一、Nitric oxide produced by cumulus cells stimulates maturation of mouse oocytes（论文文献综述）
段家昕[1]（2021）在《雌激素对猪卵母细胞自噬的作用及调控》文中认为卵母细胞在减数分裂过程中需要不断积累所需营养物质为成熟及胚胎发育作准备。雌激素作为一种重要的生殖激素,在卵母细胞成熟发育过程中起到不可替代的作用。已有证据表明,自噬（Autophagy）作为一种细胞生存机制,在体细胞及颗粒细胞的氧化应激、细胞凋亡及衰老等方面具有重要作用,而有关自噬与卵母细胞发育的研究较少,在此过程中雌激素与自噬之间的联系更是不明确。基于此,本研究利用小分子抑制剂、免疫组织化学、细胞免疫荧光和Western blot等技术与方法,解析自噬在雌激素调控下对卵母细胞成熟和胚胎发育的作用;揭示雌激素对卵母细胞自噬的影响;明确雌激素介导的自噬对成熟卵母细胞氧化应激和早期凋亡的机制;掌握雌激素参与自噬调控的细胞间隙连接通讯的作用途径;探究雌激素受体对自噬的分子途径。以期系统阐明雌激素与自噬对卵母细胞成熟发育的联合调控作用机制,为提高猪卵母细胞质量、增加成熟卵母细胞的胚胎发育能力提供科学依据。本研究获得的主要结果和结论如下:1.在卵母细胞体外成熟过程中添加0.1μM和1μM的17β-雌二醇,成熟率均显着提高（P<0.05）,并且在1μM的17β-雌二醇处理下,成熟率以时间依赖性的方式逐渐上升;自噬主要在猪卵母细胞、卵丘细胞和颗粒细胞中发生;在用自噬抑制剂Autophinib对自噬抑制的过程中,卵母细胞成熟率以剂量依赖的方式下降,通过添加17β-雌二醇可以缓解成熟率下降的趋势;用Autophinib抑制自噬的过程中,卵母细胞的卵裂率也以Autophinib的剂量依赖的方式下降,通过添加17β-雌二醇可以缓解卵裂率以及囊胚率下降的趋势（P<0.05）。这些结果表明,雌激素可以介导自噬参与的卵母细胞成熟以及胚胎发育。2.17β-雌二醇处理后的MII期卵母细胞中,自噬降解蛋白SQSTM1的表达低于空白对照（P<0.05）;在卵母细胞体外成熟早期,17β-雌二醇可以提高自噬标志蛋白LC3-II的表达（P<0.05）,并使SQSTM1的表达处于较低的水平,这些结果表明雌激素促进卵母细胞自噬的发生;用自噬抑制剂Autophinib处理成熟卵母细胞后,LC3-II蛋白的表达以剂量依赖的方式下降,证明Autophinib可以有效抑制猪卵母细胞的自噬;在猪卵母细胞中,17β-雌二醇可以显着提高Autophinib抑制的自噬（P<0.05）。这些发现证明了雌激素参与卵母细胞成熟过程中的自噬反应。3.自噬的抑制导致成熟卵母细胞出现更高ROS水平（P<0.01）和异常线粒体分布（P<0.05）,17β-雌二醇的处理与自噬抑制剂Autophinib处理相比,不仅ROS的水平较低（P<0.01）,而且线粒体的分布更加均匀（P<0.01）,在17β-雌二醇加入自噬抑制剂Autophinib组处理后,可以显着降低ROS的水平（P<0.05）,并且可以修复线粒体的异常分布（P<0.05）。17β-雌二醇处理的成熟卵母细胞内游离Ca2+的含量较低,而自噬抑制剂Autophinib处理后没有显着变化,当共同处理后的Ca2+的含量显着上升（P<0.05）。这些证据说明成熟卵母细胞中雌激素可以降低由自噬抑制导致的氧化应激作用,这一作用可能依赖于上调线粒体的正常分布和Ca2+的含量。通过早期细胞凋亡分析发现,抑制自噬增加了成熟卵母细胞的凋亡率（P<0.01）,这个作用可以被17β-雌二醇显着下调（P<0.05）;伴随着自噬的抑制,成熟卵母细胞中线粒体的功能发生障碍（P<0.01）,而17β-雌二醇具有线粒体功能修复的作用,可以显着改善由自噬抑制导致的线粒体功能障碍;进一步研究揭示,自噬抑制导致的凋亡率上升可能是通过激活caspase-8进而增加caspase-3的裂解所导致（P<0.05）,而17β-雌二醇虽然也可以激活caspase-8（P<0.05）,但对caspase-3的裂解能力显着抑制（P<0.05）,从而进一步降低由自噬抑制介导的caspase-3活性（P<0.05）。这些结果证明17β-雌二醇通过介导凋亡相关蛋白和修复线粒体功能紊乱,从而降低自噬抑制引起的卵母细胞的凋亡。4.在猪卵母细胞成熟过程中,卵丘-卵母细胞的间隙连接细胞通讯（gap junctional intercellular communication,GJICs）以时间依赖的方式降低。17β-雌二醇在体外成熟早期可以显着降低间隙连接通讯（P<0.05）,而自噬的抑制可以显着提高间隙连接（P<0.01）,此外,17β-雌二醇可以下调自噬抑制介导的间隙连接（P<0.05）;通过分析卵丘-卵母细胞亚细胞结构,发现结果与间隙连接一致,即抑制自噬可以显着提高跨带突触（Transzonal projections,TZPs）的数量（P<0.01）,这一过程被17β-雌二醇下调（P<0.05）。进一步研究发现,17β-雌二醇不仅下调连接蛋白Cx43的磷酸化水平（P<0.05）,同时也可以降低自噬抑制导致的Cx43磷酸化修饰（P<0.05）。这些结果说明雌激素下调自噬抑制的猪卵丘-卵母细胞间隙连接通讯可能依赖于下调Cx43的磷酸化修饰。5.GPR30是雌激素位于质膜上的新型受体,在猪卵母细胞体外成熟期间以时间依赖的方式下降,而17β-雌二醇可以保持GPR30在体外成熟过程中的高表达。使用G15（GPR30特异性抑制剂）处理后,完全消除了17β-雌二醇对核成熟的促进作用（P<0.05）。GPR30的失活可以下调17β-雌二醇对MEK1/2和ERK1/2的磷酸化水平（P<0.05）,这表明GPR30通过MEK/ERK通路对猪卵母细胞进行调控。进一步分析显示,MEK1/2和ERK1/2的失活可以促进SQSTM1的表达（P<0.05）,并且通过降低LC3-II的水平来抑制自噬（P<0.05）。这些结果揭示了由17β-雌二醇诱导的GPR30通过MEK/ERK信号通路促进自噬的发生,从而促进猪卵母细胞成熟。综上所述,17β-雌二醇与猪卵母细胞自噬的发生密切相关,17β-雌二醇可以促进猪卵母细胞的自噬,添加适当浓度可以提高卵母细胞成熟和早期胚胎的发育能力,降低由自噬抑制剂Autophinib导致的ROS水平升高和早期凋亡的发生,并且下调猪卵母细胞成熟早期的间隙连接细胞通讯。17β-雌二醇对猪卵母细胞自噬的促进作用可能是通过GPR30/MEK/ERK途径进行,从而促进了卵母细胞的成熟。这些发现可以为猪卵泡闭锁调控机理研究提供新的理论依据。
李瑞哲[2]（2021）在《低氧对牦牛卵母细胞体外成熟和发育能力的影响及其作用机制》文中提出牦牛（Bos grunniens）是青藏高原及其毗邻地区的特色畜种,对当地农牧民的生产生活具有重要的意义,被誉为“高原之舟”。牦牛繁殖的季节性明显,繁殖效率较低,严重制约了产业发展。利用胚胎体外生产等现代繁殖生物技术,能够提升牦牛的繁殖潜力,是提高牦牛产业效率的途径之一。卵母细胞是现代繁殖生物技术的基础材料,卵母细胞质量影响着后续胚胎质量。在人、牛、山羊和小鼠等物种上的研究表明,体外成熟过程中氧分压影响卵母细胞的质量和发育能力,而在牦牛上相关研究还较少。为此,本研究在分析不同氧分压和抗氧化剂对牦牛卵母细胞体外成熟和发育能力影响的基础上,分别从卵母细胞和卵丘细胞转录组层面探讨了低氧影响牦牛卵母细胞体外成熟和发育能力的机制。主要研究结果如下:1.不同氧分压对牦牛卵母细胞体外成熟和发育能力的影响研究了5%和20%O2对牦牛卵母细胞体外成熟率,卵母细胞ROS水平和GSH含量,孤雌胚胎和体外受精（IVF）胚胎发育的影响。结果表明:5%O2提高了卵母细胞体外成熟率（P<0.05）和GSH含量（P<0.05）,降低了卵母细胞ROS水平（P<0.01）,提高了孤雌囊胚和IVF囊胚质量。2.不同抗氧化剂对牦牛卵母细胞体外成熟和发育能力的影响研究了卵母细胞成熟液中添加半胱胺、褪黑素、白藜芦醇和维生素C对牦牛卵母细胞体外成熟率,卵母细胞ROS水平、GSH含量和线粒体分布,以及IVF胚胎发育的影响。结果表明:（1）半胱胺提高了卵母细胞GSH含量（P<0.05）;（2）褪黑素提高了卵母细胞的成熟率（P<0.05）、GSH含量（P<0.05）、线粒体均质分布比例（P<0.05）和IVF胚胎卵裂率（P<0.05）,降低了卵母细胞ROS水平（P<0.05）;（3）白藜芦醇和维生素C均提高了卵母细胞GSH含量（P<0.05）和降低了卵母细胞ROS水平（P<0.05）。3.不同氧分压对牦牛卵母细胞转录组的影响对5%和20%O2成熟培养的牦牛MⅡ期卵母细胞,分别进行单细胞转录组测序。鉴定出120个差异表达基因,其中37个基因在5%O2组上调,主要参与缺氧反应、细胞周期/细胞分裂、染色质构象与重塑和细胞骨架,83个基因在5%O2组下调,主要参与能量代谢、蛋白合成、氧化还原平衡和卵丘细胞调控。GO分析表明:上调基因（5%O2 vs 20%O2,下同）富集于核质、以DNA为模板的正向转录调控、ERK1和ERK2级联反应等7个条目;下调基因（5%O2 vs 20%O2,下同）富集于线粒体、线粒体呼吸链复合体Ⅰ、胞浆大核糖体亚单位和外泌体等7个条目等。KEGG分析表明:上调基因富集于缺氧诱导因子-1信号转导、神经营养因子信号转导、粘附斑、微丝细胞骨架调控和PI3K-Akt信号转导等11个通路;下调基因富集于氧化磷酸化等4个通路。4.不同氧分压对牦牛卵丘细胞转录组的影响对5%和20%O2成熟培养的牦牛COCs,分别收集卵丘细胞,进行转录组测序。鉴定出270个差异表达基因,其中229个基因在5%O2组上调,主要参与缺氧反应、糖酵解、免疫/炎性反应和细胞凋亡,41个基因在5%O2组下调,主要参与抗凋亡和抗炎。GO分析表明:上调基因富集于缺氧反应、糖酵解过程、ATP代谢过程、炎症反应等26个条目;下调基因富集于蛋白同二聚化活性和受体结合2个条目。KEGG分析表明:上调基因富集于神经活性配体-受体互作、c AMP信号通路、糖酵解/糖异生等9个通路;下调基因没有得到富集。本研究分析了不同氧分压和抗氧化剂对牦牛卵母细胞体外成熟和发育能力的影响及不同氧分压对牦牛卵母细胞和卵丘细胞转录组的影响,得出以下结论:与20%O2培养相比,5%O2培养时牦牛卵母细胞受到的氧化应激减少,卵丘细胞向卵母细胞提供能量代谢底物的能力增强,有利于牦牛卵母细胞的体外成熟和早期胚胎发育。研究结果为继续深入研究氧分压对牦牛卵母细胞成熟、发育能力及卵丘细胞-卵母细胞互作的影响及其作用机制提供了参考数据。
赵勇超[3]（2021）在《绵羊卵泡中NPPC/NPR2的表达及其影响因素的研究》文中研究表明卵母细胞体外成熟过程中,核质成熟不同步的问题亟待解决,C型利钠肽（C-type natriuretic peptide,NPPC）作为内源性减数分裂抑制剂备受关注,在卵母细胞体外成熟过程中,激素和转化生长因子9（Growth Differentiation Factor,GDF9）是主要的促成熟因子。但是,关于激素和GDF9对绵羊卵泡中NPPC/NPR2的影响目前还不是很清楚。本实验研究了不同直径卵泡中NPPC和利钠肽受体2（Natriuretic peptide receptor2,NPR2）的表达模式,促卵泡激素（Follicle Stimulating Formone,FSH）和GDF9对颗粒细胞中NPPC/NPR2表达模式的影响,并进一步探究了不同激素对NPPC抑制绵羊卵母细胞减数分裂的影响。结果如下:1.不同直径卵泡中NPPC和NPR2的表达模式。利用RT-PCR检测了不同直径（小腔≤2mm、2mm<中腔≤6mm、大腔>6mm）卵泡壁层颗粒细胞（MGCs）和卵丘细胞（CCs）中NPPC及NPR2基因表达量,Western blot检测细胞中NPR2蛋白表达量。结果显示:在不同直径卵泡中,NPPC基因在中腔卵泡的MGCs和CCs表达显着高于小腔和大腔卵泡（P<0.05）,且在大腔卵泡CCs中未检测到NPPC基因表达;NPR2基因和蛋白在中腔卵泡的MGCs和CCs表达显着高于小腔和大腔卵泡（P<0.05）。2.FSH与GDF9对体外培养的MGCs和CCs中NPPC及NPR2表达的影响。与未培养的MGCs（对照组）相比,体外培养的MGCs中NPPC mRNA及蛋白水平极显着下降（P<0.01）;FSH在一定程度上可显着提高体外培养的MGCs中NPPC mRNA及蛋白水平（P<0.05）,但仍显着低于对照组（P<0.05）,GDF9可极显着提高FSH诱导的MGCs中NPPC mRNA及蛋白水平（P<0.01）。体外培养的MGCs中NPR2mRNA及蛋白水平显着下降（P<0.05）;FSH在一定程度上可显着提高MGCs中NPR2mRNA及蛋白表达水平（P<0.05）,但GDF9对FSH诱导的MGCs中NPR2 mRNA及蛋白表达无影响。与未培养的CCs（对照组）相比,体外培养的CCs中NPPC mRNA及蛋白水平极显着下降（P<0.01）;FSH可以极显着提高体外培养CCs中NPPC mRNA及蛋白水平（P<0.01）,而GDF9明显抑制了FSH的这种促进作用（P<0.05）。体外培养的CCs中NPR2 mRNA及蛋白表达水平显着上升（P<0.05）,FSH在在一定程度上可显着提高CCs中NPR2 mRNA及蛋白表达水平（P<0.05）,而GDF9显着降低CCs中NPR2 mRNA及蛋白表达水平（P<0.05）。3.激素对NPPC诱导的绵羊卵母细胞减数分裂阻滞的影响。以常规成熟液（对照组）、NPPC 200 n M液（阳性对照组）、NPPC（200 n M）+FSH（10、20、30 ug/m L）、NPPC（200 n M）+LH（10、50 ug/m L）和NPPC（200 n M）+E2（0.5、1 ug/m L）预孵育绵羊卵母细胞4h、6h、8h,经免疫荧光染色进行核相分析。结果发现,200 n M NPPC对减数分裂阻滞作用时间可持续6 h（P<0.05）,0.5和1 ug/m L E2可显着促进NPPC诱导的绵羊卵母细胞减数分裂阻滞（P<0.05）,而FSH和LH对NPPC诱导的绵羊卵母细胞减数分裂阻滞没有明显的互作效应。综上表明:NPPC与NPR2均在绵羊小腔卵泡开始表达,在小、中、大腔卵泡中的表达依次为先升高后降低趋势;体外培养的颗粒细胞实验中,FSH可促进MGCs和CCs中NPPC与NPR2 mRNA及蛋白的表达,GDF9能促进FSH诱导的MGCs中NPPC mRNA及蛋白的表达,但抑制FSH诱导的CCs中NPPC和NPR2 mRNA及蛋白的表达;E2可显着增强NPPC诱导的绵羊卵母细胞减数分裂阻滞。本研究结果为进一步阐明NPPC在体外成熟中的作用机制提供理论依据。
罗晓彤[4]（2021）在《猪卵母细胞成熟前后卵丘细胞转录组及相关基因的研究》文中研究指明为了了解猪卵母细胞成熟前后卵丘细胞转录组的差异,本研究在前期预实验比较正常卵巢和异常卵巢中脂质代谢相关基因的基础上,收集了生发泡期（GV期）和第二次减数分裂中期（MⅡ）卵母细胞周围的卵丘细胞,采用RNA测序技术比较了两个阶段m RNA和micro RNA转录本的差异,对差异候选基因进行了生物信息学分析和体外验证,探索了骨形态蛋白2（BMP2）、ssc-mi R-101、ssc-mi R-155-5p在卵丘细胞扩散中所起的作用。具体研究结果如下:1.为了研究正常卵巢和囊肿卵巢中脂类代谢相关基因的表达,分别收集卵巢组织、颗粒细胞、卵母细胞,运用实时荧光定量PCR技术对脂肪代谢相关基因的表达进行比较。结果显示;囊肿卵巢组织中FABP3和CPT1表达水平显着高于正常卵巢组织,囊肿卵巢组颗粒细胞中FABP3表达水平极显着高于正常卵巢组;囊肿卵巢卵母细胞中CPT1、FABP4的表达极显着高于正常卵巢GV期和MⅡ期卵母细胞。2.通过RNA-Seq技术对GV期和MⅡ卵母细胞周围的卵丘细胞进行编码转录本测序,对候选基因进行了验证,进而在成熟培养液中添加不同浓度的BMP2,检测卵母细胞成熟效果。结果显示:与MⅡ期卵母细胞周围卵丘细胞相比,GV期卵母细胞周围的卵丘细胞中存在3 789个差异表达基因,其中2 085个上调基因,1 704个下调基因;采用q PCR对候选差异表达基因HAS、PTX3、TNFAIP6、CPT1、CD36、BMP2、FOXO1进行验证,结果与RNA-Seq的结果变化趋势基本一致;在成熟培养液中添加50 ng/ml的BMP2可显着促进卵母细胞的成熟,显着提高了卵母细胞中成熟促进因子MPF的转录水平,但添加100 ng/ml的BMP2反而抑制了卵母细胞的体外成熟;在缺乏卵泡液的条件下,50 ng/ml的BMP2可促进卵母细胞的成熟和成熟24 h时卵母细胞中MPF的转录,显示BMP2与卵泡液可能存在一定的拮抗作用。3.通过RNA-Seq技术对GV期和MⅡ卵母细胞周围的卵丘细胞进行micro RNA测序,在对部分候选mi RNA进行验证后,选择ssc-mi R-101、ssc-mi R-155-5p为研究对象,利用靶基因预测网站预测其靶基因,采用q RT-PCR、Western blot、荧光素酶报告载体等方法对靶基因进行验证,并对上述两个基因在卵母细胞成熟中的作用进行了研究。结果显示:与MⅡ期卵母细胞周围卵母细胞相比,GV期卵母细胞周围的卵丘细胞中存在40个差异表达micro RNA基因,其中13个上调,27下调基因;采用q PCR对候选差异表达基因ssc-mi R-101、ssc-mi R-130b-5p、ssc-mi R-140-5p、ssc-mi R-155-5p、ssc-mi R-let-7f进行验证,结果与与RNA-Seq的结果变化趋势基本一致;mi RNA靶基因预测网站显示,HAS2和PTGS2基因可能是mi R-101的靶基因,而SOCS1可能是ssc-mi R-155-5p的靶基因;荧光素酶报告载体分析结果表明了预测的准确性。在体外分离培养的卵丘细胞中转染ssc-mi R-101和ssc-mi R-155模拟物可显着抑制预测靶基因的表达,而转染抑制它们的抑制物则促进预测靶基因的表达;利用脂质体介导ssc-mi R-101和ssc-mi R-155-5p模拟物和抑制物转染卵母细胞-卵丘细胞复合体,发现与抑制物相比,模拟物组卵母细胞成熟后卵丘细胞的扩散受到抑制。
何翃闳[5]（2020）在《低氧浓度对牦牛卵母细胞和附植前胚胎发育的影响及其作用机制的研究》文中进行了进一步梳理牦牛对于低氧高寒环境具有较强的适应性,但其体外卵母细胞成熟率和胚胎发育能力较为低下,这严重影响了其体外受精、体细胞克隆等繁殖技术的发展。体外培养系统的气相环境对卵母细胞和早期胚胎的发育起着至关的重要作用,而氧气是体外培养系统气相环境的重要组成部分。然而,目前在国内外尚未见关于低氧浓度对牦牛卵母细胞和附植前胚胎发育影响的报道。本研究旨在探讨不同氧浓度对牦牛卵母细胞成熟和体外受精胚胎发育能力的影响,以及其作用机制的研究,为进一步优化牦牛体外胚胎生产系统提供理论依据。本研究进行了以下试验并取得了一定成果:1.通过观察在不同氧气浓度组（20%、10%、5%和1%O2）成熟的卵丘-卵母细胞复合体（Cumulus-oocyte complexes,COCs）的扩张和第一极体的排出情况,统计不同氧气浓度组牦牛卵母细胞孤雌激活（parthenogenetic activation,PA）后胚胎的卵裂率和囊胚率判断卵母细胞的发育能力,采用实时荧光定量（Quantitative Real-Time PCR,q RT-PCR）和蛋白免疫印迹分析（Western blotting）检测不同氧气浓度下牦牛卵母细胞葡萄糖转运、发育和代谢相关基因和蛋白的表达。结果显示,当氧气浓度为5%时,COCs扩散最好,卵母细胞的成熟率显着高于其他组（p<0.05）,而孤雌激活胚胎的卵裂率显着高于20%O2浓度组和1%O2浓度组（P<0.05）,囊胚率显着高于其他组（P<0.05）;不同氧气浓度组间与卵母细胞发育、抗氧化和代谢能力相关基因及其蛋白的表达有显着差异。结果表明,牦牛卵母细胞体外成熟过程中,5%的氧气浓度可以促进牦牛卵母细胞的成熟,并可显着提高后续孤雌激活胚胎的发育能力。2.通过免疫组织化学法检测HIF-1α和VEGF蛋白在牦牛卵巢中的定位,并采用q RT-PCR、Western blotting、免疫荧光染色法和TUNEL试剂盒分别检测HIF-1α、VEGF、Bax和Bcl-2在不同氧气浓度组COCs（20%、10%、5%和1%O2）中的表达情况以及不同氧气浓度组COCs中的细胞凋亡率。结果显示,HIF-1α蛋白主要定位在卵巢的卵泡颗粒层、卵泡膜、透明带、放射冠和卵巢生殖上皮层中,而VEGF蛋白主要定位在卵巢的卵泡颗粒层和卵泡膜中,在COCs中,其表达主要位于卵母细胞中,在卵丘细胞中表达较弱;随着氧气浓度的降低,HIF-1α和VEGF的表达均呈现先升高后降低的趋势,在5%氧气浓度下达到最高,显着高于其他组（P?0.05）;在5%氧气浓度下促凋亡因子Bax的表达水平均显着低于其他组（P<0.05）,而抗凋亡因子Bcl-2的表达水平均显着高于其他组（P<0.05）,其细胞凋亡率显着低于其他组（P?0.05）。结果表明,牦牛卵母细胞体外成熟过程中,5%氧气浓度可能通过HIF-1α介导VEGF的表达抑制了COCs的细胞凋亡,促进了卵母细胞的发育。3.将5%氧气浓度组中成熟的COCs分别在不同氧气浓度（20%、10%、5%和1%O2）下进行体外受精,观察不同氧气浓度对体外受精胚胎的卵裂率、囊胚率、囊胚孵化率和总细胞数来判断低氧浓度对胚胎发育能力的影响;此外,我们采用q RT-PCR、免疫荧光染色法和TUNEL试剂盒分别检测了胚胎发育相关基因的表达和细胞凋亡率。结果显示,在5%O2浓度组中,胚胎的卵裂率显着低于20%O2浓度组和10%O2浓度组（P<0.05）,显着高于1%O2浓度组（P<0.05）,而囊胚率、囊胚中的细胞总数、内细胞团细胞数、滋养层细胞数、ICM/TE的比例以及细胞凋亡率均显着高于其他组（P<0.05）;在5%O2浓度下,囊胚中CDX2、POU5F1、SOX2和NANOG基因的m RNA转录水平显着高于其他组（P<0.05）,促凋亡基因Bax的转录水平显着降低（P<0.05）,而抗凋亡因子Bcl-2的转录水平显着升高（P<0.05）。结果表明,在牦牛体外受精胚胎发育过程中,5%的氧气浓度降低了胚胎的卵裂率,但显着提高了胚胎的囊胚率,增强了附植前牦牛胚胎的发育能力并抑制了其细胞凋亡。4.通过q RT-PCR和免疫荧光染色法检测p38 MAPK与HIF-1α在常氧浓度（20%O2）和低氧浓度（5%O2）下体外受精胚胎不同阶段发育中的表达和定位。结果显示,在常氧浓度和低氧气浓度下,随着体外受精胚胎的发育,HIF-1α和p38 MAPK的表达呈先升高后降低的趋势,在8细胞中均达到最高（P<0.05）,而在囊胚期均为最低（P<0.05）;HIF-1α在各阶段胚胎中的表达差异均显着（P<0.05）,而p38 MAPK在2细胞到8细胞阶段表达差异不显着（P>0.05）,但在桑椹胚和囊胚阶段中表达差异显着（P<0.05）;在常氧浓度下,在2细胞到囊胚阶段,HIF-1α蛋白主要表达于胚胎的细胞质中,在囊胚中的表达非常弱,而p38MAPK蛋白表达于胚胎的细胞质和细胞核中,在细胞质中表达更为明显;在低氧浓度下,在2细胞到桑椹胚阶段,HIF-1α蛋白主要表达于胚胎的细胞质中,在囊胚阶段,HIF-1α蛋白在细胞质和细胞核中均有表达,而且在细胞核中表达明显,而p38 MAPK蛋白主要表达于胚胎的细胞质和细胞核中,在2细胞到桑椹胚阶段,细胞质中表达更为明显,而在囊胚阶段,细胞核中表达更为明显。结果表明5%氧气浓度下HIF-1α蛋白在囊胚中转入细胞核表达,推测5%氧气浓度可能通过p38 MAPK基因调控HIF-1α基因的表达,提高了囊胚率,进一步改善了附植前胚胎的发育。本研究表明5%的氧气浓度有利于牦牛卵母细胞的体外成熟,增强了牦牛附植前体外受精胚胎的发育能力,为进一步探讨牦牛卵母细胞体外成熟环境及建立牦牛体外胚胎生产系统提供了理论依据。
蔡姣,王芳[6]（2020）在《促黄体生成素诱导卵巢排卵的调控》文中研究说明排卵发生在卵母细胞成熟过程中的特定时间,随后具有发育能力的卵母细胞进入输卵管中等待受精。垂体促性腺激素的作用启动了排卵,卵泡膜细胞、壁颗粒细胞、卵丘细胞分泌的旁分泌因子和卵母细胞自身共同作用介导整个排卵过程。结果导致了卵丘细胞扩散、蛋白水解、血管生成、炎症反应和平滑肌的收缩。这些过程都是卵泡破裂所必需的。小鼠模型中的研究很好地阐述了上述过程细胞间的信号交流,并且与包括人类在内的脊椎动物具有高度保守性。本文将对促黄体生成素诱导的卵巢排卵的调控作一阐述。
周丽媛,毛增辉[7]（2020）在《新型雌激素膜受体GPR30与子宫内膜容受性及卵母细胞成熟的关系》文中指出子宫内膜容受性及卵母细胞成熟是辅助生殖助孕成功与否的重要因素,二者均与雌激素密切相关。通常认为雌激素发挥作用是由经典的雌激素核受体（ERs）介导,然而近期发现新型雌激素受体G-蛋白偶联受体30（GPR30）可以介导雌二醇（E2）的许多作用,包括促进子宫内膜细胞增殖、舒张子宫血管、增加子宫内膜容受性等。研究者们发现GPR30对于维持鱼类生殖过程中卵母细胞减数分裂的阻滞具有重要的作用。在山羊及小鼠生殖过程中,GPR30通过调节卵冠丘复合体（COCs）缝隙连接通透性参与卵母细胞减数分裂。目前GPR30与子宫内膜容受性及卵母细胞减数分裂阻滞关系的具体机制尚不明确。本文对GPR30与子宫内膜容受性及卵母细胞成熟的关系进行综述,为深入研究GPR30参与调控妊娠过程的机制提供新的方向。
李清瑜[8]（2020）在《左归丸联合西曲瑞克经SIRT1/P53/P21通路平衡卵泡氧化应激反应改善环磷酰胺所致的卵巢储备下降的实验研究》文中提出目的:观察补肾养阴方药左归丸联合促性腺激素释放激素拮抗剂西曲瑞克对平衡卵巢局部的氧化应激反应的作用,研究该中西结合的方法对改善环磷酰胺所致的卵巢储备下降的机制。方法:雌性ICR小鼠共分为空白组（A组）、模型组（B组）、西曲瑞克组（C组）,左归丸组（D组）、中西结合组（E组）,从实验第一天开始称为d1,实验最后一天是d38。d1-d5予C组和E组腹腔注射西曲瑞克混悬液,其余三组予腹腔注射生理盐水;d6-d10予B、C、D、E组环磷酰胺腹腔注射,A组予生理盐水腹腔注射;d11-d38予D组和E组左归丸颗粒剂混悬液灌胃,其余三组纯水灌胃。ELISA法检测卵巢匀浆中FSHR、LH、AMH、GDF-9、BDNF、LIF、NO、NOS、ROS、ATP水平,检测外周血中FSH、E2水平,免疫组化法检测p53、p21、SIRT1蛋白在卵巢中的表达。结果:1.体重:空白组体重在实验周期38天内平稳增长,其余组别在d6后持续快速下降,动物出现脱毛、萎靡不振、大便稀薄等现象;从d11开始,西曲瑞克组、左归丸组、中西结合组体重开始回升,到d38左归丸组几乎恢复到与空白组相同的体重水平,西曲瑞克组与中西结合组的体重也得到一定恢复;模型组的体重一直在快速下降。2.动情期及动情间期:与空白组对比,模型组的动情期天数明显减少（P<0.01）;动情间期比空白组长（P<0.01）。左归丸组和中西结合组的动情期均恢复到与空白组相当的水平,跟模型组相比有统计学意义;相对地,两组的动情间期跟模型组相比有统计学意义（P<0.01）。周期长度:与空白组对比,模型组的动情周期长度明显延长（P<0.01）,中西结合组的周期长度与空白组的周期长度相近,跟模型组相比有统计学意义（P<0.01）。3.卵巢切片HE染色结果显示:原始卵泡:与空白组对比,模型组的原始卵泡数明显减少（P<0.01）。与模型组对比,三个治疗组的原始卵泡数较高,差异均有统计学意义（P<0.01）。生长卵泡:对比空白组,模型组的生长卵泡数减少（P<0.05）。中西结合组的生长卵泡数接近空白组水平,与模型组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。闭锁卵泡:与空白组对比,模型组的闭锁卵泡数明显增多趋势,但差异未达到统计学意义（P>0.05）;三个治疗组的闭锁卵泡与模型组相比有下降,但差异未达到统计学意义（P>0.05）。4.免疫组化结果显示:SIRT1:与空白组对比,模型组SIRT1蛋白表达明显减少。与模型组对比,三个治疗组的SIRT1蛋白表达增加,其中左归丸组和中西结合组较为明显。P53:与空白组对比,模型组P53蛋白表达明显增多。与模型组对比,西曲瑞克组和左归丸组P53蛋白表达减少,中西结合组的P53蛋白表达则明显减少,接近空白组水平。P21:与空白组对比,模型组P21蛋白表达明显增多。与模型组对比,西曲瑞克组和左归丸组P21蛋白表达减少,中西结合组的P21蛋白表达明显减少,接近空白组水平。5.ELISA法检测各组血清及卵巢局部激素及AMH水平显示:血清FSH:模型组的血清FSH水平比空白组显着上升,组间差异有统计学意义（P<0.05）。西曲瑞克组、左归丸组、中西结合组的血清FSH水平下降,其中左归丸组及中西结合组降低较显着,与模型组相比有显着统计学差异（P<0.01）;血清E2:模型组与空白组对比血清E2浓度下降,但差异未达到统计学意义（P>0.05）,三个治疗组的E2浓度比模型组显着上升（P<0.01）。卵巢LH:与空白组对比,模型组卵巢局部的LH浓度上升（P<0.01）,三个治疗组的LH水平下降（P<0.01）。卵巢E2:与空白组对比,模型组卵巢局部的E2浓度下降（P<0.01）;左归丸组及中西结合组E2浓度上升,但与模型组相比差异没有达到统计学意义（P>0.05）。西曲瑞克组E2浓度大幅度下降（P<0.01）。卵巢AMH:与空白组对比,模型组卵巢局部的AMH浓度下降（P<0.01）,经治疗后左归丸组及中西结合组的AMH浓度恢复到空白组水平,其中中西结合组与模型组相比差异显着（P<0.01）。卵巢FSHR:与空白组对比,模型组卵巢局部FSHR浓度下降（P<0.05）,经治疗后三个治疗组的FSHR浓度上升,其中中西结合组与模型组对比差异最明显（P<0.01）。6.ELISA法检测各组氧化应激相关因子显示:与空白组对比,模型组NOS浓度上升（P<0.05）,经治疗后左归丸组、中西结合组较模型组下降,差异有统计学意义（P<0.05）。与空白组对比,模型组NO浓度上升（P<0.01）,三个治疗组的NO浓度较模型组下降,差异有统计学意义（P<0.01）。与空白组对比,模型组ROS浓度显着上升（P<0.01）,三个治疗组的ROS浓度均有下降,其中中西结合组的浓度与空白组相仿,与模型组相比差异显着（P<0.01）。与空白组对比,模型组ATP浓度显着下降（P<0.05）,三个治疗组的ATP浓度均有上升,其中中西结合组的浓度与空白组相仿,左归丸组与模型组相比差异显着（P<0.01）7.ELISA法检测各组生长发育相关因子显示:与空白组对比,模型组DBNF、GDF-9浓度均显着下降（P<0.01）,经治疗后三个治疗组BDNF的浓度上升,其中中西结合组恢复到空白组水平,与模型组相比,差异有统计学意义（P<0.01）。另外,三个治疗组的GDF-9浓度均提高到空白组水平,差异有统计学意义（P<0.01）。与空白组对比,模型组LIF水平降低,经治疗后三个治疗组的LIF浓度上升,但差异均未达到统计学意义。结论:1、化疗药物环磷酰胺的使用可以诱导卵巢局部发生氧化应激反应,使卵巢功能受损从而造成卵巢储备下降;本动物实验中使用CTX 50mg/kg,连续使用5d,满足血清激素FSH上升,卵巢内E2降低的诊断标准。2、SIRT1/P53/P21通路参与CTX诱导的DOR的发生,其机制可能与抑制卵巢局部氧化应激反应有关。3、促性腺激素释放激素拮抗剂西曲瑞克联合补肾养阴方药左归丸可通过调节SIRT1/P53/P21通路改善卵泡微环境卵巢内的氧化应激反应,减少过氧化产物的产生,在一定程度上修复CTX所致的DOR,其疗效优于单用Cetrorelix或左归丸。但其确切机制尚待进一步研究。
白琳[9]（2020）在《cGMP特异性PDEs在调控斑马鱼卵子成熟中的功能和机制研究》文中提出鱼类和其他脊椎动物一样,卵母细胞在早期通过有丝分裂的增殖进入生长期后,发育将会停滞在减数分裂的前期I,直到完全生长期（fully grown stage,FG期）,受黄体生成素（luteinizing hormone,LH）刺激使得卵母细胞恢复减数分裂,生发泡破裂（germinal vesicle breakdown,GVBD）,第一极体排出,并停滞在中期II,这个过程被称为卵母细胞成熟。最近,环磷酸鸟苷（cyclic guanosine monophosphate,cGMP）信号通路在脊椎动物卵母细胞成熟中的重要性引起了人们广泛的关注。近两年来,我们以斑马鱼为模型,揭示了cGMP和cGMP依赖性蛋白激酶（cGMP-dependent protein kinase,PKG）在卵母细胞成熟中的作用。本研究进一步分析了cGMP特异性磷酸二酯酶（PDE5a、PDE6和PDE9）在斑马鱼卵母细胞成熟中的作用。主要研究结果如下:（1）在斑马鱼中鉴定了PDE5a（pde5aa和pde5ab）、PDE6（pde6a、pde6b、pde6c和pde6d）和PDE9（pde9a、pde9al和pde9as）的直系同源基因。（2）针对PDE5a基因,首先检测了PDE5a编码基因在斑马鱼卵泡中的表达,发现pde5aa和pde5ab主要在卵母细胞中表达。接着用针对哺乳动物PDE5a和磷酸化PDE5a的商业抗体检测了斑马鱼的PDE5a和磷酸化PDE5a在卵泡中的定位,发现PDE5a和磷酸化PDE5a（pPDE5a）均只在卵母细胞中表达,而滤泡细胞中不表达,并且在人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin,hCG）诱导的卵母细胞成熟过程中磷酸化PDE5a在卵母细胞中可以被激活。有趣的是,用两种不同的PDE5a抑制剂sildenafil或tadalafil对斑马鱼的卵泡进行体外孵育,发现这两种抑制剂均可诱导卵母细胞成熟,具有明显的浓度、时期和时间依赖性,且这种作用可以被PKG的抑制剂kt5823和间隙连接的两种抑制剂（林丹和甘草次酸）完全阻断。证明PDE5a参与斑马鱼卵母细胞成熟,其活性在维持卵母细胞自发成熟过程中发挥的重要作用。（3）针对PDE6基因,检测PDE6编码基因在斑马鱼卵泡中的表达,发现pde6a、pde6b、pde6c和pde6d均主要在卵母细胞中表达,且pde6a、pde6b和pde6d的表达在卵母细胞成熟的过程中受LH的调控。推测PDE6基因参与斑马鱼卵母细胞成熟。（4）针对PDE9基因,首先检测了PDE9编码基因在斑马鱼卵泡中的表达,发现pde9a、pd9al和pde9as均主要在卵母细胞中表达,其中pde9as的表达在卵母细胞成熟的过程中受LH的调控。接着用PDE9的特异性抑制剂BAY736691对斑马鱼的卵泡进行体外孵育,发现PDE9的抑制剂可诱导卵母细胞成熟,具有明显的浓度和时间依赖性,且这种作用可被间隙连接的抑制剂林丹完全阻断。证明PDE9参与斑马鱼卵母细胞成熟,其活性在维持斑马鱼卵母细胞自发成熟过程中发挥的重要作用。综上所述,以斑马鱼为模型,揭示了cGMP特异性PDEs在卵泡中的表达规律及在卵母细胞成熟过程中的作用。
陈华丽[10]（2020）在《Wnt/PLC/Ca2+通路对猪卵泡颗粒细胞和卵母细胞凋亡及颗粒细胞激素分泌的影响机制》文中研究指明哺乳动物超过99%的卵子在发育过程中都会经历闭锁性退化而不排卵,在促性腺激素的作用下,其中一些可以达到排卵前阶段,为了促进濒危物种以及基因优良畜禽体外培养卵子更好的应用,卵子发生和卵泡发育的机制尚需进一步研究。颗粒细胞分泌的激素和生长因子对卵泡发育起重要作用,同时卵母细胞分泌各种生长因子也可以调节颗粒细胞的增殖和分化。在卵泡液中含有多种不同水平的类固醇激素,比如雌激素、孕酮和雄激素,可以通过作用于颗粒细胞生长以及卵泡液的形成来影响卵巢的卵泡发育。近年来很多的研究表明,Wnt信号可以调节小鼠和人类的性腺发育和性别分化,并且可以调节激素的合成和分泌,对哺乳动物卵泡形成和发育以及卵巢功能的维持具有重要作用,可以参与调控卵泡闭锁等生理过程。Wnt5a和Wnt11属于非经典Wnt蛋白,它们在颗粒细胞中表达并且在整个卵泡发育过程中发挥特异的调控作用。当颗粒细胞Wnt5a失去活性的时候可以导致小鼠卵泡闭锁增加和排卵率降低。然而Wnt非典型通路对猪卵泡发育的作用尚未见系统报道,本文探究Wnt/PLC/Ca2+通路对猪卵泡发育过程中凋亡和激素分泌的影响。本试验通过抽吸法取得直径为2-5mm的卵泡中的卵泡液,并且收集颗粒细胞和卵母细胞,在体外培养液中添加一定剂量的Wnt/Ca2+通路中蛋白抑制剂或激活剂,包括Wnt蛋白抑制剂IWP-2、磷脂酶C（PLC）蛋白抑制剂U73122和激活剂m-3M3FBS以及PKCβ蛋白抑制剂Enzastaurin。通过显微镜观察卵母细胞成熟率;通过CCK8试验分别观察IWP-2、U73122、m-3M3FBS或Enzastaurin对颗粒细胞活力的影响。由荧光Ca2+指示剂Fluo3-AM监测颗粒细胞内钙离子含量,Ca2+指示剂Fura-2AM测定卵母细胞内钙离子含量。采用实时荧光定量（q RT-PCR）法检测通路相关基因以及激素分泌、细胞凋亡调控相关基因转录水平的表达;Annexin V-FITC法检测PLC抑制剂和激活剂对颗粒细胞的凋亡的影响。酶联免疫法（ELISA法）检测猪颗粒细胞雌二醇和孕酮的水平。Western Blot法检测凋亡调控若干蛋白、PLC四个亚基蛋白及三种钙离子敏感蛋白（PKCβ、CAMKⅡα、Caln A）的相对表达量。得到如下主要研究结果:1. 与对照组相比,0.05μM或5μM的IWP-2对猪颗粒细胞活力没有影响,0.1μM、0.5μM和2.5μM的IWP-2增加了猪颗粒细胞活力（P<0.05）。这表明Wnt配体在一定程度上抑制颗粒细胞活力。PLC抑制剂U73122的浓度不超过0.5μM时颗粒细胞的活力没有变化,浓度增加时细胞活力在4 h、24 h和48 h降低（P<0.05）,而PLC激活剂m-3M3FBS的添加使12 h之前的颗粒细胞活力随着浓度的增加呈现先升高再降低的趋势,m-3M3FBS浓度为0.5μM时活力最高（P<0.05）。这表明,PLC蛋白参与猪颗粒细胞的活力,并且一定程度上促进颗粒细胞活力。与对照组相比,0.25μM和2μM的Enzastaurin可以降低猪颗粒细胞的活力（P<0.05）。2.0.1-5μM的Wnt抑制剂IWP-2可以对卵母细胞成熟的抑制作用具有剂量依赖性,并且0.5μM的IWP-2抑制卵裂率（P<0.01）和囊胚率（P<0.01）。0.5μM的PLC抑制剂U73122提高了卵母细胞的成熟率（P<0.05）,降低了卵裂率（P<0.001）和囊胚率（P<0.01）;0.5μM PLC激活剂m-3M3FBS降低了卵母细胞成熟率（P<0.05）,提高了卵裂率（P<0.01）和囊胚率（P<0.01）。这说明Wnt配体在猪卵母细胞的成熟过程中可能具有促进作用,PLC蛋白可以抑制卵母细胞的成熟。3.0.5μM的IWP-2可以下调颗粒细胞（P<0.01）和卵母细胞（P<0.05）中的Ca2+的浓度。0.5μM的IWP-2处理猪颗粒细胞24 h降低了PLCB1（P<0.001）、PLCG1（P<0.01）和PLCZ1（P<0.001）的m RNA丰度;IWP-2处理猪卵母细胞44 h降低了PLCB1（P<0.001）、PLCD3（P<0.001）、PLCG1（P<0.001）和PLCZ1（P<0.001）基因的表达,同时降低了PLCD3（P<0.05）蛋白的表达。抑制剂U73122和激活剂m-3M3FBS对PLCB1 m RNA的最佳作用时间是4 h,最佳处理浓度是0.5μM。0.5μM U73122处理猪颗粒细胞4 h降低了PLCB1（P<0.05）、PLCD3（P<0.05）与PLCZ1（P<0.05）的m RNA表达,同时降低了PLCB1（p=0.001）和PLCG1（P<0.05）的相对蛋白丰度以及钙离子的浓度（P<0.001）。0.5μM的m-3M3FBS处理颗粒细胞4 h显着增加了PLCB1（P<0.05）、PLCD3（P<0.05）与PLCZ1（P<0.05）的m RNA表达,并升高了钙离子浓度（P<0.01）。与对照组相比,0.5μM的U73122处理猪卵母细胞44h后,PLCB1（P<0.001）、PLCD3（P<0.01）和PLCZ1（P<0.05）的m RNA丰度下降,钙离子浓度变化不大;用0.5μM m-3M3FBS处理猪卵母细胞44小时后,PLCB1（P<0.01）、PLCD3（P<0.001）、PLCG1（P<0.05）和PLCZ1（P<0.05）的m RNA丰度增加,PLCB1蛋白的丰度明显增加（P<0.05）,钙离子浓度增加（P<0.05）。IWP-2与U73122共同作用降低了颗粒细胞（P<0.001）和卵母细胞（P<0.05）中的钙离子水平,而IWP-2与m-3M3FBS共同作用则对颗粒细胞和卵母细胞的钙离子水平没有影响。结果表明,Wnt配体与PLC蛋白可以协同调节卵泡内钙离子水平的变化,能够增加胞质中Ca2+的增加。4. 在颗粒细胞中,抑制剂U73122降低了钙离子敏感蛋白PKCβ（P<0.05）、CAMKIIα（P<0.05）和Caln A（P<0.01）的表达丰度,激活剂m-3M3FBS升高了CAMKIIα蛋白（P<0.001）的表达量。在卵母细胞中,PLC蛋白对PKCβ和CAMKIIα蛋白具有正调控功能（P<0.05）,但是不影响Caln A的表达。在颗粒细胞中,抑制剂U73122可以下调CDC42（P<0.01）、NFATc1（P<0.01）和NFκB（P<0.01）的m RNA表达水平,同时对CTNNB有少许上调作用（P>0.05）;激活剂m-3M3FBS可以上调CDC42（P<0.05）、NFATc1（P<0.01）和NFκB（P<0.05）的m RNA表达水平,同时降低CTNNB（P<0.05）的表达。在卵母细胞中,PLC对下游基因具有上调作用,但是并不影响CTNNB的m RNA表达水平（P>0.05）。结果表明,PLC蛋白可以激活猪颗粒细胞和卵母细胞的钙离子敏感蛋白和下游基因,并且在颗粒细胞中可以抑制CTNNB的表达。5.0.5μM的IWP-2上调了调控猪颗粒细胞凋亡的BAK（P<0.001）、BAX（P<0.01）、CASP8（P<0.05）和TP53（P<0.05）基因的m RNA水平,同时Bak、Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表达增加（P<0.05）。0.5μM的IWP-2处理猪卵母细胞44 h之后,BAX（P<0.01）、CASP3（P<0.05）和TP53（P<0.01）基因的表达显着升高,同时抗凋亡基因BCL6（P<0.05）基因的表达降低;Bax（P<0.01）和Cleaved caspase3（P<0.05）蛋白的表达显着增加,Bcl-6（P<0.01）蛋白的表达降低。PLC活性变化可以抑制颗粒细胞的凋亡调控基因,并且在不同的时间对凋亡率的影响有所不同。0.5μM的PLC抑制剂U73122可以上调BAK（P<0.01）、BAX（P<0.05）和CASP3（P<0.01）的m RNA表达水平。0.5μM的U73122作用颗粒细胞4 h时早期凋亡率（P<0.05）和晚期凋亡率（P<0.05）达到最高。PLC激活剂m-3M3FBS可以上调抗凋亡基因BCL2（P<0.01）的m RNA水平,并且下调BAX（P<0.05）和CASP3（P<0.05）的m RNA表达;并降低Bax蛋白的表达,增加Bcl-2蛋白的表达。0.5μM的m-3M3FBS作用颗粒细胞4 h时早期凋亡率最高（P<0.05）,作用8 h时晚期凋亡率达到最高（P<0.05）。用0.5μM U73122培养猪卵母细胞44小时,与对照组相比,、、CASP3（P=0.001）、和的相对m RNA丰度增加,而的相对m RNA水平降低;、Cleaved和蛋白的表达上调。使用0.5μM m-3M3FBS培养猪卵母细胞44 h,与对照组相比,、、CASP3（p）、和TP53（p=0.001）的相对m RNA丰度降低,而BCL6的相对m RNA水平而升高（图4-6 D）;Bcl-6的蛋白表达丰度增加（P<0.05）,且P53的蛋白表达丰度降低。0.5μM的IWP-2与0.5μM的U73122于体外共同处理猪的颗粒细胞,与对照组相比,上调了BAK（P<0.01）、BAX（P<0.001）、CASP3（P<0.01）、CASP8（P<0.001）和TP53（P<0.05）的m RNA表达量,下调了BCL2（P<0.05）的m RNA表达水平。在猪颗粒细胞培养液中同时添加0.5μM的IWP-2和0.5μM的m-3M3FBS,与对照组相比,BAK（P<0.001）和CASP8（P<0.001）的m RNA表达水平降低。与对照组相比,2μM的Enzastaurin增加了BAK（P<0.001）、BAX（P<0.001）和CASP3（P<0.01）基因的表达,同时降低了BCL2（P<0.001）基因的表达;0.5μM的U73122和2μM的Enzastaurin共同作用增加了BAK（P<0.001）和BAX（P<0.05）基因的表达,同时降低了BCL2（P<0.01）基因的表达。2μM的Enzastaurin增加了Bax蛋白（P<0.05）的表达,降低了Bcl-2蛋白（P<0.01）的表达;0.5μM的U73122和2μM的Enzastaurin共同作用降低了Bcl-2蛋白（P<0.001）的表达。结果表明,Wnt/Ca2+通路中Wnt配体和PLC蛋白可以协同抑制猪颗粒细胞和卵母细胞的凋亡过程。0.5μM的U73122和2μM的Enzastaurin可以协同促进猪颗粒细胞的凋亡。6.0.5μM IWP-2可以促进猪颗粒细胞中雌二醇相关基因CYP17A1（P<0.01）、CYP19A1（P<0.01）、ER1（P<0.001）和ER2（P<0.01）的表达上调。0.5μM PLC抑制剂U73122可以上调猪颗粒细胞CYP11A1基因（P<0.05）,0.5μM PLC激活剂m-3M3FBS对激素调控的作用很小。0.5μM U73122处理颗粒细胞2 h、8 h、12 h、24 h、48 h后雌二醇分泌下降（P<0.05）,0.5μM m-3M3FBS处理猪颗粒细胞2h后雌二醇分泌下降（P<0.05）。0.5μM U73122处理猪颗粒细胞4 h增加了孕酮的分泌（P<0.05）,0.5μM m-3M3FBS处理猪颗粒细胞2 h和8 h后孕酮水平增加（P<0.05）。0.5μM的U73122处理猪颗粒细胞后,除了8 h（P>0.05）之外,各时间点雌二醇与孕酮的比例均下降（P<0.05）。使用0.5μM m-3M3FBS处理猪颗粒细胞2 h降低了雌二醇与孕酮的比例（P<0.05）。IWP-2和U73122共同作用提高了参与调节E2和P4的基因的m RNA表达水平,IWP-2与m-3M3FBS共同作用降低了CYP11A1的m RNA表达水平（P<0.01）,提高了CYP17A1（P<0.05）、CYP19A1（P<0.01）和ER1（P<0.05）的表达水平。与对照组相比,2μM Enzastaurin以及0.5μM U73122和2μM Enzastaurin共同作用均增加了猪颗粒细胞中CYP11A1基因（P<0.01）的表达和降低了CYP19A1（P<0.001）基因的表达。0.5μM U73122和2μM Enzastaurin共同作用比2μM Enzastaurin单独作用更明显地降低了猪颗粒细胞中CYP17A1基因的表达。研究表明,Wnt/Ca2+通路中Wnt配体和PLC蛋白可以共同调控猪颗粒细胞和卵母细胞的雌二醇（E2）和孕酮（P4）的激素水平。0.5μM的U73122和2μM的Enzastaurin可以协同调控三种激素相关基因CYP11A1、CYP17A1和CYP19A1。综上所述,Wnt/Ca2+信号通路中Wnt蛋白和PLC蛋白可发挥协同作用在猪的卵泡发育过程中具有抑制细胞凋亡和调节激素分泌的功能;Wnt/Ca2+信号关键蛋白PLC可以调控钙离子敏感蛋白和下游基因的表达。
二、Nitric oxide produced by cumulus cells stimulates maturation of mouse oocytes（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Nitric oxide produced by cumulus cells stimulates maturation of mouse oocytes（论文提纲范文）
（1）雌激素对猪卵母细胞自噬的作用及调控（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 哺乳动物卵母细胞的成熟调控 |
| 1.1.1 哺乳动物的卵泡发育 |
| 1.1.2 卵泡发育的分子机制 |
| 1.1.3 卵母细胞核成熟 |
| 1.1.4 卵母细胞质成熟 |
| 1.2 卵母细胞的氧化应激和早期凋亡 |
| 1.2.1 卵母细胞的氧化应激 |
| 1.2.2 卵母细胞的早期凋亡 |
| 1.3 卵丘-卵母细胞间隙连接通讯 |
| 1.4 雌激素研究进展 |
| 1.4.1 雌激素的生成 |
| 1.4.2 雌激素受体 |
| 1.4.3 雌激素作用 |
| 1.5 自噬研究进展 |
| 1.5.1 自噬的形成 |
| 1.5.2 自噬的功能 |
| 1.5.3 自噬的机制 |
| 1.5.4 自噬对卵泡发育的影响 |
| 1.6 研究目的和意义 |
| 第二章 自噬对猪卵母细胞发育潜能的影响 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试验材料 |
| 2.2.2 试验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 雌激素对猪卵母细胞体外成熟的影响 |
| 2.3.2 自噬蛋白在猪卵巢组织中的表达 |
| 2.3.3 自噬对猪卵母细胞体外成熟的影响 |
| 2.3.4 自噬对猪胚胎发育的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 17β-雌二醇对猪卵母细胞体外成熟影响的规律 |
| 2.4.2 自噬在猪卵母细胞、卵丘细胞和颗粒细胞中高表达 |
| 2.4.3 自噬参与猪卵母细胞体外成熟 |
| 2.4.4 自噬参与猪胚胎发育 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 雌激素在猪卵母细胞体外成熟过程中对自噬的调控 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试验材料 |
| 3.2.2 试验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 雌激素在成熟卵母细胞中促进自噬的发生 |
| 3.3.2 雌激素在卵母细胞成熟过程中促进自噬的发生 |
| 3.3.3 Autophinib对成熟猪卵母细胞自噬的影响 |
| 3.3.4 雌激素重新激活成熟猪卵母细胞中Autophinib介导的自噬 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 17β-雌二醇促进成熟猪卵母细胞的自噬 |
| 3.4.2 17β-雌二醇抑制猪卵母细胞早期成熟中的自噬 |
| 3.4.3 Autophinib有效抑制猪卵母细胞的自噬活性 |
| 3.4.4 雌激素参与Autophinib调控的成熟猪卵母细胞的自噬活性 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 自噬在雌激素诱导下对猪卵母细胞氧化应激与凋亡的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试验材料 |
| 4.2.2 试验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 雌激素可以减缓自噬失活引起的氧化应激 |
| 4.3.2 雌激素可以降低自噬失活引起的线粒体分布紊乱和钙离子缺失 |
| 4.3.3 雌激素下调自噬失活引起的猪卵母细胞早期凋亡 |
| 4.3.4 自噬失活诱导猪卵母细胞凋亡的分子机制 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 自噬失活导致的氧应激可以被雌激素减缓 |
| 4.4.2 雌激素保护由自噬抑制导致的线粒体分布紊乱和钙离子缺失 |
| 4.4.3 雌激素通过介导自噬活性调节卵母细胞早期凋亡 |
| 4.4.4 雌激素通过介导caspase调节自噬失活导致的凋亡 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 自噬在雌激素诱导下调节猪卵丘-卵母细胞复合体间隙连接细胞通讯 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试验材料 |
| 5.2.2 试验方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 雌激素调节猪卵丘-卵母细胞复合体的细胞间隙连接通讯 |
| 5.3.2 雌激素介导的自噬失活对细胞间隙连接的作用 |
| 5.3.3 雌激素介导的自噬失活对跨带突触表达的检测 |
| 5.3.4 雌激素介导的自噬失活抑制Cx43的磷酸化 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 雌激素下调间隙连接通讯 |
| 5.4.2 雌激素下调自噬介导的猪卵丘-卵母细胞间隙连接通讯 |
| 5.4.3 雌激素下调自噬介导的跨带突触 |
| 5.4.4 雌激素通过自噬调节Cx43的磷酸化 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 雌激素对猪卵母细胞自噬调控的分子机制 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 试验材料 |
| 6.2.2 试验方法 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 雌激素对猪卵母细胞中GPR30表达的影响 |
| 6.3.2 雌激素通过介导GPR30信号传导促进猪卵母细胞减数分裂 |
| 6.3.3 MEK/ERK信号通路参与雌激素对GPR30的介导 |
| 6.3.4 雌激素通过MEK/ERK信号途径调控猪卵母细胞的自噬 |
| 6.4 讨论 |
| 6.4.1 雌激素维持猪卵母细胞体外成熟早期的GPR30表达 |
| 6.4.2 GPR30促进猪卵母细胞体外成熟 |
| 6.4.3 MEK/ERK信号通路参与雌激素介导的GPR30 |
| 6.4.4 GPR30通过MEK/ERK信号通路调节猪卵母细胞的自噬 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 结论 |
| 创新点 |
| 研究展望 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）低氧对牦牛卵母细胞体外成熟和发育能力的影响及其作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 哺乳动物卵母细胞成熟研究进展 |
| 1.1 卵母细胞的发育与成熟过程 |
| 1.2 卵母细胞与外界环境的物质、信息交流途径 |
| 1.3 卵母细胞成熟的分子调控机制 |
| 1.4 影响卵母细胞成熟和发育能力的因素 |
| 2 促进卵母细胞体外成熟和发育能力的措施 |
| 2.1 筛选发育能力较高的卵母细胞 |
| 2.2 增强卵丘细胞-卵母细胞互作 |
| 2.3 优化卵母细胞的培养环境与培养程序 |
| 3 氧分压和ROS对卵母细胞体外成熟和发育能力的影响 |
| 4 牦牛卵母细胞体外成熟研究进展 |
| 5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 不同氧分压对牦牛卵母细胞体外成熟和发育能力的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 卵巢来源 |
| 1.2 试验试剂及其配制 |
| 1.3 试验耗材 |
| 1.4 试验仪器 |
| 1.5 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同氧分压对牦牛卵母细胞成熟率的影响 |
| 2.2 不同氧分压对牦牛卵母细胞ROS水平和GSH含量的影响 |
| 2.3 不同氧分压对牦牛孤雌胚胎发育的影响 |
| 2.4 不同氧分压对牦牛IVF胚胎发育的影响 |
| 2.5 不同氧分压对牦牛IVF囊胚基因表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 不同抗氧化剂对牦牛卵母细胞体外成熟和发育能力的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 卵巢来源 |
| 1.2 试剂与耗材 |
| 1.3 试验仪器 |
| 1.4 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同抗氧化剂对牦牛卵母细胞成熟率的影响 |
| 2.2 不同抗氧化剂对牦牛卵母细胞ROS水平的影响 |
| 2.3 不同抗氧化剂对卵母细胞GSH含量的影响 |
| 2.4 不同抗氧化剂对牦牛卵母细胞线粒体分布的影响 |
| 2.5 不同抗氧化剂对牦牛IVF胚胎发育的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 单细胞测序分析不同氧分压对牦牛卵母细胞转录组的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 卵巢来源 |
| 1.2 试剂与耗材 |
| 1.3 试验仪器 |
| 1.4 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 测序数据质量分析 |
| 2.2 比对分析 |
| 2.3 基因表达分析 |
| 2.4 差异表达基因GO分析 |
| 2.5 差异表达基因KEGG分析 |
| 2.6 差异表达基因验证 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 高通量测序分析不同氧分压对牦牛卵丘细胞转录组的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 卵巢来源 |
| 1.2 试剂与耗材 |
| 1.3 试验仪器 |
| 1.4 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 测序数据质量分析 |
| 2.2 比对分析 |
| 2.3 转录本组装与新转录本预测 |
| 2.4 基因表达分析 |
| 2.5 差异表达基因GO分析 |
| 2.6 差异表达基因KEGG分析 |
| 2.7 差异表达基因验证 |
| 2.8 不同氧分压对卵母细胞和卵丘细胞转录组影响的对比分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论、创新与不足 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 不足之处 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附表1 不同氧分压条件下牦牛卵母细胞DEGs(5% O_2 vs20% O_2) |
| 附表2 不同氧分压条件下牦牛卵丘细胞DEGs(5% O_2 vs20% O_2) |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（3）绵羊卵泡中NPPC/NPR2的表达及其影响因素的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 卵泡发育 |
| 1.1.1 不同等级卵泡卵母细胞发育潜力 |
| 1.1.2 不同等级卵泡中颗粒细胞增殖、分化及分子作用机制 |
| 1.2 卵母细胞成熟 |
| 1.2.1 卵母细胞胞质成熟 |
| 1.2.2 卵母细胞体外成熟 |
| 1.2.3 卵母细胞成熟的激素调控 |
| 1.2.4 卵母细胞第一次减数分裂阻滞及恢复 |
| 1.2.4.1 排卵前卵泡前期停滞对壁层颗粒细胞的依赖性 |
| 1.2.4.2 排卵前卵泡早期停滞对卵母细胞产生环磷酸腺苷的依赖性 |
| 1.2.5 双阶段体外成熟体系研究进展 |
| 1.3 NPPC/NPR2 信号系统概述 |
| 1.3.1 NPPC/NPR2 表达与结构 |
| 1.3.2 NPPC/NPR2 对体外成熟的调控 |
| 1.3.2.1 NPPC/NPR2 信号级联与雌二醇、FSH、ODPF 和次黄嘌呤之间的相互作用 |
| 1.3.2.2 NPPC/NPR2 信号和卵丘形成 |
| 1.4 本研究的目的及意义 |
| 2 不同直径腔卵泡颗粒细胞中NPPC、NPR2 的表达模式 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 试验样品 |
| 2.1.2 实验药品 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 壁层颗粒细胞的收集 |
| 2.2.2 卵丘细胞的收集 |
| 2.2.3 颗粒细胞的荧光定量PCR检测 |
| 2.2.4 颗粒细胞免疫荧光 |
| 2.2.5 Western blot |
| 2.2.6 统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 NPPC mRNA在不同直径卵泡壁层颗粒细胞中的表达 |
| 2.3.2 NPPC mRNA在不同直径卵泡卵丘颗粒细胞中的表达 |
| 2.3.3 NPR2 mRNA和蛋白在不同直径卵泡壁层颗粒细胞中的表达 |
| 2.3.4 NPR2 mRNA和蛋白在不同直径卵泡卵丘颗粒细胞中的表达 |
| 2.4 讨论 |
| 3 GDF9及FSH对体外培养的颗粒细胞中NPPC、NPR2 表达的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 试验样品 |
| 3.1.2 实验药品 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 壁层颗粒细胞的培养 |
| 3.2.2 颗粒细胞荧光定量PCR检测 |
| 3.2.3 颗粒细胞免疫荧光 |
| 3.2.4 Western blot |
| 3.2.5 统计分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 GDF9及FSH对体外培养的壁层颗粒细胞中NPPC表达的影响 |
| 3.3.2 GDF9及FSH对体外培养的卵丘细胞中NPPC表达的影响 |
| 3.3.3 GDF9及FSH对体外培养的壁层颗粒细胞中NPR2 表达的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 4 不同激素对NPPC/NPR2 信号系统介导的卵母细胞减数分裂阻滞的影响 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 试验样品 |
| 4.1.2 实验药品 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.1.4 主要试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 COCS的收集 |
| 4.2.2 COCs预孵 |
| 4.2.3 卵母细胞减数分裂进程的荧光检测 |
| 4.2.4 统计分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 不同浓度LH与 NPPC预孵育对绵羊卵母细胞减数分裂进程的影响 |
| 4.3.2 不同浓度FSH与 NPPC预孵育对绵羊卵母细胞减数分裂进程的影响 |
| 4.3.3 不同促浓度E2 与NPPC预孵育对绵羊卵母细胞减数分裂进程的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 5 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（4）猪卵母细胞成熟前后卵丘细胞转录组及相关基因的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 卵母细胞的成熟过程 |
| 1.2 卵母细胞与卵丘细胞的互作 |
| 1.3 脂质代谢在猪卵母细胞成熟过程中的作用 |
| 1.4 卵母细胞脂质代谢相关通路 |
| 1.5 RNA-seq技术在卵丘细胞和卵母细胞研究领域中的应用 |
| 第二章 脂质代谢相关基因在猪正常卵巢与异常卵巢中的表达 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 利用RNA-Seq比较成熟前后卵丘细胞编码基因表达的差异 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 利用RNA-Seq比较成熟前后卵丘细胞mi RNA的差异及靶基因验证 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 A(攻读学位期间发表论文目录) |
（5）低氧浓度对牦牛卵母细胞和附植前胚胎发育的影响及其作用机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 文献综述 |
| 第一章 哺乳动物卵母细胞的成熟和附植前胚胎的发育及其细胞凋亡 |
| 1 卵母细胞的成熟 |
| 1.1 卵巢与卵泡的形成 |
| 1.2 卵母细胞体内发育过程 |
| 1.3 卵母细胞的成熟 |
| 1.4 卵丘细胞在卵母细胞成熟中的作用 |
| 2 孤雌激活 |
| 2.1 孤雌激活 |
| 2.2 孤雌激活方式 |
| 3 体外受精胚胎发育的影响 |
| 4 细胞凋亡 |
| 第二章 低氧浓度对哺乳动物卵母细胞的成熟和附植前胚胎的发育的影响 |
| 1 雌性哺乳动物生殖器官中氧浓度的变化及生理学作用 |
| 2 氧化应激 |
| 2.1 活性氧的产生及生理意义 |
| 2.2 活性氧对卵母细胞成熟和胚胎发育的作用 |
| 3 低氧对胚胎发育的影响 |
| 4 p38丝裂原活化蛋白激酶 |
| 实验研究 |
| 第三章 不同氧气浓度对牦牛卵母细胞及后续孤雌激活胚胎发育的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 卵母细胞的采集及体外成熟培养 |
| 1.3 卵母细胞成熟的评估 |
| 1.4 孤雌激活和胚胎发育的评估 |
| 1.5 引物设计 |
| 1.6 牦牛COCs RNA的提取和反转录 |
| 1.7 qRT-PCR检测不同氧气浓度组牦牛COCs中与卵母细胞发育能力相关基因的表达 |
| 1.8 Western blotting检测不同氧气浓度组牦牛COCs中与卵母细胞发育能力相关蛋白的表达 |
| 1.9 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同氧气浓度对牦牛卵母细胞成熟的影响 |
| 2.2 不同氧气浓度对牦牛孤雌激活胚胎发育潜能的影响 |
| 2.3 不同氧气浓度对牦牛COCs中卵母细胞发育能力相关基因的表达影响 |
| 2.4 不同氧气浓度对牦牛COCs中卵母细胞发育能力相关蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 不同氧气浓度对牦牛卵母细胞HIF-1α和VEGF表达的影响及其与细胞凋亡的关联性分析 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 样品的采集及卵母细胞的体外成熟培养 |
| 1.3 免疫组织化学法检测HIF-1α和VEGF在牦牛卵巢中的定位 |
| 1.4 引物设计 |
| 1.5 牦牛COCs总RNA的提取和反转录 |
| 1.6 qRT-PCR检测牦牛COCs中HIF-1α、VEGF及凋亡相关基因的表达 |
| 1.7 Westernblotting检测牦牛COCs中 HIF-1α、VEGF及凋亡相关蛋白的表达 |
| 1.8 不同氧气浓度下牦牛COCs的细胞凋亡检测 |
| 1.9 免疫荧光染色法检测不同氧气浓度组牦牛COCs中HIF-1α和VEGF蛋白的表达 |
| 1.10 数据分析 |
| 2.结果 |
| 2.1 HIF-1α和VEGF在牦牛卵巢中的定位 |
| 2.2 不同氧气浓度对牦牛COCs中HIF-1α、VEGF及凋亡相关基因的表达影响 |
| 2.3 不同氧气浓度对牦牛COCs中HIF-1α、VEGF及凋亡相关蛋白的表达影响 |
| 2.4 不同氧气浓度对牦牛COCs中细胞凋亡的影响 |
| 2.5 不同氧气浓度组牦牛COCs中HIF-1α和VEGF蛋白的表达定位 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 不同氧气浓度对牦牛体外受精胚胎发育及其凋亡的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 卵母细胞的采集及体外成熟培养 |
| 1.3 牦牛卵母细胞的体外受精及胚胎发育的评估 |
| 1.4 牦牛囊胚的差异染色及细胞计数 |
| 1.5 牦牛囊胚的细胞凋亡检测 |
| 1.6 引物设计 |
| 1.7 牦牛囊胚RNA的提取和反转录 |
| 1.8 qRT-PCR检测牦牛囊胚中与胚胎发育能力以及凋亡相关基因的表达 |
| 1.9 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 低氧浓度对牦牛体外受精胚胎发育的影响 |
| 2.2 低氧浓度对牦牛体外受精囊胚细胞数的影响 |
| 2.3 低氧浓度对牦牛囊胚细胞凋亡的影响 |
| 2.4 低氧浓度对牦牛体外受精囊胚中与胚胎发育和凋亡相关基因的表达影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第六章 低氧浓度对牦牛体外受精胚胎p38 MAPK和HIF-1α表达的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 卵母细胞的采集及体外成熟培养 |
| 1.3 牦牛卵母细胞的体外受精 |
| 1.4 引物设计 |
| 1.5 牦牛不同阶段体外受精胚胎总RNA的提取和反转录 |
| 1.6 qRT-PCR检测牦牛不同阶段体外受精胚胎中p38MAPK和HIF-1α基因的表达 |
| 1.7 免疫荧光染色法检测不同阶段体外受精胚胎中p38MAPK和HIF-1α蛋白的表达 |
| 1.8 数据分析 |
| 2.结果 |
| 2.1 低氧浓度对牦牛体外受精胚胎中HIF-1α基因的表达影响 |
| 2.2 低氧浓度对牦牛体外受精胚胎中p38 MAPK基因的表达影响 |
| 2.3 低氧浓度对牦牛体外受精胚胎中HIF-1α蛋白的表达和定位 |
| 2.4 低氧浓度对牦牛体外受精胚胎中p38 MAPK蛋白的表达和定位 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（6）促黄体生成素诱导卵巢排卵的调控（论文提纲范文）
| 1 卵丘细胞的扩散 |
| 1.1 卵母细胞旁分泌因子诱导卵丘细胞的扩散 |
| 1.2 LH通过EGF-Ls诱导卵丘细胞的扩散 |
| 1.3 细胞外基质的生成诱导卵丘细胞的扩散 |
| 1.4 LH通过Ptgs2诱导卵丘细胞的扩散 |
| 2 蛋白水解和血管生成诱导组织重建 |
| 2.1 蛋白酶水解诱导卵泡的破裂 |
| 2.2 血管内皮和新血管的生成诱导组织重建 |
| 3 LH通过Edn2诱导血管生成和肌肉收缩 |
| 4 免疫细胞浸润和炎症反应参与卵泡破裂时EMC的重建 |
| 4.1 白细胞浸润 |
| 4.2 一氧化氮和活性氧 |
| 4.3 细胞因子 |
| 5 临床上排卵障碍可能的发病机制 |
| 5.1 下丘脑-垂体-卵巢轴功能紊乱 |
| 5.2 卵巢局部因素 |
| 5.3 肾上腺及甲状腺功能异常 |
（7）新型雌激素膜受体GPR30与子宫内膜容受性及卵母细胞成熟的关系（论文提纲范文）
| 一、GPR30的发现 |
| 二、GPR30与子宫内膜容受性 |
| 三、GPR30与卵母细胞成熟 |
（8）左归丸联合西曲瑞克经SIRT1/P53/P21通路平衡卵泡氧化应激反应改善环磷酰胺所致的卵巢储备下降的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要略缩语中英文对照 |
| 一、绪论 |
| 1.1 DOR的研究进展 |
| 1.2 DOR的中医研究进展 |
| 1.3 新型促性腺激素释放激素拮抗剂——西曲瑞克 |
| 1.4 SIRT1/P53/P21 通路与氧化应激的关系 |
| 二、左归丸联合西曲瑞克干预环磷酰胺所致的卵巢储备下降的实验研究 |
| 2.1 实验目的 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 三、讨论 |
| 3.1 运用CTX建立DOR动物模型的评价 |
| 3.2 DOR状态的性激素及AMH的变化及药物的干预作用分析 |
| 3.3 DOR状态的生长因子变化情况及药物的干预作用分析 |
| 3.4 CTX所致DOR卵巢局部氧化应激反应变化及药物的干预作用分析 |
| 3.5 SIRT1/P53/P21 通路参与CTX所致DOR的发生及药物干预作用分析 |
| 四、问题与展望 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 在校期间发表论文 |
| 致谢 |
（9）cGMP特异性PDEs在调控斑马鱼卵子成熟中的功能和机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 硬骨鱼类卵母细胞的发育过程 |
| 1.1.1 卵母细胞的生长 |
| 1.1.2 卵母细胞的成熟 |
| 1.2 卵母细胞成熟的调控机制 |
| 1.2.1 卵母细胞减数分裂的阻滞及其调控因子 |
| 1.2.2 卵母细胞减数分裂的恢复及其调控因子 |
| 1.3 cGMP相关信号通路在卵母细胞成熟的作用 |
| 1.3.1 NO/sGC/cGMP信号通路在卵母细胞成熟中的作用 |
| 1.3.2 利钠肽家族对卵母细胞成熟的影响 |
| 1.3.3 cGMP-PKG对卵母细胞成熟的影响 |
| 1.3.4 PDEs家族卵母细胞成熟的影响 |
| 1.4 模式生物—斑马鱼的介绍 |
| 1.5 研究目的 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 卵巢卵泡的分离 |
| 2.3.2 hCG注射 |
| 2.3.3 总RNA的提取 |
| 2.3.4 反转录 |
| 2.3.5 PCR反应 |
| 2.3.6 卵母细胞与滤泡层的分离 |
| 2.3.7 体外孵育与卵母细胞成熟的检测 |
| 2.3.8 免疫组化 |
| 2.3.9 Western Blot |
| 2.3.10 cGMP的检测方法 |
| 2.3.11 统计分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 两种不同的PDE5a编码基因的鉴定 |
| 3.2 pde5as mRNA的表达 |
| 3.2.1 pde5as mRNA在斑马鱼不同组织中的表达 |
| 3.2.2 pde5as mRNA在滤泡细胞和卵母细胞中的表达 |
| 3.2.3 pde5as mRNA在卵泡发育过程中的表达 |
| 3.2.4 LH对卵母细胞成熟过程中pde5as mRNA表达的调控 |
| 3.3 PDE5a蛋白的表达 |
| 3.3.1 PDE5a蛋白在不同组织中的表达 |
| 3.3.2 PDE5a蛋白在斑马鱼FG期卵泡卵母细胞中的定位 |
| 3.3.3 LH对卵母细胞成熟过程中PDE5a和pPDE5a蛋白表达的调控 |
| 3.4 PDE5a在卵母细胞成熟的作用 |
| 3.4.1 PDE5a抑制剂对卵母细胞成熟的影响 |
| 3.4.2 PKG对PDE5a抑制剂诱导的卵母细胞成熟的影响 |
| 3.4.3 缝隙连接对PDE5a抑制剂诱导的卵母细胞成熟的影响 |
| 3.4.4 PDE5a抑制剂的对裸露卵母细胞成熟的影响 |
| 3.5 PDE5a的抑制剂对cGMP水平的影响 |
| 3.6 pde9s mRNA的表达 |
| 3.6.1 pde9s mRNA在不同组织中的表达 |
| 3.6.2 pde9s mRNA在滤泡层和卵母细胞中的表达 |
| 3.6.3 pde9s mRNA在不同时期卵泡中的表达 |
| 3.6.4 LH对卵母细胞成熟过程中pde9s mRNA表达的调控 |
| 3.7 PDE9在斑马鱼卵母细胞成熟中的作用 |
| 3.8 pde6s mRNA的表达 |
| 3.8.1 pde6s mRNA在滤泡层和卵母细胞中的表达 |
| 3.8.2 LH对卵母细胞成熟过程中pde6s mRNA表达的调控 |
| 3.9 PDE5a和PDE9的抑制剂对斑马鱼卵子质量影响 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 小结 |
| 4.2 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 缩写词表 |
| 致谢 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文及科研成果 |
（10）Wnt/PLC/Ca2+通路对猪卵泡颗粒细胞和卵母细胞凋亡及颗粒细胞激素分泌的影响机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 颗粒细胞和卵母细胞在哺乳动物卵泡闭锁和激素分泌中的作用 |
| 1.1.1 哺乳动物卵巢的基本结构和功能 |
| 1.1.2 卵泡发育的基本过程 |
| 1.1.3 卵泡发育的调控途径 |
| 1.1.4 颗粒细胞在卵泡发育中的作用 |
| 1.1.5 卵母细胞的发育以及在卵泡发育中的作用 |
| 1.1.6 颗粒细胞与卵母细胞的互作 |
| 1.2 Wnt-Ca~(2+)信号通路对卵泡发育的影响 |
| 1.2.1 Wnt通路概述以及Wnt-Ca~(2+)通路的组成 |
| 1.2.2 Wnt-Ca~(2+)通路在哺乳动物生理病理活动中的调节作用 |
| 1.2.3 Wnt-Ca~(2+)与Wnt典型通路的互作 |
| 1.2.4 Wnt-Ca~(2+)与其它信号通路的关系 |
| 1.3 研究目的和意义 |
| 第二章 Wnt/PLC/Ca~(2+)信号变化对猪颗粒细胞活力和卵母细胞成熟的调控 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要试验仪器 |
| 2.2.3 试验动物来源 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 猪卵巢的采集 |
| 2.3.2 猪颗粒细胞和卵母细胞的培养 |
| 2.3.3 猪颗粒细胞的鉴定 |
| 2.3.4 CCK8法测定颗粒细胞活力 |
| 2.3.5 卵母细胞成熟的判定 |
| 2.3.6 孤雌激活和早期胚胎培养 |
| 2.3.7 早期胚胎发育的评定 |
| 2.3.8 统计学数据分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 猪颗粒细胞的鉴定 |
| 2.4.2 不同浓度IWP-2对猪颗粒细胞活力的影响 |
| 2.4.3 不同浓度抑制剂U73122对颗粒细胞活力的影响 |
| 2.4.4 不同浓度激活剂m-3M3FBS对颗粒细胞活力的影响 |
| 2.4.5 不同浓度IWP-2对猪卵母细胞第一极体排出率的影响 |
| 2.4.6 不同浓度抑制剂U73122 或激活剂m-3M3FBS对卵母细胞成熟的影响. |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 IWP-2对Wnt/PLC/Ca~(2+)通路的抑制、对凋亡的促进及其对颗粒细胞激素的调控 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 主要试验仪器 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 猪卵巢的采集以及猪颗粒细胞和卵母细胞的培养 |
| 3.3.2 猪颗粒细胞和卵母细胞钙离子浓度的测定 |
| 3.3.3 猪颗粒细胞RNA提取和反转录 |
| 3.3.4 实时荧光定量PCR检测凋亡相关基因和激素调控基因的表达水平 |
| 3.3.5 Western Blot法检测凋亡相关蛋白和PLC四种亚基蛋白表达水平 |
| 3.3.6 统计学数据分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 IWP-2对猪颗粒细胞和卵母细胞中Ca~(2+)浓度的影响 |
| 3.4.2 IWP-2对猪颗粒细胞和卵母细胞凋亡的影响 |
| 3.4.3 IWP-2对颗粒细胞雌二醇和孕酮调控基因的影响 |
| 3.4.4 IWP-2 对猪颗粒细胞和卵母细胞PLC四种亚基基因和蛋白表达的影响. |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 PLC蛋白对猪卵泡发育过程中细胞凋亡、激素分泌和Wnt/Ca~(2+)信号通路的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.2.1 主要试剂 |
| 4.2.2 主要试验仪器 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 猪卵巢的采集以及颗粒细胞和卵母细胞的培养 |
| 4.3.2 颗粒细胞和卵母细胞的总RNA提取和反转录 |
| 4.3.3 实时荧光定量PCR检测凋亡、激素和Wnt/Ca~(2+)通路若干基因的表达 |
| 4.3.4 Western Blot法检测凋亡和Wnt/Ca~(2+)通路相关蛋白的表达 |
| 4.3.5 Annexin V-FITC法检测猪颗粒细胞凋亡 |
| 4.3.6 酶联免疫法(ELISA法)测定猪雌二醇和孕酮的含量 |
| 4.3.7 猪颗粒细胞和卵母细胞钙离子浓度测定 |
| 4.3.8 统计学数据分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 PLC蛋白对猪颗粒细胞和卵母细胞凋亡的调控 |
| 4.4.2 PLC蛋白对猪颗粒细胞雌二醇和孕酮分泌的调控 |
| 4.4.3 PLC蛋白对猪颗粒细胞和卵母细胞Wnt/Ca~(2+)信号中PLC四个亚基、Ca~(2+)浓度、三个钙离子敏感蛋白和若干下游基因的调控 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 IWP-2与U73122或m-3M3FBS互作对猪卵泡Ca~(2+)的调节以及对颗粒细胞凋亡和激素的调节作用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.2.1 主要试剂 |
| 5.2.2 主要试验仪器 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 猪卵巢的采集以及颗粒细胞和卵母细胞的培养 |
| 5.3.2 猪颗粒细胞和卵母细胞钙离子浓度检测 |
| 5.3.3 颗粒细胞总RNA提取和反转录 |
| 5.3.4 实时荧光定量PCR检测颗粒细胞凋亡和激素调控基因相对表达 |
| 5.3.5 统计学数据分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 IWP-2与U73122或m-3M3FBS相互作用对猪颗粒细胞和卵母细胞Ca~(2+)浓度的影响 |
| 5.4.2 IWP-2与U73122或m-3M3FBS相互作用对颗粒细胞凋亡调控基因的影响 |
| 5.4.3 IWP-2与U73122或m-3M3FBS相互作用对颗粒细胞激素调控基因的影响 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 Enzastaurin或 Enzastaurin与 U73122 互作对猪颗粒细胞激素和凋亡的调节作用 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 试验材料 |
| 6.2.1 主要试剂 |
| 6.2.2 主要试验仪器 |
| 6.3 试验方法 |
| 6.3.1 猪卵巢的采集以及颗粒细胞的培养 |
| 6.3.2 猪颗粒细胞总RNA提取和反转录 |
| 6.3.3 实时荧光定量PCR检测猪颗粒细胞凋亡和激素调控基因相对表达 |
| 6.3.4 Western Blot法检测猪颗粒细胞PKC蛋白表达的影响 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 Enzastaurin对猪颗粒细胞活力的影响 |
| 6.4.2 Enzastaurin以及Enzastaurin与 U73122 互作对猪颗粒细胞凋亡相关基因和蛋白表达的影响 |
| 6.4.3 Enzastaurin以及Enzastaurin与 U73122 互作对猪颗粒细胞雌二醇和孕酮激素相关基因表达的影响 |
| 6.4.4 Enzastaurin以及Enzastaurin与 U73122 互作对PKCβ蛋白表达的影响 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 第七章 结论与创新点 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新点 |
| 下一步研究工作 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、Nitric oxide produced by cumulus cells stimulates maturation of mouse oocytes（论文参考文献）
- [1]雌激素对猪卵母细胞自噬的作用及调控[D]. 段家昕. 西北农林科技大学, 2021
- [2]低氧对牦牛卵母细胞体外成熟和发育能力的影响及其作用机制[D]. 李瑞哲. 甘肃农业大学, 2021
- [3]绵羊卵泡中NPPC/NPR2的表达及其影响因素的研究[D]. 赵勇超. 内蒙古农业大学, 2021(01)
- [4]猪卵母细胞成熟前后卵丘细胞转录组及相关基因的研究[D]. 罗晓彤. 延边大学, 2021(02)
- [5]低氧浓度对牦牛卵母细胞和附植前胚胎发育的影响及其作用机制的研究[D]. 何翃闳. 甘肃农业大学, 2020(01)
- [6]促黄体生成素诱导卵巢排卵的调控[J]. 蔡姣,王芳. 生命的化学, 2020(10)
- [7]新型雌激素膜受体GPR30与子宫内膜容受性及卵母细胞成熟的关系[J]. 周丽媛,毛增辉. 生殖医学杂志, 2020(09)
- [8]左归丸联合西曲瑞克经SIRT1/P53/P21通路平衡卵泡氧化应激反应改善环磷酰胺所致的卵巢储备下降的实验研究[D]. 李清瑜. 暨南大学, 2020(03)
- [9]cGMP特异性PDEs在调控斑马鱼卵子成熟中的功能和机制研究[D]. 白琳. 西北师范大学, 2020(01)
- [10]Wnt/PLC/Ca2+通路对猪卵泡颗粒细胞和卵母细胞凋亡及颗粒细胞激素分泌的影响机制[D]. 陈华丽. 西北农林科技大学, 2020