一、Agilent 2100 Bioanalyzer在基因差异表达研究中的应用（论文文献综述）
赵胜[1]（2021）在《AIO-seq高通量测序技术开发及玉米NAM群体遗传特性和株型性状QTL定位研究》文中研究指明新一代测序技术（Next Generation Sequencing,NGS）的发展和测序成本的下降,使得其在全基因组基因型检测（Whole Genome Genotyping,WGG）中得到了广泛应用。然而,与测序数据产量的稳步提升相比,测序文库的制备流程仍然效率较低,导致在目前的WGG应用中,文库构建成本远远高于测序成本,尤其是其中耗时且费力的文库片段分选和定量步骤,已成为涉及大样本项目文库制备的瓶颈。针对这一技术难题,我们开展研究,获得的主要结果如下:（1）开发了All-In-One sequencing（AIO-seq）高通量测序技术:将传统文库制备中每个文库都需进行片段分选及定量的繁琐流程,替换为按照每个文库的靶区域浓度（Target Region Concentration,TRC）及预期的数据产出预先将所有文库混合在一起、而后只进行单次片段分选及定量的高效操作;（2）利用AIO-seq测序技术对少量样本混合后的文库进行小数据量测序,以及多样本混合后的文库进行包Lane测序,都可以获得预期的测序数据产出;（3）AIO-seq测序技术可以用于基因组和转录组文库测序,获得预期各样本间相等或不等的测序数据产出;（4）利用简化的AIO-seq测序技术对一个玉米BC1F4群体进行WGG,共鉴定到19个株型性状相关的QTLs,其中部分QTLs含已知的功能基因。AIO-seq测序技术提高了测序文库的制备效率,降低了文库制备成本,在群体遗传学以及植物育种等相关项目中有重要的应用前景。玉米（Zea mays）作为一种重要的生物能源和粮食作物,在世界范围内广泛种植。在构成玉米株型的主要因素中,叶夹角（Leaf Angle,LA）、株高（Plant Height,PH）和穗位（Ear Height,EH）的变化,会对玉米最终的产量产生重要影响。虽然前人已利用不同的分离群体,对控制这三个性状的遗传机制展开研究,但玉米株型调控的复杂机理仍未被完全解析。本研究利用一个新的玉米巢式关联作图群体（HNAU-NAM1）及其全基因组基因型数据（玉米9.4K芯片和百万来源于亲本的SNP标记）,通过单个亚群的连锁分析（Separate Linkage Mapping,SLM）、整合的连锁定位（Joint Linkage Mapping,JLM）以及全基因组关联分析（Genome-Wide Association Study,GWAS）三种QTL定位方法,分别对LA、PH以及EH三个株型性状进行全面而深入的遗传解析,获得的主要结果如下:（1）对由13个亲本杂交而成、包含1,625个BC1F4或BC2F4株系的玉米HNAU-NAM1群体进行了进化树分析、表型变异分析、主成分分析（Principal Component Analysis,PCA）以及连锁不平衡（Linkage Disequilibrium,LD）分析,结果显示HNAU-NAM1群体的亲本和所有株系都表现出了明显的差异,且内部群体结构微弱、LD衰减距离小,表明HNAU-NAM1群体可以用于LA、PH和EH三个性状的遗传解析;（2）在全基因组范围内:借助SLM定位方法,共鉴定到41、31和26个分别控制LA、PH和EH的QTLs;基于JLM定位方法,共鉴定到84、78和88个分别控制LA、PH和EH的QTLs;通过GWAS定位方法,共鉴定到22、23和18个分别与LA、PH和EH显着关联的SNPs;此外,每个株型性状的三种定位结果间都存在部分重叠;（3）全基因组上共鉴定到10个可同时影响LA、PH和EH的QTL热点区域,且每个区域内控制某一个株型性状的QTLs可至少被两种定位方法检测到;（4）13个可同时被三种定位方法检测到的主效QTLs区间内,结合每种方法的定位区间及区间内基因功能注释,预测了潜在的候选基因:含4个已知功能的基因,和8个新基因。本研究对玉米HNAU-NAM1群体的群体结构及LD水平等遗传特性进行了深入评估,并全面解析了控制玉米株型性状的遗传基础,这不仅为玉米遗传学及功能基因组学研究提供了新的群体资源,而且加深了我们对株型复杂调控网络的认识,为后期玉米理想株型的培育及高产、耐密植新品种的分子选育奠定了理论基础。
张鹏[2]（2021）在《FBI技术的开发及其在水稻育种中的应用》文中研究说明分子标记辅助选择（Molecular Marker-Assisted Selection,MAS）是育种家们在研究过程中提升育种筛选效率、增加目标基因筛选准确性、方便快捷得到优良品种的重要策略。随着分子检测技术的飞速发展,在大数据的时代背景下,高通量的单核苷酸多态性（SNP）标记凭借其数量多、通量高、规模大的特点,在育种过程中得到了广泛应用。本实验室前期通过改良转座子显示技术,发明了一种新的高通量SNP分子标记检测方法。该方法利用一条转座子引物和一个前景基因的特异引物,通过一步Tn5转座酶反应和两轮PCR扩增构建一个二代测序文库,分析其测序数据可以得知检测样品的前景基因型和遗传背景。在此基础上,本研究对其实验流程进行改良优化,利用特异引物在基因组模板上完全匹配的退火（primer-template perfect annealing,PTPA）扩增目标片段作为前景标记,同时利用引物在基因组模板上的不完全匹配的退火（primer-template mismatches annealing,PTMA）扩增出数以十万计的其它片段作为全基因组的背景标记,最终开发出可以一次性同时检测多个目标前景位点和全部遗传背景的FBI（Foreground and Background Integrated genotyping）技术,该技术不受物种限制,可为育种家的种质研究工作提供更多便利。具体来说,本研究共获得了以下结果:1.完成一个前景基因到多个前景基因筛选的实验方法优化,使引物的PTMA和PTPA扩增效应更强,通过Q-PCR检测最终确立了FBI方法的最优体系。2.完成了FBI技术不同引物在不同作物品种的通用性研究,证明了该方法不受物种的限制,任何一条引物都可以完成不同作物的遗传背景标记。3.利用高保真酶和非高保真酶对比实验,确定了FBI技术特异引物的PTMA效应的匹配模式是引物中间的5～7碱基完全匹配,并且是以滑窗式移动的结合扩增的方式。4.在FBI-seq的应用研究中,完成了同时对稻瘟病抗性基因Pi2、香味基因BADH2、育性恢复基因Rf3和Rf4、品质基因Waxy的5个前景的46个高世代株系的遗传前景和背景的育种筛选。这些实验结果表明,FBI-seq仅需要一条不需要特殊设计和优化的普通引物即可实现对前景标记和数十万个位点的背景标记的同时检测,且能够很方便的转换到不同的前景基因和不同的物种中,尤其是基因组信息积累较少的物种上。此外,该方法可以同时进行多达6种前景的分子标记检测,相比目前其它全基因组标记检测方法,本研究提出的基于LM-PCR和NGS测序相结合的FBI技术,实验流程简单,是一种简单快捷且符合潮流趋势的新型育种的全基因组分子标记方法,在育种研究的基因型检测中具有广泛的应用前景。
姚动邦[3]（2021）在《Bacillus stearothermophilus α-淀粉酶在芽孢杆菌中高效胞外表达的研究》文中指出α-淀粉酶（EC 3.2.1.1）是一种水解酶,能够水解淀粉中的α-1,4-糖苷键生成低分子量糊精、麦芽寡糖、麦芽糖、葡萄糖等产物。它广泛应用于食品、纺织、造纸、洗涤及医疗等行业中,市场需求量大。目前市场上用于淀粉喷射液化的高温α-淀粉酶主要来源于地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）,但其主要由国外公司进行生产和销售,国内酶制剂公司难以与其竞争,导致其售价相对较高。本课题组前期获得了一个具有热稳定性对钙离子浓度依赖度低、催化率高（约为B.licheniformisα-淀粉酶的8倍）等优点的嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）α-淀粉酶,且经分子改造获得了一个与B.licheniformisα-淀粉酶具有相似热稳定性的突变体,其具有较高的工业应用价值。然而,该突变体在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达存在胞外分泌差、易产生包涵体等问题,限制了其在工业上的应用。针对前期研究中存在的问题,本论文利用具有高效分泌蛋白能力的芽孢杆菌来胞外表达该来源的α-淀粉酶。首先,将其在可高效合成蛋白的短小芽孢杆菌（Brevibacillus choshinensis）中进行胞外重组表达,并通过敲除胞外蛋白酶、共表达胞外伴侣蛋白以及筛选内源性强启动子提高了其胞外表达水平。然后,将其在可高密度发酵的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中进行胞外重组表达。基于本论文前期促进α-淀粉酶在B.choshinensis中高效表达的研究结果,率先考察了启动子对α-淀粉酶在B.subtilis中胞外重组表达的影响,并通过优化信号肽、α-淀粉酶氨基酸序列、宿主菌胞外蛋白酶、发酵条件以及Sec分泌途径最终实现了其高效胞外表达。本研究加快了我国工业化低成本生产符合实际应用要求且具有自主产权的高温α-淀粉酶的研究进程,并为促进其它目的蛋白在芽孢杆菌中实现高效胞外表达提供了很多可供参考的重要策略。主要研究结果如下:（1）考察了α-淀粉酶在B.choshinensis中的胞外表达情况,并通过敲除胞外蛋白酶及共表达胞外伴侣蛋白提高了其胞外表达水平。以B.choshinensis HPD31-SP3为宿主,构建了含α-淀粉酶基因的重组菌BCWPS,挖掘了其基因组中的胞外蛋白酶基因bcp,建立了可用于B.choshinensis的CRISPR/Cas9n基因编辑系统。最终,通过敲除胞外蛋白酶基因bcp及共表达胞外伴侣蛋白基因prs Q获得的重组菌BCPPSQ,经摇瓶及3-L罐发酵后,胞外α-淀粉酶活性分别为6940.9和17925.6 U·mL-1,分别是重组菌BCWPS相应酶活的2.1和7.6倍。另外,重组菌BCCPSQ的3-L罐发酵酶活为目前文献报道的B.stearothermophilusα-淀粉酶在B.choshinensis中胞外表达的最高水平。（2）挖掘了B.choshinensis新内源性强启动子,并利用其提高了α-淀粉酶在B.choshinensis中的胞外表达水平。利用RNA-seq技术,获得了B.choshinensis的转录组数据。基于基因的转录水平及基因功能,筛选了高表达基因,并通过对其启动子进行预测及筛选,最终获得了两个新内源性强启动子PE和PF。在摇瓶发酵中,启动子PE和PF介导的α-淀粉酶活性分别是原始启动子P2的2.3和1.3倍。另外,通过3-L罐发酵及新的报告蛋白分别验证了内源性强启动子PE的效果及通用性。结果表明,在3-L罐发酵中,启动子PE介导的胞外α-淀粉酶活性是启动子P2的2.4倍。以蔗糖异构酶和角质酶为新的报告蛋白时,PE启动子介导的报告蛋白活性分别是P2启动子的2.3和1.3倍。（3）考察了α-淀粉酶在B.subtilis中的胞外表达情况,并通过表达元件优化提高了其胞外表达水平。首先,通过启动子的种类与强度优化将重组菌摇瓶酶活提高至210.4U·mL-1。然后,通过信号肽种类优化,将重组菌摇瓶酶活提高至732.0 U·mL-1,但重组菌产生了大量的包涵体。经研究发现,优化后的信号肽降低了胞内α-淀粉酶前体的跨膜转运效率是其引起重组菌产生包涵体的原因。通过过表达胞内伴侣蛋白减少了包涵体的产生,并将重组菌摇瓶酶活提高至1039.4 U·mL-1。最后,通过优化α-淀粉酶氨基酸序列,将重组菌摇瓶酶活提高至1496.8 U·mL-1,是原始酶活的11.2倍。（4）考察了宿主菌胞外蛋白酶对α-淀粉酶胞外表达的影响,并通过发酵优化提高了α-淀粉酶在B.subtilis中的胞外表达水平。将α-淀粉酶分别在具有不同胞外蛋白酶缺失型的B.subtilis宿主菌中进行重组表达,发现保留了胞外蛋白酶基因wpr A和vpr的宿主菌B.subtilis WS9最适合α-淀粉酶胞外表达。在摇瓶上对发酵培养基组分及发酵培养条件进行优化,将重组菌胞外α-淀粉酶活性提高了40%。在3-L罐上对发酵培养条件、补料培养基中的碳源种类、碳源与氮源的比例及总浓度进行优化,最终将重组菌胞外α-淀粉酶活性提高至23801.3 U·mL-1,是优化前的2.9倍。（5）通过优化Sec分泌途径实现了α-淀粉酶在B.subtilis中的高效胞外表达。首先,分别考察了Sec分泌途径中各个过程对α-淀粉酶胞外表达的影响。结果发现,胞内α-淀粉酶前体未折叠的可转运状态的维持及其跨膜转运效率是影响α-淀粉酶胞外表达的限制性因素。然后,在过表达胞内伴侣蛋白及共表达细胞膜转运通道组分Sec YEG的基础上,通过筛选信号肽优化了α-淀粉酶的整个Sec分泌过程,获得的信号肽SPrpm G将重组菌摇瓶酶活提高了93%。最终获得的重组菌WHS9GSAB经3-L罐发酵后,胞外α-淀粉酶活性及产率分别为35779.5 U·mL-1和384.7 U·mL-1·h-1,分别是目前文献报道的B.stearothermophilusα-淀粉酶在B.subtilis中最高表达水平的7.0和5.0倍。
黄俊红[4]（2020）在《质粒介导的oqxAB基因在大肠杆菌间的转移条件及接合子表型和基因型研究》文中进行了进一步梳理大肠埃希氏菌（Escherichia coli）是肠道菌群中重要的食源性条件致病菌之一。Oqx AB外排泵是RND（Resistance-nodulation-cell division）外排泵家族重要组成之一,对包括恩诺沙星、环丙沙星、喹乙醇和氯霉素等多种抗菌药、金属离子以及某些季铵盐类消毒剂都具有外排作用,是大肠杆菌重要的可转移抗性机制之一。目前关于质粒介导的oqx AB基因在大肠杆菌间的转移条件以及接合子的表型和基因型变化的基础研究较少。基于以上现状,本课题以临床分离的oqx AB基因阳性的鸡源大肠杆菌C26和链霉素抗性标记的工程菌大肠杆菌C600分别作为供体菌及受体菌,研究不同浓度的恩诺沙星、喹乙醇和氯霉素作为诱导底物以及不同供受体菌比例对oqx AB基因在大肠杆菌间转移的影响,并借助高通量测序手段对接合子大肠杆菌C26-600（M1）进行质粒序列分析和对大肠杆菌C600和接合子大肠杆菌C26-600（M1）转录组学研究,旨在探究影响大肠杆菌中oqx AB基因转移的条件以及转移发生后接合子的稳定性调节、生长力及耐药表型的变化规律。1鸡大肠杆菌中oqx AB基因流行性调查及细菌耐药表型研究2019年从安徽及江西地区分离的200株临床鸡源大肠杆菌进行oqx AB基因检测:对其中32株oqx AB基因阳性的大肠杆菌进行氨苄西林等16种抗菌药的药物敏感性测试,按照CLSI（M100）文件的标准进行耐药判定。结果显示,200株临床大肠杆菌中的oqx AB基因阳性率为18.5%（37/200）;32株oqx AB基因阳性大肠杆菌中,耐药率最高的为氨苄西林、大观霉素、四环素、氟苯尼考、磺胺异恶唑等5种药,均达85%以上;而耐药率低于20%的几种药为复方新诺明、头孢他啶、美罗培南、粘杆菌素和乙酰甲喹。同时,oqx AB基因阳性的大肠杆菌常呈多重耐药,5重、10重、12重耐药的菌株分别达84%（27/32）、37%（12/32）及9%（3/32）。2不同条件对大肠杆菌中oqx AB基因转移的影响的研究大肠杆菌C600作为接合转移试验的受体菌,大肠杆菌C15、C16、C26和C27作为接合转移预试验的供体菌。根据预实验结果,选取大肠杆菌C26作为接合转移试验的供体菌。接合转移试验以3种抗菌药诱导物（恩诺沙星、喹乙醇、氯霉素）、以受体菌大肠杆菌C600对相应抗菌药的MIC设置的6种诱导浓度（0 MIC、1/32 MIC、1/16MIC、1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC）及3种供受体菌接合比例[（108CFU/m L:105CFU/m L）、（105CFU/m L:105CFU/m L）、（102CFU/m L:105CFU/m L）]为基础交叉设置条件。3种抗菌药诱导结果显示,oqx AB基因在大肠杆菌中的转移受到氯霉素的调节作用最小,喹乙醇对其转移的促进作用最为明显。不同浓度诱导结果显示,3种抗菌药随诱导浓度升高接合率先升高后下降,在1/8MIC～1/4MIC处的接合率最高。不同供受体菌接合比例的诱导结果显示,供受体菌比例从1000:1、1:1、1:1000逐渐降低时,接合率逐渐降低。3接合子稳定性、耐药表型和生长力分析10株接合子（M1～M10）进行无抗LB肉汤（除含有链霉素）培养,测定接合子菌液中耐药菌比值;检测接合子M1的耐药表型变化;测定接合子M1的生长曲线。接合子稳定性验证结果显示,10株接合子在无抗LB肉汤（除含有链霉素）中传代10天后耐药菌比值范围为24.81%～94.81%,接合子M1（69.57%）作为后续试验菌株。接合子M1的药敏试验结果显示:相比受体菌,接合子对氨苄西林、庆大霉素、四环素、氟苯尼考、复方新诺明、头孢他啶、恩诺沙星、氧氟沙星、喹乙醇、氯霉素等10种抗菌药的耐药水平提升16倍以上,同时对大观霉素、头孢噻呋和安普霉素的耐药水平也有4倍以上的提升;相比供体菌,接合子对头孢他啶、安普霉素和氧氟沙星的耐药水平也有4倍及以上的提升。接合子M1生长曲线测定结果显示,与受体菌相比生长速率受到抑制,细菌终浓度与供体菌相近。4接合子质粒的基因组测序分析接合转移试验中接合子大肠杆菌C26-600（M1）进行质粒基因组测序分析。结果表明大肠杆菌C26-600（M1）的质粒类型为Inc X型,大小为138,728 bp。接合子大肠杆菌C26-600（M1）中质粒介导的耐药背景除喹诺酮类（oqx A/oqx B）外,还包括β-内酰胺类（bla TEM-1、bla TXM-55）、氨基糖苷类（aad A5）、氯霉素类（cm LA、flo R、cat B3）、季铵盐类（qac E11）、磷霉素（fos A3）及利福平（arr-3）。5.接合子和受体菌的比较转录组学测序分析接合转移试验中受体菌大肠杆菌C600和接合子大肠杆菌C26-600（M1）进行比较转录组测序分析。筛选出与多药外排泵相关的差异表达基因,主要包括RND家族（acr F、acr R）和MFS家族（emr Y、mdt G、emr D、mdf A）。适应及稳定性相关的差异表达基因主要包括hip A、hip B及umu D,参与维持接合子大肠杆菌C26-600（M1）中质粒的稳定。毒素-抗毒素（Toxin-Antitoxin,TA）系统相关差异表达基因主要包括yaf N、hok E、hok B、hok D、mqs R、rel B及mqs A。本课题首次研究了抗菌药底物、抗菌药浓度以及细菌不同接合比例对oqx AB基因在大肠杆菌中转移的影响,证实了不同抗菌药种类和浓度及不同供受体菌接合比例均会对大肠杆菌中oqx AB基因的转移产生影响。本研究对临床oqx AB基因耐药传播的风险评估和制定临床耐药防控措施具有重要的理论意义。
肖阳生[5]（2020）在《四川泡菜功能微生物代谢调控机理的研究》文中进行了进一步梳理泡菜是中华民族最具特色和代表性的传统发酵制品之一,而四川泡菜风味独特,营养价值高,是一种含有丰富生物活性物质的天然功能性食品。其风味与功能都受到微生物群体强烈且复杂的影响,然而四川泡菜发酵体系缺乏系统深入的研究。本研究综合应用扩增子测序和宏转录组等测序手段,解析传统四川泡菜自然发酵过程中微生物的群落结构和消长规律;结合色谱分析技术对发酵过程中的有机酸、游离氨基酸和挥发性物质等主要风味物质进行监测,了解风味物质的含量及对泡菜主体风味的贡献;通过宏转录组技术和正交最小偏二乘回归分析等方法系统研究发酵过程中风味物质和功能微生物之间的关联,在微观与宏观层面上探讨功能微生物的基因表达和关键酶对四川泡菜风味物质代谢通路的调控作用,期望通过优化四川泡菜群落结构、调整群落功能,为挖掘相关功能微生物、工业化生产四川泡菜及改进传统发酵工艺提供重要的理论依据,为弘扬中华民族食品文化奠定理论基础。主要研究结果如下:1、扩增子测序结果表明:四川泡菜自然发酵过程中,厚壁菌和变形菌是整个过程的优势微生物;在属水平上,乳杆菌属、肠杆菌属、乳球菌属、明串珠菌属、魏斯氏菌属等为优势属;而戊糖乳杆菌为优势菌种。基于微生物多样性分析结果可知:发酵初期微生物丰度与多样性最高,随着发酵的进行,菌群丰富度逐步降低并趋于稳定。消长规律可总结为:发酵初期,肠杆菌属及其他环境微生物如不动杆菌属和假单胞菌属等为主要微生物,魏斯氏菌属少量增长。发酵至中期,柠檬杆菌属、乳球菌属与明串珠菌属丰度逐渐增加。进入发酵后期,乳杆菌属占据了绝对的优势地位。2、泡菜发酵过程中风味物质的检测结果表明:四川泡菜中共有239种挥发性化合物、17种游离氨基酸、6种有机酸被检出;苹果酸为发酵初期的主要有机酸,乳酸和乙酸为发酵后期主要的有机酸,在第7天浓度分别为3.0mg/m L和1.41 mg/m L;氨基酸在发酵前6天迅速积累（0.71 mg/m L）,经历小幅波动后下降至0.50 mg/m L。丝氨酸、天冬氨酸和谷氨酸是四川泡菜中三种主要的氨基酸。239种挥发性物质中,硫化合物、醇类、萜类和酯类是在四川泡菜中检测到的最丰富的四类化合物。根据气味活度值筛选得到16种关键挥发性化合物,其中硫化物有9种,萜烯类2种、醇类2种、烷基苯1种、酮类1种和酯类1种。含硫化合物、酯类、醇类为四川泡菜中提供丰富独特的气味;谷氨酸和天冬氨酸为四川泡菜提供鲜味和酸味;乳酸、乙酸、苹果酸为泡菜提供酸味。3.O2PLS分析表明,微生物与风味物质关联紧密。4种有机酸,17种游离氨基酸和22种挥发性物质与32个菌属呈现强关联性。与风味物质相关性最强的有8个菌属;其中肠杆菌属和23种风味物质呈现负相关关系,乳杆菌属与21种风味物质正相关;13个菌属与柠檬酸、乳酸、乙酸、甲酸相关联。21个菌属影响氨基酸的合成与代谢,其中乳杆菌属最为关键;29个菌属与挥发性物质相关联,而乳杆菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属和果胶杆菌属都与超过10种挥发性物质相关。4、宏转录组学测序分析表明:四川泡菜发酵过程中三个时期（第1、3、7天）共9个样品的宏转录组测序数据量介于6.39至7.28Gbp之间,每个样本获得4260万至4910万个高质量序列。拼接得到140795个Unigenes。物种注释结果显示肠杆菌属、乳杆菌属、明串珠菌属、乳球菌属为优势微生物;其结果在属水平上与16s扩增子测序结果保持一致。微生物功能注释上,PICRUST可对菌群功能进行预测并初步了解其功能轮廓,但是在基因表达量以及不同层级类别的注释上与宏转录组测序结果差别较大。5、将四川泡菜微生物表达基因与四大数据库相匹配进行功能注释。KEGG匹配分析表明发酵过程中碳水化合物代谢和氨基酸合成与代谢通路最为活跃。CAZy功能基因注释结果表明糖苷水解酶和糖基转移酶基因表达量最高。GO功能基因注释表明代谢过程、单组织过程、结合、细胞过程、催化活性五个功能最为突出。Egg NOG功能基因注释表明能量、信号转运、碳水化合物及氨基酸代谢最为活跃。6、不同发酵阶段的差异表达基因聚类分析表明:发酵中后期差异基因数量远远少于前期和中期;差异基因表达主要涉及碳代谢、氨基酸生物合成、嘌呤代谢、双组分系统、ABC转运蛋白、嘧啶代谢、丙酮酸代谢、糖酵解/糖异生转运蛋白家族;前期与后期、中期与后期分别富集到220和182条代谢通路,碳代谢和氨基酸合成为差异基因富集最多的代谢通路;根据四川泡菜中的糖酵解、丙酮酸代谢和氨基酸生物合成与代谢重新构建以乳杆菌科与肠杆菌科为主的四川泡菜发酵代谢网络。7、四川泡菜中微生物对关键风味物质的调控结果表明:乳杆菌目、肠杆菌目和假单胞菌目为有机酸合成代谢的功能微生物,丙酮酸代谢为有机酸合成的主要途径。90个基因和5种酶涉及调节乳酸合成代谢;153个基因8种酶涉及乙酸的调节;353个基因调控的4种酶参与调节苹果酸的合成与代谢;乳杆菌目、肠杆菌目、假单胞菌目和气单胞菌目为调控谷氨酸、天冬氨酸的合成与代谢的功能微生物;谷氨酸的合成代谢涉及369个基因6种酶,天冬氨酸的合成与代谢涉及317个基因12种酶;真菌也参与天冬氨酸代谢的调节;乳杆菌目和肠杆菌目对于挥发性硫化物的调节起主要作用。甲硫氨酸与半胱氨酸分解为硫化物的反应涉及4种酶187个基因。微生物产生的脂酶可催化芳樟醇和甲酸的酯化反应生成芳樟醇甲酯。
王越[6]（2020）在《基于高通量测序的转座子显示技术开发及应用》文中研究表明随着基因组学研究的深入,全基因组分子标记检测技术已经成为作物学和育种中常用的一种技术手段。基于PCR的分子标记方法和全基因组基因分型技术（Genotyping By Sequencing,GBS）分别为目的基因的筛选（前景筛选）和遗传背景的筛选（背景筛选）提供了成熟的工具。然而,在科研和育种上,仍然需要开发价格低廉、能够同时对材料进行背景和前景筛选的全基因组分子标记技术。针对这个问题,我们结合已有的转座子显示技术,结合高通量测序技术开发了出一种新的全基因组分子标记检测方法TD-seq（Transposon display by sequencing）。TD-seq技术利用转座子在基因组散布分布的特点,实现对全基因组的检测。同时,TD-seq利用转座子在基因组上的拷贝数高的特点,将转座子显示得到的PCR产物全部进行高通量测序,实现用一对引物检测多达上千个分子标记位点的效果。另外,鉴于高通量测序的灵敏度高,可以检测因扩增效率低而导致的低含量PCR产物。因此,TD-seq技术利用高通量测序的优势,将传统凝胶电泳检测PCR产物有无的方法转换为利用高通量测序检测PCR产物中的SNP/indel。TD-seq技术利用一条位于转座子上的TD-primer引物,实现对背景标记的检测（背景筛选）,同时可以根据需要加入目标基因的特异引物实现对目标基因的检测（前景筛选）。目标基因的特异引物与TDprimer引物同时进行扩增,只需要一步转座酶打断反应和两次PCR扩增,即可达到前景和背景标记同时检测的效果,方案操作流程非常简单。本论文概述了我们所研发的TD-seq方案的检测方法及其开发过程,并应用TD-seq方法对回交育种后代的目标基因和遗传背景进行了检测,显示了TD-seq方法在回交育种和近等基因系构建等研究中的重要应用价值。
高宏伟[7]（2020）在《鹿茸提取物调控软骨细胞的生物学机制研究》文中认为目的:本研究旨在应用转录组学、蛋白质组学等技术手段,探讨鹿茸提取物对于软骨细胞调控作用的生物学机制。方法:本研究采用快速生长期鹿茸为研究对象,采用高速匀浆机制备鹿茸匀浆,采用冷冻干燥法获得鹿茸冻干粉。应用SDS-PAGE凝胶电泳测定鹿茸提取物中蛋白含量。采用72h内出生乳鼠的肋软骨制备原代软骨细胞,采用不同浓度的鹿茸提取物（0,0.02,0.04,0.08,0.16,0.32,0.64,1.28 mg/ml）对软骨细胞进行培养,应用CCK-8观察软骨细胞增殖能力,同时应用Alcian blue 8GX进行染色,观察软骨细胞增殖情况。采用RNA-seq技术对软骨细胞进行转录组学分析,提取总RNA,构建文库,应用Agilent 2100 Bioanalyzer对文库进行质量检测,使用Illumina HiSeq 2500测序平台进行基因测序,对基因差异表达情况进行分析。采用iTRAQ技术对血清蛋白质组学进行分析。选择雄性SD大鼠为研究对象,采用饮用水和鹿茸提取物灌胃处理,对大鼠血清蛋白进行iTRAQ标记,应用Mascot和Proteome Discoverer软件对蛋白进行鉴别,将所得结果与NCBI和UniProt databases数据库进行比对,获得差异表达蛋白结果,并进行功能富集和蛋白交互作用分析。结果:1.鹿茸提取物能够促进软骨细胞增殖,且呈浓度依赖性,软骨细胞增殖在0.64mg/ml和1.28 mg/ml浓度达到峰值。2.鹿茸提取物培养条件下的软骨细胞有639条基因差异性表达,其中上调基因365条,下调基因274条。在差异性表达基因中,靶向调节细胞有丝分裂周期的Tnfsf11、Bmper、Cebpb、Dbf4、Slc39a14和Usp3等基因上调,Cilp、Bmp4、Cthrc1、Cilp2、Lect1、Frzb和Tgfb3等促进软骨细胞分化的基因下调,Ptgs2、Zc3h12a、Tnip1、Sbno2等提高细胞抗炎能力的基因上调,Trem2、Asic3、Tsc22d3等促进细胞炎症反应的基因下调,Mafb、Sod3、Hif1a、Gsr、Nqo1和Nfkb1等提高软骨细胞抗氧化能力的基因上调。3.鹿茸提取物灌胃大鼠血清蛋白质组中共鉴定79个差异表达蛋白,其中47个蛋白表达水平显着上调,32个蛋白表达显着下调。差异表达蛋白主要功能集中于调控免疫应答、炎症反应、细胞骨架动态、细胞增殖和分化等方面,主要对骨代谢起重要调节作用。上调蛋白集中于4个结构域,而下调蛋白集中于2个结构域,上调表达蛋白如Tpm1、Tpm2、Tpm4、Wdr1、Actn1、Dstn、B2m、Cxcl1、Gapdh、Ldha、Lta4h同下调表达蛋白如A2m、Apoh、Serpina3n、Apof之间构成复杂的交互网络。结论:1.鹿茸提取物能够促进软骨细胞增殖,并促进软骨细胞酸性多糖合成,软骨细胞增殖程度与鹿茸提取物浓度呈正相关,呈浓度依赖性。2.鹿茸提取物可能通过靶向调节细胞有丝分裂周期、抑制软骨细胞分化、提高细胞抗氧化能力、提高细胞抗炎能力等多种途径调控软骨细胞增殖。3.鹿茸提取物能够调控血清蛋白差异性表达,蛋白间构成复杂的交互网络。鹿茸提取物可能通过调控免疫应答、炎症反应、细胞骨架动态、细胞增殖和分化等多种途径调节成骨细胞代谢,影响骨代谢过程,从而间接调控软骨细胞增殖。
王鑫磊[8]（2019）在《豫粉1号蛋鸡H系羽色相关基因鉴定及酪氨酸对其表达调控研究》文中认为豫粉1号蛋鸡配套系是河南农业大学牵头,河南三高农牧股份有限公司和河南省畜牧总站等单位共同参与培育的一个土种蛋鸡配套系。其中,H系为快羽,性成熟早,产蛋量高,并携带有伴性遗传的哥伦比亚羽,该性状可以作为雏鸡雌性鉴别的一个重要手段。鉴定豫粉1号蛋鸡H系羽色性状表型变异的相关基因和蛋白,从基因表达和转录后调控角度分析豫粉1号蛋鸡H系羽色表型变异的原因,揭示该羽色形成的分子遗传机制。通过日粮中添加酪氨酸分析营养素调控对羽色相关基因表达的影响,利用细胞模型,通过体外酪氨酸处理鸡黑色素细胞试验对筛选的羽色相关基因进行功能验证,确定豫粉1号蛋鸡H系哥伦比亚羽的调控基因,为豫粉1号蛋鸡配套系的进一步选育和推广提供依据。本研究主要取得的结果如下:1.基于转录组分析豫粉1号蛋鸡H系羽毛再生期羽色相关基因表达规律对豫粉1号蛋鸡H系20W的鸡进行人工拔毛,14天后选取3只鸡,采集背侧毛囊（A组,颈部背侧黑白条纹羽色）、腹侧毛囊（B组,颈部腹侧白羽）进行RNA-seq分析,共鉴定到21,306个基因,其中,597个是新基因。在A和B组间进行差异分析,共有209个差异表达基因,包括83个上调和126个下调基因。差异表达基因主要富集的色素沉积相关通路包括:Melanogenesis、MAPK pathway、c AMP pathway、PI3K-Akt pathway,c GMP-PKG signaling pathway、Adrenergic signaling in cardiomyocytes和Calcium signaling pathway等信号通路。在Melanogenesis通路中富集的差异表达基因有ASIP、KITLG、PVALB、FZD10、WNT7B、WNT9A、WNT9B、WNT11、LOC396531、CAMK2A和CAMK2B。还发现与色素沉积相关的差异表达基因有SLC45A2、RAB38和MED23。经q RT-PCR验证,SLC45A2、MED23、PVALB、WNT7B、WNT11和FZD10在两组间的表达差异显着（P<0.05）。2.基于蛋白组分析豫粉1号蛋鸡H系羽毛再生期羽色变化相关蛋白表达规律对3只豫粉1号蛋鸡H系鸡羽毛再生期背侧毛囊（A组,颈部背侧黑白条纹羽色）、腹侧毛囊（B组,颈部腹侧白羽）进行i TRAQ高通量测序分析,找寻与豫粉1号蛋鸡H系羽色有关的差异表达蛋白。共鉴定到382个差异表达蛋白,其中差异上调蛋白160个,差异下调蛋白222个。差异上调蛋白中,发现RAB23与黑色素合成有关,DVL3、KRAS、MXRA8、LOC107052863四个差异表达蛋白富集到了Melanogenesis通路中。差异下调蛋白中,发现与黑色素合成有关的蛋白GNAQ,Melanogenesis通路中富集的差异下调蛋白有GNAQ、PVALB、PLCB1、CAMK2A、CAMK2B。3.转录组与蛋白组联合分析豫粉1号蛋鸡H系羽毛再生期羽色相关基因/蛋白的表达对3只豫粉1号蛋鸡H系鸡的羽毛再生期背侧毛囊（A组,颈部背侧黑白条纹羽色）、腹侧毛囊（B组,颈部腹侧白羽）的382个差异表达蛋白和209个差异表达基因关联分析,发现49个在m RNA和蛋白质水平显着差异的基因。其中,PVALB、CAMK2A和CAMK2B基因在m RNA水平和蛋白质水平都显着差异。差异基因和差异蛋白富集的色素沉积相关通路包括Melanogenesis、calcium signaling pathway、c GMP-PKG signaling pathway和adrenergic signaling in cardiomyocytes等。Melanogenesis通路富集了5个差异表达蛋白（PLCB1、LOC107052863、PVALB、CAMK2A、CAMK2B）和11个差异表达基因ASIP、KITLG、PVALB、FZD10、WNT7B、WNT9A、WNT9B、WNT11、LOC396531、CAMK2A和CAMK2B。4.日粮中添加酪氨酸对豫粉1号蛋鸡H系羽色变化相关基因表达的影响以200只豫粉1号蛋鸡H系20W的鸡为试验对象,在日粮中添加不同水平酪氨酸（0.4%、0.6%、0.8%和1.0%）可提高血清中酪氨酸酶的含量。日粮中添加0.8%和1.0%酪氨酸的H系鸡羽毛中黑色羽颜色显着加深（P<0.05）。结果表明在日粮中添加酪氨酸可提高血清中酪氨酸酶的含量,影响羽毛中黑色素的沉积。选取豫粉1号蛋鸡H系对照组和处理组（1.0%酪氨酸）各3只鸡,利用高通量测序技术,分别对添加酪氨酸处理组H系鸡背侧毛囊（TB）、腹侧毛囊（TF）,对照组H系鸡背侧毛囊（CB）、腹侧毛囊（CF）进行RNA-seq分析,共鉴定到18,360个基因,预测新基因为775个。在CB和TB组间分析发现,共有659个差异表达基因,包括253个上调差异基因和406个下调差异基因。在CF与TF组间分析发现,共有差异表达基因501个。表达上调的基因有250个,表达下调的基因有251个。差异表达基因主要富集的与色素沉积相关通路包括:Melanogenesis、MAPK pathway、c AMP pathway、PI3K-Akt pathway,c GMP-PKG signaling pathway、Adrenergic signaling in cardiomyocytes、Wnt signaling pathway、m TOR signaling pathway、Jak-STAT signaling pathway和Calcium signaling pathway。在Melanogenesis通路中的差异表达基因EDNRB2、GNAQ、WNT3、WNT11、PRKCB、WNT16、CALM和PVALB。经q RT-PCR验证,EDNRB2、GNAQ、WNT3、WNT11、PRKCB、PVALB在CB与TB组间的表达差异显着,GNAQ和WNT3在CF与TF组间表达差异显着。5.豫粉1号蛋鸡H系羽色相关候选基因的时空表达分析对豫粉1号蛋鸡H系鸡毛囊进行RNA-seq和i TRAQ测序,挑选与羽色相关候选基因SLC45A2、MED23、EDNRB2、PRKCB、WNT3、WNT7B、WNT11、FZD10和PVALB进行时空表达谱分析。发现在0～12W的H系鸡的颈部背侧毛囊组织中,SLC45A2的绝对表达量最高,在8W相对表达量最高,MED23的相对表达量在8W也达到了最高。对不同生长期的豫粉1号蛋鸡H系毛囊组织的时空表达谱分析,发现EDNRB2和PRKCB表达量在10W达到了最高值,WNT7B、WNT11和FZD10的表达量在8W达到了最高值。我们认为SLC45A2、MED23、EDNRB2、PRKCB、WNT7B、WNT11和FZD10基因可能与豫粉1号蛋鸡H系的羽色形成的有关。6.酪氨酸处理鸡黑色素细胞对黑色素合成相关基因的影响为了验证候选基因SLC45A2、MED23、EDNRB2、PRKCB、FZD10、WNT11和WNT7B是否与黑色素的合成有关,我们用酪氨酸处理鸡黑色素细胞分析候选基因的表达量变化情况。我们发现,在10-6 mol/L时,体外培养的鸡黑色素细胞的EDNRB2和PRKCB基因的m RNA的表达量最高,并且与对照组（0 mol/L）及处理组10-9mol/L、10-8mol/L和10-7mol/L差异显着（P<0.05）;在10-8mol/L浓度时,SLC45A2基因的表达量有明显增加,与对照组（0 mol/L）及处理组10-7mol/L和10-6mol/L差异显着;在10-7mol/L时,MED23基因的表达量最高,并且与对照组（0 mol/L）及处理组10-9mol/L、10-8mol/L和10-6mol/L差异显着。试验证明,通过体外添加酪氨酸,可以影响鸡黑色素细胞中与黑色素合成相关基因的表达发生改变,SLC45A2、EDNRB2、PRKCB和MED23基因在酪氨酸的影响下,可以调控黑色素细胞内黑色素的合成。羽色是由多基因控制的性状,综合分析,我们认为主要由SLC45A2、EDNRB2、PRKCB、MED23参与调控了豫粉1号蛋鸡H系哥伦比亚羽色形成。
万世明[9]（2019）在《团头鲂肌间刺发育相关基因的发掘与功能研究》文中研究说明鱼类的肌间刺（intermuscular bones,IB）,又称肌间骨,是由肌肉中肌隔结缔组织连续同源骨化而来的膜骨,特异性的存在于肌隔中。世界上大部分淡水养殖鱼类,尤其是鲤科鱼类,都有一定数量的肌间刺。肌间刺的存在严重影响了鱼产品的食用与深加工,从而导致有肌间刺的鱼类不受消费者青睐。同时,含有肌间刺的鱼类不易出口,市场价格低,极大的影响了其经济价值。国内外对鱼类肌间刺的研究多处于形态发育方面,对于肌间刺发生发育分子机制的研究还非常缺乏。为进一步探究鱼类肌间刺的发生发育机制,本研究以我国特色经济养殖鱼类团头鲂（Megahbrama amblycephala Yih）,俗称武昌鱼,为研究对象。首先对团头鲂肌间刺及其相关组织的显微结构进行了观察,依托其组织差异以及潜在分化关系分别进行了m RNA与mi RNA的比较组学分析;基于肌间刺骨化出现的四个关键时期信息,进行了m RNA与非编码mi RNA的表达模式关联分析,发掘了大量与肌间刺发育相关的遗传信息。此外,考虑到幼年团头鲂（6月龄）与成年团头鲂（3龄）肌间刺形态特征的显着差异,我们构建了肌间刺组织的三代全长转录组数据库,补充了团头鲂基因组注释的同时,还以此为参考对两个阶段肌间刺组织内的lnc RNA与mi RNA的表达模式进行了比较分析,借此发掘了非编码RNA（non-coding RNA,nc RNA）在肌间刺生长过程中的调控机制。最后,基于前期实验结果,本研究通过CRISPR-Cas9基因编辑,表型观察,表达定量等方法对候选基因bmpr2a/2b进行了功能验证,揭示了其在骨骼发育中的作用。本论文从组织分化、阶段发育、生长发育三方面全面探究了团头鲂肌间刺组织中m RNA与nc RNA的表达模式与功能,构建了团头鲂肌间刺遗传数据库,为深入探讨鱼类肌间刺生长发育的分子机制奠定了重要的基础。主要研究内容如下:（1）组织切片观察结果揭示了团头鲂肌间刺、肌隔结缔组织以及肌肉组织的显微结构特征,表明肌间刺与肌隔结缔组织有着潜在的分化关系。基于其组织结构差异进行比较转录组分析,在肌间刺、肌隔结缔组织以及肌肉组织样本中分别发现了706,740及134个特异性表达unigenes。此外,在肌间刺与肌隔结缔组织、肌间刺与肌肉、肌隔结缔组织与肌肉三组比较中,分别发现了5,162、6,758和8,745个差异表达unigenes。GO及KEGG分析结果显示大量的unigenes富集到了TGF-β、Wnt、MAPK等骨骼发育相关的信号通路。同时,肌间刺与肌隔结缔组织的mi RNA比较组学分析揭示了218个团头鲂保守性mi RNA,隶属于97个mi RNA家族。其中188个mi RNAs在两个组织中都有表达,13和17个mi RNAs分别在肌间刺与结缔组织中特异性表达。此外,本研究共发现了44个mi RNAs在两个组织中差异表达。其中,24个mi RNAs在肌间刺中高表达,20个mi RNAs在结缔组织中高表达。差异表达mi RNAs的靶基因功能注释结果显示新陈代谢是富集mi RNAs靶基因最多的KEGG信号通路。同时,大量mi RNAs靶基因也被富集到了Wnt、TGF-β、MAPK及破骨细胞分化等骨骼发育相关的信号通路,表明了这些差异表达mi RNAs及其靶基因可能在肌间刺分化过程中发挥潜在调控作用。（2）基于团头鲂肌间刺发育的四个关键时期信息（S1,肌间刺尚未出现S2,少量短的肌间刺出现;S3,肌间刺大量出现并快速生长;S4,肌间刺完全出现且形态稳定）及参考转录组的构建,我们在四个时期分别进行了肌间刺m RNA表达谱与mi RNA转录组分析,结果共获得52,918条unigenes,其中24,094个unigenes被注释到了258个KEGG信号通路,包括MAPK、Wnt、破骨细胞分化及TGF-β等骨骼分化相关的信号通路。不同时期间的差异表达分析在S1-vs-S2,S2-vs-S3,S3-vs-S4,S1-vs-S3,S2-vs-S4和S1-vs-S4比较组中,分别发现了149,492,419,723,512和808个差异表达基因及132、120、174、194、176和241个差异表达mi RNAs。TGF-β通路基因在四个时期的表达模式分析结果显示26个TGF-β通路基因的表达量在肌间刺四个发育时期持续下降,14个TGF-β通路基因的表达量持续上升。mi RNA-m RNA互作分析发掘了大量骨骼发育相关的mi RNAs与m RNAs,如mi R-133/133a/133b,mi R-222,mi R-3960及CL712.Contig1,Unigene28219,Unigene2429,Unigene271等。mi RNAs和m RNAs定量表达与RNA-seq结果的一致性,证实了本研究所发掘的分子资源的可靠性。最后,本研究使用双荧光素酶报告基因对骨骼发育相关mi RNAs与m RNAs的反向调控关系进行了验证。结果表明mi R-133b-3p mimics和mi R-206-3p mimics显着降低了野生型质粒（GLO-tgfbr1a,GLO-runx2a）的荧光素酶活性,但并未降低空载质粒的荧光素酶活性。实验结果也显示mi R-206-3p的过表达未引起野生型质粒GLO-runx2b的表达抑制,表明了软件预测靶基因的不确定性及验证实验的必要性。（3）率先对团头鲂肌间刺组织进行了单分子实时测序（Single molecule real time sequencing,SMRT）分析。结果鉴定出了26,302个已知基因的新亚型（isoforms）和6,033个新基因亚型,发现了5,875个基因的10,208个可变剪接事件（Alternative splicing,AS）,其中大多数可变剪接事件为外显子跳跃（Exon skipping）。此外,分析预测了5,639个基因中的8541个poly（A）位点、59个家族的1,462个转录因子和31,186个完整的开放阅读框,鉴定出4,458个融合转录本和5,199个长链nc RNA（lnc RNA）。这些结果为完善团头鲂基因组草图注释,充分揭示肌间刺转录本特征,深入探究鱼类肌间刺发育机制提供了重要参考。（4）幼年团头鲂（6月龄）与成年团头鲂（3龄）肌间刺组织间nc RNA（non-coding RNA,nc RNA）的比较组学分析揭示了两个时期间353个（170个上调,183个下调）和126（68个上调,58个下调）个差异表达的lnc RNA与mi RNA。随后,我们对Lnc RNA co-expression/location m RNA以及差异表达lnc RNA的靶向差异表达mi RNA进行了预测。基于预测结果,我们对lnc RNA,mi RNA与靶基因的竞争性结合调控关系进行了关联性分析,发掘了肌间刺生长相关的潜在调控网络,如lnc RNA-017869竞争性结合mi R-142a-5p,lnc RNA-001094竞争性结合mi RNA-1331a/b-3p,进而调控下游基因的表达。定量表达分析结果也验证了nc RNA在肌间刺不同生长阶段中的表达模式。（5）针对肌间刺发育相关候选基因bmpr2a与bmpr2b,我们在模式斑马鱼中进行了CRSPR-Cas9基因敲除实验,并重点关注了其在肌间刺以及骨骼发育中的作用。系统发育和基因组结构分析结果表明斑马鱼bmpr2a和bmpr2b基因在进化过程中具有不同的序列特征。基因敲除结果显示bmpr2a和bmpr2b功能缺失未引起肌间刺表型的显着变化,但bmpr2b-/-个体显示出了不同程度和类型的矿化骨畸形。表达分析中BMP-Smad信号分子与骨骼发育相关基因表达水平的显着变化以及bmpr2b-/-个体的表型改变揭示了bmpr2b在斑马鱼骨骼发育中的重要作用。
张波涛[10]（2019）在《肿瘤发生发展与胎盘绒毛发育相关生物学行为的研究》文中研究表明该博士学位论文由相互联系的三部分内容组成。第一部分:绒毛特异性基因蕴藏了人类多种癌症的预后分子标志物背景:肿瘤的发生发展与胎盘的发育有很多相似的生物学行为,但两者之间的关系尚未得到很好的探索。绒毛是胎盘发育的一个关键时期,涉及许多生物学过程,如滋养层细胞活跃的分裂增殖能力,逃避母体的免疫排斥,植入到子宫蜕膜及肌层等。而肿瘤细胞可能劫持了滋养层细胞的特性,两者有很多相似的生物学行为。目的:通过比较正常妊娠人工流产术后绒毛组织和成熟胎盘叶状绒毛膜组织的变化,探讨肿瘤的相应特征,为肿瘤研究提供新的途径,寻找新的癌症诊断和治疗靶点。方法:收集36例正常妊娠人工流产术后的绒毛组织和8例成熟胎盘的叶状绒毛膜组织,进行了全基因组表达谱芯片检测。结合The Cancer Genome Atlas（TCGA,癌症基因组图谱）泛癌的转录组数据,利用生物信息学的方法鉴定出早期绒毛特异性表达基因,并通过GO以及KEGG富集分析,观察其主要参与的生物学功能和通路,最后确定这些特异性基因在泛癌中的改变并且评估与患者预后的关系。结果:首先,通过与成熟胎盘叶状绒毛膜组织相比,我们鉴定出237个在早期绒毛组织中特异性表达基因,这些特异性基因主要参与的生物学功能有细胞增殖、免疫相关的反应、粘着斑等,而且这些特异性基因在多种癌症中都有表达水平的改变。接着,我们从相应的显着富集的功能中提取6个增殖、5个免疫和8个局灶性粘附相关的基因,发现这19个基因在泛癌的基因组水平上也发生了改变。最后,利用生存分析发现,增殖、免疫、局灶性粘附相关的基因分别与多种肿瘤的不良预后显着相关。结论:本研究是基于绒毛特异基因表达的相关研究,表明胎盘发育和肿瘤发生发展之间存在共同的生物学特征。因此,系统地分析多种肿瘤中绒毛特异性基因的改变情况,可以为识别新的预后生物标志物提供线索。第二部分:利用人绒毛发育模型鉴别结直肠癌预后生物标志物背景:肿瘤的发生发展和胎盘发育共享许多生物学特征,如细胞增殖、植入/侵袭、代谢和免疫逃逸等,所以滋养细胞又被定义为“生理转移”或“假恶性组织”。然而,胎盘绒毛的发育是一个生理过程,遵循特定的规律;肿瘤发生发展是一个病理性过程,不受机体的调控,不加干扰会无限地进行下去。于是我们提出假设,当肿瘤中基因与基因之间的相互作用关系偏离了绒毛发育中基因与基因之间的相互作用关系,则更易发展成肿瘤或肿瘤的恶性度更高,患者的预后更差。目的:鉴别出结直肠癌中基因与基因相互作用偏离早期绒毛中基因与基因相互作用关系的基因,并进行验证,探索寻找结直肠癌预后标志物的新方法。方法:通过绒毛组织的RNA测序数据,结合本实验室的结直肠癌多阶段（正常结肠粘膜、低级别腺瘤、高级别腺瘤、结直肠癌）表达谱芯片数据和TCGA结直肠癌转录组数据,构建在早期绒毛与结直肠癌中的基因相互作用网络,鉴别出在结直肠癌中失调的基因,并通过免疫组织化学与细胞表型实验进行验证。结果:我们发现早期绒毛和结直肠癌共享许多生物学行为,如细胞增殖、代谢、免疫反应、上皮间质转化等,但是具体执行这些功能的基因是不同的,选取结直肠癌中基因与基因之间相互作用关系偏离绒毛中基因与基因之间相互作用关系的距离大于1的基因对,并且对这些基因进一步筛选,在结直肠癌的多阶段及TCGA结直肠癌的Ⅰ期到Ⅳ期中符合线性上升和下降的基因,最终鉴别出24个基因,如CHPF、MMP14、COL5A2等。在6个独立的结直肠癌队列中（TCGA,GSE39084,GSE14333,GSE17536,GSE39582,GSE29621）,这24个基因的异常表达与较差的生存率显着相关。据我们所知,CHPF没有与结直肠癌相关的报道,我们对其进行了验证,免疫组化的结果显示CHPF是结直肠癌独立的预后不良因素,细胞表型的研究表明CHPF能促进细胞的增殖、抑制细胞凋亡、促进细胞迁移等。结论:我们的研究表明,绒毛发育是一个可靠和严格调控的模型,可以为人类癌症发生发展轨迹的研究提供新的探索方法,而且利用病理过程和生理过程中网络关系的不同为评估结直肠癌的预后发现新的生物标记物。第三部分:胎盘绒毛多组学特征基因与泛癌预后的相关性背景:肿瘤的发生发展与绒毛发育的相似性越来越受到研究者的重视,但目前主要在转录组水平对两者进行研究。随着技术的发展,各组学技术的出现为生物学和医学的研究提供了新的机会。一般,每种组学的每个特征都是通过单变量统计方法进行独立分析。而这种分析往往忽略了不同特征之间的关系,可能会遗漏关键的生物学信息,多组学数据整合分析可以为生物系统提供更系统更全面的信息。因此,胎盘绒毛的多组学数据分析可以成为肿瘤研究的更稳健的模型。目的:通过对绒毛多组学特征基因的鉴定,寻求能够预测肿瘤患者生存的生物标志物,为肿瘤的研究提供新的线索。方法:收集早期正常妊娠人工流产术后的绒毛组织及成熟胎盘的叶状绒毛膜组织,并进行DNA 850K甲基化芯片检测、RNA测序、蛋白质谱检测。通过生物信息学分析,评估DNA甲基化与RNA、RNA与蛋白表达值之间的相关性,再使用DIABLO（Data Integration Analysis for Biomarker discovery using a Latent component method for Omicsstudies）算法,鉴定多组学特征基因,并且评估这些多组学特征基因与肿瘤患者预后的关系。结果:经过相关性分析后,RNA和甲基化的显着相关性只有24.9%,而RNA与蛋白的显着性相关性只有17.8%,用显着相关的蛋白/RNA做KEGG通路富集分析,发现主要富集在代谢相关的通路中,说明更多蛋白的动态改变调节来适应生物学行为的营养需求。然后通过DIABLO算法,鉴定出57个多组学特征基因。为进一步筛选与预后相关的基因,选择RNA和蛋白表达方向一致,且都发生了甲基化水平改变的基因,最终有19个特征性基因,其中3个基因在早期绒毛中表达上调（CLDN6、GPT2、CHPF）,16个表达下调（VWF、C7、CLEC3B、CNR1P1、SNTB1、RBP1、TRADD、RFTN1、SVEP1、RGCC、PRKAR2B、FABP5、CPQ、RRAS、CRIP2、IQGAP2）,并且这19个基因在多种肿瘤中表达改变,也能很好的评估肿瘤患者的预后。结论:表观遗传组、转录组、蛋白质组之间的相关性不高,说明生物过程的调控很复杂,转录和翻译是两个不同的生物学过程,引起基因的表达、基因的转录调控和蛋白差异的原因有很多。另外,经绒毛多组学数据鉴定的多组学特征基因大部分在TCGA很多种肿瘤表达失调,而且能够很好的预测患者的预后,表明从发育的角度,用多组学数据探索肿瘤的预后有很高的价值,为肿瘤的研究提供新的方向,为肿瘤标志物的发现提供新的方法。
二、Agilent 2100 Bioanalyzer在基因差异表达研究中的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Agilent 2100 Bioanalyzer在基因差异表达研究中的应用（论文提纲范文）
（1）AIO-seq高通量测序技术开发及玉米NAM群体遗传特性和株型性状QTL定位研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 AIO-seq高通量测序技术开发及应用 |
| 1.1 引言 |
| 1.1.1 测序技术发展概述 |
| 1.1.2 DNA超声波机械打断和生物酶切法在测序文库制备中的应用 |
| 1.1.3 Tn5 转座酶在测序文库制备中的应用 |
| 1.1.4 测序文库的分选和质控 |
| 1.1.5 本研究的目的与意义 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 实验材料及表型测定分析 |
| 1.2.2 AIO-seq测序文库制备 |
| 1.2.3 测序数据的分析流程 |
| 1.2.4 Bin map图谱构建及玉米株型性状QTL定位 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.3.1 AIO-seq测序技术构思 |
| 1.3.2 利用少量样本验证AIO-seq测序技术的可行性 |
| 1.3.3 利用多样本包Lane测序探索AIO-seq技术的可靠性及稳定性 |
| 1.3.4 运用AIO-seq测序技术获得样本间预期不等的数据产出 |
| 1.3.5 AIO-seq技术在RNA-seq测序文库制备中的运用 |
| 1.3.6 简化的AIO-seq测序技术在玉米BC_1F_4群体株型QTL定位研究中的运用 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 Tn5 转座酶在组学技术研究中的广泛应用 |
| 1.4.2 AIO-seq测序文库制备流程的改进 |
| 1.4.3 简化的AIO-seq测序技术在群体遗传学研究中的应用 |
| 1.4.4 后续工作展望 |
| 第二章 玉米NAM群体遗传特性和株型性状QTL定位研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.1.1 玉米生产和研究概况 |
| 2.1.2 常用分离群体类型及特点 |
| 2.1.3 连锁分析及关联分析定位 |
| 2.1.4 玉米株型相关性状QTL定位及基因克隆 |
| 2.1.5 本研究的目的与意义 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 亲本选取及HNAU-NAM1 群体构建 |
| 2.2.2 玉米HNAU-NAM1 群体株型性状考察及分析 |
| 2.2.3 HNAU-NAM1 群体基因型数据分析 |
| 2.2.4 HNAU-NAM1 群体遗传多样性及连锁不平衡分析 |
| 2.2.5 利用SLM分析方法进行株型性状QTL定位 |
| 2.2.6 利用JLM分析方法进行株型性状QTL定位 |
| 2.2.7 利用GWAS关联分析方法进行株型性状QTL定位 |
| 2.2.8 株型性状QTL热点区域分析 |
| 2.2.9 株型性状主效QTL定位区间内候选基因推断 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 HNAU-NAM1 群体特征分析 |
| 2.3.2 群体表型性状统计分析 |
| 2.3.3 亚群遗传连锁图谱构建 |
| 2.3.4 叶夹角性状遗传解析 |
| 2.3.5 株高性状遗传解析 |
| 2.3.6 穗位性状遗传解析 |
| 2.3.7 株型性状QTL定位热点区域分析 |
| 2.3.8 主效QTL区间内候选基因推断 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 HNAU-NAM1 群体特点 |
| 2.4.2 株型性状QTL定位方法及结果特征 |
| 2.4.3 株型性状候选基因 |
| 2.4.4 基因组de novo组装对基因克隆的影响 |
| 2.4.5 后续工作展望 |
| 第三章 全文总结 |
| 3.1 AIO-seq高通量测序技术开发和应用 |
| 3.2 玉米HNAU-NAM1 群体遗传特性和株型性状QTL定位研究 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）FBI技术的开发及其在水稻育种中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 分子标记与MAS育种 |
| 1.2 高通量的SNP标记方法 |
| 1.2.1 基于基因芯片杂交的分子标记 |
| 1.2.2 基于测序技术的分子标记 |
| 1.2.3 实验室已开发的高通量SNP分子标记方法 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 1.3.1 课题来源 |
| 1.3.2 本研究的目的与意义 |
| 1.3.3 FBI技术的设计原理 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料、主要仪器和试剂耗材 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要仪器及其在研究中的用途 |
| 2.1.3 重要实验试剂与耗材 |
| 2.1.4 引物序列及位点信息 |
| 2.2 实验研究方法 |
| 2.2.1 目标前景(特异位点)检测引物的设计 |
| 2.2.2 多引物(1条、2条、6条、12条)FBI-seq体系实验流程 |
| 2.2.3 生物信息学分析方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 FBI方法的开发 |
| 3.1.1 单个前景(单引物)的验证 |
| 3.1.2 多个前景(2、6、12 引物)尝试以及体系的摸索 |
| 3.1.3 多引物的Tag情况分析 |
| 3.1.4 不同引物在不同作物中的通用性研究 |
| 3.1.5 错配结合的规律分析—高保真 DNA 聚合酶和非高保真DNA聚合酶的对比 |
| 3.2 FBI-seq方法的应用-广东水稻所水稻株系与标记结果的分析 |
| 3.2.1 亲本及子代测序数据 |
| 3.2.2 子代株系的前景结果 |
| 3.2.3 背景分析--染色体重组断点分析 |
| 3.2.4 背景分析--黄华占核心基因组区段的分析 |
| 3.2.5 表型结果分析 |
| 4 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间论文发表情况 |
（3）Bacillus stearothermophilus α-淀粉酶在芽孢杆菌中高效胞外表达的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 α-淀粉酶的概述 |
| 1.1.1 α-淀粉酶的分类 |
| 1.1.2 α-淀粉酶的来源 |
| 1.1.3 α-淀粉酶的生产 |
| 1.1.4 α-淀粉酶的应用 |
| 1.2 芽孢杆菌表达系统概述 |
| 1.2.1 表达宿主 |
| 1.2.2 表达载体 |
| 1.2.3 启动子 |
| 1.2.4 跨膜转运 |
| 1.2.5 胞外蛋白酶 |
| 1.2.6 伴侣蛋白 |
| 1.2.7 增强芽孢杆菌分泌表达胞外蛋白的策略 |
| 1.2.8 短小芽孢杆菌表达系统简介 |
| 1.2.9 枯草芽孢杆菌表达系统简介 |
| 1.3 立题依据与研究意义 |
| 1.4 主要研究内容 |
| 第二章 胞外蛋白酶及伴侣蛋白对α-淀粉酶在B. choshinensis中胞外表达的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株与质粒 |
| 2.2.2 试剂和仪器 |
| 2.2.3 培养基和培养条件 |
| 2.2.4 分子生物学操作 |
| 2.2.5 分析方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 α-淀粉酶在B. choshinensis HPD31-SP3中的胞外重组表达 |
| 2.3.2 胞外蛋白酶敲除对α-淀粉酶胞外表达的影响 |
| 2.3.3 共表达胞外伴侣蛋白对α-淀粉酶胞外表达的影响 |
| 2.3.4 胞外蛋白酶敲除及伴侣蛋白共表达对α-淀粉酶胞外表达的影响 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 B. choshinensis内源性强启动子的挖掘及其对α-淀粉酶胞外表达的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株与质粒 |
| 3.2.2 试剂和仪器 |
| 3.2.3 培养基和培养条件 |
| 3.2.4 分子生物学操作 |
| 3.2.5 分析方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 基于RNA-seq技术的B.choshinensis转录组测序及分析 |
| 3.3.2 基于B.choshinensis转录组数据的内源性强启动子挖掘 |
| 3.3.3 内源性强启动子介导α-淀粉酶重组表达的研究 |
| 3.3.4 内源性强启动子PE介导α-淀粉酶高效胞外表达的效果验证 |
| 3.3.5 重组菌BCPEPSQ胞外表达α-淀粉酶的研究 |
| 3.3.6 含原始启动子P2 的重组菌胞外50 kDa附近蛋白的鉴定及功能分析 |
| 3.3.7 内源性强启动子PE的通用性分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 表达元件优化提高α-淀粉酶在B.subtilis中胞外表达的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株与质粒 |
| 4.2.2 试剂和仪器 |
| 4.2.3 培养基和培养条件 |
| 4.2.4 分子生物学操作 |
| 4.2.5 分析方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 启动子优化提高α-淀粉酶在B.subtilis中胞外表达的研究 |
| 4.3.2 信号肽优化提高α-淀粉酶在B.subtilis中胞外表达的研究 |
| 4.3.3 重组菌WS11YS包涵体产生及其胞外酶活提高的机理研究 |
| 4.3.4 过表达胞内伴侣蛋白对重组菌包涵体及胞外α-淀粉酶活性的影响 |
| 4.3.5 α-淀粉酶氨基酸序列优化提高其在B.subtilis中胞外表达的研究 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 B. subtilis胞外蛋白酶对α-淀粉酶胞外表达的影响及发酵优化研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株与质粒 |
| 5.2.2 试剂和仪器 |
| 5.2.3 培养基和培养条件 |
| 5.2.4 分子生物学操作 |
| 5.2.5 分析方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 B.subtilis宿主菌胞外蛋白酶对α-淀粉酶胞外表达的影响 |
| 5.3.2 重组菌WS9YSA的摇瓶发酵优化 |
| 5.3.3 重组菌WS9YSA的3-L罐发酵优化 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 优化Sec分泌过程提高α-淀粉酶在B.subtilis中胞外表达的研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 菌株与质粒 |
| 6.2.2 试剂和仪器 |
| 6.2.3 培养基和培养条件 |
| 6.2.4 分子生物学操作 |
| 6.2.5 分析方法 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 胞内伴侣蛋白过表达对α-淀粉酶胞外表达的影响 |
| 6.3.2 胞内蛋白前体跨膜转运效率对α-淀粉酶胞外表达的影响 |
| 6.3.3 dltD基因敲除对α-淀粉酶胞外表达的影响 |
| 6.3.4 整个Sec分泌过程的优化对α-淀粉酶胞外表达的影响 |
| 6.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（4）质粒介导的oqxAB基因在大肠杆菌间的转移条件及接合子表型和基因型研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 立题依据 |
| 1.2 国内外研究进展 |
| 1.2.1 鸡大肠杆菌中oqxAB基因的流行 |
| 1.2.2 oqxAB基因在大肠杆菌中的转移 |
| 1.3 研究内容与目标 |
| 1.3.1 研究内容 |
| 1.3.2 研究目标 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 药品、试剂及培养基 |
| 2.2 菌株 |
| 2.3 溶液和培养基的配制 |
| 2.4 主要仪器与设备 |
| 2.5 供体菌和受体菌的筛选 |
| 2.5.1 临床大肠杆菌的鉴定 |
| 2.5.2 临床鸡源大肠杆菌oqxAB基因流行性检测 |
| 2.5.3 临床鸡源大肠杆菌耐药表型检测 |
| 2.5.4 供体菌的筛选及供受体菌最小抑菌浓度(MIC)的测定 |
| 2.6 不同抗菌药诱导oqxAB基因接合转移率的测定 |
| 2.7 接合子稳定性验证及生长曲线测定 |
| 2.7.1 接合子稳定性验证 |
| 2.7.2 供体菌、受体菌及接合子生长曲线测定 |
| 2.8 接合子质粒基因组的测序分析 |
| 2.8.1 接合子质粒的提取 |
| 2.8.2 接合子质粒文库构建及库检 |
| 2.8.3 接合子质粒上机测序 |
| 2.8.4 接合子质粒原始下机数据处理 |
| 2.8.5 接合子质粒样品组装 |
| 2.8.6 接合子质粒基因组组分分析 |
| 2.8.7 接合子质粒功能注释 |
| 2.9 受体菌和接合子转录组测序比对研究 |
| 2.9.1 受体菌和接合子细菌总RNA的提取与检测 |
| 2.9.2 受体菌和接合子转录组序列文库构建及质检 |
| 2.9.3 受体菌和接合子原始数据整理、过滤及质量评估 |
| 2.9.4 受体菌和接合子比对分析 |
| 2.9.5 受体菌和接合子定量分析 |
| 2.9.6 受体菌和接合子差异分析 |
| 2.9.7 受体菌和接合子富集分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 供体菌和受体菌的筛选 |
| 3.1.1 鸡源大肠杆菌oqxAB基因流行性检测 |
| 3.1.2 oqxAB基因阳性鸡源大肠杆菌耐药背景调查 |
| 3.1.3 供体菌的筛选及供受体菌最小抑菌浓度(MIC)的测定 |
| 3.2 不同抗生素诱导oqxAB基因接合转移率的测定 |
| 3.3 接合菌株稳定性、耐药表型、生长曲线测定 |
| 3.3.1 接合菌株稳定性验证 |
| 3.3.2 大肠杆菌 C26、C600、C26-600（M1）生长曲线测定 |
| 3.4 接合子 M1 质粒基因组测序分析 |
| 3.4.1 接合子M1样品质检及原始数据过滤分析 |
| 3.4.2 接合子M1质粒基因组概况 |
| 3.4.3 接合子M1质粒类型及耐药因子比对分析 |
| 3.5 接合子M1和大肠杆菌C600转录组测序分析 |
| 3.5.1 接合子M1和大肠杆菌C600细菌总RNA的提取与质检 |
| 3.5.2 接合子M1和大肠杆菌C600原始数据评估 |
| 3.5.3 接合子 M1 和大肠杆菌 C600 同源比对分析 |
| 3.5.4 接合子M1和大肠杆菌C600表达定量 |
| 3.5.5 接合子M1和大肠杆菌C600主成分分析 |
| 3.5.6 接合子M1和大肠杆菌C600样品相关性检验 |
| 3.5.7 接合子M1 和大肠杆菌C600 差异表达基因的GO(Gene Ontology)富集 |
| 3.5.8 接合子 M1 和大肠杆菌 C600 差异表达基因的 KEGG 富集分析 |
| 3.5.9 接合子M1和大肠杆菌C600差异表达基因分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 oqxAB基因阳性大肠杆菌耐药分析 |
| 4.2 不同底物对oqxAB基因接合转移率的影响 |
| 4.3 接合子稳定性及生长力分析 |
| 4.4 接合子耐药表型变化分析 |
| 5 全文总结 |
| 6 文献综述 |
| 6.1 oqxAB基因的结构和功能 |
| 6.2 oqxAB基因的传播特点 |
| 6.3 oqxAB基因的表达调控 |
| 6.4 oqxAB基因的流行特点 |
| 6.5 总结和展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（5）四川泡菜功能微生物代谢调控机理的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 四川泡菜研究进展 |
| 1.1.1 泡菜概述 |
| 1.1.2 四川泡菜的研究进展 |
| 1.2 发酵食品微生物群落特征 |
| 1.2.1 发酵食品微生物研究进展 |
| 1.2.2 高通量测序技术在发酵食品中的应用 |
| 1.2.3 四川泡菜微生物研究进展 |
| 1.3 发酵蔬菜风味物质研究进展 |
| 1.3.1 发酵蔬菜风味物质研究 |
| 1.3.2 四川泡菜风味物质研究 |
| 1.3.3 发酵蔬菜风味形成机制 |
| 1.4 宏转录组学技术在发酵食品中的应用 |
| 1.4.1 宏基因组学的应用 |
| 1.4.2 宏转录组学简介 |
| 1.4.3 宏转录组学在发酵食品中的应用 |
| 1.5 研究意义及主要内容 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 1.5.3 技术路线图 |
| 第2章 四川泡菜发酵过程中微生物的消长规律 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试验原料 |
| 2.2.2 主要试剂及溶液 |
| 2.2.3 主要仪器设备 |
| 2.2.4 试验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 物种注释 |
| 2.3.1.1 测序数据预处理 |
| 2.3.1.2 物种分布情况 |
| 2.3.1.3 Ternaryplot分析与属水平物种进化树 |
| 2.3.2 泡菜微生物Alpha多样性分析 |
| 2.3.3 泡菜微生物的Beta多样性分析 |
| 2.3.4 PICRUSt功能预测分析比较 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 四川泡菜发酵过程中风味物质解析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试验材料与方法 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 主要仪器和设备 |
| 3.2.3 试验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 四川泡菜发酵过程中有机酸的组成及变化规律 |
| 3.3.2 四川泡菜发酵过程中氨基酸的组成及变化规律 |
| 3.3.3 四川泡菜发酵过程中挥发性物质的研究 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 O2PLS模型解析微生物与风味物质的相互作用网络 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 试验材料与方法 |
| 4.2.1 试验材料 |
| 4.2.2 主要分析软件 |
| 4.2.3 试验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 四川泡菜体系微生物与风味物质O2PLS模型 |
| 4.3.2 四川泡菜发酵过程中的微生物VIP分析 |
| 4.3.3 四川泡菜发酵过程中与风味重要相关的微生物分析 |
| 4.3.4 四川泡菜微生物与风味物质的关联分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 四川泡菜发酵过程中微生物的宏转录组学分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 试验材料 |
| 5.2.2 主要仪器设备 |
| 5.2.3 主要试剂 |
| 5.2.4 软件及数据库 |
| 5.2.5 试验方法 |
| 5.3 结果分析 |
| 5.3.1 发酵不同阶段样品RNA质量评价结果 |
| 5.3.2 测序量统计结果 |
| 5.3.3 宏转录组物种注释结果 |
| 5.3.4 常用功能数据库注释 |
| 5.3.5 宏转录组功能注释与16s基因功能预测对比分析 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 不同发酵阶段基因差异表达分析 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 试验材料与方法 |
| 6.2.1 试验材料 |
| 6.2.2 主要软件及数据库 |
| 6.2.3 差异基因筛选方法 |
| 6.2.4 差异基因聚类方法 |
| 6.2.5 差异基因KEGG富集方法 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 差异基因的筛选 |
| 6.3.2 差异基因表达聚类分析 |
| 6.3.3 差异基因KEGG Pathway富集分析 |
| 6.3.4 宏转录组揭示四川泡菜代谢通路 |
| 6.4 本章小结 |
| 第7章 四川泡菜风味物质与宏转录组联合分析 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料和方法 |
| 7.2.1 试验材料 |
| 7.2.2 试验方法 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 四川泡菜与风味相关代谢途径 |
| 7.3.2 关键风味物质的筛选 |
| 7.3.3 四川泡菜中有机酸的代谢机理 |
| 7.3.4 四川泡菜中氨基酸的代谢与合成 |
| 7.3.5 四川泡菜的挥发性化合物风味及其来源 |
| 7.4 本章小结 |
| 第8章 结论与展望 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 进一步工作方向 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（6）基于高通量测序的转座子显示技术开发及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 分子标记技术和主要应用 |
| 1.1.1 分子标记的介绍 |
| 1.1.2 分子标记的分类 |
| 1.1.3 分子标记与MAS育种 |
| 1.2 转座子及其应用 |
| 1.2.1 转座子的介绍 |
| 1.2.2 转座子的分类 |
| 1.2.3 转座子的应用 |
| 1.3 本研究的目的意义和方案设计 |
| 1.3.1 本研究的目的与意义 |
| 1.3.2 本研究的实验设计及原理 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验的关键设备和重要试剂 |
| 2.2.1 关键设备 |
| 2.2.2 重要试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 水稻的培养 |
| 2.3.2 水稻基因组DNA提取和质量控制 |
| 2.3.3 TD-seq方案的文库构建流程 |
| 2.3.4 TD-seq文库高通量测序数据的分析流程 |
| 2.3.5 PCR鉴定Pi2抗性基因 |
| 2.3.6 重测序文库制备 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 TD-primer在水稻蜀恢498 基因组中的分布 |
| 3.2 Tn5转座酶用量的测试 |
| 3.3 TD-seq方案评估 |
| 3.4 TD-seq的扩增效率 |
| 3.5 Tn5 转座酶和退火温度对TD-seq方案的影响 |
| 3.6 模板浓度对TD-seq的影响 |
| 3.7 TD-seq方案的可重复性 |
| 3.8 TD-seq对水稻BC2F4 群体材料的前景和背景检测结果 |
| 3.8.1 Pi2基因鉴定结果 |
| 3.8.2 ‘VE6219’、‘长农粳1号’、‘武育粳33号’重测序结果 |
| 3.8.3 前景检测和背景检测结果 |
| 第四章 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间论文发表情况 |
（7）鹿茸提取物调控软骨细胞的生物学机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 实验研究 |
| 第一章 鹿茸提取物的制备及其对原代软骨细胞调控的研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 原代软骨细胞培养及传代 |
| 2.2 鹿茸提取物的制备 |
| 2.3 鹿茸提取物对于原代软骨细胞增殖调控 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 鹿茸提取物调控软骨细胞增殖的生物学机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 软骨细胞总RNA提取与质控 |
| 2.2 cDNA文库制备和测序 |
| 2.3 测序数据分析与统计 |
| 2.3.1 数据过滤 |
| 2.3.2 参考基因比对 |
| 2.3.3 新转录本预测 |
| 2.3.4 基因表达水平分析 |
| 2.3.5 差异表达分析 |
| 2.3.6 差异表达基因的功能分析 |
| 2.3.7 蛋白互作网络分析 |
| 2.3.8 差异剪接基因检测分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 测序数据过滤及统计 |
| 3.2 参考基因组比对分析 |
| 3.3 新转录本预测 |
| 3.3.1 新转录本预测统计 |
| 3.3.2 新基因功能注释 |
| 3.4 表达水平分析 |
| 3.5 差异表达分析 |
| 3.6 差异表达基因GO功能分类及富集分析 |
| 3.7 差异表达基因KEGG Pathway功能分类统计和富集分析 |
| 3.8 差异表达基因蛋白互作网络分析 |
| 3.9 差异剪接基因检测 |
| 3.10 差异性表达基因功能比对 |
| 3.10.1 鹿茸提取物靶向调节细胞周期 |
| 3.10.2 鹿茸提取物抑制软骨细胞分化 |
| 3.10.3 鹿茸提取物提高软骨细胞抗炎能力 |
| 3.10.4 鹿茸提取物提高软骨细胞抗氧化能力 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 基于组学技术的鹿茸提取物对血清蛋白质组调控作用研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验动物分组与药物干预 |
| 2.2 血清蛋白提取 |
| 2.3 血清蛋白烷基化 |
| 2.4 血清蛋白定量 |
| 2.5 蛋白消化及iTRAQ标记 |
| 2.6 质谱鉴定及数据库搜索 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 差异表达蛋白分析 |
| 3.2 差异表达蛋白GO功能分类及富集分析 |
| 3.3 差异表达蛋白KEGG Pathway功能分类统计和富集分析 |
| 3.4 差异表达蛋白互作网络分析 |
| 3.5 PRM验证 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 本文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
（8）豫粉1号蛋鸡H系羽色相关基因鉴定及酪氨酸对其表达调控研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 豫粉1号蛋鸡配套系主要特征 |
| 1.2 家禽羽毛生长发育 |
| 1.2.1 家禽羽毛的生长 |
| 1.2.2 家禽羽毛发育周期 |
| 1.2.3 毛囊结构及再生 |
| 1.3 家禽羽色研究进展 |
| 1.3.1 家禽羽色形成 |
| 1.3.2 调控羽色的基因 |
| 1.3.2.1 黑素皮质激素受体1基因(MC1R)与黑素扩散位点基因座(E) |
| 1.3.2.2 内皮素受体B2 基因(EDNRB2)与花斑羽基因座(mo) |
| 1.3.2.3 性别决定区盒基因(SOX10)与深棕色基因座(DB) |
| 1.3.2.4 细胞周期依赖性激酶抑制基因(CDKN2A/B)与性连锁横斑基因座(B) |
| 1.3.2.5 溶质载体45家族第2成员基因(SLC45A2)与银羽基因座(S) |
| 1.3.2.6 前黑素体蛋白基因(PMEL17)与显性白基因座(I) |
| 1.3.2.7 酪氨酸酶基因(TYR)与隐性白基因座(C) |
| 1.3.2.8 小眼畸形转录因子基因(MITF)与蓝色羽基因座(Bl) |
| 1.4 色素合成相关信号通路研究进展 |
| 1.4.1 Wnt/β-catenin信号通路 |
| 1.4.2 SCF/c-Kit信号通路 |
| 1.4.3 MAPK信号通路 |
| 1.4.4 α-MSH/MC1R信号通路 |
| 1.4.5 G蛋白偶联介导信号通路 |
| 1.5 黑色素及黑色素细胞 |
| 1.5.1 黑色素合成 |
| 1.5.2 黑色素细胞功能 |
| 1.6 分子营养学研究进展 |
| 1.6.1 营养素对基因表达的作用 |
| 1.6.2 营养素调控基因表达的途径 |
| 1.7 转录组学研究进展 |
| 1.7.1 RNA-seq技术简介 |
| 1.7.2 RNA-seq技术的应用 |
| 1.8 蛋白质组学研究进展 |
| 1.8.1 蛋白质组研究技术与方法 |
| 1.8.2 蛋白质组技术的应用 |
| 2 引言 |
| 3 基于转录组分析豫粉1号蛋鸡H系羽毛再生期羽色相关基因表达规律 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试验动物 |
| 3.1.2 主要试剂及试验仪器 |
| 3.1.2.1 试剂 |
| 3.1.2.2 仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 羽毛再生观察及样品采集 |
| 3.2.2 总RNA提取 |
| 3.2.3 样品检测 |
| 3.2.4 cDNA文库构建 |
| 3.2.4.1 mRNA的纯化 |
| 3.2.4.2 片段化处理 |
| 3.2.4.3 cDNA文库制备 |
| 3.2.5 转录组测序数据处理 |
| 3.2.5.1 数据分析流程 |
| 3.2.5.2 转录组测序数据过滤 |
| 3.2.5.3 参考基因组比对 |
| 3.2.5.4 新转录本预测 |
| 3.2.5.5 基因表达量分析方法 |
| 3.2.5.6 差异表达基因检测 |
| 3.2.5.7 差异表达基因显着性富集分析方法 |
| 3.2.6 实时定量PCR |
| 3.2.6.1 qRT-PCR反应体系 |
| 3.2.6.2 qRT-PCR反应程序 |
| 3.2.6.3 数据分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 拔羽后羽色变化观察 |
| 3.3.2 毛囊采集 |
| 3.3.3 RNA质量检测 |
| 3.3.4 毛囊转录组数据分析 |
| 3.3.4.1 测序数据过滤及参考基因组比对 |
| 3.3.4.2 新转录本预测 |
| 3.3.4.3 基因表达量分析 |
| 3.3.5 差异表达基因检测及功能分析 |
| 3.3.5.1 差异表达基因检测 |
| 3.3.5.2 差异表达基因GO功能分析 |
| 3.3.5.3 差异表达基因KEGG分析 |
| 3.3.6 qRT-PCR验证差异表达基因 |
| 3.3.7 候选基因差异表达结果分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 基于蛋白组分析豫粉1号蛋鸡H系羽毛再生期羽色相关蛋白的表达规律 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 试验动物 |
| 4.1.2 主要试剂及试验仪器 |
| 4.1.2.1 试剂 |
| 4.1.2.2 仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 样品采集 |
| 4.2.2 蛋白质提取与检测 |
| 4.2.2.1 蛋白质提取 |
| 4.2.2.2 蛋白质控 |
| 4.2.2.3 蛋白酶解 |
| 4.2.2.4 肽段标记 |
| 4.2.2.5 肽段分离 |
| 4.2.2.6 高效液相色谱 |
| 4.2.2.7 质谱检测 |
| 4.2.3 蛋白组数据分析 |
| 4.2.3.1 原始数据处理 |
| 4.2.3.2 蛋白质iTRAQ定量 |
| 4.2.3.3 差异蛋白统计与生物信息学分析 |
| 4.2.3.4 差异表达蛋白COG分析 |
| 4.2.3.5 差异表达蛋白GO富集分析 |
| 4.2.3.6 差异蛋白KEGG富集分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 标准曲线及蛋白质浓度 |
| 4.3.2 蛋白质完整性检测 |
| 4.3.3 蛋白质鉴定 |
| 4.3.3.1 鉴定结果统计 |
| 4.3.3.2 蛋白分子质量分布 |
| 4.3.3.3 肽段长度分布 |
| 4.3.3.4 特异性肽段数量分布 |
| 4.3.4 鉴定蛋白质注释 |
| 4.3.4.1 GO注释分析 |
| 4.3.4.2 COG注释分析 |
| 4.3.4.3 KEGG注释分析 |
| 4.3.5 差异表达蛋白分析 |
| 4.3.5.1 差异表达蛋白统计 |
| 4.3.5.2 差异表达蛋白GO富集分析 |
| 4.3.5.3 差异表达蛋白KEGG富集分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 转录组与蛋白组联合分析豫粉1号蛋鸡H系羽毛再生期羽色相关基因/蛋白的表达 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 转录组与蛋白组关联分析流程 |
| 5.2.2 转录组与蛋白组关联分析参数 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 鉴定、定量和差异 |
| 5.3.1.1 关联数量统计 |
| 5.3.1.2 差异表达基因和差异表达蛋白的相关性分析 |
| 5.3.2 关联结果功能注释 |
| 5.3.2.1 GO注释 |
| 5.3.2.2 COG注释 |
| 5.3.2.3 KEGG注释 |
| 5.3.3 功能富集关联分析 |
| 5.3.3.1 GO富集关联分析 |
| 5.3.3.2 KEGG富集关联分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 6 日粮中添加酪氨酸对豫粉1号蛋鸡H系羽色变化相关基因表达的影响 |
| 6.1 试验材料 |
| 6.1.1 试验动物 |
| 6.1.2 主要试剂及试验仪器 |
| 6.1.2.1 试剂 |
| 6.1.2.2 仪器 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 酪氨酸添加试验 |
| 6.2.2 羽毛颜色评分 |
| 6.2.3 酪氨酸酶含量测定 |
| 6.2.4 毛囊样品采集 |
| 6.2.5 总RNA提取 |
| 6.2.6 样品检测 |
| 6.2.7 cDNA文库构建 |
| 6.2.7.1 mRNA的纯化 |
| 6.2.7.2 片段化处理 |
| 6.2.7.3 cDNA文库制备 |
| 6.2.8 转录组测序数据处理 |
| 6.2.8.1 数据分析流程 |
| 6.2.8.2 转录组测序数据过滤 |
| 6.2.8.3 参考基因组比对 |
| 6.2.8.4 新转录本预测 |
| 6.2.8.5 基因表达量分析方法 |
| 6.2.8.6 差异表达基因检测 |
| 6.2.8.7 差异表达基因显着性富集分析方法 |
| 6.2.9 qRT-PCR反应体系及程序 |
| 6.2.9.1 qRT-PCR反应体系 |
| 6.2.9.2 qRT-PCR反应程序 |
| 6.2.9.3 数据分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 添加不同比例酪氨酸对羽色的影响 |
| 6.3.2 添加酪氨酸对血清中酪氨酸酶的影响 |
| 6.3.3 RNA质量检测 |
| 6.3.4 转录组数据分析 |
| 6.3.4.1 测序数据过滤及参考基因组比对 |
| 6.3.4.2 新转录本预测 |
| 6.3.5 差异表达基因检测及功能分析 |
| 6.3.5.1 差异表达基因检测 |
| 6.3.5.2 差异表达基因GO功能分析 |
| 6.3.5.3 差异表达基因KEGG注释 |
| 6.3.6 qRT-PCR验证差异表达基因 |
| 6.3.7 候选基因差异表达结果分析 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 7 豫粉1号蛋鸡H系羽色相关候选基因的时空表达分析 |
| 7.1 试验材料 |
| 7.1.1 试验动物 |
| 7.1.2 主要试剂与试验仪器 |
| 7.1.2.1 试剂 |
| 7.1.2.2 仪器 |
| 7.2 试验方法 |
| 7.2.1 总RNA的提取 |
| 7.2.2 RNA质量检测 |
| 7.2.3 cDNA文库构建 |
| 7.2.4 qRT-PCR引物设计 |
| 7.2.5 qRT-PCR反应体系及程序 |
| 7.2.6 数据处理 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 RNA质量检测 |
| 7.3.2 候选基因在不同生长发育时期毛囊中的表达谱分析 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 小结 |
| 8 酪氨酸处理鸡黑色素细胞对黑色素合成相关基因的影响 |
| 8.1 试验材料 |
| 8.1.1 试验样本 |
| 8.1.2 试验仪器 |
| 8.1.3 试剂及耗材 |
| 8.2 试验方法 |
| 8.2.1 鸡黑色素细胞复苏 |
| 8.2.2 鸡黑色素细胞的传代 |
| 8.2.3 酪氨酸处理黑色素细胞及酪氨酸酶含量测定 |
| 8.2.4 黑色素细胞中色素相关基因qRT-PCR |
| 8.2.4.1 总RNA提取 |
| 8.2.4.2 cDNA文库构建 |
| 8.2.4.3 引物设计 |
| 8.2.4.4 qRT-PCR反应体系及程序 |
| 8.2.4.5 数据分析 |
| 8.3 结果与分析 |
| 8.3.1 黑色素细胞添加酪氨酸对细胞内酪氨酸酶含量的影响 |
| 8.3.2 酪氨酸处理鸡黑色素细胞对候选基因表达量变化的影响 |
| 8.4 讨论 |
| 8.5 小结 |
| 9 全文结论及创新点 |
| 9.1 全文结论 |
| 9.2 创新点 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 附录 |
（9）团头鲂肌间刺发育相关基因的发掘与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 鱼类肌间刺研究进展 |
| 1.1 鱼类肌间刺形态发育学研究 |
| 1.2 鱼类肌间刺选育可行性分析与遗传学研究 |
| 2 动物骨骼发育相关信号通路与基因的研究进展 |
| 2.1 哺乳动物骨骼发育相关信号通路 |
| 2.2 哺乳动物骨骼发育相关基因 |
| 2.3 鱼类骨骼发育相关信号通路与基因 |
| 3 动物骨骼发育相关非编码RNA的研究进展 |
| 3.1 动物非编码RNA的分子功能与作用机制 |
| 3.2 ncRNA对哺乳动物骨骼发育的调控 |
| 3.3 ncRNA对鱼类骨骼发育的调控 |
| 4 高通量测序技术的发展及其在鱼类中的应用 |
| 4.1 高通量测序技术 |
| 4.2 高通量测序技术在鱼类研究中的应用 |
| 5 团头鲂肌间刺研究的目的和意义 |
| 第二章 团头鲂肌间刺,肌隔结缔组织与肌肉组织的显微结构观察及转录组分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 形态学观察 |
| 2.2.2 Total RNA提取 |
| 2.2.3 cDNA文库构建及高通量测序 |
| 2.2.4 原始数据质控、装配及数据库比对 |
| 2.2.5 Unigenes与 miRNA的差异表达分析 |
| 2.2.6 差异表达Unigenes与 miRNA靶基因的功能注释 |
| 2.2.7 Unigenes与 miRNA的表达模式验证 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 三种组织的切片及染色观察结果 |
| 3.2 三种组织的转录组数据分析 |
| 3.2.1 转录组数据装配 |
| 3.2.2 数据库比对 |
| 3.3 肌间刺与肌隔结缔组织的sRNA转录组数据分析 |
| 3.3.1 序列比对与分类注释 |
| 3.3.2 团头鲂miRNA鉴定 |
| 3.3.3 团头鲂miRNA异构体现象(isomiRs) |
| 3.4 unigene差异表达分析 |
| 3.4.1 三种组织间差异表达unigenes的发掘 |
| 3.4.2 三种组织间差异表达unigenes的功能注释 |
| 3.4.3 三种组织特异性表达unigenes的发掘与功能注释 |
| 3.5 miRNA差异表达分析 |
| 3.5.1 肌间刺与肌隔结缔组织间差异表达miRNA的发掘 |
| 3.5.2 肌间刺与肌隔结缔组织间差异表达miRNA靶基因预测及功能注释 |
| 3.6 Unigenes与 miRNAs的表达模式验证 |
| 4 讨论 |
| 第三章 肌间刺关键发育时期m RNA与 miRNA表达模式的关联分析与验证 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验动物和组织取样 |
| 2.2 Total RNA提取及cDNA文库构建 |
| 2.3 参考转录组装配及功能注释 |
| 2.4 不同发育时期基因表达谱分析 |
| 2.5 Mi RNA表达模式及 mRNA-miRNA互作分析 |
| 2.6 miRNA与 m RNA的表达验证 |
| 2.7 miRNAs与靶基因的调控关系验证 |
| 2.7.1 双荧光素酶报告载体构建 |
| 2.7.2 miRNAs mimics的合成 |
| 2.7.3 细胞转染 |
| 2.7.4 双荧光素酶活性检测 |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 参考转录组的装配与注释 |
| 3.2 肌间刺不同发育时期的基因表达模式 |
| 3.3 不同发育时期miRNA表达模式分析 |
| 3.4 miRNA-m RNA互作关系分析 |
| 3.5 miRNA和 m RNA的表达模式验证 |
| 3.6 miR-133b-3p与 miR-206-3p的靶基因验证 |
| 4 讨论 |
| 第四章 团头鲂肌间刺三代全长转录组构建 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 Total RNA提取 |
| 2.2.2 Pac Bio Iso-Seq库的构建和测序 |
| 2.2.3 Iso-Seq下机数据处理,校正及参考基因组比对 |
| 2.2.4 基因结构分析 |
| 2.2.5 LncRNA分析 |
| 2.2.6 基因isoforms的验证 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 原始数据处理及全长转录本分析 |
| 3.2 参考基因组比对分析 |
| 3.3 基因结构分析 |
| 3.3.1 全长转录本分类及特征分析 |
| 3.3.2 可变剪接,多聚腺苷酸化及转录因子分析 |
| 3.3.3 ORF预测与融合基因分析 |
| 3.4 LncRNA分析 |
| 3.5 Unmapped转录本和新基因转录本的功能注释 |
| 3.6 基因isoforms的验证 |
| 4 讨论 |
| 第五章 肌间刺不同生长阶段lnc RNA与 miRNA的表达模式分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验组织及total RNA提取 |
| 2.2 文库构建及测序 |
| 2.3 原始数据质控与序列比对 |
| 2.4 LncRNA与 miRNA的鉴定与特征分析 |
| 2.5 lnc RNA与 miRNA的差异表达分析 |
| 2.6 lnc RNA与 miRNA的靶基因预测与功能注释 |
| 2.7 lnc RNA,miRNA与 m RNA的 ce RNA网络调控 |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 LncRNA和 miRNA转录组数据过滤与比对 |
| 3.2 LncRNA和 miRNA的筛选与特征分析 |
| 3.3 LncRNA和 miRNA的差异表达分析 |
| 3.4 LncRNA与 miRNA的靶基因预测及功能注释 |
| 3.5 lnc RNA-miRNA-m RNA的 ce RNA网络 |
| 3.6 lnc RNA与 miRNA的表达验证 |
| 4 讨论 |
| 第六章 BMPII型受体基因在斑马鱼骨骼发育中的功能验证 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 系统发育分析和基因组结构分析 |
| 2.2 实验鱼,gRNA设计,突变体构建 |
| 2.3 突变体斑马鱼的表型观察 |
| 2.4 比较转录组分析 |
| 2.5 BMP-Smad通路基因和骨骼发育相关基因的定量表达分析 |
| 2.6 Western blot蛋白表达分析 |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 染色体同线分析与bmpr2基因保守性分析 |
| 3.2 bmpr2a和 bmpr2b突变体斑马鱼的获得 |
| 3.3 bmpr2a~(-/-)与bmpr2b~(-/-)斑马鱼肌间刺发育正常 |
| 3.4 bmpr2b~(-/-)表现出不同程度的矿化骨畸形 |
| 3.5 Bmpr2b功能丧失导致BMP-Smad信号分子及骨骼发育相关基因表达量发生显着变化 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 主要研究结果 |
| 研究创新点 |
| 参考文献 |
| 附录一 附加文件详细信息 |
| 附表1 miRNA反转录特异性茎环引物 |
| 附表2 miRNAs荧光定量引物 |
| 附表3 miRNA反转录茎环引物 |
| 附表4 miRNAs荧光定量引物 |
| 附表5 基因isoforms验证引物 |
| 附表6 lnc RNA-miRNA-m RNA的 ce RNA网络(显示部分结果) |
| 附件7 矿化骨与软骨染色方法 |
| 附件8 bmpr2a突变体斑马鱼序列信息 |
| 附件9 bmpr2b突变体斑马鱼序列信息 |
| 附录二 攻读博士学位期间发表论文和授权专利 |
| 附录三 攻读博士学位期间所获得奖励与荣誉 |
| 致谢 |
（10）肿瘤发生发展与胎盘绒毛发育相关生物学行为的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 绒毛特异性基因蕴藏了人类多种癌症的预后分子标志物 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 胎盘绒毛和成熟胎盘叶状绒毛膜组织的样本收集 |
| 1.2 获取TCGA公共数据 |
| 1.3 主要的试剂与试剂盒 |
| 1.4 主要仪器与耗材 |
| 1.5 生物信息学分析软件及网站 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 总RNA的提取及纯化 |
| 2.2 总RNA的浓度测定和质控 |
| 2.3 AgilentmRNA表达谱芯片实验 |
| 2.3.1 待标记样本的制备 |
| 2.3.2 合成cDNA |
| 2.3.3 cRNA的合成扩增及Cy3荧光标记 |
| 2.3.4 cRNA的纯化及质控 |
| 2.3.5 杂交样本的准备及杂交 |
| 2.3.6 芯片的清洗 |
| 2.3.7 芯片的扫描和数据提取及质控 |
| 2.4 数据分析 |
| 2.4.1 数据预处理和标准化 |
| 2.4.2 绒毛特异基因的富集分析 |
| 2.4.3 生存分析 |
| 2.5 数据库的使用 |
| 结果 |
| 1. 表达谱芯片的总结 |
| 2. 早期绒毛特异性表达的基因执行不同的生物学功能 |
| 3. 绒毛特异性基因在多种肿瘤中表达失调 |
| 4. 免疫、增殖、黏附相关的绒毛特异基因与预后相关 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分: 利用人绒毛发育模型鉴别结直肠癌预后生物标志物 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 绒毛样本的收集 |
| 1.2 获取GEO公共数据 |
| 1.3 获取TCGA公共数据 |
| 1.4 细胞系 |
| 1.5 感受态细胞 |
| 1.6 质粒 |
| 1.7 主要的实验仪器与试剂盒及试剂 |
| 1.8 生物信息学分析软件及网站 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 样品mRNA测序 |
| 2.1.1 总RNA提取 |
| 2.1.2 总RNA质量检测及构建文库 |
| 2.1.3 上机测序 |
| 2.2 数据分析 |
| 2.2.1 数据清洗、序列比对及基因表达水平测定 |
| 2.2.2 绒毛和结直肠癌中基因共表达网络的构建及富集分析 |
| 2.2.3 根据“偏离理论”筛选基因 |
| 2.2.4 利用广义线性模型筛选基因 |
| 2.2.5 生存分析 |
| 2.3 免疫组织化学 |
| 2.4 细胞系培养 |
| 2.4.1 细胞复苏 |
| 2.4.2 细胞传代 |
| 2.4.3 细胞冻存 |
| 2.5 表达载体的扩增 |
| 2.5.1 质粒转染大肠杆菌 |
| 2.5.2 大肠杆菌的扩增 |
| 2.5.3 质粒转染细胞株 |
| 2.6 siRNA瞬时转染 |
| 2.7 细胞RNA表达水平检测 |
| 2.7.1 细胞总RNA的提取 |
| 2.7.2 Agilent 2100 Bioanalyzer检测RNA的完整性 |
| 2.7.3 cDNA合成 |
| 2.7.4 实时定量PCR |
| 2.8 细胞蛋白表达水平检测 |
| 2.8.1 细胞总蛋白提取 |
| 2.8.2 总蛋白定量 |
| 2.8.3 蛋白免疫印迹实验 |
| 2.9 细胞生物学功能实验 |
| 2.9.1 细胞增殖实验-CCK8 |
| 2.9.2 细胞增殖实验-细胞克隆形成 |
| 2.9.3 细胞迁移实验 |
| 2.9.4 细胞凋亡实验 |
| 2.9.5 CHPF参与调节的基因/通路 |
| 2.10 统计学分析 |
| 结果 |
| 1. 早期绒毛和结直肠癌中构建基因共表达网络及功能注释 |
| 2. 鉴别偏离基因 |
| 3. 鉴别在结直肠癌变过程中连续上升或下降的基因 |
| 4. 24个基因与结直肠癌患者预后的相关性 |
| 5. CHPF和MMP14的蛋白表达与预后 |
| 6. CHPF影响结直肠癌细胞的生物学表型 |
| 6.1 CHPF通过抑制结直肠癌细胞的凋亡来促进增殖 |
| 6.2 CHPF促进细胞的迁移 |
| 6.3 CHPF参与的信号通路 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 胎盘绒毛多组学特征基因与泛癌预后的相关性 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 绒毛样本的收集 |
| 1.2 TCGA公共数据的获取 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 1.4 主要试剂盒及试剂 |
| 1.5 主要溶液及配制方法 |
| 1.6 生物信息学分析软件及网站 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 样品mRNA测序 |
| 2.2 样品DNA甲基化Illumina 850K芯片 |
| 2.2.1 抽提组织DNA及纯化 |
| 2.2.2 鉴定DNA质量 |
| 2.2.3 亚硫酸氢盐处理DNA样本 |
| 2.2.4 碱变性及基因组扩增和片段化 |
| 2.2.5 芯片杂交、洗脱及扫描 |
| 2.2.6 甲基化芯片数据分析 |
| 2.3 样品蛋白质谱 |
| 2.3.1 蛋白提取、变性及酶切 |
| 2.3.2 高精度质谱Fusion检测 |
| 2.3.3 MaxQuant软件数据搜库 |
| 2.3.4 质谱数据的分析 |
| 2.4 甲基化数据、转录组数据及蛋白质谱数据整合分析 |
| 结果 |
| 1. 早期绒毛的甲基化呈整体低甲基化 |
| 2. 转录组与甲基化数据相关性分析 |
| 3. 转录组与蛋白质谱数据相关性分析 |
| 4. 多组学数据的整合分析 |
| 5. 19个组学特征基因在泛癌中表达失调并与预后相关 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 基金资助 |
| 已发表与学位论文相关的英文论文 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、Agilent 2100 Bioanalyzer在基因差异表达研究中的应用（论文参考文献）
- [1]AIO-seq高通量测序技术开发及玉米NAM群体遗传特性和株型性状QTL定位研究[D]. 赵胜. 中国农业科学院, 2021
- [2]FBI技术的开发及其在水稻育种中的应用[D]. 张鹏. 广西大学, 2021(12)
- [3]Bacillus stearothermophilus α-淀粉酶在芽孢杆菌中高效胞外表达的研究[D]. 姚动邦. 江南大学, 2021(01)
- [4]质粒介导的oqxAB基因在大肠杆菌间的转移条件及接合子表型和基因型研究[D]. 黄俊红. 华中农业大学, 2020
- [5]四川泡菜功能微生物代谢调控机理的研究[D]. 肖阳生. 南昌大学, 2020(02)
- [6]基于高通量测序的转座子显示技术开发及应用[D]. 王越. 广西大学, 2020(02)
- [7]鹿茸提取物调控软骨细胞的生物学机制研究[D]. 高宏伟. 长春中医药大学, 2020(08)
- [8]豫粉1号蛋鸡H系羽色相关基因鉴定及酪氨酸对其表达调控研究[D]. 王鑫磊. 河南农业大学, 2019
- [9]团头鲂肌间刺发育相关基因的发掘与功能研究[D]. 万世明. 华中农业大学, 2019(01)
- [10]肿瘤发生发展与胎盘绒毛发育相关生物学行为的研究[D]. 张波涛. 北京协和医学院, 2019