一、蛋白酶激活受体2在小鼠肾间质纤维化中的表达及其意义（论文文献综述）
刘思逸[1]（2021）在《基于NLRP3炎症小体信号探讨高糖环境下大鼠肾小管上皮细胞炎症因子变化及糖尿病大鼠肾脏纤维化机制》文中指出目的:研究高糖环境培养下大鼠肾小管上皮细胞和糖尿病大鼠肾脏的NLRP3炎症小体的表达及其相关炎性因子、纤维化因子的表达变化;运用NLRP3 siRNA基因沉默技术及血管紧张素受体拮抗剂（ARB类药）干预糖尿病肾病大鼠和受高糖刺激后的大鼠肾小管上皮细胞,检测上述指标的表达变化,探讨NLRP3炎症小体在糖尿病肾脏疾病的潜在作用机制,探究厄贝沙坦是否能阻断NLRP3炎症小体的作用;设计不同时间点,初步探讨高糖刺激的时间长度对NLRP3炎症小体及通路相关分子的表达变化。方法:使用脂质体转染NLRP3 siRNA,荧光显微镜下观察NRK-52E细胞转染阳性率,荧光定量PCR验证转染效率。细胞实验部分:分5组多个时间点:低糖组、高糖组、高糖+空载组、高糖+NLRP3 siRNA组、高糖+ARB组,采用Q-PCR法检测各时间点的NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）、波形蛋白（Vimentin）m RNA的表达;Western Blot检测各时间点的NLRP3、热休克蛋白47（HSP47）、核因子?B（NF-?B）P-P65、Ⅳ型胶原蛋白（Collagen IV）、波形蛋白（Vimentin）蛋白表达;ELISA法检测细胞上清液白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-ɑ（TNF-ɑ）的表达水平。动物实验部分:分5组多个时间点（4W、8W、12W）:正常对照组、高糖模型组、高糖模型+空载组、高糖模型+NLRP3 siRNA组、高糖模型+ARB组,肾组织学免疫组化观察NF-?B P-P65的变化,肾组织免疫荧光观察Vimentin、NLRP3的变化;采用Q-PCR法检测各时间点的糖尿病大鼠肾脏组织NF-?B、NLRP3、HSP47、肿瘤坏死因子受体相关蛋白6（TRAF6）、Collagen IV m RNA的表达;Western Blot检测各时间点的NLRP3、HSP47、ɑ-平滑肌肌动蛋白（ɑ-SMA）、Vimentin、p-P65蛋白的表达。结果:细胞实验:1、五组细胞干预处理48h后,与低糖组比较,高糖组及高糖+空载组NLRP3、Vimentin m RNA的表达显着增加（P<0.01）,Caspase-1 m RNA的表达明显增加（P<0.05）;NLRP3、HSP47、P-P65、Vimentin、Collagen IV蛋白的表达量显着增加（P<0.01）。与高糖组相比,高糖+NLRP3-siRNA组及高糖+ARB组的NLRP3 m RNA的表达显着下调（P<0.01）,Caspase-1、Vimentin m RNA的表达明显下调（P<0.05）,NLRP3、HSP47、P-P65、Vimenti、Collagen IV蛋白表达量显着下调（P<0.01）。高糖组与高糖+空载组以上指标之间的差异无统计学意义。2、五组细胞干预处理72h后,与低糖组比较,高糖组及高糖+空载组NLRP3、Caspase-1、Vimentin m RNA的表达显着增加（P<0.01）,NLRP3、HSP47、P-P65、Vimentin、Collagen IV蛋白的表达量显着增加（P<0.01）。与高糖组相比,高糖+NLRP3-siRNA组及高糖+ARB组的NLRP3、Vimentin m RNA的表达明显下调（P<0.05）,Caspase-1 m RNA的表达显着下调（P<0.01）,NLRP3、HSP47、P-P65、Vimenti、Collagen IV蛋白表达量显着下调（P<0.01）。高糖组与高糖+空载组上指标之间的差异无统计学意义。3、五组细胞干预处理96h后,与低糖组相比,高糖组及高糖+空载组NLRP3、HSP47、P-P65、Vimentin、Collagen IV蛋白的表达量出现显着增加（P<0.01）;与高糖组相比,高糖+NLRP3 siRNA组及高糖+ARB组NLRP3、HSP47、P-P65、Vimenti蛋白表达量显着下调（P<0.01）,Collagen IV蛋白的表达量明显下调（P<0.05）。高糖组与高糖+空载组上指标之间的差异无统计学意义。4、各时间点（24h、48h、72h）,与低糖组相比,高糖组及高糖+空载组IL-1β、TNF-α的表达量更高;与高糖组相比,高糖+NLRP3 siRNA组及高糖+ARB组IL-1β、TNF-α的表达量更低。随时间变化,24h～72h高糖组IL-1β、TNF-α的表达呈上升趋势;高糖+NLRP3 siRNA组及高糖+ARB组IL-1β、、TNF-α的亦表达呈上升趋势,但表达小于高糖组。动物实验:1、各组干预处理4W后,与Control组比较,Model组及Model+Blank组NF-?B、NLRP3、HSP47、TRAF6、Collagen IV m RNA的表达显着增加（P<0.01）,NLRP3、HSP47、α-SMA、Vimentin、P-P65蛋白的表达量增加（P<0.01）。与Model组相比,Model+NLRP3-siRNA及Model+ARB组的NF-?B、NLRP3、HSP47、TRAF6、Collagen IV m RNA的表达明显下调（P<0.05）,Model+ARB组NLRP3、HSP47蛋白表达量明显下调（P<0.05）,α-SMA、Vimentin、P-P65显着下调（P<0.01）;Model+NLRP3-siRNA组α-SMA、Vimentin、P-P65蛋白的表达量显着下调（P<0.01）,NLRP3、HSP47明显下调（P<0.05）。Model组与Model+Blank组以上指标之间差异无统计学意义。2、各组干预处理8W后,与Control组比较,Model组及Model+Blank组NF-?B、NLRP3、HSP47、TRAF6、Collagen IV m RNA的表达显着增加（P<0.01）,NLRP3、HSP47、α-SMA、Vimentin、P-P65蛋白的表达量增加（P<0.01）。与Model组相比,Model+NLRP3-siRNA及Model+ARB组的NF-?B、NLRP3、HSP47、TRAF6、Collagen IV m RNA的表达明显下调（P<0.05）,Model+ARB组NLRP3、α-SMA、Vimentin、P-P65蛋白表达量下调（P<0.01）,HSP47显着明显下调（P<0.05）,Model+NLRP3-siRNA组NLRP3、Vimentin、P-P65蛋白的表达量显着下调（P<0.01）,SP47、α-SMA明显下调（P<0.05）。Model组与Model+Blank组以上指标之间差异无统计学意义。3、各组干预处理12W后,与Control组比较,Model组及Model+Blank组NF-?B、NLRP3、HSP47、TRAF6、Collagen IV m RNA的表达显着增加（P<0.01）,NLRP3、HSP47、α-SMA、Vimentin、P-P65蛋白的表达量增加（P<0.01）。与Model组相比,Model+NLRP3-siRNA及Model+ARB组的NF-?B、NLRP3的表达显着下调（P<0.01）,HSP47、TRAF6、Collagen IV m RNA的表达明显下调（P<0.05）,NLRP3、HSP47、α-SMA、Vimentin、P-P65蛋白表达量明显下调（P<0.05）;Model+NLRP3-siRNA组NLRP3、HSP47、α-SMA、P-P65蛋白的表达量明显下调（P<0.05）。Model组与Model+Blank组以上指标之间差异无统计学意义结论:高糖可激活天然免疫受体NLRP3炎症小体表达,导致炎性因子和纤维化因子表达上调,诱导大鼠肾小管上皮细胞发生表型转换和糖尿病大鼠肾组织发生纤维化。特异性NLRP3 siRNA基因沉默及血管血管紧张素II受体拮抗剂ARB厄贝沙坦,可阻断由高糖诱导的NLRP3炎症小体的激活,下调炎性因子释放及纤维化蛋白的表达,从而延缓肾病进展。
郑海兰[2]（2021）在《FG-4592通过干预RIP1-RIP3-MLKL介导的坏死性炎症对UUO大鼠肾纤维化的保护作用》文中研究表明目的:FG-4592（Roxadustat,罗沙司他）是一种新型HIF-脯氨酸羟化酶抑制剂,已被证明对急性肾损伤具有肾保护作用。然而,它在慢性肾脏疾病进展中的作用在很大程度上是未知的。本研究旨在评估FG-4592是否通过干预单侧输尿管梗阻（Unilateral ureteral obstruction,UUO）大鼠的坏死性炎症来减缓肾纤维化,对慢性肾脏病具有肾保护作用。方法:80只7周龄（体重240～250g）SPF级Sprague-Dawley雄性大鼠均自由饮水和进食,适应性喂养1周后大鼠随机分成10组（n=8/组）。行单侧输尿管结扎术前,大鼠禁食12小时,给予正常饮水。造模前分为假手术组（Sham group）和UUO模型组,其中UUO模型组采用分离大鼠左侧输尿管进行双结扎造模,Sham组只分离左侧输尿管后不结扎输尿管。在术前,UUO模型组的大鼠提前48小时给予灌胃FG-4592（10mg/kg/d）和/或腹腔注射Nec-1（2mg/kg/d）行预处理,UUO造模后继续治疗14天,并分别于7天、14天处死大鼠。（1）Sham7组:给予等量的生理盐水灌胃7天;（2）Sham14组:给予等量的生理盐水灌胃14天;（3）UUO7组:单侧输尿管结扎术后7天;（4）UUO14组:单侧输尿管结扎术后14天;（5）UUO7+FG组:单侧输尿管结扎并给予灌胃FG-4592（10mg/kg/d）7天;（6）UUO14+FG组:单侧输尿管结扎并给予灌胃FG-4592（10mg/kg/d）14天;（7）UUO7+Nec-1组:单侧输尿管结扎并给予腹腔注射Nec-1（2mg/kg/d）7天;（8）UUO14+Nec-1组:单侧输尿管结扎并给予腹腔注射Nec-1（2mg/kg/d）14天;（9）UUO7+FG+Nec-1组:单侧输尿管结扎并给予灌胃 FG-4592（10mg/kg/d）和 Nec-1 腹腔注射（2mg/kg/d）7 天;（10）UUO14+FG+Nec-1 组:单侧输尿管结扎并给予灌胃FG-4592（10mg/kg/d）和Nec-1腹腔注射（2mg/kg/d）14天。右侧颈内静脉采血,用全自动生化分析仪检测血肌酐（Serumcreatinine,Scr）及血尿素氮（Blood urea nitrogen,BUN）。采集肾组织标本,常规石蜡包埋和切片,Masson染色法观察肾间质纤维化（Tubulointerstitial fibrosis,TIF）程度,PAS染色观察肾小管组织损伤,使用电子显微镜观察肾组织的线粒体等超微结构变化。在分子水平上,免疫印迹法检测了RIP1-RIP3-MLKL 信号轴蛋白表达、IL-1β、IL-18 和 NLRP3 和促炎介质（MCP-1、TNF-α和TLR-2）的表达、检测肾小管间质纤维化相关致纤维因子TGF-β1和CTGF表达,从坏死性凋亡、NLRP3炎症体和促炎介质的角度评价了 FG-4592对UUO诱导的坏死性炎症的影响。检测了氧化应激相关蛋白SOD、MnSOD、NOX-2、NOX-4表达和血清及尿中8-OHdG表达水平,为明确对于内质网应激的影响检测了 CHOP、BiP、IRE-1α和ATF-6的表达,以及为明确对线粒体功能障碍的影响,检测了 TOMM20、NDUFA10、SDHA、DrP-1和OPA1,此外还检测了 Bcl-2/Bax 比值和活化型caspase-3蛋白以及HIF-1α/Wnt3α/β-catenin/GSK-3β信号传导通路相关蛋白的表达。结果:1.在分子水平上,RIP1-RIP3-MLKL信号轴蛋白在UUO肾脏组织中的表达逐渐增加,FG-4592和Nec-1治疗后均可减少RIP1-RIP3-MLKL信号轴蛋白表达,且FG-4592和Nec-1联合治疗组中相关蛋白减少更加显着。电镜下可见UUO肾组织的肾小管上皮细胞聚集坏死、肿胀、上皮细胞微绒毛脱落、细胞溶解。2.UUO7 或 UUO14 组中明显上调了 IL-1β、IL-18 和 NLRP3 和促炎介质（MCP-1、TNF-α和TLR-2）的表达,而FG-4592和Nec-1均可逆转这种表达,且FG-4592和Nec-1联合治疗组中相关蛋白减少更加显着。3.UUO7或UUO14组TIF增加明显,使用FG-4592或Nec-1治疗的UUO7、UUO14组的纤维化评分增加明显减少,而联合使用FG-4592和Nec-1组则进一步明显降低。免疫印记分析表明,与UUO组相比,FG-4592或Nec-1处理后明显抑制了致纤因子TGF-1和CTGF的表达,且呈时间依赖性。4.FG-4592预处理后上调了 SOD1和MnSOD蛋白的表达,而下调了 NOX-2和NOX-4蛋白的表达,提示通过保持氧化酶和抗氧化酶平衡抑制UUO引起的氧化应激。此外,通过氧化应激标志物8-OHdG在血清和尿液中的浓度在UUO7组高于Sham组,在UUO14组最高,而给予FG-4592的UUO组血清和尿液中8-OHdG的浓度则低于Sham组,而联合给予FG-4592及Nec-1的UUO组血清和尿液中的8-OHdG的显着下降等,再次确认了 UUO引起肾损伤与氧化应激密切相关,且FG-4592可逆转UUO引起的氧化应激效应。5.电镜下观察到UUO肾组织的粗面内质网核糖体脱颗粒、囊腔断开、扩张、囊泡化变性,以及过氧化物酶体空泡化变性,而滑面内质网几乎保持正常结构。免疫印迹分析显示,与形态学结果相一致,免疫印迹分析提示UUO明显上调内质网应激相关基因的表达,呈时间依赖性,包括CHOP、Bip、IRE-1α和ATF-6,但FG-4592治疗在观察的两个时间点均明显减少了它们的表达。6.电镜清楚地显示,UUO肾组织中被破坏的线粒体结构,表现为线粒体数量显着减少,空泡变性、嵴扩张,线粒体融合（fusion）,线粒体自噬（mitophagy）,线粒体分裂（fission）两个或三个以上的子细胞器。免疫印迹分析显示,与Sham组相比,UUO肾组织中TOMM20、NDUFA10和SDHA的表达明显受到抑制,而FG-4592预处理可逆转其蛋白的表达。此外,FG-4592明显降低了 DrP-1（裂变蛋白）的表达,但增加了 OPA1（融合蛋白）的表达。7.TUNEL阳性细胞定量计数显示,UUO组TUNEL阳性细胞数增加,:FG-4592治疗组在UUO第7天和第14天均明显减少了 TUNEL阳性细胞数。免疫印迹分析显示,给予FG-4592预处理的UUO组大鼠可显着调节Bcl-2/Bax 比值,并恢复活化型caspase-3蛋白的表达以利于细胞的生存。8.UUO以时间依赖的方式诱导Wnt3α/β-catenin/GSK-3β的激活,而FG-4592处理可抑制其表达。结论:1.UUO可引起RIP1-RIP3-MLKL相关蛋白过度表达,同时引发细胞焦亡、坏死性炎症以及肾纤维化,呈时间依赖性。2.坏死性炎症与氧化应激所致线粒体功能障碍、内质网应激和细胞凋亡紧密相关。3.上述改变均被FG-4592或RIP1抑制剂Nec-1所逆转,说明FG-4592通过抑制RIP1-RIP3-MLKL诱导的坏死性炎症从而改善UUO肾纤维化。4.FG-4592的抗纤维化作用可能是通过干预HIF-1α/Wnt/catenin/GSK信号通路而完成。
张杰[3]（2021）在《E3泛素连接酶TRIM31在高血压肾病中的作用及机制研究》文中研究指明研究背景高血压作为心脑血管疾病发生的主要致病因素,同时也是导致肾脏发生损伤的重要原因。高血压肾病（Hypertensive Renal Disease,HRD）是由原发性高血压导致的肾脏结构和功能的损害,是内科常见疾病之一,但其发病机制尚未完全清楚。高血压肾损害主要表现为蛋白尿增多、良性肾小球硬化、肾脏间质纤维化以及炎症细胞浸润。肾小管及间质的纤维化、炎症和免疫激活是导致HRD持续进展的重要因素。细胞外基质蛋白合成及其降解之间的平衡受损造成过量的基质沉积,这是纤维化过程的一个典型特征。炎症因子的分泌以及炎症细胞的浸润是肾脏纤维化的始动因素。目前还没有有效的方法可预防纤维化的进展,因此提高对HRD纤维化和炎症进展的细胞及分子机制的认识至关重要。目前研究中常见的HRD发病机制有遗传因素、盐敏感、氧化应激、内皮细胞功能障碍以及肾素-血管紧张素醛固酮系统（Renin-Angiotensin-Aldosterone System,RAAS）的激活。抑制RAAS的过度激活是目前减缓肾脏疾病进展的最有效的方法。血管紧张素Ⅱ（Angiotension Ⅱ,AngⅡ）作为RAAS的主要效应因子,主要通过血流动力学和非血流动力学两方面参与血压和靶器官损害的调节。它可作用于肾脏血管平滑肌细胞,导致血管收缩;它也可作为促炎剂,激活细胞内信号传导系统,促进肾脏的炎症反应;而且它可通过上调转化生长因子β1（Transforming growth factor-beta 1,TGF-β1）的表达、增加成纤维细胞增殖,促进细胞外基质的合成、抑制细胞外基质的降解,加速肾脏纤维化的过程。因此,AngⅡ是HRD进展中的关键调节因子。泛素化修饰作为一种常见的蛋白质翻译后修饰,不仅是蛋白酶体降解目的蛋白的标记,也是蛋白-蛋白相互作用和酶激活的调节因素。目前研究发现多种E3泛素连接酶可调控高血压及其靶器官的损害,但针对高血压肾损伤的泛素化修饰研究还鲜有报道。发现调控HRD的新型E3泛素连接酶及探寻其调控机制,将为阐述HRD发病机制及研发HRD药物提供良好的理论基础,这也成为当前该领域的热点问题。TRIM（The tripartite motif）31属于TRIM家族的一员,也是一个非常重要的E3泛素连接酶,其是否同样在高血压及HRD中发挥重要作用尚未报道。既往研究表明,TRIM31在多种疾病发展中发挥着关键的调控作用,尤其是在肿瘤的增殖、迁移过程中,机制方面主要涉及到TRIM31调控核因子κB（Nuclear factor kappa-B,NF-κB）的活化参与炎症反应。因NF-κB的活化在HRD的病理进展中发挥着至关重要的作用,提示TRIM31可能同样参与到HRD疾病的发生和发展中。在本实验中,我们提出以下科学假设:在AngⅡ构建的HRD小鼠模型中,E3泛素化连接酶TRIM31可改善肾脏功能、纤维化和炎症反应。为了验证以上假说,我们精心设计了一系列的体内和体外实验。研究目的1.探讨TRIM31与人和小鼠HRD病理进展的相关性;2.探讨TRIM31是否参与调节HRD小鼠的肾脏功能损害;3.探讨TRIM31是否参与调节HRD小鼠的肾脏纤维化;4.探讨TRIM31是否参与调节HRD小鼠的肾脏炎症反应。研究方法1.实验动物利用 TALEN（Transcription activator-like effectors Nucleases）技术构建TRIM31基因敲除（TRIM3 1-/-）小鼠,小鼠背景为C57BL/6J。与野生型C57BL/6J小鼠杂交扩繁,得到同窝纯合野生型C57BL/6J（TRIM31+/+）小鼠和TRIM31-/-小鼠。野生型C57BL/6J小鼠购买于维通利华（北京）实验动物技术有限公司。所有动物实验均遵循国家卫生部动物管理办法（documentation No 55,2001）,同时遵守山东大学齐鲁医院伦理委员会对动物实验的要求和规定。2.实验动物分组（1）选取8周龄雄性野生型（Wildtype,WT）C57BL/6J小鼠,随机分成两组,每组15只:生理盐水组,AngⅡ组。（2）分别选取8周龄雄性TRIM31-/-小鼠和同窝雄性TRIM31+/+小鼠,随机分为四组,每组15只:TRIM31+/++生理盐水组,TRIM31-/-+生理盐水组,TRIM31+/++AngⅡ 组,TRIM31-/-+AngⅡ 组。3.HRD小鼠模型的建立预先将微量渗透泵灌注适当剂量AngⅡ分别埋入8周龄雄性小鼠的背侧皮下,以泵速1000ng/kg/min持续泵入AngⅡ 42天,构建高血压小鼠模型,对照组泵入同等体积的无菌生理盐水（每组15只）。分别于造模前和造模后每周定时测量小鼠血压、体重,并留取小鼠24h尿液。实验结束时,将小鼠进行安乐死,测量体重及左右肾重,并留取小鼠血液、肾脏、心脏、肝脏、小肠等组织标本进行下一步组织和细胞分子学研究。4.临床高血压肾病患者肾活检标本收集和检测我们从山东大学病理学教研室获得行肿瘤切除术的无高血压患者的正常癌旁肾组织（Control）、无高血压的肾小球轻微病变（Glomerular minor lesion,GML）患者肾脏活检组织、HRD患者肾脏活检组织样本。利用免疫组化（immunohistochemistry,IHC）检测TRIM31蛋白的表达情况,同时利用苏木素-伊红染色（Hematoxylin andeosin,HE）和 Masson’s trichrome 染色探讨 TRIM31蛋白表达与肾脏损伤和纤维化程度的相关性。5.小鼠基因型鉴定利用鼠尾提取试剂盒提取小鼠鼠尾DNA,PCR扩增后通过测序对小鼠进行基因型鉴定。同时提取小鼠的肾脏组织蛋白,通过蛋白免疫印迹分析（Western blot）的方法检测TRIM31的蛋白表达水平,评估TRIM31的基因敲除效率。6.细胞培养和处理实验中采用人近端肾小管上皮细胞系（Human proximal renal tubular eβ1thelial cell-2,HK2）,培养在 10%FBS 的 RPMI1640 培养基中,于含 5%CO2 的 37℃孵箱中增殖。主要处理见下:（1）时间浓度实验:选用10-5MAngⅡ分别刺激HK2细胞0,4h,8h,12h,24h,36h,收集细胞。（2）浓度梯度实验:分别选用 0,10-8M,10-7M,10-6M,10-5M,10-4M的 AngⅡ刺激HK2细胞24h,收集细胞。7.小鼠血压测量利用Data Sciences International（DSI）无线遥感测量方法分别于造模前和造模后每周定时测量4组小鼠（TRIM31+/++生理盐水组,TRIM31-/-+生理盐水组,TRIM31+/++AngⅡ 组,TRIM31-/-+AngⅡ 组）的收缩压（Systolic blood pressure,SBP）和舒张压（Diastolic blood pressure,DBP）。8.小鼠组织样本取材分别于造模前和造模后每周定时测量小鼠血压、体重,并留取小鼠尿液进行相关肾脏功能指标检测。实验结束时,将小鼠进行安乐死,并留取小鼠血液、肾脏、心脏、肝脏、小肠等组织标本,对心脏和左右肾脏进行称重,剥除肾脏包膜,依后期实验需求将各个组织放于液氮保存或者放于4%多聚甲醛中固定24-48h或者放于2%戊二醛中固定以待后续实验使用。9.小鼠肾脏功能和24h尿蛋白检测留取小鼠血液和尿液,利用全自动生化仪和ELISA的方法检测TRIM31-/-小鼠与 TRIM31+/+小鼠血清中尿素氮（Blood urea nitrogen,BUN）、肌酐（serum creatinine,Cr）、尿酸（Uric acid,UA）以及24h尿蛋白等主要肾脏功能指标的差异。10.透射电镜（Transmission electron microscope,TEM）观察小鼠肾脏超微结构取4组小鼠的肾脏皮质,利用2.5%的戊二醛固定组织后,利用透射电镜观察4组小鼠的肾小球足突细胞、基底膜等超微结构。11.Meso Scale Discovery（MSD）检测血清中炎症相关指标取的4组小鼠冻存在-80℃冰箱的血清,基于电化学发光的原理,利用预包埋好的MSD多因子检测板和MSD检测器来检测小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β和MCP-1的含量。12.小鼠肾脏组织学和IHC染色将固定在4%多聚甲醛中的4组小鼠肾脏组织脱水包埋成蜡块,制备石蜡切片（厚度:4μm）。通过Masson’s trichrome和天狼猩红染色检测4组小鼠肾脏间质的纤维化情况。过碘酸雪夫氏染色（Periodic acid-schiffstain,PAS）观察小鼠肾脏中肾小球硬化的差异。利用IHC的方法检测4组小鼠肾脏组织中TRIM31、KIM-1、Nephrin、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、Collagen Ⅳ、Fibronectin、α-SMA、CD68、TNF-α、IL-6和IL-1β的表达差异。13.组织RNA提取、反转录和实时荧光定量PCR（Real-time PCR,RT-PCR）提取4组小鼠肾脏组织和HK2细胞的RNA,利用TAKARA反转录试剂盒进行mRNA的反转录,然后通过RT-PCR获得目的基因trim31、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、collagen Ⅳ、fibronectin、α-sma、tnf-α、il-6和il-1β的 Ct 值,利用β-actin作为内参,将所得的Ct值,采用公式（2-ΔΔCT）计算目的分子表达量的的相对变化。14.Western blot 分析利用蛋白提取试剂盒提取4组小鼠肾脏组织蛋白,或利用细胞裂解液提取HK2细胞蛋白,BCA调定蛋白浓度后进行SDS-PAGE凝胶电泳,检测TRIM31、TRIM31、KIM-1、Nephrin、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、Collagen Ⅳ、Fibronectin、Δ-SMA、TNF-Δ、IL-6 和 IL-1β 的蛋白含量。15.数据统计分析方法所有数据分析均使用的GraphPad Prism 8软件,以均数（mean）±标准误（SEM）进行表示。首先采用Shaβ1ro-Wilk检验对数据分布进行正态性假设的评估。对于属于正态分布的单因素数据,两组间的统计差异采用非配对t检验分析,多组间的统计差异采用单因素方差分析。对于具有两个变量的多组数据,验证数据属于正态分布后,使用双因素方差分析进行分析其统计差异。对于不属于正态分布的数据,我们使用的Kruskal-Wallis检验进行非参数统计分析。在所有的统计比较中,p值小于0.05为有统计学意义。研究结果1.在AngⅡ诱导的HRD小鼠模型肾组织中TRIM31的表达量明显下调我们通过在小鼠皮下埋入AngⅡ缓释泵成功构建了 HRD小鼠模型。通过IHC、Western blot和RT-PCR的方法进行检测,发现与生理盐水组对比,AngⅡ组小鼠肾脏的TRIM31表达量明显下调。2.AngⅡ剂量和时间依赖性调控肾小管上皮细胞中TRIM31的表达体外培养的HK2细胞,AngⅡ刺激细胞不同的时间（0,4h,8h,12h,24h,36h）或以不同的浓度（0,10-8 M,10-7M,10-6 M,10-5 M,10-4 M）的 AngⅡ刺激细胞,利用Western blot和RT-PCR的方法进行检测,发现伴随AngⅡ的梯度刺激,TRIM31的表达在蛋白水平和mRNA水平均呈现显着降低。以上体内外实验说明,TRIM31的表达与HRD存在一定相关性,提示我们TRIM31可能参与到HRD疾病进展过程。3.利用TRIM31敲基因小鼠构建AngⅡ诱导的小鼠HRD模型（1）在C57BL/6J的小鼠背景下,利用TALEN技术成功构建TRIM31敲基因小鼠。提取小鼠鼠尾基因组DNA进行鼠尾基因型鉴定,证实了 TRIM31敲基因小鼠成功构建。同时提取TRIM3 1+/+和TRIM3 1-/-小鼠肾脏组织蛋白,利用Western blot的技术进一步验证了 TRIM31敲基因小鼠中TRIM31的蛋白敲除效率。（2）测量4组小鼠（TRIM31+/++生理盐水组,TRIM3 1-/-+生理盐水组,TRIM31+/++AngⅡ组,TRIM3 1-/-+AngⅡ组）造模前后的体重和取材后左右肾重量,发现TRIM31基因敲除并不影响小鼠的肾重/体重比。4.TRIM31基因缺失不影响AngⅡ诱导的小鼠血压的改变利用DSI遥感法对4组小鼠的SBP及DBP进行测量,结果显示,与生理盐水组对比,AngⅡ组小鼠血压在泵入后第一周起即出现明显升高,并在接下来的几周持续在较高水平。DSI测量结果显示AngⅡ组小鼠造模结束前最后一周血压均大于140mmHg,达到高血压的水平,证实了小鼠高血压模型构建成功。然而在泵入生理盐水或者AngⅡ后,TRIM31+/+与TRIM31-/-两组小鼠间无明显血压改变。以上结果说明,TRIM31基因缺失不影响小鼠血压的基线水平,也不影响影响AngⅡ诱导的小鼠血压的改变。5.TRIM31基因缺失加重AngⅡ诱导的高血压肾功能损伤小鼠血清Cr、BUN和24h尿蛋白的测量表明,AngⅡ诱导的HRD小鼠出现了肾功能的损伤和小鼠肾滤过屏障的损害,而TRIM31基因缺失进一步加重了AngⅡ诱导的HRD小鼠的肾损伤。肾脏Nephrin、KIM-1的Western blot和IHC染色提示,TRIM31基因敲除加重了 AngⅡ引起HRD小鼠的肾小管的损伤和肾脏足突细胞的损害。同时PAS染色表明,AngⅡ诱导的HRD小鼠的发生了肾小球硬化,TRIM31基因敲除进一步加重HRD小鼠的肾小球硬化。此外,TEM检测发现TRIM31基因敲除后明显加AngⅡ诱导的HRD小鼠肾脏的足突和基底膜的损害。以上说明TRIM31基因缺失明显加重了 HRD小鼠的肾功能损伤。6.TRIM31基因缺失加重AngⅡ诱导的高血压肾纤维化Masson’s trichrome和天狼猩红染色显示,AngⅡ诱导的HRD小鼠的肾脏呈现明显的纤维化,并且TRIM31-/-小鼠较TRIM31+/+小鼠更严重。Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、Collagen Ⅳ、纤连蛋白（Fibronectin）和促纤维化因子 α-smooth muscle actin（α-SMA）的 IHC、Western blot、RT-PCR 实验显示在泵入 AngⅡ后,与TRIM31+/+对比,TRIM3 1-/小鼠的以上纤维化指标表达明显增加。提示TRIM31基因缺失可明显加重AngⅡ诱导的高血压肾纤维化。7.TRIM31基因缺失加重AngⅡ诱导的HRD小鼠肾脏的炎症反应利用MSD多因子检测技术检测4组小鼠（TRIM31+/++生理盐水组,TRIM31-/-+生理盐水组,TRIM3 1+/++AngⅡ组,TRIM31-/-+AngⅡ组）血清中炎症相关指标,结果显示泵入AngⅡ后,小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-iβ的表达量明显增加,与TRIM31+/+小鼠对比,TRIM31-/-小鼠增加的更为显着。利用巨噬细胞表面Marker CD68抗体对4组小鼠肾脏进行IHC染色,结果显示泵入AngⅡ后,巨噬细胞浸润明显增加,与TRIM31+/+小鼠对比,TRIM31-/-进一步加重了HRD小鼠的肾脏组织中巨噬细胞的浸润。同时IHC、Western blot和RT-PCR的方法检测4组小鼠肾脏炎症指标表达量,结果同样提示与TRIM31+/+小鼠对比,TRIM31基因敲除后明显增强小鼠肾脏组织中炎症相关分子TNF-α、IL-6、IL-1β的表达。8.TRIM31在HRD患者肾活检组织中的表达明显下降利用IHC的检测方法,我们发现与非高血压患者的正常癌旁肾组织Control和非高血压的GML活检肾组织相比,HRD患者的肾组织切片中TRIM31的表达量明显下调。实验结论1.TRIM31在HRD的病理组织中蛋白表达量降低。2.TRIM31基因缺失明显加重了小鼠高血压肾功能损害、纤维化和炎症反应。研究背景炎症和纤维化是高血压肾病（Hypertensive Renal Disease,HRD）的两个主要病理特征,血管紧张素Ⅱ（AngiotensionⅡ AngⅡ）在诱发肾脏组织发生炎症和纤维化的过程中发挥着关键作用。转化生长因子β1（Transfoiming growth factor-beta 1,TGF-β1）是HRD炎症、纤维化发病机理中的主要调控因子。TGF-β1可诱导细胞外基质（Extracellular Matrix,ECM）的生成和沉积、促进成纤维细胞的增殖和分化和上皮细胞的转分化等病理过程。机制方面,TGF-β1主要通过介导Smad依赖的信号通路和非Smad依赖的信号通路（主要是MAPKs和NF-kB信号通路）的活化来调控肾脏纤维化及肾脏炎症,靶向抑制TGF-β1下游信号通路的激活对HRD的治疗具有重大意义。研究显示,Angll可诱导肾脏过度分泌TGF-β1等细胞因子,并进一步通过TGF-β1加重高血压肾损伤。探讨TGF-β1信号通路的调控机制,有利于进一步阐明高血压肾病的发病原因,并为高血压肾病药物研发提供理论依据。TGF-β-activated kinase 1（TAK1）是一种丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶（Mitogen-activated protein kinase kinase kinase,MAP3K）。TAK1的激酶活性受到TGF-β1等多种细胞因子的调控。研究显示,活化的TAK1进一步磷酸化TGF-β1信号通路下游关键接头蛋白,在非Smad依赖的信号通路（主要是MAPKs和NF-kB）的活化及炎症因子的产生过程中发挥着关键作用。然而,在HRD发生发展过程中,TAK1是否同时参与调控TGF-β1介导的经典Smad信号通路及肾脏纤维化进展仍有待进一步的研究阐明。泛素化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰,是泛素本身通过7个内部的赖氨酸（K6、K11、K27、K29、K33、K48和K64）形成多聚泛素链。E3泛素连接酶决定了泛素分子结合到靶蛋白的特异性,因此也是蛋白质泛素过程中最关键的分子。蛋白质泛素化修饰在多种疾病发生发展过程中发挥着关键作用。研究蛋白质泛素化修饰调控HRD发生的分子机制,并寻找新型治疗靶点具有重要的科学意义和临床价值。已有文献报道,蛋白泛素化修饰在TGF-β1下游信号转导以及TAK1生物学功能的发挥着重要的作用,然而相关的E3泛素连接酶有待进一步的发现。在我们第一部分研究中已证实The tripartite motif 31（TRM31）参与并调控HRD小鼠肾功能损伤、纤维化和炎症反应。TRIM31是否通过调控TGF-β1信号通路在HRD中发挥作用,以及具体的分子机制有待进一步研究。因此,我们在本研究中提出了以下科学假说:TRIM31可通过泛素化修饰TGF-β1信号通路中的靶蛋白,从而参与到TGF-1P相关信号通路在HRD中的激活,进而在HRD病理进程中发挥保护作用。在本研究中,我们将通过体内和体外实验研究进一步探讨TRIM31在HRD中发挥作用的分子机制,为高血压肾损害的治疗寻找新的靶点。研究目的1.探讨在HRD病理进展中TRIM31对TGF-β1信号通路活化的影响;2.探讨TGF-β1信号通路TRIM31的靶分子;3.探讨TRIM31对靶分子的泛素化修饰情况;4.探讨TAK1在TGF-β1信号通路中的作用。研究方法1.实验动物分组分别选取8周龄雄性TRIM31-/-小鼠和同窝雄性TRJM31+/+小鼠,随机分为四组,每组15只:TRIM31+/++生理盐水组,TRIM31-/-+生理盐水组,TRJM31+/++AngⅡ组,TRIM31-/-+AngⅡ组。2.HRD小鼠模型的建立将预先灌注好AngⅡ的微量渗透泵,分别埋入小鼠的背侧皮下,按照以1000ng/kg/min的泵速持续泵入AngⅡ42天,构建HRD小鼠模型,对照组泵入同等体积的无菌生理盐水。实验结束时,将小鼠进行安乐死,并留取小鼠肾脏进行下一步组织和细胞分子学研究。3.临床髙血压肾病患者肾活检标本收集和检测我们从山东大学病理学教研室获得行肿瘤切除术的无高血压患者的正常癌旁肾组织（Control）、无高血压的肾小球轻微病变（Glomerular minor lesion,GML）患者肾脏活检组织、HRD患者肾脏活检组织样本。利用免疫组化（immunohistochemistry,IHC）检测TGF-β1、Collagen Ⅰ、pSmad3、TAK1、TNF-a、pP65的表达情况。4.细胞培养和处理实验中采用人近端肾小管上皮细胞系（Human proximal renal tubular eβ1thelial cell-2,HK2）、小鼠原代肾小管上皮细胞（Mouse Primary renal tubular eβ1thelial cells,MRPTEβ1C）、人胚肾细胞（HEK-293T）,分别培养在含10%FBS的RPMI1640、高糖DMEM培养基和Eβ1CM-A培养基中,于含5%CO2的37°C孵箱中增殖。主要处理见下:（1）HK2细胞处理:1)选择hTGF-β1作为HRD体外刺激因子。体外培养HK2细胞,给予不同浓度的hTGF-β1（0,2ng/mL,4ng/mL,6ng/mL,8ng/mL,10ng/mL）刺激24h或以10ng/mL的hTGF-β1刺激不同时间（0,4h,8h,12h,24h,36h）,收集细胞;2)体外培养HK2细胞,给予TGF-β1中和抗体预处理后,以10-5 M浓度的AngⅡ刺激HK2细胞时间梯度（0,4h,8h,12h,24h,36h）,提取细胞蛋白;3)体外培养HK2细胞,利用RNAiMAX转染细胞TRIM31的小干扰RNA敲减TRIM31的表达,使用10ng/mL的hTGF-β1刺激细胞0、12h或24h,提取细胞蛋白;4)将构建的将Flag标签的TRIM31-WT、缺失突变体TRIM31-ΔRing以及点突变TRIM31-C53A/C56A过表达质粒利用Lipo3000转染试剂分别转染体外培养的HK2细胞,并利用10ng/mL hTGF-β1刺激细胞0或24h,提取细胞蛋白,进行Western blot实验;5)体外培养HK2细胞,lOng/mLhTGF-β1刺激0.5h或lh后,提取细胞蛋白,进行Western blot或免疫共沉淀实验（Co-immunopreciβ1tation,Co-IP）实验;6)体外培养HK2细胞系,利用TAK1的特异性抑制剂5z-7-oxozeaenol（5z7）抑制TAK1的激酶活性,或利用TAK1的小干扰RNA敲减TAK1的蛋白表达,使用10ng/mLhTGF-β1刺激细胞0.5h和lh后,提取细胞蛋白。（2）MRPTEpiC细胞处理:体外培养MRPTEpiC细胞,利用TAK1的特异性抑制剂5z7抑制TAK1的激酶活性,或者利用TAK1的小干扰RNA敲减TAK1的蛋白表达,使用10ng/mL hTGF-β1刺激细胞0.5h和lh后,提取细胞蛋白。（3）HEK-293T细胞处理:1)将TRAF6、TAK1、Smad2、Smad3及Smad4的过表达质粒,与TRIM31过表达质粒分别共转染入HEK293T细胞系。提取细胞蛋白进行Co-IP实验;2)将GFP标签的TRIM31和Myc标签的TAK1过表达质粒共转染HEK293T细胞系,进行细胞免疫荧光染色;3)将TRIM31不同的截断突变体（TRIM31-ΔRing,TRIM31-AB,TRIM31-AC-C,TRIM31-AC）和TAK1的不同截断突变体（l-300aa,l-480aa,30I-579aa）,分别与野生型TAK1或者野生型TRIM31过表达质粒共转染入HEK293T细胞系,提取细胞蛋白进行Co-IP实验;4)将不同浓度的Flag-TRIM31过表达质粒与相同浓度Myc-TAKl过表达质粒共转染HEK293T细胞系,提取细胞蛋白;5)将Flag-TRIM31与Myc-TAKl过表达质粒共转染HEK293T细胞系后培养24h,提取细胞蛋白前4h分别加入蛋白酶体途径抑制剂Bortezomib和溶酶体途径抑制剂氯喹（chloroquine）,提取细胞蛋白;6)将Flag标签的TRIM31-WT、TRIM31-ARing以及TRM31-C53A/C56A与Myc-TAKl过表达质粒共转染HEK293T细胞系24h,提取细胞蛋白;7)将HA标签的不同类型（WT、K48或K63）泛素过表达质粒,与Flag-TRIM31、Myc-TAKl过表达质粒共转染HEK293T细胞系24h,提取细胞蛋白,进行CO-1P实验;8)将TAK1赖氨酸点突变过表达质粒Myc-TAK1-K72R、Myc-TAK1-K158R,分别与Flag-TRIM31和HA标签的泛素过表达质粒共转染HEK293T细胞系,24h后提取蛋白,进行CO-IP实验。5.小鼠组织样本取材造模结束后将小鼠进行安乐死,留取小鼠肾脏标本,剥除肾脏包膜后,分别放于液氮保存或者放于4%多聚甲醛中固定2448h以待后续实验使用。6.小鼠肾脏组织制备和IHC染色将固定在4%多聚甲醛中的4组小鼠肾脏组织脱水包埋成蜡块,制备石蜡切片（厚度:4pn）。利用IHC染色的方法检测4组小鼠肾脏组织中TGF-β1的表达差异。7.组织RNA提取、反转录和实时荧光定量（Real-time PCR,RT-PCR）提取4组小鼠肾脏组织和HK2细胞的RNA,利用TAKARA反转录试剂盒进行mRNA的反转录,然后通过RT-PCR获得目的基因八Ⅰ、collagen Ⅲ、collagen Ⅳ、Jibronectin、a-sma、tnf-a、il-6和il-1β办的Ct值,利用P-actin作为内参,将所得的Ct值,采用2-AACT公式计算目的分子的相对表达量的变化。8.Western blot分析利用蛋白提取试剂盒提取4组小鼠肾脏组织蛋白,或利用细胞裂解液提取HK2、HEK293T或MRPTEβ1C细胞蛋白,BCA调定蛋白浓度后进行SDS-PAGE凝胶电泳,检测各个目的分子的蛋白含量。9.激光共聚焦检测TRIM31与TAK1的共定位将GFP标签的TRIM31和Myc标签的TAK1过表达质粒共转染HEK293T细胞系,细胞免疫荧光染色后,利用激光共聚焦显微镜检测TRIM31与TAK1在细胞内的共定位情况。10.表达载体和点突变的构建通过目的基因的引物设计、扩增、酶切和连接等步骤进行重组质粒和点突变质粒的构建和抽提,用于进一步的过表达和体外转录翻译实验。11.免疫共沉淀魏（Co-IP）体外培养HK2,利用内源性抗体进行Co-IP检测内源性目的分子的结合。体外培养HEK293T细胞,并构建各种目的分子的过表达质粒转染细胞,利用标签抗体进行Co-IP检测内源性目的分子的结合。体外翻译系统表达目的分子蛋白,利用标签抗体进行Co-IP检测目的分子的外源性结合。12.细胞转染体外培养HK2、HEK293T或MRPTEβ1C细胞,将TRIM31或TAK1的小干扰RNA利用RNAiMAX转染细胞,敲减目的基因的表达。将过表达质粒利用Lip3000转染细胞进行目的基因的过表达。13.体外翻译系统进行体外蛋白表达实验构建含有T7启动子的PCDNA3.1过表达质粒,利用Promega公司的TNT Quick Coupied Transcription/translation System试剂盒进行网织红细胞体外转录翻译系统,或者利用Mini Expression Module试剂盒进行大肠杆菌体外翻译对TAK1和TRIM31等表达质粒进行体外转录翻译。14.体外泛素化修饰实验将体外翻译系统获得的蛋白加入BostonBiochem公司的体外泛素修饰系统（包含有El,UbcH5a,K48,K63等蛋白）,室温反应30分钟后,利用Western blot的方法检测体外泛素化修饰的情况及泛素化修饰的类型。15.数据统计分析方法所有数据使用GraphPad Prism 8软件进行分析,表示为均数（mean）土标准误（SEM）。采用Shapiro-Wilk检验进行数据分布的正态性假设的评估。采用非配对t检验分析正态分布的单因素数据中两组间的统计差异,采用单因素方差分析分析正态分布的的多组间的统计差异。对于具有两个变量的多组数据,验证数据属于正态分布后,使用双因素方差分析进行分析其统计差异。不属于正态分布的数据,使用Kruskal-Wallis检验进行非参数统计分析。在所有的统计比较中,p值小于0.05为有统计学意义。研究结果1.TGF-β1参与了AngⅡ诱导的小鼠高血压肾损害TGF-β1是高血压肾损伤和肾小管间质纤维化的关键细胞因子。Western blot、IHC和RT-PCR检测发现,TGF-β1在AngⅡ诱导的小鼠HRD的肾脏组织中的表达量明显增加,说明TGF-β1参与了HRD的疾病进展。同时,TGF-β1的表达量在TRIM31+/+和TRIM31I小鼠之间没有统计学差异,说明TRIM31的基因敲除并不影响TGF-β1在HRD肾脏中的表达量。2.TGF-β1抑制TRIM31的蛋白表达Western blot及RT-PCR结果显示,伴随hTGF-β1刺激HK2细胞不同时间或利用不同浓度的hTGF-β1刺激细胞,肾小管上皮细胞中TRIM31的表达均呈现显着降低。这些结果说明TGF-β1抑制TRIM31基因的转录和翻译,并提示TRIM31可能参与TGF-β1介导的信号通路。而在给予TGF-β1中和抗体预处理的情况下,Angll导致TRIM31蛋白水平下降的情况得以恢复。以上提示TGF-β1负向调控TRIM31的蛋白表达,而Angn对TRIM31的蛋白表达调控可能是通过TGF-β1发挥的。3.TRIM31负调控hTGF-β1介导的肾小管上皮细胞的纤维化及炎症反应Western blot和RT-PCR检测结果显示,TRIM31基因敲减能明显加重hTGF-β1诱导的肾小管上皮细胞纤维化进程和炎症相关指标的表达。野生型TRIM31基因过表达可明显改善hTGF-β1诱导的肾小管上皮细胞的纤维化进程和炎症相关指标的表达。而过表达缺失E3泛素连接酶活性的TRIM31 Ring结构域缺失突变体TRIM31-ARing以及E3泛素连接酶活性缺失点突变过表达质粒TRIM31-C53A/C56A不影响hTGF-β1诱导的肾小管上皮细胞的纤维化进程和炎症相关指标的表达。以上结果说明,TRIM31通过其E3泛素连接酶活性抑制hTGF-β1诱导的肾小管上皮细胞的纤维化进程和炎症反应。4.TRIM31介导了TGF-β1信号的通路活化经典Smad信号通路以及非Smad信号通路在肾脏纤维化过程中发挥着重要作用,其中Smad2、Smad3的磷酸化代表经典Smad信号通路活化,ERK、JNK、P38、NF-κB的磷酸化代表非Smad信号通路的活化。提取4组小鼠(TRIM31+/+生理盐水组,TRIM31-/+生理盐水组,TRIM31+/++AngⅡ组,TRIM31-/-+AngⅡ组)肾脏蛋白,Western blot检测显示,相比野生型小鼠HRD肾脏组织,TRIM31-/-HRD小鼠肾脏组织中Smad2、Smad3、ERK、JNK、P38、NF-κB磷酸化明显升高。体外培养HK2细胞,发现TRIM31基因敲减同样能明显增强TGF-β1诱导的经典Smad信号通路以及非Smad信号通路的活化水平。以上结果说明TRIM31可负向调控TGF-β1信号通路的活化水平。5.明确了TGF-β1信号通路中TRIM31的靶分蛋白前期结果表明TRIM31可调控TGF-β1介导的信号通路,我们将重点寻找该信号通路中TRIM31作用的靶蛋白。将TGF-β1信号通路中关键接头分子TRAF6、TAK1、Smad2、Smad3及Smad4等的过表达质粒与TRIM31过表达质粒分别共转染入HEK293T细胞系。利用Co-IP实验检测发现TRIM31与TRAF6、TAK1发生了明显的结合。同时体外培养HK2细胞,hTGF-β1刺激不同时间点后,利用TRIM31特异性抗体进行Co-IP实验,同样检测到了内源性TRIM31与TAK1、TRAF6的结合,同时发现伴随着hTGF-β1刺激时间的增加,HK2细胞中TRIM31与TAK1的结合呈现增多的趋势。以上结果提示TAK1、TRAF6可能是TGF-β1信号通路中TRIM31调控的靶分子。6.TRIM31靶向降解TAK1将浓度梯度的TRIM31过表达质粒与TRAF6或TAK1过表达质粒分别共转染HEK293T细胞系,利用Western blot的方法检测到TRIM31可降低TAK1蛋白表达量,并且存在浓度梯度依赖性。然而,TRM31的过表达并不影响TRAF6的蛋白表达量。我们同时发现,转染TRIM31-ARing以及TRIM31-C53A/C56A过表达质粒不影响TAK1的蛋白表达量。以上结果说明,TRIM31可通过其E3泛素连接酶活性特异性降解TAK1,而对TRAF6的蛋白表达无影响。至此,我们确定TAK1为TGF-β1信号通路中TRIM31的结合及降解靶点。7.TRIM31对TAK1进行了蛋白酶体途径的降解泛素-蛋白酶体途径和自噬-溶酶体途径是体内蛋白质发生降解的主要途径。我们将Flag标签的TRIM31过表达质粒与Myc标签的TAK1过表达质粒共转染HEK293T细胞系,培养24h后分别加入蛋白酶体途径抑制剂Bortezomib和溶酶体途径抑制剂chloroquine处理4h,提取细胞蛋白,利用Western blot的方法检测到蛋白酶体抑制剂Bortezomib可恢复TRIM31介导的TAK1降解,而溶酶体抑制剂chloroquine对TRIM31介导的TAK1降解无影响。以上说明TRIM31通过蛋白酶体途径介导TAK1的降解。8.TRIM31与TAK1在细胞浆中共定位将GFP标签的TRIM31和Myc标签的TAK1过表达质粒共转染HEK293T细胞系,细胞免疫荧光染色后,利用激光共聚焦显微镜检测发现TRIM31与TAK1在细胞中存在明显的共定位。9.TRIM31与TAK1体外结合利用大肠杆菌和网织红细胞体外翻译系统分别获得TRIM31和TAK1的体外表达蛋白,利用glutathione S-transferase（GST）pull-down实验和Co-IP的方法检测到体外表达的TRIM31与TAK1蛋白可发生直接结合。10.TRIM31与TAK1发生结合的结构域通过构建一系列TRIM31与TAK1的关键结构域截断突变体,共转染HEK293T细胞系,Co-IP实验表明TRIM31的130-425氨基酸序列与TAK1的1-300氨基酸序列分别在TRIM31与TAK1的结合中发挥着重要作用。11.TRIM31对TAK1进行了泛素化修饰前期结果证明TRIM31介导了TAK1蛋白酶体途径的降解,TRIM31作为E3泛素连接酶家族的一员,我们进一步探索了TRIM31是否是通过泛素化修饰TAK1进而介导其发生蛋白酶体途径降解。将泛素过表达质粒、TRIM31过表达质粒、TAK1过表达质粒共转染HEK293T细胞系,Co-IP实验表明TRIM31明显促进了TAK1的泛素化修饰,过表达泛素连接酶活性关键结构域缺失突变体TRIM31-ARing以及泛素连接酶活性缺失点突变体TRIM31-C53A/C56A则没有此作用,说明TRIM31可促进TAK1的泛素化修饰,这一作用与TRIM31的E3泛素连接酶功能密切相关。作为对照,TRM31并不能促进接头分子TRAF6的泛素化修饰。12.证明TRIM31促进TAK1进行了K48位泛素化修饰前面验证了TRIM31可对TAK1进行泛素化修饰,为进一步探索TRIM31对TAK1进行泛素化修饰的类型,我们分别将不同类型（WT、K48或K63）的泛素过表达质粒,与TRIM31过表达质粒、TAK1过表达质粒共转染HEK293T细胞系,泛素化实验表明TRIM31可明显促进TAK1 K48位的泛素化修饰。同时培养HK2细胞系,利用TRIM31小干扰RNA敲减TRIM31的表达,hTGF-β1刺激后,提取细胞蛋白,利用TAK1特异性抗体进行Co-IP,结果显示TRIM31同样可介导内源性TAK1蛋白的K48位的泛素化修饰。13.发现了TRIM31对TAK1进行泛素化修饰的具体位点为了进一步探索TRIM31对TAK1上哪个赖氨酸位点进行了泛素化修饰,我们通过查阅文献发现TAK1上第158位赖氨酸位点和第72位赖氨酸位点可能发生泛素化修饰,但调控这2个位点进行修饰的E3泛素连接酶却一直没有被发现。我们进一步构建了K158位和K72位赖氨酸突变的TAK1过表达质粒,分别与TRIM31过表达质粒和K48泛素过表达质粒共转染HEK293T细胞系,通过泛素化实验检测发现TRIM31可对TAK1第72位赖氨酸进行了K48位的泛素化修饰。14.利用体外蛋白拥译系统和体外泛素化系统验证了TRIM31对TAK1的泛素化修饰为了进一步探索TRIM31是否直接对TAK1进行泛素化修饰,我们将TAK1和TRIM31分别构建到含有T7启动子的PCDNA3.1-Myc过表达质粒上和含有T7启动子的PCDNA3.1-Flag过表达质粒上,然后利用Promega公司的TNT体外转录翻译系统对TAK1和TRIM31的表达质粒进行体外转录翻译,将翻译后的蛋白加入BostonBiochem公司的体外泛素化修饰系统,利用Western blot的方法进一步证明了TRM31对TAK1进行了K48位的泛素化修饰。同时构建只保留K72位赖氨酸残基（Myc-TAK1-K72）和只突变掉K72赖氨酸残基（Myc-TAK1-K72R）的TAK1的点突变过表达质粒,并进行体外转录翻译得到Myc-TAKl、Myc-TAK1-K72、Myc-TAK1-K72R、FIag-TRIM31的蛋白,然后加入体外泛素化修饰系统,同样发现TRIM31只对含有K72位赖氨酸残基的TAK1进行泛素化修饰。以上结果共同说明了TRIM31可直接对TAK1的第72位赖氨酸进行K48位的泛素化修饰。15.TAK1介导了TGF-β1信号通路的活化体外培养HK2细胞系以及小鼠原代肾小管上皮细胞MRPTEβ1C,利用TAK1的抑制剂5z7抑制TAK1的激酶活性或者利用Si-RNA敲减TAK1的表达后,hTGF-β1介导的Smad2、Smad3、ERK、JNK、P38、NF-kB磷酸化表达水平均明显下降。以上说明,在肾小管上皮细胞中,TAK1同时参与调控TGF-P1信号通路中经典Smad信号通路以及非Smad信号通路的活化。16.临床患者TAK1、炎症、纤维化和TGF-β1信号通路与HRD的相关性从山东大学病理学教研室获得行肿瘤切除术的无高血压患者的正常癌旁组织、无高血压的GML患者肾活检组织、HRD患者肾活检组织切片,并进行IHC检测。结果发现纤维化水平代表性指标Collagen Ⅰ、炎症水平代表性指标TNF-α、TGF-β1信号通路活化代表指标（TGF-β1、pSmad3、pP65）、以及TAK1的表达在HRD活检组织样本中明显增加。这些结果进一步提示我们,TAK1在HRD肾脏纤维化、炎症反应及疾病进展中可能发挥着重要作用。同时,伴随HRD疾病进展,TRIM31表达逐渐降低可能是导致TAK1表达升高及HRD疾病加重的重要原因。实验结论1.TRIM31参与了TGF-β1介导的肾脏纤维化和炎症反应;2.TRIM31通过靶向调控TAK1 K48位的泛素化修饰和蛋白酶体途径的降解进而负调控TGF-β1下游经典Smad信号通路以及非Smad信号通路的活化,最终改善高血压肾损害。
王恺悦[4]（2021）在《MiR-509-3p通过靶向YAP参与调控肾纤维化的作用及分子机制研究》文中提出目的:肾间质纤维化是各种慢性肾脏病进展至终末期,最终导致肾功能严重不全的共同病理过程,目前临床上缺乏完全阻断肾纤维化进程的有效治疗措施。肾间质纤维化的特征表现为肌成纤维细胞的增殖和细胞外基质（extracellular matrix,ECM）大量沉积,来源于由上皮-间充质转化或内皮-间充质转化产生的成纤维细胞的持续激活是纤维化进展中的重要生物学事件。最近研究表明,Yes相关蛋白（Yes-associated protein,YAP）及其下游因子在纤维化中异常活化,促进肌成纤维细胞增多,导致ECM过度沉积。因此,抑制YAP活性将是一种新的阻止肾纤维化发生的治疗策略。有研究表明miRNAs作为重要的转录后调控因子与多种肾脏病所致纤维化的发生相关。本研究通过生物信息学分析发现miR-509-3p在小鼠肾纤维化组织中表达下调,另有研究发现miR-509-3p以YAP作为靶点抑制卵巢癌中ECM的产生,推测miR-509-3p可能在肾纤维化中发挥作用。本研究拟采用肾纤维化动物模型和细胞学实验,通过过表达和抑制miR-509-3p,分析其与YAP及其下游基因在肾间质纤维化形成中作用关系,为改善肾脏纤维化提供新的临床治疗思路。研究方法1.利用GEO数据库分析小鼠纤维化肾脏中差异表达的miRNA,筛选出显着下调的miRNA。2.采用实时荧光定量PCR（qPCR）法检测miR-509-3p在健康人和患有慢性肾脏疾病CKD肾纤维化患者的血清中的表达水平。3.为了研究miR-509-3p在肾纤维化中的作用,建立大剂量叶酸（Folic acid,FA）诱导的小鼠肾纤维化模型。通过组织染色（PAS、Masson）和血清生化分析（肌酐、尿素氮）观察肾脏形态改变和评估肾脏滤过功能,确定肾慢性纤维化模型建立成功,并通过免疫组化法观察水通道蛋白1（Aquaporin1,AQP1）和水通道蛋白2（Aquaporin2,AQP2）的表达。4.采用qPCR法验证miR-509-3p在模型小鼠肾组织和血清中的表达情况。5.利用免疫组化、qPCR和蛋白印迹（Western blotting）法等定位和定量检测YAP在纤维化的小鼠和患者肾组织中的表达。6.构建肾纤维化细胞模型,通过qPCR检测miR-509-3p,qPCR和Western blotting法检测YAP的表达及纤维化指标:纤连蛋白（Fibronectin,Fn）、IV型胶原蛋白（Collagen IV,Col IV）、α-平滑肌肌动蛋白（α-Smooth muscle actin,α-SMA）。7.细胞模型中过表达和抑制miR-509-3p,检测YAP的表达变化,并检测Fibronectin、Collagen IV、α-SMA的含量,同时应用荧光素酶报告基因法确定miR-509-3p与YAP的结合位点。8.为了验证miR-509-3p通过调节YAP及其下游基因,对小鼠肾纤维化进程的调节作用,构建FA肾纤维化模型过表达miR-509-3p。给予FA肾病小鼠尾静脉注射经过化学合成的双链miRNA（agomir）。采用Western blotting和qPCR及免疫组化染色检测YAP的表达及其对下游靶基因CTGF（结缔组织生长因子,Connective tissue growth factor）和CYR61（富含半胱氨酸蛋白61,Cysteinerich61）的转录调节作用。9.采用组织染色（PAS、Masson、免疫组化法）、qPCR、Western blotting等方法分析过表达miR-509-3p小鼠肾脏病理改变,检测纤维化相关蛋白α-SMA、Collagen IV和Fibronectin,钙粘蛋白（E-Cadherin）和波形蛋白（Vimentin）的表达变化,同时血清生化检测评估肾功能。结果1.根据GEO数据库筛选差异基因,显示miR-509-3p在小鼠肾纤维化组织中显着下调。在肾纤维化患者血清标本中miR-509-3p表达降低,其表达量与患者肾小球滤过率,肌酐密切相关。2.小鼠FA肾病造模后14天,肾体积缩小,肾组织变薄,肾小管萎缩,肾间质大量炎性细胞浸润和胶原纤维增多;血清肌酐、尿素氮明显上调;AQP1和AQP2在损伤严重区域肾小管表达降低。3.MiR-509-3p在FA肾病小鼠肾组织和血清中低表达。同时,YAP在FA小鼠肾组织中表达上调,且YAP细胞核阳性细胞数增加。在人纤维化肾组织中YAP细胞核阳性细胞数也明显增加。4.在肾纤维化细胞模型中,miR-509-3p低表达且与YAP呈负相关。过表达miR-509-3p可以下调YAP表达水平,抑制纤维化相关蛋白α-SMA、Fibronectin、Collagen IV等的表达。5.荧光素酶报告基因显示miR-509-3p结合于YAP基因的3’-UTR区域。6.FA小鼠过表达miR-509-3p后,YAP及其下游因子CTGF、CYR61表达降低;病理学PAS、Masson染色观察到各组小鼠肾小管损伤减轻,肾间质胶原纤维减少;同时血清生化检测肾功能有所恢复;纤维化相关蛋白α-SMA,Collagen IV,Fibronectin的表达减少。E-Cadherin蛋白表达水平升高,Vimentin蛋白表达水平降低。结论:Mi R-509-3p在人和小鼠肾纤维化组织中显着低表达且与YAP呈负相关,过表达miR-509-3p抑制YAP表达的同时改善叶酸肾病模型的肾间质纤维化和肾功能,提示miR-509-3p通过调节YAP减缓肾纤维化进程,从而保护肾功能。
李燕[5]（2020）在《IRF-1通过抑制Klotho促进肾间质纤维化的机制研究》文中研究表明研究背景:肾间质纤维化是慢性肾脏病（CKD）的主要病理改变,其一旦发生将持续进展,最终导致终末期肾病（ESRD）的发生。但截至目前,肾间质纤维化的发生、发展机制仍未完全阐明,抗肾纤维化的治疗策略始终未能达到良好预期。因此,深入探讨肾间质纤维化的发生机理并寻找有效的干预措施具有极其重要的临床意义。炎症是肾纤维化发生和发展的一个重要始动因素。干扰素调节因子-1（Interferon regulator factor 1,IRF-1）是IRFs家族的主要成员,在多种成体细胞中均有表达,作为转录因子调控一系列靶基因转录,参与炎症损伤、免疫反应、肿瘤免疫监视及病毒感染等多种生理和病理过程。众所周知,免疫异常和炎症是许多肾脏疾病的关键致病机制。近年来,有研究发现ROS通过诱导IRF-1在受损的肾小管上皮细胞表达,进而导致促炎基因上调,以此加重缺血性急性肾损伤。在新生大鼠UUO模型中,IRF-1在梗阻侧肾脏的表达显着增加。值得关注的是,近期研究发现IRF-1和Klotho以反向作用参与了肾脏钙磷代谢的生理过程。在Janus激酶3（JAK3）敲除小鼠的肾脏中,Cyp27b1的转录水平显着升高,导致1,25（OH）2D3的产生增多,并发现这与JAK3敲除后肾脏IRF-1表达增加和Klotho表达下调有关。研究证实,肾脏IRF-1表达增加促进了Cyp27b1的表达和1,25（OH）2D3的产生,而Klotho则下调了Cyp27b1的表达,降低了1,25（OH）2D3合成。IRF-1的上调以及Klotho的减少提示IRF-1和Klotho之间可能存在负调控关系。Klotho主要在肾小管上皮细胞中高度表达,包括膜型和分泌型两种类型的编码蛋白,而膜Klotho蛋白的胞外段剪切后及分泌型Klotho蛋白可以进入血循环,被称为可溶性Klotho蛋白,可对多个器官和细胞发挥保护作用。近年来,Klotho被证实为重要的抑制肾纤维化的因子,可以显着抑制TGF-β、Wnt/β-catenin信号通路和RAS系统活化,从而改善单侧输尿管梗阻（UUO）或阿霉素肾病（ADR）模型的肾间质纤维化。我们既往也证实Klotho可以通过与FGF2竞争结合FGFR受体抑制FGF2信号通路活化,减轻肾小管上皮细胞转分化和成纤维细胞增殖与活化,进而改善肾间质纤维化。同时,研究发现,在CKD及肾间质纤维化发生时Klotho在肾脏的表达水平显着降低。因此,Klotho表达下降是肾间质纤维化发生、发展的重要环节。但迄今为止,人们并未阐明CKD时Klotho表达为什么会显着降低,而明确CKD时导致Klotho表达下调的关键分子机制可能是探寻肾间质纤维化有效干预措施的重要突破口。据此,我们推测,在CKD时IRF-1可能通过抑制Klotho表达,诱导肾小管上皮细胞分泌致纤维化因子,最终导致肾间质纤维化的发生和发展。为验证以上推论,本课题首先观察了CKD患者、单侧输尿管梗阻（Unilateral Ureteral Obstruction,UUO）和阿霉素肾病（Adriamycin nephropathy,ADR）模型小鼠肾小管上皮细胞IRF-1的表达变化,以及其与肾纤维化程度之间的相关性;随后利用体外研究,在体外培养人肾小管上皮细胞（HK-2）、人胚胎肾细胞293（HEK293）中研究IRF-1对肾小管上皮细胞纤维化标志物表达的影响,探讨其作用是否与调控Klotho表达有关,并阐明上、下游分子机制;最后利用IRF-1基因敲除(IRF-1-/-)小鼠和C57BL/6J小鼠分别制备UUO模型,C57BL/6J小鼠制备的UUO模型给予尾静脉注射抗TNF-α中和抗体,明确敲除或抑制IRF-1通过调控Klotho改善肾间质纤维化的作用。方法和结果:第一部分:IRF-1与肾间质纤维化的相关性研究1.CKD患者肾活检标本中IRF-1表达增加,与肾间质纤维化程度呈显着正相关:我校第二附属医院肾内科生物标本库选取肾活检标本中无明显肾脏病理改变的肾活检标本和有肾纤维化病变的CKD患者标本,分别进行Masson染色和IRF-1免疫组织化学染色,分析肾间质纤维化程度和IRF-1表达水平。结果显示,与正常肾组织相比,在CKD患者纤维化肾组织中,IRF-1在肾小管上皮细胞的表达显着增加,IRF-1的表达水平与肾间质纤维化面积呈显着正相关,而与eGFR值呈显着负相关。这些结果表明CKD患者肾组织中IRF-1的表达可能与肾间质纤维化的严重程度密切相关。2.UUO模型和阿霉素肾病（ADR）模型小鼠肾小管上皮细胞IRF-1的表达增加:野生型雄性C57BL/6小鼠32只,10-12周龄,分别制备UUO模型和ADR模型,造模后14天处死各实验组小鼠,肾脏取材。通过HE（Hematoxylin-eosin）、Masson、免疫组化染色和蛋白质免疫印迹法（Western blot,WB）检测肾脏损伤、肾纤维化程度和IRF-1表达情况。结果发现,UUO和ADR模型小鼠肾脏出现显着损伤和纤维化,并且肾近曲小管上皮细胞IRF-1表达显着增加。因此,在两种肾纤维动物模型中我们再次发现IRF-1可能与肾间质纤维化密切相关。3.IRF-1过表达显着促进肾小管上皮细胞纤维化标志物的表达:构建人IRF-1质粒并转染体外培养人肾小管上皮细胞（HK-2）和大鼠肾小管上皮细胞（NRK52E）,利用Western blot检测IRF-1、α-SMA和fibronectin的表达变化。结果发现,正常情况下,HK-2细胞和NRK52E细胞中IRF-1仅有微弱的表达;而IRF-1质粒转染导致细胞过表达IRF-1后,可以显着诱导纤维化标志物α-SMA和fibronectin的表达上调。以上结果表明,IRF-1过表达能够显着促进肾小管上皮细胞纤维化标志物的表达。第二部分:IRF-1通过调控Klotho促进肾小管上皮细胞纤维化标志物表达的作用和机制研究1.CKD患者和UUO小鼠模型肾组织中Klotho表达降低,与IRF-1表达呈负相关:第一部分生物标本库中已选取的无明显肾脏病理改变的肾活检标本和有肾纤维化病变的CKD患者肾活检标本进行免疫组织化学染色,检测Klotho表达水平。结果显示,与正常肾组织相比,在CKD患者的纤维化肾组织中,肾小管上皮细胞Klotho表达显着减少,并与IRF-1表达呈显着负相关,这说明CKD患者肾组织中IRF-1表达升高可能与Klotho表达降低有着密切关联。野生型雄性C57BL/6小鼠32只,10-12周龄,UUO建模。建模后3天、7天和14天肾脏取材。利用Western blot、Real-time PCR和免疫荧光双染,检测IRF-1和Klotho在小鼠肾组织中的表达,及IRF-1和Klotho在肾小管上皮细胞的共定位情况。结果表明,在UUO模型组,梗阻侧肾小管上皮细胞IRF-1的表达增加伴随着Klotho的表达下调。以上结果表明,肾间质纤维化时IRF-1的高表达伴随着Klotho表达的显着降低,两者之间的是否存在调控关系值得深入探讨。2.IRF-1通过下调Klotho促进HK-2细胞纤维化标志物表达:IRF-1质粒转染至HK-2细胞,Western blot检测Klotho的表达变化,结果发现IRF-1过表达以剂量依赖性的方式抑制Klotho的表达。如果同时转染IRF-1和Klotho质粒,利用Western blot检测纤维化标志物α-SMA和fibronectin的表达变化,则发现Klotho过表达明显逆转了IRF-1质粒转染诱导的α-SMA和fibronectin表达,提示IRF-1通过抑制Klotho促进了肾小管上皮细胞纤维化标志物的表达。3.IRF-1抑制Klotho基因转录体外培养人胚肾细胞（HEK293）,Western blot检测IRF-1的表达情况,结果表明,正常情况下,HEK293细胞中IRF-1仅有微弱的表达;而同时转染IRF-1质粒和Klotho启动子荧光素酶报告质粒（Klotho promoter reporter）,利用双萤光素酶报告基因试剂盒检测Klotho启动子荧光素酶活性的变化,发现IRF-1过表达以剂量依赖性的方式抑制Klotho（KL）启动子驱动的荧光素酶活性。利用JASPAR数据库预测出转录因子IRF-1在人Klotho启动子（包括Klotho转录起始位点上游4000bp）上存在13个潜在结合位点,分别设计引物,染色质免疫共沉淀法（ChIP）明确IRF-1是否直接结合到Klotho启动子区。结果发现,PCR产物均无明显阳性条带表达。提示IRF-1可以抑制Klotho基因转录,但并非直接与Klotho启动子区结合来调控其转录。4.IRF-1通过干扰C/EBP-β的活化下调HK-2细胞Klotho的表达为了探讨IRF-1抑制Klotho转录的机制,我们利用三个生物信息学数据库（PROMO、Genecards和JASPAR）分析人Klotho基因启动子,预测出可能与Klotho启动子区域结合（相对分数在80分以上）的11个转录因子,其中9个转录因子被报道参与了肾纤维化。为了明确介导IRF-1调控Klotho的转录因子,IRF-1质粒转染HK-2细胞后,Real-time PCR检测9个转录因子,即C/EBP-β、PPAR-γ、p53、SP1、YY1、USF2、C/EBP-α、GATA3和ATF3mRNA的表达变化。结果发现,IRF-1过表达显着抑制HK-2细胞中C/EBP-βmRNA表达水平（降低到三分之一）。Western blot检测发现IRF-1过表达以剂量依赖性的方式抑制C/EBP-β的蛋白表达。如果同时转染IRF-1和C/EBP-β质粒,利用Western blot检测Klotho、纤维化标志物α-SMA和fibronectin的表达变化,则发现C/EBP-β过表达明显逆转了IRF-1质粒转染诱导的Klotho表达下调及α-SMA和fibronectin的表达增高。此结果提示,IRF-1通过干扰C/EBP-β活化下调了Klotho的表达,进而促进肾小管上皮细胞纤维化标志物的表达。5.C/EBP-β通过直接结合到Klotho启动子区域调控其转录构建一系列Klotho启动子荧光素酶报告质粒截短体KL5（-2000bp～+100bp）、KL4（-1705bp～+100bp）、KL3（-1530bp～+100bp）、KL2（-1220bp～+100bp）和KL1（-1000bp～+100bp）,分别与C/EBP-β质粒共转染到HEK293细胞。利用双荧光素酶报告基因试剂盒检测Klotho启动子截短体荧光素酶活性的变化。结果发现,C/EBP-β过表达显着增强KL5、KL4、KL3和KL2驱动的荧光素酶活性,而对KL1和PGL3-Basic驱动的荧光素酶活性无影响。对Klotho启动子（KL2）中的第二个C/EBP-β结合位点进行了位点特异性突变,利用双荧光素酶报告基因试剂盒检测发现,C/EBP-β过表达对突变的KL2截短体驱动的荧光素酶活性没有影响。C/EBP-β质粒转染至HK-2细胞,染色质免疫沉淀（Ch IP）检测证实C/EBP-β可以直接结合到Klotho启动子中第2个C/EBP-β潜在结合位点的优势区域。以上结果表明,C/EBP-β能够直接结合到Klotho启动子区（-1039～-1029）调控其转录。6.TNF-α诱导HK-2细胞IRF-1表达升高TNF-α孵育HK-2细胞,Western blot检测IRF-1、C/EBP-β、Klotho、α-SMA和fibronectin的表达变化,结果发现TNF-α以剂量依赖性的方式诱导IRF-1、α-SMA和fibronectin的表达,同时伴随着C/EBP-β和Klotho的表达下调。IRF-1 siRNA转染至HK-2细胞后再加入TNF-α处理,Western blot检测Klotho、α-SMA和fibronectin的表达变化,结果发现,siRNA干扰IRF-1明显逆转了TNF-α对Klotho、α-SMA和fibronectin表达的影响,提示TNF-α通过诱导IRF-1下调Klotho,促进肾小管上皮细胞纤维化标志物表达。同样,C/EBP-β质粒转染HK-2细胞后用TNF-α处理细胞,Western blot检测Klotho、α-SMA和fibronectin的表达变化,发现C/EBP-β过表达也显着逆转了TNF-α诱导的Klotho表达减少,以及α-SMA和fibronectin的表达增加。这些结果提示,TNF-α可以诱导IRF-1表达升高,随之通过抑制C/EBP-β的活化来下调Klotho的表达,并可能因此促进了肾纤维化。第三部分:敲除或抑制IRF-1显着改善肾间质纤维化1.IRF-1基因敲除(IRF-1-/-)小鼠制备的UUO模型肾纤维化明显减轻IRF-1-/-小鼠和野生型（WT）小鼠各16只,10～12周龄,分别随机选取8只制备UUO模型,造模14天后处死各组小鼠,肾脏取材。利用HE、Masson染色评估肾脏损伤和肾纤维化程度,结果发现,IRF-1-/-小鼠梗阻侧肾脏损伤和肾纤维化程度较WT小鼠明显减轻;通过Western blot和免疫染色检测小鼠肾组织中α-SMA和fibronectin的表达变化,发现与WT小鼠相比,IRF-1-/-小鼠梗阻侧肾组织中α-SMA和fibronectin的表达明显减少。这说明敲除IRF-1可以明显减轻UUO模型小鼠肾纤维化。利用Real-time PCR检测炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达变化,发现与WT小鼠相比,IRF-1-/-小鼠梗阻侧肾组织中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达明显减少,提示敲除IRF-1可以明显减轻UUO模型小鼠肾组织的炎症反应。为进一步验证IRF-1的作用机制,Real-time PCR、Western blot和免疫染色检测C/EBP-β和Klotho的表达变化,结果表明,与WT小鼠相比,IRF-1基因敲除可以部分逆转UUO模型小鼠梗阻侧肾组织和肾小管上皮细胞C/EBP-β及Klotho的表达下调。以上结果提示,敲除IRF-1可以明显减轻C/EBP-β和Klotho的表达下调,改善肾间质纤维化;而UUO造成的IRF-1表达升高,及随之而来的C/EBP-β和Klotho表达下调可能是肾间质纤维化发生和发展的重要机制之一。2.UUO模型小鼠尾静脉注射抗TNF-α中和抗体显着抑制Klotho表达下调和肾间质纤维化雄性C57BL/6小鼠32只,10-12周龄,随机选取16只小鼠建立UUO模型,在假手术组和UUO模型组中分别选取8只小鼠尾静脉注射抗TNF-α中和抗体,其余8只小鼠注射等体积的PBS溶液。术后14天处死各组小鼠并肾脏取材。HE、Masson染色评估肾脏损伤和肾纤维化程度,结果发现给予抗TNF-α中和抗体注射的小鼠梗阻侧肾脏损伤和纤维化程度较PBS注射小鼠明显减轻。利用Western blot和免疫荧光双标染色检测肾组织中IRF-1、Klotho、α-SMA和fibronectin的表达,以及IRF-1和Klotho在肾小管上皮细胞的表达情况,结果发现,与注射PBS溶液的小鼠相比,注射抗TNF-α中和抗体显着抑制了UUO模型小鼠梗阻侧肾组织及肾小管上皮细胞中IRF-1的表达升高和Klotho的表达降低。以上结果提示,抗TNF-α中和抗体可通过抑制IRF-1改善肾间质纤维化。结论:CKD患者肾活检标本,UUO模型和ADR模型小鼠肾组织和肾小管上皮细胞中IRF-1表达显着增加,并与肾纤维化程度呈显着正相关;IRF-1过表达显着降低了肾纤维化抑制因子Klotho的表达,并促进肾小管上皮细胞纤维化标志物的表达,其作用与下调Klotho转录的调控因子C/EBP-β的表达有关;进一步研究表明,TNF-α是诱导UUO时肾小管上皮细胞IRF-1高表达的主要原因;而敲除或利用抗TNF-α中和抗体抑制IRF-1则可以显着改善肾间质纤维化。因此,炎症因子诱导的IRF-1表达上调,以及随之导致的肾小管上皮细胞Klotho缺乏可能是肾纤维化发生和发展的重要机制之一,而炎症与IRF-1/Klotho之间的相互影响也会不断促进肾纤维化的持续进展。
秦田雨[6]（2020）在《肾康注射液对慢性肾脏病和肾纤维化的作用及机制研究》文中认为[目的]从整体动物、细胞和分子水平,结合系统药理学靶点预测,研究中药复方肾康注射液（Shenkang,SK）对慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）和肾纤维化的保护作用和机制,为SK对CKD及肾纤维化的临床治疗提供更多的数据支持及科学依据。[方法]1.系统药理学:首先通过数据挖掘和文献查阅构建SK分子数据库,并通过药物相似性和药物半衰期评估来筛选活性分子;使用WES药物靶向模型来预测生物活性成分的直接药物靶向;使用Cytoscape 3.2软件构建复合物-靶标,靶标-通路和靶标-疾病网络,并根据BioGPS数据库确定靶标在组织和器官中的分布。2.整体动物:C57BL/6小鼠36只,采用随机对照设计法将小鼠按体重随机分为:假手术组,模型组,阳性药（ARB）组,SK高剂量组,SK中剂量组,SK低剂量组（n=6）。对模型组、ARB组、SK各剂量组小鼠实施UUO手术,制备肾纤维化模型,假手术组分离左输尿管但不结扎输尿管。术后第一天开始给药,共计14天。假手术组和模型组:尾静脉注射生理盐水0.13 mL/10 g,灌胃生理盐水0.15 mL/10 g,ARB组:尾静脉注射生理盐水0.13 mL/10g,灌胃氯沙坦钾溶液0.15 mL（生药0.13 g）/10 g,SK高剂量组:尾静脉注射SK 0.13 mL（生药0.08 g）/10 g,灌胃生理盐水0.15 mL/10 g,SK中剂量组:尾静脉注射SK 0.13 mL（生药0.04 g）/10 g,灌胃生理盐水0.15 mL/10 g,SK低剂量组:尾静脉注射SK 0.13 mL（生药0.02 g）/10 g,灌胃生理盐水0.15 mL/10 g,实验过程中观察记录小鼠体重等一般情况,给药第13天行MRI扫描测定FA值明确活体肾纤维化程度,给药14天后摘眼球取血,称量肾脏重量,分别冻存固定肾脏。比色法测定血肌酐、血尿素氮、血CysC水平,行HE和天狼星红染色观察患侧肾脏病理形态学和纤维化程度,透射电镜观察超微结构情况,Western Blot检测各组小鼠肾脏肌成纤维细胞标志物α-SMA,ECM成分Col Ⅰ,JAK2/STAT3通路分子蛋白磷酸化水平,Real-time PCR检测假手术组、UUO组和SK中剂量组肾脏肌成纤维细胞标志物α-SMA,FSP-1、ECM成分(Col Ⅲ,JAK2、STAT3、TGF-β1和负调节分子SOCS1,SOCS3 mRNA水平。3.细胞:NRK-49F细胞进行复苏传代培养,以10 ng/mL 的TGF-β1刺激48 h诱导NRK-49F细胞增殖活化,不同浓度SK（0,1,2,4mg/mL）干预后,观察细胞形态、Western Blot检测NRK-49F细胞成纤维细胞标志物α-SMA,ECM成分Col Ⅲ,JAK2/STAT3通路分子蛋白磷酸化水平和负调节分子Prdx5的表达,Real-time PCR检测NRK-49F细胞肌成纤维细胞标志物α-SMA,JAK2、STAT3 mRNA 水平。[结果]1.系统药理学部分:以DL≥0.6为筛选标准,“HL=long”用于定义适当的HL范围。最终选出88种化合物作为活性分子。利用WES算法和CTD、TTD筛选结果,确定了 85个与治疗CKD相关的潜在化合物作用靶点,包括STAT3。通过KEGG数据库映射获得关键通路,包括NF-κB、MAPK、TRP离子通道和VEGF通路,结合CKD病理机制的相关进展,构建了 CKD治疗模块的通路,包括炎症、增殖、分化、迁移、通透性、降解等模块。对靶标-疾病相互作用网络的深入分析表明,SK治疗CKD主要通过影响6种疾病发挥作用:泌尿生殖系统疾病、代谢性疾病、内分泌疾病、心血管疾病,病理过程和免疫疾病。组织定位结果显示SK通过包括肾脏、肝脏、肺和心脏在内的组织模块发挥作用。2.整体动物部分:（1）肾功能检测:与假手术组比较,UUO组小鼠肾脏血CREA、BUN、Cys-C水平显着性升高（p<0.01）;与UUO组相比,ARB和高剂量SK组小鼠血CREA水平显着降低（p<0.01）;与UUO组相比,ARB和SK各剂量组小鼠血BUN水平显着降低（p<0.05或p<0.01）;与UUO组相比,SK高剂量组小鼠血Cys-C水平显着降低（p<0.05）。（2）肾脏重量和病理检测:与假手术组相比,UUO模型组的患侧肾质量/体重、患侧肾/对侧肾质量、对侧肾质量/体重均显着增加（p<0.05或p<0.01）。但各药物治疗后对UUO小鼠肾脏重量各指标没有产生影响。与假手术组比较,UUO组小鼠肾脏FA值显着性升高（p<0.01）;与UUO组相比,ARB阳性药组、SK高中低剂量组FA值显着降低（p<0.01或p<0.001）,其中以SK中剂量组最为显着（p<0.001）。与假手术组比较,UUO组小鼠肾脏病理损伤明显;与UUO组比较,各治疗组肾脏损伤情况均有不同程度缓解,细胞外基质积聚、炎性细胞浸润、肾小管扩张和/或萎缩减轻,以SK中剂量组和高剂量组较好。与假手术组比较,UUO组小鼠天狼星红面积极显着增加（p<0.001）;与UUO组比较,ARB组、SK高、中、低剂量组小鼠患侧肾脏天狼星红染色红色面积显着减少（p<0.05或p<0.01）。电镜下观察各浓度SK对UUO所致的细胞器丰富的成纤维细胞增多,间质局灶胶原纤维增生和肾小管凋亡均有一定的改善作用。（3）Western blot检测:与假手术组相比,UUO组α-SMA蛋白水平显着增加（p<0.01）,与UUO比较,SK中剂量组和低剂量组显着下调了 UUO状态下的α-SMA蛋白水平升高（p<0.05）;与假手术组相比,UUO组Col Ⅰ蛋白水平显着增加（p<0.01）,与UUO 比较,SK中剂量组显着下调了 Col Ⅰ蛋白水平升高（p<0.05）;与假手术组相比,UUO组p-STAT3（Try705位点）/STAT3比例显着增加（p<0.01）,与UUO比较,SK中（p<0.01）、低剂量（p<0.001）组显着下调了 Try705位点的STAT3磷酸化程度;与假手术组相比,UUO组p-JAK2（Try1007位点）/JAK2比例有上升趋势,但无统计学差异,与UUO 比较,SK高剂量组显着下调了 Try1007位点的JAK2磷酸化程度（p<0.05）,（4）PCR检测:与假手术组相比,UUO组小鼠患侧ECM成分Col Ⅰ、Col Ⅲ、FN,成纤维细胞活化标志物α-SMA、FSP-1,以及 JAK2、STAT3、TGF-β、JAK2/STAT3 通路负调节因子SOCS1、SOCS3 mRNA水平显着上升（p<0.05或p<0.01或p<0.001）;与UUO组相比,SK中剂量组显着降低了 Col Ⅰ、ColⅢ、FN,α-SMA、FSP-1,JAK2、TGF-β、SOCS1、SOCS3 mRNA 水平（p<0.05 或p<0.01）。3.细胞实验:TGF-β1诱导后,NRK-49F细胞的细胞骨架显示出内部微丝束,并逐渐增厚和伸长,丧失纺锤形或星形成纤维细胞外观。不同浓度的SK一定程度上逆转了TGF-β1诱导的形态变化和增殖。与空白对照组比较,模型对照组成纤维细胞p-STAT3（Try705位点）/STAT3、Prdx5蛋白水平显着性升高（p<0.05）,p-JAK2（Try1007位点）/JAK2有一定程度升高但未达统计学意义（p>0.05）;与模型对照组相比,4 mg/mL SK组和2 mg/mL SK组细胞的STAT3蛋白Try705位点的磷酸化水平显着降低（p<0.05）,1 mg/mL SK组和2 mg/mL SK组细胞的JAK2蛋白Try1007位点的磷酸化水平显着降低（p<0.05）,4 mg/mL SK组细胞的Prdx5蛋白表达水平显着降低（p<0.05）。与空白对照组比较,模型对照组成纤维细胞α-SMA、JAK2、STAT3 mRNA水平显着升高（p<0.05或p<0.001）;与模型对照组相比,ARB及不同浓度SK均极显着地降低了α-SMA mRNA 水平（p<0.001）,与模型对照组相比,ARB、1mg/mL、2 mg/mL SK（p<0.05）及 4 mg/mL SK（p<0.01）显着降低了 STAT3 mRNA 水平,与模型对照组相比,ARB及4 mg/mL SK显着降低了 JAK2 mRNA水平（p<0.05）。[结论]（1）系统药理学预测显示SK中多种化合物可能通过作用于与炎症、凋亡、增殖等相关的NF-κB、MAPK、TRP离子通道和VEGF等多通路的靶点分子治疗CKD。（2）SK有效改善UUO小鼠肾功能指标和肾间质纤维化,其机制可能是通过调节JAK2/STAT3信号通路抑制成纤维细胞活化实现的,验证了系统药理学结果。（3）SK还能够抑制TGF-β1诱导NRK-49F增殖活化以及ECM产生,其作用机制可能是通过抑制JAK2/STAT3通路的激活介导的。
安春妹[7]（2020）在《胃泌酸调节素（OXM）类似物改善慢性肾病肾脏纤维化的作用研究》文中提出研究背景和目的:肾纤维化（Renal fibrosis）是多种慢性肾病（Chronic kidney disease,CKD）进展至后期最主要的病理特征,但是目前还没有能够有效治疗或者逆转肾脏纤维化的药物,因此,寻找能够有效防治肾纤维化的药物和方法具有重要的临床意义。胃泌酸调节素（Oxyntomodulin,OXM）作为一种肽类激素,可以同时激活胰高血糖素样肽-1受体（Glucagon like peptide-1 receptors,GLP1R）和胰高血糖素受体（Glucagon receptors,GCGR）两个受体,具有降低血糖和减轻体重等作用。研究发现OXM减肥和调控血糖作用优于单靶点GLP1R激动剂,激活GCGR可避免单个受体激动剂引起的低血糖风险,增加了药物应用的安全性和依存性。目前,OXM对于肾脏是否具有潜在的保护作用还没有相关报道,课题以此为创新点,期望为肾脏纤维化的治疗提供新策略。然而,内源性OXM由于其多肽的本质容易被机体产生的酶降解,因此,我们通过对OXM进行结构修饰后设计合成了6个长效OXM类似物（OA1-OA6）,进行体外和体内实验研究其对肾纤维化的作用并筛选优势多肽化合物。方法:（1）体外实验:高糖培养肾小球系膜细胞（Mesangial cells,MCs）和肾小管上皮细胞（Tubular epithelial cells,TECs）,模拟体外促纤维化环境,通过MTT、Western Blot和ELISA方法检测OXM类似物对高糖诱导细胞增殖和细胞内外纤维化相关因子表达的影响。（2）链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）诱导糖尿病肾病小鼠模型:腹腔注射STZ柠檬酸溶液诱导构建糖尿病小鼠模型,通过生化指标的测定、病理切片染色、免疫组化和RT-PCR方法判定OXM类似物对糖尿病肾病小鼠肾脏功能和纤维化程度以及肾组织中纤维化相关因子表达的影响。（3）单侧输尿管梗阻（Unilateral ureteral obstruction,UUO）肾间质纤维化小鼠模型:手术结扎小鼠左侧输尿管构建肾间质纤维化小鼠模型,通过生化指标的测定和病理切片染色方法判定OXM类似物对UUO小鼠肾脏功能和纤维化程度的影响。结果:（1）体外实验结果显示,OXM类似物OA2可以抑制高糖刺激引起的MCs和TECs过度增殖,减少细胞内外纤维化相关因子的表达,在细胞水平对肾纤维化的抑制作用优于OA1和OA3-OA6。（2）在STZ诱导糖尿病肾病小鼠模型实验中,OA2能够改善糖尿病肾病小鼠肾脏功能,下调肾组织纤维化相关因子的表达,减轻肾脏纤维化程度,抑制肾纤维化作用优于OA1、OA3-OA6和利拉鲁肽。（3）在UUO肾间质纤维化小鼠模型实验中,OA2能够改善UUO小鼠肾脏功能,减少小鼠肾组织中胶原沉积,但并不能改善输尿管梗阻后引起的肾间质损伤。结论:在研究的6个OXM类似物中,筛选出多肽化合物OA2在细胞水平能够有效抑制高糖诱导MCs和TECs增殖以及纤维化相关因子的表达,在动物实验中具有改善STZ诱导糖尿病肾病小鼠肾纤维化,保护肾脏的作用,可以进一步的深入研究。本课题为多肽化合物OXM类似物的研究和应用提供新的思路,为肾纤维化治疗提供新的靶点和策略。
朱自强[8]（2020）在《多肽AcSDKP减少马兜铃酸诱导的小鼠肾小管间质纤维化》文中指出研究目的目前,临床上各种原发性或继发性肾脏疾病进展至终末期肾病（end stage renal disease,ESRD）后还无法进行人为逆转。肾小管间质纤维化是ESRD进展的决定性因素之一。本研究主要探讨,在马兜铃酸诱导肾脏纤维化之后,氨基端乙酰化丝氨酰-门冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸多肽（N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline,AcSDKP）能否减少已经形成的肾小管间质纤维化,及其主要机制。研究方法第一部分:本研究首先建立小鼠马兜铃酸肾病肾小管间质纤维化自身对照实验模型。C57BL/6小鼠在接受单次肾切除术后,给予5天5mg/kg/day的马兜铃酸（aristolochic acid,AA）腹腔注射。通过深度测序检测马兜铃酸（AA）组和自身对照组肾脏标本中mi RNA和m RNA的全基因组表达谱的变化。部分显着差异表达mi RNA（Defferently expressed mi RNA,DE mi RNA）和m RNA（Defferent expressed m RNA,DE m RNA）经实时RT-PCR验证。利用Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）软件对差异表达DE m RNA的细胞功能和富集信号通路进行分析。第二部分:建立马兜铃酸急性肾病小鼠模型。AA组与AA+AcSDKP组C57BL/6小鼠腹腔注射马兜铃酸（AA）（10 mg/kg/day）5天后,对照组同期腹腔注射生理盐水。第6天,AA+AcSDKP组多肽AcSDKP腹腔注射15天,AA组与对照组同期进行生理盐水腹腔注射。HE染色法和马松（Masson）染色法分别检测肾脏组织损伤与纤维化的改变。对小鼠的血清肌酐、血尿素（Blood Urea Nitrogen,BUN）与尿微量白蛋白进行生化检测。实时荧光RT-PCR检测小鼠肾脏促纤维化因子的基因Serpine1（plasminogen activator inhibitor-1（PAI-1）蛋白的基因）、extracellular matrix degradation inhibitory factor-1（TIMP-1）、extracellular matrix degradation inhibitory factor-3（TIMP-3）、interleukin-11（IL-11）与transforming growth factor beta 1（TGFβ1）的m RNA水平变化。Western blot检测小鼠肾脏以及小鼠肾脏原代成纤维细胞体外培养的细胞与细胞培养上清中的PAI-1蛋白水平。免疫组化检测肌成纤维细胞标志物Alpha-smooth muscle actin（α-SMA）蛋白以及免疫细胞标志物inducible nitric oxide synthase（i NOS）（巨噬细胞/单核细胞标志物）、Leukocyte differentiation antigen 4（CD4）（T Helper淋巴细胞标志物）与Leukocyte differentiation antigen 8（CD8）（细胞毒性T淋巴细胞标志物）。免疫荧光法分别检测凋亡相关蛋白Fas、Bax以及bcl-2与肌成纤维细胞标志物α-SMA在小鼠肾脏中共表达的变化。第三部分:建立马兜铃酸慢性肾病小鼠模型。AA组与AA+Ac SDK组的C57BL/6小鼠腹腔注射马兜铃酸（5 mg/kg/day）4星期,对照组腹腔注射生理盐水。休息16周后,AA+AcSDKP组给予多肽AcSDKP腹腔注射4星期,AA组与对照组同期给予生理盐水腹腔注射。HE染色法和马松（Masson）染色法检测肾脏组织病理学与纤维化的改变。小鼠的血清肌酐与尿素以及与尿微量白蛋白进行生化检测。实时荧光RT-PCR检测小鼠肾脏促纤维化因基因Serpine1（PAI-1蛋白基因）、TIMP-1、TIMP-3、IL-11与TGFβ1的m RNA表达水平变化。Western blot检测小鼠肾脏的PAI-1蛋白水平。免疫组化检测肌成纤维细胞标志物α-SMA蛋白以及免疫细胞标志物i NOS（巨噬细胞/单核细胞标志物）、CD4（T Helper淋巴细胞标志物）与CD8（细胞毒性T淋巴细胞标志物）。免疫荧光法分别检测凋亡相关蛋白Fas、Bax以及bcl-2与肌成纤维细胞标志物α-SMA在小鼠肾脏中共表达的变化。结果第一部分:马兜铃酸诱导的小鼠肾小管间质纤维化模型中肾脏mi RNA与m RNA表达谱的改变HE染色法和马松（Masson）染色法结果显示马兜铃酸诱导小鼠肾脏组织损伤和肾小管间质纤维化。AA治疗组和自身对照组mi RNA与m RNA的全基因组表达谱发生显着改变,分别有82个显着差异表达的DE mi RNA和4605个显着差异表达的DE m RNA,部分经实时荧光RT-PCR验证。其中,促纤维化的mi R-21家族、mi R-433家族和mi R-132家族显着升高;而抗纤维化的mi R-122-5p和let-7a-1-3p明显降低。本研究使用GO与KEGG软件分析细胞功能和DE m RNA富集的通路。本研究还分析发现了767对反向调控的DE mi RNA与其DE m RNA靶点,并构建上述DE m RNA靶点富集的KEGG信号通路相关的DE mi RNA-DE m RNA反向调控网络。此外,差异表达的DE m RNA分析提示TIMP-1与PAI-1可能是细胞外基质降解的关键抑制因子,为后续研究提供了一部分新的思路与研究对象。第二部分:多肽AcSDKP减少小鼠马兜铃酸急性肾病中已经形成的肾小管间质纤维化。在急性马兜铃酸肾病模型中,多肽AcSDKP能够显着减少经已经形成的肾小管间质纤维化、肾小管病变与肾功能受损。与对照组相比较,AA组中小鼠肾脏中细胞外基质降解的抑制因子TIMP-1与PAI-1以及促纤维化因子TGFβ1与IL-11的m RNA水平显着上调,PAI-1蛋白水平显着上调;肌成纤维细胞（α-SMA+）、巨噬/单核细胞（i NOS+）、T Helper淋巴细胞（CD4+）与细胞毒性T淋巴细胞（CD8+）的数量显着升高。马兜铃酸还诱导小鼠肾脏肌成纤维细胞的凋亡抵抗显着增加。与对照组相比,AA组中肌成纤维细胞（α-SMA+）的凋亡抑制蛋白bcl-2显着上调,促凋亡蛋白Fas、Bax以及Bax/bcl-2的比值也显着下调。后续的多肽AcSDKP给药能够显着降低马兜铃酸诱导的上述变化。与AA组相比较,在AA+AcSDKP组中,细胞外基质降解的抑制因子TIMP-1与PAI-1与促纤维化因子IL-11的m RNA水平显着下降,PAI-1的蛋白水平显着下降;在肌成纤维细胞（α-SMA+）中,凋亡抑制蛋白bcl-2显着下降,而促凋亡蛋白Fas、Bax以及Bax/bcl-2的比值均显着上升;肌成纤维细胞（α-SMA+）、巨噬/单核细胞（i NOS+）、T Helper淋巴细胞（CD4+）与细胞毒性T淋巴细胞（CD8+）的数量均显着下降。此外,在体外培养的小鼠肾脏原代成纤维细胞与细胞培养上清中,多肽AcSDKP还能够抑制TGFβ1诱导的PAI-1蛋白的表达上调。第三部分:多肽AcSDKP减少小鼠马兜铃酸慢性肾病中已经形成的肾小管间质纤维化。在马兜铃酸慢性肾病模型中,多肽AcSDKP也能够显着减少马兜铃酸诱导的已经形成的肾小管间质纤维化、肾小管病变与肾功能受损。与对照组相比较,在AA组中,马兜铃酸能够显着增高细胞外基质的降解抑制因子TIMP-1与PAI-1的m RNA水平,促纤维化因子TGFβ1与IL-11的m RNA水平,以及PAI-1蛋白水平;在肌成纤维细胞（α-SMA+）中显着上调凋亡抑制蛋白bcl-2,显着下调促凋亡蛋白Fas、Bax以及Bax/bcl-2的比值;还能够显着增加肌成纤维细胞（α-SMA+）、巨噬细胞/单核细胞（i NOS+）、T Helper淋巴细胞（CD4+）与细胞毒性T淋巴细胞（CD8+）的数量。与AA组相比较,在AA+AcSDKP组中,多肽AcSDKP能够显着降低TIMP-1、PAI-1、TGFβ1与IL-11的m RNA水平,PAI-1蛋白水平;显着降低肌成纤维细胞凋亡抵抗（bcl-2表达下调,Fas、Bax表达上调,Bax/bcl-2比值上升）;并且显着下降肌成纤维细胞（α-SMA+）、巨噬细胞/单核细胞（i NOS+）、T Helper淋巴细胞（CD4+）与细胞毒性T淋巴细胞（CD8+）的数量。结论本研究新发现,在马兜铃酸诱导形成纤维化之后,多肽AcSDKP能够显着减少肾小管间质纤维化,并发现:1)马兜铃酸诱急性肾病中肾脏mi RNA与m RNA全基因组表达谱发生显着改变,并提示TIMP-1与PAI-1可能是细胞外基质降解的关键抑制因子;2)在急性与慢性马兜铃酸肾病模型中,多肽AcSDKP能够减少已经诱导形成的肾小管间质纤维化;3)多肽AcSDKP一方面能够显着降低马兜铃酸诱导的肌成纤维细胞与免疫细胞数量的增加,肌成纤维细胞凋亡抵抗的增强,以及促纤维化因子IL-11的m RNA水平的显着上调,从而减少细胞外基质成分的合成;另一方面,还能够显着降低细胞外基质的降解抑制因子PAI-1与TIMP-1的m RNA水平的大幅度上调,从而解除对细胞外基质降解的抑制,促进细胞外基质的降解。
吴舜[9]（2020）在《Fgl2在肾纤维化中的作用及机制探讨》文中研究指明研究背景慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）是指各种原因导致的慢性肾脏结构的改变或者功能障碍超过三个月的一类慢性疾病。随着我国人口的老龄化及代谢性疾病的增多,CKD的发病率逐年升高,给家庭和社会带来了沉重的经济负担。终末期肾病（End stage renal disease,ESRD）是CKD的终末事件,然而目前尚无针对该疾病的特异性药物。肾纤维化是各种CKD发展为ESRD的共同通路,是肾功能丧失的重要原因之一,尽管过去几年我们对肾纤维化的认识有了大幅度的提升,但目前疾病的具体机制仍未完全阐明,因此研究肾纤维化的病理发生机制和特异性靶点,对于疾病的预防和治疗具有十分重要的意义。炎症在肾纤维化的病理发生中扮演着重要的角色,而巨噬细胞作为免疫系统的重要成员之一,同样也对炎症调节起着重要的作用。巨噬细胞在不同的刺激下可以极化为经典活化的M1型巨噬细胞和替代活化的M2型巨噬细胞。目前研究表明,纤维化肾组织中有大量的巨噬细胞浸润,且其极化在肾纤维化的病理发生过程中非常重要,M1型巨噬细胞主要是通过促进肾脏损伤加速肾纤维化的发展,M2型巨噬细胞主要通过促进细胞外基质的沉积和促纤维化因子的分泌介导肾纤维化的病理发生。纤维蛋白原样蛋白2（Fibrinogen-like protein 2,Fgl2）作为一种凝血酶原酶,具有凝血活性和免疫调节双重作用。最新研究发现,Fgl2可以通过调节炎症反应参与多种疾病的病理发生,而炎症又是肾纤维化发生的核心环节,因此我们推测Fgl2可能参与了肾纤维化的发生发展。本研究通过建立单侧输尿管结扎（Unilateral ureteral obstruction,UUO）诱导的肾纤维化模型,通过免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）、蛋白质免疫印记（Western Bolt,WB）流式细胞术（Flowcytometry,FCM）和定量实时PCR（Quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR）等技术探讨了Fgl2对巨噬细胞极化的调节作用。研究目的:1.探讨Fgl2基因缺失对肾纤维化病理发生的影响。2.探讨在肾纤维化的病理发生过程中,Fgl2对M1型和M2型巨噬细胞极化的作用。研究方法1.Fgl2基因缺失对肾纤维化病理发生的影响1.1收集CKD病人肾脏组织标本,IHC检测肾组织中Fgl2的表达。1.2收集Fgl2+/+小鼠UUO术后3d或7d或14d的小鼠肾组织,IHC、WB和qRT-PCR检测小鼠肾组织中Fgl2的表达。1.3收集Fgl2+/+和Fgl2-/-小鼠UUO术后7d的肾组织,进行以下实验:（1）IHC、WB和qRT-PCR检测小鼠肾组织中α平滑肌肌动蛋白（αsmooth muscle actin,α-SMA）、胶原蛋白Ⅰ（CollagenⅠ）和纤连蛋白（Fibronectin）的表达。（2）Masson染色检测Fgl2+/+和Fgl2-/-小鼠肾组织中胶原纤维的沉积。（3）qRT-PCR检测小鼠肾组织转化生长因子β1（Transforming growth factorβ1,TGF-β1）的表达。2.在肾纤维化的病理发生过程中,Fgl2对M1型和M2型巨噬细胞极化的作用2.1收集Fgl2+/+小鼠UUO术后14d的肾组织,免疫荧光检测纤维化肾组织中巨噬细胞（F4/80+）上Fgl2的表达情况。2.2收集Fgl2+/+和Fgl2-/-小鼠UUO术后7d或14d的肾组织,进行以下实验:（1）流式细胞术检测小鼠肾组织中巨噬细胞（F4/80+CD11b+）、M1型巨噬细胞（F4/80+CD11b+MHC-Ⅱ+）和M2型巨噬细胞（F4/80+CD11b+CD206+）的比例。（2）qRT-PCR检测小鼠肾组织中M1型巨噬细胞相关分子（诱导型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase,iNOS）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factorα,TNF-α）、IL-12p40、IL-6和IL-1β）和M2型巨噬细胞相关分子（甘露糖受体（Mannose receptor,MR）、精氨酸酶1（Arginase-1,Arg-1）、IL-10、炎症区分子1（Found in inflammatory zone-1,Fizz-1）、类几丁质酶3样分子（Chitinase 3-like 3,即YM-1）、TGF-β1）的表达。2.3巨噬细胞集落刺激因子（Macrophage concolony stimulating factor,M-CSF）诱导Fgl2+/+和Fgl2-/-小鼠的骨髓细胞分化成为骨髓来源的巨噬细胞（Bone Marrow-derived macrophages,BMDM）,然后分别加入脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）和γ干扰素（Interferon-γ,IFN-γ）或IL-4诱导BMDM向M1型巨噬细胞或M2型巨噬细胞极化。（1）流式细胞术检测Fgl2+/+和Fgl2-/-来源的BMDM中M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞的比例。（2）qRT-PCR检测Fgl2+/+和Fgl2-/-来源的BMDM中M1型巨噬细胞相关分子（iNOS、IL-12p40、IL-6、IL-1β和TNF-α）和M2型巨噬细胞相关分子（MR、Arg-1、Fizz-1和YM-1）的表达。实验结果1.Fgl2基因缺失对肾纤维化病理发生的影响1.1与正常肾组织相比,Fgl2的表达在CKD病人肾组织中显着升高。1.2与假手术组小鼠相比,Fgl2的表达在UUO诱导的小鼠纤维化肾组织中明显升高。1.3在UUO手术后7d,与Fgl2+/+小鼠相比,Fgl2-/-小鼠的肾组织纤维化更严重,表现为α-SMA、胶原蛋白Ι和纤连蛋白的表达、促纤维化因子TGF-β1的分泌、胶原沉积（Masson染色）增多。2.在肾纤维化的病理发生过程中,Fgl2对M1型和M2型巨噬细胞极化的作用2.1在UUO手术后14d,Fgl2高表达于小鼠纤维化肾组织中浸润的巨噬细胞上。2.2在UUO手术后7d或14d,在Fgl2+/+小鼠和Fgl2-/-小鼠肾组织中巨噬细胞（F4/80+CD11b+）、M1型巨噬细胞（F4/80+CD11b+MHC-Ⅱ+）的百分率无明显差异,但Fgl2基因敲除后M2型巨噬细胞（F4/80+CD11b+CD206+）的百分率显着增多。2.3在UUO手术后7d,在Fgl2+/+小鼠和Fgl2-/-小鼠肾组织中,M1型巨噬细胞相关分子的表达均无明显变化,但Fgl2基因敲除后部分M2型巨噬细胞相关分子（MR,TGF-β1）的表达明显增多。2.4在UUO手术后14d,与Fgl2+/+小鼠相比,Fgl2-/-小鼠肾组织中部分M1型巨噬细胞相关分子（IL-12p40和TNF-α）和M2型巨噬细胞相关分子（MR、TGF-β1、IL-10和Fizz-1）表达明显增多。2.5在BMDM向M1型巨噬细胞极化过程中,与Fgl2+/+小鼠相比,Fgl2-/-小鼠来源的BMDM中M1型巨噬细胞的百分率及其相关分子表达（iNOS、IL-12p40、IL-6、IL-1β和TNF-α）明显增多。2.6在BMDM向M2型巨噬细胞极化过程中,与Fgl2+/+小鼠相比,Fgl2-/-小鼠来源的BMDM中M2型巨噬细胞的百分率及其相关分子表达（MR、Arg-1和Fizz-1）明显增多。结论1.Fgl2在纤维化肾组织中高表达。2.Fgl2基因敲除促进UUO诱导的肾纤维化的病理发生。3.Fgl2基因敲除可以通过促进巨噬细胞的极化介导肾纤维化的病理发生。
李冰珏[10]（2020）在《ADAM10激活Notch通路调控肾近端小管发育及肾纤维化研究》文中进行了进一步梳理背景研究发现子宫内发育异常会增加出生后患肾脏疾病风险,慢性肾脏病可因子宫内异常环境侵害而在生命早期就出现。越来越多的证据表明,肾脏发育会在不良条件下启动异常编程,从而导致永久性的结构和功能改变。目前,环境污染已被视为肾脏疾病危险因素,其中农药污染在国内是一个突出的问题。Notch信号通路是已知的肾脏发育相关重要通路,其中NOTCH2主要参与肾近端小管分化。此外,Notch通路还介导肾脏疾病发展,在纤维化肾脏中表达上调。据报道,Notch通路上游分子去整合素金属蛋白酶10（A disintegrin and metalloproteinase domain10,ADAM10）也参与肾脏纤维化的发生发展。然而,ADAM10如何通过Notch信号通路介导肾脏纤维化,具体机制尚未完全阐明。目的本研究旨在探索ADAM10-Notch信号轴在肾脏近端小管发育及肾脏纤维化中的作用,以发现可早期干预从而预防慢性肾脏病的潜在靶点。方法8周龄ICR小鼠构建孕期亚中毒剂量毒死蜱（CPF）暴露模型,实验组小鼠从孕7.5天开始连续皮下注射5 mg/kg/d CPF5天,对照组注射同等体积DMSO。显微镜下分离获得12.5天（E 12.5）、14.5天（E 14.5）、16.5天（E 16.5）、18.5天（E 18.5）胚胎肾脏标本;子代小鼠于4周（4 w）、8周（8 w）、6月（6 m）、9月（9 m）处死并留取肾脏、血液标本。不同时间点胚胎肾脏样本进行转录组测序（RNA-seq）,利用基因集富集分析（GSEA）探索Notch信号通路富集情况。对不同发育时间点正常胚胎肾脏进行Notch信号通路基因芯片筛查,明确Adam10与Notch分子间的表达趋势关系。进一步检测胚胎肾脏及成年期肾脏Adam10、Notch通路及纤维化相关因子基因蛋白表达情况。利用反义寡核苷酸Morpholino阻断Adam10（Adam10-MO）表达,观察体外培养胚胎肾脏发育情况及肾近端小管分化、Notch通路活性变化情况。人293T细胞敲减和过表达ADAM10并观察Notch通路活性及纤维化相关因子表达变化。81名经肾穿刺病理确诊的Ig A肾病（Ig AN）患者,根据肾穿刺切片Masson染色将纤维化程度分层,免疫组化对ADAM10和NOTCH2进行表达评分,利用卡方检验、相关性分析、Logistic回归分析探索ADAM10、NOTCH2表达与Ig AN纤维化程度、肾功能关系。结果胚胎肾脏RNA-seq测序结果提示Notch通路在产前CPF暴露组小鼠胚胎肾脏中富集。GSEA分析还发现近端小管标志物Aqp1在CPF组富集,而肾单位祖细胞相关标志物表达下调。Notch芯片结果表明Adam10与Notch受体Notch1、Notch2表达趋势一致。RT-q PCR、WB验证Adam10、Notch1、Notch2在CPF组表达升高,肾单位祖细胞标志物Six2在CPF组表达下降。免疫荧光、免疫组化明确CPF处理组小鼠肾近端小管数量增加。体外培养胚胎肾脏经Adam10-MO处理后,肾脏发育受阻,近端小管数量减少,Notch通路活性下降。出生后CPF组小鼠肾脏中,持续存在Adam10、Notch1、Notch2、Aqp1表达升高,近端小管数量增加;此外,CPF组6m和9m肾脏出现自发性肾纤维化,Masson染色纤维化面积增加,间充质标记物表达上调,表现出上皮间质转化（EMT）改变。人293T细胞转染si RNA-ADAM10后,Notch活性无明显下调,纤维化标志物无明显下降,同时转染ADAM10同家族ADAM17的si RNA后,Notch活性下调、纤维化标志物表达下调;转染过表达质粒pc DNA-ADAM10-HA后,Notch活性上调、纤维化标志物表达上调。卡方检验分析表明Ig AN患者中ADAM10表达与NOTCH2表达显着相关;ADAM10、NOTCH2表达与肾纤维化程度显着相关;ADAM10表达与血清肌酐水平、Cystatin C水平、e GFR水平显着相关。相关性分析表明Ig AN患者中ADAM10表达与NOTCH2表达正相关;ADAM10、NOTCH2表达与纤维化程度正相关;ADAM10表达与血清肌酐水平、Cystatin C水平、血尿素氮水平正相关,与e GFR水平负相关。单因素回归分析表明ADAM10表达水平、血清肌酐水平、血尿素氮水平、e GFR水平、Cystatin C水平与Ig AN肾纤维化相关,进一步的多因素回归分析表明ADAM10表达水平和e GFR水平是Ig AN肾纤维化的独立危险因素。结论产前毒死蜱暴露小鼠胚胎肾脏中,ADAM10-Nocth信号轴活化,导致肾单位祖细胞向肾近端小管过度分化。这种异常的近端小管数量增加表型在成年后小鼠肾脏中持续存在。ADAM10-Nocth轴的持续活化,促进6月龄小鼠出现自发性肾纤维化。人293T细胞敲减和过表达实验证实ADAM10在纤维化中的作用。Ig AN患者中,ADAM10、NOTCH2表达与肾纤维化程度相关,且ADAM10表达增高与肾功能减退相关。表明ADAM10可能是潜在的可以早期干预预防慢性肾脏病肾纤维化的靶点。
二、蛋白酶激活受体2在小鼠肾间质纤维化中的表达及其意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、蛋白酶激活受体2在小鼠肾间质纤维化中的表达及其意义（论文提纲范文）
（1）基于NLRP3炎症小体信号探讨高糖环境下大鼠肾小管上皮细胞炎症因子变化及糖尿病大鼠肾脏纤维化机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 NOD样受体家族与NLRP3 炎症小体 |
| 1.2 NLRP3 炎症小体的活化及其调控机制 |
| 1.3 NLRP3 炎症小体与TLR之间的关系 |
| 1.4 NLRP3 炎症小体与天然免疫 |
| 1.5 NLRP3 炎症小体与DKD |
| 第2章 材料与研究方法及步骤 |
| 第一部分 实验:细胞实验 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 研究方法及步骤 |
| 2.1 主要溶液的配置 |
| 2.2 细胞实验(培养、冻存、传代、复苏及计数) |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验分组 |
| 2.5 荧光定量PCR检测各组NLRP3、Caspase-1、Vimentin mRNA的表达 |
| 2.6 Western Blot分析各处理NLRP3、HSP47、P-P65、Vimentin、Collagen Ⅳ蛋白的相对表达量 |
| 2.7 ELISA检测细胞上清液中IL-1β、TNF-ɑ的表达量, 操作步骤如下 |
| 3 统计学分析 |
| 第二部分 试验:动物实验 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要溶液配制 |
| 2 研究方法和步骤 |
| 2.1 动物模型的建立 |
| 2.2 实验分组 |
| 2.3 采集标本 |
| 2.4 常规生理生化指标检测 |
| 2.5 肾组织病理学检测 |
| 2.6 免疫组织化学 |
| 2.7 荧光定量PCR检测各组NF-kB、NLRP3、HSP47、TRAF6、Collagen Ⅳ mRNA的表达 |
| 2.8 Western Blot分析各处理组NLRP3、HSP47、α-SMA、Vimentin、P-P65蛋白的相对表达量 |
| 3 统计学分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 第一部分实验 |
| 3.1.1 检测各组NLRP3 siRNA的干扰效率有效性检测 |
| 3.1.2 荧光定量PCR检测48h、72h各组细胞NLRP3、Caspase-1、Vimentin mRNA的相对表达量 |
| 3.1.3 Western blot检测48h、72h和96h各组细胞NLRP3、HSP47、P-P65、Vimentin、Collagen IV蛋白的表达量 |
| 3.1.4 ELISA检测24h、48h、72h各组细胞培养上清液IL-1β、TNF-ɑ的表达 |
| 3.2 第二部分实验: |
| 3.2.1 肾组织病理变化 |
| 3.2.2 荧光定量PCR检测4W、8W和12W各组细胞NF-?B、NLRP3、HSP47、TRAF6、Collagen IV m RNA的相对表达量 |
| 3.2.3 Western blot检测4W、8W和12W各组细胞NLRP3、HSP47、α-SMA、Vimentin、P-P65 蛋白的表达量 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 第6章 创新之处 |
| 第7章 展望与不足 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 天然免疫细胞与糖尿病肾病 |
| 参考文献 |
（2）FG-4592通过干预RIP1-RIP3-MLKL介导的坏死性炎症对UUO大鼠肾纤维化的保护作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验动物饲养及分组 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 SPF级大鼠饲养环境 |
| 2.1.3 实验动物分组 |
| 2.2 实验试剂与抗体及实验仪器 |
| 2.2.1 主要试剂及主要抗体 |
| 2.2.2 主要实验仪器 |
| 2.3 标本的采集 |
| 2.4 实验室检测 |
| 2.5 肾脏病理学检查 |
| 2.5.1 石蜡切片制作的基本过程 |
| 2.5.2 Masson三色染色 |
| 2.5.3 PAS染色 |
| 2.5.4 透视电镜标本观察 |
| 2.6 免疫组织化学染色 |
| 2.7 ELISA法检测血及尿8-羟基-2-脱氧鸟苷(8-OHd G) |
| 2.8 免疫印迹法 |
| 2.9 原位Td T介导的d UTP-生物素缺口末端标记(TUNEL)检测 |
| 2.10 统计学处理 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 各组大鼠生化检测结果评估 |
| 3.2 FG-4592 对UUO所致坏死性凋亡的影响 |
| 3.3 FG-4592 对UUO诱导的坏死性炎症的影响 |
| 3.4 FG-4592 对UUO所致肾纤维化的影响 |
| 3.5 FG-4592 对UUO所致氧化应激酶失调的影响 |
| 3.6 FG-4592 对UUO所致内质网应激的影响 |
| 3.7 FG-4592 对UUO所致线粒体结构的影响 |
| 3.8 FG-4592 对UUO所致细胞凋亡的影响 |
| 3.9 FG-4592对HIF-1α/Wnt/β-catenin/GSK信号通路的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 综述 缺氧诱导因子-1研究进展 |
| 参考文献:(综述) |
| 附录:攻读学位期间发表的论文目录 |
（3）E3泛素连接酶TRIM31在高血压肾病中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 第一部分: E3泛素连接酶TRIM31调控高血压肾病发生的实验研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语说明 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分: E3泛素连接酶TRIM31改善高血压肾病的分子机制研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语说明 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文Ⅰ |
| 外文论文Ⅱ |
（4）MiR-509-3p通过靶向YAP参与调控肾纤维化的作用及分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 MiR-509-3p在肾纤维化组织中的表达及与YAP相关性研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 主要试剂与仪器 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要试剂的配制 |
| 2.2 研究对象和分组 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 FA肾病模型的建立 |
| 2.2.3 人肾组织及血清标本采集 |
| 2.3 MiRNAs芯片数据分析 |
| 2.4 PAS染色显示肾组织损伤情况 |
| 2.5 Masson染色检测肾间质纤维化 |
| 2.6 肾功能检测血清肌酐、尿素氮 |
| 2.7 免疫组织化学染色检测YAP、AQP1、AQP2 表达 |
| 2.8 Western blot检测YAP蛋白表达 |
| 2.8.1 肾组织蛋白提取 |
| 2.8.2 BCA法检测蛋白浓度 |
| 2.8.3 Western blot实验 |
| 2.9 Realtime-PCR检测miR-509-3p和 YAP mRNA |
| 2.9.1 RNA提取 |
| 2.9.2 血清miRNA提取 |
| 2.9.3 PCR检测 |
| 2.10 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 MiR-509-3p在肾纤维化中的表达及与临床的关系 |
| 3.1.1 GEO数据库筛选小鼠肾纤维化组织差异基因 |
| 3.1.2 MiR-509-3p在 CKD患者中低表达 |
| 3.2 FA肾病小鼠病变特征 |
| 3.2.1 FA肾病小鼠的病理改变 |
| 3.2.2 FA肾病小鼠的血清生化检测 |
| 3.2.3 FA肾病小鼠的水通道蛋白AQP1、AQP2 表达 |
| 3.3 MiR-509-3p在 FA肾病小鼠中低表达 |
| 3.4 YAP在肾纤维化组织中的表达显着升高 |
| 3.4.1 YAP在人肾纤维化组织中高表达 |
| 3.4.2 YAP在小鼠肾纤维化组织中高表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 细胞学实验检测miR-509-3p在肾纤维化中的作用 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 主要试剂与仪器 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要试剂的配制 |
| 2.2 细胞株 |
| 2.3 细胞实验 |
| 2.3.1 构建肾纤维化细胞模型 |
| 2.3.2 MiR-509-3p转染 |
| 2.3.3 MiR-509-3p和 YAP过表达质粒共转染 |
| 2.4 Western blot检测YAP及肾纤维化指标 |
| 2.4.1 细胞蛋白提取 |
| 2.4.2 BCA法检测蛋白浓度 |
| 2.4.3 Western blot实验 |
| 2.5 Realtime-PCR检测miR-509-3p、YAP及肾纤维化指标 |
| 2.5.1 RNA提取 |
| 2.5.2 PCR检测miR-509-3p |
| 2.5.3 PCR检测YAP及纤维化指标 |
| 2.6 荧光素酶报告基因实验检测miR-509-3p与 YAP结合位点 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 MiR-509-3p对 SV40 MES13 细胞的生物学作用 |
| 3.1.1 MiR-509-3p在 TGF-β1 诱导的SV40 MES13 细胞中低表达 |
| 3.1.2 MiR-509-3p转染效率的验证 |
| 3.1.3 MiR-509-3p抑制TGF-β1 诱导的SV40 MES13 细胞分泌ECM |
| 3.2 MiR-509-3p靶向YAP抑制SV40 MES13 细胞分泌ECM |
| 3.2.1 YAP在 TGF-β1 诱导的SV40 MES13 细胞中高表达 |
| 3.2.2 转染miR-509-3p下调SV40 MES13 细胞中YAP的表达 |
| 3.2.3 双荧光素报告基因实验显示miR-509-3p与 YAP的3'-UTR的位点结合 |
| 3.2.4 过表达YAP抑制了miR-509-3p减少ECM分泌的作用 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 过表达miR-509-3p下调YAP减轻FA诱导的小鼠肾纤维化 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 主要试剂与仪器 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要试剂的配制 |
| 2.2 实验动物和分组 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 FA肾病小鼠过表达miR-509-3p |
| 2.3 PAS染色显示FA肾病组织病理 |
| 2.4 Masson染色检测FA肾病肾脏纤维化 |
| 2.5 肾功能检测血清肌酐、尿素氮 |
| 2.6 免疫组织化学染色检测肾纤维化指标及EMT指标 |
| 2.7 Western blot检测肾纤维化指标、YAP及下游因子等 |
| 2.7.1 肾组织蛋白提取 |
| 2.7.2 BCA法检测蛋白浓度 |
| 2.7.3 Western blot实验 |
| 2.8 Realtime-PCR检测miR-509-3p、肾纤维化指标、YAP及下游基因等 |
| 2.8.1 RNA提取 |
| 2.8.2 PCR检测miR-509-3p |
| 2.8.3 PCR检测肾纤维化指标、YAP及下游基因等 |
| 2.9 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 过表达 miR-509-3p下调YAP及其下游靶基因的表达 |
| 3.1.1 过表达miR-509-3p下调YAP |
| 3.1.2 过表达miR-509-3p抑制YAP下游靶基因CTGF、CYR61 的产生 |
| 3.2 过表达miR-509-3p改善FA肾病小鼠的肾损伤 |
| 3.2.1 FA肾病小鼠的病理改变 |
| 3.2.2 FA肾病小鼠血清生化检测 |
| 3.3 过表达miR-509-3p减轻FA诱导小鼠肾间质纤维化 |
| 3.3.1 过表达miR-509-3p减轻FA诱导小鼠肾ECM的分泌 |
| 3.3.2 过表达 miR-509-3p下调FA诱导小鼠肾α-SMA表达 |
| 3.3.3 过表达 miR-509-3p上调E-cadherin,减少vimentin的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 Hippo信号通路与纤维化疾病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）IRF-1通过抑制Klotho促进肾间质纤维化的机制研究（论文提纲范文）
| Abstract |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 IRF-1与肾间质纤维化的相关性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 IRF-1 通过调控Klotho促进肾小管上皮细胞高表达纤维化标志物的作用和机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 敲除或抑制IRF-1显着改善肾间质纤维化 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述Klotho在肾间质纤维化中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（6）肾康注射液对慢性肾脏病和肾纤维化的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 慢性肾脏病肾纤维化的现代研究进展 |
| 1 病因研究 |
| 2 发病机制研究 |
| 3 治疗与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 中医药防治慢性肾脏病研究进展 |
| 1 病名研究 |
| 2 病因病机研究 |
| 3 防治研究 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 实验一 肾康注射液治疗慢性肾脏病的系统药理学分析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果和讨论 |
| 3 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 肾康注射液对UUO小鼠肾间质纤维化的保护作用及机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 实验三 肾康注射液对NRK-49F人鼠肾间质成纤维细胞活化的作用及机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 主要研究成果 |
| 个人简历 |
（7）胃泌酸调节素（OXM）类似物改善慢性肾病肾脏纤维化的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 肾纤维化及其致病机制 |
| 1.1.1 慢性肾病概述 |
| 1.1.2 引起CKD有关的疾病 |
| 1.1.3 肾纤维化与CKD |
| 1.1.4 肾纤维化相关的通路 |
| 1.1.5 治疗肾纤维化的相关靶点和药物 |
| 1.2 胰高血糖素样肽-1受体激动剂与糖尿病肾病 |
| 1.3 胃泌酸调节素的生物活性 |
| 参考文献 |
| 第二部分 OXM类似物对高糖诱导MCs和 TECs的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 细胞株 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 溶液的配制 |
| 2.3.2 细胞培养 |
| 2.3.3细胞毒性实验 |
| 2.3.4 高糖诱导的细胞增殖模型的建立 |
| 2.3.5 TGF-β1诱导的细胞增殖模型的建立 |
| 2.3.6 ELISA法检测高糖诱导下MCs胞外COLIV和 FN的表达 |
| 2.3.7 Western Blot实验 |
| 2.3.8 统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 OXM类似物对MCs正常生长情况的影响 |
| 2.4.2 OXM类似物对高糖诱导MCs增殖的影响 |
| 2.4.3 OXM类似物对高糖诱导MCs胞内FN表达的影响 |
| 2.4.4 OXM类似物对高糖诱导MCs胞内TGF-β1 表达的影响 |
| 2.4.5 OXM类似物对高糖诱导MCs胞外COLIV和 FN含量的影响 |
| 2.4.6 OXM类似物对高糖诱导TECs增殖的影响 |
| 2.4.7 OXM类似物对TGF-β1 诱导TECs增殖的影响 |
| 2.4.8 OXM类似物对高糖诱导TECs胞内TGF-β1 表达的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 第三部分 OXM类似物对糖尿病小鼠肾脏的保护作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 动物模型的构建 |
| 3.3.2 实验分组 |
| 3.3.3 生理和生化指标的测定 |
| 3.3.4 肾脏病理切片常规染色 |
| 3.3.5 免疫组化染色 |
| 3.3.6 RT-PCR实验 |
| 3.3.7 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 OXM类似物对糖尿病小鼠血糖和体重的影响 |
| 3.4.2 OXM类似物对糖尿病小鼠生化指标的影响 |
| 3.4.3 OXM类似物对小鼠肾脏组织形态学改变的影响 |
| 3.4.4 RT-PCR:OXM类似物对小鼠肾组织中FN和 TGF-β1 mRNA表达的影响 |
| 3.4.5 OXM类似物对小鼠肾脏组织中FN表达的影响 |
| 3.4.6 OXM类似物对小鼠肾脏组织中CTGF表达的影响 |
| 3.4.7 OXM类似物对小鼠肾脏组织中胶原的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 第四部分 OXM类似物对UUO小鼠肾脏的保护作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 动物模型的构建 |
| 4.3.2 实验分组 |
| 4.3.3 生化指标的测定 |
| 4.3.4 肾脏病理切片Masson染色 |
| 4.3.5 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 OXM类似物对UUO小鼠生化指标的影响 |
| 4.4.2 OXM类似物对UUO小鼠肾脏组织中胶原的影响 |
| 4.4.3 OXM类似物对UUO小鼠肾脏组织病理改变的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 5.1 主要结果 |
| 5.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
| 附录 |
（8）多肽AcSDKP减少马兜铃酸诱导的小鼠肾小管间质纤维化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 :马兜铃酸诱导的小鼠肾小管间质纤维化模型中肾脏mi RNA与 m RNA表达谱的改变 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 :多肽AcSDKP减少小鼠马兜铃酸急性肾病中已经形成的肾小管间质纤维化 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 :多肽AcSDKP减少小鼠马兜铃酸慢性肾病中已经形成的肾小管间质纤维化 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文 |
| 综述 消除纤维化的潜在机制与进展 |
| 参考文献 |
| 中英文缩写词对照表 |
| 致谢 |
（9）Fgl2在肾纤维化中的作用及机制探讨（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 Fgl2对小鼠肾纤维化形成的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 肾纤维化病理发生发展中,Fgl2对M1和M2型巨噬细胞极化的作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 研究生期间参与的其他工作 |
| 淋巴毒素β受体在狼疮性肾炎中的作用及机制研究 |
| 参考文献 |
| 文献综述 巨噬细胞在肾脏疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间研究成果 |
| 致谢 |
（10）ADAM10激活Notch通路调控肾近端小管发育及肾纤维化研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 第一部分 产前毒死蜱暴露对小鼠肾脏发育影响的探索 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 结论 |
| 第二部分 ADAM10-Notch信号轴调控肾近端小管发育的机制研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 第三部分 ADAM10-Notch信号轴促进肾纤维化的机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 ADAM10在肾脏发育及肾脏疾病中的作用 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在读期间所取得的科研成果 |
四、蛋白酶激活受体2在小鼠肾间质纤维化中的表达及其意义（论文参考文献）
- [1]基于NLRP3炎症小体信号探讨高糖环境下大鼠肾小管上皮细胞炎症因子变化及糖尿病大鼠肾脏纤维化机制[D]. 刘思逸. 南昌大学, 2021(01)
- [2]FG-4592通过干预RIP1-RIP3-MLKL介导的坏死性炎症对UUO大鼠肾纤维化的保护作用[D]. 郑海兰. 延边大学, 2021(02)
- [3]E3泛素连接酶TRIM31在高血压肾病中的作用及机制研究[D]. 张杰. 山东大学, 2021
- [4]MiR-509-3p通过靶向YAP参与调控肾纤维化的作用及分子机制研究[D]. 王恺悦. 中国医科大学, 2021(02)
- [5]IRF-1通过抑制Klotho促进肾间质纤维化的机制研究[D]. 李燕. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(01)
- [6]肾康注射液对慢性肾脏病和肾纤维化的作用及机制研究[D]. 秦田雨. 北京中医药大学, 2020(04)
- [7]胃泌酸调节素（OXM）类似物改善慢性肾病肾脏纤维化的作用研究[D]. 安春妹. 兰州大学, 2020(01)
- [8]多肽AcSDKP减少马兜铃酸诱导的小鼠肾小管间质纤维化[D]. 朱自强. 苏州大学, 2020(06)
- [9]Fgl2在肾纤维化中的作用及机制探讨[D]. 吴舜. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(01)
- [10]ADAM10激活Notch通路调控肾近端小管发育及肾纤维化研究[D]. 李冰珏. 浙江大学, 2020(01)