一、NDV感染体外诱导胃癌细胞BGC-823的凋亡（论文文献综述）
王旭[1]（2021）在《GCS参与调控维拉帕米逆转胃癌化疗多药耐药的作用研究》文中认为研究背景:胃癌（gastric carcinoma）是消化系统最为常见的恶性肿瘤之一,其起源于胃腔内的粘膜上皮组织。据2021年资料数字统计,去年全球范围内新确诊胃癌的患者高达108万例,占比5.6%,位居第5位,因罹患胃癌而死亡的患者累计有76万例,高居恶性肿瘤死亡排行榜第4位。据2020年中国癌症年报统计,我国胃癌新发病几率和死亡人数均高居第三位。早期胃癌患者因无明显的症状通常被忽略,其具有隐蔽性且无特异性,可时隐时现,也可长期存在,等出现不适症状时就诊已确诊进展期,这也和由我国医学卫生资源的分配不平衡且癌症普查率较低有着密切关系,此时罹患胃癌的患者遗憾地错过了最佳的手术根治时机,临床上针对进展期胃癌患者则采用化学治疗、放射治疗、生物靶向精准治疗等综合治疗。同时由于胃癌对放疗的不敏感,而且放疗产生较多的副作用限制了放疗的使用,内科多线综合化疗已然成为治疗中晚期胃癌的主要手段之一,希望能以此延长患者的生命周期,提高患者的生活质量。对于早期胃癌患者,即使有机会行根治性手术,大约有80%的早期胃癌患者在手术根治治疗后的3年内出现局灶复发或远处脏器侵袭转移,其5年生存率低于30%。而中晚期胃癌的首选治疗方案是内科综合化疗,国内外多项研究表明:肿瘤多药耐药（multi drug resistance,MDR）是造成肿瘤内科化疗无效的关键因素。肿瘤多药耐药是指肿瘤细胞在一种抗癌药物治疗后所产生的耐药性,后期该肿瘤细胞对其它未曾接触过的、作用机制及分子结构完全不同的其它抗癌药物也同时产生交叉耐药的一种现象。肿瘤多药耐药分为天然耐药和获得性耐药。多因素共同导致的胃癌细胞对抗癌药物产生耐药性是当下治疗中晚期胃癌患者十分突出的问题。因此,如何克服肿瘤细胞的多药耐药,更进一步提高抗癌药物的疗效已然成为目前治疗肿瘤亟待解决的问题,进一步深入的研究胃癌细胞耐药所产生的分子机制、寻求能运用于临床的药物及方法,是研究胃癌治疗的重要契点。随着多种用于临床治疗的手段不断被发明和发展,特别是针对肿瘤治疗的方式也日益丰富,除手术、化疗、放疗外,新型的介入治疗学使肿瘤患者在整个治疗过程中受益。靶动脉灌注化疗是联合穿刺、插管,在X线引导下将导管精准地选择性插入瘤灶的供血靶动脉内,通过DSA对病灶的部位、数量、形态等进行分析、诊断后,将高浓度的抗癌药物通过导管精准地直接灌注于瘤体,而除瘤体外其它组织器官药物浓度低,极大地降低全身副反应。从19世纪80年代开始,有研究者开始尝试使用通过靶动脉精准局部灌注化疗药物以此来治疗食道恶性肿瘤,研究发现通过靶动脉灌注化疗药物的治疗方法能够显着提高抗癌治疗疗效,且副反应明显小于传统化疗。维拉帕米（Verapamil,VER）是一类Ca2+通道阻滞剂,是治疗心脏病的常见药物,同时维拉帕米也是早期发现的可以通过改变细胞内药物浓度从而降低肿瘤耐药性的药物。既往研究认为VER主要是通过抑制P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）的表达及活性来实现抗肿瘤多药耐药的,然而,近来多数研究发现VER还可通过其他非经典途径来增加其抗耐药性。体外实验表明,VER对多数肿瘤细胞具有抗耐药性,且有效作用浓度为6.0～10.0 μmol/L,但静脉用VER的安全浓度为1.0～2.0 μmoL/L,超出此范围则会导致心率下降、血压下降、房室传导阻滞等严重的不良反应,导致VER作为肿瘤耐药逆转剂不能在临床治疗晚期恶性肿瘤中广泛应用。本课题组通过前期犬实验证实,当VER在组织浓度是外周静脉血浓度的50-100倍时,VER能成功逆转肝恶性肿瘤的多药耐药,且实验犬未发生不良的心血管反应。本研究采用靶动脉灌注VER联合静脉应用抗癌药物治疗中晚期胃癌患者,结果表明能显着提高治疗疗效,但仍有近30%的患者治疗效果不理想。因此,寻找VER逆转肿瘤细胞耐药的关键基因,以期增强其疗效成为亟待解决的问题。有学者提出寻找凋亡相关因子,并验证其为肿瘤细胞多药耐药的新靶点。研究表明,抗凋亡基因Bcl-2在肿瘤耐药形成过程中表达量明显增高,导致肿瘤细胞的多药耐药。这些基因相互作用调控细胞的凋亡程序的同时,也在细胞耐药中也有一定影响。葡萄糖神经酰胺合成酶（glucosylcemmide synthase,GCS）是神经酰胺代谢合成葡糖脑苷脂的关键酶,其活性增高可导致肿瘤细胞获得性多药耐药的产生。本团队前期研究表明VER能够逆转部分晚期恶性肿瘤细胞的多药耐药。本研究通过筛选出有效预测VER逆转化疗耐药能力的个体差异的分子标志物,将为TACE+VER联合使用提供临床疗效预测手段和理论依据,对于完善VER个体化治疗有着重要意义。本课题组前期研究通过实时荧光定量PCR及Western blotting实验表明化疗联合VER通过抑制Bcl-2表达及活性从而促进恶性肿瘤细胞的凋亡、增强细胞对化疗敏感性,但其中的具体作用机制有待进一步深入研究,旨在寻找与VER逆转恶性肿瘤细胞耐药的关键基因,为靶动脉灌注VER治疗胃恶性肿瘤提供理论依据。第一章胃癌细胞hMDR1/P-gp表达水平与维拉帕米逆转化疗耐药能力相关性研究目的:探讨在胃癌细胞株中,hMDR1/P-gp水平与VER抗耐药能力差异的相关性。方法:1.实时荧光定量PCR和Western blot方法分别检测hMDR1/P-gp在3株胃癌细胞株（差分化人胃癌细胞株AGS、低分化人胃癌细胞株BGC-823和中分化人胃癌细胞株SGC-7901）中表达水平;2.CCK-8法分别检测不同胃癌细胞株对抗癌药物（5-Fu、ADM、DDP）的敏感性;3.CCK-8法分别检测胃癌细胞株对VER联合上述3种抗癌药物的药物敏感性;4.VER逆转胃癌化疗耐药能力的判断。结果:1.hMDR1/P-gp在基因和蛋白层面的表达水平在不同分化程度的胃癌细胞株中的表达水平差异明显,与SGC-7901相比,AGS中的表达量最高;2.BGC-823和AGS对顺铂耐药性大于SGC-7901;SGC-7901和AGS对阿霉素耐药性显着大于BGC-823,SGC-7901和AGS对5-氟尿嘧啶耐药性大于BGC-823;3.用固定浓度的VER（4.91μg/mL）联合抗癌药物分别处理胃癌细胞,均不同程度降低了胃癌细胞对3种抗癌药物的IC50值,提示VER提高了抗癌药物的敏感性;4.在SGC-7901细胞中,VER逆转ADM化疗耐药能力最强（Relative IC50=6.77）,与BGC-823细胞相比有显着性差异（Relative IC50=1.66）。结论:hMDR1/P-gp水平与VER逆转胃癌细胞对ADM化疗耐药能力之间无相关一致性。第二章胃癌耐药细胞株的构建并验证其耐药效率目的:建立人胃癌SGC-7901/5-Fu耐药细胞株。方法:应用间歇作用体外诱导法构建胃癌耐5-Fu细胞株SGC-7901/5-Fu,反复短期暴露并逐步增加5-Fu的浓度,每月做相关检测,CCK-8法对药物的敏感性进行检测,并在耐药细胞株成功构建后第3天、第15天、后每间隔15天对其稳定性进行检测。结果:经历6个月建成人胃癌5-氟尿嘧啶耐药细胞株SGC-7901/5-Fu,并与ADM抗癌药存在交叉耐药。结论:SGC-7901/5-Fu细胞株具有耐药性,且耐药性稳定。第三章介导维拉帕米逆转胃癌细胞化疗耐药能力差异性基因的筛选、验证及机制研究目的:筛选出介导VER逆转胃癌细胞化疗耐药能力的差异基因并验证,初步探讨其作用机制。方法:1.通过生物信息学分析及文献资料筛选出可能的差异基因;2.实时荧光定量PCR/Western blot法检测候选基因/蛋白在胃癌细胞中的表达;3.GCS基因表达沉默或过表达后,CCK-8法检测VER逆转胃癌耐药细胞对ADM化疗耐药能力的变化;4.GCS基因表达沉默及过表达后,Annexin V-PI双染法检测VER促胃癌细胞凋亡能力的变化。结果:1.我们筛选出8个候选基因,分别为hMDR1、LRP、GST-π、GCS、TOPO Ⅱ、PrPc、MGr1-Ag、CIAPIN1;2.实时荧光定量PCR验证表明经过VER处理后,LRP、GCS、TOPOⅡ的表达存在差异,其中GCS差异最为明显（p<0.01）;3.western blot验证经VER处理后GCS蛋白表达存在差异,结合实时荧光定量PCR结果,本研究着重从GCS出发,初步探讨其参与调控VER逆转耐药的可能机制;4.在SGC-7901和SGC-7901/5-Fu、SGC-7901/ADM细胞株中,过表达GCS基因（pEGFP-GCS）,VER逆转胃癌细胞ADM化疗耐药能力明显减弱,表达沉默GCS基因（siR-GCS）,VER逆转胃癌细胞ADM化疗耐药能力明显增强;5.过表达GCS基因（pEGFP-GCS）后,VER促进ADM胃癌细胞凋亡能力明显减弱,表达沉默GCS基因（siR-GCS）后,VER促进ADM胃癌细胞凋亡能力较前增强;6.western blot法检测沉默GCS基因（siR-GCS）后,VER促进ADM胃癌细胞凋亡蛋白Bcl-2及ERK表达量明显减弱。结论:GCS介导了 VER逆转胃癌细胞ADM化疗耐药能力差异,VER可能通过改变GCS基因表达水平,可明显改变其逆转ADM化疗耐药及促进细胞凋亡能力。第四章 临床研究P-gp、GCS蛋白在胃癌组织样本中的表达目的:临床研究P-gp、GCS蛋白在胃癌两组极端病例（治疗明显好转组/治疗疾病进展组）组织样本中的表达。方法:1.选取2014.1-2017.12入住我院就诊中晚期胃癌患者11例,均经胃镜技术提取病变标本,病理证实为胃癌,每位患者每月介入1次共介入2-4次,评估患者治疗疗效,分为两组:维拉帕米抗耐药治疗有效组（治疗明显好转病例,CR）7例,维拉帕米抗耐药治疗无效组（治疗疾病进展病例,PD）5例;2.免疫组化法检测P-gp、GCS蛋白在两组胃恶性肿瘤组织样本中的表达。结果:1.P-gp蛋白主要表达于癌细胞胞浆/胞膜中,有效组的P-gp蛋白平均光密度值与无效组比较无明显差异;2.GCS蛋白主要表达于癌细胞胞核/胞浆中,在癌组织中,有效组的GCS平均光密度值明显低于无效组（p<0.01）。结论:1.维拉帕米抗耐药治疗有效组P-gp蛋白表达水平与无效组比较无明显差异;2.维拉帕米抗耐药治疗有效组GCS蛋白表达水平明显低于抗耐药治疗无效组。
王玲[2]（2021）在《双硫仑联合铜通过调控应激反应与Wnt/β-catenin信号通路抑制胃癌细胞生长》文中研究表明目的:胃癌对人类生命和经济造成严重负担。化学治疗是胃癌的主要治疗方式之一,然而胃癌患者对化疗药物的敏感性差及不耐受副作用等原因,导致其预后不佳。开发新的化疗药物成为胃癌研究的热点。双硫仑作为一种临床用戒酒药,在癌症中表现出广谱的抗肿瘤作用。双硫仑与铜联合可以增强其抗肿瘤能力。因此,为了给胃癌的治疗提供更多可选择的药物,我们研究双硫仑联合铜对胃癌细胞的作用,同时探讨其效应机制。方法:在体外细胞实验中,以胃癌细胞株MKN-45细胞和BGC-823细胞为细胞模型,采用CCK8法和细胞克隆形成实验分别检测双硫仑联合铜对MKN-45细胞和BGC-823细胞的毒性和增殖活力作用;使用Transwell和细胞划痕实验研究双硫仑联合铜对胃癌细胞的侵袭迁移效应;使用Annexin V-FITC/PI流式细胞凋亡染色和免疫印迹技术检测凋亡相关蛋白（BCL2、BAX）的表达,研究双硫仑联合铜对MKN-45细胞和BGC-823细胞的凋亡作用;采用透射电镜、免疫印迹、瞬时转染和慢病毒稳定转染等多种方法从结构、分子和蛋白水平研究双硫仑联合铜对MKN-45细胞和BGC-823细胞的自噬作用;使用荧光探针检测活性氧的表达,免疫印迹法检测P21、P53、γ-H2AX、Fzd7、β-catenin、C-myc、Cyclin D1蛋白的表达,使用Seahorse XF24分析仪检测细胞中氧耗率和细胞外酸化率,研究双硫仑联合铜通过调节应激反应和Wnt/β-catenin信号通路发挥对MKN-45细胞和BGC-823细胞的抗肿瘤作用。在体内研究中,以雄性Balb/C裸鼠为动物模型,使用MKN-45细胞建立胃癌的皮下移植瘤模型,通过研究肿瘤体积大小,对肿瘤组织进行苏木素-伊红染色,并利用免疫组化染色检测Ki67的表达,研究双硫仑联合铜对胃癌细胞体内增殖的抑制作用;通过记录裸鼠的体重,研究双硫仑联合铜在体内的毒副作用;通过Tunel凋亡染色及免疫组化（Beclin1、LC3、P53、γ-H2AX、Fzd7、β-catenin、C-myc和Cyclin D1）研究双硫仑联合铜抑制胃癌细胞体内生长的作用机制。结果:双硫仑联合铜抑制MKN-45细胞和BGC-823胃癌细胞的体外增殖活力和侵袭迁移能力,存在时间-剂量依赖性;双硫仑联合铜也可以在体内抑制胃癌皮下移植瘤的生长（抑制率为48.24%）和增殖（Ki67的表达降低）,且无明显毒副作用。在体外,双硫仑联合铜可以诱导MKN-45细胞和BGC-823细胞发生凋亡,调控线粒体凋亡途径中的BCL2和BAX蛋白;在体内,双硫仑联合铜可以诱导凋亡,Tunel染色结果显示实验组移植瘤组织中的凋亡细胞增加。双硫仑联合铜可以在体外诱导MKN-45细胞和BGC-823细胞发生自噬和自噬流,在电镜下可以观察到自噬体,在蛋白水平上调Beclin 1和LC3的表达;通过瞬时转染GFP-LC3和稳定转染m RFP-GFP-LC3分别构建表达GFP-LC3和m RFP-GFP-LC3的胃癌细胞,双硫仑联合铜可以上调MKN-45细胞和BGC-823细胞中GFP-LC3和m RFP-GFP-LC3的表达。双硫仑联合铜可以增加活性氧、抑制糖酵解和氧化磷酸化,在蛋白水平上调P53、P21和γ-H2AX的表达,下调β-catenin、Cyclin D1、C-myc、Fzd7的表达。结论:双硫仑联合铜具有抑制胃癌细胞生长、迁移及侵袭的能力,可以诱导胃癌细胞发生凋亡和自噬,通过调控应激反应和Wnt/β-catenin信号通路发挥抗肿瘤作用,且在体内无明显毒性作用。双硫仑有潜力成为治疗胃癌的抗肿瘤药物。
贾步云[3]（2021）在《基于lncRNA GAS5/miR-23a/Apaf-1通路研究藤黄酸B对胃癌细胞caspase-3依赖凋亡及焦亡的影响及机制》文中认为背景胃癌作为消化系统常见的恶性肿瘤,发病率在各种癌症当中位居前列。藤黄中蕴藏着多种氧杂蒽酮类抗肿瘤活性物质,其中藤黄酸B（morellic acid,MA）具有潜在的抗胃癌的活性,其体内外抗胃癌的作用及作用机理值得深入的探讨。长链非编码RNA（Long non-coding RNAs,lncRNAs）作为细胞中重要的调控因子,与包括肿瘤在内的多种疾病有着密切的关系。lncRNAs能够作为caspase上游信号分子影响肿瘤细胞程序性死亡过程。因此,本研究首次尝试从lncRNAs调控caspase介导的肿瘤细胞凋亡及焦亡的角度探讨MA体内外抗胃癌作用的机制。目的观察MA对于胃癌的体内外的抗癌活性;以lncRNA GAS5/miR-23a/Apaf-1信号通路促进胃癌细胞caspase-3依赖的凋亡和焦亡为切入点,探讨MA抗胃癌作用的分子机制。方法（1）MA提取分离纯化与含量测定乙醇超声提取、中压制备色谱分离及高压色谱纯化的方法对藤黄中MA进行分离;高效液相色谱（high performance liquid chromatography,HPLC）法对MA进行含量测定及有机溶剂（甲醇,乙醇,二甲亚砜）中放置稳定性的考察。（2）MA抗胃癌活性及其诱导胃癌细胞caspase-3依赖凋亡及焦亡体外研究。MTT实验观察梯度浓度的MA对不同胃癌细胞体外抑制作用;划痕实验观察胃癌细胞迁移。Annexin V-PI双染法检测胃癌细胞凋亡率;Western blot法测定胃癌细胞中凋亡相关蛋白cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、Bcl-2以及Bax的表达水平;荧光倒置显微镜观察胃癌细胞焦亡形态;乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）试剂盒检测胃癌细胞LDH释放率;测定胃癌细胞焦亡相关蛋白GSDME N端肽段（GSDME N terminal,GSDME-NT）以及IL-18的蛋白表达水平。（3）MA抗胃癌活性及其诱导胃癌细胞caspase-3依赖凋亡及焦亡体内研究。采用小鼠胃癌MFC细胞制备BALB/c小鼠胃癌皮下移植瘤模型,实验动物随机的分为:模型组（Model）,MA低剂量组（MA-L）,MA中剂量组（MA-M）,MA高剂量组（MA-H）和阳性药5-氟尿嘧啶组（5-FU）,另设正常对照组（Normal）;选择肿瘤体积、肿瘤重量、肿瘤抑制率、以及动物体重经时变化作为指标,观察MA对小鼠皮下移植瘤生长的影响;HE染色观察肿瘤病理形态的影响;免疫组化法测定MA胃组织中Ki67表达量。测定胃癌组织中凋亡相关蛋白cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、Bcl-2以及Bax的表达水平,焦亡相关蛋白GSDME-NT以及IL-18的蛋白表达水平,研究MA对体内胃癌细胞caspase-3依赖凋亡及焦亡的影响。（4）MA促进胃癌细胞caspase-3依赖凋亡及焦亡的分子机制研究。RT-qRCR法测定不同浓度MA对胃癌细胞以及动物实验中各组动物胃癌组织中lncRNA GAS5的表达水平的影响。采用siRNA构建lncRNA GAS5低表达细胞,实验细胞分为:非靶序列siRNA对照组（NC-siRNA组）、非靶序列siRNA给药组（NC-siRNA+MA组）,lncRNA GAS5低表达对照组（GAS5-siRNA组）,lncRNA GAS5低表达给药组（GAS5-siRNA+MA组）。检测lncRNA GAS5低表达胃癌细胞的凋亡率、焦亡形态、LDH释放,检测lncRNA GAS5低表达胃癌细胞中lncRNA GAS5、miR-23a和Apaf-1mRNA水平以及cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、GSDME-NT、Apaf-1和IL-18蛋白表达。采用shRNA慢病毒包装构建lncRNA GAS5低表达细胞稳转细胞株,用得到的稳转株制备lncRNA GAS5低表达胃癌动物模型,实验动物分为:非靶序列shRNA对照组（NC-shRNA组）、非靶序列shRNA给药组（NC-shRNA+MA组）,lncRNA GAS5低表达对照组（GAS5-shRNA组）,观察MA对lncRNA GAS5低表达胃癌动物体内肿瘤生长的影响;测定lncRNA GAS5低表达胃癌组织中lncRNA GAS5、miR-23a和Apaf-1 mRNA水平以及cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、GSDMENT、Apaf-1和IL-18蛋白表达。结果（1）藤黄酸B提取分离与稳定性成功分离得到MA,经HPLC色谱峰的面积归一化方法测定及计算纯度为98.3%;MA在DMSO溶液中45 d内稳定性良好。（2）藤黄酸B在体外具有较强的抗胃癌活性,并能够诱导MKN-45以及MFC细胞发生caspase-3依赖的凋亡及焦亡。MA对于胃癌BGC-823,SGC-7901,HGC-27 MKN-45以及MFC细胞的IC50值分别为6.216±0.23μM,3.859±0.11μM,4.518±0.17μM,2.964±0.25μM和1.81±0.16μM。其中,对于MKN-45和MFC细胞的抑制活性最强。MA（1μM、2μM和4μM）处理组的胃癌细胞的迁移能力被显着的抑制（P<0.05或P<0.01）。MA（1μM、2μM和4μM）处理组胃癌细胞凋亡率显着升高,细胞中cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和Bax的表达显着上调,Bcl-2的表达显着下调（P<0.05或P<0.01）。MA（1μM、2μM和4μM）处理胃癌细胞,均出现了明显的焦亡形态。MA（1μM、2μM和4μM）处理组胃癌细胞LDH释放率,显着增加,细胞中GSDME-NT以及IL-18表达显着上调（P<0.05或P<0.01）。（3）藤黄酸B具有体内抗胃癌活性,并能在体内诱导胃癌细胞发生caspase-3依赖凋亡及焦亡。在小鼠胃癌皮下移植瘤模型中,MA及阳性药5-FU对小鼠皮下肿瘤生长均有显着的抑制作用。疗程第15天,MA（1、2和4mg/kg）各剂量组以及阳性药5-FU（100mg/kg）对于小鼠体内肿瘤的抑制率分别为:79.32±7.69%,92.36±4.21%,92.18±2.99%和87.64±6.30%。肿瘤组织病理形态观察发现,模型组肿瘤组织中肿瘤细胞细胞核完整,细胞排列相对致密。MA（1、2和4mg/kg）各剂量组及阳性药5-FU（100mg/kg）组肿瘤组织中可见散在分布的凋亡以及坏死的肿瘤细胞,胞间出现裂隙,细胞核出现固缩和破裂的形态。MA（1、2和4mg/kg）各剂量组以及阳性药5-FU（100mg/kg）组动物肿瘤组织中的Ki67蛋白的表达量均显着降低,胃癌组织中cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、Bax、GSDME-NT和IL-18的表达显着上调,Bcl-2的表达显着下调（P<0.05或P<0.01）。（4）MA通过调控lncRNA GAS5/miR-23a/Apaf-1通路促进胃癌细胞caspase-3依赖凋亡及焦亡。在体外,MA（1μM、2μM和4μM）处理的MKN-45细胞和MFC细胞中lncRNA GAS5的水平显着提高（P<0.05或P<0.01）。在小鼠皮下移植瘤模型中,MA（1、2和4mg/kg）各剂量组及阳性药组动物肿瘤组织中lncRNA GAS5水平均显着提高（P<0.05或P<0.01）。MA（2μM）组胃癌细胞凋亡率显着提高,细胞出现了显着的焦亡形态,LDH的释放率显着增加,敲低lncRNA GAS5水平后,MA（2μM）诱导胃癌细胞凋亡、焦亡及增加LDH释放率的作用被部分逆转（P<0.05或P<0.01）。MA（2μM）组胃癌细胞中lncRNA GAS5和Apaf-1 mRNA水平显着上调,miR-23a水平显着下调,敲低lncRNA GAS5水平后,MA（2μM）上调lncRNA GAS5和Apaf-1 mRNA以及下调miR-23a的作用被部分逆转（P<0.05或P<0.01）。MA（2μM）组胃癌细胞中cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、GSDME-NT、Apaf-1以及IL-18蛋白表达显着上调,敲低lncRNA GAS5水平后,MA（2μM）对于这些蛋白水平的上调作用被部分逆转（P<0.05或P<0.01）。在lncRNA GAS5低表达胃癌动物模型中,MA（2 mg/kg）组动物肿瘤体积和重量明显减小,敲低lncRNA GAS5水平后,MA（2 mg/kg）对于动物肿瘤生长的抑制作用被部分逆转（P<0.05或P<0.01）。MA（2 mg/kg）组胃癌组织中lncRNA GAS5和Apaf-1 mRNA水平显着上调,miR-23a水平显着下调,敲低lncRNA GAS5水平后,MA（2 mg/kg）上调lncRNA GAS5和Apaf-1 mRNA以及下调miR-23a的作用被部分逆转（P<0.05或P<0.01）。MA（2 mg/kg）组胃癌组织中cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、GSDMENT、Apaf-1以及IL-18蛋白表达显着上调,敲低lncRNA GAS5水平后,MA（2mg/kg）对于这些蛋白水平的上调作用被部分逆转（P<0.05或P<0.01）。结论MA具有体内外抗胃癌的作用,其作用机制可能与其上调胃癌MKN-45及MFC细胞中lncRNA GAS5水平,靶向吸附miR-23a,拮抗miR-23a对Apaf-1的抑制作用,进而激活caspase-9及caspase-3,促进胃癌MKN-45及MFC细胞发生凋亡和焦亡相关。
李亚[4]（2020）在《新加良附方调控miR-34a/SIRT1/p53及Caspase凋亡通路抑制胃癌的机制研究》文中认为我国是胃癌大国,中西医结合治疗是我国胃癌综合治疗的独特模式。临床实践证实采用新加良附方（高良姜、香附、穿山龙）联合化疗针对进展期胃癌较单纯化疗具有更高的临床缓解率和更优的生活质量。机制研究发现新加良附方抗胃癌作用与调控凋亡相关基因表达有关,但其上游调控机制尚未明确。基于前期基础,本研究拟从microRNA角度,深入探讨新加良附方及穿山龙主要成分薯蓣皂苷元对miR-34a/SIRT1/p53通路及miR-34a凋亡相关靶基因的调控作用和对凋亡信号通路的激活作用,明确新加良附方及薯蓣皂苷元的作用机制,为新加良附方治疗胃癌提供基础研究依据。目的通过体内外实验明确新加良附方及成分薯蓣皂苷元对人胃癌细胞功能的抑制作用,基于miR-34a/SIRT1/p53及Caspase凋亡通路,明确新加良附方及薯蓣皂苷元抗胃癌作用机制。方法1.新加良附方及薯蓣皂苷元抑制胃癌细胞功能作用及机制研究①新加良附方及薯蓣皂苷元抑制人胃癌细胞功能实验:CCK-8实验检测新加良附方及薯蓣皂苷元抑制胃癌细胞增殖的作用,流式细胞术检测新加良附方及薯蓣皂苷元对胃癌细胞周期及凋亡的调控作用,划痕实验检测新加良附方抑制胃癌细胞迁移作用;②新加良附方、薯蓣皂苷元调控miR-34a作用:qPCR检测正常胃黏膜上皮细胞及胃癌细胞miR-34a表达,慢病毒感染构建过表达mi R-34a的胃癌HGC-27细胞,CCK-8方法检测过表达miR-34a胃癌HGC-27细胞增殖功能,划痕实验检测过表达mi R-34a胃癌细胞迁移能力,并通过qPCR方法检测新加良附方、薯蓣皂苷元对miR-34a基因水平影响;③新加良附方、薯蓣皂苷元调控miR-34a抗胃癌作用机制研究:qPCR方法检测过表达miR-34a后HGC-27细胞miR-34a/SIRTl/p53通路及miR-34a靶基因表达水平,qPCR方法检测新加良附方、薯蓣皂苷元对miR-34a/SIRT1/p53通路、miR-34a靶基因及Caspase凋亡通路的作用,Western blot检测新加良附方、薯蓣皂苷元对Caspase凋亡通路作用。2.新加良附方及薯蓣皂苷元对裸鼠胃癌移植瘤抑制作用及机制研究BSP方法检测胃癌细胞miR-34a甲基化水平,并构建HGC-27胃癌细胞荷瘤小鼠模型,设正常对照组、模型组、新加良附方中剂量组、新加良附方高剂量组、薯蓣皂苷元组、5-Aza-CdR组、中剂量联合组及高剂量联合组,药物干预18天,观察裸鼠一般状态;测量移植瘤长短径,计算瘤体积和抑瘤率,观察裸鼠生存期;qPCR方法检测miR-34a表达情况;Western blot方法检测miR-34a/SIRT1/p53相关蛋白表达及Caspase凋亡通路情况。结果1.新加良附方及薯蓣皂苷元抑制胃癌细胞功能作用及机制研究新加良附方抑制人胃癌细胞功能实验:新加良附方呈浓度及时间依赖性地抑制HGC-27、MGC80-3及AGS细胞增殖;新加良附方提高G1期HGC-27细胞,降低G2期细胞;新加良附方可诱导HGC-27及MGC80-3细胞凋亡,其中诱导HGC-27细胞凋亡作用显着;与对照组比较,新加良附方组除24h 4mg/mL浓度外,其余各组均可抑制胃癌HGC-27细胞迁移功能,作用呈时间及浓度依赖性;新加良附方可显着抑制MGC80-3细胞迁移功能,作用呈时间依赖性,差异有统计学意义;各浓度新加良附方24h及48h均可抑制AGS细胞迁移;薯蓣皂苷元抑制人胃癌细胞功能实验:薯蓣皂苷元呈时间及浓度依赖性地抑制胃癌HGC-27、MGC80-3及AGS细胞增殖作用,差异有统计学意义;薯蓣皂苷元干预后胃癌细胞周期无明显改变;薯蓣皂苷元可诱导HGC-27及MGC80-3细胞凋亡,其中诱导HGC-27细胞凋亡作用显着;新加良附方及薯蓣皂苷元调控miR-34a作用:HGC-27、MGC80-3及AGS细胞中miR-34a相对表达量显着低于正常细胞GES-1,p<0.05;与阴性对照组相比较,过表达miR-34a后,HGC-27细胞增殖能力受到显着抑制,并可显着抑制其迁移能力;新加良附方及薯蓣皂苷元干预后,HGC-27及AGS细胞miR-34a表达水平升高,p<0.01;新加良附方及薯蓣皂苷元调控miR-34a抗胃癌作用机制研究:过表达miR-34a显着上调p53并下调SIRT1表达水平,可提高Bax及Caspase-3 mRNA表达水平,降低Bcl-2及Survivin的mRNA表达水平;新加良附方及薯蓣皂苷元干预可提高p53表达,降低SIRT1表达水平,并可上调Bax及Caspase-3的mRNA表达水平,降低Bcl-2及Survivin的mRNA表达水平,p<0.01,差异有统计学意义;Z-VAD-FMK可降低新加良附方及薯蓣皂苷元诱导的HGC-27细胞凋亡;新加良附方作用后可降低Caspase-9、Caspase-3前体水平,升高活化Caspase-3的表达水平;2.新加良附方及薯蓣皂苷元对裸鼠胃癌移植瘤抑制作用及机制研究胃癌细胞HGC-27在miR-34a各位点甲基化水平均较高,选取HGC-27细胞构建胃癌荷瘤小鼠模型,药物干预后观察到新加良附方中剂量组、新加良附方高剂量组、薯蓣皂苷元组及中剂量联合组、高剂量联合组裸鼠状态较好,反应灵敏,活动及饮食、饮水量正常,5-Aza-CdR组裸鼠一般状态较差。5-Aza-CdR组裸鼠体重于实验给药第8天后逐渐下降,第11天其体重低于新加良附方高剂量组,差异有统计学意义,第15天,其体重低于模型组、新加良附方高剂量组、薯蓣皂苷元组及高剂量联合组,p<0.05,第18天,其体重低于其余各组,p<0.05,差异有统计学意义。5-Aza-CdR组抑瘤率为32.08%,与模型组比较,p>0.05,差异无统计学意义,中剂量联合组抑瘤率为35.00%,高剂量联合组抑瘤率为37.18%,与模型组相比较,p<0.05,差异有统计学意义。模型组平均生存时间为46.33±10.50天,新加良附方中剂量组、新加良附方高剂量组、薯蓣皂苷元组、中剂量联合组及高剂量联合组裸鼠均未出现死亡现象,平均生存时间为57.00±0.00天,具有延长荷瘤裸鼠生存时间的趋势,5-Aza-CdR组裸鼠平均生存时间为40.33±7.37天,生存时间较模型组短。除新加良附方中剂量组外,其余各治疗组均可提高胃癌miR-34a表达,以联合组作用最为显着;新加良附方中剂量、高剂量、薯蓣皂苷元及高剂量联合组均可显着增加p53蛋白的表达,且药物干预各组均可显着抑制SIRT1 蛋白的表达,可降低 Bcl-2、Survivin 表达,并提高 Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9 及 Caspase-3 底物 Cleaved PARP 蛋白的表达。结论1.miR-34a表达水平异常与胃癌发生密切相关;2.新加良附方可抑制胃癌细胞增殖及迁移、调节细胞周期、诱导凋亡,其成分薯蓣皂苷元可抑制胃癌细胞增殖,并诱导胃癌细胞凋亡,机制可能与调控miR-34a/SIRT1/p53通路、miR-34a凋亡相关靶基因及激活Caspase凋亡通路相关;3.新加良附方联合5-Aza-CdR可抑制胃癌裸鼠移植瘤生长,并可改善裸鼠一般状态,有维持体重、延长其生存时间的趋势,机制可能与调控miR-34a/SIRT1/p53通路、miR-34a凋亡相关靶蛋白及Caspase凋亡信号通路相关。
丁瑞贤[5]（2020）在《生长抑素通过Wnt/β-catenin调控上皮间质转化抑制胃癌细胞迁移侵袭》文中研究表明背景和目的胃癌是世界上最常见的消化道恶性肿瘤。胃肠激素的体内调节对胃癌发生和发展起着关键性作用,在众多的相关因子中生长抑素（somatostatin,SST）受到广泛关注。生长抑素是一个对外分泌、内分泌、旁分泌及自分泌均起作用的调节肽。大多数研究表明,SST及生长抑素类似物（Somatostatin Analogs,SSTA）在许多肿瘤细胞中抑制增殖,但也有学者指出不同浓度的SSTA（1μg/L-200μg/L）可以刺激胃癌细胞生长,这提示SST在不同肿瘤中的作用不同且机制不明。本研究利用慢病毒过表达SST,观察胃癌细胞超微结构的变化及对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响,探讨SST在Wnt/β-catenin信号通路中作用机制及其与上皮间质转化（epithelial-MesenchymalTransition,EMT）的关系,为临床治疗提供新靶点。方法1.利用第二代慢病毒过表达载体系统,将PCMV-dR8.2dvpr、PCMV-VSV-G、PHBLV-SST三质粒共转染HEK293T细胞,收取细胞上清液获得病毒颗粒,将复制缺陷型慢病毒载体颗粒直接用于感染胃癌细胞BGC823、SGC7901、MGC803。2.采用实时荧光定量PCR技术和蛋白质免疫印迹技术验证SST胃癌细胞株在mRNA和蛋白水平表达量的变化。3.检测过表达SST基因对胃癌细胞BGC823、SGC7901、MGC803细胞器的变化。利用透射电子显微镜观察胃癌细胞器中线粒体、内质网、以及高尔基体的变化。4.检测过表达SST基因对胃癌细胞BGC823、SGC7901、MGC803增殖、迁移和侵袭能力等行为功能学的影响。利用MTT实验检测细胞的增殖能力;划痕实验检测细胞的迁移能力;Transwell实验检测细胞的侵袭能力。5.检测过表达SST基因对胃癌细胞BGC823、SGC7901、MGC803上皮间质转化的影响。通过蛋白质免疫印迹技术检测E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和β-catenin的蛋白表达量变化。6.探讨SST基因对上皮间质转化的影响是否由Wnt/β-catenin信号通路介导。加入Licl试剂,激活Wnt/β-catenin信号通路。通过蛋白质免疫印迹技术检测 β-catenin、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 的蛋白表达量变化。结果1.成功建立过表达SST的胃癌细胞BGC823、SGC7901、MGC803细胞株。2.过表达SST影响胃癌细胞BGC823、SGC7901、MGC803细胞器形态。3.过表达SST在一定程度上抑制胃癌细胞BGC823、SGC7901、MGC803的增殖、迁移和侵袭能力。4.过表达SST在一定程度上逆转上皮间质转化。5.SST可能通过Wnt/β-catenin信号通路影响上皮间质转化。结论SST可通过Wnt/β-catenin信号通路调控上皮间质转化抑制胃癌细胞BGC823、SGC7901、MGC803的增殖、迁移和侵袭。
冯振[6]（2019）在《健脾为主的中药对胃癌术后无病生存期的影响及实验研究》文中研究指明目的:观察以健脾为基础的辨证治疗对胃癌根治术后III期患者无病生存期（Disease Free Survival,DFS）的影响;研究胃肠安的活性成分熊果酸在体外诱导胃癌细胞凋亡的分子机制,进一步探讨胃肠安方抑制胃癌的作用。方法:采用多中心非随机同期对照研究的方法,将胃癌根治术后III期病例分别纳入治疗组（以健脾为基础辨证治疗的治疗组）和对照组（同期未服用本辨治方案中药的对照组）,采用Kaplan-Meier法和Cox比例风险模型对影响胃癌根治术后无病生存期（DFS）的相关影响因素进行单因素和多因素分析,并预设分层根据临床病理分期分层分析。体外用胃肠安活性成分熊果酸干预人胃癌细胞MKN45和SGC7901模型,运用CCK8法检测熊果酸对人胃癌细胞MKN45和SGC7901增殖的抑制作用,计算各组IC50值;流式细胞术检测人胃癌细胞MKN45和SGC7901细胞周期和凋亡的发生情况,运用Hoechst染色观察MKN45细胞凋亡的形态,以及Western Blot实验检测人胃癌细胞MKN45凋亡相关蛋白Bax,Bcl-2,Bcl-x,Caspase-3的表达变化,探讨熊果酸诱导胃癌细胞凋亡的作用机制。结果:（1）本研究共纳入555例胃癌根治术后III期病例,包括治疗组253例和对照组302例。Cox多因素分析显示患者的Lauren分型（P=0.011）,临床病理分期（P=0.000）和健脾为基础的中药治疗（P=0.000）是影响胃癌根治术后III患者DFS的独立预后因素。同时按照临床病理分期进行分析,IIIB期亚组中,共193例病例,其中包括治疗组88例和对照组105例,Cox多因素分析结果显示健脾为基础的中药治疗（P=0.027）和Lauren分型（P=0.014）是胃癌根治术后IIIB期患者DFS的独立影响因素,治疗组患者的中位DFS未达到,对照组的中位DFS为31.2个月（P=0.008）;治疗组1,3,5年的无病生存率分别为88%,64%,56%,对照组1,3,5年的无病生存率分别为78%,45%,36%,差异具统计学意义。IIIC期亚组中,共108例病例,包括治疗组40例和对照组68例,Cox多因素分析结果显示健脾为基础的中药治疗（P=0.042）是胃癌根治术IIIC期患者DFS的独立影响因素,治疗组的中位DFS为59.1个月,对照组的中位DFS为21.7个月（P=0.007）;治疗组1,3,5年的无病生存率分别为84%,61%,43%,对照组1,3,5年的无病生存率分别为75%,30%,19%（P=0.013）,差异具统计学意义。（2）CCK8结果示熊果酸干预MKN45和SGC7901后,随着药物作用浓度增加和作用时间延长,两株细胞的增殖抑制率升高。流式细胞术检测到熊果酸干预细胞株MKN45和SGC7901 24H后,高浓度组（浓度为IC50时）与空白对照组（0μM）相比,细胞凋亡比率增加（P<0.05）,差异具统计学意义,且MKN45细胞凋亡主要发生在晚期,阻滞在G2期,SGC7901凋亡主要发生在早期,阻滞在S期。Hochest染色示:熊果酸干预MKN45细胞株24H后,细胞染色质浓缩,出现凋亡小体,出现明显的细胞凋亡的特性。Western-blot实验发现促凋亡蛋白Caspase-3和Bax的表达增加,抗凋亡蛋白Bcl-x和Bcl-2表达下调。结论:（1）以健脾为基础的辨证治疗是影响胃癌根治术后III期患者DFS的独立保护性因素,可延长胃癌根治术后IIIB和IIIC期患者的无病生存期。（2）熊果酸能够抑制胃癌细胞MKN45和SGC7901的增殖,并呈时间剂量依赖性,分别阻滞细胞周期在G2和S期;分别诱导胃癌细胞MKN45和SGC7901的凋亡发生于晚期和早期。
吕垚[7]（2019）在《重组麻疹病毒沪191株（r-MV-Hu191株）以及联合顺铂对胃癌的溶瘤作用及其机制研究》文中研究表明第一部分 重组麻疹病毒沪191株（r-MV-Hu191株）对胃癌溶瘤作用及其机制研究。研究目的:胃癌是世界上最常见的癌症之一,死亡率很高。尽管癌症死亡率在下降,但五年的总生存率仍然很低。因此,寻找有效的治疗方法,提高胃癌患者的生存率已成为当务之急。之前,许多不同种类的溶瘤病毒已被用来研究作为新的癌症治疗手段。Hu191是一种麻疹减毒活疫苗株,作为一种安全的疫苗在中国使用已超过50年,有报道称麻疹病毒Hu191株对肺癌有溶瘤作用,但尚未在其他恶性肿瘤中报道。而且麻疹病毒的溶瘤效应的潜在机制也有待进一步阐明。之前本课题组已经利用反向遗传学系统成功拯救了重组麻疹病毒Hu191株(r-MV-Hu191。在本研究中,国内首次拟应用r-MV-Hu191株探索在胃癌中的溶瘤作用,并分析麻疹病毒抗肿瘤的凋亡机制,拟揭示麻疹病毒诱导的细胞凋亡与生物膜结构域脂筏之间的联系,为肿瘤治疗探索新思路。研究方法:1、利用工具细胞Vero对r-MV-Hu191株进行扩增,待有90%以上Vero细胞产生病变时,收集全部细胞和培养基,采用反复冻融、低温高速离心的方法收集r-MV-Hu191病毒液,应用空斑形成单位法测定病毒滴度。在r-MV-Hu191株感染人胃癌细胞株SGC-7901,BGC-823后的24h-48h,利用免疫荧光方法,检测病毒P蛋白表达情况,从而确定r-MV-Hu191株能够感染该胃癌细胞株。在r-MV-Hu191株感染人胃癌细胞株SGC-7901,BGC-823后的24h-96h,并且收集病毒液,利用半数组织培养感染剂量（TCID50）法检测麻疹病毒滴度,对该病毒在各种细胞上的增殖动力学进行研究。2、在r-MV-Hu191株以不同感染复数（MOI）感染人胃癌细胞株SGC-7901,BGC-823 后的24h-96h,通过倒置显微镜观察SGC-7901,BGC-823细胞的病变效应与合胞体的形成。应用CCK-8法检测细胞增殖活力。应用龙胆紫染活细胞的方法,检测细胞病变效应。3、在胃癌细胞株SGC-7901,BGC-823感染病毒后的24h-96h,应用流式Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞的凋亡率。在胃癌细胞株SGC-7901,BGC-823感染不同MOI病毒后24h-96h,收集各个时间点的相应总蛋白,应用Western Blot实验检测不同时间点不同浓度下的凋亡相关的蛋白Caspase-3,PARP的表达情况。广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK,能阻断caspase依赖的细胞凋亡,Z-VAD-FMK和r-MV-Hu191病毒株联用72h,应用Western Blot实验检测caspase阻断之后各组之间凋亡相关的蛋白Caspase-3,PARP的表达量的变化,应用流式Annexin V-FITC/PI双染法检测caspase阻断之后各组的细胞凋亡率的变化。4、胃癌细胞株SGC-7901,BGC-823先和5 mM MβCD在37度的培养基中共培养2小时,收集胃癌细胞的全部蛋白,用Western blotting检测flotillin 1蛋白的表达。MβCD破坏脂筏后,检测24小时后在BGC-823和SGC-7901细胞中的病毒滴度,检测细胞中MV-P蛋白表达量。5、为了在病毒感染前破坏脂筏,细胞先和5 mM MβCD在37度的培养基中共培养2小时,接着再用含有病毒的培养液去感染病毒。为了在病毒感染后破坏脂筏,细胞先感染病毒2小时,接着再用MβCD处理2小时,最后将含有MβCD的培养基去除掉,换上新鲜培养基,直到特定的时间点为止。在上述处理后,收集细胞并进行Western blotting分析或流式细胞分析。6、动物实验中,将胃癌细胞SGC-7901接种在BABL/C裸鼠右翼,建立胃癌移植瘤模型。在肿瘤植入后第7天,将小鼠随机分为两组,每组10只。r-MV-Hu191株组共注射6次病毒液,对照组注射相同体积的Opti-MEM的培养基。在肿瘤植入后第15天,每组取3只小鼠,收集肿瘤组织,进行原位凋亡和病毒复制检测。从新鲜肿瘤组织中提取并蛋白质进行Western Blot实验分析。每组另外7只小鼠饲养到死亡那天或者到安乐死那天。研究结果:1、当r-MV-Hu191株的MOI为0.1时,通过MV-P蛋白的表达,可以看到病毒颗粒,从而证实该病毒可以成功感染BGC-823和SGC-7901细胞。此外,r-MV-Hu191株在两种细胞系中均能复制,BGC-823细胞感染48小时后达到滴度的峰值,SGC-7901细胞感染72小时后达到滴度的峰值。2、在两个细胞系中,在感染后48小时内首次观察到细胞活力下降,而且r-MV-Hu191株的溶瘤作用呈现出剂量和时间依赖性。在感染病毒后的BGC-823和SGC-7901细胞中,当r-MV-Hu191的MOIs为0.1和1时,均以剂量和时间依赖性的方式引起了显着的细胞病变效应。3、在MOI为0.5时,BGC-823和SGC-7901细胞感染r-MV-Hu191株后,凋亡细胞比例显着增加,且呈现时间依赖性。在BGC-823细胞中,r-MV-Hu191株感染24、48、72、96 h后凋亡率分别为3%、23%、28%、43%;然而,对照组的细胞凋亡率仅为2%。在SGC-7901细胞中,r-MV-Hu191株感染24、48、72、96h后凋亡率分别为1%、6%、19%、26%;然而,在对照组中,这个比例仅为1%。为了阐明r-MV-Hu191株诱导的细胞凋亡是caspase途径的,我们检测了caspase 3和PARP活化形式的表达量。在感染r-MV-Hu191株后,caspase 3和PARP的活化形式的蛋白显着增加,且呈现时间和剂量依赖性。此外,病毒与Z-VAD共培养72小时可抑制两种细胞系中caspase 3和PARP的活化。根据蛋白灰度分析证实,两种细胞系的caspase 3活化蛋白表达量均显着降低（P<0.01）,PARP活化蛋白表达量均亦显着降低（P<0.05）。根据流式细胞分析器得出的结果,在Z-VAD存在的情况下,由病毒引起的细胞凋亡也得到了部分逆转。4、在病毒感染之前,先用β-环糊精（MβCD）溶解细胞膜上的胆固醇,从而破化脂筏结构后,BGC-823和SGC-7901细胞中r-MV-Hu191株的病毒颗粒和病毒滴度均显着降低。细胞内MV-P蛋白表达降低,这进一步证实脂筏破化后病毒数量减少。蛋白灰度分析证实感染细胞中MV-P蛋白表达显着降低（P<0.01）。虽然脂筏的破坏阻碍了病毒的复制,但并不影响病毒的吸附。因为比较（MβCD）处理组和未处理组的未结合在细胞上的的病毒上清,两者没有统计学上的差异。比较（MβCD）处理组和未处理组的结合在细胞上的的病毒量,两者也没有统计学上的差异。此外,通过flotillin 1在低密度区分布减少,使用MβCD破化脂筏的有效性也得到了验证。5、当病毒感染之前,先用MβCD破坏脂筏的完整性。发现细胞凋亡通路中的标志蛋白表达量降低。同样地,BGC-823细胞的凋亡率由35%下降至7%,SGC-7901细胞的凋亡率由22%下降至3%。如果先让病毒感染2小时,让病毒充分地吸附到细胞膜上,再加入MβCD破坏脂筏,在这两种不同胃癌细胞系中,脂筏破坏均未降低细胞凋亡率。事实上,当病毒结合后脂筏完整性受损时,凋亡细胞比例甚至增加。6、r-MV-Hu191的体内抑瘤作用在肿瘤植入裸鼠后第10天,即治疗后第3天即能被检测到。治疗效果随时间增加而显现,在肿瘤植入裸鼠后10天至16天,r-MV-Hu191株能有效抑制肿瘤生长,其中注射6次后,即第16天效果最为显着。r-MV-Hu191株治疗显着提高了裸鼠的生存率。r-MV-Hu191治疗组的中位生存期为30天,而对照组仅为17天。r-MV-Hu191株处理的动物的中位生存期增加了 1.76倍,明显高于对照组（P<0.01）。但是两组间体重无明显差异。r-MV-Hu 191株治疗的肿瘤切片中能检测到MV-P蛋白,而对照组中未检测到MV-P蛋白。以合胞体形成为表现的细胞病变效应,仅在r-MV-Hu191治疗的肿瘤中检测到。此外,通过对活化的caspase3表达的检测和原位凋亡的分析,发现r-MV-Hu191株是通过诱导肿瘤组织凋亡达到溶瘤作用。在肿瘤组织的蛋白提取物中,对caspase 3的表达量进行了定量分析,发现r-MV-Hu191株组明显高于对照组（P<0.01）。结论:1、r-MV-Hu191株能在体外诱导细胞病变,抑制肿瘤增殖。2、r-MV-Hu191株在体内能抑制肿瘤生长,延长裸鼠的生存时间。3、r-MV-Hu191的复制需要脂筏,但病毒的吸附不需要脂筏。4、在病毒与细胞结合之前,r-MV-Hu191诱导的细胞凋亡依赖于脂筏完整性。5、r-MV-Hu 191在体外和体内均可诱导caspase依赖的细胞凋亡。第二部分 重组麻疹病毒沪191株（r-MV-Hu191株）联合顺铂治疗胃癌的作用及机制研究。研究目的:联合治疗模式能够产生超过任何一种单独方法的附加或协同效应。为了寻找一种能提高患者的耐受性和延缓耐药性,而且是安全有效的胃癌辅助治疗方法。我们在前一部分研究基础上,采用重组麻疹病毒Hu191株（r-MV-Hu191）联合化疗药顺铂（DDP）这种方式,探究该联合用药在胃癌细胞体内、外实验中的治疗作用。研究方法:1、利用工具细胞Vero对r-MV-Hu191进行扩增,待有90%以上Vero细胞产生病变时,收集全部细胞和培养基,采用反复冻融、低温高速离心的方法收集r-MV-Hu191病毒液,应用空斑形成单位法滴定病毒滴度。2、r-MV-Hu191 联合 DDP 感染 BGC-823 和 SGC-7901 细胞 72 小时,采用 CCK-8 法测定胃癌细胞的存活率,采用个体剂量反应实验数据来计算ZIP评分。r-MV-Hu191联合DDP（按照以上计算出的最佳剂量）感染BGC-823和SGC-7901细胞24-72h,采用CCK-8法测定胃癌细胞的存活率。3、病毒复制实验,BGC-823和SGC-7901细胞分别用r-MV-Hu191和DDP共处理24-72小时,取不同时间间隔的细胞和上清液,进行两次反复冻融。用TCID50方法在Vero细胞上进行滴定病毒浓度。BGC-823和SGC-7901细胞分别用r-MV-Hu1 91和DDP共处理0-24小时,用免疫荧光方法检测病毒P蛋白。4、r-MV-Hu191、DDP、Z-VAD联合处理BGC-823、SGC-7901 细胞96h。收集细胞,与Annexinv-荧光素异硫氰酸酯（FITC）和碘化丙啶（PI）试剂孵育,在流式细胞仪分析。收集所有蛋白,用Western blotting检测活化caspase 3和PARP的表达情况。5、建立裸鼠胃癌模型:将胃癌细胞BGC-823接种在BABL/C裸鼠右翼,建立胃癌移植瘤模型。将小鼠随机分为4组,每组10只。给予r-MV-Hu191治疗的小鼠瘤内注射病毒悬液6次。给予DDP治疗的小鼠腹腔内注射DDP 3次。对照组注射PBS或Opti-MEM培养基作为对照。术后第13天处死各组小鼠3只,取肿瘤组织进行原位凋亡分析,取眼角静脉血进行肝肾功能分析。蛋白质从新鲜组织中提取并进行Western blotting分析。每组其余7只小鼠被饲养至死亡或安乐死日。研究结果:1、与单独使用r-MV-Hu191或DDP相比,r-MV-Hu191联合DDP治疗对两种细胞系的细胞毒性均显着升高。应用零相互作用效价强度（ZIP）分析,在BGC-823和SGC-7901细胞的所有剂量反应中,r-MV-Hu191与DDP的相互作用几乎都具有普遍的协同作用。当r-MV-Hu191的浓度在0.1MOI的剂量组合区域时,BGC-823细胞的协同效应最强,平均的ZIP协同得分为12.101。当DDP的浓度在2.8 uM的剂量组合区域时,SGC-7901细胞的协同效应最强,平均的ZIP协同得分为6.953。为了评估协同效应是否依赖于治疗时间,在联合处理48h时,r-MV-Hu191与DDP的协同作用首次出现,这种效应随着时间的推移而增强,对BGC-823和SGC-7901细胞的生长均产生了协同抑制作用。2、在SGC-7901细胞中,DDP仅在24小时时导致病毒复制和病毒P蛋白表达水平略有降低,但在随后的时间内没有降低。对于BGC-823细胞,DDP对病毒复制和病毒P蛋白表达均无抑制作用。3、与对照组相比,单独或联合应用r-MV-Hu191和DDP后,两种细胞系凋亡细胞比例均显着增加（P<0.001）。此外,r-MV-Hu191联合DDP比单独使用r-MV-Hu191或DDP更能诱导细胞凋亡（P<0.001）。在广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK的存在下,细胞凋亡的增加被部分逆转。与单独使用r-MV-Hu 191或DDP处理相比,r-MV-Hu 191和DDP联合处理在24小时和48小时时活化的caspase 3和PARP的蛋白水平均升高。在联合处理72小时的实验中也证实了此前的观察结果,Z-VAD逆转了 caspase 3和PARP在联用组和r-MV-Hu191单用治疗组中的活化。4、与对照相比,应用r-MV-Hu191（P<0.05）或DDP单独治疗（P<0.001）和联合治疗后第11天（P<0.001）,都表现出对小鼠肿瘤的抑制作用。此外,与单独使用r-MV-Hu191或DDP相比,联合治疗后肿瘤体积明显缩小（P<0.001,与r-MV-Hu191组相比,P<0.01,与DDP组相比）。与对照相比,给予r-MV-Hu191或联合治疗可显着提高生存率（对照组中位生存期为18天,r-MV-Hu191组为23天,P<0.01;联合治疗组为33天,P<0.01）。然而,DDP组与对照组的生存率比较无显着差异（对照组中位生存时间为18天,DDP组中位生存时间为17天,P>0.05）,联合治疗组较单独病毒治疗组的生存时间更长（P<0.01）。与r-MV-Hu191和DDP单独治疗组相比,联合治疗组肿瘤组织中caspase 3的表达水平较高。苏木精—伊红染色法（H&E）显示,对照组肿瘤细胞细胞密度很高,细胞核深染,细胞边界清晰。而用r-MV-Hu191治疗组的小鼠,肿瘤细胞密度较低。与对照组相比,仅用DDP治疗组的小鼠肿瘤核染色缺失,胞浆嗜酸性粒细胞增多,细胞微细结构和细胞边界丢失。与单独r-MV-Hu191或DDP治疗组相比,联合治疗可增强肿瘤肿块的细胞死亡和坏死症状。在免疫组织化学（IHC）分析中,与r-MV-Hu191和DDP治疗组相比,联合治疗组中活化的caspase 3表达量增加。末端脱氧核苷酸转移酶介导的三磷酸脱氧鸟苷-生物素刻痕末端标记（TUNEL）分析显示,与单独使用r-MV-Hu191或DDP相比,r-MV-Hu191联合DDP治疗能诱导更多细胞凋亡。5、与对照相比,DDP和联合治疗组小鼠的体重首次出现了减轻,联合组体重略重于DDP组,说明联用r-MV-Hu191可降低DDP的毒性。治疗组与对照组裸鼠的血清白蛋白（Alb）、血清球蛋白（Glb）、谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、血尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）水平无显着差异。结论:1、r-MV-Hu191联合DDP在体外能协同抑制人胃癌细胞生长。2、DDP对MV复制无影响。3、r-MV-Hu191联合DDP治疗显着增加胃癌细胞的凋亡。4、r-MV-Hu191联合DDP治疗在体内是有效的。5、r-MV-Hu 191联合DDP治疗的副作用很小。
张轩[8]（2018）在《ADRB2介导慢性应激调控胃癌发展的机制研究》文中研究表明研究背景和目的:胃癌位列世界上常见的恶性肿瘤之一,据统计,胃癌在最常见的恶性肿瘤中排名第四。中、日、韩等东亚国家的发病率高于欧美,2017年我国流行病学统计结果提示我国胃癌发病率及死亡率均居第二位,每年新增胃癌病例数约40%发生在中国。男女发病率之比约2:1,发病年龄高峰为5060岁,是严重危害人民身体健康的疾病。诸多因素导致胃癌地域分布差别的不均一性,其中环境是导致这一差异的重要因素。现今,随着医学模式从单一的生物医学模式转变为生物-心理-社会模式,社会心理因素对肿瘤的影响愈发引起众多学者关注。流行病学研究显示,社会心理压力可以促进癌症的发生和发展,并降低癌症患者五年生存率,但其作用机制仍不清楚。近年来,心理干预和免疫治疗已构建为癌症综合治疗的重要组分,但鉴于缺乏显效的治疗靶点,临床心理干预的有效性尚未达成一致。因此,深入研究精神心理应激如何引发胃癌发生、促进其发展以及转归调控,从而为应激相关胃癌的防治提供了新的方向,也是目前亟待解决的重要问题之一。机体感受应激刺激后,发生相应的适应性反应并激活交感肾上腺髓质系统（SAM）释放儿茶酚胺类等交感神经递质,对肿瘤细胞生长、微环境血管生成实施影响。诸多研究及临床证据亦表明SAM的活化、儿茶酚胺类神经递质水平的增高对多种实体肿瘤的生长、转移均有促进效应,而儿茶酚胺类神经递质发挥其诸多生理效应是经由结合并激活细胞表面的β肾上腺素能受体（ADRB）将胞外的信息传递至胞内从而引发其后续一系列效应。近年来诸多体外研究证实β肾上腺素能受体阻断剂可抑制乳腺癌、口腔癌和前列腺癌细胞的迁移及侵袭。因此有必要研究机体在慢性应激状态下,胃癌细胞表面的β肾上腺素能受体活化后对其发挥哪些生物学调控效应。本研究首先通过检测胃癌组织及胃癌细胞株中各型ADRB的表达水平,从而进一步确立何种ADRB的激活介导了儿茶酚胺类神经递质对胃癌的生长调控。从而着重研究该类ADRB的活化通过何种方式促进胃癌细胞的生长、转移。并通过构建慢性应激模型,来深入研究各型ADRB激动剂、阻断剂及ADRB2干扰在这一模型中对胃癌的发展、转移是否发挥进一步影响。这样不仅可以明确慢性应激状态能否对胃癌的发展、转移实施影响,而且更可为临床治疗胃癌、改善病患预后提供新的靶点。研究方法:1.首先RT-PCR验证各型ADRB在人胃粘膜细胞、各胃癌细胞系表达情况,Western-blot进一步验证。2.临床标本进一步验证胃癌组织中ADRB2的表达与临床特征关系。3.根据验证结果,利用体内、体外实验方法评价可能受ADRB2影响的胃癌生物学功能;4.不同浓度外源性ADRB激动剂、阻断剂对胃癌细胞增殖能力的影响,通过CCK8细胞增殖实验、平板集落形成实验、Edu实验、流式细胞技术检测细胞周期、凋亡细胞比例等实验方法,体外检测活化及阻滞ADRB信号通路对胃癌细胞系增殖及存活能力的影响。构建sh-ADRB2慢病毒质粒、包装纯化慢病毒;通过ADRB2干扰胃癌细胞系进一步验证ADRB2信号通路对肿瘤细胞增殖能力的调控;分析正常胃粘膜细胞株和胃癌细胞株胞内环磷酸腺苷（cAMP）水平;阻断及干扰ADRB2后胃癌细胞内cAMP变化;利用Western-blot检测胞内与细胞增殖、核转录相关的关键蛋白JNK、ERK、AP-1、NFκB、CREB、STAT3的表达情况,以及使用信号通路抑制剂观察是何种信号通路介导了上述作用,进一步机制层面进行验证。5.单纯慢性应激状态对裸鼠皮下成瘤能力、机体一般状态、血清激素水平的影响;6-OHDA选择性损毁小鼠外周交感神经后,观察慢性应激对裸鼠体内成瘤能力的影响。激动和阻滞ADRB信号后对慢性应激状态下裸鼠体内成瘤能力的影响、ADRB1是否参与其中发挥效应;sh-ADRB2细胞系裸鼠皮下成瘤能力的改变。这些结果与体内HPA轴持续激活的关系;采用免疫组织化学染色和TUNEL分析观察体内胃癌细胞存活能力的调节。6.建立尾静脉注射转移瘤模型:验证慢性应激状态是否通过ADRB2影响胃癌细胞株在裸鼠体内的侵袭、转移能力。Western-blot进一步验证小鼠胃癌组织中与转移、侵袭相关VEGF、MMP-2、MMP-7、MMP-9蛋白表达情况。结果:1.ADRB2在胃癌中特异性高表达;胃癌组织中ADRB2的表达水平与肿瘤的大小、病理分化程度、临床分期、淋巴结转移相关。2.慢性应激状态下,儿茶酚胺类物质能够促进胃癌发展、转移,并且这些促进效应通过活化ADRB2信号实现。3.在体外实验中,我们采用双向调控ADRB2的活性,证实了ADRB2与配体结合后通过激活ERK1/2,JNK MAPK信号通路及活化NF-κB,AP-1,CREB,STAT3等转录因子,从而调控胃癌细胞系的增殖和存活。4.ADRB2通过调控CyclinD1/CDK4/CDK6/p-Rb蛋白表达水平,影响胃癌细胞周期的进程;ADRB2通过影响Bcl-2家族、caspase-3蛋白的表达,从而介导胃癌细胞凋亡水平的调控。5.慢性应激状态可促进胃癌细胞体内增殖、转移能力。ADRB2阻滞剂可干扰胃癌细胞株体内成瘤能力,并在一定程度上对抗慢性应激对移植瘤的促生长作用。6.慢性应激致ADRB2信号通路激活后,移植瘤组织中VEGF、MMP2、MMP7、MMP9的表达均增强,且儿茶酚胺类激素可以增强转移相关蛋白的表达,导致了血管形成、转移能力的增加,从而促进肿瘤的生长、播散。ADRB2激动剂能够明显促进胃癌细胞在裸鼠体内肝肺转移能力,ADRB2阻滞剂能够明显抑制这种转移能力。7.ADRB2阻滞后可激活凋亡信号通路,从而促使胃癌细胞凋亡,继而衰减了胃癌细胞的体内成瘤能力。结论:本课题从体外胃癌细胞系、慢性应激动物实验模型和临床标本三个方面,首次证明了慢性应激状态下诱导ADRB2信号传导途径的激活在胃癌进展和转移中起关键作用。在实验中我们发现,ADRB2的表达水平同肿瘤的大小、病理分化程度、临床分期正相关。激活ADRB2信号通路能够增强胃癌细胞系体外增殖、侵袭能力以及体内成瘤能力,而阻滞、干扰ADRB2可以抑制胃癌细胞的增殖、促进胃癌细胞凋亡;ADRB2信号激活后可引发胞内cAMP的过度聚集,从而激活ERK1/2,JNK MAPK通路和活化NF-κB,AP-1,CREB,STAT3等转录因子从而促进胃癌细胞的增殖及存活。以上研究为更好研究慢性应激等外部环境因素影响胃癌进展、转移提供理论基础和依据,同时也提示临床应用ADRB2阻滞剂可作为治疗胃癌一个新策略。
姜晓燕[9]（2017）在《二烯丙基三硫醚的体内外生物转化、抗肿瘤活性及逆转顺铂诱发肾毒性的初步研究》文中研究指明研究背景大蒜是百合科葱属类植物,在我国有悠久的药用和食用历史。流行病学研究显示,大蒜的日常食用能减少许多癌症的发生率。近半个多世纪以来,大蒜中各类成分在抗肿瘤方面的研究在一直处于热点状态,目前已有部分文献记载了众多含硫化合物在抗癌方面的突出活性,尤其以前列腺癌的研究最为集中,其次是乳腺癌、结肠癌、肺癌、胃癌等。据不完全统计,大蒜中的主要成分二烯丙基硫醚（DAS）,二烯丙基二硫醚（DADS）,二烯丙基三硫醚（DATS）,S-烯丙基巯基半胱氨酸（SAMC）等化合物均报道过抗肿瘤方面的研究。而纵观当前已上市的大蒜类产品,如大蒜精油、老蒜提取物、蒜粉胶囊和片剂,这些产品多作为保健品应用,其中,大蒜精油,老蒜提取物因其混合物成分复杂,且含有的有效成分含量较低,严重限制了其疗效的发挥。而市场上少量的大蒜类药品也多作为抗细菌和抗真菌类药物应用,其市场销售量小,未见其在如抗肿瘤等更为广泛的临床应用,究其原因是缺乏更为深入且规范的研究。综合分析现有文献的研究,可总结出以下缺点:首先是对于目标化合物的选择过于随机。如现有文献中就有报道DAS、DADS、DATS、AMDS、SAC、SAMC,甚至有黑蒜提取物、蒜粉等混合物成分的抗癌作用,少有在结构上探讨过构效和量效关系的描述,亦少有兼顾其溶解度、稳定性以及代谢转化等方面的综合考量;其次,部分研究仅仅在细胞模型评价了各类化合物的抗肿瘤效果,进而探讨各类信号通路机制。由于细胞模型过于理想化,且忽略了药物进入体内的吸收、分布、代谢、排泄过程,特别是无法评价其体内免疫调节的作用;再者,偶有文献虽兼顾了体内动物模型的验证,但肿瘤模型的建立过于随意,如移植肿瘤未生长到指定大小或者刚接种即开始治疗流程,甚至在给药过程中,违背体内研究的本意,直接将药物注射在皮下瘤中;最后,绝大部分研究多为单一成分的体内外抗肿瘤研究,少有联合用药的方案研究,且均未考虑有机硫化合物进入体内后的吸收、代谢、分布情况。总之前期研究的不系统和欠规范,使得多数研究结果的应用价值较低。本课题大蒜有机硫目标化合物以及疾病治疗模型的选择是综合考量了化合物的活性、稳定性、毒性以及其流行性病学的统计结果。前期抗肿瘤药物构效关系研究表明,大蒜有机硫化合物中烯丙基和硫元素是药效官能团,其抗癌活性随着硫元素数目的增多而增强,但其稳定性降低、毒性也随之增大,经综合考量后本课题选择了二烯丙基三硫醚（DATS）单一成分作为化合物研究对象。抗肿瘤应用模型的选择是依据流行性病学统计结果,大数据统计数据表明日常大蒜食用在降低胃癌和肺癌发病率上均有着积极的作用。本课题的实验设计旨在综合体内和体外两个方面,对大蒜中含量较高其活性较强的DATS进行了较为深入的药物代谢和抗肿瘤活性评价,其主要研究内容由以下三部分组成:（1）体内外药物代谢研究,（2）抗胃癌和肺癌的药效学临床前评价,（3）与顺铂联合应用以降低顺铂毒副作用的初步研究。本课题弥补了前期研究的缺陷,为后期蒜类有机硫化合物药物的开发利用提供一些有用的实验依据。研究设计及结果（1）大蒜有机硫化合物DATS的体内外代谢及转化途径研究:在药物代谢研究方面,通过单剂量和多剂量给药大鼠DATS,GC-MS分析显示只在血浆中检测到了甲基烯丙基亚砜（AMSO）和甲基烯丙基砜（AMS02）两个代谢产物,并未检测到DATS的底物峰,说明DATS在血液中代谢较快。DATS体外代谢研究采用了大鼠红细胞模型,以HPLC技术对DATS在大鼠体外的代谢产物进行了定性研究,确证了烯丙基硫醇（AM）和DADS两个主要代谢产物;为了解释体内外代谢结果的不一致性,我们对DATS代谢转化途经进行了更为深入的研究。综合文献查阅,推测化合物甲基烯丙基硫醚（AMS）可能为其中间产物。根据甲基化反应原理,验证AM先在血细胞中甲基化生成AMS,后经由肝微粒体氧化反应生成AMSO和AMS02。而DADS已被报道可转化生成 AM。至此,我们得到 DATS → DADS → AM → AMS → AMSO → AMS02 的转化路径。在动力学方面,DATS在体内有一个迅速的代谢过程,致使体内研究上我们检测不到原型药物;但是其代谢产物AMSO,AMS02,在大鼠血浆中有较长的滞留时间。（2）DATS抗胃癌和肺癌的活性研究:利用体外细胞技术评价了 DATS的抗肿瘤活性,选择SGC-7901和BGC-823作为胃癌模型,NCI-H460为肺癌模型,结果显示DATS对这几种肿瘤细胞均有明显的抑制作用,其作用机制通过调节cyclin家族蛋白阻滞细胞周期、激活caspase级联反应、调节bcl-2家族蛋白和MAPK通路诱导细胞凋亡实现的;在体内抗肿瘤评价中,通过构建人源的肿瘤移植瘤模型,严格按照标准操作,即待肿瘤生长到100-200 mm3,进行分组实验,通过评价包括肿瘤体积、相对肿瘤体积以及相对肿瘤生长率在内的主要指标。结果显示,与对照组相比,DATS对肺癌和胃癌移植瘤均有明显的抑制作用,并且裸鼠体重无明显的降低现象。然而,经计算DATS在各肿瘤上的相对肿瘤增长率T/C（%）值,其均未达到低于40%的规范要求,说明DATS虽然具有一定的抗胃癌和肺癌效果,有可能需要与其它抗肿瘤药物联合使用。通过观察阳性对照顺铂（DDP）组后,发现DDP给药5mg/kg,虽然能达到肿瘤的抑制标准,但是其体重有显着性降低,从侧面说明DDP对机体的损伤严重。鉴于蒜类化合物独有的机体防护作用的特点,本课题设计了DDP和DATS联合治疗方案,结果显示,DATS不仅具有增强DDP疗效的作用,而且DATS联用明显抑制了 DDP单用时引起的体重降低的现象。（3）DATS及其活性代谢产物逆转顺铂诱发的肾毒性研究:顺铂在临床上存在多种副作用,其中肾毒性是临床中十分常见的不良反应。因此,本部分着重研究DATS联合DDP在改善肾毒方面的积极作用。通过构建DDP诱发的BALb/c小鼠肾损伤模型,研究DATS对其防治作用,结果显示,DATS预处理给药后,有效降低DDP引起的肾功能异常,如调节炎症因子的表达,修复肾组织中肾小管周围的损伤和炎症。在机制研究方面,选择人肾小管上皮细胞HK-2作为体外模型,经细胞活力检测显示DATS在体外研究中不具备保护肾细胞的作用。考虑DATS进入体内后形成的其他代谢产物。经过GC-MS检测全血样本和肾组织匀浆样本,确认血液、肾组织中均存在一定量的AMS02。由此本课题以AMS02作为研究目标,细胞活性实验表明其对HK-2细胞基本没有杀伤作用,且联用DDP后,能明显增加细胞活率。此外,AMS02可有效的调节caspase蛋白减少细胞凋亡的发生,显着抑制炎症介质COX-2的产生,以及调节MAPK（包括ERK,JNK,p38）和NFκB通路减少细胞内ROS的异常积累,这些均是AMS02缓解DDP对HK-2细胞毒性损伤的重要机制。此外,在验证MAPK特异性抑制剂的作用时,以JNK和ERK的抑制剂有明显的增加细胞活率和降低细胞凋亡发生的作用。由此说明,JNK和ERK可能是AMS02发挥作用的关键因子。结论本课题综合利用体内外多种代谢模型研究了 DATS的生物转化路径,并鉴定了主要代谢产物;DATS的体外和裸鼠体内抗肿瘤活性规范化研究结果表明其抗胃癌和肺癌的疗效没有达到相对肿瘤增长率T/C（%）值低于40%的规范要求;依据DATS抗肿瘤作用特点,本课题创造性地提出了联合顺铂给药的治疗方案,并验证了 DATS在提高顺铂疗效方面的积极作用;最后,探究了 DATS在缓解顺铂诱发肾毒性方面的积极作用;同时发现了 DATS活性代谢产物AMS02降低肾毒性方面的作用。本研究为大蒜类有机硫化合物的进一步药用开放提供了药物代谢和药效学方面的理论和实验参考数据。
刁凌云[10]（2019）在《中药单体藤黄酸通过调控miRNA-590-5p的功能抑制人胃癌细胞上皮—间质转移的机制研究》文中研究指明胃癌是一种常见的恶性肿瘤,根据统计,胃癌发病率位于全球恶性肿瘤的第3位,且死亡率极高。为了探索中药单体藤黄酸是否通过调节microRNA从而参与了人胃癌的发生发展,我们对添加藤黄酸处理的胃癌细胞系进行qRT-PCR分析,结果显示处理组中miR-590-5p表达水平显着上调。我们进一步对手术获取的胃癌组织与癌旁组织进行了miRNA microarray检测,我们惊喜地发现人miR-590-5p在肿瘤组织中表达显着低于对照组,推测其可能是胃癌发生潜在的抑癌基因。miR-590-5p通过PI3K-AKT-mTOR信号通路靶向调控TGF-β2参与胃癌上皮-间充质转化国内外尚未见报道。我们进一步采用microRNA.org以及Targetscan.org两个预测软件预测了miR-590-5p可能的靶基因,在两个预测软件中我们同时发现了TGF-β2基因是其潜在的下游靶点。目前尚未有文章报道miR-590-5p参与胃癌的上皮-间充质转化过程。我们课题小组推测藤黄酸可能通过引起miR-590-5p表达水平的改变进而通过调控TGF-β2以及Akt/mTOR信号通路从而抑制胃癌细胞上皮-间质转移过程。miR-590-5p可能作为一种重要的分子标记物,通过明确其信号转导机制,联合多种抑制剂或者寻找作用于多种信号通路、多靶点的新药,对于肿瘤的靶向治疗有重要意义。本研究也为中药单体用于肿瘤的治疗提供了一定的理论参考。目的:分析研究藤黄酸可通过引起miR-590-5p表达水平的改变进而通过调控TGF-β2及Akt/mTOR信号通路从而抑制胃癌细胞上皮-间质转移过程的作用及其机制,从而确藤黄酸在胃癌中的抗癌功效;通过明确其信号转导机制,联合多种抑制剂或者寻找作用于多种信号通路、多靶点的新药,对于肿瘤的靶向治疗有重要意义。本研究也为中药单体用于肿瘤治疗的提供了一定的理论参考。方法:1.藤黄酸对胃癌细胞侵袭和迁移能力以及miR-590-5p表达水平的影响1.1 Transwell侵袭和迁移实验检测藤黄酸对胃癌细胞生物学特性的影响1.2藤黄酸对胃癌细胞中miR-590-5p表达水平的影响2.胃癌miRNA筛选及其在组织和细胞中的表达检测2.1构建胃癌差异miRNAs表达谱2.2临床水平验证miR-590-5p表达情况2.3细胞水平分析miR-590-5p表达情况3.miR-590-5p对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭以及上皮-间充质转化相关基因的影响3.1噻唑蓝比色法（MTT法）检测细胞增殖情况。3.2 细胞迁移实验（Transwell migration）检测转染miR-590-5p mimics和inhibitor后细胞迁移能力。3.3 Transwell invasion实验检测转染miR-590-5p mimics和inhibitor后细胞侵袭能力。3.4 Real-time PCR以及蛋白质印迹（Westernblotting）检测上皮-间质转移marker基因E-cadherin、N-cadherin、Vimentin mRNA及蛋白表达变化。4.miR-590-5p靶基因预测及验证4.1 Targetscan以及microRNA.org数据库预测miR-590-5p下游勒靶基因为TGF-β2。4.2荧光素酶报告基因检测miR-590-5p与TGF-β2的直接靶向效应。4.3 Real-timePCR以及Western blotting检测转染miR-590-5p mimics和inhibitor后两株胃癌细胞系中TGF-β2表达变化。5.miR-590-5p调控胃癌细胞上皮-间充质转化的机制研究5.1 BGC-823 和 SGC-7901 细胞分别或者共转 miR-590-5pNC、mimics、PMIR-GLOTM-TGF-β2（突变掉3’-UTR区）或者空的PMIR-GLOTM质粒,检测TGF-β2蛋白表达变化。5.2 BGC-823 和 SGC-7901 细胞分别或者共转 miR-590-5pNC、mimics、PMIR-GLOTM-TGF-β2（突变掉3’-UTR区）或者空的PMIR-GLOTM质粒,Transwell migration检测细胞迁移能力。5.3 BGC-823 和 SGC-7901 细胞分别或者共转 miR-590-5pNC、mimics、PMIR-GLOTM-TGF-β2（突变掉3’-UTR区）或者空的PMIR-GLOTM质粒,Transwell migration检测细胞侵袭能力。5.4 BGC-823和SGC-7901细胞分别或者共转miR-590-5pNC、mimics、inhibitor后检测PI3K/AKT/mTOR通路蛋白变化。5.5 BGC-823 和 SGC-7901 细胞分别或者共转 miR-590-5pNC、mimics、PMIR-GLOTM-TGF-β2（突变掉3’-UTR区）或者空的PMIR-GLOTM质粒后检测PI3K/AKT/mTOR通路蛋白变化。5.6 BGC-823 和 SGC-7901 细胞分别或者共转 miR-590-5pNC、mimics、PMIR-GLOTM-TGF-β2（突变掉3’-UTR区）或者空的PMIR-GLOTM质粒后Western blotting检测上皮-间充质转化marker基因E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表达变化。6.体内实验验证miR-590-5p对胃癌细胞成瘤的影响6.1采用慢病毒感染法构建miR-590-5p稳定表达的胃癌细胞株。6.2将miR-590-5p稳定表达的胃癌细胞株植入裸鼠皮下,观察裸鼠体重和成瘤情况。结果:1.藤黄酸可以改变miR-590-5p的表达水平。2.在正常胃粘膜细胞和胃癌细胞系中miR-590-5p差异化表达。即胃癌细胞低表达,而正常胃粘膜细胞高表达。3.miR-590-5p mimics抑制胃癌细胞增殖,减弱胃癌细胞迁移及侵袭能力;miR-590-5pinhibitor促进胃癌细胞增殖,增强胃癌细胞迁移及侵袭能力。4.miR-590-5p通过靶向作用于TGF-β2参与胃癌的侵袭与转移。5.TGF-β32是miR-590-5p的下游靶基因,因此加入miR-590-5p mimic之后,TGF-β2的表达量降低,细胞迁移及侵袭能力下降,PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表达减低;miR-590-5p-NC不影响TGF-β2的表达量,miR-590-5p-NC+PMIR-GLOTM后TGF-β2的表达量不变;miR-590-5p+PMIR-GLOTM后TGF-ββ2的表达量减少;miR-590-5p+PMIR-GLOTM-TGF--β2后TGF-β2的表达量恢复。6.高表达miR-590-5p的BGC-823和SGC-7901细胞体内成瘤性明显下降,肿瘤体积小于对照组,与NC组比较有显着性差异。结论:1.藤黄酸可以增强胃癌中miR-590-5p表达水平。2.miR-590-5p在胃癌中低表达,是潜在的抑癌基因。3.miR-590-5p通过调控胃癌细胞中TGF-β2进而调控上皮-间充质转化进程。4.藤黄酸通过引起miR-590-5p表达水平的改变进而通过调控TGF-ββ2以及Akt/mTOR信号通路从而抑制胃癌细胞上皮-间质转移过程。
二、NDV感染体外诱导胃癌细胞BGC-823的凋亡（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、NDV感染体外诱导胃癌细胞BGC-823的凋亡（论文提纲范文）
（1）GCS参与调控维拉帕米逆转胃癌化疗多药耐药的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中文论文 |
| 英文缩略词表（Abbreviation) |
| 前言 |
| 第一部分 胃癌细胞hMDR1/P-gp表达水平与维拉帕米逆转化疗耐药能力相关性研究 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 引物 |
| 2.1.3 主要仪器与耗材 |
| 2.1.4 主要试剂耗材与药物 |
| 2.1.4.1 试剂耗材 |
| 2.1.4.2 药物 |
| 2.1.5 主要试剂配制方法 |
| 2.2. 方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 检测方法 |
| 2.2.2.1 RNA提取与RT-PCR |
| 2.2.2.2 实时荧光定量PCR |
| 2.2.2.3 CCK-8法检测胃癌细胞VER逆转抗癌药物耐药能力效率指数(IC_(50)值) |
| 2.2.2.4 Western印迹分析 |
| 3. 统计学分析 |
| 4. 结果 |
| 4.1 维拉帕米对3种胃癌细胞系(SGC-7901、BGC-823和AGS)3种化疗药物(5-Fu、ADM、DDP)逆转耐药能力判定 |
| 4.2 胃癌细胞株中hMDR1/P-gp基因对相对表达水平 |
| 4.3 hMDR1/P-gp表达水平与维拉帕米逆转胃癌细胞化疗耐药能力相关性 |
| 5. 讨论 |
| 6. 结论 |
| 第二部分 构建胃癌耐药细胞株并验证其耐药效率 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 主要仪器与耗材 |
| 2.1.3 主要试剂耗材与药物 |
| 2.1.3.1 试剂耗材 |
| 2.1.3.2 药物 |
| 2.2. 方法 |
| 2.2.1 建立胃癌5-Fu耐药细胞株SGC-7901/5-Fu |
| 2.2.2 耐药细胞株SGC-7901/5-Fu稳定性测定 |
| 2.2.3 细胞培养 |
| 2.2.4 实时荧光定量PCR |
| 2.2.5 CCK-8法检测胃癌细胞VER逆转抗癌药物耐药能力效率指数(IC_(50)值) |
| 2.2.6 Western印迹分析 |
| 3. 统计学分析 |
| 4. 结果 |
| 4.1 胃癌耐药细胞株SGC-7901/5-Fu稳定性检测药物 |
| 4.2 胃癌耐药细胞株SGC-7901/ADM耐药性检测 |
| 4.3 胃癌耐药细胞株对3种抗癌药物(5-Fu、ADM、DDP)药物敏感性检测 |
| 4.4 胃癌耐药细胞株hMDR1/P-gp的相对表达水平 |
| 4.5 维拉帕米对胃癌耐药细胞株对3种抗癌药物(5-Fu、ADM、DDP)逆转耐药能力判定 |
| 5. 讨论 |
| 6. 结论 |
| 第三部分 介导维拉帕米逆转胃癌细胞化疗耐药能力差异基因的筛选、确证及机制研究 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 引物 |
| 2.1.3 主要仪器与耗材 |
| 2.1.4 主要试剂耗材与药物 |
| 2.1.4.1 试剂耗材 |
| 2.1.4.2 药物 |
| 2.1.4.3 主要抗体 |
| 2.1.4.4 菌株与质粒 |
| 2.2. 方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 质粒抽提 |
| 2.2.3 质粒DNA转染 |
| 2.2.4 siRNA转染 |
| 2.2.5 实时荧光定量PCR |
| 2.2.6 Western印迹分析 |
| 2.2.7 Annexin V-FTC/PI双染细胞凋亡检测 |
| 2.2.8 介导维拉帕米逆转胃癌细胞化疗耐药能力差异基因的筛选 |
| 3. 统计学分析 |
| 4. 结果 |
| 4.1 胃癌耐药差异基因的筛选 |
| 4.2 实时荧光定量PCR法检测候选基因在胃癌细胞中的表达 |
| 4.3 Western blot法检测候选蛋白在胃癌细胞中的表达 |
| 4.4 胃癌SGC-7901细胞和SGC-7901/5-Fu细胞GCS基因表达沉默和过表达验证 |
| 4.5 改变GCS基因表达水平,VER逆转ADM化疗耐药能力变化 |
| 4.6 改变GCS基因表达水平,对VER干预后的胃癌细胞凋亡水平影响 |
| 4.7 改变GCS基因表达水平,凋亡信号通路蛋白Bcl-2变化 |
| 4.8 改变GCS基因表达水平,凋亡信号通路蛋白ERK变化 |
| 5. 讨论 |
| 6. 结论 |
| 第四部分 临床研究P-gp、GCS蛋白在胃癌病例组织样本中的表达 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1 胃癌组织标本 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 临床资料分类 |
| 2.3.1 纳入标准 |
| 2.3.2 排除标准 |
| 2.3.3 剔除标准 |
| 2.4 VER联合TACE治疗方式 |
| 2.5 疗效评价 |
| 2.5.1 肿瘤病灶的变化 |
| 2.5.2 临床收益判断 |
| 2.6 免疫组化 |
| 3. 统计学分析 |
| 4. 结果 |
| 4.1 肿瘤原发病灶治疗疗效评价 |
| 4.2 生存期评价 |
| 4.3 免疫组化法检测P-gp蛋白在胃癌临床标本中的表达情况 |
| 4.4 免疫组化法检测GCS蛋白在胃癌临床标本中的表达情况 |
| 5. 讨论 |
| 6. 结论 |
| 讨论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 图表索引 |
| 综述 肿瘤多药耐药机制的研究现状及进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表(含待发表)学术论文 |
| 附英文论文 |
| ABSTRACT |
| Abbreviation List (Abbreviation) |
| PREFACE |
| Chapter 1. The correlation between the expression level of P-gp and the reversal ofVER's resistance to chemotherapy in gastric carcinoma cells |
| 1.Introduction |
| 2. Materials and Methods |
| 2.1 material |
| 2.1.1 cell line |
| 2.1.2 primer |
| 2.1.3 Main instruments and consumables |
| 2.1.4 Main reagents, consumables and drugs |
| 2.1.4.1 Reagent consumables |
| 2.1.4.2 Medicine |
| 2.1.5 Preparation method of main reagents |
| 2.2. Method |
| 2.2.1 Cell culture |
| 2.2.2 Test Method |
| 2.2.2.1 RNA extraction and RT-PCR |
| 2.2.2.2 Real time fluorescent quantitative PCR |
| 2.2.2.3 CCK-8 method was used to detect the efficiency index (IC50 value) of VER reversing chemotherapy drug resistance of gastric cancer cells |
| 2.2.2.4 Western blot analysis |
| 3. Statistical analysis |
| 4. Results |
| 4.1 The ability of verapamil to reverse drug resistance of SGC-7901, BGC-823 and AGS cells to 5-FU, ADM and DDP |
| 4.2 Relative expression level of hMDR1/P-gp gene in gastric cancer cell lines |
| 4.3 Relationship between hMDR1/P-gp expression and VER+ADM resistance(Relative IC_(50)) |
| 5. Discuss |
| 6. Conclusion |
| Chapter2 Construct gastric cancer drug-resistant cell line and verify its drug-resistant efficiency |
| 1.Introduction |
| 2. Materials and Methods |
| 2.1 Material |
| 2.1.1 cell line |
| 2.1.2 Main instruments and consumables |
| 2.1.3 Main reagents, consumables and drugs |
| 2.1.3.1 Reagent consumables |
| 2.1.3.2 Medicine |
| 2.2. Method |
| 2.2.1 Establishment of gastric cancer 5-Fu resistant cell line SGC-7901/5-Fu |
| 2.2.2 Stability of drug resistant cell line SGC-7901/5-Fu |
| 2.2.3 Cell culture |
| 2.2.4 Real time fluorescent quantitative PCR |
| 2.2.5 CCK-8 method was used to detect the efficiency index (IC_(50) value) of verapamil reversing chemotherapy drug resistance |
| 2.2.6 Western blot |
| 3. Statistical analysis |
| 4. Results |
| 4.1 Stability of drug resistant gastric cancer cell line SGC-7901/5-Fu |
| 4.2 Detection of drug resistance in gastric cancer cell line SGC-7901/ADM |
| 4.3 Detection of drug sensitivity of gastric cancer cell lines to three chemotherapeutic drugs (5-FIJ, ADM, DDP) |
| 4.4 Relative expression level of drug resistant gastric cancer cell line hMDR1/P-gp |
| 4.5 The ability of verapamil to reverse drug resistance of gastric cancer cell lines SGC-7901/5-Fu and SGC-7901/ADM to three chemotherapeutic drugs (5-FU,ADM and DDP) |
| 5. Discuss |
| 6. Conclusion |
| Chapter3 Screening,confirmation and mechanism study of differential genes mediated by VER in the reversal of chemotherapy resistance of gastric carcinoma cells |
| 1 .Introduction |
| 2. Materials and Methods |
| 2.1 Material |
| 2.1.1 Cell line |
| 2.1.2 Primer |
| 2.1.3 Main instruments and consumables |
| 2.1.4 Main reagents, consumables and drugs |
| 2.1.4.1 Reagent consumables |
| 2.1.4.2 Medicine |
| 2.1.4.3 Major antibodies |
| 2.1.4.4 Strains and plasmids |
| 2.2 Method |
| 2.2.1 Cell culture |
| 2.2.2 Plasmid Extraction |
| 2.2.3 plasmid DNA transfection |
| 2.2.4 siRNA transfection |
| 2.2.5 qRT-PCR |
| 2.2.6 Western blot |
| 2.2.7 Detection of apoptosis by annexin V-FITC / PI double staining |
| 2.2.8 Screening of differentially expressed genes mediated by verapamil in reversing cell chemo resistance gastric cancer |
| 3. Statistical analysis |
| 4. Results |
| 4.1 Screening of drug resistance genes in gastric cancer |
| 4.2 Detection of candidate gene expression in GC ceils by qRT-PCR |
| 4.3 Western blot was used to detect the expression of candidate proteins in gastric cancer cells |
| 4.4 Verification of GCS gene silencing and overexpression in SGC-7901 cells and SGC-7901/5-Fu cells |
| 4.5 Change the expression level of GCS gene and the change in the ability of VER to reverse ADM chemotherapy resistance |
| 4.6 Changing the expression level of GCS gene affected the apoptosis level of gastric cancer cells after VER intervention |
| 4.7 Change the expression of GCS gene and Bcl-2 |
| 4.8 Change the expression of GCS gene and pERK |
| 5. Discuss |
| 6. Conclusion |
| Chapter4 Clinical study on the expression of P-gp and GCS in tissue samples of gastric cancer cases |
| 1. Introduction |
| 2. Materials and Methods |
| 2.1 Tissue samples of gastric cancer |
| 2.2 Main reagents |
| 2.3 classification of clinical data |
| 2.3.1 Inclusion criteria |
| 2.3.2 Exclusion criteria |
| 2.3.3 Exclusion criteria |
| 2.4 VER Combined TACE treatment |
| 2.5 Efficacy evaluation |
| 2.5.1 Changes of tumor focus |
| 2.5.2 Clinical benefit judgment |
| 2.5.2.1 Survival evaluation |
| 2.6 Immunohistochemical |
| 3. Statistical analysis |
| 4. Results |
| 4.1 Evaluation of therapeutic effect of primary tumor |
| 4.2 The PFS and OS |
| 4.3 The expression of P-gp protein in clinical specimens of gastric cancer was detected by immunohistochemistry |
| 4.4 The expression of GCs protein in clinical specimens of gastric cancer was detected by immunohistochemistry |
| 5. Discussion |
| 6. Conclusion |
| Discussion and Outlook |
| Reference |
| Attached The Chart Index |
| REVIEW Research status and progress of multi drug resistance mechanism incancer |
| Reference |
| Acknowledgement |
| Academic papers published (including to be published)during academic degree |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（2）双硫仑联合铜通过调控应激反应与Wnt/β-catenin信号通路抑制胃癌细胞生长（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 胃癌的研究进展 |
| 1.1.1 胃癌的治疗现状 |
| 1.1.2 应激反应与Wnt/β-catenin信号通路在胃癌中的作用 |
| 1.2 双硫仑的研究进展 |
| 1.2.1 双硫仑的抗肿瘤作用 |
| 1.2.2 双硫仑联合铜的抗肿瘤作用 |
| 1.3 本文的研究内容与目标 |
| 第二章 双硫仑联合铜对人胃癌细胞的体外作用 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 实验药物 |
| 2.1.3 质粒 |
| 2.1.4 实验试剂 |
| 2.1.5 实验仪器 |
| 2.1.6 实验相关抗体 |
| 2.1.7 相关液体的配置及保存方式 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 CCK-8细胞增殖(活力)检测 |
| 2.2.3 细胞克隆形成检测 |
| 2.2.4 细胞划痕实验 |
| 2.2.5 细胞Transwell迁移实验 |
| 2.2.6 细胞凋亡检测 |
| 2.2.7 细胞自噬检测 |
| 2.2.8 活性氧的检测 |
| 2.2.9 免疫印迹法检测凋亡、自噬、DNA损伤修复及Wnt/β-catenin信号通路中相关蛋白表达 |
| 2.2.10 糖酵解和线粒体呼吸的检测 |
| 2.2.11 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 双硫仑联合铜对胃癌细胞增殖活性的作用 |
| 2.3.2 双硫仑联合铜抑制胃癌细胞克隆形成 |
| 2.3.3 双硫仑联合铜对胃癌细胞划痕愈合能力的作用 |
| 2.3.4 双硫仑联合铜对胃癌细胞中的侵袭效应 |
| 2.3.5 双硫仑联合铜对胃癌细胞凋亡效应的调控 |
| 2.3.6 双硫仑联合铜对胃癌细胞自噬的影响 |
| 2.3.7 双硫仑联合铜对胃癌细胞氧化应激和DNA损伤的影响 |
| 2.3.8 双硫仑联合铜对胃癌细胞能量代谢的影响 |
| 2.3.9 双硫仑联合铜对Wnt/β-catenin信号通路的影响 |
| 2.4 实验小结 |
| 第三章 双硫仑联合铜对人胃癌细胞的体内作用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验相关仪器 |
| 3.1.4 实验相关抗体 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 胃癌皮下移植瘤的建立及药物干预 |
| 3.2.2 苏木精-伊红染色 |
| 3.2.3 Tunel染色 |
| 3.2.4 免疫组化染色 |
| 3.2.5 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 双硫仑联合铜对胃癌皮下移植瘤的生长抑制效应 |
| 3.3.2 双硫仑联合铜对胃癌皮下移植瘤凋亡和自噬效应 |
| 3.3.3 双硫仑联合铜对裸鼠胃癌皮下移植瘤中应激反应与Wnt/β-catenin通路的影响 |
| 3.4 实验小结 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 附 缩略词简表 |
| 在学期间研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（3）基于lncRNA GAS5/miR-23a/Apaf-1通路研究藤黄酸B对胃癌细胞caspase-3依赖凋亡及焦亡的影响及机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 1 实验材料与仪器 |
| 1.1 药物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 细胞 |
| 1.4 动物 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 MA的提取分离纯化、含量测定及稳定性考察 |
| 2.1.1 MA的提取分离纯化及含量测定 |
| 2.1.2 MA的稳定性考察 |
| 2.2 MA抗胃癌活性及其对caspase-3依赖凋亡及焦亡影响的体外研究 |
| 2.2.1 受试药物配制 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 MTT法检测MA对不同胃癌细胞株体外增殖的抑制作用 |
| 2.2.4 划痕实验观察胃癌细胞迁移 |
| 2.2.5 Annexin V-PI双染法测定胃癌细胞凋亡率 |
| 2.2.6 Western-blot测定胃癌细胞中caspase-3依赖凋亡相关蛋白表达 |
| 2.2.7 荧光倒置显微镜观察胃癌细胞的焦亡 |
| 2.2.8 乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒测定胃癌细胞LDH释放率 |
| 2.2.9 Western-blot测定胃癌细胞中caspase-3依赖焦亡相关蛋白表达水平 |
| 2.3 MA抗胃癌活性及其对caspase-3依赖凋亡及焦亡影响的体内研究 |
| 2.3.1 受试药物配制 |
| 2.3.2 BALB/c小鼠胃癌皮下异位移植模型的制备 |
| 2.3.3 动物分组、给药与处理 |
| 2.3.4 小鼠胃癌皮下异位移植模型中观察MA对肿瘤生长的影响 |
| 2.3.5 HE染色法观察肿瘤组织病理形态 |
| 2.3.6 免疫组化检测胃癌模型小鼠胃癌细胞增殖 |
| 2.3.7 Western-blot测定胃癌组织中caspase-3依赖凋亡相关蛋白表达水平 |
| 2.3.8 Western-blot测定胃癌组织中caspase-3依赖焦亡相关蛋白表达水平 |
| 2.4 MA促进胃癌细胞caspase-3依赖凋亡及焦亡的分子机制研究 |
| 2.4.1 受试药物配制 |
| 2.4.2 细胞培养 |
| 2.4.3 RT-qRCR检测MA对于胃癌细胞及肿瘤组织中lncRNA GAS5表达的影响 |
| 2.4.4 siRNA建立lncRNA GAS5低表达胃癌瞬转细胞株 |
| 2.4.5 lncRNA GAS5低表达胃癌瞬转细胞分组与给药 |
| 2.4.6 Annexin V-PI双染法测定lncRNA GAS5低表达胃癌细胞凋亡率 |
| 2.4.7 荧光倒置显微镜观察lncRNA GAS5低表达胃癌细胞焦亡 |
| 2.4.8 乳酸脱氢酶(LHD)试剂盒测定lncRNA GAS5低表达胃癌细胞LDH释放率 |
| 2.4.9 RT-qPCR测定lncRNA GAS5低表达胃癌细胞中lncRNA GAS5/mi R-23a/Apaf-1通路相关RNA水平 |
| 2.4.10 Western-bolt实验测定lncRNA GAS5低表达胃癌细胞中lncRNA GAS5/miR-23a/Apaf-1通路相关蛋白表达 |
| 2.4.11 shRNA构建lncRNA GAS5低表达胃癌稳转细胞株 |
| 2.4.12 lncRNA GAS5低表达胃癌动物模型的制备 |
| 2.4.13 lncRNA GAS5低表达动物分组与给药 |
| 2.4.14 lncRNA GAS5低表达胃癌动物模型中观察MA对皮下移植瘤生长的影响。 |
| 2.4.15 RT-qPCR测定lncRNA GAS5低表达胃癌组织中lncRNA GAS5/miR-23a/Apaf-1通路相关RNA水平 |
| 2.4.16 Western-bolt实验测定lncRNA GAS5低表达胃癌组织中lncRNA GAS5/miR-23a/Apaf-1通路相关蛋白表达 |
| 2.5 数据结果分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 MA的提取分离纯化、含量测定及稳定性考察 |
| 3.1.1 MA提取分离纯化及含量测定 |
| 3.1.2 MA的稳定性考察 |
| 3.2 MA抗胃癌活性及其对caspase-3依赖凋亡及焦亡影响的体外研究 |
| 3.2.1 MA对不同胃癌细胞株体外增殖的抑制作用 |
| 3.2.2 MA对胃癌MKN-45及MFC细胞迁移能力的影响 |
| 3.2.3 进一步研究中受试细胞系的选择 |
| 3.2.4 MA对胃癌MKN-45及MFC细胞凋亡率的影响 |
| 3.2.5 MA对胃癌MKN-45及MFC细胞中凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 3.2.6 MA对胃癌MKN-45及MFC细胞焦亡形态的影响 |
| 3.2.7 MA对胃癌MKN-45及MFC细胞LDH释放的影响 |
| 3.2.8 MA对胃癌MKN-45及MFC细胞中焦亡相关蛋白表达的影响 |
| 3.3 MA抗胃癌活性及其对caspase-3 依赖凋亡及焦亡影响的体内研究 |
| 3.3.1 MA对胃癌模型小鼠体内肿瘤生长的影响 |
| 3.3.2 MA对于胃癌模型小鼠体内肿瘤组织病理形态的影响 |
| 3.3.3 MA对胃癌模型小鼠体内肿瘤细胞增殖的影响 |
| 3.3.4 MA对胃癌组织中凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 3.3.5 MA对胃癌组织中焦亡相关蛋白表达的影响 |
| 3.4 MA通过lncRNA GAS5/miR-23a/Apaf-1通路促进胃癌细胞caspase-3依赖凋亡和焦亡 |
| 3.4.1 MA对胃癌细胞及肿瘤组织中lncRNA GAS5表达的影响 |
| 3.4.2 MA对lncRNA GAS5低表达胃癌细胞凋亡率的影响 |
| 3.4.3 MA对lncRNA GAS5低表达胃癌细胞焦亡形态的影响 |
| 3.4.4 MA对于lncRNA GAS5低表达胃癌细胞LDH释放的影响 |
| 3.4.5 MA对lncRNA GAS5低表达胃癌细胞中lncRNA GAS5,miR-23a以及Apaf-1 mRNA水平的影响 |
| 3.4.6 MA对lncRNA GAS5低表达胃癌细胞中cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、GSDME-NT、Apaf-1以及IL-18 蛋白表达的影响 |
| 3.4.7 lncRNA GAS5低表达稳定转染细胞株构建的最优条件 |
| 3.4.8 MA对lncRNA GAS5低表达胃癌皮下移植瘤生长的影响 |
| 3.4.9 MA对lncRNA GAS5低表达胃癌组织中lncRNA GAS5,miR-23a以及Apaf-1 mRNA水平的影响 |
| 3.4.10 MA对lncRNA GAS5低表达胃癌组织中cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、GSDME-NT、Apaf-1以及IL-18 蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 MA抑制胃癌细胞增殖和迁移 |
| 4.2 MA体外诱导胃癌细胞caspase-3依赖凋亡 |
| 4.3 MA体外诱导胃癌细胞caspase-3依赖焦亡 |
| 4.4 小鼠胃癌皮下异位移植模型的制备 |
| 4.5 MA抑制胃癌模型小鼠体内肿瘤的生长 |
| 4.6 MA体内诱导胃癌细胞caspase-3依赖凋亡及焦亡 |
| 4.7 MA上调胃癌细胞及肿瘤组织中lncRNA GAS5水平 |
| 4.8 MA通过lncRNA GAS5/miR-23a/Apaf-1通路促进胃癌细胞caspase-3依赖凋亡及焦亡,抑制小鼠体内肿瘤的生长 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 不足之处与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 Antitumor effects and mechanisms related to the induction of programmed tumor cell death by active components in Resina Garciniae |
| Reference |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（4）新加良附方调控miR-34a/SIRT1/p53及Caspase凋亡通路抑制胃癌的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 中药抗胃癌基础研究现状与进展 |
| 1 中药有效成分基础研究 |
| 2 单味中药基础研究 |
| 3 复方基础研究 |
| 4 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 胃癌相关miRNA研究现状与展望 |
| 1 miRNA在胃癌发生发展中的作用研究 |
| 2 miRNA在胃癌诊断治疗中的作用研究 |
| 3 思考与展望 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 新加良附方及薯蓣皂苷元抑制胃癌细胞功能作用及机制研究 |
| (一) 新加良附方抑制人胃癌细胞功能实验 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| (二) 薯蓣皂苷元抑制人胃癌细胞功能实验 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| (三) 新加良附方及薯蓣皂苷元调控miR-34a作用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| (四) 新加良附方及薯蓣皂苷元调控miR-34a抗胃癌作用机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 新加良附方及薯蓣皂苷元对裸鼠胃癌移植瘤抑制作用及机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
（5）生长抑素通过Wnt/β-catenin调控上皮间质转化抑制胃癌细胞迁移侵袭（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 载体 |
| 1.2 菌株和细胞系 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要试剂盒 |
| 1.5 主要仪器 |
| 1.6 常用培养基和缓冲液的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 细胞计数 |
| 2.3 重组慢病毒载体构建、病毒包装与滴度检测 |
| 2.4 构建稳转细胞株 |
| 2.5 实时荧光定量PCR (QRT-PCR) |
| 2.6 蛋白免疫印迹(Western blotting) |
| 2.7 SST过表达对细胞器的影响 |
| 2.8 SST过表达对细胞行为功能学影响 |
| 2.9 SST过表达对上皮间质转化的影响 |
| 2.10 Wnt/β-catenin信号通路对上皮间质转化影响 |
| 2.11 统计学分析 |
| 实验结果 |
| 1. 慢病度滴度测定荧光成像结果 |
| 2. QRT-PCR检测胃癌细胞中SST mRNA水平表达 |
| 3. WB检测胃癌细胞中SST蛋白水平表达 |
| 4. SST过表达影响细胞器形态 |
| 5. SST过表达影响细胞行为功能 |
| 5.1 细胞增殖(MTT)结果 |
| 5.2 细胞划痕结果 |
| 5.3 Transwell结果 |
| 6.SST过表达细胞抑制上皮间质转化 |
| 7.SST过表达通过Wnt/β-catenin通路影响上皮间质转化 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 生长抑素及其类似物在肿瘤信号通路中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（6）健脾为主的中药对胃癌术后无病生存期的影响及实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 健脾为基础的中药对胃癌术后无病生存期的影响 |
| 1 临床资料 |
| 1.1 病例来源 |
| 1.2 诊断标准 |
| 1.2.1 疾病诊断标准 |
| 1.2.2 中医辨证标准 |
| 1.3 纳排标准 |
| 1.3.1 纳入标准 |
| 1.3.2 排除标准 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 分组方法 |
| 2.2 治疗方案 |
| 2.2.1 中医药辨证治疗 |
| 2.2.2 化疗 |
| 2.2.3 合并用药及治疗 |
| 2.3 观察项目 |
| 2.4 评价指标 |
| 2.5 资料收集、管理及随访 |
| 2.6 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 病例资料描述 |
| 3.2 Ⅲ期患者全组病例分析 |
| 3.2.1 单因素分析 |
| 3.2.2 多因素分析 |
| 3.2.3 基线比较 |
| 3.3 分层研究 |
| 3.3.1 IIIA期亚组 |
| 3.3.2 IIIB期亚组 |
| 3.3.3 IIIC期亚组 |
| 第二部分 胃肠安活性成分熊果酸诱导胃癌细胞凋亡的研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 实验药物 |
| 1.3 生化试剂 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 常用试剂的配制 |
| 2.2 细胞的培养 |
| 2.2.1 复苏细胞 |
| 2.2.2 细胞传代 |
| 2.2.3 细胞冻存 |
| 2.3 细胞增殖实验 |
| 2.4 细胞周期的检测 |
| 2.5 细胞凋亡实验 |
| 2.5.1 流式细胞术检测凋亡 |
| 2.5.2 Hoechst染色检测细胞凋亡形态 |
| 2.5.3 Western Blot检测凋亡相关蛋白 |
| 2.6 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 熊果酸抑制胃癌细胞的生长 |
| 3.2 熊果酸诱导胃癌细胞周期阻滞 |
| 3.3 熊果酸诱导胃癌细胞凋亡 |
| 3.3.1 流式细胞数检测细胞凋亡 |
| 3.3.2 Hoechst染色检测细胞凋亡形态 |
| 3.3.3 Western Blot检测凋亡相关蛋白 |
| 讨论 |
| 1 从“脾虚”论胃癌 |
| 1.1 “脾虚”是胃癌发生的基本因素 |
| 1.2 “健脾”为基础的辨证治疗对胃癌根治术后DFS的影响 |
| 2 化疗对胃癌根治术后DFS的影响 |
| 3 临床病理分期对胃癌根治术后DFS的影响 |
| 4 其他因素对胃癌根治术后DFS的影响 |
| 5 胃肠安的活性成分熊果酸诱导胃癌细胞凋亡 |
| 5.1 熊果酸抑制胃癌细胞增殖并阻滞细胞周期 |
| 5.2 熊果酸可以诱导细胞凋亡 |
| 6 问题与展望 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录一 文献综述 熊果酸抗肿瘤作用机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录二 病例报告表 |
| 附录三 附件 |
（7）重组麻疹病毒沪191株（r-MV-Hu191株）以及联合顺铂对胃癌的溶瘤作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 第一部分 重组麻疹病毒减毒株(r-MV-Hu191株)对胃癌溶瘤作用及其机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 研究对象及方法 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 7 参考文献 |
| 第二部分 重组麻疹病毒减毒株(r-MV-Hu191株)联合顺铂治疗胃癌的作用及机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 研究对象及方法 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 7 参考文献 |
| 全文结论 |
| 存在问题 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在读期间所取得的科研成果 |
（8）ADRB2介导慢性应激调控胃癌发展的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 序言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 ADRB2在胃癌中表达及临床意义 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 ADRB2对胃癌细胞生物学行为影响及机制研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 ADRB2介导慢性应激调控胃癌进展及机制研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 英汉缩略词对照(Abbreviations) |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（9）二烯丙基三硫醚的体内外生物转化、抗肿瘤活性及逆转顺铂诱发肾毒性的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 大蒜中有机硫化合物的来源和生物活性(综述) |
| 第一章 大蒜中有机硫化物的活性及研究现状 |
| 1.大蒜中有机硫化合物的来源 |
| 2.有机硫化合物的生物活性 |
| 3.上市的蒜类产品现状 |
| 4.大蒜抗癌活性的研究现状 |
| 5.本课题的设计思路 |
| 参考文献 |
| 第二部分 DATS的体内外生物转化及动力学研究 |
| 前言 |
| 第二章 DATS在大鼠体内的代谢研究 |
| 1.仪器与动物 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 动物 |
| 1.3 试剂与药品 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 大鼠体内代谢实验 |
| 2.2 血液样本采集 |
| 2.3 尿液样本采集 |
| 2.4 胆汁样本采集 |
| 2.5 组织样本采集 |
| 2.6 大鼠体内样本预处理 |
| 2.7 气相质谱条件 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 单剂量给药 |
| 3.2 多剂量给药后血浆中代谢物 |
| 3.3 多剂量给药后尿液中代谢产物 |
| 3.4 多剂量给药后胆汁中代谢产物检测 |
| 3.5 多剂量给药后大鼠各组织中代谢产物检测 |
| 4.讨论 |
| 5.本章小结 |
| 第三章 DATS在体外的生物转化途径研究 |
| 1.仪器与动物 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 动物 |
| 1.3 试剂与药品 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 DATS在大鼠血液体系主要代谢产物的确证 |
| 2.2 方法学验证 |
| 2.3 反应条件的选择 |
| 2.4 血细胞稀释比例的优化 |
| 2.5 DATS在大鼠全血、血浆和血细胞中代谢动力学 |
| 2.6 DATS在全血中酶促动力学 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 DATS在大鼠血中各部位代谢产物的确证 |
| 3.2 方法学验证 |
| 3.2.1 检测波长的选择 |
| 3.2.2 专属性 |
| 3.2.3 标准曲线和定量下限 |
| 3.2.4 精密度和准确度 |
| 3.2.5 回收率 |
| 3.2.6 样品处理后室温稳定性 |
| 3.3 DATS的在反应体系中的稳定性研究 |
| 3.4 不同血细胞浓度选择 |
| 3.5 DATS在大鼠全血、血浆以及血细胞中代谢动力学 |
| 3.6 表观动力学 |
| 4.讨论 |
| 5.本章小节 |
| 参考文献 |
| 第三部分 DATS在胃癌和肺癌中的抗肿瘤活性研究 |
| 第四章 蒜类有机硫化合物在胃癌和肺癌中研究进展 |
| 1.蒜类化合物在胃癌相关疾病中的研究进展 |
| 2.蒜类化合物在肺癌相关疾病中的研究进展 |
| 3.蒜类化合物在联合用药中的应用 |
| 第五章 DATS对胃癌的体内外抗肿瘤活性研究 |
| 1.仪器与动物 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 细胞和动物 |
| 1.3 试剂和药品 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 肿瘤细胞活力测定 |
| 2.2 细胞周期检测实验 |
| 2.3 细胞核DAPI染色实验 |
| 2.4 Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡 |
| 2.5 裸鼠肿瘤移植实验 |
| 2.6 ELISA测定血清中细胞因子 |
| 2.7 RT-PCR测定脾脏中细胞因子的表达 |
| 2.8 肿瘤组织病理学检查 |
| 2.9 TUNEL法检测肿瘤组织凋亡 |
| 2.10 免疫组化检测肿瘤组织中相关蛋白 |
| 2.11 Western blot检测细胞和肿瘤组织中相关蛋白 |
| 2.12 统计分析 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 DATS抑制胃癌细胞BGC-823和SGC-7901体外增殖 |
| 3.2 DATS阻滞胃癌细胞周期进程,调节周期相关蛋白的表达 |
| 3.3 DATS诱导胃癌细胞形态学变化和促进凋亡 |
| 3.4 DATS调节胃癌细胞中bcl-2家族蛋白的表达 |
| 3.5 DATS激活caspase级联反应 |
| 3.6 DATS调节MAPK及Nrf2通路 |
| 3.7 DATS抑制胃癌肿瘤组织的生长 |
| 3.8 DATS增强DDP治疗胃癌的效果 |
| 3.9 DATS增强血清中免疫因子的表达 |
| 3.10 DATS增强脾脏中相关免疫因子的表达 |
| 3.11 DATS促进肿瘤组织的凋亡 |
| 3.12 肿瘤中MAPK通路的影响 |
| 4.讨论 |
| 5.本章小结 |
| 第六章 DATS对肺癌的体内外抗肿瘤活性研究 |
| 1.仪器与动物 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 细胞培养和细胞生长抑制试验 |
| 2.2 流式分析细胞周期 |
| 2.3 DAPI染色 |
| 2.4 Annexin V/PI双染检测凋亡 |
| 2.5 肺癌移植瘤模型的建立 |
| 2.6 HE染色和免疫组化分析 |
| 2.7 TUNEL检测组织细胞原位凋亡 |
| 2.8 Western blot分析 |
| 2.9 数据统计 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 DATS抑制NCI-H460细胞的生长且阻滞细胞周期进程 |
| 3.2 DATS诱导NCI-H460细胞凋亡 |
| 3.3 DATS诱导caspase激活,调节Bcl-2家族蛋白的表达 |
| 3.4 DATS具备体内抗肿瘤活性且增强顺铂的抗肿瘤疗效 |
| 3.5 DATS抑制肿瘤生长且诱导肿瘤组织凋亡 |
| 3.6 DATS调节肿瘤组织中粘附相关蛋白的表达 |
| 3.7 DATS减轻顺铂诱发的氧化损伤 |
| 3.8 DATS调节MAPK通路的激活 |
| 4.讨论 |
| 5.本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 DATS逆转顺铂诱发的肾毒性研究 |
| 前言 |
| 第七章 DATS逆转顺铂诱发的小鼠急性肾损伤 |
| 1.仪器与动物 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 动物 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 小鼠肾损伤模型的建立 |
| 2.2 样本采集 |
| 2.3 肾功能评价指标 |
| 2.4 组织病理检测 |
| 2.5 NF-κB免疫组化染色 |
| 2.6 ELISA检测IFN-γ,TNF-α,IL-1β和IL-6 |
| 2.7 统计分析 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 DATS对小鼠体重以及肾比重影响 |
| 3.2 DATS改善顺铂引起的肾功损伤 |
| 3.3 DATS预防肾小管的炎症损伤 |
| 3.4 DATS降低机体炎症因子的表达 |
| 4.讨论 |
| 5.本章小结 |
| 第八章 DATS代谢产物的确证及其肾保护机制研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 细胞 |
| 2.实验方法 |
| 2.1. 组织和血液样本预处理 |
| 2.2. GC-MS检测 |
| 2.3. 细胞培养 |
| 2.4. 筛选目标化合物 |
| 2.5. 细胞凋亡 |
| 2.6. ROS测定 |
| 2.7. Western分析Caspase, NFκB和MAPK相关蛋白 |
| 2.8. MAPK特异性抑制剂 |
| 2.9. 数据统计 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 鉴别血液和肾组织中的代谢物 |
| 3.2 AMSO2埔强DDP处理后HK-2细胞的活力 |
| 3.3 AMSO2减轻DDP诱导的HK-2细胞凋亡 |
| 3.4 AMSO2抑制DDP诱导的HK-2细胞caspase级联激活 |
| 3.5 AMSO2抑制DDP诱导的HK-2细胞ROS生成 |
| 3.6 AMSO2抑制DDP诱导的MAPK和NFκB通路激活 |
| 3.7 JNK和ERK在DDP损伤细胞中的作用 |
| 4.讨论 |
| 5.本章小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（10）中药单体藤黄酸通过调控miRNA-590-5p的功能抑制人胃癌细胞上皮—间质转移的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 一. 藤黄酸及其抗肿瘤机制的研究进展 |
| 1. 逆转肿瘤耐药 |
| 2. 增强机体免疫力 |
| 3. 诱导细胞凋亡 |
| 4. 抑制血管生成 |
| 5. 化疗增敏剂 |
| 6. 抑制细胞增殖 |
| 7. 抑制肿瘤细胞粘附 |
| 二. miRNA参与胃癌EMT的发生机制研究 |
| 1. EMT的信号转导通路与转录调控 |
| 2. EMT和肿瘤的侵袭潜力 |
| 3. TGF-β诱导上皮-间质转化中的信号通路号 |
| 4. MicroRNAs调节ENT及癌症转移 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 藤黄酸对胃癌细胞侵袭和迁移能力以及miR-590-5p表达水平的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验二 胃癌miRNA筛选及其在组织和细胞中的表达检测 |
| 1. 材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验三 miR-590-5p对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭以及EMT相关基因的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验四 miR-590-5p靶基因预测及验证 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验五 miR-590-5p调控胃癌细胞EMT的机制研究 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验六 体内实验验证miR-590-5p对胃癌细胞成瘤的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 结论 |
| 创新与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、NDV感染体外诱导胃癌细胞BGC-823的凋亡（论文参考文献）
- [1]GCS参与调控维拉帕米逆转胃癌化疗多药耐药的作用研究[D]. 王旭. 山东大学, 2021(10)
- [2]双硫仑联合铜通过调控应激反应与Wnt/β-catenin信号通路抑制胃癌细胞生长[D]. 王玲. 兰州大学, 2021(09)
- [3]基于lncRNA GAS5/miR-23a/Apaf-1通路研究藤黄酸B对胃癌细胞caspase-3依赖凋亡及焦亡的影响及机制[D]. 贾步云. 安徽中医药大学, 2021(01)
- [4]新加良附方调控miR-34a/SIRT1/p53及Caspase凋亡通路抑制胃癌的机制研究[D]. 李亚. 北京中医药大学, 2020(04)
- [5]生长抑素通过Wnt/β-catenin调控上皮间质转化抑制胃癌细胞迁移侵袭[D]. 丁瑞贤. 郑州大学, 2020(02)
- [6]健脾为主的中药对胃癌术后无病生存期的影响及实验研究[D]. 冯振. 上海中医药大学, 2019
- [7]重组麻疹病毒沪191株（r-MV-Hu191株）以及联合顺铂对胃癌的溶瘤作用及其机制研究[D]. 吕垚. 浙江大学, 2019(03)
- [8]ADRB2介导慢性应激调控胃癌发展的机制研究[D]. 张轩. 南京医科大学, 2018(01)
- [9]二烯丙基三硫醚的体内外生物转化、抗肿瘤活性及逆转顺铂诱发肾毒性的初步研究[D]. 姜晓燕. 山东大学, 2017(08)
- [10]中药单体藤黄酸通过调控miRNA-590-5p的功能抑制人胃癌细胞上皮—间质转移的机制研究[D]. 刁凌云. 南京中医药大学, 2019(08)