一、卵巢癌组织中端粒酶活性的测定（论文文献综述）
杨宏毅[1]（2020）在《TNKS1通过Wnt/β-catenin信号通路调控卵巢癌发生发展的作用与机制》文中提出研究背景卵巢癌作为妇科生殖系统三大恶性肿瘤之一,临床起病隐匿,缺乏有效早期诊断指标,容易复发和转移,化疗极易产生耐药性,而放疗大多不敏感,预后差。因此,深入研究卵巢癌发生发展的分子机理,对于寻找有效早期诊断指标、预后判断指标和基因靶向治疗具有重大指导意义。端锚聚合酶（tankyrase,TNKS）属于聚ADP-核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase,PARP）蛋白家族,可与端粒酶重复绑定序列结合。人类TNKS1基因在第8号染色体p23.1上,作为调控端粒长度的关键因子在多种疾病中发挥重要作用,与多种恶性肿瘤的发生发展关系密切,与卵巢癌的关系尚不清楚。Wnt/β-catenin信号传导通路在恶性肿瘤的发生和发展中起重要作用,同时研究证实TNKS对Wnt信号通路进行正调控。本文率先系统地研究了 TNKS1通过调控Wnt/β-catenin信号传导通路来影响卵巢癌发生发展的相关机制。研究目的本研究从临床样本、细胞水平、动物模型以及分子机制层面,系统立体研究TNKS1在卵巢癌发生发展中的作用及机制,为卵巢癌诊疗提供理论依据。研究材料和方法1.采用q-PCR、免疫组化和Western blot技术研究TNKS1在卵巢癌组织中的表达。2.采用MTS法、细胞集落形成、裸鼠皮下移植瘤实验研究TNKS1对卵巢癌细胞增殖与成瘤的影响。3.采用MTS法和凋亡实验研究TNKS1表达改变对卵巢癌细胞药物敏感性的影响。4.采用细胞划痕实验和Transwell转移小室实验研究TNKS1在卵巢癌迁移与侵袭中的作用。5.采用葡萄糖摄取、乳酸分泌、ATP生成以及线粒体氧耗率研究TNKS1在卵巢癌细胞有氧糖酵解中的作用。6.采用Western blot技术及细胞转染法研究TNKS1参与卵巢癌发生发展的分子调控机制。7.应用SPSS 21.0进行统计分析,实验结果以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.TNKS1在卵巢癌组织中的表达高于癌旁组织及正常卵巢组织,且与卵巢癌患者的病理分级和肿瘤大小密切相关。2.敲低或抑制TNKS1显着抑制卵巢癌细胞增殖、细胞集落形成、体内成瘤及细胞周期进展,并有效提高卵巢癌细胞对常用化疗药物敏感性,显着抑制其迁移和侵袭能力;同时通过降低丙酮酸羧化酶表达降低卵巢癌细胞的糖代谢,提高线粒体耗氧率。3.敲低或抑制TNKS1通过抑制Wnt/β-catenin信号通路,进而下调Snail、PC、CyclinD、MDR、MMP-9 等 Wnt/β-catenin 信号通路靶蛋白的表达。TNKS1、Snail和PC在临床卵巢癌组织中表达两两之间呈正相关。结论TNKS1在卵巢癌组织中高表达,具有一定的临床意义。TNKS1可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路活性进而促进卵巢癌生长与成瘤、迁移与侵袭和降低药物敏感性;并通过β-catenin/Snail/PC信号轴促进卵巢癌细胞的有氧糖酵解。TNKS1在卵巢癌发生发展中发挥重要作用,可作为卵巢癌潜在的早期诊断指标、判断预后指标或靶向基因治疗靶点。
戴薇[2]（2019）在《NF-κB和端粒酶启动的肿瘤基因治疗新技术研究》文中研究指明癌症是目前困扰人类健康、威胁人类生命的重大疾病之一。传统的手术切除、放疗、化疗和最新的免疫疗法已被用于癌症治疗,提高了病人的五年存活率,但由于不可避免的毒副反应使得疗效还与病人对于生命健康的期望相差甚远。NF-κB是一种序列特异性DNA结合型转录因子,通过与细胞核内DNA靶点结合,调控靶基因的表达,从而参与炎症反应、免疫应答以及细胞生长、分裂和凋亡等多种生理病理过程。NF-κB在各种癌症中过度活化,是抗肿瘤药物筛选和癌症治疗的优良靶点。由于NF-κB是一把“双刃剑”,传统的NF-κB活性抑制剂因其显着的毒副作用而未能成为临床药物。抑制从来不是解决问题的好办法,应采用因势利导的策略,创制新的肿瘤治疗技术。本研究发展了三种肿瘤基因治疗新技术,并探索了其生物医学研究领域的应用价值,主要研究成果包括以下:1.人肝癌细胞中NF-κB结合靶点和靶基因的鉴定及其应用研究发现,过度活化的NF-κB与肝炎和肝细胞癌（HCC）的发生密切相关,但其完整而精确的分子途径和机制目前还不清楚。本研究使用Ch IP-seq和RNA-seq高通量测序技术,在TNFα诱导的人HCC细胞系Hep G2细胞中共计鉴定出699个NF-κB直接靶基因（direct target gene,DTG）,包括399个激活基因和300个抑制基因。其中,216个基因（包括126个激活基因和90个抑制基因）是目前已经鉴定出的HCC基因标志物。比较TNFα诱导的Hep G2细胞、LPS诱导的THP-1细胞和TNFα诱导的He La细胞中NF-κB靶基因数目,仅有24–46个NF-κB靶基因由两种细胞系共有,表明本研究鉴定出的NF-κB DTG具有HCC细胞特异性。基因功能注释分析表明,Hep G2细胞中的NF-κB DTG主要富集在经典的NF-κB生物学过程,如免疫系统过程、压力反应、刺激反应、防御反应和细胞死亡,并且涉及MAPK、TNF、TGF-β、趋化因子、NF-κB和Toll样受体KEGG信号通路。部分NF-κB DTG也与丙型肝炎和乙型肝炎病毒密切相关。此外,82个NF-κB DTG编码的分泌蛋白是目前临床上已经使用的HCC生物标志物,如CCL2和DKK1。最后,通过Ch IP-q PCR和RT-q PCR实验证实,NFKB1、NFKBIA、CCL2、IL1A、IL1B、PTX3、NUDT7、EFNA5、ID4、GPC6、KLF15、DKK1、OAZ2和IGFBP3这14个基因是TNFα诱导的Hep G2细胞中NF-κB DTG。这些结果为进一步研究NF-κB相关的分子机制和HCC生物标志物诊疗技术的发展提供了有价值的基因信息。2.NF-κB激活的肿瘤细胞特异性基因疗法及其应用研究转录因子NF-κB在各种肿瘤细胞/组织中过度活化,已经成为抗肿瘤药物研发和肿瘤治疗的优良靶点。正因如此,过去几十年发展了无数的NF-κB活性抑制剂,然而由于不可避免的毒副反应,没有一例抑制剂成为临床使用的药物。本研究中,利用NF-κB在肿瘤细胞中高度活化的生物学特性,发展了一种肿瘤细胞特异性基因疗法,即NF-κB激活的基因表达（NF-κB-activated gene expression,Nage）载体用于癌症治疗。Nage载体通过将NF-κB诱骗子序列（decoy）与最小启动子序列（minimal promoter）融合构成NF-κB特异性启动子（decoy minimal promoter,DMP）,DMP与肿瘤细胞内高表达的NF-κB结合,从而激活下游效应基因的表达。本研究首先使用Western-blotting方法验证了NF-κB p65蛋白在肿瘤细胞中特异性表达。随后以绿色荧光蛋白Zs Green作为效应基因,证实Nage载体可在肿瘤细胞中特异性表达效应基因,产生绿色荧光,而在正常细胞中不表达效应基因。随后,以CRISPR/Cas9作为效应基因,在靶向端粒重复序列的sg RNA（Tsg RNA）的引导下,Nage载体特异性地诱导多种肿瘤细胞死亡,包括Hep G2、He La、PANC-1、MDA-MB-453、A549、HT-29、SKOV-3、Hepa1-6和RAW264.7,而对正常细胞293T、MRC-5和HL7702不产生影响。最后,将表达Cas9-Tsg RNA的Nage载体包装进腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）中,构建肿瘤基因治疗载体AAV-Nage,通过静脉注射给药途径注入小鼠体内,显着地抑制小鼠体内肿瘤的生长。本研究发展的肿瘤细胞特异性基因疗法Nage载体为抗肿瘤药物研发提供了一种新思路。3.端粒酶激活的肿瘤基因疗法及其应用研究癌症是由一系列表观基因突变引起的,以多种复杂形式存在的难以预防和治疗的疾病。端粒酶是真核细胞中负责端粒延长的一种RNA聚合酶。研究发现,端粒酶的活性在大多数正常细胞中被程序性关闭,而在90%的肿瘤细胞中被重新激活,使其成为癌症治疗中的重要靶点。目前,已开发出多种端粒酶活性抑制剂用于治疗癌症,但由于不可避免的毒副反应均已失败告终。本研究中,利用肿瘤细胞中端粒酶的活性发展了一种名为端粒酶激活的基因表达（telomerase-activated gene expression,Tage）系统用于治疗癌症。Tage系统由一段携带端粒酶可识别的3’粘性末端效应基因表达载体、表达d Cas9-VP64人工转录因子的表达载体和靶向端粒重复序列的sg RNA（Tsg RNA）组成。以CRISPR/Cas9作为效应基因,Tage系统有效地杀灭多种肿瘤细胞,包括Hep G2、He La、PANC-1、MDA-MB-453、A549、HT-29、SKOV-3、Hepa1-6和RAW264.7,但对正常细胞293T、MRC-5、HL7702和骨髓间充质干细胞（BMSC）不产生影响。更重要的是,酵母同宗接合切换内切酶（homothallic switching endonuclease,HO）切割产生的4碱基3?粘性末端可被细胞中端粒酶识别并延伸,为Tage系统体内应用奠定基础。以腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）作为基因载体,实现了Tage系统体内安全有效治疗肿瘤的目的。荷载Tage系统的AAV经静脉注射给药,显着地抑制小鼠体内肿瘤的生长,并且没有观察到明显的毒副反应。4.肿瘤干细胞基因治疗载体的构建及其应用研究癌症由不同分化等级和致瘤潜力的肿瘤细胞构成,是一种高度异质性、难以预防和治疗的疾病。癌干细胞或肿瘤干细胞（cancer stem cell,CSC）是具有自我更新、多能分化和无限增殖潜能的肿瘤细胞亚群,对维持肿瘤细胞异质性和致瘤性起关键作用。CSC可抵抗常规抗癌药物,并在肿瘤转移和复发中发挥重要作用,使得抗肿瘤药物研发面临巨大挑战。本研究中,使用前期发展的两种肿瘤细胞特异性基因疗法,端粒酶激活的基因表达（Tage）系统和NF-κB激活的基因表达（Nage）载体24 h内有效地杀灭旺盛分裂的肿瘤细胞,残存细胞具有CSC自我更新增殖特性。q PCR检测发现,涉及上皮/间充质细胞转换、Wnt信号通路、细胞间粘附以及干细胞标志基因VIM、TWIST、p53、p16INK4α、p21、CD24、CD326、DLL4、JAG1、Notch1、MUC1、DACH1、CD133、CD44、ATXN1、BMP7、CXCR4、GATA3、JAK2、KLF4、LIN28a、LIN28b、MYCN、NANOG和SOX2,在残存肿瘤细胞中均高表达,表明Tage系统和Nage载体可在24 h内有效分离得到CSC。研究发现,NF-κB不仅在各种肿瘤细胞中高度活化,在CSC中也显示出高活性,使其有望成为针对CSC的肿瘤治疗靶点。将前期发展的新型NF-κB活性抑制剂,即NF-κB特异性启动子DMP调控的靶向Rel A的mi R533包装进腺相关病毒（AAV）中,构成肿瘤干细胞基因治疗载体AAV-mi R533。AAV-mi R533有效地杀灭Hep G2 CSC,感染病毒20 d后的CSC仍没有再生长增殖迹象。本研究为分离CSC和开发针对CSC的抗肿瘤药物提供了新方法。总之,本研究通过联合运用高通量测序技术、生物信息学技术和传统的分子生物学技术,鉴定出了肝癌细胞中NF-κB的结合靶点和靶基因,发展了三种肿瘤细胞基因治疗新技术—NF-κB激活的基因表达（Nage）载体、端粒酶激活的基因表达（Tage）系统和肿瘤干细胞基因治疗载体,这些基因技术在肿瘤基因治疗领域具有重要的应用价值。
侯小赛[3]（2018）在《miR-1182通过靶向hTERT抑制卵巢癌的转移和增殖》文中进行了进一步梳理目的:目前研究发现,micromaRNA（miRNA）与多种危害人类健康的恶性肿瘤发生发展密切相关,其参与调控肿瘤细胞的生物学特性,例如增殖、侵袭、转移、凋亡等阶段,通过对癌基因、抑癌基因以及相关蛋白表达的表观遗传学调控对肿瘤细胞发挥作用,这表明miRNA有望成为癌症治疗靶点。MicroRNA1182（miR-1182）是micromaRNA调控网络的重要组成部分,对许多疾病发挥重要调节作用,然而,其对卵巢癌发生发展和作用机制尚未研究。本研究旨在探讨miR-1182在卵巢癌发生、发展以及转移中的表达情况,及其潜在的变化规律和作用靶点,为临床诊断和治疗卵巢癌提供理伦依据。方法:本研究通过收集我院2015年03月至2018年03月之间卵巢癌患者行手术切除的卵巢上皮癌组织标本,共50例;同时收集癌旁正常卵巢组织标本50例。在第一部分通过荧光实时定量PCR（RT-PCR）法观察比较miR-1182在卵巢癌组织、细胞（SKOV3）和正常卵巢组织及细胞（IOSE80）中的表达情况和变化规律。在第二部分中,为了研究miR-1182的潜在靶点,我们利用TargetScan,miRDB和microRNA三种公开的算法对其进行了检测,以推测阐明miR-1182的可能靶点,并采用双荧光素酶报告系统证实了人端粒酶逆转录酶（human Telomerase Reverse Transcriptase,hTERT）是miR-1182的直接调控靶点,并被实施到下一步的实验中。在第三部分中我们在SKOV3细胞中分别设立三个组进行相似的实验（miR-NC组,miR-1182模拟组和模拟物+ hTERT组）,使用RT-PCR方法和Western blot蛋白印记实验检测miR-1128对靶基因hTRET表达情况的影响,进而明确miR-11H82与其靶基因之间的相关性。在第四部分中我们进一步采用MTT法检测卵巢癌细胞的增殖率,采用Transwell实验检测卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力,从而明确miR-1182对卵巢癌的发生与发展,以及在侵袭和转移方面发挥的作用。结果:1、miR-1182在卵巢癌组织和细胞中表达下调我们通过RT-PCR的方法观察了miR-1182在卵巢癌组织和细胞（SKOV3细胞）及正常卵巢组织和细胞（IOSE80细胞）中miR-1182的表达情况,结果显示,与正常卵巢组织相比,卵巢癌组织中miR-1182的表达水平下调,差异有统计学意义（p<0.0001,见图1-1）,与正常卵巢细胞（IOSE80细胞）相比,卵巢癌细胞（SKOV3细胞）中miR-1182的表达水平也呈下降趋势,差异有统计学意义（p<0.001,见图1-2）,因此我们认为miR-1182在卵巢癌进展过程中具有一定的调节作用。2、卵巢癌中hTERT是miR-1182的直接靶标我们利用TargetScan,miRDB和microRNA三种公开的算法推测出人端粒酶逆转录酶（human Telomerase Reverse Transcriptase,hTERT）是miR-1182的潜在靶点,并建立含有hTERT3’UTR野生型和含有hTERT3’UTR突变型miR-1182种子序列的萤光素酶报告载体,利用模拟物增加miR-1182的表达从而导致野生型hTERT 3’UTR报告基因的荧光素酶活性降低,但对突变型却没有影响（P<0.001,见图2-2）,这表明可通过调节miR-1182来抑制hTERT的表达水平。3、miR-1182和hTERT的相关性我们在SKOV3细胞中分别设立三个组进行相似的实验（miR-NC组,miR-1182模拟组和模拟物+ hTERT组）,通过实时PCR分析和Western blot蛋白质印迹两种实验可以发现,SKOV3细胞中miR-1182的上调可以降低hTERT的表达水平（图3-1,图3-2）,其差异有统计学意义（P<0.05）,这些数据表明hTERT受到miR-1182的负调控。4、miR-1182抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迁移我们通过MTT法检测细胞增殖率,MTT结果显示,通过转染miR-1182模拟物上调miR-1182后,SKOV3细胞的细胞增殖率出现降低趋势,相比之下,下调miR-1182反而促进卵巢癌细胞的生长（见图4-1）。在Transwell实验中,我们发现SKOV3细胞的迁移和侵袭能力通过上调miR-1182起到抑制作用。（p<0.05,图4-2,图4-3）。结论:首先实验发现miR-1182在卵巢癌组织、细胞（SKOV3）中的异常表达情况,进而证实hTERT是miR-1182的潜在靶点,hTERT的表达可被miR-1182调节,hTERT受到miR-1182的负调控,从而抑制卵巢癌细胞的增殖和侵袭迁移能力,揭示miR-1182/hTERT轴可能成为诊断和治疗卵巢癌的潜在靶点,为临床提供理论依据。
李金龙[4]（2018）在《肝癌相关标志蛋白电化学检测新方法研究》文中研究表明肝癌相关标志蛋白的检测是肝癌诊断、治疗的重要手段,对肝癌的诊断、转移、治疗、转归有着重要的参考价值。目前对于肝癌相关标志蛋白的检测主要包括胶体金法、酶联免疫吸附法、免疫比浊法和化学发光法等,但这些方法都存在一定的缺陷,如灵敏度较低,操作复杂和需要大型仪器等,这对于肝癌的早期诊断极为不利。电化学检测方法具有快速、灵敏、不需要大型仪器等优点,为肝癌相关标志蛋白的快速、灵敏检测提供了新的平台。本论文中,我们基于纳米材料和酶辅助的信号放大策略提出了一系列肝癌相关标志蛋白电化学检测新方法,实现了肝癌相关标志蛋白的高灵敏、快速检测,并对新方法的各种性能进行了评价。研究工作分为以下几个部分:1.基于银纳米颗粒电位溶出技术的AFP-L3电化学检测新方法研究甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP）是肝癌诊断的重要标志物,然而,AFP特异性并不高,在一些非肝癌疾病,如慢性肝炎、肝硬化患者的血清中也会增高。AFP-L3是AFP的一种异质体,特异性强,对于肝癌的诊断具有重要价值。在这部分工作中,我们基于功能化的银纳米颗粒（AgNPs）和小扁豆凝集素（Lens culinaris agglutinin,LCA）提出了一种AFP-L3电化学检测的新方法,实现了对AFP-L3快速而灵敏的检测。首先,合成生物素化小扁豆凝集素修饰的银纳米颗粒（B-LCA-AgNPs）,借助小扁豆凝集素和AFP-L3之间作用的特异性作用,B-LCA-AgNPs可直接与AFP-L3结合并通过AgNPs产生电化学信号,实现对AFP-L3的检测。与现有的临床检测方法相比,本方法无需对AFP-L3进行分离,大大简化了检测步骤。此外,B-LCA-AgNPs和AFP-L3相互识别后,AgNPs通过亲和素-生物素相互作用可大量沉积在电极表面,从而实现电化学信号的放大,实现了对AFP-L3高灵敏检测。在这项工作中,我们用该方法对人血清样品中AFP-L3进行了检测,结果证明具有良好的特异性和稳定性。以上结果表明,我们构建的AFP-L3电化学检测新方法在肝癌的临床诊断中具有巨大的应用前景。2.基于双功能金纳米颗粒电化学信标的fuc-gp73检测新方法研究高尔基体蛋白73（Golgi protein 73,GP73）在临床上已被广泛应用于肝癌的诊断,其虽然在肝癌患者血清中含量增高,但在慢性肝炎病人、肝硬化病人的血清中含量也有增高的现象,而进一步研究发现,岩藻糖基化的高尔基体蛋白73（fuc-gp73）只在肝细胞癌（HCC）病人的组织中增高,是区分肝癌与其他肝脏疾病一个重要标准。在本部分工作中,我们基于GP73巯基化的适配体和亲和素标记的小扁豆凝集素修饰的金纳米颗粒（A-LCA-AuNPs）提出了一种fuc-gp73电化学检测新方法。AuNPs较大的比表面积,不仅为A-LCA的固定提供了条件,而且实现了 fuc-gp73高灵敏的检测。此外,生物素标记的辣根过氧化物酶（B-HRP）可以通过亲和素-生物素的相互作用修饰在AuNPs表面,因此通过双功能化的AuNPs可以极大提高fuc-gp73分析的灵敏度。我们利用该方法对血清中的fuc-gp73进行了检测,结果显示该方法具有良好的精确性,选择性和重现性,为肝癌的早期、特异性诊断提供了一种新手段。3.基于DNA-G四联体-Hemin的甲基化转移酶1的电化学检测新方法研究研究发现DNA甲基化在肝癌的发生、转移和预后中起着重要作用。在本部分工作中,我们基于尿嘧啶特异性切割试剂（USER）诱导G-四链体脱氧核酶形成提出了一种灵敏的电化学方法实现了对DNA甲基转移酶1（DNMT1）的超灵敏检测。实验中,我们将含有DNMT1的识别序列的双链DNA固定在金电极表面,其中一条链（DNAS1）富含G碱基序列,互补链（DNAS2）含有丰富的胞嘧啶序列和一个甲基化的胞嘧啶,经过DNMT1甲基化后,半甲基化CG识别序列发生甲基化,经过重亚硫酸盐处理后,DNAS2中胞嘧啶转化为尿嘧啶,从而被USER切割,DNA S1中的胞嘧啶因为发生甲基化,无法转化为尿嘧啶,从而避免了 USER的切割,加入K+和Hemin后,形成G-四联体脱氧核酶,从而产生与DNMT1活性成正比的电化学信号。此外,抑制实验研究表明,在160mM的S-腺苷甲硫氨酸的存在下,SGI-1027抑制DNMT1活性的IC50为6 mM,与之前的报道一致。同时该方法能够在复杂的生物样品中有效地检测人DNMT1活性。以上结果表明,我们提出的DNMT1电化学检测方法在DNA甲基化相关的临床实践和生化研究中有较大的应用潜力。4.基于核酸外切酶Ⅲ辅助的端粒酶电化学检测新方法研究研究表明端粒酶的异常表达在肝癌的发生、发展过程中起着关键作用,研究者对肝癌组织中端粒酶活性的研究表明,肝癌中端粒酶的阳性率远远高于慢性肝炎组织、肝硬化组织和癌旁组织,而正常肝组织并没有端粒酶活性。在论文本部分工作中,我们基于功能化的纳米磁珠和核酸外切酶Ⅲ辅助的放大策略构建了一种电化学检测新方法,实现了对肿瘤细胞端粒酶活性的检测。在这一方法中,互补的探针可以与延长的端粒酶引物重复序列杂交,杂交产物通过磁性分离后,端粒酶引物重复序列链被核酸外切酶Ⅲ识别和切割。然后,释放的互补探针能够杂交并打开多个亚甲基蓝（MB）标记的发夹（HP）DNA探针,经过核酸外切酶Ⅲ的二次切割后,互补探针又可以进入下一个与MB标记的发夹样结构杂交的循环,而MB标记的探针与金电极表面的捕获探针结合,从而产生与端粒酶活性呈正比的峰电流值。利用核酸外切酶Ⅲ辅助的循环放大策略,该检测方法能够在单细胞水平检测端粒酶活性。该方法中,端粒酶的延长是在一个匀相的溶液进行的,然后通过磁珠进行分离纯化,能够除去细胞裂解产物中存在的干扰物,避免假阴性结果的产生,为检测实际样本中的端粒酶活性提供了新的思路。此外,为了证明我们提出的方法具有筛选端粒酶抑制剂的潜在应用价值,我们使用该方法成功地检测到端粒酶活性被3叠’-脱氧胸苷抑制,因此我们构建的电化学检测方法为端粒酶检测及端粒酶抑制剂的筛选提供了一种新手段,具有较大的潜在应用价值。5.基于铜离子级联催化信号放大策略的β-连环蛋白电化学检测新方法研究在肝癌中,β-连环蛋白与转录因子相互作用来调控肿瘤远处转移。在论文本部分工作中,我们基于铜离子级联催化信号放大策略提出了一种β-连环蛋白活性电化学检测的新方法。该方法利用多肽的蛋白靶向配体,通过电化学催化交联实现非共价键的分子识别、结合,并通过铜离子的氧化还原产生与β-连环蛋白丰度成比例的信号。此外,铜离子作为催化剂,在电极表面氧化产生电活性的分子可以有效放大电化学信号,实现β-连环蛋白的高灵敏检测,检测限达10pM（信噪比为3:1）。用该方法对临床样本进行检测时,β-连环蛋白的细胞分布、表达与样本的病理分级平行,进一步证明β-连环蛋白在促进肿瘤转移中起着重要作用。以上结果表明,该方法有望作为一种预测肝癌侵袭和转移的潜在工具。6.肝癌微环境中硫酸酯酶活性的电化学分析新方法研究肿瘤的发展、转移与细胞外基质酶活性有着密切的关系。在论文本部分工作中,我们构建了一种硫酸乙酰肝素（Heparan sulfate,HS）的丰度和硫酸化程度,及HS和生长因子的相互作用的电化学检测新方法方法来评估肝癌微环境中硫酸酯酶的活性,并研究了硫酸酯酶在生物环境中对肝癌发展的作用。该方法的构建元件包括一个多肽探针和一个光催化剂（多吡啶钌配合物）,该多肽探针序列来自淀粉样肽,而通过多吡啶钌配合物可以获得更加灵敏的信号输出。通过该方法,我们可以评估HepG2细胞中调控成纤细胞生长因子2（fibroblast growth factor 2,FGF2）介导的细胞增殖的硫酸酯酶2的活性和丰度,也可以评估HS的硫酸化程度及其与生长因子结合的亲和力。最后,我们利用该方法分析了肝癌的临床组织样品,结果显示,可以通过上述研究中的HS生化特征指示肿瘤发展、转移等相关的改变。因此,我们构建的方法对肝癌转移的诊断和预后判断有着重要价值。
李海龙[5]（2015）在《PinX1基因作为肾癌的独立预后因子通过NF-κB/MMP-2信号通路抑制其转移的研究》文中认为目的利用组织芯片研究PinX1基因与肾癌转移及预后的关系;利用体外体内实验研究其在肾癌细胞转移过程中的具体分子机制。方法1.对本实验室已构建完成的具有完整临床资料和随访信息的两套独立的肾癌患者组织芯片（共353例）进行免疫组化染色,并对PinX1染色进行评分,研究PinX1与肾癌临床特征的相关性,探讨其与肾癌转移及预后的关系。利用Cox回归分析判断PinX1是否可作为独立预后因子判断肾癌患者的预后。2.利用PinX1 siRNA及pEGFP-C3-PinX1表达载体转染人肾癌786-O和ACHN细胞,Western Blot检测转染后两株肾癌细胞中PinX1蛋白表达情况,确定PinX1 siRNA及pEGFP-C3-PinX1表达载体的有效性。CCK-8细胞增殖实验检测PinX1基因低表达及高表达对两株肾癌细胞增殖能力的影响。细胞迁移、侵袭实验检测PinX1基因低表达及高表达对肾癌786-O和ACHN细胞迁移、侵袭能力的影响。Western Blot实验检测PinX1基因低表达及高表达对两株肾癌细胞中MMPs及TIMPs蛋白表达的影响;明胶酶谱实验检测PinX1基因低表达及高表达对两株肾癌细胞MMPs活性的影响。为证实PinX1通过MMP-2调节肾癌细胞的转移能力,在PinX1基因低表达的两株肾癌细胞中加入MMP-2外源性抑制剂阻断MMP-2通路,观察阻断MMP-2通路后低表达PinX1对肾癌细胞迁移和侵袭能力的影响。为证实PinX1通过NF-κB通路调节MMP-2的表达及活性进而调控肾癌细胞的转移能力。Western Blot及RT-PCR检测PinX1基因低表达及高表达的两株肾癌细胞中NF-κB p65的蛋白表达及mRNA的表达;Western Blot检测p65的核、浆分布。对肾癌786-O及ACHN细胞同时转染PinX1 siRNA和p65-siRNA与单独转染PinX1 siRNA的细胞相比较,Western Blot检测PinX1低表达或PinX1和p65同时低表达的肾癌细胞中MMP-2表达的变化。迁移、侵袭实验检测PinX1低表达或PinX1和p65同时低表达的肾癌细胞迁移、侵袭能力的变化。3.包装携带PinX1表达基因及PinX1 shRNA的慢病毒及对照病毒,对肾癌786-O细胞进行转染,构建PinX1高、低表达及对照的肾癌稳转细胞系。Western blot鉴定稳转细胞系PinX1蛋白的表达情况。自裸鼠尾静脉注射PinX1高、低表达及对照的肾癌稳转细胞,建立裸鼠肾癌肺转移模型。2月后处死裸鼠,检测肺部转移瘤情况,对转移瘤进行统计、比较。免疫组化检测转移瘤中PinX1、MMP-2、p65的表达情况。结果1.组织芯片染色显示与正常组织及癌旁组织相比肾癌组织中PinX1表达显着降低;研究PinX1的表达与肾癌临床特征的相关性显示:在试验组中PinX1表达水平与肿瘤浸润程度,区域淋巴结转移及TNM分期呈负相关（Two sided Fisher’s exact tests,P值分别为0.018,0.043和0.013）,验证组中PinX1表达水平同样与肿瘤浸润程度,淋巴结转移及TNM分期呈负相关（Two sided Fisher’s exact tests,P值分别为0.001,0.006和0.002）;分析PinX1表达水平与肾癌患者预后的关系显示:PinX1表达水平与术后5年总生存时间及疾病特异性生存时间均呈正相关（Log-rank test,P值均为0.002）。单因素及多因素Cox回归分析提示PinX1可作为判断肾癌患者预后的独立预测分子。2.分别使用PinX1 siRNA和pEGFP-C3-PinX1表达载体转染人肾癌细胞786-O和ACHN后Western Blot实验显示:与对照组相比,转染PinX1 siRNA成功降低786-O和ACHN细胞中PinX1的表达,转染pEGFP-C3-PinX1成功在两株肾癌细胞中高表达PinX1;CCK-8增殖实验显示:PinX1基因低表达和高表达对两株肾癌细胞增殖能力的影响均无统计学意义（P>0.05）;迁移实验显示,PinX1基因的低表达或高表达可显着提升或抑制肾癌细胞的迁移能力（P<0.001）;侵袭实验显示,PinX1基因的低表达或高表达可显着提升或抑制肾癌细胞的侵袭能力（P<0.001）;Western Blot实验显示:PinX1低表达或高表达可增强或降低MMP-2的表达,但MMP-9的表达无明显改变,且PinX1基因低表达和高表达对基质金属蛋白酶特异性内源性抑制剂TIMP-1及TIMP-2的表达均无明显影响;明胶酶谱实验显示:PinX1低表达或高表达可增强或降低MMP-2的活性。以上结果提示PinX1基因可抑制肾癌细胞的迁移、侵袭能力,同时抑制其MMP-2的表达及活性,但其对MMP-2的调节是不依赖与TIMP-2的。利用MMP-2的外源性抑制剂处理经PinX1 siRNA沉默的肾癌细胞,Western Blot实验显示经MMP-2外源性抑制剂处理后,因PinX1被干扰后引起的MMP-2表达的上调被阻断;明胶酶谱实验显示:经MMP-2外源性抑制剂处理后,因PinX1被干扰后引起的MMP-2活性的增加被阻断;迁移、侵袭实验显示:肾癌细胞原本因PinX1干扰而提升的迁移、侵袭能力在MMP-2外源性抑制剂处理后又降回至常规水平（P<0.001）。以上结果提示:PinX1可通过MMP-2调节肾癌细胞的转移能力。Western blot检测PinX1低表达和高表达的两株肾癌细胞中NF-κB p65的表达情况显示:PinX1的低表达或高表达可增强或减弱p65的蛋白表达;RT-PCR结果显示:PinX1的低表达或高表达可增强或减弱p65的mRNA的表达水平;Western blot检测PinX1低表达的两株肾癌细胞中p65发生了明显的核转位。这表明PinX1低表达可以上调p65的转录并增加其核转位,从而激活NF-κB通路的转录活性。NF-κB p65 siRNA与PinX1 siRNA共转染肾癌786-O及ACHN细胞,与PinX1 siRNA单独转染细胞对比,Western blot结果显示:PinX1干扰后MMP-2表达水平上调,而当PinX1和p65双干扰后MMP-2表达又回调至正常水平;迁移、侵袭实验结果显示:PinX1干扰后肾癌细胞的迁移、侵袭能力均明显增加（P<0.001）,而当PinX1和p65双干扰后细胞的迁移、侵袭能力又回调至正常水平（P<0.001）。以上结果进一步提示PinX1可通过NF-κB/MMP-2信号通路调节肾癌细胞的迁移、侵袭能力。3.包装携带PinX1表达基因或PinX1 shRNA的慢病毒,对肾癌786-O细胞进行转染,构建PinX1高表达及低表达的肾癌稳转细胞系。Western blot结果显示:PinX1高、低表达的肾癌稳转细胞系成功过表达或敲减了PinX1。裸鼠肾癌肺转移模型建立2月后,处死并解剖裸鼠,肺组织石蜡切片H&E染色显示:肺部新生结节为肾癌转移瘤;对各组肺部转移结节进行统计,结果显示:PinX1低表达组的裸鼠肺转移结节数明显多于PinX1高表达组及对照组,且各组间均存在显着差异（χ2 test,P<0.001）;免疫组化显示:PinX1高表达或低表达组的转移瘤中MMP-2及p65同时呈低表达或高表达,且TIMP-2的表达无明显变化。以上结果进一步在体内验证了PinX1通过NF-κB/MMP-2信号通路调节肾癌细胞转移能力的机制。结论综上所述,我们在该研究中得出的结论是:与正常肾组织及癌旁组织相比肿瘤组织中PinX1表达降低,且其降低与淋巴结转移,肿瘤TNM分期及患者预后不良高度相关,Cox回归分析提示PinX1可作为独立预测分子判断肾癌患者的预后。体内及体外实验证实,PinX1可通过NF-κB/MMP-2信号通路调节肾癌细胞的转移能力。我们的工作对以后研究PinX1在肿瘤转移中的作用提供了重要的线索,并有望为肾癌的分子诊断和基因治疗提供新的靶点。
张汉英,黎丹戎,李力,张利,王喜文,曹月华,曾映琼,王洁[6]（2013）在《端粒酶与卵巢上皮性癌化疗的相关性研究》文中研究指明目的检测卵巢上皮性癌患者化疗前后端粒酶活性的变化,探讨以顺铂为主的联合化疗对卵巢癌端粒酶活性的抑制作用。方法 43例原发性卵巢上皮性癌患者行首次卵巢癌细胞减灭+淋巴结清扫术,采用TRAP-PCR-银染法测定癌组织的端粒酶活性;RT-PCR法测定hTERT基因的表达;抗生素-生物素过氧化酶复合物（SP）免疫组化法检测hTERT蛋白的表达。术后予顺铂+环磷酰胺（A组）、顺铂+紫杉醇（B组）、顺铂+环磷酰胺+多柔比星（C组）全身化疗6.5（68）个疗程,选取临床检查和影像学检查未发现肿瘤残存、血液CA125水平在正常范围者30例（A组13例,B组11例,C组6例）行二次探查术,术中取原病灶周围组织活检,测定其端粒酶活性、hTERT基因及其蛋白的表达变化。随访3组患者的5年生存率。结果 43例卵巢上皮性癌患者化疗前端粒酶活性的高低与病理类型、病理分级、FIGO分期无关,差异无统计学意义（P>0.05）。化疗后3组化疗方案均有下调端粒酶活性的作用,化疗前后端粒酶活性阳性率分别为88.37%、36.67%,差异有统计学意义（P<0.05）,其中B组下调端粒酶hTERT蛋白的表达较明显（P<0.05）。化疗后hTERT蛋白的表达较化疗前明显下调（P<0.05）,但患者5年生存率无明显提高（P>0.05）。结论卵巢上皮性癌以顺铂为主的联合化疗具有抑制端粒酶活性的作用,顺铂+紫杉醇化疗后端粒酶活性下调明显,但未能提高患者5年生存率,可能与化疗药物的耐药性有关。
段洁[7]（2012）在《卵巢癌脱落细胞端粒酶活性检测在预测早期复发的价值研究》文中研究表明目的：采用银染PCR法对上皮性卵巢癌手术及规范化疗后处于随访阶段的患者进行腹腔灌洗液脱落细胞端粒酶活性检测,探讨端粒酶活性检测用于卵巢癌早期复发预测的价值。方法：收集20例上皮性卵巢癌手术及规范化疗后处于随访阶段的患者腹腔灌洗液标本,应用银染TRAP法检测灌洗液中脱落细胞端粒酶活性,并将检测结果与血清CA125结果做比较。结果：①在20例上皮性卵巢癌手术及规范化疗后处于随访阶段的患者腹腔灌洗液标本中,端粒酶活性检测阳性者12例（60%）,而该20例患者血清CA125测定无一例阳性。因此腹腔灌洗液脱落细胞端粒酶活性检测阳性率明显高于血清CA125（p<0.05）。②12例检测出端粒酶活性者于化疗结束后6个月到9个月之间检测出者比例为41.67%,于化疗结束后9个月到12个月之间检测出者比例为58.33%,端粒酶活性检出率对于处于化疗结束后6个月到9个月之间和处于化疗结束后9个月到12个月之间进行检测没有显着差异（p>0.05）。③Ⅰ期、Ⅱ期共7例病例中端粒酶阳性率28.57%,Ⅲ期13例病例中端粒酶阳性率76.92%,端粒酶活性检测阳性率Ⅲ期患者明显高于Ⅰ、Ⅱ期患者（p<0.05）。④12例浆液性囊腺癌端粒酶阳性率58.33%,3例黏液性囊腺癌端粒酶阳性率66.66%,5例卵巢子宫内膜样癌端粒酶阳性率60%,端粒酶活性表达在上皮性卵巢癌组织学类型上无显着差异（p>0.05）结论：腹腔灌洗液脱落细胞端粒酶活性检测可能在预测卵巢癌早期复发方面有重要价值,且端粒酶活性检出率与卵巢癌术前临床分期呈正相关。
李艳,佟玲霞,李立安,李红霞[8]（2012）在《卵巢肿瘤组织中端粒酶活性的表达》文中研究说明目的分析端粒酶活性在卵巢肿瘤中的表达,探讨端粒酶活性作为卵巢肿瘤诊断肿瘤标记物的意义。方法取冰冻肿瘤组织,采用端粒重复序列扩增法（Telomeric Repeat Amplication Protocol）,结合银染,共测定了27例卵巢癌、5例良性卵巢肿瘤、22例卵巢癌癌旁组织以及12例正常卵巢组织中端粒酶活性,并分析其与组织分级、FIGO分期、病理类型以及有无转移的关系。PCR产物以采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,以出现特征性的6-bp间隔的特征性阶梯状条带为阳性。出现>100bp的条带为强阳性,出现<99bp的条带为中低阳性。结果本实验共对66份标本进行了检测,12例正常卵巢组织中,仅有2例表达端粒酶活性;5例卵巢良性肿瘤中,1例表达端粒酶弱阳性。27例卵巢恶性肿瘤标本中,有23例表达端粒酶活性（其中强阳性16例）;在检测的22例卵巢上皮癌的癌旁组织中,有12例表达端粒酶弱阳性。卵巢恶性肿瘤的端粒酶活性表达阳性率显着高于卵巢良性肿瘤（P=0.0090）和正常卵巢（P=0.0000）。Ⅰ-Ⅱ期患者端粒酶活性阳性率71%,Ⅲ-Ⅳ期患者端粒酶活性阳性率90%（P=0.269）。而强阳性率Ⅲ-Ⅳ期明显高于Ⅰ-Ⅱ期（P=0.009）。在肿瘤类型和组织学分级中,端粒酶阳性表达率均没有显着差异。结论在卵巢恶性肿瘤组织中端粒酶活性有较高的表达率;早期和晚期卵巢肿瘤组织中端粒酶活性阳性率没有明显差异,但晚期卵巢肿瘤组织中的端粒酶活性程度较高;端粒酶活性有可能作为早期诊断卵巢肿瘤的标记物之一,并可以作为卵巢肿瘤判断预后的指标。
张馥彬,信涛,隋丽华[9]（2009）在《卵巢癌组织中Bmi-1蛋白的表达与端粒酶活性的关系》文中认为目的通过检测癌基因Bmi-1在卵巢上皮癌中表达情况,探讨其与端粒酶活性的关系。方法①使用Realtime-PCR的方法检测47例卵巢上皮癌组织中Bmi-1基因的mRNA表达情况;②采用免疫组化SP法检测47例卵巢上皮癌组织中Bmi-1蛋白的表达;③改良端粒重复序列扩增技术（telomerase repeatamplification protocol）——TRAP-银染技术检测该47例卵巢上皮癌组织中端粒酶基因水平;④WesternBlot检测卵巢上皮癌组织中端粒酶蛋白表达量。结果①Bmi-1蛋白在卵巢上皮癌组织中较正常组织有明显表达（P<0.05）,并且与病理分级和临床分期有关,G3级阳性表达率（93.10%）高于G2级（61.11%）,Ⅱ期、Ⅲ期阳性表达率（66.67%）低于Ⅳ期（92.31%）,二者均有统计学差异（P<0.05）。②卵巢上皮癌组织中端粒酶活性阳性检测率为87.23%（41/47）,正常组织中阴性表达;③端粒酶活性阳性标本中Bmi-1蛋白高表达,占90.24%,Spearman相关性分析显示Bmi-1蛋白表达与端粒酶活性阳性率呈正相关（P<0.05）。结论Bmi-1基因和蛋白在卵巢上皮癌组织中高表达,其表达率与组织学分级和临床期别相关;Bmi-1阳性率与端粒酶活性阳性率密切相关,其在卵巢癌的发病过程中可能有重要意义,值得进一步研究。
江希萍,郭彩霞,杨伟文[10]（2007）在《端粒酶联合CA125检测在上皮性卵巢癌诊断中的价值》文中提出目的探讨端粒酶定量检测联合血清CA125测定在上皮性卵巢癌诊断中的临床意义。方法采用RTQ-PCR法（实时定量端粒重复扩增PCR法）定量检测卵巢上皮性癌组织20例、良性卵巢肿瘤组织5例、12例正常卵巢组织中的端粒酶活性,同时以放免法检测其血清CA125值。结果上皮性卵巢癌Ⅰ～Ⅱ期患者的端粒酶值（197.10±28.20）明显高于Ⅲ～Ⅳ期患者（347.14±60.10）（P<0.05）;而与肿瘤组织学分类无关（P>0.05）;患者血清CA125水平则与病理类型有关,浆液性囊腺癌组高于黏液性囊腺癌组（P<0.05）,而其与临床分期无相关性（P>0.05）。结论端粒酶定量检测联合血清CA125测定有助于卵巢癌的诊断及预后监测。
二、卵巢癌组织中端粒酶活性的测定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、卵巢癌组织中端粒酶活性的测定（论文提纲范文）
（1）TNKS1通过Wnt/β-catenin信号通路调控卵巢癌发生发展的作用与机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1. 卵巢癌临床研究概况 |
| 1.1 卵巢癌发病流行病学研究进展 |
| 1.2 卵巢癌诊断研究进展 |
| 1.3 卵巢癌治疗研究进展 |
| 2. TNKS研究背景 |
| 2.1 TNKS生物学特性 |
| 2.2 TNKS生物学功能 |
| 2.3 TNKS1介导Wnt通路与恶性肿瘤关系的研究进展 |
| 3. 研究内容和科学意义 |
| 3.1 研究内容 |
| 3.2 科学意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 临床标本 |
| 1.2 细胞系 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 试剂与配置 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 TNKS1敲低细胞模型建立 |
| 2.3 免疫组织化学染色 |
| 2.4 实时荧光定量 |
| 2.5 免疫印迹(Western blot)检测 |
| 2.6 细胞生长实验(MTS) |
| 2.7 细胞集落形成实验 |
| 2.8 细胞迁移与侵袭实验 |
| 2.9 流式细胞学 |
| 2.10 葡萄糖摄取实验 |
| 2.11 乳酸分泌实验 |
| 2.12 细胞ATP检测 |
| 2.13 双荧光素酶报告基因分析 |
| 2.14 裸鼠皮下移植瘤实验 |
| 2.15 统计分析 |
| 第三章 结果 |
| 1. TNKS1在卵巢癌组织的表达及其临床意义 |
| 1.1 网络数据库TNKS在卵巢癌中的表达 |
| 1.2 临床资料 |
| 1.3 TNKS1在卵巢癌组织中的表达 |
| 1.4 TNKS1在卵巢癌组织中高表达的临床意义 |
| 2. TNKS1促进卵巢癌细胞的体内外增殖 |
| 2.1 TNKS1敲低细胞模型建立 |
| 2.2 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞体外生长的影响 |
| 2.3 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞周期的影响 |
| 2.4 敲低TNKS1对卵巢癌细胞体内成瘤的影响 |
| 3. TNKS1与卵巢癌耐药性的关系 |
| 3.1 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞药物敏感性的影响 |
| 3.2 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞凋亡的影响 |
| 4. TNKS1促进卵巢癌细胞的迁移与侵袭 |
| 4.1 细胞划痕修复法检测TNKS1对卵巢癌细胞迁移的影响 |
| 4.2 转移小室法检测TNKS1对卵巢癌细胞迁移与侵袭的影响 |
| 5. TNKS1促进卵巢癌细胞的有氧糖酵解 |
| 5.1 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞葡萄糖摄取的影响 |
| 5.2 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞乳酸分泌的影响 |
| 5.3 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞ATP生成的影响 |
| 5.4 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞耗氧率的影响 |
| 6. TNKS1通过调控PC表达介导卵巢癌细胞有氧糖酵解 |
| 6.1 抑制或敲低TNKS1对卵巢癌细胞丙酮酸羧化酶表达的影响 |
| 6.2 TNKS1通过PC介导卵巢癌细胞有氧糖酵解 |
| 7. TNKS1通过激活Wnt/β-catenin/snail信号通路调控卵巢癌发生发展 |
| 7.1 敲低或抑制TNKS1显着抑制Wnt/β-catenin信号通路 |
| 7.2 TNKS1对Wnt/β-catenin信号通路多个靶基因的调控 |
| 7.3 TNKS1通过调控Snail表达而影响PC的表达 |
| 8. TNKS1与Snail、PC蛋白在临床组织表达的相关性分析 |
| 第四章 讨论 |
| 1. TNKSI在卵巢癌中高表达及其临床意义 |
| 2. TNKS1促进卵巢癌细胞快速增殖 |
| 3. TNKS1介导卵巢癌细胞耐药性产生 |
| 4. TNKS1促进卵巢癌细胞转移 |
| 5. TNKS1促进卵巢癌细胞有氧糖酵解 |
| 6. TNKS1调控卵巢癌发生发展的分子机制 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录 主要缩略语表 |
| 博士期间科研成果 |
| 致谢 |
（2）NF-κB和端粒酶启动的肿瘤基因治疗新技术研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 NF-κB在癌症治疗中的应用 |
| 1.1.1 NF-κB的生物学特性 |
| 1.1.2 NF-κB的结合靶点和靶基因 |
| 1.1.3 NF-κB与肿瘤 |
| 1.2 基因编辑技术用于癌症治疗 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas9 系统介导的基因编辑技术 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas9 系统在癌症研究中的应用 |
| 1.3 端粒酶与癌症 |
| 1.3.1 端粒和端粒酶 |
| 1.3.2 端粒酶在癌症治疗中的应用 |
| 1.4 癌症干细胞 |
| 1.4.1 CSC的生物学特性 |
| 1.4.2 CSC的分离与鉴定 |
| 1.4.3 NF-κB与 CSC |
| 1.5 本论文研究内容及意义 |
| 第二章 人肝癌细胞中NF-κB结合靶点和靶基因的鉴定及其应用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 主要试验材料 |
| 2.2.2 主要试验仪器 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 细胞siRNA干扰 |
| 2.3.2 RNA-seq和数据分析 |
| 2.3.3 染色质免疫沉淀(ChIP) |
| 2.3.4 Ch IP-seq和数据分析 |
| 2.3.5 RT-qPCR |
| 2.3.6 Ch IP-qPCR |
| 2.3.7 数据分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 NF-κB结合区域鉴定 |
| 2.4.2 增强子区NF-κB的结合 |
| 2.4.3 NF-κB差异表达基因鉴定 |
| 2.4.4 NF-κB直接靶基因鉴定 |
| 2.4.5 细胞特异性NF-κB直接靶基因 |
| 2.4.6 NF-κB直接靶基因GO分析 |
| 2.4.7 NF-κB直接靶基因KEGG分析 |
| 2.4.8 编码分泌蛋白的NF-κB直接靶基因鉴定 |
| 2.4.9 qPCR检测 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 NF-κB激活的肿瘤细胞特异性基因疗法及其应用研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 主要试验材料 |
| 3.2.2 主要试验仪器 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 载体构建 |
| 3.3.2 细胞培养和转染 |
| 3.3.3 Western blotting |
| 3.3.4 细胞增殖能力测定 |
| 3.3.5 相对端粒长度检测 |
| 3.3.6 病毒包装和纯化 |
| 3.3.7 病毒滴度测定 |
| 3.3.8 病毒感染 |
| 3.3.9 动物实验 |
| 3.3.10 qPCR检测 |
| 3.3.11 数据分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 不同细胞系中NF-κB蛋白表达检测 |
| 3.4.2 Nage载体特异性验证 |
| 3.4.3 Nage载体杀灭肿瘤细胞 |
| 3.4.4 相对端粒长度检测 |
| 3.4.5 rAAV-Nage载体杀灭肿瘤细胞 |
| 3.4.6 Nage载体体内肿瘤治疗 |
| 3.4.7 qPCR和 Western blotting检测 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 端粒酶激活的肿瘤基因疗法及其应用研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.2.1 主要试验材料 |
| 4.2.2 主要试验仪器 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 载体构建 |
| 4.3.2 细胞培养和转染 |
| 4.3.3 细胞活力和增值能力测定 |
| 4.3.4 端粒合成检测 |
| 4.3.5 相对端粒长度检测 |
| 4.3.6 病毒包装和滴度测定 |
| 4.3.7 病毒感染 |
| 4.3.8 动物实验 |
| 4.3.9 qPCR检测 |
| 4.3.10 数据分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 Tage系统特异性验证 |
| 4.4.2 细胞内端粒合成验证 |
| 4.4.3 Tage系统杀灭肿瘤细胞 |
| 4.4.4 相对端粒长度检测 |
| 4.4.5 四碱基粘性末端Tage系统验证 |
| 4.4.6 HO酶在Tage系统中的应用 |
| 4.4.7 Tage系统优化 |
| 4.4.8 rAAV-Tage系统杀灭肿瘤细胞 |
| 4.4.9 Tage系统体内肿瘤治疗 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 肿瘤干细胞基因治疗载体的构建及其应用研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.2.1 主要试验材料 |
| 5.2.2 主要试验仪器 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 载体构建 |
| 5.3.2 细胞培养和转染 |
| 5.3.3 病毒包装和滴度测定 |
| 5.3.4 病毒感染 |
| 5.3.5 细胞活力测定 |
| 5.3.6 RT-qPCR检测 |
| 5.3.7 数据分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 Tage系统和Nage载体杀灭肿瘤细胞 |
| 5.4.2 Tage系统和Nage载体连续杀灭Hep G2 细胞 |
| 5.4.3 动态观察和检测残存细胞 |
| 5.4.4 rAAV杀灭残存细胞 |
| 5.4.5 rAAV-mi R533 杀灭CSC |
| 5.4.6 rAAV杀灭急性白血病细胞 |
| 5.4.7 AML CSC标志基因q PCR检测 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 个人履历 |
| 攻读博士学位期间参与的科研项目 |
| 攻读博士学位期间学术成果 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 致谢 |
（3）miR-1182通过靶向hTERT抑制卵巢癌的转移和增殖（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分: miR-1182在卵巢癌组织、细胞中的表达情况及其意义 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第二部分: miR-1182在卵巢癌组织、细胞中靶基因的研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第三部分: 卵巢癌细胞中miR-1182和靶基因hTERT的相关性 |
| 1 前言 |
| 2 实验试剂 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 第四部分: miR-1182抑制卵巢癌细胞的增殖和转移 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文和其他相关成果 |
| 致谢 |
（4）肝癌相关标志蛋白电化学检测新方法研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 绪论 |
| 1 肝癌相关标志蛋白的临床意义及检测方法 |
| 1.1 肝癌相关标志蛋白体外诊断的临床意义 |
| 1.2 肝癌相关标志蛋白检测的免疫学方法 |
| 1.2.1 免疫电泳技术 |
| 1.2.2 放射免疫技术 |
| 1.2.3 荧光免疫技术 |
| 1.2.4 酶免疫技术 |
| 1.2.5 化学发光免疫分析技术 |
| 2 电化学生物传感技术及其在肿瘤标志蛋白检测中的应用 |
| 2.1 电化学生物传感技术概述 |
| 2.1.1 循环伏安法 |
| 2.1.2 交流阻抗法 |
| 2.1.3 差分脉冲伏安法 |
| 2.1.4 方波伏安法 |
| 2.2 电化学生物传感技术在肿瘤标志蛋白检测中的应用 |
| 3 信号放大策略在电化学生物传感技术中的应用 |
| 3.1 基于纳米材料的信号放大策略 |
| 3.1.1 金纳米颗粒 |
| 3.1.2 银纳米颗粒 |
| 3.1.3 碳纳米管 |
| 3.1.4 磁性微球 |
| 3.1.5 石墨烯 |
| 3.1.6 量子点 |
| 3.2 基于酶催化的信号放大策略 |
| 3.2.1 具有催化活性的蛋白酶 |
| 3.2.2 具有催化活性的核酶 |
| 3.2.3 具有剪切活性的蛋白酶 |
| 3.2.4 具有剪切活性的核酶 |
| 4. 本论文的主要研究内容 |
| 5. 参考文献 |
| 第一章 基于银纳米颗粒电位溶出技术的AFP-L3电化学检测新方法研究 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 实验部分 |
| 1.2.1 实验试剂和仪器 |
| 1.2.2 B-LCA修饰纳米银的制备 |
| 1.2.3 玻碳电极的处理和修饰 |
| 1.2.4 AFP-L3的检测 |
| 1.2.5 电化学测量 |
| 1.3 结果与讨论 |
| 1.3.1 实验原理 |
| 1.3.2 B-LCA-GSH-AgNPs的表征 |
| 1.3.3 电极修饰过程的表征 |
| 1.3.4 信号放大策略验证 |
| 1.3.5 实验条件优化 |
| 1.3.6 检测性能研究 |
| 1.3.7 检测方法的特异性,重复性和稳定性研究 |
| 1.3.8 血清样本中AFP-L3的分析 |
| 1.4 结论 |
| 1.5 参考文献 |
| 第二章 基于双功能金纳米颗粒电化学信标的fuc-gp73检测新方法研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验试剂和仪器 |
| 2.2.2 HRP/LCA/AuNPs的制备 |
| 2.2.3 金电极的处理和修饰 |
| 2.2.4 Fuc-gp73的检测 |
| 2.2.5 电化学测量 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 实验原理 |
| 2.3.2 所制备的B-LCA-GSH-AuNPs的特征 |
| 2.3.3 电极修饰过程的表征 |
| 2.3.4 实验条件优化 |
| 2.3.5 检测性能研究 |
| 2.3.6 检测方法的重复性、稳定性和特异性研究 |
| 2.3.7 血清样本中fuc-gp73的分析 |
| 2.4 结论 |
| 2.5 参考文献 |
| 第三章 基于DNA-G四联体-Hemin的甲基化转移酶1的电化学检测新方法研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验试剂和仪器 |
| 3.2.2 细胞培养和蛋白提取 |
| 3.2.3 DNA固定和杂交 |
| 3.2.4 DNA甲基化 |
| 3.2.5 USER切割和G-四联体的形成 |
| 3.2.6 DNMT1活性抑制实验 |
| 3.2.7 电化学测量 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 实验原理 |
| 3.3.2 电极修饰过程的表征 |
| 3.3.3 DNA甲基化的检测可行性分析 |
| 3.3.4 实验条件优化 |
| 3.3.5 检测性能研究 |
| 3.3.6 检测方法的重复性和特异性研究 |
| 3.3.7 复杂生物样品中DNMT1的分析 |
| 3.3.8 DNMT1活性的抑制实验研究 |
| 3.4 结论 |
| 3.5 参考文献 |
| 第四章 基于核酸外切酶Ⅲ辅助的端粒酶电化学检测新方法研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验试剂和仪器 |
| 4.2.2 细胞培养及端粒酶的提取 |
| 4.2.3 金电极处理和DNA的固定 |
| 4.2.4 端粒酶活性的电化学检测 |
| 4.2.5 电化学测量 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 实验原理 |
| 4.3.2 端粒酶活性测定的可行性分析 |
| 4.3.3 细胞中提取的端粒酶的验证 |
| 4.3.4 电极修饰过程的表征 |
| 4.3.5 实验条件优化 |
| 4.3.6 检测性能研究 |
| 4.3.7 检测方法特异性研究 |
| 4.4 结论 |
| 4.5 参考文献 |
| 第五章 基于铜离子级联催化信号放大策略的β-连环蛋白电化学检测新方法研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 实验试剂和仪器 |
| 5.2.2 金电极的预处理和修饰 |
| 5.2.3 β-连环蛋白的检测 |
| 5.2.4 实验测量 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 实验原理 |
| 5.3.2 原理验证 |
| 5.3.3 实验条件优化 |
| 5.3.4 检测性能研究 |
| 5.3.5 检测方法特异性研究 |
| 5.3.6 不同细胞系β-连环蛋白的检测 |
| 5.3.7 临床样本中β-连环蛋白的检测 |
| 5.4 结论 |
| 5.5 参考文献 |
| 第六章 肝癌微环境中硫酸酯酶活性的电化学分析新方法研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验部分 |
| 6.2.1 实验试剂和仪器 |
| 6.2.2 玻碳电极的预处理和修饰 |
| 6.2.3 HS浓度、硫酸化及其与生长因子多肽的相互作用检测 |
| 6.2.4 电化学测量 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 实验原理 |
| 6.3.2 实验条件优化 |
| 6.3.3 检测性能研究 |
| 6.3.4 组织样本中HS的丰度、HS的硫酸化的研究 |
| 6.4 结论 |
| 6.5 参考文献 |
| 全文总结与展望 |
| 附录 |
| 致谢 |
（5）PinX1基因作为肾癌的独立预后因子通过NF-κB/MMP-2信号通路抑制其转移的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 统计学处理 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| PinX1:位于人染色体8p23上的单倍体不足抑癌基因 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表学术论文 |
| 致谢 |
（6）端粒酶与卵巢上皮性癌化疗的相关性研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 临床资料 |
| 1.2 治疗方法 |
| 1.3 端粒酶活性的测定 |
| 1.4 h TERT基因及蛋白的检测 |
| 1.5 免疫组化判断 |
| 1.6 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 卵巢上皮性癌组织端粒酶活性的表达 |
| 2.2 卵巢上皮性癌组织端粒酶h TERT基因的表达 |
| 2.3 肿瘤组织病理学观察 |
| 2.4 h TERT蛋白的表达 |
| 2.5 化疗前肿瘤组织端粒酶活性、h TERT基因及其蛋白的表达 |
| 2.6 化疗后行二探术患者原病灶周围活检组织端粒酶活性、h TERT基因及其蛋白的表达 |
| 2.7 卵巢上皮性癌化疗前后端粒酶活性、h TERT蛋白表达的比较 |
| 2.8 卵巢上皮性癌化疗后行二探术患者的5年生存率 |
| 3 讨论 |
（7）卵巢癌脱落细胞端粒酶活性检测在预测早期复发的价值研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 材料 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 研究对象选择标准 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2. 研究方法 |
| 2.1 标本采集及处理 |
| 2.2 端粒酶重复序列扩增(TRAP) |
| 2.3 ELISA法检测端粒酶活性 |
| 2.4 银染法检测端粒酶活性 |
| 2.5 统计学处理 |
| 结果 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）卵巢肿瘤组织中端粒酶活性的表达（论文提纲范文）
| 资料与方法 |
| 一、标本来源 |
| 二、实验方法 |
| 1.引物设计 |
| 2.端粒酶活性的检测 |
| 3.端粒酶活性判断标准 |
| 4.统计学分析 |
| 结 果 |
| 一、端粒酶活性在正常卵巢及不同类型的卵巢肿瘤组织中的表达 |
| 二、端粒酶活性表达与肿瘤临床分期 (FIGO分期) 之间的关系 |
| 三、端粒酶活性与肿瘤类型之间的关系 |
| 四、端粒酶活性与肿瘤分化程度之间的关系 |
| 讨 论 |
四、卵巢癌组织中端粒酶活性的测定（论文参考文献）
- [1]TNKS1通过Wnt/β-catenin信号通路调控卵巢癌发生发展的作用与机制[D]. 杨宏毅. 南方医科大学, 2020(01)
- [2]NF-κB和端粒酶启动的肿瘤基因治疗新技术研究[D]. 戴薇. 东南大学, 2019(01)
- [3]miR-1182通过靶向hTERT抑制卵巢癌的转移和增殖[D]. 侯小赛. 武汉大学, 2018(01)
- [4]肝癌相关标志蛋白电化学检测新方法研究[D]. 李金龙. 南京大学, 2018(01)
- [5]PinX1基因作为肾癌的独立预后因子通过NF-κB/MMP-2信号通路抑制其转移的研究[D]. 李海龙. 南京医科大学, 2015(05)
- [6]端粒酶与卵巢上皮性癌化疗的相关性研究[J]. 张汉英,黎丹戎,李力,张利,王喜文,曹月华,曾映琼,王洁. 中国癌症防治杂志, 2013(03)
- [7]卵巢癌脱落细胞端粒酶活性检测在预测早期复发的价值研究[D]. 段洁. 遵义医学院, 2012(04)
- [8]卵巢肿瘤组织中端粒酶活性的表达[J]. 李艳,佟玲霞,李立安,李红霞. 中国优生与遗传杂志, 2012(03)
- [9]卵巢癌组织中Bmi-1蛋白的表达与端粒酶活性的关系[J]. 张馥彬,信涛,隋丽华. 国际免疫学杂志, 2009(06)
- [10]端粒酶联合CA125检测在上皮性卵巢癌诊断中的价值[J]. 江希萍,郭彩霞,杨伟文. 苏州大学学报(医学版), 2007(01)