一、α_(1A)-和α_(1B)-肾上腺素受体介导HEK293细胞增殖和Ca~(2+)-钙调蛋白依赖性蛋白激酶激活(英文)（论文文献综述）
赵卓[1]（2021）在《长链非编码RNA XIST在心肌肥厚中的作用及机制研究》文中研究表明研究背景:心肌肥厚是心脏在生理和病理超负荷状态下最初为了维持心脏功能而发生的适应性反应,以心肌细胞体积增大和心肌质量增加为特征,此时心肌细胞总量增加,收缩力增强,使得心脏得以维持正常的收缩功能。然而,当心脏长期处于病理性应激状态下,将会诱发病理性心肌肥厚,主要表现为心肌细胞体积增大、间质和血管周围纤维化、心肌细胞丢失、胶原蛋白增多和肌成纤维细胞活化,如果这一系列改变不能在短时间内得到改善,将会导致适应性不良的心室重塑,最终导致心力衰竭和猝死。因此,全面深入地研究心肌细胞肥大的发生机制,将有助于早期预防和控制心肌肥厚的发生发展,对于预防和治疗心力衰竭具有重要的现实意义。长链非编码RNA（LncRNAs）是在真核生物中发现的一类长度大于200个核苷酸、缺乏显着开放阅读框、不具备编码蛋白质能力的RNA。大量的研究显示,LncRNAs参与调控心脏的各种生理和病理过程,与各种心血管疾病的发病机制密切相关。LncRNAs通过顺式调控、反式调控等多种方式参与调节基因转录、mRNA拼接、组蛋白修饰,促进转录因子激活,抑制下游基因表达。其中,LncRNAs作为竞争内源性RNA（CeRNA）,通过miRNA反应原件（MREs）竞争与miRNA结合,抑制miRNA的表达和活性,进而减少目的mRNA的降解,是LncRNAs调控的主要机制。越来越多的研究显示LncRNA-miRNA-mRNA之间的形成调控网络参与了心肌肥厚发生发展的病理生理过程。LncRNA XIST是哺乳动物X染色体转录沉默的主要调节因子,且LncRNA XIST表达上调是心肌肥厚病理生理过程中的一种特征性分子改变,但LncRNA XIST对心肌肥厚的影响尚不明确,有研究发现LncRNA XIST能促进心肌肥厚,但也有研究报道LncRNA XIST能够抑制心肌肥厚。因此,LncRNA XIST对心肌肥厚的作用及其机制尚需进一步研究。LncRNAs主要通过调控miRNA对目的蛋白发挥调控作用,利用生物信息学技术分析,筛选出与LncRNA XIST结合的miRNAs及相关的信号通路是研究其机制的技术手段。MiR-126a是LncRNA XIST的靶基因,而miR-126与心力衰竭、扩张型心肌病、心肌肥厚的发病机制密切相关。MiR-126a调控心肌肥厚的机制可能与靶向抑制IGF-1有关,已有研究发现IGF-1是miR-126a的靶基因并在调控心肌肥厚过程中发挥重要的作用,然而IGF-1的过度表达则可导致病理性心肌肥厚的发生发展。因此,我们推测,LncRNA XIST可能通过影响miR-126a/IGF-1调控心肌肥厚,研究上述机制,可为预防和治疗心力衰竭寻找相应的靶点,提供理论和实验基础。研究目的:我们在通过主动脉缩窄（TAC）建立的小鼠病理性心肌肥厚动物模型和血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）作用下建立的心肌肥大细胞模型中,探索XIST在心肌肥厚发生发展过程中的作用和潜在的分子机制。研究方法:（1）采用主动脉缩窄（TAC）的方法建立小鼠病理性心肌肥厚的动物模型;通过心肌组织病理组织学H&E染色、测量小鼠HW/BW比值、心脏超声检查、qPCR和Western Blot的方法检测心肌组织中心肌肥厚相关基因和蛋白（ANP、BNP、β-MHC）的表达水平评价是否建模成功,同时检测心肌组织中XIST、miR-126a、IGF-1表达水平。（2）应用Ang Ⅱ处理HL-1细胞建立心肌肥大的细胞模型;通过免疫荧光染色测量细胞表面积、测量Protein/DNA比值、qPCR和Western Blot的方法检测心钠素（ANP）、脑钠素（BNP）、和β-肌球蛋白重链（β-MHC）水平作为评价心肌细胞肥大的指标,同时检测细胞中XIST、miR-126a、IGF-1表达水平。（3）应用si-XIST转染HL-1细胞建立XIST低表达细胞模型,通过免疫荧光染色测量细胞表面积、测量Protein/DNA比值、qPCR和Western Blot的方法检测心钠素（ANP）、脑钠素（BNP）、和β-肌球蛋白重链（β-MHC）水平评价XIST低表达对Ang Ⅱ诱导的心肌细胞肥大的影响,同时检测IGF-1的表达水平。生物信息学预测XIST与miR-126a之间存在潜在的结合位点,双荧光素酶基因报告实验验证XIST与miR-126a之间是否能够结合。（4）应用miR-126a mimics转染HL-1细胞建立miR-126a高表达细胞模型,通过免疫荧光染色测量细胞表面积、测量Protein/DNA比值、qPCR和Western Blot的方法检测心钠素（ANP）、脑钠素（BNP）、和β-肌球蛋白重链（β-MHC）水平评价miR-126a高表达对Ang Ⅱ诱导的心肌细胞肥大的影响,同时检测IGF-1的表达水平。生物信息学预测IGF-1与miR-126a之间存在潜在的结合位点,双荧光素酶基因报告实验验证IGF-1与miR-126a之间是否能够结合。Western Blot的方法检测Ang Ⅱ诱导的心肌肥大细胞模型中XIST低表达对Akt、p-Akt表达的影响。研究结果:（1）TAC组小鼠的心脏体积明显增大,心肌组织H&E染色心脏横截面积增大,心肌细胞排列紊乱,细胞间隙明显增宽;HW/BW比值增加;心脏彩超显示TAC组小鼠表现出典型的心肌肥厚特征;TAC组小鼠心肌组织中心肌肥厚相关基因心钠素（ANP）、脑钠素（BNP）和β-肌球蛋白重链（β-MHC）的表达水平也显着上调;上述结果表明,通过TAC的方法成功建立小鼠病理性心肌肥厚的动物模型。（2）在Ang Ⅱ的作用下,HL-1细胞表面积明显增大,Protein/DNA比值增加,心肌肥厚相关基因ANP、BNP和β-MHC的表达水平也显着上调,提示利用Ang Ⅱ成功诱导心肌肥大的细胞模型。（3）在病理性心肌肥厚动物模型和心肌肥大细胞模型中,XIST表达显着上调;在Ang Ⅱ诱导的心肌肥大细胞模型中沉默XIST,能够减小细胞表面积、降低Protein/DNA比值,抑制心肌肥厚相关基因的表达,提示沉默XIST能够抑制Ang Ⅱ促心肌肥大的作用。（4）miR-126a在病理性心肌肥厚动物模型心肌组织中表达水平明显下调,而且在AngⅡ诱导的心肌肥大细胞模型中miR-126a的表达与XIST之间呈负性相关;当沉默XIST后miR-126a的表达上调,双荧光素酶基因报告明确证实了XIST能够直接与miR-126a结合。（5）在Ang Ⅱ诱导的心肌肥大细胞模型中过表达miR-126a,能够减小细胞表面积、降低Protein/DNA比值,抑制心肌肥厚相关基因的表达,提示miR-126a具有抑制心肌肥大发生发展的作用。（6）在病理性心肌肥厚动物模型和心肌肥大细胞模型中,IGF-1表达显着上调,在Ang Ⅱ诱导的心肌肥大细胞模型中过表达miR-126a或沉默XIST,均能够抑制IGF-1的表达水平,双荧光素酶基因报告实验的结果证实IGF-1与miR-126a能够直接结合,提示在心肌细胞中XIST通过竞争性结合miR-126a从而促进IGF-1的表达。（7）在Ang Ⅱ诱导的心肌肥大细胞模型中,p-Akt的蛋白表达水平明显增加,而沉默XIST则能够降低p-Akt的蛋白表达水平。结论:在病理性心肌肥厚动物模型和细胞模型中,LncRNA XIST和IGF-1表达上调,而miR-126a表达下调,表明LncRNA XIST、IGF-1、miR-126a可能与心肌肥大的发生发展有关;沉默XIST或高表达miR-126a能够抑制Ang Ⅱ诱导的心肌肥大,提示XIST通过miR-126a发挥作用;LncRNA XIST通过靶向抑制miR-126a的表达激活IGF-1/Akt信号通路促进病理性心肌肥厚的发生发展。创新点及研究意义本研究发现了LncRNA XIST在病理性心肌肥厚动物模型和心肌肥大细胞模型中高表达并具有促进心肌肥厚的作用;并进一步阐明XIST促进病理性心肌肥厚的分子机制与竞争性结合miR-126a激活IGF-1/Akt信号通路有关。抑制LncRNA XIST表达或高表达miR-126a可以抑制Ang Ⅱ诱导的心肌肥大,有望成为预防或治疗心肌肥厚的新策略。
陆珊珊[2]（2021）在《SHH通路在缺血性脑卒中和新生小鼠肺发育中的作用机制研究》文中研究表明研究目的:在缺血性脑卒中发生后,大脑中缺血侧的细胞快速释放大量谷氨酸到细胞间隙并产生堆积,多余的谷氨酸溢出细胞间隙后作用在间隙外的谷氨酸受体上,使缺血侧的神经元处于过度激活的状态,对神经元产生兴奋性毒性作用。谷氨酸在缺血性脑损伤中具有至关重要的作用,细胞间谷氨酸清除的唯一途径是通过细胞膜上的谷氨酸转运体将谷氨酸转运到细胞内,转运到细胞内的谷氨酸在谷氨酰胺转化酶的作用下转化成谷氨酰胺,再经谷氨酰胺转运体释放到细胞间隙被神经元吸收,从而达到细胞外谷氨酸清除和转化的目的。大脑中的谷氨酸转运体有五种表现形式,不同形式的转运体表达在不同的细胞中,其中表达在星形胶质细胞上的谷氨酸转运体GLT-1,承担了细胞间约90%的谷氨酸的转运任务。然而,细胞外堆积的谷氨酸在缺血过程中是如何被调控的目前仍不是很清楚。在缺血模型中,缺血部位的神经元快速释放大量的Shh,并激活SHH通路,而该通路的过度激活也会造成神经元的丢失,与组织损伤的发生有关。在我们之前的研究工作中发现,SHH通路可以通过快速调节细胞膜上的谷氨酸转运体的表达量实现对细胞外谷氨酸浓度的快速调节,抑制SHH通路可以有效降低细胞外谷氨酸的含量,并且在这一过程发挥作用的转运体是GLT-1。因此我们的研究目的是明确在脑缺血过程中SHH通路调节GLT-1清除细胞间谷氨酸的机制,进而通过抑制SHH通路实现对缺血后的脑损伤的保护作用。研究内容:明确SHH通路对GLT-1的调节作用;找到SHH通路对GLT-1调节过程中的关键作用分子;进一步验证SHH通路在缺血过程中的作用,抑制SHH通路实现对缺血后的脑损伤的保护作用。研究方法:1.通过体外电生理全细胞膜片钳记录原代培养的星形胶质细胞膜上谷氨酸转运体的电流的方法,明确SHH通路对谷氨酸转运体的调节作用。2.通过细胞转染的方法在转染了谷氨酸转运体GLT-1的HEK293细胞中,通过细胞膜片钳记录方法明确SHH通路调节谷氨酸转运体的分子机制。3.在星形胶质细胞中通过RNA干扰的方法,实现对星形胶质细胞中分子蛋白表达的敲低,明确参与SHH通路调节谷氨酸过程中的信号分子。4.在小鼠和食蟹猴中建立MCAO模型,验证抑制SHH通路活性对缺血脑损伤的保护作用。研究结果:1)SHH通路可以通过调节星形胶质细胞膜上GLT-1的表达量来快速调节细胞外谷氨酸的浓度。2)SHH通路能够通过PKCα磷酸化GLT-1的563位点使其快速从细胞膜上转运到胞浆内。3)抑制SHH通路可以有效的改善小鼠MCAO模型后脑缺血导致的梗死面积。4)NVP-LDE225通过抑制SHH通路可以有效改善非人类灵长类MCAO模型缺血后的脑损伤,并建立短期和长期的保护作用。研究结论:SHH通路可以通过调节细胞膜上GLT-1的数量快速调节细胞外谷氨酸的浓度,而SHH信号通过激活PKCα使GLT-1上的563（562）位点的丝氨酸发生磷酸化从而降低膜上GLT-1的表达。抑制SHH信号通路能够维持膜上GLT-1的表达量,实现对细胞外谷氨酸的快速转运,从而降低细胞外谷氨酸的浓度。抑制SHH信号通路的活性可以改善缺血性脑损伤,减少缺血导致的脑梗死面积,并且能够改善缺血后的神经功能。FDA批准临床用于基底细胞癌的药物,NVP-LDE225可以通过抑制SHH通路的活性,维持细胞膜上谷氨酸转运体GLT-1的表达量,有效改善小鼠和食蟹猴缺血模型后导致的脑损伤,并且可以建立长期有效的保护作用。以上结果提示,SHH通路是降低谷氨酸兴奋性毒性,治疗缺血性脑损伤的一个有效靶点。Sonic hedgehog（Shh）作为一种有丝分裂素和形态形成素,通过Smoothened（SMO）受体介导的SHH通路在细胞增殖分化和发育过程中发挥着重要作用。胆固醇作为内源性的甾醇结构,可以直接与SMO结合来激活SHH通路。然而,SMO的内源性抑制作用的研究目前并不十分清晰。因此,在我们的研究中发现皮质醇能够直接与SMO结合,来竞争性地抑制胆固醇对SHH通路的激活作用,而消除皮质醇对SMO的抑制后,会促进肺部细胞过度增殖并导致肺发育的不成熟。Shh和胆固醇均可激活经典和非经典通路,两条途径都能够被皮质醇抑制。皮质醇和胆固醇能够在SMO上产生竞争结合。当SMO中的L112变为A112时,皮质醇不再能与胆固醇竞争结合在SMO上。Smoa/a（L116A）的突变小鼠出生后由于呼吸衰竭很快死亡,主要原因是肺间质成纤维细胞增加和表面活性蛋白的分泌减少。这些结果表明,皮质醇是SMO的内源性抑制剂,其对SMO的抑制对小鼠肺发育至关重要。
王伟伟[3]（2021）在《神经肽受体GPR103信号转导机制研究》文中研究说明神经肽是神经元分泌的细胞间信号分子,在体内充当神经递质,神经调节剂或神经激素,并且在生物发育各个阶段对各种生理功能起重要的调控作用。谷氨酰胺RF-酰胺肽（Pyroglutamine RF-amide peptide,QRFP）是RFamide家族中最新发现的成员,并被鉴定为GPR103内源性配体,GPR103通过与异源三聚体G蛋白结合发挥作用。GPR103及其配体广泛表达于大脑和外周组织中,参与调节体内诸如摄食和能量稳态、神经内分泌和骨骼发育等多种生理功能,可以作为诊断、预防和治疗能量稳态以及内分泌等相关疾病的有效药物靶标。神经肽QRFP前体肽可以水解产生两个C末端酰胺化的成熟肽,分别为26RFa和43RFa。先前的研究报道26RFa和43RFa神经肽均能特异性结合并激活GPR103,但两个神经肽激活GPR103介导的信号通路机制仍存在很大争议。本文中,我们首先检测了两个神经肽介导的信号通路,研究发现在HEK293T细胞中,26RFa刺激GPR103与Gαq和Gαi蛋白偶联,抑制c AMP的生成,并介导胞内Ca2+的动员以及ERK1/2的磷酸化,与先前的报道一致。与26RFa不同的是,43RFa可以激活GPR103与Gαs蛋白偶联促进c AMP的积累,并同时通过Gαq和Gαs蛋白介导Ca2+动员和ERK1/2的磷酸化。我们通过分子动力学模拟预测配体-受体相互作用并结合定点突变的方法,检测受体突变体和配体类似物激活受体介导的信号通路活性差异。结果显示突变体ECL2上的Lys189、Asp191和Leu 202残基对受体与Gα蛋白结合至关重要。在43RFa作用下,Lys189突变为丙氨酸导致受体选择性地与Gαi蛋白结合,Asp191突变为丙氨酸后仅激活Gαq蛋白;而丙氨酸替代Leu 202可致受体由Gαs和Gαq双偶联变为Gαi和Gαq双偶联。研究还揭示,截断N端8个氨基残基的35RFa同样激活GPR103与Gαs和Gαq双偶联,但把Phe10突变为丙氨酸的35RFa-F10A导致受体由Gαs和Gαq双偶联变为Gαi和Gαq双偶联。进一步活体研究表明,43RFa和26RFa均能促进小鼠胰岛细胞的胰岛素分泌,但作用机制不同。43RFa主要通过Gαs-c AMP和Gαq-Ca2+偶联的信号通路促进胰岛素分泌,且作用明显强于26RFa,而26RFa仅通过Gαq依赖的Ca2+信号通路促进胰岛素分泌。糖基化作为GPCR蛋白翻译后修饰的重要过程,影响着蛋白质折叠、分泌、表面表达、蛋白定位、转运、配体结合等多种生理功能。GPR103受体具有三个潜在的N-糖基化位点,两个位于N末端结构域(Asn5和Asn19),一个位于第一个细胞外环（ECL1）(Asn106),但迄今为止,它们在GPR103表达和信号转导中的作用尚未确定。我们结合定点突变的方法（天冬酰胺替换为谷氨酰胺）与糖苷酶PNGase F和N糖基化抑制剂Tunicamycin（衣霉素）,研究N-糖基化在调控GPR103细胞表面表达和信号转导中的作用。结果显示,位于N端的N19和ECL1的N106是N-糖基化位点,位于N5的天冬酰胺并未被糖基化。共聚焦显微镜和定量ELISA分析显示,GPR103的N-糖基化作用对靶向细胞膜并不重要。然而,进一步的结合实验和功能实验表明去除N-糖基化或衣霉素处理导致受体与26RFa结合能力以及介导下游信号通路的能力显着减弱。因此,我们的研究结果表明,对于人QRFP受体GPR103,N糖基化对细胞表面表达并不重要,但却是配体结合和受体激活的先决条件。综上所述,本研究主要从GPR103与配体相互作用及蛋白翻译后修饰对受体的功能影响两部分探索GPR103受体信号转导机制。进一步加深我们对A类GPCR与它们的肽配体尤其是RF家族神经肽与它们的同源受体之间相互作用的理解,为设计以GPR103为靶点的激动剂和拮抗剂药物奠定了基础。
王毅晖[4]（2021）在《钙整合素结合蛋白2在心房重构中的作用机制研究》文中研究指明背景和目的:心房颤动（简称房颤）是最常见的持续性心律失常。随着年龄增长房颤的发生率不断增加,75岁以上人群可达10%。房颤的主要病因来源心房结构的改变,其中主要包括结构异常以及心房电生理异常。心房肌特异性表达基因群在维持心房行使其正常功能发挥着重要的作用。有相关的研究表明,心房肌特异性表达基因的改变可以加重房颤的发生与发展。本研究旨在通过高通量mRNA测序系统性筛选出心房肌特异性表达基因群,并在心房肌特异性表达基因群中挑选出在房颤组织中有差异性改变的基因,从有效挖掘房颤的治疗靶点。方法:通过对正常组织的心房和心室以及在具有房颤疾病的心房组织进行高通量mRNA测序分析寻找靶基因。通过实时mRNA定量,免疫荧光以及蛋白免疫印迹对靶基因的表达进行精确评估。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现在体靶基因的敲除或者过表达,从而评估靶基因在心房重构中所产生的作用。从机制层面上,通过对转基因小鼠的心房组织进行mRNA测序分析,有效揭示靶基因所涉及的主要通路。利用钙调神经磷酸酶（Calcineurin）活性测定,实时定量PCR,免疫共沉淀,蛋白免疫印迹,病理切片染色以及siRNA转染技术等细胞学,生物分子学以及生物化学技术对靶基因在调节心房组织的重构中的作用进行详细的分析以及验证。结果:通过高通量的mRNA测序分析发现共有65个基因在心房组织中特异性高表达,其中相对于房颤组织中有显着差异的基因共有6个（5个上调,1个下调）。结合既往研究,我们发现CIB2基因可能在心房组织重构中具有潜在的调节价值。利用转基因技术,发现CIB2基因敲除可以加重房颤的发生率以及房颤的持续时间,而过表达CIB2基因则有效抑制房颤的发生率以及房颤的持续时间。通过对CIB2基因敲除或过表达的房颤组织进行高通量mRNA测序结果分析,发现CIB2基因可能通过对钙调神经磷酸酶活性抑制作用,从而有效抑制心房重构,降低房颤的发生率（易感性）及其持续时间。在细胞学水平上,我们发现CIB2可以抑制CIB1介导的Calcineurin的细胞膜定位,进而抑制心房肌细胞内钙调神经磷酸酶活性,防止活化T细胞核因子（NFAT）进入细胞核,从而有效抑制心房肌的重构。结论:在房颤组织中,CIB2下调可以促进钙调神经磷酸酶的细胞膜定位,从而活化Calcineurin,继而导致心房重构,促进房颤的发生。通过过表达CIB2则可以有效抑制房颤发生。综上所述,通过开发新药物或者基因技术改变CIB2的表达量可能成为未来治疗房颤的新治疗手段。
刘慧[5]（2021）在《TMEM16A钙激活氯通道介导辛伐他汀抑制乳腺癌作用的分子机制研究》文中研究指明目的:TMEM16A（也称为Anoctamin 1,ANO1）是钙激活氯离子通道的分子基础,有10个跨膜结构域。TMEM16A广泛分布在多种细胞中,并参与调节多种重要的生理功能。TMEM16A在包括乳腺癌在内的多种肿瘤中高表达且与患者的不良预后相关。他汀类药物（statins）是临床常用的一线降脂药,为羟甲基戊二酸单酰辅酶A（HMG-Co A）还原酶抑制剂,常用于心血管疾病的治疗。他汀类药物对包括乳腺癌在内的多种肿瘤有抑制作用。和亲水性他汀类药物相比,包括辛伐他汀在内的亲脂性他汀类药物可以明显抑制乳腺癌的复发和转移。本实验的前期研究显示,亲脂性他汀和亲水性他汀在抑制TMEM16A钙激活氯电流和抑制乳腺癌增殖能力方面存在差异。因此,本研究的目的是探究辛伐他汀对TMEM16A的抑制能力及对结合起着关键作用的氨基酸,阐明辛伐他汀抑制乳腺癌细胞TMEM16A钙激活氯通道的机制,寻找TMEM16A促进乳腺癌发生发展的信号通路,并验证辛伐他汀通过TMEM16A介导的信号通路抑制乳腺癌的作用机制,为开发靶向TMEM16A的药物用于治疗乳腺癌提供新思路与实验依据。方法:本研究通过CCK-8细胞活力法检测辛伐他汀（辛伐他汀酸为对照）处理之后的乳腺癌细胞增殖能力;在HEK293细胞中转染TMEM16A质粒,应用全细胞膜片钳（Whole cell）记录模式,检测并比较不同浓度辛伐他汀处理后HEK293T细胞钙激活氯电流;通过引物设计和位点定向突变（site-directed mutagenesis）方法,将TMEM16A中的氨基酸系统地突变为TMEM16B中相应序列的氨基酸,应用质粒转化和提取技术,扩增并提取TMEM16A突变体质粒,培养HEK293T,依靠瞬时转染技术,在HEK293细胞中转染含TMEM16A突变体质粒,应用全细胞膜片钳技术,检测并比较辛伐他汀处理前后转染TMEM16A突变体（WT TMEM16A为对照）的HEK293细胞钙激活氯电流,验证TMEM16A与辛伐他汀结合的关键氨基酸;通过对TCGA数据库和GSEA基因富集分析,探讨TMEM16A在乳腺癌中的基因富集情况;通过sh RNA敲除TMEM16A及转染含有TMEM16A质粒到MCF-7和T47D乳腺癌细胞,构建TMEM16A沉默或过表达乳腺癌细胞模型;应用Western blot方法检测并比较TMEM16A沉默及过表达乳腺癌细胞中EGFR、AKT磷酸化表达水平;检测辛伐他汀处理后乳腺癌MCF-7细胞中EGFR、AKT磷酸化表达水平。结果:CCK-8细胞活力法检测MCF-7和T47D细胞增殖能力,结果显示辛伐他汀可明显抑制乳腺癌MCF-7和T47D细胞增殖,并呈浓度依赖性。转染TMEM16A质粒的HEK293T细胞钙激活氯电流,辛伐他汀对TMEM16A钙激活氯电流呈现剂量依赖性。通过位点定向突变方法,将TMEM16A突变体转染至HEK293T细胞中,应用全细胞膜片钳技术（Whole cell）记录转染TMEM16A突变体的钙激活氯电流变化情况,结果显示R429A、K430L、R437F降低了辛伐他汀诱导的TMEM16A钙激活氯电流的抑制;R429A/K430L/R437F也降低了辛伐他汀诱导的TMEM16A钙激活氯电流的抑制。应用Western blot检测转染含有TMEM16A过表达质粒和Sh RNA敲除质粒检测MCF-7和T47D磷酸化EGFR和AKT表达水平,结果显示转染高表达TMEM16A细胞中磷酸化EGFR和AKT蛋白表达显着升高,提示TMEM16A高表达可能激活EGFR/AKT信号通路;辛伐他汀处理后乳腺癌T47D细胞中磷酸化EGFR/AKT的表达降低。结论:我们研究发现辛伐他汀抑制乳腺癌细胞增殖,对TMEM16A钙激活氯通道剂量依赖性地抑制。确认辛伐他汀与TMEM16A直接结合的关键氨基酸:R429A、K430L、R437F。实验表明TMEM16A钙激活氯通道能够激活乳腺癌细胞EGFR/AKT信号通路;TMEM16A过表达乳腺癌细胞中磷酸化EGFR/AKT蛋白表达显着增高,TMEM16A沉默后EGFR和AKT的磷酸化蛋白表达水平降低,TMEM16A钙激活氯通道功能有促进乳腺癌发生发展作用。研究表明辛伐他汀抑制乳腺癌细胞中磷酸化EGFR、AKT的表达。
王天宇[6]（2021）在《和厚朴酚靶向TMEM16A钙激活氯通道抑制大肠癌的研究》文中进行了进一步梳理目的:大肠癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。据美国癌症统计数据显示,大肠癌每年的新发病例超过10万例,发病率居全球恶性肿瘤的第3位,死亡率居所有肿瘤的第2位。TMEM16A钙激活氯通道在许多肿瘤中高表达,促进肿瘤的发生发展。近年研究发现TMEM16A过表达能够促进大肠癌的增殖、迁移和侵袭。靶向TMEM16A为治疗大肠癌提供了一种全新的具有潜力的治疗策略。因此,发现新的TMEM16A抑制剂对于大肠癌的治疗有着十分重要的意义。和厚朴酚是从中药厚朴中分离的主要活性成分之一,具有多种药理学作用。虽然研究发现和厚朴酚具有抑制大肠癌细胞增殖和肿瘤生长的作用,然而和厚朴酚的分子靶点及抗增殖机制尚不清楚。本研究旨在探讨和厚朴酚对TMEM16A钙激活氯通道的作用以及和厚朴酚通过靶向TMEM16A通道对大肠癌细胞增殖的影响。方法:1.将TMEM16A过表达质粒转染到HEK293细胞中,用全细胞膜片钳记录模式分别记录转染后HEK293细胞在0.2μM和1μM Ca2+时的电流。加入不同浓度（0.1-50μM）的和厚朴酚,检测和厚朴酚对TMEM16A电流的抑制作用。采用Inside-out膜片钳记录模式记录转染TMEM16A过表达质粒后的HEK293细胞在1μM Ca2+时的电流。加入10μM和厚朴酚,检测和厚朴酚对TMEM16A电流的直接抑制作用。采用全细胞膜片钳记录模式记录转染TMEM16A过表达质粒后的HEK293细胞在0.2μM Ca2+时的电流。加入10μM和厚朴酚,待抑制完全后洗涤,观察和厚朴酚对TMEM16A的作用是否可逆。将TMEM16B过表达质粒转染到HEK293细胞中,用全细胞膜片钳记录模式记录转染后HEK293细胞在1μM Ca2+时的电流。加入不同浓度（10-400μM）的和厚朴酚,检测和厚朴酚对TMEM16B电流的抑制作用。2.将TMEM16A和TMEM16B各个跨膜区的氨基酸进行比对,找出其中化学性质相差较大的氨基酸,从中选取一些氨基酸采用定点突变技术突变成TMEM16B对应的氨基酸。将TMEM16A突变体质粒转染到HEK293细胞中,加入10μM和厚朴酚,用全细胞膜片钳记录模式检测在0.2μM Ca2+时和厚朴酚对不同TMEM16A突变体电流的抑制作用。采用定点突变技术将TMEM16A第二跨膜区上与TMEM16B不同的氨基酸突变成TMEM16B对应的氨基酸,并把TMEM16A第二跨膜区上带正电的氨基酸突变成丙氨酸。将TMEM16A突变体质粒转染到HEK293细胞中,加入10μM和厚朴酚,用全细胞膜片钳记录模式检测在0.2μM Ca2+时和厚朴酚对不同TMEM16A突变体电流的抑制作用。采用定点突变技术将TMEM16A上氨基酸R429、K430和N435进行三点突变,将TMEM16A三点突变体R429A/K430L/N435G转染到HEK293细胞中,用全细胞膜片钳记录模式检测在0.2μM Ca2+时不同浓度（1-400μM）和厚朴酚对R429A/K430L/N435G电流的抑制作用。采用定点突变技术将TMEM16B上氨基酸L372和G377进行双点突变,将TMEM16B双点突变体L372K/G377N转染到HEK293细胞中,用全细胞膜片钳记录模式检测在1μM Ca2+时不同浓度（1-100μM）和厚朴酚对L372K/G377N电流的抑制作用。3.采用全细胞膜片钳记录不同Ca2+（0-1μM）下SW620细胞的钙激活氯电流。应用TMEM16A-sh RNA敲低TMEM16A蛋白,采用q RT-PCR技术检测转染TMEM16A-sh RNA的SW620细胞m RNA的相对表达量。采用Western blot技术检测SW620细胞转染Scrambled sh RNA和TMEM16A-sh RNA后TMEM16A蛋白的表达量。采用全细胞膜片钳记录模式记录SW620细胞转染Scrambled sh RNA和TMEM16A-sh RNA后在1μM Ca2+时的电流。采用全细胞膜片钳记录模式记录SW620细胞在1μM Ca2+时的电流,加入10μM T16Ainh-A01或Ani9,检测T16Ainh-A01和Ani9对SW620细胞的钙激活氯电流的抑制作用。采用Western blot技术检测NCM460和SW620细胞中TMEM16A蛋白的表达情况以及NCM460细胞转染TMEM16A-Vector、WT TMEM16A和通道功能减弱的Δ444EEEEEAVKD452质粒48 h后TMEM16A蛋白的表达情况。采用CCK-8检测NCM460细胞转染TMEM16A-Vector、WT TMEM16A和Δ444EEEEEAVKD452质粒48 h后的细胞活力、SW620细胞转染Scrambled sh RNA和TMEM16A-sh RNA48 h后的细胞活力以及SW620细胞加入10μM T16Ainh-A01或Ani9 48 h后的细胞活力。采用全细胞膜片钳记录模式记录SW620细胞在1μM Ca2+时的钙激活氯电流,加入不同浓度（0.1-50μM）的和厚朴酚,检测和厚朴酚对SW620内源性TMEM16A电流的抑制作用。采用CCK-8检测不同浓度（1-20μM）的和厚朴酚对SW620细胞增殖的抑制作用。采用CCK-8检测10μM和厚朴酚对转染Scrambled sh RNA和TMEM16A-sh RNA的SW620细胞增殖的抑制作用。采用CCK-8检测不同浓度（1-20μM）的和厚朴酚对NCM460细胞增殖的抑制作用。采用Western blot技术检测NCM460细胞转染TMEM16A-Vector、WT TMEM16A和R429A/K430L/N435G质粒48 h后TMEM16A蛋白的表达情况。采用CCK-8检测10μM和厚朴酚对转染TMEM16A-Vector、WT TMEM16A和R429A/K430L/N435G质粒的NCM460细胞增殖的抑制作用。结果:1.在全细胞模式下和厚朴酚呈浓度依赖性抑制转染TMEM16A过表达质粒的HEK293细胞异源表达的TMEM16A电流,在0.2μM和1μM Ca2+时的IC50值分别为5.29±0.95μM和5.83±0.37μM。在Inside-out模式下在1μM Ca2+时10μM和厚朴酚能显着抑制HEK293细胞异源表达的TMEM16A电流。在全细胞模式下在0.2μM Ca2+时加入10μM和厚朴酚能显着抑制HEK293细胞异源表达的TMEM16A电流,洗涤后电流能恢复到之前的80%左右。在全细胞模式下在1μM Ca2+时和厚朴酚对HEK293细胞异源表达的TMEM16B电流抑制作用较弱,IC50值为68.71±2.05μM。2.在0.2μM Ca2+时10μM和厚朴酚对R429A、K430L和N435G单点突变TMEM16A电流的抑制作用相比WT TMEM16A显着减弱。在0.2μM Ca2+时和厚朴酚对R429AK430LN435G电流的抑制作用相比WT TMEM16A显着减弱,IC50值为40.01±3.33μM。在1μM Ca2+时和厚朴酚对L372KG377N电流的抑制作用相比WT TMEM16B显着增强,IC50值为16.53±1.23μM。3.在全细胞模式下在1μM Ca2+时检测到SW620细胞中有钙激活氯电流,应用TMEM16A-sh RNA敲低TMEM16A蛋白后TMEM16A m RNA和蛋白的表达量都显着降低,敲低SW620细胞中TMEM16A后,检测到的钙激活氯电流显着降低。在全细胞模式下在1μM Ca2+时10μM的TMEM16A特异性抑制剂T16Ainh-A01和Ani9能显着抑制SW620细胞中的钙激活氯电流。TMEM16A在SW620细胞中的蛋白表达量显着高于在NCM460中的蛋白表达量。转染WT TMEM16A和通道功能减弱的Δ444EEEEEAVKD452质粒的NCM460细胞TMEM16A蛋白的表达量基本相同。转染WT TMEM16A质粒的NCM460细胞增殖能力相比TMEM16A-Vector显着增强,而转染Δ444EEEEEAVKD452质粒的NCM460细胞增殖能力并无明显变化。应用TMEM16A-sh RNA敲低的SW620细胞增殖能力显着减弱,应用TMEM16A特异性抑制剂T16Ainh-A01和Ani9也能显着降低SW620细胞的增殖能力。在全细胞模式下在1μM Ca2+时和厚朴酚呈浓度依赖性抑制SW620细胞中内源性TMEM16A电流,IC50值为4.78±0.47μM。和厚朴酚呈浓度依赖性抑制SW620细胞增殖。应用TMEM16A-sh RNA敲低TMEM16A蛋白后,10μM和厚朴酚对SW620细胞增殖的抑制能力相比Scrambled sh RNA显着减弱。和厚朴酚对NCM460增殖的抑制能力较弱。转染WT TMEM16A和R429A/K430L/N435G质粒的NCM460细胞TMEM16A蛋白的表达量基本相同。转染WT TMEM16A质粒后,10μM和厚朴酚对NCM460细胞增殖的抑制能力相比TMEM16A-Vector显着增强,而转染R429AK430LN435G质粒后,和厚朴酚对NCM460细胞增殖的抑制能力增强作用较弱。结论:1.和厚朴酚抑制TMEM16A钙激活氯通道电流;2.R429、K430和N435是和厚朴酚抑制TMEM16A的关键氨基酸;3.和厚朴酚通过靶向TMEM16A抑制大肠癌细胞增殖。
关开行,王文景,李子健,董尔丹[7]（2020）在《肾上腺素受体与心血管疾病》文中提出交感-肾上腺髓质系统在调节心血管活动中发挥至关重要的作用,而肾上腺素受体是其发挥作用的门户.肾上腺素受体是G蛋白偶联受体家族的代表性受体,介导了重要的生理信号功能.肾上腺素受体信号系统的异常是导致众多心血管疾病的主要机制,因此也是临床用药的最主要靶点.本文回顾了肾上腺素受体的发现及其研究进展,梳理了肾上腺素受体的信号转导系统及其与心血管疾病之间的关系,为肾上腺素受体的进一步研究和心血管疾病的治疗提供了理论基础.
叶城[8]（2020）在《草鱼大脑和垂体中神经肽挖掘及速激肽功能鉴定》文中进行了进一步梳理在脊椎动物中,大脑和垂体是机体内极其重要的器官。大脑可以通过合成与释放神经肽调节垂体激素的合成与分泌,进而参与机体生长、生殖、应激和免疫等生理过程的调控。与哺乳动物不同,鱼类的下丘脑-垂体轴缺失了门脉系统,因此调控垂体激素合成与分泌的上游神经肽变得更为庞大和复杂。基于此,本研究以草鱼（Ctenopharyngodon idellus）为研究对象,首先,通过组织切片技术分析草鱼不同大脑亚区及垂体的形态和显微结构,并结合生物信息学方法初步探究草鱼各脑区和垂体的功能及各脑区间的相互关系。接着,基于草鱼基因组数据库和草鱼大脑各亚区和垂体的转录组数据,挖掘草鱼大脑和垂体中的神经肽编码基因及其相关受体信息,并对它们在草鱼大脑不同亚区和垂体内的分布进行分析。最后,以挖掘出的速激肽家族的神经肽为切入点,分别研究了TAC3编码产物NKB和NKBRP以及TAC4编码产物HK1和HK2在草鱼垂体内的功能及其作用机制。主要研究结果如下:1、草鱼大脑和垂体的形态学和组织学H.E染色切片结果显示,草鱼大脑主要由6个亚区构成,包括嗅球、端脑、视顶盖、下丘脑、小脑和延脑。与软骨鱼类和哺乳类不同,草鱼大脑和垂体间无下丘脑-垂体门脉系统,下丘脑的神经元直接伸入并终止于前腺垂体内。通过分析草鱼不同脑区和垂体的转录组测序数据,本研究发现嗅球可能与生殖和免疫有关;端脑可能参与食欲和生殖的调控;视顶盖不仅在视觉系统中发挥重要功能,并可能涉及摄食行为的调控;下丘脑在摄食和生殖过程中扮演重要角色;延脑与听觉系统有关;垂体在能量代谢、器官发育和生殖过程中起关键作用。相关性分析结果显示,下丘脑和端脑不仅在结构上高度相关,其功能也存在重叠性,表明端脑和下丘脑可能是硬骨鱼类摄食和生殖的调控中心。2、结合草鱼基因组数据库和草鱼大脑各亚区及垂体的转录组数据,本研究系统地挖掘了来自23个家族共计91个神经肽前体编码基因,以及上述神经肽相对应的112个受体基因。基于RNA-seq数据,对上述基因在草鱼6个不同大脑亚区和垂体内的转录本表达水平进行分析。最后,结合已有研究和本研究的结果,对神经肽及其受体在草鱼大脑和垂体的主要合成区域和功能行使位置进行了预测。3、以草鱼垂体细胞为研究对象,转录组分析表明NKB能够诱导垂体内729个基因的差异表达,这些基因涉及了激素活性、食物摄入、信号转导和代谢等。体外细胞培养和RT-q PCR结果显示,NKB在草鱼垂体细胞中可以以时间和剂量依赖的方式诱导四种厌食肽（UTS1、CART、POMCb和NMB）m RNA的表达。受体选择性和受体后信号通路实验结果显示,NKB对草鱼垂体中UTS1、CART、POMCb和NMB表达的刺激作用均能由NK3R介导。这些反应激活了腺苷酸环化酶/蛋白激酶A（c AMP/PKA）通路、磷脂酶C/肌醇1,3,5-三磷酸/蛋白激酶C（PLC/IP3/PKC）通路和Ca2+/钙调蛋白/Ca M-依赖性蛋白激酶II(Ca2+/Ca M/Ca MK-II)通路。此外,腹腔注射NKBa能够显着诱导草鱼垂体内这四种厌食肽m RNA表达。此外,摄食实验结果显示,草鱼进食后下丘脑内的TAC3a和TAC3b m RNA表达显着提高。这些结果表明,NKB是一个饱感因子,它能够通过调节垂体中厌食肽的表达参与硬骨鱼类摄食调节。4、以草鱼为研究对象,本研究从草鱼大脑和垂体中克隆得到TAC4基因及其受体NK1Rb和NK3Ra1。序列分析显示草鱼TAC4能够编码HK1和HK2成熟肽。组织表达分析表明TAC4在下丘脑、嗅球和延脑中高表达,受体NK1Rb、NK3Ra2和NK3Rb等均在垂体中有较高的表达,预示TAC4在草鱼垂体中可能发挥重要功能。通过在HEK293T细胞膜上表达NKRs,HK2对6个NKRs均有较高的激活效率,其中对NK2R应是HK2的特异性受体;而HK1仅能微弱激活NK2R、NK3Ra2和NK3Rb。转录组测序和生物信息学分析结果显示,HK2能够诱导垂体细胞内1051个基因差异表达,这些基因主要涉及食欲的负调节、激素活性、受体配体结合和G蛋白偶联受体信号通路等。在草鱼垂体原代细胞中,HK2能够以时间依赖性和剂量依赖性的方式促进PRL、SLα、UTS1、NMB1、CART2和SN2 m RNA表达,而HK1对上述基因均无显着反应。为了解析HK1在草鱼垂体内的失活原因,本研究将含VFGLM基序的HK1修改为FFGLM基序的HK1突变体（HK1-M）。受体-配体反应表明,不同于HK1,HK1-M对6个NKRs展现了很高的激活效率。同时,HK1-M能够显着诱导草鱼垂体细胞内UTS1、PRL和SLαm RNA表达。此外,HK1和HK2共处理垂体细胞实验显示,HK1不能有效阻断HK2在垂体中的功能,表明HK1不是HK2的内源性拮抗剂。综上结果表明,HK2可以直接作用于草鱼垂体细胞,通过受体NKRs的介导,促进垂体内PRL、SLα、UTS1、CART2、NMB1和SN2的m RNA表达;而HK1因其FXGLM序列突变致使其功能丢失。综上所述,本研究建立了草鱼不同大脑亚区和垂体的解剖学和转录组数据库,对草鱼不同脑区以及垂体的结构和功能做出了初步分析,深入挖掘了草鱼大脑和垂体内的神经肽前体及其受体基因,并以速激肽家族为切入点,研究了TAC3编码产物和TAC4编码产物在垂体中的功能及作用机制。本研究有助于丰富我们对鱼类大脑不同亚区显微结构和功能的认识,为进一步深入研究鱼类神经肽的功能提供了基础。
曹铮[9]（2020）在《G蛋白偶联受体介导的蛋白激酶C激活及其下游信号通路机制研究》文中研究表明20世纪80年代,蛋白激酶C（PKC）因其作为一种二酰甘油敏感的酶,同时也是强效促肿瘤因子佛波酯的“受体”而引起人们的广泛关注。PKC的发现解决了科学界长达25年的疑问,即促进脂质水解的激动剂是怎样去改变细胞生理活动的。PKC属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,其活性的控制是通过自抑制假底物的可逆释放来实现的。G蛋白偶联受体（GPCRs）在激动剂的作用下,可以将胞外信号传递至胞内,引发一系列生理活动,其中尤为重要的一个方面就是可以通过PKC激活胞外信号调节激酶（ERK1/2）,从而调节细胞分化、有丝分裂、增殖等,甚至是一些异常的生理过程,如肿瘤的发生等。因此,进行GPCRs介导的蛋白激酶C激活机制及其下游信号通路机制的探究尤为重要。首先,本文的研究用生物信息学的方法在刺参（Apostichopus japonicus）基因组数据信息中挖掘得到Kisspeptin及其受体的相关基因,并进行功能性鉴定和研究分析。编码AjKiss前体的基因可以翻译得到一条长为180个氨基酸的前体肽,可以进一步水解产生两条成熟的C末端酰胺化多肽,即AjKiss1a（32个氨基酸）和AjKiss1b（18个氨基酸）。另外,两个AjKiss受体（AjKissR1和AjKissR2）的cDNA序列信息在A.japonicus的基因组中被找到并在卵巢组织中被克隆得到。功能性实验分析结果表明,AjKissR1和AjKissR2均能很好地表达和定位在HEK293T细胞的细胞膜上,并在AjKiss1a和AjKiss1b的作用下可以快速动员胞内钙离子,但呈现一定的配体选择性（AjKiss1a倾向作用于AjKissR2,AjKiss1b倾向作用于AjKissR1）。此外,AjKissR1/2在AjKiss1a/b的作用下,都能发生明显内吞,以及介导Gαq-PLC依赖的信号通路途径。进一步的研究发现,AjKiss1b的C末端核心10肽片段,即AjKiss1b-10,均能激活AjKissR1/2,引起受体内吞发生,以及Gαq-PLC依赖的Ca2+信号通路和ERK1/2信号通路的激活。在AjKiss1b-10的作用下,AjKissR1和AjKissR2均能通过Gαq-PLC-Ca2+/PKC信号通路激活ERK1/2,另外,AjKissR1还能够偶联Gαi/o并通过Gβγ依赖的方式激活PKCε,进而对ERK1/2的激活做出贡献。其次,本文的研究在先前工作（家蚕CAPAPVK受体相关研究）的基础上首次发现了可变剪接产生的天然剪接变体BomCAPAPVK-R1△341是CAPA-PK的特异性受体。BomCAPAPVK-R1基因由七个外显子组成,其中第七个外显子的丢失致使C末端截短的剪接变体△341的产生。C末端的截短不仅影响了△341的膜定位,同时也影响了GRKs依赖的受体内吞发生。之前我们关于R1的研究表明,和常见的GPCRs剪接变体类似,△341可以作为负调节蛋白对野生型受体R1的膜定位和功能等方面产生影响,但其本身并不能被CAPA-PVKs激活。而在本研究中,我们惊喜地发现△341能被另一相近家族神经肽CAPA-PK特异性激活。进一步的功能性实验分析结果表明,不同于Gαq偶联的野生型受体R1,△341是通过偶联Gαi/o来介导腺苷酸环化酶的抑制和胞内cAMP的下调,以及通过Gβγ-PI3K-PKCζ信号通路来介导ERK1/2的磷酸化。综上所述,本文的研究发现首次揭示了Kisspeptin神经肽信号系统在非脊索动物物种中的存在和功能,并探究了其可能介导信号通路机制,为下丘脑神经分泌系统的古老起源提供了有力证据,也为无脊椎动物神经肽相关的研究提供了重要的参考。而对天然剪接变体△341的研究则为在家蚕中区分CAPA-PK和CAPA-PVK神经肽信号系统的作用提供了有力的证据,进一步说明了单个GPCR基因能够产生多种结构和功能上更为独特的蛋白亚型,明确了之前未被承认的GPCRs剪接变体的重要地位,为更好地理解GPCRs剪接变体在生理和病理研究中的重要意义提供了有力证据。
李文奇[10]（2020）在《酪氨酸激酶Src在β-肾上腺素受体介导心脏重塑中的功能与机制研究》文中研究表明目的:心力衰竭是多种心脏疾病的终末阶段,进行性发展,预后极差,已成为世界范围内严重的公共卫生问题,其严重性主要体现在其高发病率、高死亡率、以及治疗所需要的高昂费用。而心脏重塑是心力衰竭的必经病理过程。心脏重塑是指心脏质量、体积和功能的改变,以适应心肌损伤或负荷的变化,是众多心血管疾病的病理基础,而交感应激导致的β-肾上腺素受体（β-AR）的过度激活是心脏重塑的主要发病机制。交感应激条件下,β-AR过度激活会导致心脏心肌细胞产生凋亡和肥大等病理效应,引起心脏的损伤;而β-AR的持续激活则会引起心脏病理性重构。然而,目前对于β-AR信号转导途径及其激动剂引起病理效应的机制尚不清楚。我们所关注的Src激酶是β-AR下游关键的酪氨酸激酶,但是目前,Src与β-AR介导心脏重塑的关系尚不明确。因此,本研究旨在阐明酪氨酸激酶Src是否介导β-AR诱导的心脏重塑,能否将其作为治疗心脏重塑的药物靶点,为心脏重塑的精准治疗提供依据。方法:选择12周左右野生型C57雄鼠构建心脏重塑模型,将其随机分为三组CON组（对照组）、ISO组（模型组）、以及PP1+ISO组（药物干预组）,ISO组（模型组）皮下注射β-AR激动剂异丙基肾上腺素（isoprenaline）,剂量是10mg/kg/day,连续14天;PP1+ISO组（药物干预组）在注射ISO的同时,腹腔注射Src抑制剂PP1,剂量是1.5mg/kg/day,间隔给药14天;CON组（对照组）分别注射等量溶剂作为对照。14天后,通过超声心动图检测小鼠心脏结构和功能;H&E染色检测心脏心肌细胞横截面积以及心脏炎症;天狼猩红染色检测心脏纤维化;记录小鼠体重、胫骨长度以及小鼠心脏重量,并以此计算并统计心体比和心胫比;通过RT-PCR的方法,检测心脏肥大的标志物ANP和BNP m RNA水平的表达,同时检测心脏纤维化标志物Col-Ⅰ和Col-ⅢmRNA水平的表达以及心脏炎症相关标志物IL-1β和IL-6 mRNA水平的表达;通过CCK-8检测心脏成纤维细胞的增殖;通过Western Blot检测成纤维细胞增殖标志物PCNA的表达;干预Src,通过Western Blot检测p-ERK1/2、T-ERK、p-p38、T-p38、T-Src以及GAPDH的表达。结果:动物实验的结果表明:小鼠的心脏重塑模型构建成功;抑制Src可以减轻β-AR诱导的心脏肥大;抑制Src可以减轻β-AR诱导的心脏纤维化;抑制Src可以减轻β-AR诱导的心脏炎症。细胞实验的结果表明:Src介导心脏重塑的分子机制是通过介导ERK1/2和p38信号通路实现的。Src抑制剂PP1能够有效抑制ISO诱导的ERK1/2、p38的磷酸化,同时过表达Src能够促进ISO诱导的ERK1/2、p38的磷酸化。结论:酪氨酸激酶Src能够介导β-AR诱导的心脏重塑;Src介导心脏重塑的分子机制是通过介导β-AR下游ERK1/2和p38 MAPK实现的。
二、α_(1A)-和α_(1B)-肾上腺素受体介导HEK293细胞增殖和Ca~(2+)-钙调蛋白依赖性蛋白激酶激活(英文)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、α_(1A)-和α_(1B)-肾上腺素受体介导HEK293细胞增殖和Ca~(2+)-钙调蛋白依赖性蛋白激酶激活(英文)（论文提纲范文）
（1）长链非编码RNA XIST在心肌肥厚中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第一章 综述 长链非编码RNA在心力衰竭中的研究进展 |
| 1 心力衰竭的发病机制 |
| 1.1 心力衰竭与心肌肥厚 |
| 1.1.1 生理性心肌肥厚 |
| 1.1.2 病理性心肌肥厚 |
| 1.1.3 生理性心肌肥厚和病理性心肌肥厚之间的相互关系 |
| 1.2 心力衰竭与心肌纤维化 |
| 1.3 心力衰竭与心肌细胞凋亡 |
| 2 长链非编码RNA |
| 2.1 LncRNAs的分类 |
| 2.2 LncRNAs的分子功能 |
| 3 LncRNAs与心力衰竭 |
| 3.1 LncRNAs与心肌肥厚 |
| 3.2 LncRNAs与心肌纤维化 |
| 3.3 LncRNAs与心肌细胞凋亡 |
| 第二章 实验研究 |
| 1 LncRNA XIST对心肌肥大的影响 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验仪器与器材 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 溶液的配制 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 统计学处理 |
| 1.7 实验结果 |
| 1.8 讨论 |
| 2 LncRNA XIST通过miR-126a调控心肌肥大 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验仪器与器材 |
| 2.3 实验试剂 |
| 2.4 溶液的配制 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.6 统计学处理 |
| 2.7 实验结果 |
| 2.8 讨论 |
| 3 XIST通过miR-126a/IGF-1/Akt信号通路调控心肌细胞肥大 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验仪器与器材 |
| 3.3 实验试剂 |
| 3.4 溶液的配制 |
| 3.5 实验方法 |
| 3.6 统计学处理 |
| 3.7 实验结果 |
| 3.8 讨论 |
| 第三章 结论 |
| 参考文献 |
| 在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）SHH通路在缺血性脑卒中和新生小鼠肺发育中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| PartⅠ:探究SHH通路在缺血性脑卒中中的作用及其分子机制 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 脑卒中 |
| 1.2 脑卒中的风险因素 |
| 1.3 急性缺血性脑卒中的治疗 |
| 1.3.1 静脉溶栓 |
| 1.3.2 血管内治疗 |
| 1.3.3 支架回收器 |
| 1.4 脑卒中的损伤机制 |
| 1.5 脑卒中损伤的分子机制 |
| 1.5.1 缺血引起的细胞外谷氨酸积累 |
| 1.5.2 谷氨酸大量释放的机制 |
| 1.5.3 缺血后再灌注时激活谷氨酸能递质 |
| 1.5.4 细胞外谷氨酸积累与神经元损伤 |
| 1.5.5 缺血后脑梗死 |
| 1.6 脑卒中的保护机制 |
| 1.6.1 阻断突触前谷氨酸释放 |
| 1.6.2 阻断突触后谷氨酸受体激活 |
| 1.6.3 促进细胞外谷氨酸的重吸收 |
| 1.7 SHH通路调节细胞外谷氨酸浓度 |
| 1.7.1 SHH通路 |
| 1.7.2 SHH非经典通路 |
| 1.8 本课题的研究依据和目的 |
| 第二章 实验材料与实验方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验材料和试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 常用试剂及配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 克隆与细胞转染 |
| 2.2.3 实时荧光定量PCR |
| 2.2.4 电生理细胞膜片钳 |
| 2.2.5 ~3H标记的谷氨酸重吸收检测 |
| 2.2.6 细胞膜蛋白提取 |
| 2.2.7 蛋白样品制备及免疫印迹 |
| 2.2.8 免疫沉淀 |
| 2.2.9 脑缺血模型与TTC染色 |
| 2.2.10 数据分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 SHH通路通过GLT-1 调节胞外谷氨酸的浓度 |
| 3.2 SHH通路通过PKCα调节GLT-1 |
| 3.3 SHH通路通过PKCα调节GLT-1a使其下膜 |
| 3.4 SHH通路通过PKCα磷酸化GLT-1的563 位点使其下膜 |
| 3.5 抑制GLT-1 的磷酸化改善小鼠缺血后的脑梗死面积 |
| 3.6 抑制SHH通路改善小鼠脑缺血后的脑梗死面积 |
| 3.7 NVP-LDE225 可以有效改善非人类灵长类缺血模型后的脑损伤 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.2 不足之处 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| PartⅡ:探究SHH通路在新生小鼠肺发育中的作用及其分子机制 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 HH通路 |
| 1.2 SHH通路 |
| 1.3 SHH经典通路 |
| 1.4 SHH非经典通路 |
| 1.4.1 Ⅰ型非经典SHH通路 |
| 1.4.2 Ⅱ型非经典SHH通路 |
| 1.5 SHH通路的作用 |
| 1.5.1 SHH通路在胚胎肺发育中的作用 |
| 1.5.2 SHH通路在疾病中的作用 |
| 1.6 SHH通路的激活与抑制 |
| 1.6.1 SHH通路的激活 |
| 1.6.2 SHH通路的抑制 |
| 1.7 本课题的研究依据和目的 |
| 第二章 实验材料与实验方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验材料和试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 常用试剂及配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 电生理细胞膜片钳 |
| 2.2.3 实时荧光定量PCR |
| 2.2.4 克隆与细胞转染 |
| 2.2.5 蛋白样品制备及免疫印迹 |
| 2.2.6 CCK8 检测细胞增殖 |
| 2.2.7 分子模拟 |
| 2.2.8 结合实验 |
| 2.2.9 免疫组化 |
| 2.2.10 数据分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 糖皮质激素可以抑制SHH通路 |
| 3.2 Cortisol抑制SHH通路 |
| 3.3 Cortisol与 SMO结合抑制SHH通路 |
| 3.4 Cortisol通过与SMO的112 位点结合抑制SHH通路 |
| 3.5 Cortisol在小鼠中抑制SMO的活性 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.2 不足之处 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录:SHH通路在发育和疾病过程中的作用 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（3）神经肽受体GPR103信号转导机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 人神经肽QRFP及其受体的研究现状 |
| 1.1.1 RFa神经肽 |
| 1.1.2 QRFP及其受体GPR103 的发现 |
| 1.1.3 QRFP及其受体介导的生理功能 |
| 1.2 G蛋白偶联受体信号转导研究 |
| 1.2.1 G蛋白偶联受体活化的结构基础 |
| 1.2.2 G蛋白偶联受体变构调节 |
| 1.2.3 G蛋白偶联受体偏向性信号转导 |
| 1.3 G蛋白偶联受体蛋白翻译后修饰 |
| 1.3.1 蛋白翻译后修饰 |
| 1.3.2 GPCR中的蛋白翻译后修饰 |
| 1.3.3 糖基化修饰在GPCR中的作用 |
| 1.4 参与胰岛素分泌调控的GPCRs |
| 1.4.1 胰岛β细胞中GPCR的表达 |
| 1.4.2 GPCR调控胰岛素分泌机制 |
| 1.5 前景展望 |
| 1.6 研究意义 |
| 第二章 人神经肽QRFP与其受体相互作用的结构基础 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 GPR103 配体 43RFa活性明显高于配体 26RFa |
| 2.3.2 26RFa和43RFa通过GPR103 激活不同的信号通路 |
| 2.3.3 GPR103/43RFa复合物结构的同源建模 |
| 2.3.4 突变体K189A、D191A和 K196A对 43RFa介导下游信号通路的影响 |
| 2.3.5 L202A和 Y214A突变为丙氨酸对43RFa介导下游信号通路的影响 |
| 2.3.6 配体截断体 35RFa及突变体 35RFa-F10A对受体激活的影响 |
| 2.3.7 43RFa和26RFa及35RFa-F10A对胰岛素分泌的调节作用 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 GPR103 N-糖基化对配体结合和受体激活影响及其机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 GPR103 N-糖基化发生在N端结构域和第一个胞外环上 |
| 3.3.2 GPR103 糖基化不影响细胞表面表达 |
| 3.3.3 N-连接糖基化的缺失削弱了激动剂介导的信号转导 |
| 3.3.4 N-连接的糖基化是配体与受体结合所必需的 |
| 3.3.5 N-糖基化在GPR103 功能选择性中的作用 |
| 3.3.6 内源性GPR103 的N-糖基化对于受体激活至关重要 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 全文总结 |
| 4.1 主要研究成果 |
| 4.2 本文创新点 |
| 4.3 本文的不足与后续研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）钙整合素结合蛋白2在心房重构中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 材料与方法 |
| 文献综述 丝氨酸/苏氨酸磷酸酶1在心房颤动中的作用 |
| 参考文献 |
| 基金资助 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（5）TMEM16A钙激活氯通道介导辛伐他汀抑制乳腺癌作用的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 药品与试剂 |
| 2.1.2 仪器 |
| 2.1.3 试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 CCK-8 实验 |
| 2.2.3 引物设计与定点突变 |
| 2.2.4 目的基因PCR及克隆 |
| 2.2.5 质粒的转化与提取 |
| 2.2.6 TMEM16A在 HEK-293 细胞中的瞬时转染 |
| 2.2.7 电生理膜片钳实验 |
| 2.2.8 TCGA数据收集及GSEA通路富集分析 |
| 2.2.9 Western blot |
| 2.2.10 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 辛伐他汀抑制乳腺癌细胞增殖 |
| 3.2 辛伐他汀显着抑制TMEM16A钙激活氯电流 |
| 3.3 R429A,K430L,R437F是辛伐他汀与TMEM16A结合的关键氨基酸 |
| 3.4 R429A/K430L/R437F-TMEM16A降低了辛伐他汀对钙激活氯电流的抑制 |
| 3.5 ER、PR阳性乳腺癌中TMEM16A高表达的基因富集通路 |
| 3.6 TMEM16A激活EGFR/AKT信号通路促进乳腺癌细胞增值 |
| 3.7 辛伐他汀抑制乳腺癌细胞TMEM16A/EGFR/AKT通路 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 钙激活氯通道 TMEM16A 的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）和厚朴酚靶向TMEM16A钙激活氯通道抑制大肠癌的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:和厚朴酚抑制TMEM16A钙激活氯通道的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 主要实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养相关实验方法 |
| 2.2.2 细胞转染相关实验方法 |
| 2.2.3 膜片钳电生理实验方法 |
| 2.2.4 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 和厚朴酚抑制HEK293细胞异源表达的TMEM16A钙激活氯电流 |
| 3.2 和厚朴酚在Inside-out模式下抑制TMEM16A钙激活氯电流 |
| 3.3 和厚朴酚可逆地抑制TMEM16A电流 |
| 3.4 和厚朴酚对TMEM16B钙激活氯电流的作用 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:和厚朴酚抑制TMEM16A的关键氨基酸的鉴定 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 主要实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 氨基酸定点突变 |
| 3 结果 |
| 3.1 R429A、K430L和N435G能降低和厚朴酚对TMEM16A抑制率 |
| 3.2 R429A/K430L/N435G能显着降低TMEM16A对和厚朴酚的敏感性 |
| 3.3 L372K/G377N能显着增强TMEM16B对和厚朴酚的敏感性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:和厚朴酚通过靶向TMEM16A通道抑制大肠癌细胞增殖 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 主要实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 CCK-8细胞增殖检测实验 |
| 2.2.2 qRT-PCR实验 |
| 2.2.3 Western Blot实验 |
| 3 结果 |
| 3.1 TMEM16A介导了SW620细胞中的钙激活氯电流 |
| 3.2 TMEM16A通过钙激活氯通道功能促进细胞增殖 |
| 3.3 和厚朴酚抑制SW620细胞内源性TMEM16A钙激活氯电流 |
| 3.4 和厚朴酚通过靶向TMEM16A通道抑制大肠癌细胞增殖 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 TMEM16A的结构、功能及其抑制剂的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）肾上腺素受体与心血管疾病（论文提纲范文）
| 1 肾上腺素受体的发现与分类 |
| 1.1 肾上腺素受体的发现与理论发展 |
| 1.2 肾上腺素受体分类的意义 |
| 2 肾上腺素受体的信号转导 |
| 2.1 G蛋白依赖性信号通路 |
| 2.2 G蛋白非依赖性信号通路 |
| 3 肾上腺素受体与心血管系统 |
| 3.1 肾上腺素受体与心血管生理功能 |
| 3.2 肾上腺素受体与心血管疾病 |
| 4 总结与展望 |
（8）草鱼大脑和垂体中神经肽挖掘及速激肽功能鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 脊椎动物大脑和垂体研究概况 |
| 2 大脑和垂体中调节机体功能的重要调控因子 |
| 3 速激肽家族研究进展 |
| 4 研究主要目的及意义 |
| 第二章 草鱼大脑与垂体的结构和功能的初步研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要仪器和试剂 |
| 2.2.1 主要实验仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.3 草鱼脑和垂体组织样品获得 |
| 2.4 石蜡组织切片的制作 |
| 2.4.1 常规石蜡切片制作过程 |
| 2.4.2 H.E染色 |
| 2.5 总RNA提取 |
| 2.6 RNA-seq测序、质控、参考序列比对和基因注释 |
| 2.7 差异表达基因的富集分析和组织间关系分析 |
| 2.8 RT-q PCR验证及数据统计分析 |
| 3 实验结果与分析 |
| 3.1 草鱼大脑和垂体的整体结构 |
| 3.2 草鱼大脑各亚区和垂体的转录组数据总览 |
| 3.3 草鱼嗅球的显微结构和转录组分析 |
| 3.4 草鱼端脑的显微结构和转录组分析 |
| 3.5 草鱼视顶盖的显微结构和转录组分析 |
| 3.6 草鱼下丘脑的显微结构和转录组分析 |
| 3.7 草鱼小脑的显微结构和转录组分析 |
| 3.8 草鱼延脑的显微结构和转录组分析 |
| 3.9 草鱼垂体的显微结构和转录组分析 |
| 3.10 草鱼各脑区和垂体的关联分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 嗅球可能在免疫响应中起重要作用 |
| 4.2 端脑参与食欲和生殖调节 |
| 4.3 视顶盖在视觉系统和摄食中的重要性 |
| 4.4 下丘脑作为潜在的摄食和生殖的调节中枢 |
| 4.5 草鱼小脑未解之谜 |
| 4.6 延脑在听觉系统中的潜在作用 |
| 4.7 垂体在机体生长、生殖、能量代谢以及器官发育中的重要功能 |
| 4.8 端脑和下丘脑—可能的摄食和生殖调控中枢 |
| 第三章 草鱼大脑和垂体内神经肽及其受体的挖掘和分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要仪器和试剂 |
| 2.3 草鱼各脑亚区及垂体总RNA提取 |
| 2.4 转录组测序 |
| 2.5 草鱼大脑和垂体内神经肽及其受体的挖掘和转录本表达分布 |
| 3 实验结果与讨论 |
| 3.1 Apelin家族 |
| 3.2 NMB/GRP家族 |
| 3.3 Calcitonin家族 |
| 3.4 CART家族 |
| 3.5 CRH家族 |
| 3.6 CCK/Gastrin家族 |
| 3.7 GRL/MLN家族 |
| 3.8 Glucagon家族 |
| 3.9 GnRH家族 |
| 3.10 INS/IGF家族 |
| 3.11 MCH家族 |
| 3.12 NPP家族 |
| 3.13 NPB/NPW家族 |
| 3.14 NTS家族 |
| 3.15 Neuromedin家族 |
| 3.16 NPY家族 |
| 3.17 Opioid家族 |
| 3.18 HCRT家族 |
| 3.19 PTH家族 |
| 3.20 RFamide家族 |
| 3.21 SST家族 |
| 3.22 TAC家族 |
| 3.23 TRH家族 |
| 第四章 TAC3编码产物在草鱼垂体中的功能及机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要仪器和试剂 |
| 2.2.1 主要实验仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.3 转录组测序与生物信息学分析 |
| 2.4 NKBa在草鱼垂体细胞中的功能分析 |
| 2.5 NKBa促进垂体摄食因子表达的受体选择性和信号通路分析 |
| 2.6 草鱼NKBa在体功能验证 |
| 2.6.1 草鱼腹腔注射NKBa |
| 2.6.2 草鱼摄食实验 |
| 2.7 数据分析 |
| 3 实验结果与分析 |
| 3.1 NKBa诱导草鱼垂体细胞的转录组分析 |
| 3.2 NKBa对草鱼垂体细胞中CART、UTS1、NMB和 POMCb的调节 |
| 3.3 NKBa诱导草鱼垂体细胞中CART、UTS1、NMB和 POMCb合成的受体选择性实验 |
| 3.4 NKBa诱导CART、UTS1、NMB和 POMCb m RNA表达的受体后信号通路. |
| 3.5 在体实验验证NKBa对草鱼垂体内CART、UTS1、NMB和 POMCb合成的调控作用 |
| 3.6 摄食实验验证NKB与摄食调控的关系 |
| 4 讨论 |
| 第五章 TAC4编码产物对草鱼垂体中摄食肽的调控研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要仪器和试剂 |
| 2.2.1 主要实验仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.3 草鱼TAC4和NKRs的分子克隆和组织表达分析 |
| 2.3.1 总RNA提取与逆转录 |
| 2.3.2 引物设计与PCR扩增 |
| 2.3.3 草鱼TAC4和NKRs序列分析及系统进化树构建 |
| 2.3.4 草鱼TAC4和NKRs的组织表达分布 |
| 2.4 转录组测序与生物信息学分析 |
| 2.5 HKs在草鱼垂体细胞中的功能分析 |
| 2.6 草鱼NKRs在 HEK293T细胞中的功能表达 |
| 2.7 HK1在草鱼垂体中的功能失活分析 |
| 2.8 数据分析 |
| 3 实验结果与分析 |
| 3.1 草鱼TAC4和NKRs的基因克隆及序列分析 |
| 3.2 草鱼TAC4和NKRs的组织表达分析 |
| 3.3 草鱼HKs和 NKRs的受体配体选择性实验 |
| 3.4 HK2诱导草鱼垂体细胞的转录组分析 |
| 3.5 HK1和HK2 对草鱼垂体细胞中关键DEGs mRNA表达的调节 |
| 3.6 HK1突变体在草鱼垂体中的功能分析及受体配体验证 |
| 4 讨论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 1 研究总结 |
| 2 创新性 |
| 3 存在问题 |
| 4 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（9）G蛋白偶联受体介导的蛋白激酶C激活及其下游信号通路机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 GPCRs的激活和调节 |
| 1.3 GPCRs介导的Ca~(2+)和PKC信号通路 |
| 1.4 PKC的发现 |
| 1.4.1 蛋白激酶C的结构域组成 |
| 1.4.2 PKC的成熟 |
| 1.4.3 PKC的可逆活化 |
| 1.4.4 PKC的下调 |
| 1.4.5 PKC的下游底物 |
| 1.5 GPCRs诱导的ERK激活:依赖PKC和不依赖PKC的通路 |
| 参考文献 |
| 第二章 PKC-EGFP转位系统的构建与测试 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 PKC-GFP质粒改造 |
| 2.3.2 更多PKC亚型的克隆与载体的构建 |
| 2.3.3 PKC-EGFP活细胞成像检测 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 刺参Kisspeptins受体通过PKC介导的ERK1/2 信号通路活化机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 刺参(A.japonicus)Kisspeptin系统 |
| 3.3.2 Apoja KpRs及其配体的功能性鉴定 |
| 3.3.3 Apoja KpRs配体结合力差异鉴定 |
| 3.3.4 Apoja KpRs偶联Gαq介导下游信号通路 |
| 3.3.5 AjKiss1b-10 激活Apoja KpRs并介导下游信号通路 |
| 3.3.6 AjKiss1b-10 激活Apoja KpRs介导ERK1/2 磷酸化机制不同 |
| 3.3.7 AjKiss1b-10 激活Apoja KpRs并介导PKC活化 |
| 3.3.8 Apoja Kisspeptin系统和脊椎动物Kisspeptin系统的交互作用 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 家蚕神经肽CAPA-PVK受体可变剪接体介导的ERK1/2 磷酸化机制研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 Bom CAPA-PVK-R1 天然剪接突变体△341 的产生 |
| 4.3.2 剪接突变体△341 在细胞中的表达 |
| 4.3.3 △341 能够被CAPA-PK激活 |
| 4.3.4 剪接突变体△341 偶联Gαi/o介导下游信号通路 |
| 4.3.5 剪接突变体△341 通过Gβγ介导下游ERK1/2 信号通路 |
| 4.3.6 剪接突变体△341 通过PKCζ介导下游ERK1/2 信号通路 |
| 4.3.7 剪接突变体△341 通过PI3K介导下游ERK1/2 信号通路 |
| 4.3.8 缺少C末端,剪接突变体△341 激动剂引起的内吞受损 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 全文总结 |
| 5.1 主要研究成果 |
| 5.2 本文创新点 |
| 5.3 本文的后续研究及展望 |
| 作者简介 |
（10）酪氨酸激酶Src在β-肾上腺素受体介导心脏重塑中的功能与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肾上腺素受体 |
| 1.1.1 肾上腺素受体亚型 |
| 1.1.2 心脏β-肾上腺素受体的亚型 |
| 1.1.3 心脏β-肾上腺素受体的功能 |
| 1.1.4 心脏交感神经与β-肾上腺素受体 |
| 1.2 β-肾上腺素受体信号通路 |
| 1.2.1 经典的Gs-AC-c AMP通路 |
| 1.2.2 非Gs-AC-c AMP通路 |
| 1.3 心脏β-肾上腺素受体在心力衰竭时的变化 |
| 1.3.1 β1-AR在心力衰竭时的变化 |
| 1.3.2 β2-AR在心力衰竭时的变化 |
| 1.4 β-肾上腺素受体信号通路调节蛋白及其在心脏重塑中的作用 |
| 1.4.1 直接调节蛋白及其在心脏重塑中的作用 |
| 1.4.2 激酶及其在心脏重塑中的作用 |
| 1.4.3 其他 |
| 1.5 酪氨酸激酶Src |
| 1.5.1 酪氨酸激酶Src |
| 1.5.2 心脏中Src的结构 |
| 1.5.3 心脏中Src的功能 |
| 1.5.4 Src与β-肾上腺素受体 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 动物 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 主要仪器和耗材 |
| 2.1.4 常用试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 乳大鼠心脏成纤维细胞的原代分离及培养 |
| 2.2.2 心脏成纤维细胞的传代 |
| 2.2.3 HEK-293细胞的培养及转染 |
| 2.2.4 蛋白提取及测定 |
| 2.2.5 蛋白免疫印迹实验 |
| 2.2.6 心脏重塑模型的建立 |
| 2.2.7 心脏超声 |
| 2.2.8 心脏取材 |
| 2.2.9 组织包埋、切片及染色 |
| 2.2.10 RNA的提取 |
| 2.2.11 逆转录 |
| 2.2.12 Q-PCR及 RT-PCR |
| 2.2.13 细胞增殖检测 |
| 2.2.14 数据处理 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 Src介导心脏重塑 |
| 3.1.1 心脏重塑模型构建成功 |
| 3.1.2 Src介导β-肾上腺素受体诱导的心脏肥大 |
| 3.1.3 Src介导β-肾上腺素受体诱导的心脏纤维化 |
| 3.1.4 Src介导β-肾上腺素受体诱导的心脏炎症 |
| 3.2 Src介导心脏重塑的机制 |
| 3.2.1 Src介导β-AR下游ERK1/2 |
| 3.2.2 Src介导β-AR下游p38 |
| 第四章 总结与展望 |
| 4.1 主要结论 |
| 4.2 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 :作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
四、α_(1A)-和α_(1B)-肾上腺素受体介导HEK293细胞增殖和Ca~(2+)-钙调蛋白依赖性蛋白激酶激活(英文)（论文参考文献）
- [1]长链非编码RNA XIST在心肌肥厚中的作用及机制研究[D]. 赵卓. 吉林大学, 2021(01)
- [2]SHH通路在缺血性脑卒中和新生小鼠肺发育中的作用机制研究[D]. 陆珊珊. 军事科学院, 2021(02)
- [3]神经肽受体GPR103信号转导机制研究[D]. 王伟伟. 浙江大学, 2021(01)
- [4]钙整合素结合蛋白2在心房重构中的作用机制研究[D]. 王毅晖. 北京协和医学院, 2021
- [5]TMEM16A钙激活氯通道介导辛伐他汀抑制乳腺癌作用的分子机制研究[D]. 刘慧. 中国医科大学, 2021(02)
- [6]和厚朴酚靶向TMEM16A钙激活氯通道抑制大肠癌的研究[D]. 王天宇. 中国医科大学, 2021(02)
- [7]肾上腺素受体与心血管疾病[J]. 关开行,王文景,李子健,董尔丹. 中国科学:生命科学, 2020(08)
- [8]草鱼大脑和垂体中神经肽挖掘及速激肽功能鉴定[D]. 叶城. 华中农业大学, 2020(02)
- [9]G蛋白偶联受体介导的蛋白激酶C激活及其下游信号通路机制研究[D]. 曹铮. 浙江大学, 2020(08)
- [10]酪氨酸激酶Src在β-肾上腺素受体介导心脏重塑中的功能与机制研究[D]. 李文奇. 江南大学, 2020(01)