一、P-糖蛋白、Bcl-2蛋白在胰腺癌组织中的表达及其与临床病理的关系（论文文献综述）
范爽[1]（2021）在《RUNX3在人结肠癌HCT-116/5-FU耐药细胞株中的表达及其与耐药的相关性研究》文中研究指明本课题通过建立耐5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）的人结肠癌细胞株HCT-116/5-FU,初步探讨RUNX3与结直肠癌耐药的关系。第一部分:采用低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击法建立人结肠癌耐药细胞株HCT-116/5-FU,cck-8法检测5-氟尿嘧啶对亲本株HCT-116及耐药株HCT-116/5-FU的半数抑制浓度（half maximal inhibitoryconcentration,IC50值）,绘制细胞生长曲线,并计算细胞倍增时间;q RT-PCR检测亲本株HCT-116细胞及耐药株HCT-116/5-FU细胞中RUNX3、P-gp、MRP1、LRPm RNA的表达,western-blot检测亲本株HCT-116细胞及耐药株HCT-116/5-FU细胞中RUNX3、P-gp、MRP1、LRP蛋白的表达;第二部分:通过si RNA技术敲低HCT-116细胞中RUNX3的表达,分为RUNX3敲低组（si-RUNX3-1组、siRUNX3-2组）和阴性对照组（si-NC组）,通过q RT-PCR和Western blot分别在m RNA水平和蛋白水平验证RUNX3的敲低效率,采用cck-8法测定si-RUNX3组和si-NC组的IC50值,通过western-blot测定两组中P-gp、MRP1、LRP的表达情况。成功构建了稳定的人结肠癌耐药细胞株HCT-116/5-FU,耐药倍数为7.7倍,HCT-116/5-FU耐药细胞株群体倍增时间较HCT-116亲本株延长,差异有统计学意义,P<0.001,耐药细胞群体倍增时间（TD）是亲本细胞的1.38倍,差异有统计学意义,P=0.002,耐药株细胞形态发生变化。耐药细胞HCT-116/5-FU的RUNX3m RNA表达水平较亲本细胞株HCT-116明显降低,差异有统计学意义,p=0.048,耐药细胞HCT-116/5-FU的P-gp、MRP1、LRPm RNA表达水平较亲本细胞株HCT-116明显升高,差异有统计学意义,p=0.008,p=0.001,p=0.001,耐药细胞HCT-116/5-FU的RUNX3蛋白质相对表达量较亲本细胞株HCT-116明显降低,差异有统计学意义,p<0.001,耐药细胞HCT-116/5-FU的P-gp、MRP1、LRP蛋白的相对表达量较亲本细胞株均明显升高,差异有统计学意义,p均<0.001;成功构建了RUNX3低表达的HCT-116细胞模型,si-RUNX3-1组RUNX3m RNA的表达和si-NC组比较,差异无统计学意义,P=0.064,si-RUNX3-2组RUNX3m RNA的表达量低于si-NC组,差异有统计学意义,P=0.034;si-RUNX3-1组和si-RUNX3-2组RUNX3蛋白的相对表达量低于siNC组,差异有统计学意义,p均<0.001;并且si-RUNX3-2组的敲低效率更高,选用si-RUNX3-2组完成后续试验,si-RUNX3组的IC50值较si-NC组明显升高,下调RUNX3的表达能够降低HCT-116细胞对5-FU的敏感性,差异具有统计学意义,p<0.001;si-RUNX3组的P-gp、MRP1、LRP蛋白的相对表达量较si-NC组均明显升高,差异有统计学意义,p均<0.001。综上,RUNX3表达下调能降低人结肠癌HCT-116细胞对5-FU的敏感性,考虑与RUNX3表达的降低上调Pgp、MRP1、LRP等耐药蛋白表达,从而增加细胞的耐药性有关。
葛宁[2]（2021）在《KCNMA1的上调促进维拉帕米逆转食管鳞状细胞癌对顺铂的化学耐药》文中研究指明研究背景:食管癌（esophagus cancer,EC）是消化系统常见的恶性肿瘤之一,2018年,全球新增57万例EC患者,且有50万例患者死于EC[1]。全球食管癌新增和死亡病例约有一半发生在中国,其在我国的发病率和死亡率占第六和第四位[2]。食管癌主要包括食管鳞状细胞癌（sophageal squamous cell carcinoma,ESCC）和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma,EAC）两个亚型,美国和欧洲国家主要以EAC亚型为主,而我国食管癌患者90%以上都是ESCC亚型。目前手术、放疗和化疗是ESCC三大主要治疗手段。手术是早期局限性病灶患者的首要治疗方式,但由于早期食管癌临床症状不明显,很多患者发现即为中晚期而不能手术。放疗做为食管癌局部治疗主要手段之一,对于颈段食管癌及非手术食管癌具有不可替代的作用,但对于病灶长度较长及放疗后复发的患者作用有限。化学治疗和靶向药物治疗可部分延长中晚期或术后食管癌患者生存时间,受肿瘤耐药性的限制,标准化疗方案对晚期食管癌的反应率只有30%左右。探索食管癌细胞对化疗药物的耐药性,对食管癌治疗具有非常重要的临床意义。肿瘤细胞的耐药性有单药耐药和多药耐药两种形式,多药耐药是较为多见的耐药形式。既往研究认为药物耐药性与细胞内药物的浓度与分布改变、抗氧化体系激活、DNA损伤修复系统活化和细胞外基质等各种因素相关。维拉帕米（Verapamil,VER）是一种L-型的钙离子通道抑制剂,主要用于治疗心脑血管系统疾病。随着对其深入研究发现它可逆转肿瘤细胞多药耐药性（multidrugresistance,MDR）,有效逆转肿瘤多药耐药的浓度为6.0-10.0umol/L。传统静脉注射的安全浓度为1.0～2.0umol/L,但此浓度达不到有效逆转耐药浓度,通过动脉灌注药物的方式可使其局部组织浓度达到外周血液浓度的3-10倍。研究表明,通过VER逆转肿瘤的多药耐药,改善了化学药物治疗临床疗效,其中包括肝细胞癌、大肠癌、胃癌、肺癌和恶性腹水等。最初研究表明VER是通过调节P-gp蛋白的表达抗肿瘤MDR,VER能够抑制或下调P-gp的表达,阻止药物外排提高肿瘤化疗药物的杀伤作用。最近研究表明VER逆转肿瘤多药耐药的机制很有可能与P-gp无关。我们通过高通量筛选实验发现 SLIT3、KCNMA1、KLK1、LPAR1、CHRDL1、NID1 这6个候选基因与维拉帕米逆转耐药相关。其中KCNMA1基因在VER逆转ESCC细胞对顺铂（DDP,cisplatin）耐药中表达显着升高。本课题通过细胞实验、动物实验及临床资料层面研究KCNMA1基因表达与VER逆转肿瘤顺铂耐药之间的关系。第一章:KCNMA1的表达在VER逆转ESCC细胞耐药中的作用目的:本研究通过研究KCNMA1基因在ESCC组织和细胞中的表达差异,来研究KCNMA1基因的表达差异与VER逆转ESCC肿瘤耐药可能存在的关系,为肿瘤耐药的ESCC患者靶向治疗提供理论依据。基于这些实验,我们检测了 KCNMA1基因在ESCC中的表达;通过过表达或沉默表达KCNMA1基因,研究肿瘤细胞对顺铂的敏感性差异;通过经增强KCNMA1表达研究对ESCC增殖和凋亡的作用。通过这些实验,我们对VER逆转肿瘤MDR的机制有了更深的认识,为治疗ESCC患者提供临床证据。方法:1.CCK-8实验和集落形成实验验证检测VER联合顺铂对KYSE150、KYSE180和KYSE450三种ESCC细胞活力影响;2.高通量筛选测序,比较KYSE150、KYSE180中DPP组和VER+DPP组中基因表达差异,同时用qRT-PCR验证这种差异;3.WB检测VER组、DPP组、以及VER+DPP组中KCNMA1蛋白的表达;4.免疫组织化学法检测VER联合顺铂治疗的ESCC患者组织样本中KCNMA1的蛋白表达;5.通过沉默或过表达KCNMA1基因的表达,再用CCK-8法检测ESCC细胞对顺铂的细胞活力;6.通过抗增殖实验和凋亡实验,研究KCNMA1基因的表达与ESCC细胞增殖和细胞凋亡关系。结果:1.CCK-8实验和集落形成实验结果显示VER增加了 ESCC细胞对顺铂的敏感性,尤其是对KYSE150细胞,而VER对KYSE180细胞的作用小。因此本实验选择KYSE150细胞作为VER逆转敏感细胞,选择KYSE180细胞作为抗逆转模型细胞进行进一步研究;2.高通量转录测序结果显示,SLIT3、KCNMA1、NID1、KLK1、LPAR1和CHRDL1基因表达均表现出差异,并通过qRT-PCR验证了这种差异。与KYSE150 DDP组相比,KYSE150 DDP+VER组的KCNMA1表达明显上调,且KYSE150细胞中的KCNMA1表达水平高于KYSE180细胞中的表达水平;3.WB结果显示在KYSE180 DDP组和KYSE180 DDP+VER组之间,KCNMA1的蛋白表达没有显着差异,而在KYSE150 DDP+VER组中,KCNMA1显着上调;4.免疫组化结果表明对VER逆转方案呈现阳性患者中,KCNMA1的表达显着升高,而阴性患者中KCNMA1的表达无显着差异;5.通过过表达KCNMA1基因,可以显着增加KYSE150细胞对顺铂的敏感性,而沉默KCNMA1基因的表达后,KYSE150细胞对顺铂的敏感性下降;6.增殖和凋亡实验结果表明,KCNMA1的表达能够增强了 VER对ESCC细胞的抗增殖作用,也可以增强VER对ESCC细胞的促凋亡作用。结论:VER能够促进KCNMA1的表达,增强KYSE150细胞对顺铂的敏感性,其存在的机制可能是KCNMA1的表达能够增强顺铂对KYSE150细胞的抗增殖和促凋亡作用。第二章:KCNMA1的表达促进顺铂对移植瘤裸鼠抑制作用研究目的:本研究旨在分析在食管鳞状细胞移植瘤裸鼠中,KCNMA1的表达与VER逆转肿瘤对顺铂敏感性的相关性,探讨KCNMA1对ESCC治疗中的作用.方法：1.构建过表达和沉默KCNMA1KYSE150细胞模型,2.将ESCC细胞经皮下注射裸鼠.构建食管鳞状细胞癌模型,分为五组包括Control组、DPP组、DPP+VER组、siRNA-KCNMAl组和Over-KCNMAl+DPP组.待肿瘤体积生长至50mm2时,腹膜内注射2.0mg/kg的顺铂和1.Omg/kg的VER,比较各组裸鼠的肿瘤大小、肿瘤抑制率;3.免疫组化实验比较各组裸鼠组织中KCNMA1蛋白表达;4.WB与qRT-PCR实验检测三组裸鼠中KCNMA1的表达;结果:1.通过质粒转染和慢病毒转染制备KCNMA1过表达和表达沉默的KYSE150细胞珠,qRT-PCR和WB结果显示,Over-KCNMAl组中KCNMA1蛋白的表达显着高于vector组,而siRNA-KCNMA1组中KCNMA1蛋白的表达显着低于sh-NC组,表示过表达和沉默表达KCNMA1细胞模型构建成功;2.本实验中所有裸鼠均成瘤,且在治疗期间各组裸鼠肿瘤体积均随着时间推移不断增大,Over-KCNMAl+DPP组和DPP+VER组在14天之后肿瘤体积大小明显小于单独DPP组,而沉默KCNMA1的表达后,肿瘤组织体积显着增加;3.裸鼠肿瘤组织WB和qRT-PCR结果显示,Over-KCNMAl组和DPP+VER组中KCNMA1蛋白表达显着高于Control组和DPP组.结论:过表达的KCNMA1能够提高食管鳞状细胞癌组织对顺铂的敏感性,抑制肿瘤组织体积的生长;而沉默KCNMA1的表达,降低顺铂对裸鼠肿瘤的抑制作用.第三章:临床研究KCNMA1基因在食管鳞状细胞癌患者组织样本中的表达目的：本研究旨在分析经过维拉帕米联合化疗动脉灌注治疗的食管鳞状细胞癌患者数据,通过免疫组化法对不同治疗效果病例KCNMA1基因表达情况检测,探讨KCNMA1在ESCC动脉灌注治疗中的作用。方法：1.所有患者釆用Seldinger技术经股动脉穿刺每月介入治疗1次,每例患者介入治疗2-3次,介人治疗结束后第4周对疗效进行评估。方案为:维拉帕米（25 mg）+化疗药物（顺钻+5-氟尿嘧啶）?方法为:术前常规静脉滴注喘啶（0.25 mg）和地塞米松（5?10mg）;灌注过程中用肝素盐水间断冲洗导管35次,同时静脉滴注昂丹司琼（816 mg）和地塞米松（510 mg）?2.收集经过维拉帕米联合化疗动脉灌注治疗的食管鳞状细胞癌患者临床病例3.根据治疗效果将上述食管鳞状细胞癌患者临床病例分为四组,包括临床治愈或显着改善（CR）、临床治疗改善（PR）、临床治疗疗稳定（SD）和进行性或恶化（PD）.将CR+PR组定义为治疗阳性组,SD+PD组定义为治疗阴性组4.免疫组化实验比较各组食管癌患者中KCNMA1表达;结果:1、在患有ESCC中期或晚期的患者中,11例完全缓解（complete remission,CR）,65例部分缓解（partial remission,PR）,13例未出现改变（SD）,5例进行性疾病（progressive disease,PD）.总缓解率（CR+PR）为80.85%2、通过免疫组织化学测定法测量对VER逆转治疗方案呈阳性（CR或PR）患者的组织样品中KCNMA1表达明显高于阴性（SD和PD）的患者。结论:经靶动脉灌注维拉帕米联合化疗药物治疗中、晚期食管鳞状细胞癌提高了食管鳞状细胞癌治疗的近期疗效,改善了患者的临床获益及临床症状。免疫组化结果显示对本治疗方案呈阳性患者组织中KCNMA1表达显着高于阴性反应组。
聂元华[3]（2021）在《REG3G在胰腺癌中的表达及临床意义》文中认为研究目的 胰腺癌是临床常见的恶性肿瘤之一。因其早期及部分中期患者未见特异性临床症状,往往发现时已成晚期,难以手术治疗,同时,其化学治疗的疗效常常不佳,故病死率较高。REG基因是Ca2+依赖性凝集素基因家族成员,其编码的蛋白属于小分泌蛋白。REG蛋白在炎症时分泌增多,具有调节细胞生长和凋亡的能力,与各种恶性肿瘤的关系密切。其中,REG3G蛋白具有调控细胞凋亡,调节肿瘤内环境,平衡机体肠道菌群的能力,与肿瘤的发生、发展、治疗以及预后有重要作用。本研究通过数据库和实验综合分析,共同探究REG3G在胰腺癌中的表达、与患者临床病理信息的关联、以及影响肿瘤发生的相关通路,为胰腺癌的诊断及治疗提供新思路。方法1.生信分析通过Oncomine数据库以及GENT2数据库分别分析REG3G基因在各个肿瘤及其正常组织中的表达差异。利用TCGA数据库,分析REG3G表达与胰腺恶性肿瘤患者分期、分化、淋巴结转移以及远处转移情况。随后,通过c Bio Portal数据库分析了REG3G在胰腺癌中基因突变情况;TIMER数据库分析机体各个免疫细胞浸润与REG3G表达量的关系;GSRA富集分析与REG3G相关的信号通路。2.相关实验为探索胰腺恶性肿瘤及正常胰腺中REG3G的表达差异,我们采用RT-PCR和Western blot进行细胞层面的分析;同时收集手术病理组织标本,利用免疫组化分析REG3G与患者病理和临床相关资料的关系。结果1.Oncomine分析结果提示,REG3G在子宫颈、胃、淋巴组织以及胰腺的正常组织和癌组织中表达存在差异（p<0.05）。GENT2数据库分析结果提示,在乳腺、结肠、子宫内膜、皮肤、胃、舌以及胰腺的正常组织与癌组织中,REG3G的表达有差异（p<0.05）。同时,两个数据库均提示,REG3G在正常胰腺中地表达高于其在胰腺恶性肿瘤组织中（p<0.05）。2.RT-PCR提示REG3G在正常胰腺HPNE细胞的表达量明显高于其他3株胰腺癌细胞（p<0.05）。Western blot提示REG3G在HPNE细胞中表达最高,癌细胞中的表达量低于HPNE细胞（p<0.05）。3.免疫组化提示胰腺癌组织中REG3G的阳性表达率（18/53）低于其在对应的癌旁组织中的阳性表达率（46/53）（p<0.05）。K-M生存曲线分析说明REG3G与患者预后有关,高表达REG3G的患者预后较好。Mann Whitney U检验或Kruskal Wallis检验及卡方检验结果提示:REG3G的表达量与肿瘤分化程度及肿瘤大小和分期情况有关,高分化、肿瘤小、早期的肿瘤组织REG3G表达量较高,反之则低（p<0.05）。4.单因素及多因素分析说明,REG3G可以作为预测胰腺恶性肿瘤患者预后情况的独立危险因素（p<0.05）。5.通过TCGA数据库下载胰腺癌临床相关数据,通过Log-Rank分析结果提示,REG3G的表达与胰腺恶性肿瘤患者的分期以及淋巴结情况相关（p<0.05）,与分化程度没有关系（p>0.05）。6.cBioPortal数据库提示,在168例胰腺癌样本中,共有10例发生了REG3G基因突变。在REG3G蛋白中除了Lectin-C结构域以外,共有1个突变位点。基因突变主要形式包括融合以及m RNA表达升高。同时结果提示REG3G表达与REG1B成正相关（p<0.01）。7.TIMER数据库汇总了不同算法分析REG3G与免疫细胞浸润相关性的结果。CIBERSORT算法提示REG3G表达与CD8+T细胞、单核细胞以及巨噬细胞（M1型）浸润呈正相关。XCELL算法提示REG3G与CD4+T细胞浸润呈负相关。TIMER算法提示REG3G与B细胞浸润呈负相关,p均<0.05。而REG3G在胰腺癌中的表达与免疫细胞Treg浸润无关,p>0.05。8.GSEA结果提示与MAPK、WNT、细胞周期等相关的蛋白富集在REG3G高表达组,补体凝集素系统富集于REG3G低表达组。结论 胰腺恶性肿瘤组织及细胞中REG3G蛋白及m RNA的表达减低,正常组织和细胞中REG3G的蛋白及m RNA表达升高。分化程度、分期以及预后与REG3G的表达量有关。在胰腺癌组织中,REG3G与部分免疫细胞浸润有关。REG3G高表达组富集了多个与肿瘤发生相关的信号通路。总体而言,REG3G与胰腺癌发生关系密切,为未来胰腺癌的诊断和治疗提供新方向。
杜金童[4]（2020）在《CDK1在胰腺癌中的生物学功能、临床意义及相关抑制剂研究》文中研究表明研究背景胰腺癌是恶性程度极高的消化道肿瘤之一,其总体5年生存率不足8%。近年来,随着研究的深入,越来越多的治疗方案被不断提出,但胰腺癌患者的预后并未得到明显的改善。目前,传统的化疗药物对胰腺癌患者疗效有限,胰腺癌的靶向治疗也一直举步维艰。2005年FDA批准了“吉西他滨+厄洛替尼”用于局部晚期不可切除或有远处转移的胰腺癌患者的治疗,然而仅约10天的生存期提高使得厄洛替尼在胰腺癌治疗中难以取得较大的临床获益。2019年12月,FDA批准了 PARP抑制剂奥拉帕利用于携带BRCA基因突变的转移性胰腺癌患者的维持治疗,然而携带有BRCA基因突变的转移性胰腺癌患者人群数量有限。因此,有必要继续探索新的抗胰腺癌靶点,为未来胰腺癌的临床治疗研究提供一定的基础。细胞周期蛋白依赖性激酶（Cyclin-dependent kinases,CDKs）在细胞周期的调控中处于核心地位。目前,在人体中已发现的CDKs包含20个亚型,其中CDK1～6和CDK14～18直接参与细胞周期调控,其它CDKs则主要调控基因转录。已有研究证实,CDKs的异常激活可导致细胞周期进程的失调,从而导致肿瘤细胞异常增殖。近年来,已有多个CDK4/6的选择性小分子抑制剂被FDA批准上市,用于晚期或转移性乳腺癌患者。有研究发现了 CDKs在胰腺癌的发生和发展中具有重要作用。CDK5在胰腺腺癌中过度表达,可促进胰腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移。KRAS突变可刺激CDK8的表达,通过Wnt/β-catenin信号通路促进胰腺癌细胞的侵袭和迁移。在众多的CDKs中,CDK1则具有不可替代的位置。在正常生理条件下,CDK1与Cyclin A或Cyclin B形成复合物,调控细胞周期G2/M,而CDK1异常激活则与肿瘤的发生发展密切相关。CDK1在结直肠癌、肝癌和肺癌等多种肿瘤中过表达,并且与患者的不良预后有关。CDK1选择性抑制剂RO3306对白血病、乳腺癌等多种肿瘤细胞具有良好的抗增殖活性。然而CDK1在胰腺癌中的研究仍然较少。有研究发现,磷酸酶CDC25B的抑制剂可抑制胰腺癌细胞生长,并观察到CDK1磷酸化水平增高以及细胞G2/M期阻滞。CDK1在胰腺癌患者组织中高表达,且与患者较差的预后有关。目前仍未有研究阐明抑制CDK1对胰腺癌生长的影响,CDK1在胰腺癌中的生物学功能与临床意义有待进一步探索。此外,尽管已有研究发现CDKs泛抑制剂具有良好的抗胰腺癌活性,然而靶向CDK1的选择性抑制剂RO3306在胰腺癌中的抗肿瘤活性及作用机制尚未见报道。因此,仍需进一步研究CDK1成为抗胰腺癌靶点的潜力,探索新的抗胰腺癌策略。另一方面,细胞凋亡的异常调控也是胰腺癌发生发展的重要原因。有研究表明,抗凋亡蛋白Mcl-1在胰腺癌中异常表达,抑制Mcl-1可抑制胰腺癌的生长。对Mcl-1蛋白及内源性细胞凋亡通路的调控是CDKs抑制剂诱导肿瘤细胞凋亡的重要机制。因此,可通过研究CDK1抑制剂RO3306对Mcl-1蛋白的影响,进而分析其作用机制。另外,多项研究表明,Mcl-1小分子抑制剂具有较好的抗胰腺癌活性。因此,进一步筛选新型Mcl-1抑制剂有助于将来探索新的抗胰腺癌策略。研究目的本课题旨在研究CDK1作为新型抗胰腺癌靶点的潜力,探索新的抗胰腺癌策略,为将来胰腺癌的临床转化研究提供一定的基础。首先,研究CDK1在胰腺癌中的生物学功能;其次,研究CDK1在胰腺癌患者中的表达及临床意义;再次,进一步对已知的CDK1抑制剂RO3306进行抗胰腺癌活性研究,通过研究RO3306对Mcl-1等相关蛋白的影响以探索其作用机制;最后,筛选新型CDK1抑制剂和Mcl-1抑制剂,并对其进行靶点抑制活性及抗胰腺癌活性研究。研究方法和结果第一部分敲减CDK1对胰腺癌体内外生长的影响1、首先,通过生物信息学分析、基因敲减和细胞增殖实验,发现敲减CDK1能够在体外显着抑制胰腺癌细胞的增殖。（1）基于TCGA数据中170余例胰腺癌患者的mRNA表达谱数据,通过生物学信息学GEPIA平台分析了CDK1-CDK10在胰腺癌组织和正常组织中的表达情况,发现CDK1、CDK2和CDK6在胰腺癌患者组织中高表达（p<0.01）,且其高表达与患者差的生存期相关（p<0.05）。（2）通过Celigo细胞增殖实验,分别研究了敲减CDK1、CDK2和CDK6对Panc-1胰腺癌细胞增殖的影响,发现敲减CDK1对Panc-1细胞增殖的抑制效果最为明显（p<0.005）。2、进一步研究了敲减CDK1对胰腺癌细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡及细胞迁移的作用。通过MTT细胞增殖实验,发现了敲减CDK1可抑制胰腺癌细胞（Panc-1和Aspc-1）的增殖（p<0.05）。使用流式细胞仪进行细胞周期和细胞凋亡实验,结果表明,敲减CDK1可将胰腺癌细胞（Panc-1和Aspc-1）阻滞在G2/M期（p<0.05）,但对细胞凋亡无明显影响（p>0.05）。通过Transwell实验表明,敲减CDK1能够抑制Panc-1细胞迁移（p<0.05）,而对Aspc-1细胞的迁移没有影响（p>0.05）。3、使用肿瘤异种移植模型研究了敲减CDK1对裸鼠胰腺癌体内生长的影响,结果表明,与对照组相比,敲减CDK1的瘤体生长速度及重量均低于对照组（p<0.05）。第二部分CDK1在胰腺癌患者中的表达与临床意义1、首先,通过免疫组化方法检测了 CDK1在90例胰腺癌术后患者的胰腺癌组织及对应的60例癌旁组织中的表达。结果显示,在44例有配对癌旁组织的患者中,CDK1在胰腺癌患者中高表达,其细胞浆表达高于细胞核表达（p<0.05）。2、进一步分析了 73例胰腺癌患者中CDK1的表达与临床病理特点的关系。结果示,CDK1在细胞浆中的表达与组织学分级、p53和Ki67表达有关（p<0.05）;CDK1在细胞核中的表达与p53表达有关（p<0.05）。3、最后,分析了 CDK1的表达与73例胰腺癌患者预后的关系。Kaplan-Meier曲线法及单因素分析表明,CDK1细胞浆高表达的患者具有更短的总生存期（p<0.05）。COX多因素分析表明组织学分级和N分期是总生存期的独立预后因子（p<0.05）,而CDK1不是总生存期的独立预后因子（p>0.05）。CDK1细胞核表达与胰腺癌患者的总生存期无关（p>0.05）。第三部分CDK1抑制剂RO3306的抗胰腺癌活性及作用机制研究1、首先,研究了 RO3306在胰腺癌细胞中的抗增殖活性。(1通过Western-blot实验,检测了 CDK1在五种胰腺癌细胞系中的表达,发现了 CDK1在SW1990细胞系中表达量最高。（2）通过SRB细胞增殖实验,发现了 RO3306能够抑制五种胰腺癌细胞的增殖,且其对SW1990细胞的抗增殖效果最佳（IC50=2.9 μM）,优于化疗药物5-Fu（IC50=4.9 μM）。2、进一步研究了 RO3306抗胰腺癌的作用机制。（1）使用流式细胞仪检测了 RO3306对SW1990细胞周期的影响,结果发现,RO3306能够将细胞周期阻滞在G2/M和S期（p<0.05）。通过Western-blot实验表明,RO3306可能是通过激活p53-p21信号通路实现对细胞周期S期的阻滞。（2）使用流式细胞仪检测了RO3306对SW1990细胞凋亡的影响,结果发现,RO3306能够诱导SW1990细胞凋亡（p<0.005）。通过Western-blot实验表明,RO3306可能通过影响Bcl-2-Bax信号通路以及调控Mcl-1蛋白的磷酸化水平,进而诱导胰腺癌细胞凋亡。3、最后,通过SRB抗增殖实验研究了 RO3306与四种化疗药物（5-Fu、吉西他滨、紫杉醇或奥沙利铂）的联合用药效果,结果表明RO3306能够增强5-Fu和紫杉醇对胰腺癌细胞SW1990的抗增殖活性。第四部分新型CDK1抑制剂及Mcl-1抑制剂的研究1、通过计算机虚拟筛选平台进行了 CDK1抑制剂以及Mcl-1抑制剂的筛选。综合运用三维药效团和分子对接技术,分别构建了针对CDK1小分子抑制剂和Mcl-1小分子抑制剂的虚拟筛选平台,对商业化合物库中21万个分子进行了虚拟筛选。通过对筛选到的命中化合物进行活性测试,发现了初步具有CDK1抑制活性的化合物,以及与阳性药Gossypol活性相当的Mcl-1抑制剂M02（Ki=5.4μM）和 M08（Ki=0.53μM）。2、进一步研究了新型Mcl-1抑制剂M02和M08的抗胰腺癌活性。Western-blot实验表明,Mcl-1蛋白在五种胰腺癌细胞中均有表达,在SW1990细胞中表达最高。SRB实验表明,M02和M08在胰腺腺癌细胞SW1990中具有一定的抗增殖活性（IC 50=44.4-48.4μM）。细胞周期和细胞凋亡实验表明,M02和M08不仅能够诱导SW1990细胞凋亡（p<0.005）,而且可将细胞周期阻滞在G2/M期（p<0.05）。进一步的联合用药实验表明,M08能够提高吉西他滨或5-Fu对胰腺癌细胞的抗增殖活性,而M02对吉西他滨或5-Fu的抗增殖活性影响较小。研究结论1、敲减CDK1对胰腺癌细胞具有抗增殖活性,可将胰腺癌细胞阻滞在G2/M期,并且在小鼠肿瘤异种移植模型中具有较好的肿瘤生长抑制效果,表明CDK1有望成为新型抗胰腺癌靶点。2、CDK1在胰腺癌患者中高表达,其细胞浆表达高于细胞核表达。细胞浆表达与肿瘤级别、p53表达和Ki67表达等临床病理特征有关,细胞核表达与p53的表达有关。细胞浆高表达CDK1的患者具有更短的总生存期。提示CDK1可作为胰腺癌潜在的生物学标志物。3、CDK1抑制剂RO3306在多种胰腺癌细胞系中均具有抗增殖活性。RO3306对胰腺癌细胞周期阻滞的作用与p53-p21信号通路有关。RO3306还可通过影响Bcl-2-Bax信号通路以及下调Mcl-1蛋白的磷酸化水平,进而诱导胰腺癌细胞凋亡。此外,RO3306能够增强5-Fu或紫杉醇对胰腺癌细胞的抗增殖活性。4、发现了新型具有CDK1抑制活性的化合物,以及与阳性药活性相当的Mcl-1新型抑制剂M02和M08。特别是,M02和M08具有抗胰腺癌活性,且M08可增强吉西他滨或5-Fu对胰腺癌细胞的抗增殖活性。
周文阳[5]（2020）在《长链非编码RNA LINC00473通过上调PD-L1表达促进胰腺癌的恶性生物学行为》文中认为目的:胰腺癌是一种致死率很高的恶性肿瘤,预后差,在世界范围内日益成为一种沉重的健康负担。虽然手术、化疗和放射治疗可以轻微缓解胰腺癌患者的症状,但由于缺乏有效的分子生物标记物实现早期发现和预测预后,胰腺癌病人临床治疗效果仍不理想。因此,寻找新的潜在的胰腺癌治疗靶点已迫在眉睫。研究发现PD-L1在临床预后差的胰腺癌患者中过度表达。PD-L1作为T细胞活化的负调控分子,通过改变免疫监视状态促进肿瘤进展。最近,程序性死亡配体-1（PD-L1）作为一种免疫检查点,已开始应用于肿瘤治疗。众所周知,miRs可以控制多个靶基因的表达,从而调节各种生物过程和免疫监视。值得注意的是,一些microRNAs（miRs）已被证实下调PD-L1从而提高靶向治疗的疗效。miR-195-5p被发现与多种人类癌症有关,且miR-195在胰腺癌中的抑瘤作用已经在以往的研究中被报道。竞争性内源性RNA（ceRNAs）被认为是通过降低miRs的靶向浓度来进行相互通信的RNA转录物。长链非编码RNA（lncRNAs）作为ceRNAs可以调节癌症进展。目前,一系列lncRNAs已被证实在胰腺癌肿瘤形成中起重要作用。LINC00473在肾母细胞瘤组织中过度表达,抑制了miR-195在发病机制中的抑癌作用。我们在线预测发现miR-195-5p与LINC00473及PD-L1均存在结合位点。综上所述,我们推测LINC00473可能通过结合miR-195-5p调节PD-L1表达,促进胰腺癌发生和发展。本研究旨在证实这一假说,为进一步分析胰腺癌进展的分子机制提供一定的理论基础。研究方法:1.临床资料:选取从2008年12月至2012年1月,在中国医科大学附属盛京医院胰腺和胆道外科接受胰腺切除术的134例胰腺癌患者的胰腺癌组织。对这些病人随访36个月,随访截至时间为2014年12月,采用Kaplan-Meier法进行生存期分析。另外,收集20名胰腺良性囊肿患者的正常胰腺组织,液氮保存做后续分析。本研究符合中国医科大学附属盛京医院伦理委员会批准的指导原则。2.免疫组化方法检测PD-L1蛋白在胰腺癌和正常胰腺组织中的表达情况。3.利用RT-qPCR法检测PD-L1、LINC00473及miR-195-5p在胰腺癌组织中的表达。4.利用RT-qPCR法检测LINC00473在5种胰腺癌细胞株中表达,筛选出1株表达量最高的细胞株用于后续实验。5.双荧光素酶报告基因检测mi R-195-5p与PD-L1及LINC00473的结合情况。6.FISH检测LINC00473的细胞定位。7.RNA免疫共沉淀和RNA下拉实验检测miR-195-5p与LINC00473的结合情况。8.构建miR-195-5p模拟物及抑制物、LINC00473过表达质粒及沉默质粒及相应对照组转染SW-1990细胞。9.分别用EDU细胞增殖检测、Tunel细胞凋亡检测、划痕实验及Transwell实验检测各组细胞的增殖、凋亡、迁移及侵袭情况。10.用RT-qPCR及Western blot方法检测各组细胞Bcl-2,Bax,MMP-2及MMP-9表达情况。11.将SW-1990细胞与CD8+T细胞共培养,ELISA法检测各组细胞的细胞因子IL-10、IFN-γ、IL-4表达量。12.Annexin V-FITC/PI双染法检测各组CD8+T细胞凋亡。13.用RT-qPCR及Western blot方法检测各组细胞PD-1及PD-L1表达情况。结果:1.免疫组化染色结果显示,PD-L1主要表达在细胞膜,PD-L1在胰腺癌组织中阳性表达率为57.69%,明显高于正常胰腺组织（23.53%）。PD-L1高表达与肿瘤大小、肿瘤分期、淋巴结转移、远处转移密切相关（P<0.05）。Kaplan-Meier分析显示PD-L1阳性表达组的胰腺癌患者整体生存较差。2.与正常胰腺组织相比,胰腺癌组织中LINC00473、PD-L1表达显着升高,miR-195-5p表达显着降低（P<0.05）。与人正常胰腺细胞H6C7相比,胰腺癌细胞SW-1990、Panc-1、Bx PC-3、AsPC-1、CAPAN-2中LINC00473表达均显着升高,我们选择LINC00473表达水平最高的SW-1990细胞株开展后续实验。3.双荧光素酶报告基因检测结果显示,与阴性对照组相比,miR-195-5p与PD-L1野生型质粒共转染组荧光素酶活性显着降低（P<0.05）,而突变型质粒荧光素酶活性强度无明显变化。说明miR-195-5p与PD-L1存在靶向调节关系。分组实验中miR-195-5p mimic组miR-195-5p表达量显着升高,miR-195-5p inhibitor+Atezolizumab（PD-L1抑制剂）组miR-195-5p表达量显着降低。miR-195-5p mimic组和Atezolizumab组PD-L1表达量显着降低。结果表明,miR-195-5p可靶向下调PD-L1表达。4.荧光原位杂交试验表明LINC00473主要定位于细胞质。5.双荧光素酶报告基因检测结果显示,与阴性对照组相比,野生型LINC00473质粒与miR-195-5p共转染组荧光素酶活性显着降低（P<0.05）,而突变型质粒荧光素酶活性强度无明显变化,说明miR-195-5p与LINC00473存在靶向调节关系。RNA pull down结果显示,与MUT-mi R-195-5p和Bio-NC组相比,WT-miR-195-5p结合的LINC00473明显增加,RIP实验进一步证实LINC00473可以与miR-195-5p结合。在LINC00473沉默和过表达的分组实验中,si-LINC00473组细胞miR-195-5p表达显着升高,PD-L1表达量显着降低,miR-195-5p inhibitor组miR-195-5p表达显着降低,PD-L1表达量显着升高（P<0.05）。表明LINC00473作为ceRNA结合miR-195-5p,从而上调PD-L1表达。6.分组功能实验中显示与Blank组相比,miR-195-5p mimic组和Atezolizumab组SW-1990细胞增殖情况显着降低,凋亡情况显着升高,Bcl-2基因表达量显着降低,Bax表达量显着升高（P<0.05）。划痕实验和Transwell侵袭实验结果显示,与Blank组相比,mi R-195-5p mimic组和Atezolizumab组细胞迁移和侵袭情况显着降低,MMP-2、MMP-9表达量显着降低（P<0.05）。结果表明,过表达miR-195-5p或抑制PD-L1可促进胰腺癌细胞凋亡,抑制增殖、迁移和侵袭。7.沉默LINC00473和过表达LINC00473分组功能实验结果显示,与Blank相比,si-LINC00473组细胞增殖情况显着降低,凋亡情况显着升高,Bcl-2基因表达量显着降低,Bax表达量显着升高。LINC00473组细胞增殖情况显着升高,细胞凋亡情况显着降低,Bcl-2基因表达量显着升高,Bax表达量显着降低（P<0.05）。划痕实验和Transwell侵袭实验检测显示,与Blank组相比,si-LINC00473组细胞迁移和侵袭情况显着降低,MMP-2、MMP-9表达量显着降低,LINC00473组细胞迁移和侵袭情况显着升高,MMP-2、MMP-9表达量显着升高（P<0.05）。结果表明,沉默LINC00473可促进胰腺癌细胞凋亡,抑制增殖、迁移和侵袭。8.将各组SW-1990细胞和CD8+T细胞的共培养后进行以下实验。ELISA结果显示,与Blank相比,si-LINC00473组细胞促肿瘤细胞因子IL-10表达量显着降低,抗肿瘤细胞因子IFN-γ、IL-4表达量显着升高;LINC00473组细胞促肿瘤细胞因子IL-10表达量显着升高,抗肿瘤细胞因子IFN-γ、IL-4表达量显着降低（P<0.05）。流式细胞仪检测凋亡结果显示,与Blank相比,si-LINC00473组CD8+T细胞凋亡情况显着降低,LINC00473组CD8+T细胞凋亡情况显着升高（P<0.05）。RT-qPCR和Western-blot结果显示,与Blank相比,si-LINC00473组细胞PD-L1、PD-1表达情况显着降低,LINC00473组细胞PD-L1、PD-1表达情况显着升高（P<0.05）。结果表明:LINC00473作为ceRNA结合miR-195-5p上调PD-L1的表达影响CD8+T细胞活化。结论:1.高水平的PD-L1表达与胰腺癌患者不良预后显着相关。与正常胰腺组织相比,胰腺癌组织中LINC00473、PD-L1表达量增高,mi R-195-5p表达量降低。2.LINC00473作为ceRNA通过竞争性结合miR-195-5p上调PD-L1表达。3.胰腺癌中miR-195-5p靶向抑制PD-L1的表达,抑制胰腺癌进展。4.LINC00473作为ceRNA结合miR-195-5p上调PD-L1的表达进而促进胰腺癌细胞增殖、迁移及侵袭,抑制胰腺癌细胞凋亡,可以加速胰腺癌进展。5.LINC00473作为ceRNA结合miR-195-5p上调PD-L1的表达,从而抑制CD8+T细胞活化。
石岩玉[6]（2020）在《培美曲塞联合顺铂促进卵巢癌SKOV3细胞调亡和抑制侵袭的研究》文中进行了进一步梳理卵巢癌是常见的女性生殖系统恶性肿瘤,可发生于任何年龄阶段,在妇科肿瘤中,卵巢癌的病死率位于首位[1]。由于卵巢癌发病隐匿,又缺乏有效的早期诊断技术,导致70%卵巢癌确诊时已处于疾病晚期阶段[2]。目前临床治疗措施主要是手术+化疗+维持治疗（PARP抑制剂）,其中化疗仍是卵巢癌治疗的关键手段。70%左右的上皮性卵巢癌对铂类联合紫杉醇化疗敏感,然而随着化疗次数增多,最终出现铂耐药、疾病出现难以控制的进展[3],致使晚期卵巢癌患者的5年生存率仅有30%左右[4]。顺铂是常用的抗肿瘤化疗药物,临床上用于多种实体肿瘤的治疗[5]。目前多数认为顺铂杀灭肿瘤细胞的机制主要是引起DNA损伤、破坏DNA复制和转录而致细胞毒性,间接启动线粒体通路介导的内源性凋亡途径,其中Bcl-2/BAX家族和Caspase家族蛋白的活化发挥至关重要的作用[6]。顺铂为药物剂量-浓度依赖性的抗肿瘤药物,但因其严重的神经毒性、耳肾毒性等严重副作用,限制了铂类药物的大剂量长期应用,另外,长期治疗过程中逐渐出现铂类耐药,限制了铂类药物使用。需要寻找药物与铂类药物联合应用,提高疗效,延缓耐药,降低剂量减轻副作用。近年来随着分子靶向药物在恶性肿瘤治疗中的应用,叶酸代谢通路中的关键酶作为肿瘤治疗的靶点逐渐受到关注。培美曲塞是一种新型多靶点抗叶酸代谢药物[7],体外研究显示,培美曲塞主要抑制胸苷酸合成酶（TS）,对二氢叶酸还原酶（DHFR）、甘氨酰胺核苷酸甲酰转移酶活性也有一定的抑制作用,导致嘌呤和嘧啶合成障碍,从而抑制DNA复制、阻滞细胞于S期。多项临床研究显示培美曲塞与化疗药物联用对恶性胸膜间皮瘤、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤具有抗瘤活性[8]。培美曲塞通过细胞膜上的叶酸结合蛋白运输系统进入细胞内[9],其抗肿瘤治疗的效应可能与叶酸受体的表达的高低有关。目前发现的叶酸受体有三种亚型[10],分别为叶酸受体-α（FR-α）、叶酸受体-β（FR-β）、叶酸受体-γ（FR-γ）。其中FR-α的高表达与人类肿瘤进展、化疗耐药相关[11]。FR-α位于细胞外膜[12],通过胞饮机制将叶酸转运到细胞内,通过胸苷酸合成酶（TS）等参与噪呤、嘧啶的合成。YU等[11]实验研究表明,FR-α在正常卵巢、卵巢良性病变的血清、组织不表达或者低表达,而在上皮性卵巢癌中呈现高表达状态,大多数表达于浆液性卵巢癌。FR-α高表达通过加强嘌呤、嘧啶的合成作用,促进肿瘤细胞DNA复制及损伤修复、导致肿瘤细胞的耐药。有资料显示FR-α高表达可能是培美曲塞抗肿瘤治疗的有效生物学标记[13]。当与顺铂联用时,一方面使顺铂所致肿瘤细胞DNA损伤不能修复、增强顺铂化疗的敏感性;另一方面通过阻止DNA复制抑制肿瘤细胞增殖[14]。本实验旨在研究抗叶酸代谢药物培美曲塞与顺铂联用,对卵巢癌SKOV3细胞增殖、凋亡、侵袭的影响及相关机制,为临床卵巢癌的治疗提供新的思路。目的通过qRT-PCR技术、Western Blot法检测中国仓鼠卵巢上皮细胞CHO、卵巢癌SKOV3细胞中FR-α及胸苷酸合成酶（TS）的mRNA及蛋白水平,并着重研究培美曲塞联合顺铂对卵巢癌SKOV3细胞增殖、凋亡、侵袭的影响及其可能机制。研究对象和实验方法1.研究对象:中国仓鼠卵巢上皮细胞CHO、卵巢癌SKOV3细胞。2.研究方法:qRT-PCR技术、Western Blot法检测中国仓鼠卵巢上皮细胞CHO、卵巢癌SKOV3细胞中FR-α mRNA、蛋白及TS mRNA、蛋白水平;MTT、Annexin V-FITC和PI双染法结合流式细胞术、Transwell检测培美曲塞、顺铂及培美曲塞联合顺铂对SKOV3细胞的增殖、凋亡、侵袭的影响;Western blot实验检测培美曲塞、顺铂及联合使用时对BAX、Bcl-2蛋白表达的影响,同时Western Blot法检测SKOV3细胞加入培美曲塞前后TS、FR-α蛋白的变化。3.统计学方法:采用SPSS24.0进行统计分析。正态分布计量资料用x±s表示,非正态分布定量资料用M（P25～P75）表示,应用两独立样本t检验分析两组定量资料,培美曲塞、顺铂及联合使用对SKOV3侵袭及凋亡的影响采用单因素方差分析,检验水准α=0.05。结果1.FR-α 蛋白（0.46±0.04）、TS 蛋白（0.34±0.03）在卵巢癌 SKOV3 细胞,与中国仓鼠卵巢上皮细胞CHO中的FR-α蛋白（0.12±0.02）、TS蛋白（0.19±0.02）相比,差异均具有统计学意义（P<0.001）;FR-α mRNA（3.73±1.50）、TS mRNA（1.77±0.48）在卵巢癌SKOV3细胞,与中国仓鼠卵巢上皮细胞CHO中的FR-αmRNA（0.90±0.38）、TS mRNA（0.75±0.29）相比,差异均具有统计学意义（P<0.01）。2.在体外采用不同浓度（10mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L、160mg/L、320mg/L、640mg/L、1280mg/L）的培美曲塞处理 SKOV3,不同浓度（0.75mg/L、1.5mg/L、3mg/L、6mg/L、12mg/L）的顺铂处理SKOV3。结果显示培美曲塞、顺铂对SKOV3细胞的增殖抑制作用均呈剂量浓度依赖性,培美曲塞IC50值为（597.53±113.27）mg/L,顺铂 IC50 值为（8.23±0.79）mg/L。6mg/L 顺铂的增殖抑制率为（25.57±0.94）%,320mg/L培美曲塞的增殖抑制率为（34.82±1.64）%,二者联合的抑制率为（50.00±1.40）%,差异具有统计学意义（P<0.001）,选取为6mg/L顺铂、320mg/L培美曲塞作为后续实验浓度。3.侵袭结果表明,培美曲塞组平均侵袭细胞数（53.11±4.17）个,顺铂组平均侵袭细胞数（43.89±3.69）个,培美曲塞+顺铂组平均侵袭细胞数（26.22±2.99）个,对照组平均侵袭细胞数（73.44±6.16）,经单因素方差分析结果显示:联合用药组较单药组相比,差异具有统计学意义（P<0.001）。单药组较对照组相比,差异具有统计学意义（P<0.001）。4.凋亡结果表明,培美曲塞组细胞凋亡率为（17.46±0.84）%,顺铂组凋亡率为（20.50±0.93）%,而联合使用凋亡率则增加到（36.41±2.07）%,经过单因素方差分析结果显示,联合用药组细胞凋亡率明显大于单药组,且差异具有统计学意义（P<0.001）,单药组较对照组相比,差异具有统计学意义（P<0.001）。5.Western blot结果表明,Bcl-2蛋白在顺铂组（0.25±0.03）、培美曲塞组（0.31±0.02）、顺铂+培美曲塞组（0.12±0.01）,对照组（0.49±0.03）;BAX蛋白在顺铂组（0.42±0.04）、培美曲塞组（0.37±0.03）、顺铂+培美曲塞组（0.61 ±0.04）,对照组（0.16±0.02）。联合用药组的BAX、Bcl-2蛋白表达水平较顺铂组相比,差异均具有统计学意义（P<0.001）。6.Western blot结果表明,加入培美曲塞后SKOV3细胞中的TS蛋白（0.34±0.03）,较SKOV3细胞中的TS蛋白（0.25±0.02）相比,差异具有统计学意义（P<0.001）,而FR-α蛋白无明显变化。结论1.培美曲塞抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖、诱导凋亡、减弱细胞侵袭,与顺铂联合具有协同作用。2.在卵巢癌SKOV3细胞中FR-α、TS蛋白呈现高表达状态,培美曲塞可降低TS蛋白的表达。3.培美曲塞联合顺铂可能通过降低叶酸代谢通路中TS蛋白的表达抑制DNA复制及损伤修复,激活线粒体通路介导的内源性凋亡途径,从而为顺铂化疗起到增敏作用,为治疗卵巢癌提供新的思路。
杨刚[7]（2020）在《OLR1调控胰腺癌侵袭转移的功能与机制研究》文中认为研究背景胰腺癌是消化道恶性程度最高的肿瘤之一,总体五年生存率不足9%。主要原因在于胰腺癌早期症状不典型、容易发生远处转移等特点导致大部分患者就诊时就已发生局部进展或者远处转移。因此深入研究胰腺癌侵袭转移机制对寻找新的治疗靶点,改善患者预后具有重要意义。氧化低密度脂蛋白受体1（Oxidized low-density lipoprotein receptor 1,OLR1）是一种Ⅱ型膜表面糖蛋白,其既往研究主要聚焦在动脉粥样硬化、糖尿病等心脑血管、代谢性疾病领域。近年来,越来越多的研究显示OLR1可能也参与了癌症的发生发展,尤其是参与肿瘤的转移。课题组前期研究发现OLR1可能参与调节胰腺癌生物学行为,但其在胰腺癌中的具体作用及机制尚不完全明确。因此,本课题将进一步研究OLR1在胰腺癌中的作用及机制。研究目的明确OLR1对胰腺癌细胞增殖、侵袭、迁移及化疗敏感性等生物学行为的影响;探索OLR1调控胰腺癌侵袭、转移的具体机制;检测OLR1在胰腺癌组织中的表达并评估其临床意义。研究方法首先,在胰腺癌细胞株中上调或者下调OLR1的表达水平,在体外采用CCK8法、Transwell小室、细胞划痕等实验检测OLR1对胰腺癌细胞侵袭、迁移、增殖、化疗敏感性及划痕愈合等生物学行为的影响;然后,通过构建裸鼠皮下移植瘤、尾静脉移植瘤、原位移植瘤以及脾脏注射移植瘤等模型在体内明确OLR1对胰腺癌侵袭、转移的影响;其次,通过RT-qPCR、Western Blot、转录组测序、生物信息学分析、染色质免疫共沉淀、免疫荧光、双荧光素酶报告基因实验等技术探索OLR1调控胰腺癌侵袭转移的分子机制;最后,通过免疫组织化学染色检测胰腺癌组织中OLR1及其下游靶基因的表达水平并评估其作为胰腺癌患者预后标志物的临床应用价值。研究结果体外实验结果显示,上调OLR1的表达水平可以促进胰腺癌细胞增殖、侵袭、迁移及划痕愈合,并且降低胰腺癌细胞对吉西他滨的化疗敏感性;反之,敲低OLR1的表达水平则可以抑制胰腺癌细胞增殖、侵袭、迁移及划痕愈合,并且增加胰腺癌细胞对吉西他滨的化疗敏感性。体内实验结果显示,上调OLR1可以促进小鼠胰腺癌皮下移植瘤的生长,敲低OLR1则抑制小鼠胰腺癌皮下移植瘤的生长;并且,下调OLR1的表达水平后还可以抑制小鼠胰腺癌尾静脉注射移植瘤、原位移植瘤以及脾脏注射移植瘤的远处转移。机制方面,通过转录组测序、RT-qPCR、Western Blot及rescue实验发现OLR1可以通过上调c-Myc和HMGA2的表达水平促进胰腺癌的侵袭转移;通过生物信息学分析、染色质免疫共沉淀、双荧光素酶报告基因实验等方法证实c-Myc可以与HMGA2启动子区域结合,并促进HMGA2的转录与表达;通过rescue实验证明c-Myc可以通过调节HMGA2的表达促进胰腺癌侵袭转移;通过Western Blot等实验证明HMGA2可以导致胰腺癌细胞E-cadherin蛋白表达水平下降,Snail及β-Catenin表达水平升高,从而发生上皮间质转化,促进其侵袭转移。以上结果表明,OLR1可以通过c-myc促进HMGA2的转录,介导胰腺癌细胞发生上皮间质转化,最终导致胰腺癌发生侵袭转移。临床组织样本检测结果显示,OLR1主要分布在胰腺癌的细胞膜和细胞质,与癌旁组织相比,OLR1在胰腺癌组织中明显高表达;OLR1表达水平与肿瘤的分化程度、N分期以及TNM分期相关,OLR1高表达是胰腺癌患者预后不良的独立危险因素;OLR1与c-Myc、HMGA2在胰腺癌组织中的表达水平呈明显正相关,三者联合可以作为胰腺癌患者预后预测标志物:胰腺癌患者组织中这三种蛋白高表达种类越多,患者预后越差。结论OLR1可通过上调c-Myc表达水平,促进HMGA2的转录,使胰腺癌细发生上皮间质转化,从而促进胰腺癌细胞侵袭、转移,OLR1/c-Myc/HMGA2通路可能作为胰腺癌患者的预后标志物及潜在治疗靶点。
林海[8]（2020）在《Lnc-ATB通过miR-200c相关信号通路调控胆管癌增殖及转移的机制研究》文中研究指明第一部分胆管癌组织中Lnc-ATB/miR-200c的表达及临床意义目的:研究Lnc-ATB与miR-200c在胆管癌组织中的表达及相关性,初步探讨其临床意义。方法:应用q RT-PCR方法检测Lnc-ATB及miR-200（miR-200a/b/c）在30例胆管癌组织及相应非癌组织中的表达。对两者表达量进行相关性分析,并结合患者的临床病理资料分析其临床意义。结果:通过比较30例胆管癌患者肿瘤组织及其相应非癌组织中Lnc-ATB及miR-200a/b/c表达水平,发现胆管癌组织中Lnc-ATB表达升高（3.807±0.907 VS1.049±0.510,P<0.001）,而miR-200a（2.260±0.899 VS 3.099±1.062,p<0.05）,miR-200b（1.338±0.587 VS 2.268±0.510,P<0.001）及miR-200c（0.469±0.251 VS1.452±0.410,P<0.001）表达均降低,其中以miR-200c表达降低最为明显。相关性分析提示胆管癌组织中Lnc-ATB高表达与miR-200c低表达密切相关（P<0.01）。Lnc-ATB呈高表达的胆管癌患者肿瘤体积较大,容易合并淋巴结转移,TNM分期较晚。而miR-200c呈低表达的胆管癌患者容易合并淋巴结转移,具有较晚的TNM分期。结论:胆管癌组织中Lnc-ATB表达升高,miR-200c表达降低,两者表达呈负相关。Lnc-ATB可能在胆管癌中发挥癌基因作用,而miR-200c可能发挥抑癌基因作用。第二部分:Lnc-ATB/miR-200c信号轴在胆管癌细胞中表达及功能目的:通过体外实验探讨Lnc-ATB/miR-200c信号轴在胆管癌细胞中的表达及生物学作用。方法:应用q RT-PCR方法检测胆管癌细胞系HUCCT1、RBE、TFK1、Huh-28和人支气管上皮细胞BEC中Lnc-ATB/miR-200c的表达。采用si RNA技术敲低HUCCT1和RBE细胞中的Lnc-ATB表达水平,用q RT-PCR方法检测Lnc-ATB及miR-200c表达水平的变化。将Hu CCT1细胞同时转染带有野生型或突变型psi CHECK2-Lnc-ATB结合位点的质粒与miR-200c模拟物。转染后48h用双荧光素酶报告基因检测试剂盒进行荧光素酶活性测定,结合生物信息学分析,初步确定Lnc-ATB与miR-200c的调控关系及结合位点。采用si RNA技术敲低HUCCT1和RBE细胞中Lnc-ATB的表达结合共转染miR200c抑制剂建立三组不同Lnc-ATB/miR200c表达水平的细胞。三组细胞分别为单纯敲低Lnc-ATB表达组（si RNA-Lnc-ATB组）,si RNA-Lnc-ATB+共转染miR200c抑制剂组及阴性对照组,应用q RT-PCR方法检测各组细胞miR-200c表达水平变化。通过CCK8细胞增殖实验、流式细胞周期实验及细胞凋亡实验、Transwell试验分析Lnc-ATB/miR-200c信号轴对HUCCT1和RBE细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡及细胞迁移能力的影响。结果:与正常BEC细胞相比,Lnc-ATB在HUCCT1、RBE、TFK1、Huh-28四种胆管癌细胞株中呈高表达,而miR-200c呈相对低表达,其中以HUCCT1、RBE细胞最为明显,因此选择HUCCT1、RBE细胞进行si RNA干扰实验。si RNA干扰实验显示敲低HUCCT1和RBE细胞中Lnc-ATB的表达可以提高miR-200c的表达水平,并且si RNA1干扰效果优于si RNA2,因此采用si RNA1序列进行后续试验。生物信息学分析表明,Lnc-ATB含有潜在的miR-200c结合位点,预测miR-200c为Lnc-ATB的靶基因。双荧光素酶报告分析表明,miR-200c模拟物可以明显抑制带有野生型miR-200c结合位点的psi CHECK2-Lnc-ATB的荧光素酶活性,而在带有突变型miR-200c结合位点的psi CHECK2-Lnc-ATB中没有观察到这种现象。应用si RNA-Lnc-ATB体外敲低HUCCT1和RBE细胞Lnc-ATB表达可以升高miR-200c的表达水平,从而导致细胞增殖活力以时间依赖性方式下降,并促进细胞凋亡及G0/G1期阻滞,抑制细胞的迁移能力。然而,当将miR-200c抑制剂共转染入细胞以降低miR-200c表达时,可以逆转si RNA-Lnc-ATB对胆管癌细胞增殖、凋亡、G0/G1期阻滞及迁移能力的抑制。结论:胆管癌细胞中Lnc-ATB表达升高,miR-200c表达降低,Lnc-ATB通过抑制miR-200c表达参与调控胆管癌细胞的生长及迁移过程。第三部分:Lnc-ATB/miR-200c信号轴调控胆管癌生长和迁移的分子机制目的:研究Lnc-ATB/miR-200c相关信号通路因子在胆管癌细胞中的表达,为后续进一步研究提供理论指导。方法:采用si RNA技术敲低HUCCT1和RBE细胞中Lnc-ATB的表达,结合共转染miR200c抑制剂建立三组不同Lnc-ATB/miR200c表达水平的细胞。三组细胞分别为单纯敲低Lnc-ATB表达组（si RNA-Lnc-ATB组）,si RNA-Lnc-ATB+共转染miR200c抑制剂组及阴性对照组（NC组）。应用Western blotting检测三组细胞之间细胞周期相关蛋白CCND1/CDK2、细胞凋亡相关蛋白BCL-2/Caspase-3及EMT相关信号通路因子ZEB1/2及E-cadherin/N-cadherin的表达差异。结果:体外敲低HUCCT1细胞Lnc-ATB表达可以抑制CCND1/CDK2表达,升高Caspase-3表达,降低BCL-2表达,抑制ZEB1/2表达,上调E-cadherin表达并下调N-cadherin表达。而将miR-200c抑制剂共转染入HUCCT1细胞后可以抑制miR-200c表达上调,进而逆转上述分子蛋白的表达变化。结论:Lnc-ATB通过抑制miR-200c表达调控胆管癌细胞周期、凋亡及EMT相关信号通路因子的表达,从而促进胆管癌细胞的增殖及迁移。第四部分:Lnc-ATB/miR-200c信号轴在胆管癌体外移植瘤模型中的作用目的:研究Lnc-ATB/miR-200c信号轴对胆管癌细胞成瘤作用及体内相关信号通路因子表达的影响,初步探讨其是否可能作为胆管癌诊断及治疗的潜在分子靶标。方法:设计包装携带有lentivirus-RNAi-Lnc-ATB,miR-200c抑制剂及阴性对照（negative control）的慢病毒,先利用该病毒感染HUCCT1细胞系,得到长期稳定表达的三组细胞,分别为单纯敲低Lnc-ATB表达组,敲低Lnc-ATB表达+共转染miR-200c抑制剂组及阴性对照组（NC组）。采用5周BALB/c裸鼠,随机分为三组,每组5只,分别取符合条件的三组HUCCT1细胞悬液建立裸鼠皮下移植瘤模型,连续饲养观察3周,每隔3天观察并记录期间肿瘤体积变化。待饲养3周后将裸鼠处死,比较肿瘤体积大小。采用免疫组织化学方法分析细胞增殖标志物PCNA在三组裸鼠肿瘤组织中的表达水平。利用Western blotting检测三组裸鼠肿瘤组织中细胞周期相关蛋白CCND1/CDK2、细胞凋亡相关蛋白BCL-2/Caspase-3及EMT相关信号通路因子ZEB1/2及E-cadherin/N-cadherin的表达差异。结果:采用慢病毒转染技术敲低HUCCT1细胞Lnc-ATB表达构建的裸鼠皮下移植瘤组织体积较小并伴有PCNA表达降低,而同时稳定转入miR-200c抑制剂的肿瘤细胞构建的裸鼠肿瘤组织体积及PCNA表达可以恢复。采用慢病毒转染技术敲低Lnc-ATB表达的HUCCT1细胞构建的裸鼠皮下移植瘤中的CCND1/CDK2及BCL-2表达降低,Caspase-3表达升高,ZEB1/2及N-cadherin表达降低,E-cadherin表达升高。而稳定转入si RNA-Lnc ATB+miR-200c抑制剂的肿瘤细胞构建的裸鼠移植瘤组织可以恢复其表达。结论:Lnc-ATB/miR-200c通过调控细胞周期、细胞凋亡及EMT相关信号通路因子表达促进胆管癌细胞的成瘤作用。Lnc-ATB/miR-200c或许可能成为胆管癌诊治的潜在分子靶标。
吴彬[9]（2019）在《TROP2在浆液性卵巢癌组织中的表达及对其生物学行为的影响》文中研究说明卵巢癌（Ovarian cancer,OC）是常见的妇科恶性肿瘤之一,尽管其发病率在妇科生殖系统肿瘤中居第三位,但其死亡率却高居首位。因卵巢癌的发病机制复杂,至今仍缺乏有效的诊断分子标记物及治疗靶点。因此,寻找针对卵巢癌的独特分子标志物仍是卵巢癌基础研究的一项重大课题,一旦有所突破,将能够有效提高患者生存率,为卵巢癌患者带来希望。人滋养层细胞表面抗原-2（TROP2）是一种在多种肿瘤中表达的跨膜糖蛋白,由TACSTD2基因编码,能通过传递细胞内的钙信号、调控ERK/MAPK的信号通路,来参与细胞周期相关蛋白的激活,从而影响肿瘤细胞的增殖、侵袭及凋亡等恶性生物学行为。TROP2被首次发现于胎盘的滋养细胞,它在具有干细胞性质的细胞中表达。研究表明TROP2在子宫内膜样腺癌、宫颈癌、乳腺癌、喉癌和结直肠癌等组织中都有过度表达,该蛋白过表达与多种恶性肿瘤患者的生存率降低以及肿瘤侵袭性和转移性增加有关,且TROP2在转移组织中的过度表达使其成为治疗晚期恶性肿瘤极具吸引力和潜在的治疗靶点。浆液性卵巢癌（Serous ovarian carcinoma,SOC）是卵巢癌中最常见的组织学类型。本研究我们检测出TROP2蛋白在SOC组织中的高表达,评价其与临床病理特征和预后之间的关系,并观察到用siRNA对卵巢癌细胞进行干扰后TROP2的表达明显下调。我们的结果表明TROP2蛋白过表达与SOC侵袭性进展和不良预后密切相关,是评价SOC不良预后的独立因素,能促进卵巢癌细胞增殖、侵袭和转移。TROP2是一个SOC潜在的预后标志物和靶向治疗的新靶点。第一部分TROP2在浆液性卵巢癌中的表达及与Ki-67的相关性研究目的:检测并分析TROP2在卵巢病变组织及正常卵巢、输卵管伞组织中的表达,探讨TROP2的表达在SOC细胞增殖中的作用及与SOC患者临床病理特征的相关性。方法:采用免疫组织化学方法检测126例SOC患者,36例交界性卵巢肿瘤,26例卵巢浆液性囊腺瘤、20例正常卵巢和20例正常输卵管伞石蜡包埋组织标本中TROP2及Ki-67蛋白的表达;比较不同临床病理特征的TROP2表达水平,并分析TROP2和Ki-67表达的相关性。结果:1.TROP2蛋白的表达情况卵巢低级别浆液性腺癌（LGSOC）实验组,采用正常卵巢组织作为正常对照组,正常卵巢组织中TROP2蛋白表达阴性12例（60%）,弱阳性7例（35%）,中度阳性1例（5%）,无强阳性表达。而LGSOC组织中TROP2蛋白阴性6例（10%）,弱阳性13例（21.7%）,中度阳性20例（5%）,强阳性21例（35%）,TROP2蛋白表达较正常卵巢、卵巢浆液性囊腺瘤及卵巢交界性肿瘤组织明显增高,具有统计学差异（P<0.05）。卵巢高级别浆液性腺癌（HGSOC）实验组,采用正常输卵管伞组织作为正常对照组,正常输卵管伞组织中TROP2蛋白表达阴性10例（50%）,呈弱阳性表达8例（40%）,中等阳性2例（10%）,无强阳性表达。HGSOC组织中TROP2蛋白表达阴性8例（12.1%）,弱阳性16例（24.2%）,中等阳性22例（33.3%）,强阳性表达20例（30.3%）,TROP2蛋白表达较对照组正常输卵管伞组织明显增高（P<0.05）。2.TROP2蛋白表达与SOC的FIGO临床分期、肿瘤病理分级、术前血清CA125水平、腹水和淋巴结转移关系密切（P<0.05）,而其表达与卵巢癌患者年龄及铂耐药无相关性（均为P>0.05）。3.Ki-67在卵巢低级别及高级别浆液性腺癌中的表达明显高于对照组及良性病变组织（P<0.05）。Spearman等级相关分析显示,TROP2和Ki-67在SOC组织中的表达具有相关性（P<0.05）。结论:1.TROP2在SOC组织中表达升高,与SOC的不良临床病理特征密切相关,说明TROP2参与SOC的发生发展过程。2.TROP2与Ki-67蛋白表达呈正相关,提示TROP2可能参与SOC细胞的增殖及侵袭过程。第二部分126例浆液性卵巢癌患者的临床资料统计及生存分析目的:进一步探究此项研究第一部分中影响SOC患者预后的相关因素。分析TROP2的表达、FIGO临床分期、肿瘤病理分级、术前血清CA125水平、腹水、淋巴结转移及年龄等不同因素对SOC患者生存时间的影响。方法:采集入组与第一部分中的SOC癌相同的患者病例,共计126例SOC患者。患者在山东大学附属齐鲁医院行手术且及时完成治疗,并保存了完整的病例记录和随访资料,术后随访时间60个月,随访信息包括总生存时间（OS）和无进展生存时间（PFS）。采用Kaplan-Meier法进行生存时间的比较,并绘制生存曲线;采用单因素、多因素Cox比例风险回归分析,筛选影响预后的主要因素。结果:1.单因素分析显示:TROP2蛋白过表达与无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）有相关性（均为P<0.05）。在FIGO临床分期、肿瘤病理分级、术前血清CA125水平、腹水和淋巴结转移方面,患者中位生存期具有统计学差异（P<0.05）,而年龄<50岁和≥50岁两组患者中位生存期无统计学差异。2.多因素COX回归模型分析结果显示:TROP2的表达、FIGO临床分期、术前血清CA125水平、腹水和淋巴结转移情况是影响SOC患者五年生存率的独立因素。结论:1.TROP2的过表达导致SOC患者的不良预后,是评价SOC预后的独立因素。2.FIGO临床分期、术前血清CA125水平、腹水和淋巴结转移也是影响卵巢癌预后的危险因素。第三部分TROP2的表达对卵巢癌生物学行为的影响目的:观察TROP2表达水平的变化对卵巢癌细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移能力等生物学行为的影响,探索TROP2在卵巢癌肿瘤的形成发展中的作用及可能的机制。方法:我们合成了两个独立的siRNA序列siRNA-550和siRNA-1100序列来转染卵巢癌细胞,干扰沉默TROP2的内源性表达。用Western Blot检测转染后TROP2蛋白的表达量;用CCK-8法测定TROP2表达水平的改变对卵巢癌细胞增殖能力的影响;分别用划痕实验和侵袭实验来测定细胞的迁移和侵袭能力;使用Western Blot法测定凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达。结果:1.免疫荧光染色分析显示:在A2780、HO8910和SK-OV-3细胞表面均有一层红色荧光染色。Western Blot检测结果表明TROP2蛋白在3种细胞中均有表达,其中A2780细胞系中TROP2的表达比其它两个细胞系更高。2.用转染序列siRNA-550和siRNA-1100对A2780进行干扰后,TROP2蛋白表达明显降低。3.用CCK-8法研究发现:TROP2基因沉默的A2780细胞增殖能力显着降低（P<0.05）。4.通过细胞侵袭实验发现:TROP2基因沉默后的卵巢癌细胞穿过Transwell小室的细胞数量明显降低（P<0.05）,说明细胞侵袭能力降低。5.细胞划痕试验显示在进行细胞划痕24和48小时后,TROP2基因沉默后的卵巢癌细胞具有显着较慢的划痕愈合速度（P<0.05）,说明细胞迁移能力显着下降。6.Western Blot法测定凋亡相关蛋白显示:TROP2基因沉默后的卵巢癌细胞Bcl-2蛋白的表达显着下降,而Bax蛋白表达显着增强。结论:通过沉默卵巢癌A 2780细胞的TROP2基因,发现TROP2基因参与卵巢癌细胞的增殖、侵袭和转移。TROP2基因通过破坏Bax/Bcl-2家族蛋白之间的平衡调节来诱导细胞凋亡。
林雪竹[10]（2019）在《FL118通过调控CIP2A/PP2A信号通路诱导结肠癌凋亡的机制研究》文中指出目的FL118是通过高通量筛选（HTS）化合物库得到的一种高效、低毒、抗耐药性强的新型喜树碱类抗癌药物。我们的前期研究表明,FL118能够通过抑制肿瘤细胞生长以及促进肿瘤细胞凋亡发挥抗肿瘤作用,但其作用机制尚未明确。本课题旨在探讨FL118对人结肠癌的抗肿瘤效果及其作用机制。方法（1）细胞实验。首先检测FL118对人结肠癌细胞（HCT116和SW480）的抗肿瘤作用。应用不同浓度（1、2、5、10、20、50和100 nM）FL118处理结肠癌细胞48小时后,通过CCK-8实验检测FL118对结肠癌细胞活力的影响,同时对FL118的应用浓度进行优化。应用优化浓度的FL118处理结肠癌细胞48小时后,通过克隆形成实验检测FL118对结肠癌细胞增殖的影响;利用光学显微镜观察FL118对结肠癌细胞形态的影响;通过Hoechst–PI染色实验和Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测FL118对结肠癌细胞凋亡的影响;通过WB实验检测凋亡标志性蛋白Cleaved Caspase 3、Cleaved PARP、Bax和Bcl-2的表达情况,从而检验FL118对结肠癌细胞凋亡的影响。为了进一步研究FL118发挥抗肿瘤作用的机制,应用FL118处理结肠癌细胞HCT116后,通过ITRAQ技术对其中的差异表达蛋白进行分析,发现FL118能够下调结肠癌细胞中CIP2A蛋白的表达水平。为了验证FL118对CIP2A表达水平的调控作用,应用优化浓度的FL118处理结肠癌细胞48小时后,通过qRT-PCR实验检测FL118对CIP2A的mRNA表达水平的影响;通过WB实验检测FL118对CIP2A的蛋白表达水平的影响。已知CIP2A作为PP2A的内源性抑制剂,其发挥作用的经典机制是抑制PP2A活性。为了进一步确认FL118通过调控CIP2A表达水平发挥作用的机制,应用PP2A磷酸酶活性测定实验检测FL118对结肠癌细胞中PP2A磷酸酶活性的影响,同时应用WB实验检测FL118对结肠癌细胞中PP2Ac蛋白表达水平的影响。利用R语言对TCGA数据库中结肠癌相关的基因数据进行分析,从而了解CIP2A基因在结肠癌中的表达情况;应用qRT-PCR实验对结肠癌患者的临床样本进行分析,从而了解CIP2A的mRNA在结肠癌中的表达情况;应用免疫组化实验对结肠癌患者的临床样本进行分析,从而了解CIP2A蛋白在结肠癌中的表达情况及其与结肠癌的关系,确认CIP2A能否作为本研究的目标蛋白。为了进一步验证FL118通过调控CIP2A表达水平发挥抗肿瘤作用,将PP2A抑制剂OA与FL118联合应用处理结肠癌细胞,按照处理情况将细胞分为四组:对照组、OA组、FL118组以及OA+FL118组。通过PP2A磷酸酶活性测定实验检测各组结肠癌细胞中PP2A磷酸酶活性的变化,同时通过WB实验检测PP2Ac蛋白表达水平的变化;通过CCK-8实验检测结肠癌细胞活力的变化,并通过流式细胞术实验以及WB实验检测结肠癌细胞凋亡的变化。（2）动物实验。利用结肠癌细胞HCT116对小鼠进行皮下注射,构建肿瘤异体移植模型。将实验动物分成空白对照组、低浓度实验组（4 mg/kg/week）和高浓度实验组（8 mg/kg/week）,各组实验动物采用灌胃方式给予相应剂量的FL118溶液。实验结束后,取出肿瘤,将小鼠的肿瘤组织以及主要组织（心、肝、脾、肺、肾、大脑）进行包埋保存。通过测量不同组别小鼠皮下肿瘤相对体积及重量来研究FL118对移植瘤体内生长的作用;通过TUNEL-DAPI染色实验检测FL118在动物水平对结肠癌凋亡的影响;通过HE染色实验检测FL118对移植瘤组织病理学的影响;通过免疫组化实验检测FL118对体内结肠癌凋亡及CIP2A蛋白表达水平的影响。通过测量不同组别小鼠体重的变化、对小鼠主要器官的组织切片进行HE染色、检测小鼠肝肾功能指标以及血常规检测实验对FL118的耐受性做出初步评价。结果（1）细胞实验。应用不同浓度（1、2、5、10、20、50和100 nM）FL118处理结肠癌细胞48小时后,CCK-8实验结果表明,FL118能够显着降低结肠癌细胞的活力,另将10 nM和20 nM选为后续实验浓度。应用优化浓度（10 nM和20 nM）FL118处理结肠癌细胞48小时后,克隆形成实验结果表明,FL118能够显着降低结肠癌细胞的增殖能力;细胞形态学观察实验的结果表明,FL118能显着影响结肠癌细胞形态,使其呈现凋亡趋势;Hoechst–PI染色实验以及流式细胞术结果表明,FL118能够显着诱导结肠癌细胞的凋亡,并具有剂量依赖性;在WB结果中,凋亡标志性蛋白Cleaved Caspase 3和Cleaved PARP的表达水平随FL118浓度的升高而显着上升,而Bcl-2/Bax比值逐渐降低,这一结果亦证实FL118能够诱导结肠癌细胞凋亡。ITRAQ结果表明,FL118能够使结肠癌细胞中多种蛋白出现差异表达,其中CIP2A蛋白受FL118调控后表达水平下降了约40倍,是所有差异表达蛋白中下调水平最高的一种蛋白。应用优化浓度（10 nM和20 nM）FL118处理结肠癌细胞48小时后,qRT-PCR实验结果表明,CIP2A的mRNA表达水平随着FL118浓度的升高而降低;WB实验结果表明,FL118能够显着下调CIP2A的蛋白表达水平。同时,PP2A磷酸酶活性测定实验结果表明,PP2A的磷酸酶活性随着FL118浓度的升高而显着上升;而WB实验结果表明,FL118并没有显着影响PP2Ac的蛋白表达水平。以上实验结果表明,FL118能够下调结肠癌细胞中CIP2A的表达水平,继而提高PP2A磷酸酶活性。利用R语言对TCGA数据库中结肠癌相关的基因数据进行分析的结果表明,CIP2A基因在结肠癌中异常高表达;应用qRT-PCR实验对结肠癌患者的临床样本进行分析的结果表明,CIP2A的mRNA在结肠癌组织中异常高表达;应用免疫组化实验对结肠癌患者的临床样本进行分析的结果表明,CIP2A蛋白在结肠癌中异常高表达,并且与结肠癌进展以及淋巴结转移水平相关。基于以上结果,我们以CIP2A为本研究的目标蛋白,做出了本课题的实验假说:在结肠癌中,FL118能够通过下调CIP2A表达水平继而提高PP2A磷酸酶活性来诱导结肠癌凋亡。PP2A抑制剂OA与FL118联合应用处理结肠癌细胞时,PP2A磷酸酶活性测定实验结果显示,与FL118组结肠癌细胞相比,OA+FL118组结肠癌细胞的PP2A磷酸酶活性显着降低;而WB结果显示,PP2Ac蛋白的表达水平并没有发生显着变化。CCK-8实验结果显示,与FL118组结肠癌细胞相比,OA+FL118组结肠癌细胞的活力明显升高;流式细胞术以及WB实验结果显示,与FL118组结肠癌细胞相比,OA+FL118组结肠癌细胞的凋亡率明显降低。上述实验结果在细胞水平验证了我们的实验假说,即在结肠癌中,FL118能够通过下调CIP2A表达水平继而提高PP2A磷酸酶活性来诱导结肠癌凋亡。（2）动物实验。测量不同组别小鼠皮下肿瘤相对体积及重量的结果表明,FL118能够抑制移植瘤的体内生长;TUNEL-DAPI染色实验的结果表明FL118能够诱导移植瘤组织中的结肠癌凋亡;HE染色实验结果表明,FL118能显着影响移植瘤组织病理学特征,使其呈现凋亡趋势;免疫组化实验结果表明,FL118能够诱导移植瘤组织中的结肠癌凋亡并抑制增殖,同时降低CIP2A蛋白的表达水平。上述实验结果在动物水平验证了本课题的实验假说,即FL118能够通过下调CIP2A表达水平诱导结肠癌凋亡。测量不同组别小鼠体重变化的结果显示,应用FL118治疗小鼠时其体重未出现明显下降,表明FL118对小鼠生长未产生显着影响;对各组小鼠主要器官进行HE染色的结果表明,FL118对小鼠的主要器官没有产生显着性损伤;检测小鼠肝肾功能指标AST、ALT及BUN水平的结果表明,FL118对小鼠的肝肾功能没有产生显着性损伤;血常规检测实验结果表明,FL118对小鼠的血常规指标未产生显着性影响。上述结果表明,动物对FL118具有良好的耐受性。结论在结肠癌中,FL118能够通过下调CIP2A表达水平继而提高PP2A磷酸酶活性来诱导结肠癌凋亡。意义在结肠癌中对FL118的抗肿瘤作用机制进行了深入研究,并初步评价了动物对FL118的耐受性,为FL118进一步研究和开发成为结肠癌的临床药物提供了实验基础。
二、P-糖蛋白、Bcl-2蛋白在胰腺癌组织中的表达及其与临床病理的关系（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、P-糖蛋白、Bcl-2蛋白在胰腺癌组织中的表达及其与临床病理的关系（论文提纲范文）
（1）RUNX3在人结肠癌HCT-116/5-FU耐药细胞株中的表达及其与耐药的相关性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 消化道肿瘤耐药机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）KCNMA1的上调促进维拉帕米逆转食管鳞状细胞癌对顺铂的化学耐药（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表（Abbreviation) |
| 前言 |
| 第一章 KCNMA1的表达在逆转ESCC耐药中的作用 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3.统计学分析 |
| 4.结果 |
| 4.1 VER逆转ESCC细胞对顺铂的化学耐药性 |
| 4.2 高通量转录组测序筛选ESCC细胞中差异表达的基因 |
| 4.3 实时定置PCR法检测候选基因在食管鳞状癌细胞中的表达 |
| 4.4 WB检测ESCC细胞中KCNMA1的蛋白表达 |
| 4.5 KCNMA1影响VER逆转ESCC细胞对顺铂的化学耐药性 |
| 4.6 KCNMA1增强VER对ESCC细胞的抗增殖和促凋亡作用 |
| 5.讨论 |
| 6.结论 |
| 第二章 介导维拉帕米KCNMA1的表达与逆转顺铂耐药移植瘤裸鼠作用研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3.统计学分析 |
| 4.结果 |
| 4.1.建立过表达和沉默KCNMA1 KYSE150细胞模型 |
| 4.2 移植瘤BALB/C-nu裸鼠一般情况观察 |
| 4.3 移植瘤裸鼠肿瘤体积和顺铂对肿瘤抑制率的影响 |
| 4.4 移植瘤裸鼠各组中KCNMA1的表达 |
| 5.讨论 |
| 6.结论 |
| 第三章 临床研究KCNMA1基因在食管鳞状细胞癌患者组织样本中的表达 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 临床样本和试剂 |
| 2.2 临床资料、分组 |
| 2.3 VER联合化疗靶动脉灌注治疗方式及疗效评价标准 |
| 2.4 免疫组化方法及结果分析 |
| 3.统计学分析 |
| 4.结果 |
| 4.1 两组食管鳞状细胞癌患者治疗前后典型病例展示 |
| 4.2 免疫组织化学法检测患者组织样本中KCNMA1的蛋白表达 |
| 5.讨论 |
| 6.结论 |
| 参考文献 |
| 综述 肿瘤MDR的发病机制以及MDR抑制剂或调节剂药物研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表(含待发表)学术论文 |
| 附英文论文1 (已发表) |
| 附英文论文2 (未发表) |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（3）REG3G在胰腺癌中的表达及临床意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验分析 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 生信分析 |
| 2.2.1 所用数据库 |
| 2.2.2 具体分析 |
| 2.3 统计学分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 实验结果 |
| 3.1.1 REG3G在正常胰腺细胞与癌细胞中表达差异地分析 |
| 3.1.2 REG3G在癌旁组织与胰腺癌组织中表达差异地分析 |
| 3.1.3 REG3G在胰腺癌组织中的表达与临床资料及部分病理信息的相关性分析 |
| 3.1.4 REG3G在胰腺癌组织中的表达与患者生存预后的相关性分析 |
| 3.1.5 影响胰腺癌患者预后的Cox比例风险回归模型 |
| 3.2 生信分析结果 |
| 3.2.1 数据库分析REG3G在肿瘤与正常组织中表达的差异。 |
| 3.2.2 TCGA数据库探索患者临床资料表达与REG3G关系 |
| 3.2.3 cBioPortal提示胰腺癌中REG3G存在变异 |
| 3.2.4 TIMER提示胰腺癌中与REG3G相关的免疫细胞 |
| 3.2.5 GSEA分析与REG3G相关的通路 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 REG蛋白在胰腺恶性肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（4）CDK1在胰腺癌中的生物学功能、临床意义及相关抑制剂研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 1. 胰腺癌的靶向治疗现状 |
| 2. 细胞周期蛋白依赖性激酶CDKs在肿瘤中的研究 |
| 3. 抗凋亡蛋白Mcl-1 |
| 4. 研究方案 |
| 5. 参考文献 |
| 第一部分 敲减CDK1对胰腺癌体内外生长的影响 |
| 1. 引言 |
| 2. 实验材料与方法 |
| 3. 实验结果与讨论 |
| 4. 小结 |
| 5. 参考文献 |
| 第二部分 CDK1在胰腺癌患者中的表达及临床意义 |
| 1. 引言 |
| 2. 实验材料与方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 参考文献 |
| 第三部分 CDK1抑制剂抗胰腺癌活性与及作用机制研究 |
| 1. 引言 |
| 2. 实验材料与方法 |
| 3. 实验结果与讨论 |
| 4. 小结 |
| 5. 参考文献 |
| 第四部分 新型CDK1抑制剂和相关抗凋亡蛋白Mcl-1抑制剂的研究 |
| 1. 引言 |
| 2. 实验材料与方法 |
| 3. 实验结果与讨论 |
| 3.1 CDK1小分子抑制剂的虚拟筛选 |
| 3.2 Mcl-1小分子抑制剂的虚拟筛选 |
| 3.3 Mcl-1抑制剂M02和M08的抗胰腺癌活性 |
| 4. 小结 |
| 5. 参考文献 |
| 综述: CDKs在胰腺癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| English manuscript Ⅰ Structure-based virtual screening, biological evaluation and biophysical study of novel Mcl-1 inhibitors |
| English manuscript Ⅱ Recent progress in development of cyclin-dependent kinase 7 inhibitors for cancer therapy |
（5）长链非编码RNA LINC00473通过上调PD-L1表达促进胰腺癌的恶性生物学行为（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:PD-L1、miR-195-5p及 LINC00473 在胰腺癌中的表达及靶向关系研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 临床资料 |
| 2.3 免疫组化染色检测胰腺癌组织中PD-L1表达 |
| 2.3.1 组织处理及切片准备 |
| 2.3.2 抗原热修复 |
| 2.3.3 免疫组化染色 |
| 2.3.4 结果判读 |
| 2.4 细胞培养 |
| 2.5 细胞分组 |
| 2.6 慢病毒包装及转染 |
| 2.6.1 慢病毒包装 |
| 2.6.2 感染 |
| 2.7 Real time PCR |
| 2.7.1 引物序列 |
| 2.7.2 提取细胞总RNA |
| 2.7.3 提取组织总RNA |
| 2.7.4 反转录反应 |
| 2.7.5 Real time RT-PCR反应 |
| 2.8 Western blot |
| 2.8.1 细胞蛋白质抽提 |
| 2.8.2 组织蛋白质抽提 |
| 2.8.3 蛋白定量 |
| 2.8.4 制备SDS-PAGE胶 |
| 2.8.5 转膜 |
| 2.8.6 封闭与杂交 |
| 2.8.7 ECL底物发光 |
| 2.9 双荧光素酶报告基因检测 |
| 2.10 FISH亚细胞定位 |
| 2.10.1 细胞培养 |
| 2.10.2 细胞固定与通透 |
| 2.10.3 探针检测 |
| 2.10.4 封片及检测 |
| 2.11 RNA免疫共沉淀(RIP) |
| 2.12 RNA pull down |
| 2.13 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 胰腺癌中PD-L1表达情况及与临床病理相关性 |
| 3.1.1 免疫组化方法检测胰腺癌PD-L1表达 |
| 3.1.2 胰腺癌PD-L1表达与临床病理特征相关性分析 |
| 3.1.3 Kaplan-Meier分析PD-L1 的表达水平与预后的关系 |
| 3.2 胰腺癌组织中PD-L1,LINC00473及miR-195-5p的表达情况 |
| 3.2.1 Western blot检测胰腺癌中PD-L1 蛋白表达情况 |
| 3.2.2 RT-qPCR检测胰腺癌组织中LINC00473,miR-195-5p及 PD-L1 表达情况 |
| 3.2.3 LINC00473在多种胰腺癌细胞系的表达水平检测 |
| 3.3 miR-195-5p与 PD-L1 的靶向关系验证 |
| 3.3.1 双荧光素酶报告基因检测显示miR-195-5p可靶向结合PD-L1 |
| 3.3.2 分组实验验证miR-195-5p可靶向结合PD-L1 |
| 3.4 LINC00473 作为ceRNA结合miR-195-5p调控PD-L1 的表达 |
| 3.4.1 荧光原位杂交试验检测LINC00473细胞定位 |
| 3.4.2 双荧光素酶报告基因检测显示miR-195-5p可靶向结合LINC00473 |
| 3.4.3 RNA pull down结果显示LINC00473 可以与miR-195-5p结合 |
| 3.4.4 RNA免疫共沉淀(RIP)结果显示LINC00473 可以与miR-195-5p结合 |
| 3.4.5 分组实验表明LINC00473 作为ceRNA结合miR-195-5p上调PD-L1 表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:长链非编码RNA LINC00473 通过结合miR-195-5p上调PD-L1 表达促进胰腺癌发展 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 细胞分组 |
| 2.3 细胞处理 |
| 2.3.1 分离CD8~+T细胞 |
| 2.3.2 细胞培养及转染 |
| 2.4 EDU增殖检测 |
| 2.5 TUNEL法检测细胞凋亡 |
| 2.6 划痕实验 |
| 2.7 Transwell侵袭实验 |
| 2.8 Real time PCR |
| 2.8.1 引物序列 |
| 2.8.2 提取细胞总RNA |
| 2.8.3 反转录反应 |
| 2.9 Western blot |
| 2.10 ELISA |
| 2.11 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡 |
| 2.12 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 miR-195-5p靶向抑制PD-L1 的表达促进胰腺癌细胞凋亡、抑制增殖 |
| 3.1.1 EDU增殖实验检测细胞增殖情况 |
| 3.1.2 TUNEL检测细胞凋亡情况 |
| 3.1.3 划痕实验检测细胞迁移情况 |
| 3.1.4 Transwell侵袭实验检测细胞侵袭情况 |
| 3.1.5 各组细胞凋亡、转移相关基因相对表达量 |
| 3.1.6 Western blot检测凋亡、转移相关蛋白表达水平 |
| 3.2 LINC00473 作为ceRNA结合miR-195-5p上调PD-L1 的表达影响胰腺癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭 |
| 3.2.1 EDU增殖实验检测细胞增殖情况 |
| 3.2.2 TUNEL检测细胞凋亡情况 |
| 3.2.3 划痕实验检测细胞迁移情况 |
| 3.2.4 Transwell侵袭实验检测细胞侵袭情况 |
| 3.2.5 各组细胞凋亡、转移相关基因相对表达量 |
| 3.2.6 Western blot检测凋亡、转移相关蛋白表达水平 |
| 3.3 LINC00473 作为ceRNA结合miR-195-5p上调PD-L1 的表达影响CD8~+T细胞活化 |
| 3.3.1 ELISA检测各实验组细胞上清细胞因子表达 |
| 3.3.2 流式细胞仪检测细胞凋亡结果 |
| 3.3.3 RT-qPCR检测各组细胞PD-L1、PD-1 表达 |
| 3.3.4 Western-blot检测各组细胞PD-L1、PD-1 蛋白表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）培美曲塞联合顺铂促进卵巢癌SKOV3细胞调亡和抑制侵袭的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词 |
| 1 引言 |
| 2 实验标本、试剂及仪器 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 叶酸受体α在卵巢癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历在学期间发表的学术论文和研究成果 |
| 致谢 |
（7）OLR1调控胰腺癌侵袭转移的功能与机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 材料与方法 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 第一部分: OLR1对胰腺癌生物学功能的影响 |
| 第二部分: OLR1影响胰腺癌转移的机制研究 |
| 第三部分: OLR1在胰腺癌组织中的表达及临床意义 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果及奖励 |
| 致谢 |
（8）Lnc-ATB通过miR-200c相关信号通路调控胆管癌增殖及转移的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分:胆管癌组织中Lnc-ATB/miR-200c的表达及临床意义 |
| 一.实验材料 |
| 二.实验方法 |
| 三.实验结果 |
| 四.讨论 |
| 五.小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分:Lnc-ATB/miR-200c信号轴在胆管癌细胞中表达及功能 |
| 一.实验材料 |
| 二.实验方法 |
| 三.实验结果 |
| 四.讨论 |
| 五.小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分:Lnc-ATB/miR-200c信号轴调控胆管癌生长和迁移的分子机制 |
| 一.实验材料 |
| 二.实验方法 |
| 三.实验结果 |
| 四.讨论 |
| 五.小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分:Lnc-ATB/miR-200c信号轴在胆管癌体外移植瘤模型中的作用 |
| 一.实验材料 |
| 二.实验方法 |
| 三.结果 |
| 四.讨论 |
| 五.小结 |
| 参考文献 |
| 第五部分:全文总结 |
| 1.研究结论 |
| 2.本研究的创新性 |
| 3.研究不足和展望 |
| 综述 长链非编码RNA在恶性肿瘤诊治中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 攻读学位期间的主要成果 |
| 致谢 |
（9）TROP2在浆液性卵巢癌组织中的表达及对其生物学行为的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 TROP2在浆液性卵巢癌中的表达及与Ki-67的相关性研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第二部分 126例浆液性卵巢癌患者的临床资料统计及生存分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第三部分 TROP2的表达对卵巢癌生物学行为的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 英文论文Ⅰ |
| 英文论文Ⅱ |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（10）FL118通过调控CIP2A/PP2A信号通路诱导结肠癌凋亡的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 1.结肠癌的研究现状 |
| 2.FL118 的来源和抗肿瘤研究进展 |
| 3.CIP2A蛋白的作用特点及其致癌作用 |
| 4.本研究主要内容 |
| 实验材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 主要试剂和材料 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 CCK-8 法检测细胞活力 |
| 2.2 克隆形成实验检测细胞增殖 |
| 2.3 细胞形态学观察实验检测细胞形态 |
| 2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.5 Hoechst–PI染色实验检测细胞凋亡 |
| 2.6 细胞总蛋白提取实验 |
| 2.7 BCA法测定蛋白浓度 |
| 2.8 Western Blot(蛋白质免疫印迹实验) |
| 2.9 ITRAQ |
| 2.10 RNA提取 |
| 2.11 qRT-PCR实验(实时荧光定量PCR) |
| 2.12 PP2A磷酸酶活性测定实验 |
| 2.13 临床样本分析 |
| 2.14 构建异体移植肿瘤模型并考察FL118 对移植瘤体内生长的影响 |
| 2.15 TUNEL-DAPI双染法检测肿瘤组织中的细胞凋亡 |
| 2.16 HE染色检测FL118 对组织形态的影响 |
| 2.17免疫组化实验 |
| 2.18 检测肝功能指标AST及 ALT水平(单试剂速率法) |
| 2.19 BUN(尿素氮)水平检测 |
| 2.20 检测血常规指标 |
| 2.21 统计学分析 |
| 实验结果 |
| 1.FL118 对结肠癌细胞发挥抗肿瘤作用 |
| 1.1 FL118 对结肠癌细胞活力的影响 |
| 1.2 FL118 对结肠癌细胞增殖的影响 |
| 1.3 FL118 对结肠癌细胞形态的影响 |
| 1.4 FL118 对结肠癌细胞凋亡的影响 |
| 2.通过ITRAQ技术确定FL118 在结肠癌细胞中的调控靶点 |
| 3.FL118 对结肠癌细胞CIP2A表达水平的影响及其作用机制 |
| 4.CIP2A在结肠癌组织中异常高表达并且与患者的临床病理特征相关 |
| 5.抑制PP2A磷酸酶活性可减弱FL118 对结肠癌细胞的抗癌作用 |
| 6.FL118 抑制移植瘤生长,诱导肿瘤组织中的细胞凋亡 |
| 6.1 FL118 对移植瘤体内生长的影响 |
| 6.2 FL118 对小鼠肿瘤组织中细胞凋亡及CIP2A蛋白的影响 |
| 6.3 FL118 在动物体的耐受性评价 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究结果 |
| 致谢 |
四、P-糖蛋白、Bcl-2蛋白在胰腺癌组织中的表达及其与临床病理的关系（论文参考文献）
- [1]RUNX3在人结肠癌HCT-116/5-FU耐药细胞株中的表达及其与耐药的相关性研究[D]. 范爽. 河北北方学院, 2021(01)
- [2]KCNMA1的上调促进维拉帕米逆转食管鳞状细胞癌对顺铂的化学耐药[D]. 葛宁. 山东大学, 2021(11)
- [3]REG3G在胰腺癌中的表达及临床意义[D]. 聂元华. 兰州大学, 2021(12)
- [4]CDK1在胰腺癌中的生物学功能、临床意义及相关抑制剂研究[D]. 杜金童. 山东大学, 2020(04)
- [5]长链非编码RNA LINC00473通过上调PD-L1表达促进胰腺癌的恶性生物学行为[D]. 周文阳. 中国医科大学, 2020(01)
- [6]培美曲塞联合顺铂促进卵巢癌SKOV3细胞调亡和抑制侵袭的研究[D]. 石岩玉. 郑州大学, 2020(02)
- [7]OLR1调控胰腺癌侵袭转移的功能与机制研究[D]. 杨刚. 北京协和医学院, 2020(05)
- [8]Lnc-ATB通过miR-200c相关信号通路调控胆管癌增殖及转移的机制研究[D]. 林海. 苏州大学, 2020(06)
- [9]TROP2在浆液性卵巢癌组织中的表达及对其生物学行为的影响[D]. 吴彬. 山东大学, 2019(02)
- [10]FL118通过调控CIP2A/PP2A信号通路诱导结肠癌凋亡的机制研究[D]. 林雪竹. 青岛大学, 2019(02)