人软骨蛋白聚糖Northern杂交探针的构建与应用

一、人软骨蛋白聚糖Northern杂交探针的构建及其应用（论文文献综述）

周志斌^[1]（2020）在《环状RNA CircCDH13对microRNA的调控在骨性关节炎中的作用及其机制研究》文中研究表明研究背景:骨性关节炎（Osteoarthritis,OA）是最常见的年龄相关性关节退行性疾病之一,以慢性关节炎症、关节软骨组织破坏、软骨下骨质硬化及骨赘逐渐生成为主要特征。OA早期症状以受累关节疼痛、僵硬,活动能力下降为主,晚期将导致关节功能丧失而致残,这不仅极大地影响着患者的身体健康及生活质量,还持续增加着家庭及社会的人力与财力负担。由此,OA的预防与治疗已经逐渐成为一项急需解决的医学难题。此外,当前OA的临床治疗方法有限,主要为对症治疗,缺乏有效的对因治疗手段,关节置换常常是终末期OA的唯一选择。因此,深入研究OA的病理过程,探索其确切的致病机理及调控机制,对于OA的防治具有重要的临床价值和社会意义。环状RNA（circular RNA,circ RNA）是一种新近发现的内源性RNA分子。与传统的线性RNA结构不同,circ RNA既没有5’端帽子,也没有3’端尾巴,其闭合的环状结构由序列通过共价键形成。Circ RNA主要由pre-m RNA通过可变剪接加工产生,具有表达丰富、组织特异性高及稳定性好等特点。研究表明,circ RNA具有强大的生物学功能,可在转录及转录后水平对基因表达进行调控。Circ RNA可以参与调控机体正常细胞生长发育、维持干细胞特性,也可以在心衰、椎间盘退变、肿瘤等多种疾病的发生发展过程中,发挥关键的调节作用。然而,虽然circ RNA在机体生理功能及多种疾病中的作用已被大量研究阐述,circ RNA参与OA疾病进程的相关报道国内外数量甚少,有待进一步研究。研究目的与方法:本研究运用芯片技术,检测了circ RNA在OA软骨组织和正常软骨组织中的表达情况。通过PCR、Sanger测序、Northern blot等方法,对Circ CDH13的差异表达情况及其环化特性进行了验证。采用体外干扰、过表达技术,在软骨细胞中进行了Circ CDH13的功能获得及缺失实验,以Annexin V-FITC流式细胞仪及TUNEL染色对软骨细胞凋亡进行检测,以Western blot、细胞免疫荧光对软骨细胞中MMP13、Col2a1、ADAMTS-5及Aggrecan的表达进行检测。通过生物信息学预测、RNA pulldown等方法,结合双荧光素酶报告基因实验预测并验证Circ CDH13与mi R-296-3p及mi R-296-3p与PTEN的靶向结合。利用腺相关病毒沉默小鼠体内Circ CDH13表达,通过番红-固绿染色、X线及micro-CT检测Circ CDH13沉默对DMM诱导的小鼠膝关节OA的作用,并以Western blot、免疫组化检测MMP13、Col2a1、ADAMTS-5及Aggrecan的表达情况。研究结果:我们的研究发现,相比正常软骨组织,人OA软骨组织中存在大量circ RNA差异表达,其中,Circ CDH13在OA软骨组织及IL-1β诱导的OA体外细胞模型中表达量均显着增高。Sanger测序结果显示Circ CDH13的反向剪接位点附近序列与Circ Base数据库一致,Northern blot结果证实Circ CDH13在c DNA中可被双向引物扩增,同时PCR结果表明Circ CDH13可以抵抗RNase R酶的消化。通过RNA干扰及过表达技术,以IL-1β建立OA体外模型,在体外研究Circ CDH13对OA中软骨细胞的作用。结果显示,Circ CDH13体外干扰时,相比IL-1β刺激组,si RNA转染组软骨细胞凋亡率显着降低,软骨细胞细胞外基质Col2a1、Aggrecan表达量显着增加,基质降解酶MMP13、ADAMTS-5表达量显着减少;而Circ CDH13体外过表达时,软骨细胞凋亡率显着增加,Col2a1、Aggrecan合成减少,MMP13、ADAMTS-5分泌增多。细胞“核质”分离实验显示,Circ CDH13主要定位于软骨细胞细胞质中。mi Randa与Target Scan数据库预测及Circ CDH13 pulldown检测发现mi R-296-3p是Circ CDH13的靶向mi RNA。双荧光素酶报告基因实验结果显示,相比对照组,与mi R-296-3共转染后,Circ CDH13-wt组荧光检测强度显着下降,而Circ CDH13-mut组荧光检测强度变化无统计学差异,表明mi R-296-3p可直接与Circ CDH13靶向结合。PCR检测发现,mi R-296-3p在OA软骨组织中显着低表达。功能实验结果进一步表明,mi R-296-3p体外过表达可显着抑制IL-1β及Circ CDH13诱导的软骨细胞凋亡,Col2a1、Aggrecan降解及MMP13、ADAMTS-5合成。Target Scan数据库预测PTEN为mi R-296-3p下游靶基因,双荧光素酶报告基因实验发现,与mi R-296-3p共转染后,相比对照组,PTEN 3’UTR wt组荧光检测强度显着降低,而PTEN 3’UTR mut组荧光检测强度变化无统计学差异,表明mi R-296-3p可直接与PTEN靶向结合。Western blot结果显示,PTEN在OA中显着高表达。PTEN功能实验显示,PTEN过表达显着上调软骨细胞凋亡率,同时显着降低Col2a1、Aggrecan表达,升高MMP13、ADAMTS-5表达。功能实验结果进一步表明,在软骨细胞中,mi R-296-3p可以通过对PTEN表达的负向调控,显着抑制PTEN诱导的软骨细胞凋亡、Col2a1、Aggrecan的降解及MMP13、ADAMTS-5的合成。研究还发现,Circ CDH13在小鼠中存在同源的circ RNA（mmu＿circ＿0014630）,人鼠来源的Circ CDH13（hsa＿circ＿0040646与mmu＿circ＿0014630）序列同源性达89%。构建Circ CDH13腺相关病毒沉默载体,小鼠关节腔内注射治疗8周后,结果显示,相比DMM组,小鼠体内Circ CDH13沉默组小鼠膝关节软骨破坏减轻,骨赘生成减少,同时软骨细胞细胞外基质Col2a1、Aggrecan合成增加,基质降解酶MMP13、ADAMTS-5分泌减少。结论:综上所述,本研究通过体内外实验,发现OA软骨组织中存在大量circ RNA差异表达,其中Circ CDH13在OA软骨组织及OA体外细胞模型中表达量均显着增高。功能上,高表达的Circ CDH13主要通过诱导软骨细胞凋亡,促进软骨细胞细胞外基质降解及其降解酶的合成,进而促进OA的发生发展。机制上,定位于软骨细胞细胞质中的Circ CDH13可以作为mi R-296-3p海绵,通过与mi R-296-3p靶向结合,解除mi R-296-3p对其下游靶基因PTEN表达的抑制,参与OA进程的调控。Circ CDH13在人与小鼠中高度同源,体内沉默小鼠Circ CDH13后,可减少DMM诱导的小鼠膝关节软骨破坏,骨赘生成,以及软骨细胞细胞外基质降解及其降解酶的分泌,有效地缓解了DMM诱导的小鼠膝关节骨性关节炎的进展。

王惠,钱冲,郭峰,关超,苏长青,白洪志^[2]（2013）在《实时定量PCR检测技术研究进展》文中进行了进一步梳理传统定量PCR检测方法如内参照法和竞争PCR法,因为在达到平台期后才能对其进行检测,由于PCR扩增已经过了对数期,其检测重复性相对较差。而实时荧光定量PCR技术可直接监测PCR过程中荧光信号的变化,以获得目的区段扩增产物定量的结果,直接可以进行定性分析和定量分析,操作简便无污染。本文通过对实时荧光定量PCR检测技术的原理、分类、方法和应用4个方面阐述实时定量PCR检测技术研究进展。

朱振宗^[3]（2011）在《海藻酸钠复合载体长期扩增培养的软骨细胞生物学稳定性》文中提出背景：近年研究发现在海藻酸钠三维培养体系中软骨细胞存活时间延长,细胞外基质分泌旺盛。目的：探讨海藻酸钠复合载体对体外长期快速增殖培养的软骨细胞生物学稳定性的影响。方法：将兔软骨细胞接种至以海藻酸钠、透明质酸、壳聚糖、纤维连接蛋白、碱性成纤维细胞生长因子为主要成分的复合载体三维培养体系中,以平面培养作为对照。定期观察在两种不同培养体系中软骨细胞形态学改变,细胞生长曲线差异,细胞上清液糖胺多糖含量差异,软骨细胞中表达Ⅱ型胶原、糖胺多糖的差异。结果：软骨细胞在海藻酸钠复合载体中生长良好,生长旺盛,并形成球状细胞团,细胞分裂增殖活跃；培养2d时复合载体培养软骨细胞增殖稍高于平面培养软骨细胞；培养4d时可见复合载体培养软骨细胞增殖明显加快；培养6～14d时复合载体培养的仍保持较稳定增殖,而平面培养的软骨细胞增殖逐渐降低；复合载体细胞外液糖胺多糖含量明显高于平面培养软骨细胞；复合载体培养的软骨细胞表达糖胺多糖及Ⅱ型胶原的量明显高于平面培养软骨细胞。结论：海藻酸钠复合载体可以长期扩殖培养软骨细胞并保持其生物学稳定性。

王蕾^[4]（2010）在《肝细粒棘球蚴周围纤维囊壁形成机制的初步探索》文中研究指明目的：肝包虫侵入人体后,会在人体的肝脏部位形成病灶-包囊。在这个过程中,正常的肝脏组织不断发生细胞调亡、免疫应答等反应,并且在病灶的周围不断出现纤维化的组织结构,即靠近虫体的外囊和靠近肝实质的外膜。本文旨在寻找肝包虫周围纤维囊壁形成的影响因素和影响因子。1.对正常肝脏组织和病旁肝脏组织蛋白质组学的分析,寻找在表达谱上的差异。2.利用生物信息学软件分析SSH文库数据,查找转录组的差异,并对文库进行复制保存。方法：1.通过蛋白质双向电泳,寻找在病旁肝脏组织中差异表达的蛋白；2.利用抑制消减杂交技术,从转录组上,寻找差异基因；3.通过细菌培养等技术,对SSH文库进行复制。4.应用生物信息学软件,处理获得基因序列和蛋白质信息。5.采用RNA斑点杂交技术,对获取的差异基因进行初步验证。结果：1.针对纤维化肝脏组织的特殊性,对肝脏蛋白质各种提取条件的进行了优化,摸索到了提取纤维化肝脏组织的方法,包括裂解蛋白质裂解液的各种成分及浓度、提取条件等。最后确定使用尿素浓度为8M的裂解液来溶解蛋白质,通过间断超声处理核酸,45000g离心力以保证蛋白质组的完整性。2.在进行蛋白质双向电泳时,通过对样品上样量的调节、胶条的选择、水化聚焦条件的优化、凝胶染色方法选择等条件的摸索,寻找到了适合病旁肝脏组织双向电泳的方法和条件。使用了800μg的上样量、pH5-8的预制胶条、80000Vhr聚焦时间、考马斯亮蓝染色,获得了较高质量的双向电泳凝胶图谱。3.用PDQuest软件分析和质谱检测,共获得了72个差异蛋白点,并通过数据库分析,确定42个差异蛋白的名称及分类。这些蛋白主要分为以下几类：物质代谢及能量代谢相关占16%,病灶发生发展相关和免疫相关的各占了13%,次生代谢相关的占10.5%,细胞凋亡及炎症反应相关、物质运输相关各占7.9%,生物合成相关、细胞骨架、耐药性相关、肝脏损伤指示蛋白、信号传导相关各占了5.3%,未知蛋白有7.7%.4.通过Seqman、DNAstar、ESTin等软件分析,将前期构建的SSH文库数据处理后,在NCBI提交67条EST序列,Genebank号为：G0349048-G0349115；并获得了20个基因的不同cDNA序列信息。5.利用细菌培养、文库复制等技术,将构建的cDNA文库进行了复制,减少了操作时,文库被污染的概率。6.通过RNA斑点杂交,共验证了5个差异基因在病旁肝脏组织中的表达情况。其中,P40、P150、细胞色素氧化酶Ⅲ亚基在病旁肝脏组织中高表达；ATP合酶、半胱氨酸蛋白酶在病旁肝脏组织中表达下调。结论：1.通过对差异蛋白质的分析,发现了一部分蛋白质在肝包虫病的发生发展过程中起到一定的作用,如免疫反应相关的蛋白、细胞凋亡及炎症相关蛋白、物质运输相关蛋白等,在病灶发生过程中,都发生了不同程度的表达变化。2.通过抑制差减文库数据分析和RNA斑点杂交,确定了部分差异基因在病旁肝脏组织中的表达情况,并初步判断这些基因可能与肝包虫病发生过程中的炎症反应有关。

曲华正^[5]（2010）在《体外共培养方法诱导兔脂肪干细胞向软骨细胞方向分化的实验研究》文中提出目的由于软骨的组织学特点及其无神经和血管的营养,在正常的生理环境中,关节软骨缺损的修复是很困难的。应用生物相容性聚合物与细胞复合构建组织功能性软骨以及刺激诱导软骨形成都是修复软骨缺损的方法。在软骨再生中,自体软骨细胞是很有用的,但是其作用却受制于终末分化的软骨细胞增殖能力和纤维性软骨形成等因素。因此,在软骨组织工程中,在干细胞的应用方面,开展了许多研究。近来,脂肪源性干细胞（adipose-derived stem cells, ADSCs）因其具有自我更新能力、长时间的细胞生存能力以及多向分化潜能而成为关节透明软骨修复和再生的种子细胞。另外,ADSCs还具有能够在局麻下从身体不同部位大量获取的优势。本实验研究的目的是通过一种创新的脂肪干细胞、软骨细胞和滑膜细胞共培养方法,诱导兔脂肪干细胞向软骨细胞方向分化,通过各项指标的检测,在实践中检验该共培养方法的可行性,并对实验结果进行评价。材料和方法1.取3-4月龄健康新西兰大白兔,3%戊巴比妥耳缘静脉麻醉,无菌取出肾周脂肪组织,I型胶原酶酶解法分离出脂肪源性干细胞（adipose-derived stem cells, ADSCs）,进行体外原代培养,传代后差速贴壁培养纯化。流式细胞仪鉴定细胞表面标志CD49d,CD105,CD34,CD106的表达。2.无菌切取3-4月龄新西兰大白兔膝关节非负重区关节软骨及关节内滑膜,将软骨剪成1—3mm3薄片,先以0.25%胰蛋白酶消化30-35分钟,再以0.1%的Ⅱ型胶原酶消化6-8小时,过滤、离心收集、计数,以2×105个／ml的细胞密度接种于培养瓶内；将滑膜剪碎,4mg／m1Ⅰ型胶原酶消化、过滤、离心收集、计数后,以1×105个／ml的细胞密度接种于细胞培养瓶中。将两种细胞分别体外常规培养与扩增,第三代细胞用于实验。3.取第三代的ADSCs,根据诱导方式不同分为三组：Ⅰ组空白对照组,不加任何诱导；Ⅱ组软骨细胞诱导组滴加软骨细胞诱导液（组成：TGF-β1 10n g／ml、bFGF-25ng／ml、Vc 50μg/ml、Dexamethasone10-7M／L）；Ⅲ组共培养组取35mm×10mm培养皿培养的第三代脂肪干细胞、软骨细胞和滑膜细胞,将三个皿放入一个200mm×20mm培养皿中,成“品”字形摆放,在大皿中加入培养基（加10%胎牛血清）培养。收集三组中的脂肪干细胞,提取mRNA,反转录酶-聚合酶链锁反应（RT-PCR）产物电泳及荧光定量PCR检测SOX-9、Aggrecan、TypeⅡcollagen的表达。结果1.细胞形态学改变倒置相差显微镜观察发现,原代细胞接种后24小时可见少量细胞贴壁,呈短梭形。48小时后多数细胞已贴壁并开始伸展,分裂,出现由单个细胞分裂形成的集落。换液2-3次之后,大多数漂浮细胞被清除。5-7天后,细胞逐渐分裂、增殖,形成多个细胞克隆。传代细胞贴壁快,7-8天形成单层,细胞核大,胞浆内颗粒多,呈平行或漩涡状生长。2.ADSCs免疫表型流式测定流式细胞学分析显示,CD49d和CD105均呈阳性表达,CD34和CD106均呈阴性表达。3.RT-PCR电泳及荧光定量PCR检测：在分组培养后的第7天和第14天,三个目的基因中只有SOX-9、Aggrecan表达,第21天,三个目的基因都有表达。共培养组SOX-9和TypeⅡcollagen的表达水平均高于诱导组,且有统计学差异；两组在Aggrecan的表达水平上无统计学差异。结论1.ADSCs适合成为软骨组织工程的种子细胞。取材方便,Ⅰ型胶原酶酶解法分离可以获取大量脂肪干细胞,体外培养性能稳定,易于传代扩增,在体外增殖多代之后仍具有完好的细胞特异性标志,并继续保持分化的能力。2.软骨细胞和滑膜细胞可分泌多种生长因子如：转化生长因子TGF-β、胰岛素样生长因子IGF等。这些因子是公认的间充质干细胞（MSCs）软骨分化诱导因子,这些可溶性因子可能在ADSCs软骨形成过程中发挥了重要作用。3.本实验所采用的脂肪干细胞、软骨细胞和滑膜细胞共培养方法,可以使软骨细胞和滑膜细胞分泌的多种生长因子对ADSCs进行诱导,使其向软骨细胞方向分化,并具有软骨细胞表型,诱导效果优于外源性转化生长因子TGF-β的诱导。

李连华^[6]（2006）在《注射重组转化生长因子-β1和胰岛素样生长因子-1基因治疗骨关节炎的实验研究》文中提出研究背景 骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是中老年人最常见的关节疾患之一，主要表现为关节软骨退变、磨损，骨质增生，导致关节肿胀、疼痛、畸形和功能障碍等，严重影响人们的日常生活。骨关节炎的最基本的病理改变是关节软骨的损伤退变，包括软骨细胞和软骨基质的改变。在骨关节炎的发病机制中，细胞因子占重要的地位。细胞因子可分为保护性细胞因子和破坏性细胞因子，起保护性作用的细胞因子主要有转化生长因子-β（Transforming growthfactor-β，TGF-β）、胰岛素样生长因子（Insuline-like growth factor，IGF）等多肽类生长因子，它们可激活软骨细胞合成软骨基质的能力，对软骨的合成起着至关重要的作用，而且还可通过复杂信号传导机制，抑制IL-1和TNF-α等破坏性因子对关节软骨的破坏作用。这些细胞因子经常联合作用于软骨，维持关节软骨基质的代谢平衡。在骨关节炎病变软骨中，TGF-β和IGF等保护性细胞因子表达明显降低。关节腔内注射保护性细胞因子可修复病损的关节软骨已经为实验所证实。但由于细胞因子代谢半衰期短，直接关节腔内注射需要费用高，剂量不容易调控。通过基因治疗，将保护性细胞因子TGF-β1和IGF-1等基因转入宿主体内，是治疗骨关节炎的一个重要研究方向。 研究目的 通过建立骨关节炎动物模型，进行下列观察： 1．观察单基因、多基因体外转染软骨细胞的效果； 2．观察单基因、多基因体内转染对骨关节炎模型的治疗效果； 3．观察转基因后的软骨细胞移植对骨关节炎模型的治疗效果。 研究方法 1．关节模型的制作：39只新西兰兔，雌雄不限，体重约3kg，随机分为空白对照、增龄对照、固定3周、固定5周和固定8周共5组，将固定组新西兰兔

操海萍^[7]（2004）在《核心蛋白聚糖（decorin）在肿瘤组织中的表达及基因重组decorin的克隆与表达的研究》文中指出核心蛋白聚糖（decorin）是细胞外基质的组成成分，属于蛋白聚糖的一种，是SLRPs家族成员之一。它可抑制胶原纤维形成，参与调控细胞增殖、粘附。近年研究发现decorin可抑制细胞增殖，具有潜在抗肿瘤治疗应用前景。大量研究显示decorin可抑制各种组织来源的肿瘤细胞的增殖，在体内外均可抑制肿瘤细胞生长。Decorin基因转染的肿瘤细胞在重度免疫缺陷小鼠体内不能形成肿瘤。国内外研究资料显示，Decorin基因及蛋白分子在不同肿瘤组织中表达是多样化的。关于decorin抗肿瘤作用机制国外也进行了一些研究，目前认为其抗肿瘤作用机制主要为：（1）Decorin是TGF－?的天然抑制剂，可能通过抑制TGF－?的生物学活性，进而抑制肿瘤的发生及转移。（2）Decorin可激活内皮细胞生长因子受体（EGFR）,使其形成二聚体而发生自身磷酸化，引起丝裂原激活蛋白激酶（MAP）激活，导致细胞内钙离子增多，从而上调强效抑制性细胞周期蛋白p21，最终导致细胞生长抑制。（3）Decorin可能通过抑制肿瘤血管生成而发挥抗肿瘤作用。（4）Decorin可与细胞外基质中的其他分子相互作用，影响细胞间粘附及迁移，可能对肿瘤发生、发展具有一定作用。目前国内尚无联合研究decorin mRNA及蛋白分子在肿瘤组织中表达的报道，尚未进行基因重组人decorin在真核细胞中表达的研究。本实<WP=86>验从基因转录和翻译水平研究了decorin在乳腺癌和结直肠癌中的表达，并采用基因工程技术进行rhdecorin表达的研究，进一步探讨rhdecorin对肿瘤细胞的作用。研究取得如下进展：1、Decorin mRNA在乳腺癌和结直肠癌中的表达本实验采用原位杂交技术，分别检测decorin mRNA在25例乳腺癌、9例相对正常乳腺、10例结直肠癌、9例相对正常大肠组织中的表达。实验结果显示：乳腺癌癌细胞中可见decorin mRNA表达，阳性信号定位于胞浆和（或）胞核内，呈黄色，乳腺癌癌细胞内decorin mRNA表达总阳性率为88％（22／25）。远离乳腺癌的相对正常乳腺腺细胞内无decorin mRNA表达，其差别具有非常显着性（P<0.01）。统计分析结果显示在不同病理类型的乳腺癌中decorin mRNA表达阳性率的差别无显着性（P>0.05）。结直肠癌癌细胞及相对正常大肠腺细胞内均可见decorin mRNA表达，其差别无显着性（P>0.05）。实验结果提示decorin mRNA在不同肿瘤组织中表达不同。2、Decorin蛋白分子在乳腺癌和结直肠癌中的表达实验采用免疫组织化学方法分别检测decorin蛋白分子在38例乳腺癌、9例相对正常乳腺、10例结直肠癌、9例相对正常大肠组织中的表达。研究发现decorin蛋白分子主要表达于乳腺癌癌细胞胞浆内，相对正常乳腺腺细胞内未见decorin蛋白分子阳性表达，Decorin蛋白分子在乳腺癌癌细胞中表达阳性率高于相对正常乳腺腺细胞，其差别具有非常显着性（P<0.01）。统计分析结果显示，在各种不同病理类型的乳腺癌中，Decorin蛋白分子表达阳性率差别无统计学意义（P>0.05）。Decorin蛋白分子在乳腺癌间质及相对正常乳腺组织中均有大量表达，紧邻乳腺癌的间质中decorin蛋白表达较相对正常乳腺腺体周围间质高，其差别具有非常显着性（P<0.01）。在10例结直肠癌，9例相对正常大肠标本中，均未见结直肠癌癌细胞及相对正常大肠腺细胞内有decorin蛋白表达。实验结果表明decorin蛋白在不同肿瘤组织中的表达是多样化的。 <WP=87>3、rhdecorin表达载体的构建PCR方法从质粒中调取人decorin基因全长，将decorin基因定向克隆至表达载体pcDNA3.1，成功构建基因重组真核表达载体pcDNA-dec。经酶切鉴定、DNA序列分析，结果表明重组真核表达载体pcDNA-dec中插入的目的基因与文献报道人decorin基因顺序基本相同。这表明rhdecorin表达载体已成功构建。4、rhdecorin在CHO细胞中的表达脂质体介导的重组真核表达载体pcDNA-dec稳定转染CHO细胞，经G418筛选两个半月，建立稳定转染decorin的CHO细胞株。对稳定转染的细胞进行免疫组织化学检测，发现在稳定转染的细胞胞浆内有decorin蛋白表达。5、rhdecorin转染HCT／8细胞及其对HCT／8细胞作用的研究脂质体介导的基因重组真核表达载体pcDNA-dec稳定转染HCT／8细胞，经G418筛选近两个月，建立稳定转染decorin的HCT／8细胞株。对稳定转染的细胞进行免疫组织化学检测，发现在稳定转染的细胞胞浆内有decorin蛋白的表达。采用MTT法检测稳定转染肿瘤细胞增殖活力，发现稳定转染decorin基因的HCT／8细胞生长受抑制。未发现稳定转染decorin基因影响HCT／8细胞的细胞周期及诱导HCT／8细胞凋亡。本研究结果提示decorin在不同组织来源的肿瘤细胞中表达是不同的，同时肿瘤间质细胞可大量表达decorin，推测decorin在肿瘤发生、发展中的作用比较复杂。Decorin基因转染可抑制肿瘤细胞HCT／8细胞的生长，这证明decorin具有抑制肿瘤细胞增殖的能力，其作用机制尚需进一步研究。实验成功地进行了基因重组人decorin在CHO细胞中的表达，为进一步研究decorin的生物学功能及其在肿瘤发生发展中的作用奠定基础。

陆峻泓,李卿,刘伟,吴娟娟,刘德莉,曹谊林^[8]（2003）在《人软骨蛋白聚糖Northern杂交探针的构建及其应用》文中进行了进一步梳理目的 构建人软骨蛋白聚糖 （aggrecan）探针 ,应用于整复外科研究中Northern法对aggrecanmRNA表达水平的检测。 方法 取人软骨细胞 ,逆转录 多聚酶链反应 （RT PCR ）扩增ag grecan球间区域 （IGD）片段。将纯化的RT PCR产物构建入 pUCm T载体 ,酶切及测序鉴定。32 P标记aggrecan探针 ,Northern杂交法检测人软骨组织和培养软骨细胞 （各 3组 ）以及人正常和瘢痕疙瘩成纤维细胞 （各 6组 ）中aggrecanmRNA的表达。 结果 构建产物经鉴定 ,显示其包含了人ag grecanIGD的基因序列 ,与GeneBank已收录序列 （M 5 5 172 ） 10 0 %相同。Northern结果显示 ,该探针可用于aggrecanmRNA表达水平的定性和定量检测。对正常人软骨组织和体外培养人软骨细胞的aggrecan β actin的吸光度比值进行比较 ,发现其间 （ 0 .5 75 6± 0 .0 15 2 1.36 90± 0 .0 2 0 6 ）差异具有显着性 （P <0 .0 1）。结论 Northern杂交法可以对整复外科研究中常见的软骨和瘢痕疙瘩成纤维细胞中aggrecanmRNA的表达水平进行检测 ,且具有较好的灵敏度和特异性。

二、人软骨蛋白聚糖Northern杂交探针的构建及其应用（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、人软骨蛋白聚糖Northern杂交探针的构建及其应用（论文提纲范文）

（1）环状RNA CircCDH13对microRNA的调控在骨性关节炎中的作用及其机制研究（论文提纲范文）

（2）实时定量PCR检测技术研究进展（论文提纲范文）

（3）海藻酸钠复合载体长期扩增培养的软骨细胞生物学稳定性（论文提纲范文）

（4）肝细粒棘球蚴周围纤维囊壁形成机制的初步探索（论文提纲范文）

（5）体外共培养方法诱导兔脂肪干细胞向软骨细胞方向分化的实验研究（论文提纲范文）

（6）注射重组转化生长因子-β1和胰岛素样生长因子-1基因治疗骨关节炎的实验研究（论文提纲范文）

（7）核心蛋白聚糖（decorin）在肿瘤组织中的表达及基因重组decorin的克隆与表达的研究（论文提纲范文）

四、人软骨蛋白聚糖Northern杂交探针的构建及其应用（论文参考文献）

• [1]环状RNA CircCDH13对microRNA的调控在骨性关节炎中的作用及其机制研究[D]. 周志斌. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
• [2]实时定量PCR检测技术研究进展[J]. 王惠,钱冲,郭峰,关超,苏长青,白洪志. 种子, 2013(06)
• [3]海藻酸钠复合载体长期扩增培养的软骨细胞生物学稳定性[D]. 朱振宗. 暨南大学, 2011(10)
• [4]肝细粒棘球蚴周围纤维囊壁形成机制的初步探索[D]. 王蕾. 石河子大学, 2010(03)
• [5]体外共培养方法诱导兔脂肪干细胞向软骨细胞方向分化的实验研究[D]. 曲华正. 山东大学, 2010(08)
• [6]注射重组转化生长因子-β1和胰岛素样生长因子-1基因治疗骨关节炎的实验研究[D]. 李连华. 中国协和医科大学, 2006(11)
• [7]核心蛋白聚糖（decorin）在肿瘤组织中的表达及基因重组decorin的克隆与表达的研究[D]. 操海萍. 吉林大学, 2004(04)
• [8]人软骨蛋白聚糖Northern杂交探针的构建及其应用[J]. 陆峻泓,李卿,刘伟,吴娟娟,刘德莉,曹谊林. 中华实验外科杂志, 2003(01)

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