 |
| 4.2.3 绵羊成熟卵母细胞的孤雌激活 |
| 4.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的复苏 |
| 4.2.5 显微操作前的实验准备 |
| 4.2.6 核供体细胞的准备 |
| 4.2.7 核受体卵母细胞的准备 |
| 4.2.8 卵母细胞的去核和注核 |
| 4.2.9 重构胚的融合与激活 |
| 4.2.10 重构胚的体外培养 |
| 4.2.11 转基因胚胎的分子鉴定 |
| 4.2.12 转基因胚胎的移植 |
| 4.2.13 数据统计 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 卵巢的保存和运输对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.2 绵羊卵母细胞的采集方法和分级对卵成熟的影响 |
| 4.3.3 卵密度和不同成熟液对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.4 绵羊卵母细胞成熟时间对成熟和去核的影响 |
| 4.3.5 不同的激活方法对绵羊卵母细胞孤雌激活的影响 |
| 4.3.6 供体细胞修饰和处理对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.7 绵羊重构胚融合方式对核移植胚胎发育的影响 |
| 4.3.8 重构胚激活前培养时间对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.9 不同培养液对绵羊核移植重构胚发育的影响 |
| 4.3.10 转基因重构胚的获得和PCR鉴定 |
| 4.3.11 胚胎移植和流产胎儿鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 卵巢的保存和运输 |
| 4.4.2 卵母细胞的采集、分级和培养 |
| 4.4.3 供体细胞的遗传修饰和处理 |
| 4.4.4 重构胚的融合、激活和培养 |
| 4.4.5 转基因动物的生产 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物和菌株 |
| 5.1.2 实验载体信息 |
| 5.1.3 药品和试剂 |
| 5.1.4 溶液的配制 |
| 5.1.5 主要仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小鼠Rosa26基因sgRNA的设计与获得 |
| 5.2.2 Rosa26基因sgRNA体外编辑效率检测 |
| 5.2.3 肌肉特异性小鼠Rosa26同源打靶载体的构建 |
| 5.2.4 小鼠胚胎的显微注射 |
| 5.2.5 注射后囊胚的基因分型和检测 |
| 5.2.6 胚胎移植和基因分型检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 sgRNA获得与体外编辑效率检测 |
| 5.3.2 肌肉特异表达同源打靶载体的构建 |
| 5.3.3 小鼠Rosa26基因编辑胚胎的获得 |
| 5.3.4 Rosa26基因编辑小鼠的获得 |
| 5.3.5 肌肉特异表达Cas9蛋白小鼠胚胎的获得 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（7）梓醇促进BMSCs增殖分化及Hedgehog信号通路的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 研究背景 |
| 1 骨质疏松的研究进展 |
| 2 BMSCs成骨分化的研究进展 |
| 3 Hedgehog信号转导通路 |
| 4 中医理论对BMSCs成骨分化与“肾主骨生髓”理论相关性的认识 |
| 5 补肾中药促进BMSCs成骨分化的研究进展 |
| 6 地黄和梓醇的研究进展 |
| 实验一 SD大鼠BMSCs的分离、培养和鉴定 |
| 1 研究目的 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 实验二 梓醇对BMSCs增殖及骨向分化的影响 |
| 1 研究目的 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 实验三 梓醇对BMSCs骨向分化过程中Hedgehog信号通路的影响 |
| 1 研究目的 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（8）诱导小鼠ES/iPS细胞向角膜内皮细胞定向分化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略语一览表 |
| 第一部分 前言 |
| 1.1 研究意义和背景 |
| 1.1.1 角膜内皮层重建的重要意义 |
| 1.1.2 组织工程技术修复角膜内皮层的研究现状 |
| 1.1.3 ES/IPS细胞为基础的干细胞治疗的研究现状 |
| 1.1.4 ES/iPS 细胞为基础的干细胞作为替代治疗的种子细胞的可行性 |
| 1.2 本论文的研究目的及主要内容 |
| 第二部分 晶状体上皮细胞的旁分泌作用对角膜内皮细胞的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试剂与材料 |
| 2.2.2 兔角膜内皮细胞(Corneal endothelial cell,CEC)的取材和培养 |
| 2.2.3 兔角膜内皮细胞的表面分子标记鉴定(表型鉴定) |
| 2.2.4 晶状体上皮细胞(Lens epitheliual cell,LEC)的取材和培养 |
| 2.2.5 晶状体上皮细胞表型鉴定 |
| 2.2.6 MTT/CCK8 生长曲线法检测 LEC 条件培养液对角膜内皮细胞增值的影响 |
| 2.2.7 免疫荧光法 Ki67 检测条件培养液对角膜内皮细胞增殖的影响 |
| 2.2.8 流式细胞术检测 LEC 条件培养液对角膜内皮细胞增殖的影响 |
| 2.2.9 Western-blot 检测条件培养液对角膜内皮细胞表型维持的影响 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 兔角膜内皮细胞 CEC 和晶状体上皮细胞 LEC 的体外生长形态与规律 |
| 2.3.2 兔角膜内皮细胞的表面分子标记鉴定 |
| 2.3.3 兔角膜内皮细胞Ac-LDL 及UEA-1 检测 |
| 2.3.4 兔晶状体上皮细胞的细胞标记鉴定 |
| 2.3.5 MTT/CCK8 生长曲线法检测晶状体条件培养液对角膜内皮细胞增殖的影响 |
| 2.3.6 免疫荧光法Ki67检测条件培养液对角膜内皮细胞增殖的影响 |
| 2.3.7 条件培养液下多次传代后的CEC细胞状态 |
| 2.3.8 流式细胞术检测晶状体条件培养液对角膜内皮细胞增殖的影响 |
| 2.3.9 Western-blot检测条件培养液对角膜内皮细胞表型维持的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章结论 |
| 第三部分 ES/iPS细胞的体外培养,经EB途径RA诱导向神经脊间充质干细胞的分化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 试剂与材料 |
| 3.2.2 ES/iPS干细胞的体外培养和增殖 |
| 3.2.3 ES/iPS干细胞的全能性标记鉴定 |
| 3.2.4 拟胚体EB(Embryonic body,EB)形成 |
| 3.2.5 RA诱导EB进一步分化方法 |
| 3.2.6 不同铺层的制备 |
| 3.2.7 免疫荧光检测神经脊间充干细胞相关蛋白标记物(P75、AP-2α、SOX10) |
| 3.2.8 Real-time PCR法检测EB分化过程中神经脊间充干细胞相关m RNA表达 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 分化流程 |
| 3.3.2 feeder的准备 |
| 3.3.3 ES/iPS细胞的体外生长形态与规律 |
| 3.3.4 ES/iPS 干细胞的全能性标记物检测鉴定 |
| 3.3.5 EB分化及RA诱导分化的生长情况 |
| 3.3.6 不同铺层 EB 细胞迁出的形态与大体情况 |
| 3.3.7 免疫荧光检测神经脊间充干细胞相关蛋白标记物表达 |
| 3.3.8. RT-PCR检测分化过程胚层标记物表达及Realtime PCR法检测EB分化过程中神经脊间充质干细胞相关mRNA 表达 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章结论 |
| 第四部分 共培养诱导角膜内皮样细胞分化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试剂与材料 |
| 4.2.2 不同共培养体系的建立 |
| 4.2.3 不同共培养体系对EB贴壁细胞迁出的初步比较 |
| 4.2.4 条件培养液法进一步诱导ES/iPS细胞源的NC细胞向内皮样细胞分化 |
| 4.2.5 免疫荧光检测角膜内皮细胞相关蛋白标记物表达 |
| 4.2.6 Realtime PCR检测诱导分化后角膜内皮样细胞相关mRNA表达 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 不同共培养模式及其中诱导细胞的状态 |
| 4.3.2 不同共培养方式细胞分化生长的差别 |
| 4.3.3 免疫荧光检测诱导后角膜内皮细胞相关蛋白标记物表达情况 |
| 4.3.4 Realtime PCR法检测不同诱导方案,分化过程中角膜内皮细胞相关m RNA表达变化及差异 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章结论 |
| 第五部分 单层贴壁法诱导ES细胞向角膜内皮样细胞分化 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试剂与材料 |
| 5.2.2 bFGF+BMP4单层贴壁法诱导ES细胞向NC细胞分化 |
| 5.2.3 神经脊 NC 细胞分化指标的检测 |
| 5.2.4 条件培养液法对 NC 细胞的序贯诱导 |
| 5.2.5 分化后角膜内皮样细胞标记物的检测 |
| 5.2.6 分化后角膜内皮细胞相关 mRNA 表达变化及差异 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 ES细胞单层贴壁法向神经脊干细胞分化的情况 |
| 5.3.2 免疫荧光检测神经脊间充干细胞相关蛋白标记物 |
| 5.3.3 RealtimePCR法检测分化过程中神经脊间充干细胞相关m RNA表达 |
| 5.3.4 NC分化后序贯诱导出现 CEC 的分化 |
| 5.3.5 分化后角膜内皮样细胞标记的检测 |
| 5.3.6 分化后角膜内皮细胞相关 mRNA 表达变化及差异 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章结论 |
| 第六部分 全文总结与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 主要贡献和创新点 |
| 6.3 未来研究工作展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间学术论文及科研成果 |
（9）血小板相关抗体对巨核细胞增殖的实验研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 F-CM的制备[6] |
| 1.2.2 采用不同浓度的F-CM进行巨核细胞的体外培养 |
| 1.2.3 PAIgG对巨核细胞增殖的影响 |
| 1.2.4 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 细胞形态学观察 |
| 2.2 F-CM对巨核细胞增殖的影响 |
| 2.3 PAIgG不同稀释倍数对巨核细胞增殖的影响 |
| 3 讨论 |
（10）小鼠、兔和牛胚胎干细胞分离培养及其向神经样细胞的分化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 哺乳动物胚胎干细胞和胚胎生殖细胞 |
| 1.1 ES 细胞研究的概况 |
| 1.1.1 ES 细胞研究的历史起源：胚胎瘤细胞（Embryonic carcinoma cells or embryonic carcinoma stem cells, EC cells） |
| 1.1.2 哺乳动物ES 细胞研究的历史与现状 |
| 1.1.2.1 小鼠 |
| 1.1.2.2 兔 |
| 1.1.2.3 猪 |
| 1.1.2.4 牛 |
| 1.1.2.5 人类 |
| 1.2 PGCS 来源的EG/ES 细胞研究概况 |
| 1.2.1 小鼠 |
| 1.2.2 兔 |
| 1.2.3 牛 |
| 1.2.4 猪 |
| 1.2.5 人 |
| 1.3 胚胎干细胞的生物学特性 |
| 1.3.1 胚胎干细胞的生物学特性 |
| 1.3.2 维持胚胎干细胞生物学特性的分子机制 |
| 1.3.2.1 LIF 及其相应信号通路对ES 细胞多能性的维持 |
| 1.3.2.2 BMP 信号通路 |
| 1.3.2.3 Wnt 信号转导途径 |
| 1.3.2.4 Oct 与ES 细胞多能性 |
| 1.3.2.5 Nanog 与ES 细胞多能性维持 |
| 1.4 ES 细胞分离建系的方法 |
| 1.4.1 ES 细胞分离材料的获取及处理方法 |
| 1.4.1.1 早期胚胎的处理方法 |
| 1.4.1.2 PGCs 的分离 |
| 1.4.2 ES 细胞的培养 |
| 1.4.2.1 ES 细胞培养的分化抑制物 |
| 1.4.2.2 常用基础培养基 |
| 1.4.2.3 常用添加物 |
| 1.4.2.4 ES 细胞的克隆和传代 |
| 1.4.2.5 ES 细胞冷冻和解冻 |
| 1.4.2.6 ES 细胞的鉴定方法 |
| 1.5 影响ES 细胞分离建系的因素 |
| 1.5.1 遗传背景对ES 细胞分离培养的影响 |
| 1.5.2 胚龄与分离培养方式对ES 细胞建系的影响 |
| 1.5.2.1 胚龄 |
| 1.5.2.2 分离培养方式 |
| 1.5.3 饲养层 |
| 1.5.4 培养基 |
| 1.5.5 条件培养液、细胞因子和生长因子 |
| 1.5.5.1 条件培养液 |
| 1.5.5.2 细胞因子和生长因子 |
| 1.6 ES 细胞的体外分化研究现状 |
| 1.6.1 胚胎干细胞诱导分化的一般方法 |
| 1.6.1.1 细胞因子诱导法 |
| 1.6.1.2 选择性标记基因筛选目的细胞法 |
| 1.6.1.3 特异性转录因子异位表达法 |
| 1.6.2 ES 细胞分化为造血细胞 |
| 1.6.3 ES 细胞分化为神经细胞 |
| 1.6.4 ES 细胞体外分化为心肌细胞 |
| 1.6.5 由ES 细胞分化为胰岛细胞 |
| 1.7 ES 细胞的应用前景 |
| 1.7.1 生产克隆动物 |
| 1.7.2 生产转基因动物 |
| 1.7.3 研究发育和细胞分化 |
| 1.7.4 在细胞和组织修复中的作用 |
| 1.7.5 治疗性克隆 |
| 研究部分 |
| 前言 |
| 第二章 昆明小鼠胚胎干细胞分离、培养 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 动物来源 |
| 2.1.1.2 主要试剂 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.2.1 小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）饲养层的制备 |
| 2.1.2.2 大鼠心肌细胞条件培养液制备 |
| 2.1.2.3 囊胚的获取与培养 |
| 2.1.2.4 内细胞团的分离 |
| 2.1.2.5 胚胎外胚层的分离与培养 |
| 2.1.2.6 ES 细胞集落分离传代 |
| 2.1.2.7 ES 细胞的鉴定 |
| 2.1.2.8 ES 细胞和胎儿成纤维细胞的冷冻与解冻 |
| 2.1.3 实验设计与统计方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 小鼠胎儿成纤维细胞的培养与饲养层的制备 |
| 2.2.2 大鼠心肌细胞的分离培养 |
| 2.2.3 品系对小鼠ES 细胞培养、克隆、分离、传代的影响 |
| 2.2.4 不同日龄胚胎和不同取材方法对ES 细胞分离培养的影响 |
| 2.2.5 大鼠心肌细胞条件培养液对小鼠ES 细胞分离、培养、传代的影响 |
| 2.2.6 不同消化液及消化方法对ES 细胞分离、克隆、传代的影响 |
| 2.2.7 ES 细胞形态与生长方式观察 |
| 2.2.8 碱性磷酸酶活性检查（AKP 染色） |
| 2.2.9 体外分化能力 |
| 2.2.10 核型分析 |
| 2.2.11 ES 细胞和胎儿成纤维细胞的冷冻与解冻 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 品系和胚龄对ES 细胞分离培养的影响 |
| 2.3.2 分离培养方式对ES 细胞培养建系的影响 |
| 2.3.3 条件培养液、饲养层和细胞因子对ES 细胞分离培养的影响 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 自PGCS 分离、克隆昆明小鼠EG 细胞的研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.2.1 小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）饲养层的制备 |
| 3.1.2.2 PGCs 分离 |
| 3.1.2.3 细胞传代 |
| 3.1.2.4 碱性磷酸酶(AKP)染色 |
| 3.1.2.5 体外分化能力鉴定 |
| 3.1.2.6 EG 细胞冷冻 |
| 3.1.3 实验设计与统计方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 小鼠PGCs 生长情况 |
| 3.2.2 不同PGCs 分离方式对小鼠EG 细胞分离、传代的效果 |
| 3.2.3 不同传代方式对EG 细胞分离、克隆的影响 |
| 3.2.4 不同日龄的胚胎分离培养EG 细胞的效果 |
| 3.2.5 碱性磷酸酶活性检查（AKP 染色） |
| 3.2.6 体外分化能力 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 胚胎日龄对EG 细胞分离培养的影响 |
| 3.3.2 PGCs 分离方式对EG 细胞培养的影响 |
| 3.3.3 消化液和传代方式对EG 细胞培养的影响 |
| 3.3.4 细胞因子和饲养层对EG 细胞分离培养的影响 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 兔胚胎干细胞分离培养 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.1.1 实验动物 |
| 4.1.1.2 主要试剂 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.1.2.1 胚胎获取及培养 |
| 4.1.2.2 饲养层制备 |
| 4.1.2.3 胚胎处理 |
| 4.1.2.4 内细胞团集落的分离 |
| 4.1.2.5 ES 细胞集落分离、传代 |
| 4.1.2.6 ES 培养液 |
| 4.1.2.7 大鼠心肌细胞条件培养液的制备 |
| 4.1.2.8 ES 细胞的鉴定 |
| 4.1.2.9 ES 细胞的冷冻 |
| 4.1.3 实验设计与统计方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 兔胚胎的形态特征 |
| 4.2.2 不同饲养层对兔ES 细胞分离的效果 |
| 4.2.3 不同胚胎处理方式对兔ES 细胞的分离效果 |
| 4.2.4 大鼠心肌细胞条件培养液对兔ES 细胞分离、传代的影响 |
| 4.2.5 兔类ES 细胞的鉴定 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 胚胎日龄对ES 细胞分离的影响 |
| 4.3.2 饲养层对ES 细胞分离的影响 |
| 4.3.3 胚胎处理方式对ES 细胞分离的影响 |
| 4.3.4 条件培养液和细胞因子对ES 细胞培养的影响 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 自PGCS 分离克隆兔EG 细胞 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.1.1 实验动物 |
| 5.1.1.2 试剂 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.1.2.1 兔胎儿的生殖嵴的获取 |
| 5.1.2.2 胎儿生殖嵴的处理 |
| 5.1.2.3 EG 细胞的传代培养 |
| 5.1.2.4 碱性磷酸酶染色 |
| 5.1.2.5 体外分化试验 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 体外培养的兔PGCs 的生长情况 |
| 5.2.2 兔PGCs 传代后的生长 |
| 5.2.3 不同浓度的消化液对兔PGCs 分离培养的效果 |
| 5.2.4 AKP 染色结果 |
| 5.2.5 体外分化结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 牛胚胎生殖细胞的分离与培养 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.1.1 牛胎儿 |
| 6.1.1.2 试剂 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.1.2.1 牛和小鼠胎儿成纤维细胞的分离培养与饲养层的制备 |
| 6.1.2.2 大鼠心肌细胞条件培养液的制备 |
| 6.1.2.3 从牛胎儿生殖嵴分离与纯化PGCs |
| 6.1.2.4 EG 细胞培养液 |
| 6.1.2.5 细胞传代 |
| 6.1.2.6 牛EG 细胞的鉴定 |
| 6.1.2.7 牛胎儿成纤维细胞和EG 细胞的冷冻与解冻 |
| 6.1.3 数据统计方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 牛胎儿成纤维细胞的生长情况 |
| 6.2.2 牛PGCs 和EG 细胞的形态与生长方式 |
| 6.2.3 不同饲养层对牛EG 细胞培养的效果 |
| 6.2.4 不同的生殖嵴处理方式对牛EG 细胞分离培养的效果 |
| 6.2.5 大鼠心肌细胞条件培养液用于牛EG 细胞培养的效果 |
| 6.2.6 EG 细胞鉴定 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 胚龄对PGCs 分离培养的影响 |
| 6.3.2 分离培养方式对PGCs 的影响 |
| 6.3.3 条件培养液、细胞因子和饲养层对EG 细胞分离培养的影响 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 小鼠EG 细胞体外分化为神经细胞的研究 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.2 方法 |
| 7.1.2.1 小鼠EG 细胞的分离与培养 |
| 7.1.2.2 EG 细胞的体外神经分化与检测 |
| 7.1.2.3 RA 诱导EG 细胞分化 |
| 7.1.2.4 EG 细胞来源的神经前体细胞的传代培养与冷冻保存 |
| 7.1.3 数据统计方法 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 小鼠EG 多能干细胞在老化饲养层上的分化 |
| 7.2.2 不同浓度RA 对EG 细胞的诱导效果 |
| 7.2.3 EG 细胞来源的神经前体细胞的冷冻保存 |
| 7.3 讨论 |
| 7.3.1 EG 细胞的分化潜能 |
| 7.3.2 不同诱导分化方法对ES 细胞神经分化的影响 |
| 7.3.3 EG 细胞分化的时序性 |
| 7.4 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 进一步研究的课题 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、骨髓成纤维细胞条件培养液对体外巨核系细胞生成的促进作用（论文参考文献）
- [1]激活素A与TNF-α在成纤维细胞活化调控中的相互拮抗作用研究[D]. 姜玲玲. 吉林大学, 2021(01)
- [2]脯氨酸羟化酶抑制剂DMOG在牙周组织再生中生物学效应的研究[D]. 商玲玲. 山东大学, 2021(11)
- [3]含稀土碳酸化羟基磷灰石材料的制备及其应用于骨修复的实验研究[D]. 刘鹏. 吉林大学, 2021(01)
- [4]DC细胞来源IFN-λ1对炎性骨丢失保护效应的机制探讨[D]. 陈玥琦. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [5]ABA、高脂血浆及PKA在人iPSC分化巨核细胞中的作用及机制探讨[D]. 黄韦华. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [6]Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究[D]. 李昊. 东北林业大学, 2019(01)
- [7]梓醇促进BMSCs增殖分化及Hedgehog信号通路的研究[D]. 赖满香. 广州中医药大学, 2018(08)
- [8]诱导小鼠ES/iPS细胞向角膜内皮细胞定向分化的研究[D]. 陈苹. 上海交通大学, 2012(05)
- [9]血小板相关抗体对巨核细胞增殖的实验研究[J]. 汤喜兰,黄立新,曾治君,张启云,单义民,徐国良. 江西中医学院学报, 2009(05)
- [10]小鼠、兔和牛胚胎干细胞分离培养及其向神经样细胞的分化[D]. 郭志林. 西北农林科技大学, 2008(11)