一、致病性嗜水气单胞菌气溶素基因的克隆与高效表达（论文文献综述）
刘小芳[1]（2021）在《鱼源气单胞菌的毒力基因分型及重组外膜蛋白OmpAⅡ的免疫效果》文中研究说明气单胞菌（Aeromonas）是革兰氏阴性菌,广泛存在于土壤、淡水、海水等环境中,是人、兽以及水产动物共患条件致病菌,可造成我国大量淡水鱼巨大的经济损失。本研究主要调查2009-2018年分离的173株鱼源气单胞菌的毒力基因、分型与其致病力的相关性;并选取不同时间分离的、不同患病动物来源的、不同毒力基因型和不同致病力的5株维氏气单胞菌菌株,测定其主要生物学特性;探究维氏气单胞菌外膜蛋白ompAⅡ基因的分布情况、OmpAⅡ的抗原性及其对异育银鲫的免疫效果。主要内容如下:1、鱼源气单胞菌的毒力基因检测、分型及致病力以2009-2018年从不同患病鱼分离的173株气单胞菌为研究对象,通过检测10种毒力相关基因、测定溶血活性、腹腔注射感染异育银鲫等方法开展评价。管家基因gyrB分子鉴定结果显示,173株气单胞菌中维氏气单胞菌（A.veronii）（119/173,68.8%）和嗜水气单胞菌（A.hydrophila）（50/173,28.9%）是主要流行的菌株。aer（162/173,93.64%）、act（131/173,75.72%）、lip（152/173,87.86%）、exu（154/173,89.02%）、fla（143/173,82.66%）和gca T（148/173,85.55%）6个毒力基因普遍存在气单胞菌中。依据检测到的毒力基因数量从多到少分布情况,这些菌株可分为7大类（Ⅰ～Ⅶ）53个毒力基因型。大部分嗜水气单胞菌菌株检测到8-10个毒力基因,主要分布于Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类基因型;维氏气单胞菌菌株的eprCAI、ahyB、ast和alt四个毒力基因检测率低,主要分布于Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ类基因型。大部分气单胞菌菌株（94.22%,163/173）具有溶血活性。代表性毒力基因型的38株维氏气单胞菌和20株嗜水气单胞菌腹腔注射攻毒结果显示,3.0×106CFU/尾的剂量下,3株维氏气单胞菌使鲫死亡率达80%～100%,16株嗜水气单胞菌使鲫死亡率达90%～100%。结果表明,维氏气单胞菌是目前最主要流行的气单胞菌,其检测到的毒力基因普遍少于嗜水气单胞菌菌株,且对异育银鲫的致病力普遍弱于嗜水气单胞菌菌株。2、维氏气单胞菌生物学特性及药物敏感性选取不同时间分离的、不同患病动物来源的、不同毒力基因型和不同致病力的5株维氏气单胞菌菌株（GZ09007、YC170511、XZ180501、Ci13643、FS12001）和1株ATCC来源的维氏气单胞菌ATCC35624,评价了不同培养条件（温度、盐度和pH）对GZ09007菌株生长的影响;测定了6株维氏气单胞菌菌株的胞外产物活性、外膜蛋白抗原性以及其药物敏感性。结果显示:GZ09007菌株的最适生长温度为24～40℃,盐度为5‰,pH为7.0。6株维氏气单胞菌菌株均具有溶血活性、蛋白酶活性及脂肪酶活性,且均携带aer、act、lip、exu等毒力基因。外膜蛋白SDS-PAGE图谱表明,6株维氏气单胞菌菌株的外膜蛋白（Omps）呈多态性分布,大约36kDa左右的条带均能被GZ09007的Omps兔抗血清识别。药物敏感试验显示,6株维氏气单胞菌菌株对同一种药物的敏感性一致,复方新诺明（复方磺胺甲基异恶唑）、氟苯尼考及恩诺沙星可用于治疗该菌引起的细菌性败血症。3、维氏气单胞菌GZ09007株OmpAⅡ的重组表达及抗原性为探究维氏气单胞菌中外膜蛋白ompAⅡ基因的分布情况及OmpAⅡ的抗原性,通过ompAⅡ基因检测、OmpAⅡ的重组表达、外膜蛋白免疫印迹等方法开展研究。结果显示:ompAⅡ基因广泛存在于维氏气单胞菌中（33/39,84.61%）。维氏气单胞菌GZ09007的ompAⅡ基因开放阅读框为999bp,编码332 aa,蛋白分子量大小为36k Da,等电点（p I）为4.91。菌株GZ09007的兔抗血清、GZ09007rOmpAⅡ、外膜蛋白Omps及全菌的兔抗血清均能够识别rOmpAⅡ。rOmpAⅡ的兔抗血清能够识别维氏气单胞菌约36k Da的外膜蛋白Omps;结果表明,OmpAⅡ具有良好的抗原性。4、维氏气单胞菌GZ09007株OmpAⅡ的免疫效果为评价rOmpAⅡ在鱼体的免疫效果,通过免疫异育银鲫、测定血清抗体效价、血清SOD酶活性、LZM活性以及不同气单胞菌菌株攻毒等方法开展评价。结果显示:腹腔注射rOmpAⅡ-ISA763A免疫异育银鲫可以产生显着的免疫应答,血清抗体效价第7 d、14 d、21 d、28 d、42 d和56 d分别达到1:100、1:800、1:1600、1:800、1:800和1:800。免疫组第42d、56d的SOD活性显着增强;第7 d、14 d、21 d、28 d、42 d和56 d的LZM活性与对照组差异极显着。免疫28 d后,腹腔注射维氏气单胞菌（GZ09007、YC170511和XZ180501）和嗜水气单胞菌（Hn099）进行人工感染,免疫组的相对保护率（RPS）分别为100%、100%、38%和89%。结果表明,rOmpAⅡ-ISA763A具有良好的免疫效果,能提高异育银鲫抵抗维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌感染能力,可作为气单胞菌基因工程亚单位疫苗进一步研究开发。
陈楠[2]（2020）在《鳜鱼源嗜水气单胞菌致病性及宿主抗菌免疫应答研究》文中认为鳜鱼（Sinipercachuatsi）是我国传统的名贵鱼类,随着集约化养殖规模增加,养殖密度增大和水体环境的恶化,鳜鱼的病害问题日益严重,目前已成为威胁我国鳜鱼养殖业健康发展的主要因素。其中由嗜水气单胞菌（A erom o nas hydrophila）引起的败血症常造成鳜鱼大批死亡,给养殖户造成了巨大的经济损失。本实验开展了嗜水气单胞菌对鳜鱼的致病性研究,建立了嗜水气单胞菌的环介导等温扩增技术（LAMP）检测方法;开展了鳜鱼感染嗜水气单胞菌后的转录组分析以及不同时间点免疫相关基因的表达分析。本研究针对严重危害江苏鳜鱼养殖生产的细菌病开展了病原学研究,通过对分离菌的形态特征、致病性、16S rRNA和gyrB基因的同源性分析,研究结果表明,嗜水气单胞菌是危害鳜鱼养殖生产的重要病原之一,分离鉴定的嗜水气单胞菌G3对鳜鱼的半数致死量LD50为1.6×106 CFU/mL;该菌株呈杆状,两端钝圆,表面覆有大量菌毛;毒力相关基因检测结果表明分离菌 G3 携带aerA、act、ahp、fla、alt、lip、ast、ahpB、eprCAI、hlyA、lafA、acg、gcaT、ompAI等共14种毒力相关基因;胞外酶及溶血活性检测表明分离菌G3具有蛋白酶、脂酶、卵磷脂酶、淀粉酶、明胶酶及β溶血活性,但不具有尿素酶活性;组织病理学研究表明患病鳜鱼的鳃、肝脏、脾脏和头肾组织细胞排列松散,出现空泡、坏死。以嗜水气单胞菌气溶素基因aerA为靶基因,利用环介导等温扩增技术建立了病原嗜水气单胞菌的快速检测方法。结果显示嗜水气单胞菌G3可扩增出阶梯状条带,加入SYBR Green 1染色后呈现绿色的阳性反应,其他对照菌株呈阴性反应,表明该LAMP检测方法对于嗜水气单胞菌具有很好的特异性,且灵敏度为4.6×101 CFU/mL。该检测方法具有特异性强、灵敏度高及使用方便等特点,可应用于嗜水气单胞菌引起的水生动物疾病的检测。为了更好地揭示鳜鱼和嗜水气单胞菌之间复杂的相互关系,本研究利用高通量测序技术对鳜鱼感染嗜水气单胞菌24 h后的头肾组织进行转录组测序（RNA-seq）,共得到53,040条Unigene,比较分析了感染嗜水气单胞菌后鳜鱼头肾组织和未感染组的基因表达图谱,共获得529个差异表达基因（DEGs）,包括254个上调基因和272个下调基因。对获得的差异表达基因进行了 GO富集分析,得到29个显着富集的GO类别,包括生物刺激、免疫系统调节、免疫反应和细胞因子的产生等与免疫相关的类别;对获得的差异表达基因进行了 KEGG富集分析,发现与免疫相关的KEGG途径包括内吞作用（Endocytosis）、吞噬体（Phagosome）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和转化生长因子-β（TGF-β）信号通路等。此外,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术,随机选取IL-6等7个与免疫相关的DEGs进行进一步验证,结果与RNA-seq数据一致。转录组分析有助于我们在整个转录组水平上了解鳜鱼的免疫和防御机制,并将为预防由嗜水气单胞菌引起的败血症提供理论依据。为了进一步阐明鳜鱼感染嗜水气单胞菌的免疫应答情况,本研究利用qRT-PCR检测了6 种免疫相关基因（MHC Ⅱ、TCR-α、TNF-α、CC chemokine 3、IL-8和Hepcidin）在鳜鱼感染嗜水气单胞菌6 h、12 h、24 h、48 h和72 h后的表达水平。结果表明,鳜鱼鳃、脾脏和头肾组织中MHC Ⅱ等6种免疫相关基因在感染嗜水气单胞菌6-48 h后表达量显着上调,于72恢复到正常水平。该实验结果表明,在鳜鱼感染嗜水气单胞菌初期,这些免疫相关基因参与到了抵抗病原入侵的途径中,对机体自身起到免疫保护作用,该研究结果为鳜鱼疾病防御和健康养殖提供了理论基础。
刘春[3]（2019）在《鱼类类结节病病原舒伯特气单胞菌的致病机制研究》文中认为2009年以来,舒伯特气单胞菌为病原的类结节病在鳢科鱼类中暴发,给鳢养殖业造成了严重的经济损失。该病典型症状为肾、肝、脾点状白色类结节结构,此症状在气单胞菌病中非常少见。目前,国内外舒伯特气单胞菌致病机理的研究较少,其生物学特性和致病机理的研究,对该病的诊断和防治具有重要意义。本项目利用全基因组测序、组织病理分析、激光共聚焦活体成像观察、转录组测序、荧光定量PCR检测等技术对类结节病的病原特性、病理特征和致病机制等进行了研究,主要结果如下:1.鱼源舒伯特气单胞菌的菌株生物学特征。利用多位点序列分型（MLST）发现近两年流行的43株舒伯特气单胞菌分为同一个ST331型;基因组重测序分析发现近10年来的10株菌株基因组差异较小,亲缘关系较近;药敏分析研究发现,近年来菌株耐药性有增加的趋势,耐药性的增加与其基因携带的耐药基因有关;罗非鱼源菌株与鳢源菌株基因组差异较小,形态特征、生长特性、生理生化特性等主要生物学特征基本相似。2.舒伯特气单胞菌的致病性特征。鳢源菌株WL-2具有淀粉酶活性,不具有蛋白酶、脂肪酶和磷脂酶活性,具有一定的抗血清能力;人工感染实验发现舒伯特气单胞菌对杂交鳢毒力较强,高温可以极大增强鳢源菌株WL-2的毒力;定量检测和活体成像观察发现鳃和肠是舒伯特气单胞菌重要的入侵部位,脾和肾是主要的增殖场所。3.舒伯特气单胞菌感染的病理形态学特征。感染后组织病理分析显示:脾、肾和肝中可观察到大量肉芽肿结节,大量巨噬细胞聚集吞噬病原菌,推测脾、肾和肝是感染靶器官,肉芽肿是感染的主要症状,巨噬细胞是吞噬细菌的主要细胞;肉芽肿是渐进性形成的,其典型结构可分为三层:中心为病原菌细菌和坏死细胞,外面包裹上皮样细胞,最外围为多层纤维细胞包绕。4.舒伯特气单胞菌与吞噬细胞的相互作用关系研究。印片观察确认病原菌可能在吞噬细胞中存活,引起细胞死亡并释放。对病原菌在鱼体内示踪观察,发现中性粒细胞和巨噬细胞能在宿主体内聚集并吞噬病原菌,巨噬细胞可能促进了病原菌的扩散;对病原菌感染小鼠巨噬细胞后的活体计数和示踪研究,确认病原菌可在小鼠巨噬细胞中存活、增殖。5.杂交鳢抗病原菌感染的机制。对病原菌感染杂交体转录组测序获得14796个差异表达基因,其中4441个上调,10355个下调。RT-QPCR分析发现,感染后48h内CXC13、TLR5、IL-1、IL-6、TNF2和IFNy等非特异性免疫相关基因表达量显着升高,TCR、MHC-I和IgM等特异性相关基因表达量受到抑制,表明非特异性免疫反应发挥了重要作用,而病原菌抑制了部分特异性免疫应答。Tunel检测发现,感染后脾脏凋亡细胞明显增加,感染后48h细胞凋亡率（18.12%）显着高于感染前（0.63%）;RT-QPCR检测发现,感染后凋亡相关因子TNFa、CASP3、CASP7和CASP8表达量均显着高于正常水平,推测病原菌通过TNF/TNFR1凋亡途径介导宿主细胞凋亡,促进了肉芽肿的形成。综合研究结果,推测舒伯特气单胞菌感染和肉芽肿结节形成的部分机制:病原菌通过鳃和肠入侵机体后,宿主中炎症细胞因子快速反应,激活、趋化中性粒细胞和巨噬细胞等聚集对病原菌吞噬。被吞噬的病原菌部分在巨噬细胞内存活,通过吞噬细胞（主要是巨噬细胞）转移到其它部位,诱导细胞凋亡、破裂,释放病原菌。肝、脾、肾等内脏组织内由于巨噬细胞较容易聚集,释放的病原菌也较多,成为了病原菌感染的主要器官。病原菌与吞噬细胞相互作用产生的大量凋亡细胞碎片和细菌刺激机体巨噬细胞上皮样化和纤维化包裹形成肉芽肿结节。形成的肉芽肿又作为庇护所和栖息地促进了病原菌的增殖和扩散。同时病原菌还通过抑制抗原递呈过程阻止宿主的部分特异性免疫应答,进一步对宿主进行感染。
李芳[4]（2019）在《胭脂鱼运动型气单胞菌败血症及弯口吸虫病初步研究》文中指出随着高密度水产养殖的发展,鱼类疾病已经成为制约该行业发展的重要因素。淡水鱼类运动型气单胞菌败血症（motile Aeromonas septicemia,MAS）与弯口吸虫病（Clinostomum disease）（又称黄蛆病,yellow grubs disease）,分别是典型的鱼类细菌性疾病和复殖吸虫病。胭脂鱼（Myxocyprinus asiaticus）为我国特有鱼类,属于二级保护动物,同时因其为亚口鱼科鱼类在亚洲的唯一分布,因此胭脂鱼兼具重要的经济价值和研究价值。近年来,上述两种疾病在胭脂鱼养殖过程中时常发生,给鱼苗培育和养殖生产造成了较大损失。本研究针对胭脂鱼养殖场频发的上述两种疾病展开病因学、病理学及免疫应答机制等内容的研究,以期为深入解析宿主对MAS的免疫应答机制和防控胭脂鱼MAS和弯口吸虫病提供新视角和参考资料。1、胭脂鱼运动型气单胞菌败血症初步研究为鉴定某养殖基地患运动型气单胞菌败血症的胭脂鱼幼鱼病原菌,利用传统病原菌分离方法,从患病胭脂鱼内脏和腹水中分离致病菌,采用形态学观察、生理生化特性分析、16S rRNA和cpn60、rpoB、gyrB基因序列分析并构建系统发育树的方法进行细菌种类鉴定,通过回感实验、半致死量（LD50）实验和16个毒力基因检测确定菌株致病性,同时开展32种药物敏感性试验;为获得胭脂鱼运动型气单胞菌败血症病理材料,对筛选出的健康胭脂鱼幼鱼进行腹腔注射200μL2.0×108 cfu/mL(LD50-24h)的嗜水气单胞菌菌液,于感染后第4、12、24 h取中肾、头肾、脾脏和肝脏用于组织结构观察,第24 h取中肾、头肾、脾脏和肝脏用于超微结构观察,结合半定量描述方法对不同时间点各组织损伤程度进行评价,以黑色素巨噬细胞中心（melano-macrophage center,MMC）为参考指标,采用定量分析方法描述各组织中MMC响应策略,以评价组织免疫反应水平;为探究诸多病理现象背后的分子机制,对致病菌感染前、后（第4 h）的胭脂鱼脾脏进行转录组分析,使用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测19个免疫相关基因在感染后第4、12和24 h的表达情况。主要研究结果及结论如下:（1）从自然发病胭脂鱼幼鱼内脏团和腹水中分离到两株优势菌,经生理生化特征和分子标记鉴定,证实两个菌株分别为嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）（命名为BBAh1）和维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）（命名为BBAv1）。（2）回感实验证实分离到的嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌均为胭脂鱼MAS致病菌,两个菌株中分别检测到7个毒力基因（aerA、alt、ascV、hlyA、lip、ompA和aspA）和8个毒力基因（aerA、alt、ascV、hlyA、lip、aexT、ast和flaA）,二者对胭脂鱼幼鱼的7天半致死量(LD50-7d)分别为1.93×105 cfu/g和8.77×105 cfu/g;且嗜水气单胞菌致死性更强,维氏气单胞菌致肠炎比例更高。（3）对32种药物的敏感性实验结果表明,两个菌株药敏特征相似,对28种药物显示出相似的敏感性,这可能与两个菌株来源于同一环境有关;建议使用两个菌株都十分敏感的头孢噻肟、氨曲南、头孢曲松和头孢呋辛等药物来治疗胭脂鱼运动型气单胞菌败血症。（4）MAS的组织显微结构病理特征表现为:内皮细胞损伤、溶血、血液凝集、MMC响应、组织坏死、淋巴细胞浸润、粒细胞胞质嗜酸性增强、肝细胞空泡化、凝固样坏死和胞质嗜酸性变性以及红细胞萎缩变性等;超微结构病理特征表现为:肾小球毛细血管塌陷,系膜细胞肿胀,足细胞增生,滤过装置遭到严重破坏;巨噬细胞功能活跃,表现为大量吞噬各类损伤细胞,包含淋巴细胞和嗜酸性粒细胞;肝脏狄氏间隙遭到严重破坏,肝细胞中糖原消失,线粒体外嗜肿胀,自噬溶酶体增多。上述现象说明:胭脂鱼MAS导致组织发生严重的病理变化,进而导致机体造血、排泄和代谢等功能障碍,是细菌感染致病和致死的主要原因。（5）MAS发展进程中组织MMC响应策略:中肾、头肾和脾脏MMC响应策略基本一致,表现为单个MMC面积越来越大,数量越来越多,相对组织面积越来越大;肝脏MMC响应策略与上述组织存在差别,即感染后12 h内,肝脏中MMC各指标基本无变化,至感染后第24 h,组织中MMC数量和相对组织面积才显着增加（P<0.05）。（6）组织MMC响应策略反映出组织器官免疫应答策略,即脾脏在细菌感染引发的免疫应答中占据主导地位,其次为头肾、中肾,肝脏免疫反应能力最弱;另外,由于脾脏MMC响应最为敏感,因此其更适宜用作评价机体生理状态或免疫水平的生物指标。（7）嗜水气单胞菌急性感染后第4 h,胭脂鱼脾脏共获得1390个显着差异表达基因（q<0.05）,其中907个表达显着上调,483个表达显着下调;随机抽取8个差异表达基因进行qRT-PCR验证,发现qRT-PCR结果与转录组结果表达趋势基本一致,进而证明了转录组数据的可靠性。（8）1390个差异表达基因显着富集于16个二级GO类别,主要为白介素1受体绑定（GO:0005149）、白介素1受体复合物（GO:0045323）、细胞因子受体绑定（GO:0005126）、炎症反应（GO:0006954）、生长因子受体绑定（GO:0070851）和免疫反应（GO:0006955）等;15条KEGG信号通路,主要包含:NF-kB信号通路（ko04064）、TNF信号通路（ko04668）、NOD样受体信号通路（ko04621）、Toll样受体信号通路（ko04620）和炎性肠炎疾病IBD（ko05321）等;上述GO类别和信号通路均与机体免疫反应相关。（9）qRT-PCR检测结果显示:模式识别受体（TLR2、TLR4、TLR6和PGRP5）、白介素（IL1B、IL6、IL8、IL10、IL11和IL12）、趋化因子（CXCL1、CXCL2和CXCL8）、免疫细胞活性调节分子（CD68、CD200、CD247、CSF3和CSF3R）及补体（C6和C7）等诸多免疫相关分子均积极参与到机体抗菌活动中。（10）据转录组和qRT-PCR结果推测胭脂鱼对嗜水气单胞菌感染的免疫应答机制可能如下:病原菌进入机体后,其病原体相关分子模式（PAMP）便被模式识别受体（如TLRs和PGRP5）所识别,接着收到信号的受体细胞开始分泌细胞因子,如IL1和TNF等,这些细胞因子进而激活MAPK信号通路,而MAPK信号通路的激活将直接启动其下游的NF-kB信号通路应答,活化的NF-kB进入核内与靶基因上游特定序列结合从而起始转录,至此机体开始启动强烈的免疫反应来抵御病原菌的进一步感染,组织学层面可见免疫细胞大量增殖,吞噬作用活跃,MMC响应强烈,炎性细胞浸润组织等,但与此同时,MAPK和NF-kB信号通路似乎还启动了负调节机制来避免机体炎症反应过度。2、胭脂鱼弯口吸虫病初步研究本研究从自然发病的人工池塘中随机抽取148尾胭脂鱼幼鱼进行编号和生长指标（全长、体长和体质量）测量;随后通过解剖从鱼体组织中剥离寄生虫包囊,并记录包囊寄生部位和数量用于计算感染率、感染强度、局部感染率和局部感染强度;使用解剖针分离出包囊中的囊蚴并将其保存于70%酒精,后采用形态学（制作囊蚴标本）结合分子生物学方法（CO1和ITS）鉴定囊蚴种类;针对复殖吸虫生活史中第一中间宿主淡水螺类和终末宿主食鱼鸟类,在发病胭脂鱼养殖场进行寄生虫生活史调查。主要研究结果及结论如下:（1）囊蚴形态学和分子标记鉴定结果证实本研究分离到的寄生虫为扁弯口吸虫（Clinostomum complanatum）。这是胭脂鱼乃至亚口鱼科鱼类作为扁弯口吸虫中间宿主的首次记录,且证实囊蚴生殖系统形态特征是鉴别此类寄生虫的可靠形态学依据,CO1（6.87%）较ITS（1.68%）变异位点率更高,鉴别弯口吸虫的效率也更高。（2）抽查样本中共有96尾胭脂鱼受到扁弯口吸虫感染,感染率为64.9%,感染强度为1-7（2.3±1.38）个囊蚴/尾;较躯干部和尾部而言,囊蚴在胭脂鱼头部分布较多,相应的局部感染率和局部感染强度分别为0.557和0.545。（3）感染组与未感染组胭脂鱼在全长和体长上均无显着差异（P>0.05）,就体质量和肥满度而言,感染组（体质量=6.44±0.19 g;肥满度=1.70±0.03 g/cm3）则显着低于未感染组（体质量=10.36±0.51 g;肥满度=2.51±0.03 g/cm3）（P<0.01）。（4）扁弯口吸虫在发病渔场生活史完整:以椭圆萝卜螺（Radix swinhoei）和小土蜗（Galba pervia）为第一中间宿主,胭脂鱼幼鱼为第二中间宿主,食鱼鸟类白鹭（Egretta garzetta）、池鹭（Ardeola bacchus）和普通翠鸟（Alcedo bengalensis）为终末宿主。（5）防治建议:1)年终彻底清塘并用生石灰杀灭螺类,清除池塘引水渠中大量繁殖的宿主螺类;2)在鱼苗、鱼种培育池上方设置防鸟网。综上研究,首次在患运动型气单胞菌败血症的胭脂鱼中同时分离到具有强烈致病性的嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌,并根据药敏实验结果筛选出适于治疗胭脂鱼运动型气单胞菌败血症的药物;通过对嗜水气单胞菌急性感染前后胭脂鱼幼鱼肾、脾和肝脏显微和超微结构变化的观察,发现一系列未见报道的运动型气单胞菌败血症的病理现象,以及组织中黑色素巨噬细胞中心应答情况;通过嗜水气单胞菌刺激胭脂鱼脾脏的转录组分析,以及qRT-PCR对免疫相关基因在感染前后的表达量检测,发现以TLRs和PGRP5为代表的PRRs在早期病原识别中发挥着重要作用,此步骤是激活其下游信号通路、产生免疫应答的关键。本研究还发现胭脂鱼乃至亚口鱼科鱼类为扁弯口吸虫的中间宿主;弄清楚了扁弯口吸虫在发病渔场的完整生活史过程;提出了清塘杀螺、防鸟等防控措施。研究结果丰富了鱼类病害研究内容,为生产实践上防控胭脂鱼此类疾病亦有重要的指导作用。
白晓倩[5]（2016）在《4株鳖源致病性嗜水气单胞菌对氨氮和亚硝酸盐的耐受与响应特征》文中研究说明采用分光光度法研究在氨氮、亚硝酸盐及两者复配组合条件下,对四株鳖源致病性嗜水气单胞菌ZHYYZ-1、ZHYYZ-2、ZHYYZ-3、ZHYYZ-4生长的影响,结果表明:（1）在氨氮质量浓度2g/L时对实验菌的生长均无显着性的影响,随着氨氮浓度的增大,对实验菌生长的抑制作用均呈增大趋势,延迟期相应增长。（2）在亚硝酸盐质量浓度0.2g/L时对实验菌的生长均无显着性的影响,随着亚硝酸盐浓度的增大,对实验菌生长的影响作用基本同氨氮,但对延迟期的作用没有氨氮的影响大。（3）氨氮和亚硝酸盐复配组合条件下,以氨氮的半致死浓度（M）和亚硝酸盐的半致死浓度（N）设置梯度浓度组合,在高浓度氨氮和低浓度亚硝酸盐组合（0.8M+0.2N）时,实验菌的24h生长量均达到最大,而在低浓度氨氮和高浓度亚硝酸盐组合（0.2M+0.8N）时,其24h生长量均达到最小。采用PCR技术对嗜水气单胞菌的AHH、Aha、OMP和AerA四个毒力基因进行分布检测表明:四个毒力基因在分离的四株嗜水气单胞菌中均有分布。采用RT-PCR技术对四个毒力基因表达进行半定量检测,结果表明:在氨氮、亚硝酸盐,及两者双重胁迫下,AHH、Aha和OMP三个毒力基因均有表达,且在亚硝酸盐胁迫下,随着浓度的升高对AHH、OMP及Aha三个毒力基因的表达有抑制作用;AerA基因在氨氮单独胁迫、氨氮和亚硝酸盐双重胁迫下几乎没有表达,而在亚硝酸盐胁迫下,仅ZHYYZ-1在高浓度条件下有微量表达。采用用荧光定量PCR技术,在高浓度氨氮、亚硝酸盐,及两者双重胁迫下,对嗜水气单胞菌ZHYYZ-1的AerA基因表达进行定量检测,结果表明:氨氮胁迫组的整体表达量低于对照组,亚硝酸盐胁迫组的表达量高于对照组,而两者双重胁迫组的表达量最高,且在低浓度氨氮与高浓度亚硝酸盐的组合中更利于AerA基因的表达。
余波,罗永成,马永兵,徐景峨,周思旋,杨莉,史开志[6]（2014）在《大鲵致病性嗜水气单胞菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR诊断试剂盒的研制》文中提出根据GenBank中致病性嗜水气单胞菌特异性的气溶素基因序列,设计1对引物,利用普通PCR技术扩增获得hlyA基因片段,并克隆到pMD-18T载体上作为阳性标准品。通过对SYBR GreenⅠ荧光定量PCR反应条件的优化,建立了快速检测致病性嗜水气单胞菌的SYBR GreenⅠ荧光定量诊断方法,以此为基础研制出试剂盒。试剂盒扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,对非致病性嗜水气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、迟缓爱德华菌、柱状黄杆菌均无阳性信号扩增,重复性好,灵敏度可达1.0x101拷贝/uL。结果表明研制的致病性嗜水气单胞菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR试剂盒具有特异、灵敏、快速、重复性好等特点,适合于大鲵临床样品的检测。
李绍戊,卢彤岩[7]（2013）在《嗜水气单胞菌毒力因子研究进展》文中进行了进一步梳理嗜水气单胞菌是一种广泛分布于自然界中的革兰氏阴性菌,是一种人-兽-鱼共患病的条件致病菌。其危害的产生与其外毒素、胞外蛋白酶及表面分子等毒力因子的分泌、表达相关。研究其毒力因子有利于深入了解该菌的致病机理,探索有效的防治方法。本文综述了嗜水气单胞菌毒力因子的相关研究进展。
杜娜[8]（2013）在《嗜水气单胞菌耐药性分析及气溶素抗血清的免疫保护性研究》文中提出本研究选取实验室分离、鉴定并保存的5株嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila） Ah638、Ah640、 Ah563、Ah541和Ah465,并以A.hydrophila标准菌株ATCC7966作为对照,采用次抑菌浓度传代培养方法,分别人工诱导获得耐左氧氟沙星的A.hydrophila菌株,以此分析A.hydrophila的氟喹诺酮类药物耐药机制及氟喹诺酮类药物之间的交叉耐药性。克隆一株A.hydrophila的气溶素基因ORF序列,原核表达并免疫新西兰大白兔得多克隆抗体,对异育银鲫腹腔注射免疫,探讨气溶素多克隆抗体的被动免疫效果,为鱼类疾病的防治丰富资料积累。研究结果如下：1.参照日本化学疗法学会制定的标准法测定左氧氟沙星对菌株的最小抑菌浓度（MIC）,除Ah465对左氧氟沙星为中等耐药菌外,其余5株A.hydrophila菌株对左氧氟沙星均敏感。在28℃条件下分别对5株A.hydrophila敏感菌株在含有左氧氟沙星的培养基中连续传代培养,72h为1代,共传9代,其MIC上升倍数为500～3906倍。对野生型A.hydrophila、标准菌株A.hydrophila ATCC7966和诱导得到的耐药菌株分别扩增GyrA和ParC,发现耐药菌株在GyrA的抗性决定区内存在突变（Ser-83→lle,Leu-92→Met）,在抗性决定区外的50、116、165和168位点也存在突变,而ParC无突变。对耐药菌进行回复突变使其MIC下降,发现83、116和165位点与野生型一致,因此我们认为此三个位点与氟喹诺酮类药物耐药性密切相关。通过外排泵机制的研究发现除Ah541外,其余诱导得到的耐药菌株的MIC下降2～4倍。耐左氧氟沙星菌株对其他氟喹诺酮类药物产生交叉耐药性。2.根据GenBank中致病性A.hydrophila气溶素（Aer）基因的序列设计引物,以鱼源A.hydrophila分离株（Ah15）为模板扩增出Aer基因的ORF序列,克隆到pMD18-T载体上进行序列测定,并以Aer为分子标记构建系统进化树,结果表明,国内菌株聚为一支,国外菌株聚为一支。通过pET-32a （+）载体构建Ah15株Aer基因的表达载体pET32a-15,转化大肠杆菌BL21（DE3） pLysS中进行诱导表达,通过SDS-PAGE分析,显示与预期大小约72.2kD相吻合的融合蛋白带,且以包涵体形式存在。用浓缩后的包涵体蛋白免疫新西兰大白兔获得了重组蛋白的抗血清,Western-blotting结果显示,兔抗血清可以识别嗜水气单胞菌的重组毒素,说明该基因的重组蛋白具有很好地免疫原性,可作为基因工程疫苗的候选基因。3.异育银鲫（Carrassius auratus）经腹腔注射免疫接种多克隆抗体,并在24h后攻毒。免疫组的累计死亡率为40%,对照组的累计死亡率为87%,对照组的累计死亡率显着高于免疫组,免疫组的相对保护率（RPS）为54.02%。免疫组与对照组存活鱼的血清凝集抗体效价均为1：32,说明免疫组的保护性由多克隆抗体的被动免疫产生,而非由A.hydrophila攻毒后产生抗体的差异性造成。
程方俊[9]（2012）在《黄颡鱼溃疡综合征病原菌及主要毒力因子研究》文中研究说明黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco, Yellow catfish）属鲶形目,鲿科,黄颡鱼属。广泛分布于我国的长江、珠江、黑龙江流域及太平洋水系,是我国重要的淡水经济鱼类,也是我国出口创汇的优良鱼种,经济价值超过四大家鱼。在我国,黄颡鱼已人工驯化饲养,年产量已达50万吨左右,产值超过10亿元/年。由于养殖模式的变化和规模不断扩大,新的传染疾病出现了暴发与流行。近年来,重庆市一些集约化鱼场养殖的黄颡鱼出现鳍红肿、出血,肌肉溃疡及败血症的疾病,发病率超过30%,死亡率高达15%,经济损失巨大,严重危及养鱼业的生存与发展。但是,该传染病的病原尚不清楚,故不能有效地进行预防和治疗。确定其病原及致病机理,可为有效预防和治疗黄颡鱼的溃疡综合征提供临床依据,对于黄颡鱼养殖有重要的理论和生产意义。目前,有关黄颡鱼溃疡综合征的病原尚不清楚,其致病机理也待研究。由于鱼类溃疡综合征的病原细菌有10余种,必须明确黄颡鱼溃疡综合征病原,弄清其发病机理,才能有效控制黄颡鱼溃疡综合征。本研究从患病黄颡鱼分离获得病原,借助细菌生化及分子鉴定方法确定病原种类,对溶血素、气溶素、胞外丝氨酸蛋白、脂肪酶重要毒力因子的基因进行了克隆,并通过大肠杆菌异源表达获得了重组溶血素,为利用重组溶血素蛋白作为抗原,建立检测温和气单胞菌技术及亚单位疫苗研制提供了基础条件。主要研究结果如下：1.病原分离鉴定与致病性从黄颡鱼病料的心血获得两株细菌,命名为RC-07-KA株和RC-07-XB株。两株细菌能够在LB、麦康凯、鲜血培养基上生长。生化试验鉴定两株细菌的氧化酶试验、精氨酸试验阳性、O/F发酵,KCN生长试验、七叶苷、水杨苷等试验为阴性与温和气单胞菌（A.sobria）生化特性一致；通过PCR扩增的16S rRNA基因序列与GenBank上公布的25株细菌16S rRNA的基因序列进行同源性分析,结果显示,本次分离菌株与6株不同来源的温和气单胞菌（A.sobria） EU916710、 DQ822702、DQ822759（Lithuania,2008）, AY987762（India,2006）, DQ133178（Korea,2007）, EU069415（China,2007）之间的亲缘关系很近,同源性达到96.4-99.8%。结合两种鉴定方法结果,证明分离的RC-07-KA株和RC-07-XB株为温和气单胞菌（A.sobria）。RC-07-KA株回归动物试验结果表明,RC-07-KA株对试验的黄颡鱼、鲤鱼、鲫鱼肌肉接种6.15×107CFU/尾,七天内能够导致死亡。鲫鱼病理组织观察表明,肾脏肾小球肿大,肾小球毛细血管内皮细胞肿胀,肾小管上皮细胞肿胀,有的管腔内可见丝状纤维蛋白渗出,肾小管间质中可见炎性白细胞浸润；心脏部分心肌纤维肿胀,横纹不明显；肝脏肝细胞变性坏死,排列紊乱,中央静脉有纤维蛋白渗出,嗜中性白细胞浸润；肠道粘膜部分上皮脱落,肠内有大量中性白细胞和少量的巨噬细胞浸润等病变。表明RC-07-KA株对鲫鱼多器官有明显病理损伤。RC-07-KA株经LB液体培养基培养,过滤的无菌滤液,在10%鲜血LB琼脂平板上进行溶血活性初步测定,结果显示：无菌滤液的溶血效价达到1×25,表明RC-07-KA株具有较强产生p溶血素特性；无菌滤液经硫酸铵二步盐析法处理得到胞外粗提物。溶血试验结果显示：胞外粗提物有明显的溶血性,表明具有溶血活性的β溶血素可以通过硫酸铵盐析方法制备。2.RC-07-KA株主要毒力基因的克隆及序列分析温和气单胞菌的致病力与多种毒力因子相关,包括气溶素、溶血素、蛋白酶、脂肪酶等,为了探讨RC-07-KA株的毒力因子,本试验采用PCR方法,扩增、克隆了该菌株的溶血素、气溶素、脂肪酶和胞外丝氨酸蛋白酶基因,并对其基因序列进行了分析。2.1气溶素基因通过PCR扩增得到RC-07-KA株气溶素基因0.7kb片段,克隆到pGEM-T载体,测序结果显示,所得到的基因片段大小为692bp,序列能编码230个氨基酸残基的多肽。Blast分析结果显示：得到的序列与气单胞菌属内菌株的气溶素基因相关,属于气单胞菌属的毒力因子气溶素超家族（aerolysin superfamily）,序列含有成孔毒素的保守结构域序列；遗传进化分析结果显示：RC-07-KA株气溶素基因序列与中国、日本和印度等报道菌株A. hydrophila, AEF （HM853019, China,2010）, A. sobria, isolate S2-As （AF443392, China,2001）, A.sobria isolate S34-As （AF443394, China,2001）, A.veronii, S43-Av （AF443395, China,2001）, A.veronii bv.sobria （AB109093, Japan,2004）, A.veronii, MTCC32497（EF034117, India,2007）的气溶素基因序列亲缘关系较近,为同一分支簇。分析结果同时显示：中国来源的气单胞菌分离株气溶素基因分别属于几个主要的簇。2.2β溶血素基因通过序列比对分析结果设计引物,采用PCR方法扩增得到RC-07-KA株p溶血素基因片段,克隆测序结果表明：得到的p溶血素基因片段大小为1467bp,包含一个ORF,编码487个氨基酸残基,编码蛋白分子量约为54KDa。遗传进化分析结果表明,该基因与气单胞菌属中的A. hydrophila菌株Sb（AY611033）、NLEPA-1607（AF410466）、AEF （HM853019）, A.sobria菌株357（AY157998）、人源分离株（EF620533）和A.salmonicida菌株17-2（X65048）的β溶血素基因亲缘关系较近,同源性大于95%,而与其他菌株的同源性较低。进化树构建结果显示：气单胞菌属的β溶血素基因可分为几个明显分支的基因簇,RC-07-KA株溶血素基因与AY611033（A.hydrophila strain Sb）、EF620533（host=Homo sapiens"）、 AY157998（A.sobria strain357）、X65048（A.salmonicida strain:17-2）、AF410466（A.hydrophila strain:NLEP A-1607）. HM853019（A.hydrophila strain AEF）为同一簇。对比分析气单胞菌属内与RC-07-KA株亲缘关系较近及较远的代表菌株p溶血素氨基酸序列的亲水性、抗原性指数及表面可及性,结果显示：气单胞菌属的溶血素具有很强的抗原性,与RC-07-KA株亲缘关系较近菌株β溶血素的抗原性相差较小,揭示p溶血素具有作为候选的蛋白疫苗的潜能。2.3胞外丝氨酸蛋白酶基因采用PCR方法扩增得到RC-07-KA株胞外丝氨酸蛋白酶基因得到1.9kb基因片段,克隆测序结果显示：得到的RC-07-KA株胞外丝氨酸蛋白酶基因大小为1875bp,包含一个ORF,编码624个氨基酸残基的多肽。构建系统进化树分析结果显示：RC-07-KA株胞外丝氨酸蛋白酶基因与AF253471（A.sobria strain288）、 AF126213（A.hydrophila, South Korea,1999）和CP002607（A.veronii B565）属于同一遗传衍化分支Ⅱ。序列相似性分析结果显示：RC-07-KA株胞外丝氨酸蛋白酶基因与AF253471、AF126213和CP002607的序列相似性高,分别为93.6%、93.3%和92.5%。这些结果表明我们成功克隆得到RC-07-KA株胞外丝氨酸蛋白酶基因,为进一步深入研究胞外丝氨酸蛋白酶的功能奠定了良好的基础。2.4脂肪酶基因采用PCR方法扩增得到RC-07-KA株脂肪酶基因片段,克隆测序显示：得到的脂肪酶基因片段为2445bp,包含一个ORF,编码814个氨基酸残基的多肽,蛋白分子量约为83KDa。构建系统进化树分析结果显示：RC-07-KA株脂肪酶基因与A.sobria strain AS228（AB206038, Japan,2005）、A.sobria strain AS008（AB206037, Japan,2005）、A.sobria strain288（JN019936, Japan,2011）属于同一遗传衍化分支Ⅱ。同源性分析结果显示：RC-07-KA株脂肪酶基因与A.sobria AS228、AS008（AB206038、AB206037, Japan,2005）的序列相似性高,分别为93.6%、93.3%。3.重组溶血素表达载体构建将RC-07-KA株溶血素基因片段连接到pET28a（+）载体的EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ位点,转化大肠杆菌提取质粒,用EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ、Sal Ⅰ进行单、双酶切鉴定,结果表明：正确构建得到重组溶血素表达质粒pET28a-Hly。将pET28a-Hly转化大肠杆菌Rosetta,用IPTG诱导溶血素基因的表达,SDS-PAGE结果显示：重组菌株表达目的蛋白条带位于66.4KDa与44.3KDa之间,结果与预期相符,且重组蛋白多为包涵体,少量为可溶性蛋白。通过His单克隆抗体进行Western-blot鉴定,结果显示在66.4KDa与44.3KDa之间出现印迹条带,表明目的蛋白在大肠杆菌中获得了表达,这为进一步研究重组溶血素的活性奠定了基础。4.重组溶血素优化表达、纯化及活性检测为了得到较多的可溶性重组溶血素,对IPTG、诱导温度及诱导表达时间进行了优化,结果显示：IPTG浓度为0.4mmol/L、诱导温度为32℃、诱导表达3-4h可溶目的蛋白的相对含量较高。在优化的条件下表达可溶性溶血素,用Ni2+-Sepharose6Fast Flow凝胶进行目的蛋白的纯化,SDS-PAGE检测结果显示纯化产物在58KDa左右得到单一条带,表明得到纯化的重组溶血素。采用鲫鱼红细胞为靶细胞进行重组溶血素的活性测定,结果显示：重组溶血素在20℃和37℃均具有溶血活性,1.0μg的重组溶血素、反应1h能明显观察到明显的溶血现象,反应3h能使试验红细胞完全溶解,表明重组溶血素具有活性,这为进一步深入研究奠定了基础。
刘明智,叶星,田园园,邓国成,马冬梅,白俊杰[10]（2010）在《嗜水气单胞菌气溶素和溶血素基因的克隆与结构预测》文中研究表明从患出血病草鱼体上分离出1个菌株,传统分类学及16SrRNA基因鉴定其为嗜水气单胞菌,人工感染实验显示该分离菌株为强毒株。克隆该菌株的气溶素（aerolysin,aerA）基因和溶血素（hemolysin,hlyA）基因,序列分析显示这2个基因只有46.7%的同源性。Blast分析显示,hlyA基因与GenBank上已登录的hlyA序列具有较高的同源性,而aerA基因与已登录的aerA基因以及一些hlyA序列也具有较高的同源性。对与aerA基因同源性较高的这些hlyA序列进行结构域预测,发现它们均具有APT结构域和气溶素结构域,说明它们实际上应是aerA基因,只是命名上与hlyA基因混淆。用DNAstar软件预测aerA和hlyA的抗原区,显示它们均具有很好的抗原性。用特异性引物检测菌株的aerA基因和hlyA基因,结果显示2株毒力株均有特异条带,而无毒株则未扩增到特异条带,说明aerA和hlyA有可能作为鉴定嗜水气单胞菌毒力菌株的标记。
二、致病性嗜水气单胞菌气溶素基因的克隆与高效表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、致病性嗜水气单胞菌气溶素基因的克隆与高效表达（论文提纲范文）
（1）鱼源气单胞菌的毒力基因分型及重组外膜蛋白OmpAⅡ的免疫效果（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 引言 |
| 1 细菌分子分型及其在气单胞菌中的应用 |
| 1.1 肠道细菌重复基因间共有序列PCR技术(ERIC-PCR) |
| 1.2 随机引物PCR(AP-PCR) |
| 1.3 脉冲场凝胶电泳技术(PFGE) |
| 1.4 重复基因外回文序列PCR技术(REP-PCR) |
| 1.5 扩增片段长度多态性分析(AFLP) |
| 1.6 多位点序列分型(MLST) |
| 1.7 毒力基因分型 |
| 2 气单胞菌主要毒力因子 |
| 2.1 气溶素(Aerolysin) |
| 2.2 细胞毒性肠毒素(Cytotoxic enterotoxin) |
| 2.3 胞外蛋白酶(Extracelluar protease) |
| 2.4 鞭毛 |
| 2.5 外膜蛋白 |
| 3 展望 |
| 4 研究内容、技术路线及意义 |
| 4.1 研究内容 |
| 4.2 技术路线 |
| 4.3 研究意义 |
| 第2章 鱼源气单胞菌的毒力基因检测、分型及致病力 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 细菌基因组提取 |
| 1.3 gyrB管家基因的扩增与测序 |
| 1.4 气溶素aer等10 个毒力相关基因检测及分型 |
| 1.5 溶血性测定 |
| 1.6 腹腔注射感染异育银鲫 |
| 2 结果 |
| 2.1 气单胞菌管家基因gyrB序列分析 |
| 2.2 10 种毒力基因分布及分型 |
| 2.3 溶血活性结果 |
| 2.4 腹腔注射攻毒结果 |
| 3 讨论 |
| 第3章 维氏气单胞菌生物学特性及其药物敏感性 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 温度、pH和盐度对维氏气单胞菌GZ09007 菌株生长的影响 |
| 1.3 胞外产物活性及aer等10 个毒力相关基因检测 |
| 1.4 外膜蛋白提取及免疫印迹 |
| 1.5 药物敏感试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 温度、pH和盐度对维氏气单胞菌GZ09007 菌株生长的影响 |
| 2.2 胞外产物活性及毒力相关基因检测结果 |
| 2.3 外膜蛋白的提取及抗原性分析 |
| 2.4 药物敏感性 |
| 3 讨论 |
| 第4章 维氏气单胞菌GZ09007株OmpAⅡ的重组表达及抗原性评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细菌菌株、质粒、抗体和实验鱼 |
| 1.2 ompAⅡ全基因克隆及序列分析 |
| 1.3 ompAⅡ基因检测 |
| 1.4 OmpAⅡ表达载体的构建 |
| 1.5 重组蛋白rOmpAⅡ的表达 |
| 1.6 免疫印迹 |
| 1.7 重组蛋白rOmpAⅡ的兔抗血清制备 |
| 1.8 不同维氏气单胞菌菌株外膜蛋白的制备及免疫印迹分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 ompAⅡ全基因的克隆及序列分析 |
| 2.2 ompAⅡ基因的检测情况 |
| 2.3 重组OmpAⅡ表达载体的构建 |
| 2.4 重组OmpAⅡ蛋白诱导表达条件的优化 |
| 2.5 重组蛋白OmpAⅡ的表达及免疫反应性 |
| 2.6 不同来源的维氏气单胞菌菌株间OmpAⅡ的抗原保守性 |
| 3 讨论 |
| 第5章 维氏气单胞菌GZ09007株OmpAⅡ的免疫效果 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 鱼体免疫 |
| 1.3 血清抗体效价测定 |
| 1.4 血清SOD酶活性测定 |
| 1.5 血清LZM酶活性测定 |
| 1.6 鱼体攻毒试验 |
| 1.7 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 血清抗体效价 |
| 2.2 血清SOD酶活性 |
| 2.3 血清LZM酶活性 |
| 2.4 鱼体攻毒结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表论文及参会情况 |
| 附录 |
| 致谢 |
（2）鳜鱼源嗜水气单胞菌致病性及宿主抗菌免疫应答研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 鳜鱼的生物学特性和养殖现状 |
| 1.1.1 鳜鱼的生物学特性 |
| 1.1.2 鳜鱼的养殖现状 |
| 1.2 鳜鱼病害的研究进展 |
| 1.2.1 细菌性疾病 |
| 1.2.2 病毒性疾病 |
| 1.3 鳜鱼病害的防治方法 |
| 1.3.1 抗菌药物防治 |
| 1.3.2 疫苗防治 |
| 1.4 嗜水气单胞菌的生物学特性及其对水产养殖生产的危害 |
| 1.4.1 嗜水气单胞菌的生物学特性 |
| 1.4.2 嗜水气单胞菌的毒力因子 |
| 1.4.3 嗜水气单胞菌在水产养殖生产中的危害 |
| 1.4.4 嗜水气单胞菌的检测方法 |
| 1.5 本论文的研究意义和主要内容 |
| 第2章 鳜鱼病原嗜水气单胞菌鉴定及致病特性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验试剂 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.1.4 细菌分离 |
| 2.1.5 分离菌的形态观察 |
| 2.1.6 分离菌株G3致病性检测 |
| 2.1.7 组织病理观察 |
| 2.1.8 生理生化特性检测 |
| 2.1.9 16S rRNA和gyrB基因序列测定 |
| 2.1.10 嗜水气单胞菌的毒力相关基因检测 |
| 2.1.11 胞外酶与溶血活性检测 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 菌株形态特征 |
| 2.2.2 分离菌株G3的致病性 |
| 2.2.3 组织病理变化 |
| 2.2.4 理化特性 |
| 2.2.5 菌株G3系统发育树构建 |
| 2.2.6 毒力基因检测结果 |
| 2.2.7 胞外酶和溶血活性 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 嗜水气单胞菌LAMP检测方法的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验试剂 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 供试菌株 |
| 3.1.4 菌株DNA的提取 |
| 3.1.5 LAMP引物设计与合成 |
| 3.1.6 LAMP反应条件的优化 |
| 3.1.7 LAMP扩增的特异性检测 |
| 3.1.8 LAMP扩增的灵敏性检测 |
| 3.1.9 LAMP检测的应用 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 LAMP检测方法的优化体系 |
| 3.2.2 嗜水气单胞菌LAMP检测的特异性扩增结果 |
| 3.2.3 嗜水气单胞菌LAMP检测的灵敏度 |
| 3.2.4 LAMP检测方法的应用 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 鳜鱼感染嗜水气单胞菌后转录组测序分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验试剂 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 实验鳜鱼 |
| 4.1.4 鳜鱼的感染及取样 |
| 4.1.5 RNA的提取及提取质量检测 |
| 4.1.6 cDNA文库构建和转录组测序 |
| 4.1.7 测序质量控制 |
| 4.1.8 De novo拼接和unigene功能注释 |
| 4.1.9 差异表达基因和富集分析 |
| 4.1.10 qRT-PCR验证差异基因表达 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 测序与De novo拼接结果 |
| 4.2.2 Unigene功能注释 |
| 4.2.3 差异表达基因及其聚类分析 |
| 4.2.4 差异表达基因GO功能富集 |
| 4.2.5 差异表达基因KEGG通路富集分析 |
| 4.2.6 测序结果验证 |
| 4.3 讨论 |
| 第5章 鳜鱼感染嗜水气单胞菌后6种免疫相关基因表达的变化分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验试剂 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.1.3 实验鳜鱼 |
| 5.1.4 鳜鱼的感染及取样 |
| 5.1.5 RNA的提取及cDNA的合成 |
| 5.1.6 qRT-PCR所用引物的设计与验证 |
| 5.1.7 qRT-PCR检测 |
| 5.1.8 数据处理及分析 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 qRT-PCR所用引物的获得 |
| 5.2.2 MHCⅡ在鳃、脾脏和头肾中的表达变化 |
| 5.2.3 TCR-α在鳃、脾脏和头肾中的表达变化 |
| 5.2.4 TNF-α在鳃、脾脏和头肾中的表达变化 |
| 5.2.5 CC chemokine 3在鳃、脾脏和头肾中的表达变化 |
| 5.2.6 IL-8在鳃、脾脏和头肾中的表达变化 |
| 5.2.7 Hepcidin在鳃、脾脏和头肾中的表达变化 |
| 5.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（3）鱼类类结节病病原舒伯特气单胞菌的致病机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 鱼类细菌性内脏类结节病的研究进展 |
| 1.1 鱼类内脏类结节病的病原 |
| 1.2 病理学特征 |
| 1.3 肉芽肿的致病机理 |
| 1.4 防治方法 |
| 2 舒伯特气单胞菌的研究进展 |
| 2.1 分类地位 |
| 2.2 生物学特性 |
| 2.3 致病性 |
| 2.4 诊断及检测方法 |
| 2.5 项目研究的目的与意义 |
| 第二章 鱼源舒伯特气单胞菌生物学特性分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 舒伯特气单胞菌的多位点序列分型 |
| 3.2 舒伯特气单胞菌的毒力基因分析 |
| 3.3 舒伯特气单胞菌的药敏性分析 |
| 3.4 舒伯特气单胞菌菌株的亲缘关系分析 |
| 3.5 舒伯特气单胞菌LF1708的全基因组分析 |
| 3.6 两种鱼源舒伯特气单胞菌的形态学特征分析 |
| 3.7 两种鱼源舒伯特气单胞菌的生长特性分析 |
| 3.8 两种鱼源舒伯特气单胞菌的生理生化特征分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 舒伯特气单胞菌致病性研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 胞外酶活性 |
| 3.2 抗血清杀菌能力测定 |
| 3.3 宿主特异性检测 |
| 3.4 致病力检测 |
| 3.5 绿色荧光标记舒伯特气单胞菌的构建 |
| 3.6 舒伯特单胞菌荧光定量检测方法的建立 |
| 3.7 舒伯特气单胞菌在宿主体内的动态分布研究 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 舒伯特气单胞菌感染的病理形态学研究分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 病鱼临床症状 |
| 3.2 感染杂交鳢体内病原菌与吞噬细胞分布情况 |
| 3.3 典型病理特征 |
| 3.4 病理变化过程 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 舒伯特气单胞菌与吞噬细胞的相互作用关系研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 舒伯特气单胞菌与杂交鳢体内吞噬细胞相互作用关系研究 |
| 3.2 舒伯特气单胞菌与斑马鱼中性粒细胞相互作用关系研究 |
| 3.3 舒伯特气单胞菌与斑马鱼巨噬细胞相互作用关系研究 |
| 3.4 舒伯特气单胞菌与小鼠巨噬细胞的相互作用关系 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第六章 杂交鳢抗舒伯特气单胞菌感染的机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 转录组测序、分析与验证 |
| 3.2 免疫相关基因在感染杂交鳢脾脏中的表达情况 |
| 3.3 舒伯特气单胞菌感染对宿主脾脏细胞凋亡的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（4）胭脂鱼运动型气单胞菌败血症及弯口吸虫病初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 鱼类运动型气单胞菌败血症研究进展 |
| 1.1.1 运动型气单胞菌简介 |
| 1.1.2 病原菌鉴定方法 |
| 1.1.3 运动型气单胞菌败血症的病症及危害 |
| 1.1.4 运动型气单胞菌的致病基础与感染途径 |
| 1.1.5 转录组研究鱼类运动型气单胞菌败血症 |
| 1.1.6 运动型气单胞菌败血症的防治措施 |
| 1.2 鱼类弯口吸虫病研究进展 |
| 1.2.1 弯口吸虫简介 |
| 1.2.2 弯口吸虫病的病症及危害 |
| 1.2.3 弯口吸虫与宿主互作研究 |
| 1.2.4 弯口吸虫病流行病学研究 |
| 1.2.5 弯口吸虫病的防治方法 |
| 1.3 本研究目的与意义 |
| 第2章 胭脂鱼运动型气单胞菌败血症病原菌分离鉴定及防治药物筛选 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验鱼来源 |
| 2.1.2 病原菌分离与鉴定 |
| 2.1.3 人工感染实验 |
| 2.1.4 病原菌毒力因子鉴定 |
| 2.1.5 药敏实验 |
| 2.1.6 数据处理与分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 患病胭脂鱼病症描述 |
| 2.2.2 病原菌生理生化和分子标记鉴定结果 |
| 2.2.3 病原菌回感实验结果 |
| 2.2.4 病原菌毒力因子鉴定结果 |
| 2.2.5 药敏实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 生理生化和分子生物学方法鉴定病原菌 |
| 2.3.2 毒力因子分布与气单胞菌致病性的关系 |
| 2.3.3 气单胞菌的耐药性问题 |
| 2.3.4 胭脂鱼运动型气单胞菌败血症的防治措施 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 胭脂鱼运动型气单胞菌败血症的病理特征 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 细菌感染实验 |
| 3.1.2 显微结构观察样本处理 |
| 3.1.3 超微结构观察样本处理 |
| 3.1.4 组织病理特征定量与半定量描述 |
| 3.1.5 数据统计分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 病理特征的定量与半定量描述 |
| 3.2.2 MAS对肾、脾和肝脏组织结构的影响 |
| 3.2.3 MAS对肾、脾和肝脏超微结构的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 MAS诸多病理现象背后的意义 |
| 3.3.2 MAS进程中组织MMC响应策略 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 胭脂鱼对运动型气单胞菌败血症的免疫应答机制 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细菌感染和取材 |
| 4.1.2 感染前后脾脏总RNA提取 |
| 4.1.3 RNA质检、cDNA建库和测序 |
| 4.1.4 实验数据处理 |
| 4.1.5 差异表达基因及其功能通路分析 |
| 4.1.6 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 4.1.7 数据统计分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 RNA-seq分析和de novo组装 |
| 4.2.2 基因功能注释 |
| 4.2.3 Unigene功能注释和代谢通路分析 |
| 4.2.4 差异表达基因鉴定和注释 |
| 4.2.5 差异表达基因的GO富集分析 |
| 4.2.6 差异表达基因的代谢通路分析 |
| 4.2.7 实时荧光定量PCR验证差异表达基因 |
| 4.2.8 MAS引起大量免疫相关基因表达显着上调 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 胭脂鱼脾脏的免疫功能 |
| 4.3.2 MAS激活信号转导通路 |
| 4.3.3 MAS导致机体产生强烈的免疫反应 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 胭脂鱼弯口吸虫病病原、病症及病因初步研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验鱼来源 |
| 5.1.2 寄生虫分离与鉴定 |
| 5.1.3 感染状况分析 |
| 5.1.4 病因调查分析 |
| 5.1.5 数据处理与分析 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 囊蚴形态特征 |
| 5.2.2 囊蚴分子标记CO1和ITS序列分析及系统发育树构建 |
| 5.2.3 囊蚴在胭脂鱼组织中的寄生部位与感染情况分析 |
| 5.2.4 囊蚴寄生对胭脂鱼生长指标的影响 |
| 5.2.5 弯口吸虫生活史调查结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 胭脂鱼是扁弯口吸虫的又一中间宿主 |
| 5.3.2 扁弯口吸虫寄生对胭脂鱼生长存在明显不利影响 |
| 5.3.3 如何有效防治胭脂鱼的弯口吸虫病 |
| 5.4 小结 |
| 结论与展望 |
| 本研究的主要创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表论文情况 |
| 在读期间主持及参与项目情况 |
（5）4株鳖源致病性嗜水气单胞菌对氨氮和亚硝酸盐的耐受与响应特征（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 综述 |
| 1.1 嗜水气单胞菌的致病性 |
| 1.2 嗜水气单胞菌的毒力因子 |
| 1.2.1 外毒素 |
| 1.2.2 胞外蛋白酶 |
| 1.2.3 粘附因子 |
| 1.3 嗜水气单胞菌的检测 |
| 1.3.1 生理生化鉴定 |
| 1.3.2 免疫学检测 |
| 1.3.3 PCR反应鉴定 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 氨氮、亚硝酸盐对四株嗜水气单胞菌生长的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验菌株 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 菌种活化 |
| 2.1.5 实验内容 |
| 2.1.5.1 氨氮对四株嗜水气单胞菌生长的影响 |
| 2.1.5.2 亚硝酸盐对四株嗜水气单胞菌生长的影响 |
| 2.1.5.3 氨氮和亚硝酸盐复配组合对四株嗜水气单胞菌生长的影响 |
| 2.2 数据处理 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 氨氮和亚硝酸盐复配组合的NH4Cl和NaNO2浓度 |
| 2.3.2 氨氮对四株嗜水气单胞菌生长的影响 |
| 2.3.3 亚硝酸盐对四株嗜水气单胞菌生长的影响 |
| 2.3.4 氨氮和亚硝酸盐复配组合对四株嗜水气单胞菌生长的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 氨氮、亚硝酸盐胁迫下四株嗜水气单胞菌毒力基因的半定量检测 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.1.1 实验菌株 |
| 3.1.1.2 主要试剂 |
| 3.1.1.3 主要仪器 |
| 3.1.2 实验菌胁迫处理 |
| 3.1.3 DNA提取 |
| 3.1.4 总RNA提取 |
| 3.1.5 提取的总RNA质量检测 |
| 3.1.6 引物设计 |
| 3.1.7 各菌株毒力基因的分布 |
| 3.1.8 胁迫下的毒力基因半定量检测 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 总RNA提取质量检测 |
| 3.2.2 各菌株毒力基因分布 |
| 3.2.3 各菌株毒力基因半定量检测 |
| 3.2.3.1 氨氮胁迫下各菌株毒力基因半定量检测 |
| 3.2.3.2 亚硝酸盐胁迫下各菌株毒力基因半定量检测 |
| 3.2.3.3 氨氮和亚硝酸盐双重胁迫下各菌株毒力基因半定量检测 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 氨氮、亚硝酸盐胁迫下嗜水气单胞菌毒力基因的荧光定量检测 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.1.1 实验菌株 |
| 4.1.1.2 主要试剂 |
| 4.1.1.3 主要仪器 |
| 4.1.2 实验菌株胁迫处理 |
| 4.1.3 总RNA提取 |
| 4.1.4 提取的总RNA质量检测 |
| 4.1.5 RNA反转录体系及程序 |
| 4.1.6 引物设计 |
| 4.1.7 胁迫下的毒力基因荧光定量检测 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 总RNA提取质量检测 |
| 4.2.2 荧光定量扩增结果 |
| 4.2.3 荧光定量PCR检测AerA表达水平 |
| 4.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文及研究成果 |
（7）嗜水气单胞菌毒力因子研究进展（论文提纲范文）
| 1 毒力相关的分泌物质 |
| 1.1 溶血素 |
| 1.2 气溶素 |
| 1.3 肠毒素 |
| 1.4 胞外蛋白酶 |
| 1.5 转移酶类 |
| 2 致病相关的表面分子 |
| 2.1 外膜蛋白 |
| 2.2 S层蛋白 |
| 2.3 脂多糖 |
| 2.4 菌毛 |
| 3 展望 |
（8）嗜水气单胞菌耐药性分析及气溶素抗血清的免疫保护性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 氨基酸及其缩写 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 革兰氏阴性菌对喹诺酮类药物的耐药机制 |
| 1.1 染色体突变介导的耐药机制 |
| 1.2 细胞内药物蓄积的减少介导的耐药机制 |
| 1.3 质粒介导的耐药机制 |
| 2 嗜水气单胞菌气溶素的研究进展 |
| 2.1 嗜水气单胞菌气溶素的序列特点 |
| 2.2 嗜水气单胞菌气溶素的致病性 |
| 2.3 嗜水气单胞菌气溶素基因的研究现状 |
| 3 疫苗的研究进展 |
| 3.1 主动免疫 |
| 3.1.1 灭活疫苗 |
| 3.1.2 弱毒疫苗 |
| 3.1.3 基因工程亚单位疫苗 |
| 3.1.4 核酸疫苗 |
| 3.1.5 基因工程载体疫苗 |
| 3.2 被动免疫 |
| 4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 嗜水气单胞菌对氟喹诺酮类药物的耐药性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 菌株最小抑菌浓度(MIC)的测定 |
| 1.5 次抑菌浓度药物诱导产生耐药突变菌 |
| 1.6 耐药突变菌GyrA与ParC基因的突变分析 |
| 1.6.1 嗜水气单胞菌基因组DNA的提取 |
| 1.6.2 特异性引物的设计 |
| 1.6.3 基因的PCR扩增 |
| 1.6.4 PCR产物的检测与测序 |
| 1.7 耐药突变菌的回复突变分析 |
| 1.8 耐药突变株的外排泵机制 |
| 1.9 耐药突变菌对其他类药物的交叉耐药 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 耐药菌株的获得 |
| 2.2 耐药菌株的gyrA和parC突变分析 |
| 2.3 耐药菌株的回复突变 |
| 2.4 外排泵机制 |
| 2.5 耐药菌株的交叉耐药性 |
| 3 讨论 |
| 第三章 嗜水气单胞菌气溶素的原核表达及其多克隆抗血清的制备 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 菌株和载体 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 Aer基因的扩增、克隆及测序 |
| 1.4.1 Aer基因的扩增 |
| 1.4.2 PCR产物回收与纯化 |
| 1.4.3 目的基因的克隆与筛选 |
| 1.4.4 重组质粒的PCR鉴定 |
| 1.4.5 序列特征和生物信息学分析 |
| 1.5 融合表达载体的构建及原核表达 |
| 1.5.1 质粒与表达载体pET-32a(+)的双酶切 |
| 1.5.2 目的基因与原核表达载体的连接 |
| 1.5.3 重组质粒的转化 |
| 1.5.4 重组原核表达质粒的双酶切鉴定 |
| 1.5.5 测序鉴定与分析 |
| 1.5.6 蛋白的诱导表达 |
| 1.5.7 融合蛋白的浓缩 |
| 1.5.8 SDS-PAGE分析 |
| 1.5.9 多克隆抗体的制备 |
| 1.5.10 Western-blotting |
| 2. 结果 |
| 2.1 Aer基因的序列特征 |
| 2.2 重组质粒pMD-18T-15的菌液PCR鉴定 |
| 2.3 重组质粒pET32a-15的鉴定 |
| 2.4 表达分析 |
| 2.5 蛋白的浓缩与免疫原性 |
| 3. 讨论 |
| 第四章 嗜水气单胞菌的被动免疫保护性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验鱼 |
| 1.2 供试菌株 |
| 1.3 抗血清的被动免疫 |
| 1.4 攻毒菌液的准备 |
| 1.5 攻毒 |
| 1.6 凝集抗体效价的测定 |
| 1.7 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 被动免疫保护性 |
| 2.2 凝集抗体效价 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录1 实验补充图表 |
| 附表2 实验中试剂的配制方法 |
| 附录3 在读期间发表的论文 |
| 致谢 |
（9）黄颡鱼溃疡综合征病原菌及主要毒力因子研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 气单胞菌分类地位与生物学特性 |
| 1.2.1 分类地位 |
| 1.2.2 生物学特性 |
| 1.2.3 基因组特点 |
| 1.3. 鉴定方法 |
| 1.3.1 数值鉴定 |
| 1.3.2 16S rRNA基因序列分析 |
| 1.4 气单胞菌致病性 |
| 1.4.1 鱼类感染疾病 |
| 1.4.2 人类感染疾病 |
| 1.4.3 动物感染疾病 |
| 1.5 气单胞菌毒力因子 |
| 1.5.1 鞭毛 |
| 1.5.2 S-层 |
| 1.5.3 气溶素 |
| 1.5.4 溶血素 |
| 1.5.5 毒性酶 |
| 1.5.6 Ⅲ型分泌系统 |
| 1.6 临床诊断方法 |
| 1.6.1 PCR方法 |
| 1.6.2 标记抗体技术 |
| 1.6.3 酶联免疫吸附及斑点酶联免疫吸附技术 |
| 1.7 防治方法 |
| 1.7.1 药物 |
| 1.7.2 疫苗 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 我国黄颡鱼饲养状况 |
| 2.2 气单胞菌属细菌的危害及研究状况 |
| 2.3 研究内容及方法 |
| 2.3.1 病原分离鉴定与致病性试验 |
| 2.3.2 病原主要毒力因子克隆、测序及生物信息学分析 |
| 2.3.3 重组溶血素表达载体构建、表达及生物活性检测 |
| 第三章 黄颡鱼溃疡综合征病原菌分离鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 分离株形态、培养特性 |
| 3.2.2 分离株生化试验 |
| 3.2.3 分离株16S rRNA基因的序列分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 RC-07-KA株致病性与病理组织学观察 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 黄颡鱼、鲫鱼、鲤鱼感染试验 |
| 4.2.2 鲫鱼病理组织观察 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 RC-07-KA株致病性 |
| 4.3.2 感染鲫鱼组织病理学变化 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 RC-07-KA株培养液溶血效价测定及胞外产物粗提 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 温和气单胞菌(RC-07-KA株)静置培养滤液的溶血效价 |
| 5.2.2 胞外粗提物溶血试验 |
| 5.2.3 胞外粗提物鲤鱼毒性试验 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 RC-07-KA株主要毒力基因的克隆及序列分析 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 试验材料 |
| 6.1.2 试验方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 温和气单胞菌RC-07-KA株的四种毒力基因的扩增与测序 |
| 6.2.2 RC-07-KA株四种毒力基因的序列分析 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 RC-07-KA株β溶血素重组质粒构建及其表达 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 试验材料 |
| 7.1.2 试验方法 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 溶血素基因片段扩增 |
| 7.2.2 重组溶血素表达质粒构建 |
| 7.2.3 目的蛋白诱导表达 |
| 7.2.4 Western-blot |
| 7.3 讨论 |
| 第八章 重组β溶血素优化表达、纯化及活性检测 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.1.1 试验材料 |
| 8.1.2 试验方法 |
| 8.2 结果与分析 |
| 8.2.1 重组溶血素诱导表达条件优化 |
| 8.2.2 重组溶血素纯化 |
| 8.2.3 重组溶血素活性检测 |
| 8.3 讨论 |
| 第九章 结论 |
| 进一步研究设想 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表文章及参研科研项目 |
| 附录 |
（10）嗜水气单胞菌气溶素和溶血素基因的克隆与结构预测（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试菌株、宿主菌和质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 引物设计与合成 |
| 1.4 aerA和hlyA基因的扩增 |
| 1.5 嗜水气单胞菌强毒、弱毒与无毒株hlyA基因和aerA基因片段扩增 |
| 1.6 序列分析与结构预测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 aerA和hlyA基因的扩增与序列分析 |
| 2.2 aerA和hlyA的系统进化分析 |
| 2.3 aerA和hlyA的抗原性预测 |
| 2.4 aerA和hlyA的结构域分析 |
| 2.5 aerA与hlyA基因毒力相关性分析 |
| 3 讨论 |
四、致病性嗜水气单胞菌气溶素基因的克隆与高效表达（论文参考文献）
- [1]鱼源气单胞菌的毒力基因分型及重组外膜蛋白OmpAⅡ的免疫效果[D]. 刘小芳. 上海海洋大学, 2021(01)
- [2]鳜鱼源嗜水气单胞菌致病性及宿主抗菌免疫应答研究[D]. 陈楠. 扬州大学, 2020
- [3]鱼类类结节病病原舒伯特气单胞菌的致病机制研究[D]. 刘春. 华中农业大学, 2019(02)
- [4]胭脂鱼运动型气单胞菌败血症及弯口吸虫病初步研究[D]. 李芳. 西南大学, 2019(01)
- [5]4株鳖源致病性嗜水气单胞菌对氨氮和亚硝酸盐的耐受与响应特征[D]. 白晓倩. 浙江海洋大学, 2016(03)
- [6]大鲵致病性嗜水气单胞菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR诊断试剂盒的研制[J]. 余波,罗永成,马永兵,徐景峨,周思旋,杨莉,史开志. 基因组学与应用生物学, 2014(05)
- [7]嗜水气单胞菌毒力因子研究进展[J]. 李绍戊,卢彤岩. 水产学杂志, 2013(05)
- [8]嗜水气单胞菌耐药性分析及气溶素抗血清的免疫保护性研究[D]. 杜娜. 华中农业大学, 2013(02)
- [9]黄颡鱼溃疡综合征病原菌及主要毒力因子研究[D]. 程方俊. 西南大学, 2012(11)
- [10]嗜水气单胞菌气溶素和溶血素基因的克隆与结构预测[J]. 刘明智,叶星,田园园,邓国成,马冬梅,白俊杰. 江西农业大学学报, 2010(02)