一、大麦黄矮病毒外壳蛋白基因和运动蛋白基因酵母表达载体的构建（论文文献综述）
仝则乾[1]（2021）在《荻草谷网蚜体内与大麦黄矮病毒互作的蛋白筛选与验证》文中研究说明小麦黄矮病是我国各麦区小麦生产上的重要病毒病,其病原物为大麦黄矮病毒（Barley yellow dwarf virus,BYDV）,GAV为我国田间主流株系,可由田间麦蚜优势种荻草谷网蚜Sitobion miscanthi（Takahashi）（在中国曾被误定为麦长管蚜Sitobion avenae（Fabricius）,且目前仍在普遍沿用）以持久非增殖型方式传播。小麦黄矮病与介体荻草谷网蚜在田间常同时发生,加剧小麦产量和品质的损失。介体蚜虫体内有两道屏障和免疫反应,BYDV若要在植物间传播就必须突破这些障碍,这就涉及到BYDV蛋白与蚜虫体内受体蛋白之间的特异性识别及互作。前人研究发现BYDV的外壳蛋白（coat protein,cp）和蚜传蛋白（aphid transmission protein,atp）对于病毒突破蚜虫体内的障碍都具重要作用,但介体蚜虫中参与互作过程的蛋白种类还不清楚。因此,本课题以BYDV-GAV及其介体荻草谷网蚜作为研究对象,通过酵母双杂交方法筛选荻草谷网蚜体内与BYDV-GAV cp和atp互作的蛋白,并通过酵母双杂交和BiFC方法进行验证。对了解大麦黄矮病毒与其介体荻草谷网蚜的互作机理以及通过阻断介体传毒从而防治小麦黄矮病具有重要意义。本研究主要结果如下:1.将BYDV-GAV两个与传毒相关的蛋白cp和atp的基因,分别插入GAL4酵母双杂交系统的诱饵载体pGKBT7上,成功构建两个诱饵质粒pGKBT7-cp和pGKBT7-atp。并对两个诱饵质粒进行毒性和自激活检测,发现两个诱饵蛋白可以在酵母Y2H Gold中正常表达,且自身无转录活性,满足酵母双杂交系统筛库的条件。2.收集羽化24 h内携带BYDV-GAV荻草谷网蚜与无毒荻草谷网蚜成蚜各300头,根据全虫总RNA构建荻草谷网蚜c DNA质粒文库。使用共转法进行酵母双杂交筛库过程,共筛到了15个可能与pGKBT7-cp互作的荻草谷网蚜蛋白,11个可能与pGKBT7-atp互作的荻草谷网蚜蛋白。其中lwr、ata和ccq三个蛋白被pGKBT7-cp和pGKBT7-atp同时筛到。3.根据NCBI中同源蛋白的功能,从中选择5个被pGKBT7-cp筛到的蛋白（lwr、ata、ccq、tra和tph）以及8个被pGKBT7-atp筛到的蛋白（lwr、ata、ccq、ntf、tcs、sia、ugt和nap）,通过酵母双杂交的方法进行一对一验证。分别将上述10个蛋白的基因插入到GAL4酵母双杂交系统的猎物载体pGADT7上,成功构建7个猎物质粒。将两个诱饵质粒与七个猎物质粒一一对应,分别共转入酵母Y2H Gold菌株中,结果发现,候选蛋白ntf和lwr均与pGKBT7-cp和pGKBT7-atp具有强互作,ccq和nap均与pGKBT7-cp和pGKBT7-atp存在弱相互作用关系。4.选用双分子荧光互补技术（BiFC）继续验证候选蛋白与两个诱饵蛋白的互作关系。将候选蛋白的基因连接到pNC-BiFC-vcn载体上,将诱饵蛋白cp和atp的基因连接到pNC-BiFC-vnn载体上,成功构建了5个荧光表达载体质粒（分别为cp,atp,ntf,lwr和ccq,nap未构建成功）。将质粒转化农杆菌并注射本氏烟,结果表明候选蛋白ntf和lwr与BYDV-GAV cp和atp均能互作,ccq在本氏烟中与cp和atp均不互作。5.MEGA 6.0构建进化树显示荻草谷网蚜蛋白lwr和ntf均与豌豆蚜同源性最高;SMART分析结果表明lwr具有UBCc结构域,ntf没有结构域;TMHMM和Signal P 5.0分析结果表明lwr和ntf均为非跨膜、非分泌蛋白。综上所述,本研究明确了荻草谷网蚜体内两个既与BYDV-GAV cp存在较强互作关系也与pGKBT7-atp存在较强互作关系的蛋白lwr和ntf。本研究为后续深入了解荻草谷网蚜的传毒机制和开展小麦黄矮病的防治打下基础。
李静远[2]（2021）在《BYDV-GAV运动蛋白与小麦TaCDK3蛋白互作对其侵染的影响研究》文中认为小麦黄矮病（Wheat yellow dwarf disease）是由麦二叉蚜传播大麦黄矮病毒（Barley yellow dwarf virus,BYDV）引起的病毒病害,目前,我国主要流行的小麦黄矮病病原为BYDV-GAV,感病小麦呈现植株矮化、分蘖减少、叶片倒V字型黄化等一系列症状,对小麦的质量和产量造成了严重的损失,发病严重的麦田产量减产可达到60%左右。病毒的运动蛋白（Movement protein,MP）在病毒细胞间运输过程中有重要作用,通过胞间连丝协助病毒粒子在寄主细胞扩散。本研究对接种BYDV-GAV的华山新麦草样品进行转录组测序,筛选得到与病毒增殖密切相关的细胞周期蛋白依赖性激酶TaCDK3,讨论了小麦TaCDK3基因与GAV的互作关系及对病毒增殖的影响,主要研究结果如下:（1）对华山新麦草接种BYDV-GAV,取样进行转录组测序（RNA-seq）,筛选得到与病毒增殖密切相关的细胞周期蛋白依赖性激酶TaCDK3,该基因的表达量与病毒RNA的复制呈负相关。（2）通过酵母双杂交、双分子荧光互补、Pull-down试验分析GAV病毒与TaCDK3、TaCDK3与帽结合蛋白TaeIF4E之间的互作关系,结果表明病毒MP与TaCDK3互作,进一步确定TaCDK3与TaeIF4E之间存在互作关系。（3）利用酵母双杂交技术鉴定TaCDK3蛋白的结构域,结果表明MP、TaeIF4E能与TaCDK3的激酶结构域（PK domain）结合。采用点突变法将TaCDK3第121-126氨基酸保守基序[Y（x）4L?]的酪氨酸和亮氨酸突变成丙氨酸和天冬酰胺后,发现TaCDK3既不与MP互作,也不与TaeIF4E互作,表明TaCDK3的激酶结构域是与MP、TaeIF4E互作的关键结构域。（4）TaCDK3和TaeIF4E基因调控病毒复制的功能鉴定。构建p BSMV:γ:TaCDK3和p BSMV:γ:TaeIF4E载体,在小麦上进行VIGS试验。结果表明,分别沉默TaCDK3和TaeIF4E基因,10天后接种GAV,接种7天后测定病毒含量,结果表明沉默TaCDK3后,病毒含量是对照组的4.39倍,沉默TaeIF4E后,病毒含量是对照组的0.11倍,说明沉默TaCDK3促进了GAV的侵染,而沉默TaeIF4E抑制了GAV的侵染。（5）采用原核表达获得GST-MP、GST-TaCDK3、GST-TaeIF4E蛋白,纯化后采用等温量热滴定法测定蛋白间的结合系数及焓变等热力学参数,结果表明MP与TaeIF4E反应的结合常数Ka（MP-TaCDK3）为3.551E4,TaeIF4E与TaCDK3反应的结合常数Ka（TaeIF4E-TaCDK3）为2.621E5。综上所述,本研究明确了BYDV-GAV侵染小麦后,小麦TaCDK3表达显着下调,影响了TaeIF4E的磷酸化和植物细胞的依赖帽结构的蛋白翻译,同时有利于GAV翻译元件BTE利用寄主的TaeIF4E等翻译因子,促进了GAV增殖的调控关系,为小麦黄矮病的防治以及抗病毒品种的培育提供理论依据。
李桑桑[3]（2020）在《辣椒脉黄病毒P4蛋白介导病毒胞间运动功能研究》文中进行了进一步梳理植物病毒侵染寄主,需要克服寄主细胞胞间连丝（Plasmodesmata,PD）的限制,进行胞间运动,从而系统侵染寄主。为了克服PD屏障,植物病毒通过编码运动蛋白来介导病毒通过PD。辣椒脉黄病毒（Pepper vein yellows virus,Pe VYV）是正义单链RNA病毒,属于黄症病毒科（Luteoviridae）马铃薯卷叶病毒属（Polerovirus）。该病毒能够通过蚜虫和嫁接进行传毒,受侵染寄主会出现叶脉黄化、新叶簇生等症状,严重影响辣椒等茄科作物的产量和品质。研究Pe VYV编码的运动蛋白及其功能,可为分析Pe VYV的致病性提供科学依据,也可为科学评估Pe VYV对茄科经济作物的潜在威胁提供理论基础。辣椒脉黄病毒ORF4编码的一个大小为17.5 KDa的蛋白,P4蛋白的结构域分析表明,在117-138 aa区段有一个跨膜结构域。P4蛋白亚细胞定位结果表明,P4蛋白,与PD的标志蛋白PDLP8共定位,形成不连续的黄色荧光点。删去或A替代P4蛋白的117-138 aa跨膜结构域,?P4 117-138蛋白（缺失突变子）和?P4 AAA117-138（A替代突变子）虽定位于细胞膜,但两个突变子均不能与PDLP8蛋白共定位。研究结果表明,P4蛋白的117-138 aa跨膜结构域是P4蛋白定位于PD的关键结构域。P4蛋白介导植物病毒胞间运动研究表明,P4蛋白能够互补运动蛋白缺失突变黄瓜花叶病毒（CMV?3a）进行胞间运动,92%的病毒运动到邻近细胞;?P4 AAA117-138驱动仅16%CMV?3a侵染邻近细胞;而?P4 117-138蛋白完全失去互补CMV?3a进行胞间运动的能力。利用免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）结合液相色谱-质谱/质谱（Liquid-chromatography Mass/Mass,LC-MS/MS）,筛选鉴定与P4蛋白及其跨膜结构域突变子互作的寄主蛋白。筛选到与P4蛋白可能直接互作的寄主蛋白16个,主要参与内质网结合（ER binding）、能量代谢、丝裂原活化激酶途径、自噬体途径、DNA甲基化途径等;两个突变子可能直接互作的寄主蛋白14个,不能与丝裂原活化激酶途径、自噬体途径的2个蛋白互作。P4蛋白不但介导病毒胞间运动,还可能参与调控病毒复制和寄主抗性等多重功能。
周昕[4]（2019）在《苦苣菜黄网弹状病毒运动及超侵染排阻机理研究》文中认为植物弹状病毒（rhabdoviruses）是一类基因组为负链RNA的囊膜病毒（envelopedviruses）,广泛为害多种粮食和经济作物,引起严重产量损失。苦苣菜黄网病毒（Sonchus yellow net virus,SYNV）在分类上属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）细胞核弹状病毒属（Nucleorkibabdovirus）,是目前研究较为深入的植物弹状病毒。SYNV在细胞核内复制,病毒粒子从内核膜（inner nuclear membrane）出芽后富集于核周腔（perinuclearspace）。侵染植物、昆虫、鱼类和脊椎动物等不同寄主的弹状病毒均以3’-N-P-M-G-L-5’的顺序编码五个保守的病毒结构蛋白,且在基因组复制与转录、出芽（budding）和病毒粒子形成等过程具有类似的特性。此外,植物弹状病毒还编码了一个额外的非结构蛋白,即植物弹状病毒扩散侵染所必须的运动蛋白（movement protein,MP）。长久以来由于反向遗传学体系的缺失,学界对于植物弹状病毒的运动机制知之甚少。本研究以实验室构建的植物弹状病毒侵染性克隆为基础,以SYNV为重点研究对象,探索了病毒胞间运动和长距离运动模式,以及超侵染排阻（superinfectionexclusion,SIE）等现象的分子机制。为了明确SYNV胞间运动方式,我们构建一系列SYNV缺失突变体,包括非结构蛋白sc4、病毒基质蛋白（matrix protein,M）、糖蛋白（Glycoprotein,G）以及M蛋白和G蛋白双缺失突变体,并分析了这些缺失突变体病毒的胞间运动能力。研究结果表明,sc4为SYNV的运动蛋白,其缺失导致SYNV丧失胞间运动能力;M、G以及M和G双缺失突变体依然具有有限的胞间运动能力,从而明确了 SYNV的最小运动单位是其病毒核蛋白（nucleoprotein,N）、磷蛋白（phosphoprotein,P）和RNA聚合酶（Large polymerase,L）蛋白包裹基因组形成的核衣壳（nucleocapsid,NC）。亚细胞定位分析发现,瞬时表达的SYNVsc4蛋白主要定位于本氏烟表皮细胞的细胞周质（cell periphery）,在细胞核内也有少许分布。sc4和高尔基体marker ManI-mCherry、ER 内质网的marker GFP-HDEL、细胞骨架微管marker MAP65-RFP以及细胞骨架微丝marker ABD2-GFP均没有显着的共定位。利用抑制蛋白分泌系统和细胞骨架的药物进行处理发现,20μg/ml的布雷非德菌素A（Brefeldin A,BFA）可以通过破坏内质网网腔结构来抑制SYNV胞间运动,而微管抑制剂氨黄乐灵（Oryzalin）和微丝解聚剂拉春库林B（Latrunculin B,Lat B）则对SYNV胞间运动没有影响。与SYNVN、P蛋白一样,sc4也具有体外非特异性结合单链RNA的能力。BiFC和酵母双杂交均发现sc4与主要核衣壳蛋白N和P蛋白存在互作。我们利用弹状病毒SYNV、马铃薯黄矮病毒（Potato yellow dwarf virus,PYDV）、水稻黄矮病毒（Rice yellow stunt virus,RYSV）、水稻条纹花叶病毒（Rice yellow stunt virus,RSMV）和番茄黄斑驳相关病毒（Tomato yellow mottle-associated virus,TYMaV）编码的MP,分别成功回补了番茄花叶病毒运动蛋白缺失突变体（ToMV-GFPΔMP）和马铃薯X病毒运动蛋白缺失突变体（PVX-GFPΔp25）的胞间运动,表明弹状病毒的运动蛋白和正链RNA病毒的运动蛋白有功能上的相似性。对SYNV运动蛋白缺失突变体（rSYNV-GFPΔsc4）进行反式互补实验发现,除了其自身编码的sc4运动蛋白,其它弹状病毒如PYDV、RYSV、RSMV和TYMaV编码的MP以及黄瓜花叶病毒（Cucumbber mosaic virus,CMV）、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）、水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）、番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus,TSWV）、番茄丛矮病毒（Tomato bushy stunt virus,TBSV）、番茄花叶病毒（Tomato mosaic virus,ToMV）病毒编码的MP都无法回补rSYNV-GFPΔsc4的运动。同样的,对于细胞质弹状病毒——TYMaV来说,仅其自身编码的P3可以回补rTYMaV-GFPΔP3的运动,表明弹状病毒胞间运动特异性地依赖于其自身编码的MP。蛋白互作分析表明,SYNV和TYMaV MP仅与自身N蛋白互作,而不与异源N蛋白互作,推测正是这种核衣壳蛋白与运动蛋白间的特异性互作导致异源病毒编码的MP无法回补弹状病毒胞间运动。进一步共表达试验发现,sc4能够帮助SYNVN-P复合体从核内复制位点定位到细胞周边类似PD的结构上,而不能互作的异源病毒MP则无法改变SYNVN-P复合体定位。这些结果表明,弹状病毒MP通过与核衣壳蛋白特异性互作,引导后者胞内和胞间运动。目前对于植物病毒长距离运动的认识主要基于正链RNA病毒的相关研究,而我们对于植物负链RNA包膜病毒长距离运动的方式和机制了解甚少。我们利用SYNV反向遗传学系统对病毒的结构蛋白融合荧光标签,并对SYNV侵染的本氏烟叶柄、茎秆和根部等维管组织进行徒手切片和超薄切片,通过共聚焦显微镜和透射电镜跟踪和观察病毒蛋白以及病毒粒子的组织定位。实验结果表明,SYNV可在韧皮部复制并进行长距离运输;完整的病毒粒子或结构蛋白存在于本氏烟韧皮部和木质部薄壁细胞、甚至木质部导管等组分中,但没有直接的证据表明SYNV完整病毒粒子可以通过植物木质部导管进行长距离运输。超侵染排阻是指初侵染病毒阻止相同的或将近的病毒对该细胞的再次侵染,是一种病毒之间的同源干扰（homologous interference）,也被称为交叉保护（cross protection）。利用不同荧光标记的SYNV变体,发现SYNV在细胞水平和器官水平都存在明显的SIE现象,而与亲缘关系较远的PVX之间并没有SIE现象。瞬时表达SYNV M蛋白抑制SYNV侵染,而表达M mRNA则无抑制作用,表明SIE发生在M蛋白水平而不是RNA水平。相应地,SYNVM缺失突变体部分丧失了对同源病毒排阻的能力。进一步分析发现,SYNV M蛋白可以通过与N蛋白的互作抑制基因组复制与转录。MG126L突变体丧失了与SYNV N蛋白互作的能力后丧失了对SYNV转录和复制的抑制能力;同时M蛋白的NLS突变体无法与N蛋白在细胞核内发生强烈互作,也丧失了对SYNV转录和复制的抑制能力。这些结果表明,初次侵染的SYNV经复制后期大量表达的M蛋白通过与包裹基因组RNA的N蛋白互作,抑制病毒的基因组复制和转录,从而导致再次进入细胞的同源病毒无法复制和侵染。本文利用SYNV反向遗传学体系,深入研究了 SYNV的运动蛋白sc4的性质以及SYNV在胞内、胞间和长距离运动上的特性;发现了 SYNV存在的SIE现象,并揭示了 SYNV诱发SIE现象的背后机制。本论文研究结果有助于深入理解植物负链RNA病毒运动和侵染等分子机制,为该类病毒病害的防控提供理论支撑。
陶烨[5]（2016）在《大麦黄矮病毒GAV与二穗短柄草互作蛋白的筛选鉴定研究》文中研究说明大麦黄矮病毒（Barley yellow dwarf viruses,BYDVs）是一类在世界范围内广泛分布的重要禾谷类作物病毒,仅通过麦蚜传播,能够侵染多种禾本科作物,引起黄矮病,对世界范围内的农业生产造成了严重损失。在我国,BYDVs主要侵染小麦（Triticum aestivum）,导致叶片黄化、分蘖减少等症状,其中造成危害最主要的病原之一是BYDV-GAV。因此,为了更好的控制由BYDV-GAV引起的小麦黄矮病,我们需要对病毒和寄主之间的互作关系,以及病毒的致病机制进行更加深入的了解,这对探索新型的病毒防治方法有着重要的意义。但由于小麦基因组非常庞大,且遗传转化体系不太成熟,致使在小麦上开展病毒-寄主互作及病毒分子致病机制的研究非常困难。二穗短柄草（Brachypodium distachyon）是禾本科的模式植物,具有植株矮小,基因组简单且背景清晰,生命周期短和易于培养等优点。更重要的是,它和小麦的农艺性状相似,染色体组也具有很好的共线性。因此,本研究选用二穗短柄草作为模式寄主,探索了BYDV-GAV和寄主之间的互作关系,筛选和鉴定了与BYDV-GAV的互作的寄主因子,主要研究内容如下:（1）建立了二穗短柄草与BYDV-GAV的互作研究体系。通过蚜虫接种的方法,将BYDV-GAV接种到二穗短柄草Bd21-3上,接种21天后植株表现出叶片变红、严重矮化以及根部萎缩等黄矮病症状,并通过RT-PCR和TAS-ELISA的方法确认了BYDV-GAV的侵染。对健康的和感染BYDV-GAV的二穗短柄草的叶片细胞进行透射电镜观察,发现接种植株的筛管伴胞中存在病毒粒子,叶肉薄壁细胞的叶绿体结构也被严重破坏。以BYDV-GAV侵染的二穗短柄草为毒源进行了蚜传实验,表明BYDV-GAV可以在二穗短柄草之间进行传播。将BYDV-GAV同时接种至二穗短柄草和其自然寄主小麦上,观察和比较了接种21天内的症状扩展情况,并通过TAS-ELISA的方法检测了期间病毒含量的变化,结果表明,与BYDV-GAV的自然寄主小麦相比,二穗短柄草发病更早,表现出了更加严重的黄矮病症状,但病毒的积累模式与小麦非常相似。通过以上实验证明了禾本科模式植物二穗短柄草Bd21-3可以被BYDV-GAV成功侵染,侵染过程与小麦比较相似,因此可以作为研究BYDV-GAV的模式寄主。（2）筛选鉴定了与BYDV-GAV互作的寄主蛋白。首先,通过GatewayTM技术中的LR反应将二穗短柄草的入门文库成功转化成用于酵母双杂交筛选的cDNA文库,并通过半固体法对该文库进行了扩增,最终获得了滴度为1.7×107 cfu/mL的cDNA文库,可用于后续的酵母双杂交筛选。其次,通过GatewayTM技术成功构建了BYDV-GAV的外壳蛋白CP、假定的运动蛋白MP及基因沉默抑制子P6的诱饵载体,并对三个诱饵蛋白进行了自激活检测,确定了文库筛选所需的3-AT（3-氨基三唑）浓度为50mM。再次,通过酵母双杂交的方法,用三个诱饵蛋白分别对二穗短柄草的cDNA酵母文库进行筛选。在SC-Leu-Trp-His+50mM 3-AT平板上获得互作子后,通过检测HIS3、URA3、Lac Z三个报告基因的表达情况确定互作后,对互作蛋白的序列进行分析。结果表明,以CP为诱饵蛋白筛到16个与其存在弱相互作用的蛋白,包括2个假定蛋白,5个叶绿体蛋白（叶绿体磷酸果糖激酶、叶绿体转酮醇酶、叶绿体蛋白转运组件、叶绿体二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活化酶、叶绿素a/b结合蛋白）,以及动力蛋白2A、钙调蛋白3、跨膜蛋白147等;以MP为诱饵蛋白筛选到35个强互作蛋白,序列分析后主要为四个蛋白,分别是14-3-3 like蛋白、转录因子VOZ1、富甘氨酸RNA结合蛋白和26S蛋白酶体的一个亚基类似蛋白;以P6为诱饵蛋白没有筛到任何互作子。最后,将筛选到的猎物载体和诱饵载体重新转化酵母细胞验证,最终确定VOZ1与MP存在互作。（3）验证了MP与VOZ1的蛋白互作。首先,通过原核表达分别获得GST-MP和MBP-VOZ1融合蛋白进行GST pull-down实验,确定MP和VOZ1可以在体外互作。其次,通过农杆菌接种的方法,确定了MP和VOZ1在本氏烟中的亚细胞定位。结果表明,MP主要定位在核膜上,少量定位在细胞质中,VOZ1以聚集的形式在细胞质中存在。最后,通过双分子荧光互补实验（BiFC）,结合农杆菌接种的方法,确定MP和VOZ1在烟草细胞内可以互作,并通过DAPI染色确定互作位置在细胞质而非细胞核。综上所述,本研究建立了二穗短柄草与BYDV-GAV的互作体系,在此基础上,以二穗短柄草为模式寄主,筛选和鉴定了和BYDV-GAV的互作蛋白,为进一步解析BYDV-GAV致病的分子机理奠定了基础。
宋爽[6]（2016）在《华山新麦草对小麦黄矮病抗性研究及BYDV-GAV侵染性克隆构建》文中进行了进一步梳理大麦黄矮病毒（Barley yellow dwarf viruses,BYDVs）是黄症病毒科（Luteoviridae）多种病毒的统称,仅由麦蚜以持久、循回、非增殖方式传播。大麦黄矮病毒GAV（BYDV-GAV）为我国特有的一种大麦黄矮病毒,近年来已经成为我国小麦黄矮病的主要病原,在小麦生产上造成严重的产量损失。培育和种植抗病品种是防治小麦黄矮病最为经济有效的措施,但是目前大面积推广应用的小麦品种大多对小麦黄矮病缺乏抗性,抗黄矮病小麦品种数量较少,抗病基因来源也较为单一,挖掘新的抗性资源是防治小麦黄矮病研究中亟待解决的重大问题。与此同时,对于BYDV-GAV群体遗传结构、病毒基因功能、分子致病机制等方面的研究也还较少。因此,本研究针对BYDV-GAV引起的小麦黄矮病,分别从寄主抗性和病原致病性两个方面进行了研究,主要结果如下:1.通过室内蚜虫接种,明确了BYDV-GAV能够侵染我国特有的小麦野生近缘植物—华山新麦草（Psathyrostachys huashanica）,并且病毒能够通过无毒蚜虫由华山新麦草回传至健康小麦。华山新麦草接种BYDV-GAV后,利用RT-PCR和TAS-ELISA方法分别对接种叶和非接种叶定期进行病毒检测,结果表明BYDV-GAV在华山新麦草接种叶内增殖缓慢,病毒含量极低,且系统运动受到抑制,说明华山新麦草对BYDV-GAV具有高度抗性。对31份小麦-华山新麦草衍生系对BYDV-GAV的抗性进行了鉴定,室内抗病性鉴定和连续三年的田间抗病性鉴定结果表明,小麦-华山新麦草衍生系H9020、H9020-1-6-8-3、H9020-17-25-6-4、H9014-27-1-1-13-5-5、H9020-17-5和H9014-157-2-15-3共6个材料室内接种BYDV-GAV后21 d病毒含量相对于衍生系所用的母本材料普通小麦7182明显降低,H9020、H9020-1-6-8-3、H9020-17-25-6-4和H9015-17-4-4共4个材料田间接种BYDV-GAV后相对于普通小麦7182,症状明显减轻,田间接种病毒对千粒重的影响也较小,表明部分小麦-华山新麦草衍生系对BYDV-GAV有一定抗性,华山新麦草对BYDV-GAV的抗性具有潜力应用到小麦遗传育种工作之中。2.采用RT-PCR分段扩增和cDNA的RACE扩增技术,构建了BYDV-GAV全基因组扩增体系,测定了我国西北冬麦区5个BYDV-GAV小麦分离物的全基因组序列,分别为GAV-AK2（KF523378）、GAV-WN5（KF523379）、GAV-YL4（KF523380）、GAV-FF1（KF523381）和GAV-TS1（KF523382）,并结合GenBank数据库中已公布的全部9个BYDV-GAV分离物的全基因组序列进行序列分析。结果表明BYDV-GAV的基因组序列较为保守,基因组核酸序列一致性高达97.0%-99.7%,在基因组内部各个ORF间,ORF1变异最大,ORF4最为保守;基于全基因组序列和RdRp基因（ORF1+2）序列的系统发育分析显示BYDV-GAV种内分为2个类群,但与其地理分布没有相关性,基于RTP基因（ORF3/4+5）、P6基因（ORF6）、P3a基因（ORF3a）的系统发育分析则未见存在种内分化;BYDV-GAV各ORF的核酸变异对其蛋白序列的影响较小,目前病毒种群在进化中处于负向选择压力下,种群遗传结构趋于稳定,种群规模处于扩张阶段;BYDV-GAV种群内部存在着重组现象,检测到GAV-05WN7和GAV-WN5两个分离物可能均由GAV-04FX1和GAV-38W重组而来。3.应用重叠延伸PCR和多片段同源重组技术得到了BYDV-GAV杨凌分离物（GAV-YL4）的全长cDNA,在其3’末端融合了具有自剪切活性的HDV-RZ元件,构建了CaMV 35S启动子介导的侵染性克隆载体pCass-GAV、pCass-GAV-RZ和pCass-HH-G-RZ,构建了玉米泛素启动子介导的pTCK-GAV-RZ和水稻蔗糖合酶1启动子介导的pRSS-GAV-RZ。利用农杆菌GV3101浸润接种本氏烟（Nicotiana benthamiana）,pCass-GAV-RZ和pCass-HH-G-RZ成功在接种叶转录出能进行自我复制的病毒基因组RNA,并检测到了病毒蛋白的表达,但是子代病毒不能系统运动。在本氏烟上研究发现,BYDV-GAV基因组RNA 3’末端冗余序列能严重干扰病毒基因组RNA的复制或蛋白表达,但5’末端少量的冗余碱基和5’帽子结构对病毒RNA复制和蛋白表达未见明显影响。利用农杆菌LBA4404浸润接种小麦、燕麦,pTCK-GAV-RZ和pRSS-GAV-RZ均能在接种叶转录出少量的病毒基因组RNA,并能检测到病毒复制,但子代病毒仍然缺乏系统运动能力。为了提高农杆菌在单子叶植株上的侵染效率,尝试了不同寄主（小麦、燕麦、水稻）、不同农杆菌菌株（LBA4404、GV3101、AGL1、C58C1）、不同启动子（玉米泛素启动子、RSS1启动子）、不同接种方式（农杆菌浸润接种、农杆菌真空渗透接种、农杆菌针刺接种、基因枪接种）,但接种效果未见明显改善。
庞俊兰[7]（2012）在《利用RNAi介导抗BYDV和WDV小麦新种质的研究》文中研究说明小麦作为世界上最重要的粮食作物之一，其产量关系着国家粮食安全和国民经济的发展。由大麦黄矮病毒（Barley yellow dwarf viruses，BYDVs）引发的小麦黄矮病，是我国小麦种植区最重要的小麦病毒病害之一，同时也是世界上危害最严重、流行最广泛的植物病毒病害之一。该病毒流行年份一般会造成20％～30％的减产，严重时达50％以上，甚至颗粒无收，被称为小麦的“黄色瘟疫”和“癌症”。由小麦矮缩病毒（Wheat dwarf virus，WDV）引发的小麦矮缩病在欧洲、北非、亚洲和大洋洲造成了严重的经济损失，特别是在欧洲该病害造成小麦减产40%～80%。2007年本实验室在国内首次报道了小麦矮缩病的发生，随后该病害在陕西、甘肃、河北、云南等12个省陆续被报道发现，尤其在陕西北部麦区已经引起小麦严重的减产，成为威胁我国西北、华北和西南麦区重要的病毒病害。防治与控制病毒病最为经济有效的方法是利用品种自身的抗性从而达到主动防治病害的目的，然而利用传统的育种方式很难获得兼抗两种病毒病和高产、优质品种。RNA干涉（RNAinterference，RNAi）是指由双链RNA的介导，特异性靶标对应序列的mRNA，从而抑制相应基因表达的一种基因表达与调控方式，也是寄主一种重要防御病毒病侵害的机制。当表达来源于病毒某一基因序列的转基因植物发生RNAi时，就能使入侵的同一病毒或同属中相近病毒的RNA降解，从而赋予转基因植物对病毒的抗性。因此利用RNAi获得抗BYDVs和WDV小麦种质，成为解决这两种病害的有效途径。随着转基因植物研究的深入和转基因作物的大范围种植，转基因生物安全性评价标准也在不断提高，人们期望获得无筛选标记基因和其他载体骨架的转基因新种质，这也成为目前转基因植物研究的热点之一。本研究针对BYDV-GAV和WDV的CP基因的高保守性，构建了RNAi植物表达载体和最小表达框，期望利用基因枪介导的遗传转化和最小表达框技术，筛选获得高抗或免疫的小麦种质。为最终实现利用RNAi获得抗BYDVs和WDV小麦新品种的预期目标提供抗病新种质。主要结果如下：1.表达载体的构建。成功的构建成了适用于小麦基因枪转化的载体：双价表达载体有pMCG161+/-BW、pMCG161+BW、pMCG161-BW；pWMB006+/-HBW、pWMB006+HBW、pWMB006-HBW。单价表达载体有pMCG161+/-W、pMCG161+W、pMCG161-W。另外通过酶切获得+/-HBW最小表达框。2.基因枪转化小麦及转化后代的分子检测。将构建好的载体和最小表达框利用基因枪法转化小麦幼胚幼胚愈伤组织，经过筛选和抗性愈伤的分化得到再生植株，再通过PCR检测获得了pMCG161+/-BW阳性植株36株，pMCG161+BW和pMCG161-BW均获得5株；pWMB006+/-HBW获得20株，pWMB006+HBW和pWMB006-HBW均获得5株；pMCG161+/-W获得10株，pMCG161+W和pMCG161-W均获得4株；转最小表达框的获得11株。平均转化率是1.2%，最高转化率是2.0%。Southen Blotting结果显示：在T3代稳定遗传的3个转基因株系中外源基因已经成功整合到小麦基因组染色体上，拷贝数为1-3个。对T3代稳定遗传的转基因株系中取8个株系，进行了实时荧光定量PCR检测，结果表明：转基因植株中目的基因的表达量低于受体材料，pMCG161+/-BW的一个株系P7-5-2相对基因表达量为0.3；P11-1-3的相对基因表达量为0.24；转pWMB006+/-HBW载体植株6个株系中5个株系的目的基因干扰效果很明显，其相对基因表达量0.15。3．转基因植株的抗病鉴定。对稳定遗传的株系在T3代和T4代植株进行了BYDV-GAV的抗病性鉴定，获得了免疫株系有：14个转干扰载体pMCG161+/-BW的株系，9个独立转化事件；5个转干扰载体pWMB006+/-HBW的株系，5个独立转化事件；后者有望筛选到无标记基因的转基因抗病种质，为抗病育种提供新材料。
曹汝菲[8]（2011）在《大麦黄矮病毒运动蛋白影响植物生长发育的分子基础》文中研究说明大麦黄矮病毒（Barley Yellow Dwarf Virus, BYDV）是黄症病毒属（Luteovirus）的代表成员,该病毒依靠介体蚜虫传播、扩散而引起大麦、小麦、燕麦等多种禾谷类作物的黄矮病[1]。病毒在植物体内的传播需要17 kDa的运动蛋白（movement protein,MP）。本论文主要开展了两方面的研究:1.BYDV-MP的生化特性研究。构建了原核表达载体pET30a-MP,转化表达菌株BL21（DE3）pLysS,0.4 mM IPTG诱导得到与组氨酸标签的的融合蛋白,分子量约20kDa的MP。Western-blot检测到两条带,20 kDa和40 kDa,推测40 kDa是MP的同源二聚体,对20 kDa的MP切胶回收、透析纯化复性,同样检测到两条带,证实了MP的体外二聚化。构建酵母穿梭载体pGADT7-MP,进行自激活和毒性检测后,将pGADT7-MP、pGBKT7-MP共转化酵母AH109感受态细胞,铺在SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His选择性培养基上,检测到相互作用的发生。利用酵母双杂交实验得出的结果与原核表达结果一致。表明MP可以在体内形成同源二聚体。2.利用转基因技术研究BYDV-MP对植物生长发育的影响。前期研究表明:MP的N端含有4个α-螺旋,使运动蛋白可以定位于核膜,C端富含精氨酸,有非特异的ssRNA结合活性。为了确定MP的关键功能域,设计引物分别扩增出MP,NMP（1-250 bp）,CMP（250-500 bp）构建含有CaMV的35S强启动子的植物表达载体。转化农杆菌后flowral-dip法转化拟南芥,筛选PCR鉴定后得到转基因系。统计植株的的生长发育情况后,发现转GFP:MP的植株开花时间推迟,平均比野生型晚10天,转CMP的植株次之。推测GFP:MP、CMP在植物体内影响了植物细胞周期相关基因,而CDC48在拟南芥芽、根、花的伸长细胞以及生长点细胞中均高度表达,荧光定量PCR结果显示CDC48到转基因植株中的表达水平降低。对CDC48拟南芥T-DNA插入突变体（cdc48）的生长实验表明:CDC48的抑制或下调表达导致拟南芥植株发育迟缓。这进一步暗示了MP可能通过抑制CDC48的表达影响植物的生长发育。
翟浩[9]（2011）在《BYDVs编码的两种抑制子及其作用机制研究》文中研究表明由大麦黄矮病毒（Barley yellow dwarf viruses,BYDVs）引起的小麦黄矮病在世界范围内广泛发生,在我国小麦产区间隙性大发生,威胁小麦的生产。为最终达到防治该病害的目的,各国的科学家们对大麦黄矮病毒的基因表达、进化、传播介体与寄主的相互作用等方面开展了深入的基础研究。筛选鉴定出BYDVs基因组中可能存在的沉默抑制子,可为研究BYDV基因与寄主的互作提供新的证据。本实验室已经初步鉴定出BYDV-GAV的ORF6和BYDV-GPV的P0在局部侵染中具有沉默抑制子活性。在已构建好的质粒载体中筛选出pGD-GPV-P0、pGD-GPV-CP、pGD-GPV-MP、pBin-GAV-CP、pBin-GAV-ORF1和pBin-GAV-ORF6共6个蛋白基因的重组载体,为增加实验的严谨性,本实验新构建了pGD-GPV-UTR-P0重组载体;其次实验通过重复沉默表型观察证明了GPV的P0和GAV的ORF6在局部侵染中确实具有抑制子活性。随后采用半定量PCR对浸润区GFP的mRNA水平进行了检测,发现强抑制子蛋白HC-Pro与pBin-mGFP5-ER共同浸润本生烟后,浸润区GFP的mRNA水平明显比pBin-GAV-ORF6或pGD-GPV-P0与pBin-mGFP5-ER共浸润叶片后GFP mRNA的积累水平要高,其中接种pGD-GPV-P0与pBin-mGFP5- ER共浸润叶片后GFP mRNA的积累水平比pBin-GAV-ORF6与pBin-mGFP5- ER的积累水平高。而作为RNA定量标准的内参基因EF-1-α的mRNA水平在不同浸润组合的植株中都是相同的。结果表明GAV-ORF6抑制子的活性比GPV-P0弱。GFP蛋白的Western blot和GFP mRNA、siRNA的Northern blot分析结果进一步证实了GPV-P0与GAV-ORF6表现出的抑制子活性的差异。虽然GPV-P0、GAV-ORF6的表达与阳性对照HC-Pro一样,能够增加GFP蛋白的表达量和GFP mRNA的累积量,进而增强GFP荧光,但从实验可以看出GPV-P0这种抑制子的GFP蛋白的表达量以及GFP mRNA的累积量明显高于GAV-ORF6。表明GPV-P0是抑制子而GAV-ORF6是弱抑制子。另外,分别将pGD-GPV-P0、pBin-GAV-ORF6与含GFP的植物表达载体pBin-mGFP5- ER对四叶期转基因烟草16c植株共浸润,并以HC-Pro作为对照。在侵染16天后对非浸润叶片进行了Northern blot检测,也证明GPV的P0、GAV的ORF6与PVY的HC-Pro一样能抑制由GFP正单链RNA引起的系统性基因沉默。此外,为研究BYDV的基因组结构中基因突变（插入、缺失、重复等）对病毒复制和表达策略的影响、验证病毒的蛋白功能以及确定重要功能结构域,建立BYDVs侵染性cDNA克隆技术平台尤为重要。本文以PAV-06KM14分离物为对象,成功构建了pTCK303-06KM14 （ubi启动子控制下）和pGD-06KM14全长基因组侵染性克隆载体,分别进行基因枪转染小麦幼胚或农杆菌侵染本生烟以获得具有侵染性的植株。目前实验已获得似BYDV症状的植株,侵染活性验证实验正在进行当中。
陈亮[10]（2010）在《中间偃麦草抗病相关基因TiERF1与TiDPK1的分离与功能研究》文中指出由腐生型真菌禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis）引起的小麦纹枯病,已成为我国最严重的真菌病害之一。小麦纹枯病抗性遗传基础研究薄弱,易于育种利用的抗纹枯病小麦种质资源匮乏,迫切需要揭示抗纹枯病作用机制、发掘抗纹枯病有效基因。大量的研究已表明ERF转录因子在植物防御反应中起着重要的调控作用。本课题组在前期工作中,从抗多种病害的小麦近缘野生种中间偃麦草（Thinopyrum intermedium）中,分离到一个受纹枯病菌诱导的乙烯反应因子（ERF）基因TiERF1,并将其转入小麦品种扬麦12号中。本研究对TiERF1转录因子的特性与功能进行了更深入的研究。Southern杂交分析表明TiERF1基因在中间偃麦草基因组中至少含有两个拷贝。酵母单杂交试验结果表明,其编码的TiERF1蛋白能够在酵母体内与GCC-box顺式作用元件结合,并激活下游报告基因的表达,当预测的转录激活域缺失后,TiERF1的转录激活活性基本丧失。对转TiERF1基因小麦进行的PCR扩增和Southern杂交分析表明：TiERF1基因已成功整合入转基因小麦基因组中,并能够稳定遗传。定量RT-PCR分析结果表明,TiERF1基因能够在稳定遗传的转基因小麦株系中过量表达,并且一些乙烯/茉莉酸抗病信号途径上的病程相关基因几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因等的表达水平也显着提高。纹枯病抗性鉴定结果表明,与未转基因的小麦受体扬麦12号和TiERF1基因表达沉默的小麦株系相比,TiERF1基因的过量表达使转基因小麦对纹枯病的抗性得到提高。可以初步推测：TiERF1基因的转录调控机理是通过结合一些ET/JA信号转导途径中防御相关基因启动子上GCC-box顺式作用元件,激活这些基因的转录表达,从而介导寄主对纹枯病菌的防御反应。本研究对于揭示小麦抗纹枯病作用机制、改良小麦品种的纹枯病抗性非常重要。小麦黄矮病是由蚜虫介导的大麦黄矮病毒（BYDV）侵染引起的小麦主要病毒病害之一。至今,小麦属内尚未发现有效的抗黄矮病基因。小麦的近缘野生种中间偃麦草7X（7Ai#1）染色体长臂上的抗黄矮病基因Bdv2,高抗BYDV多个株系。本课题组已将携带Bdv2的中间偃麦草7Ai#1染色体长臂片段导入普通小麦基因组,选育出抗黄矮病的小麦-中间偃麦草易位系YW642等。由于该易位的外源染色体片段可能携带不利性状,因此分离7Ai#1L染色体上的抗黄矮病重要基因,对于深入研究抗黄矮病作用分子机制,开展抗黄矮病小麦基因工程育种十分重要。本课题组在前期研究中利用比较作图等策略,筛选出一些定位于含Bdv2的中间偃麦草染色体7Ai#1L区的基因表达序列EST-PCR标记。其中一条特异序列与蛋白激酶具有较高的同源性。本研究以上述含Bdv2的7Ai#1L区特异的蛋白激酶基因序列做为起始序列,开展了以下研究,取得良好进展。（1）首先利用瞬时的病毒诱导的基因沉默技术使抗黄矮病的小麦易位系YW642中该蛋白激酶基因表达沉默,结果此材料对黄矮病表现感病,表明该蛋白激酶基因是中间偃麦草染色体7Ai#1L区上的抗黄矮病重要基因。（2）利用RT-PCR和RACE方法,从接种饲BYDV蚜虫的中间偃麦草中,分离到该基因的全长序列。序列分析得知,该基因编码一个催化丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸磷酸化的双底物特异性蛋白激酶,因此,命名该基因为TiDPK1 （Thinopyrum intermedium Dual-specificity Protein Kinase 1）。TiDPK1基因的编码产物具有类受体蛋白激酶（RLK）的结构特征,即含有一个胞外结构域、一个跨膜结构域及一个位于细胞质的蛋白激酶催化结构域。（3）通过自磷酸化试验证实TiDPK1蛋白的激酶催化结构域具有较强的自磷酸化活性。（4）通过基因枪转化洋葱表皮细胞瞬时表达试验表明TiDPK1-GFP融合蛋白集中分布于细胞膜。（5）Southern杂交分析表明TiDPK1基因定位于含Bdv2的中间偃麦草染色体7Ai#1L区,但在小麦与中间偃麦草基因组中都有同源拷贝,说明该基因是基因家族的一个成员。（6）对TiDPK1基因的表达特性分析结果表明：该基因仅在含Bdv2的抗黄矮病材料中表达,受BYDV诱导而上调表达,并且在接种BYDV的12h达到表达高峰；TiDPK1基因的表达在未接种BYDV的YW642幼苗期的各组织中无明显差异,但在接种BYDV约40天的YW642成株期的组织中具有表达优势,其中以叶片表达量最高,这似乎与抗黄矮病的功能相关,成株期时小麦黄矮病主要在叶部发病,TiDPK1基因的转录本优势地出现在叶片中,而小麦茎秆韧皮部可能是BYDV传输的主要部位,因此茎秆中TiDPK1基因表达量也较根和幼穗中高。此外,外源激素油菜素内酯和水杨酸处理可以明显提高TiDPK1基因的表达量。（7）利用酵母双杂交系统验证了TiDPK1蛋白激酶的胞外结构域与BYDV外壳蛋白的相互作用。（8）利用转基因技术从功能获得方面（使TiDPK1基因在感黄矮病小麦中表达）和功能缺失方面（利用双链RNA干扰技术敲减TiDPK1基因在抗黄矮病小麦中的转录本）开展该基因的功能互补研究。结果表明,受体小麦中8601对黄矮病高度敏感,TiDPK1基因表达的转基因小麦获得了对黄矮病的抗性,与携带Bdv2的抗黄矮病对照小麦易位系YW642对黄矮病的抗性程度相当；另一方面,以携带Bdv2的抗黄矮病小麦易位系YW642做受体,获得的TiDPK1基因沉默的转基因小麦对黄矮病表现高度敏感,与感黄矮病对照中8601相当,充分说明TiDPK1是中间偃麦草7Ai#1L染色体上的抗黄矮病重要基因。
二、大麦黄矮病毒外壳蛋白基因和运动蛋白基因酵母表达载体的构建（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大麦黄矮病毒外壳蛋白基因和运动蛋白基因酵母表达载体的构建（论文提纲范文）
（1）荻草谷网蚜体内与大麦黄矮病毒互作的蛋白筛选与验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 麦蚜与小麦黄矮病概述 |
| 1.1.1 麦蚜 |
| 1.1.2 小麦黄矮病 |
| 1.1.3 大麦黄矮病毒对蚜虫的影响 |
| 1.1.4 麦蚜传播大麦黄矮病毒传毒过程 |
| 1.2 介体昆虫与植物病毒互作研究技术 |
| 1.2.1 酵母双杂交技术 |
| 1.2.2 双分子荧光 |
| 1.2.3 Co-IP技术 |
| 1.2.4 其他技术 |
| 1.3 介体昆虫与循回型病毒互作研究进展 |
| 1.3.1 水稻矮缩病毒与叶蝉互作 |
| 1.3.2 大麦黄矮病毒与麦蚜互作 |
| 1.4 本研究的目的及意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试植物、昆虫及菌株 |
| 2.1.2 实验试剂(盒) |
| 2.1.3 仪器 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.2 酵母双杂交系统筛选荻草谷网蚜cDNA文库 |
| 2.2.1 诱饵载体(Bait)构建 |
| 2.2.2 诱饵基因自激活检测 |
| 2.2.3 诱饵质粒筛选文库 |
| 2.3 酵母双杂交验证cp和atp与候选蛋白互作 |
| 2.3.1 候选蛋白构建验证载体 |
| 2.3.2 转化酵母细胞并验证 |
| 2.4 BiFC验证cp和 atp与候选蛋白互作 |
| 2.4.1 荧光表达载体构建 |
| 2.4.2 转化农杆菌 |
| 2.4.3 农杆菌注射本氏烟 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 酵母双杂交系统筛选荻草谷网蚜cDNA文库 |
| 3.1.1 诱饵载体构建 |
| 3.1.2 诱饵质粒自激活检测 |
| 3.1.3 筛选文库中与cp蛋白互作的荻草谷网蚜蛋白 |
| 3.1.4 筛选文库中与atp蛋白互作的荻草谷网蚜蛋白 |
| 3.2 酵母双杂交验证cp和atp与候选蛋白互作 |
| 3.2.1 候选蛋白pGADT7 载体构建 |
| 3.2.2 酵母双杂验证结果 |
| 3.3 BiFC验证cp和 atp与候选蛋白互作 |
| 3.3.1 荧光表达载体构建 |
| 3.3.2 激光共聚焦观察结果 |
| 3.4 候选蛋白生物信息学分析 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论与研究展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）BYDV-GAV运动蛋白与小麦TaCDK3蛋白互作对其侵染的影响研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物病毒的运动蛋白MP |
| 1.1.1 植物病毒入侵寄主的方式 |
| 1.1.2 植物病毒的运动蛋白 |
| 1.1.3 植物病毒MP的其他功能 |
| 1.2 细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-dependent Kinase,CDK) |
| 1.2.1 细胞周期 |
| 1.2.2 细胞周期蛋白分类 |
| 1.2.3 细胞周期蛋白依赖性激酶及分类 |
| 1.2.4 细胞周期蛋白依赖性激酶的其他功能 |
| 1.3 真核起始因子e IF4E |
| 1.3.1 真核翻译起始复合物e IF4F |
| 1.3.2 真核起始因子e IF4E的相关研究 |
| 1.3.3 植物病毒利用寄主e IF4E |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 第二章 TaCDK3 对大麦黄矮病毒侵染过程的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 植物材料 |
| 2.2.2 载体、菌株 |
| 2.2.3 病毒与传播介体蚜虫来源 |
| 2.2.4 仪器与试剂 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 BYDV-GAV接种小麦试验 |
| 2.3.2 样品RNA提取 |
| 2.3.3 总RNA反转录获得cDNA |
| 2.3.4 TaCDK3 表达量检测 |
| 2.3.5 VIGS沉默TaCDK3 基因 |
| 2.3.6 VIGS沉默后的接毒试验 |
| 2.3.7 VIGS后病毒表达量分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 CDK家族差异化表达基因聚类热图分析 |
| 2.4.2 VIGS载体构建、载体线性化以及体外转录 |
| 2.4.3 VIGS沉默TaCDK3 病毒含量分析 |
| 2.5 小结与讨论 |
| 第三章 GAV-MP与 TaCDK3 的互作验证 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 酵母双杂交 |
| 3.3.2 双分子荧光互补法 |
| 3.3.3 pulldown互作证明 |
| 3.3.4 等温量热滴定法验证互作 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 酵母双杂交验证互作 |
| 3.4.2 双分子荧光互补法验证互作 |
| 3.4.3 GST Pull-down验证互作 |
| 3.4.4 等温量热滴定法验证互作 |
| 3.5 小结与讨论 |
| 第四章 TaeIF4E的功能验证及其与CDK3 的互作验证 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 病毒诱导的基因沉默(VIGS) |
| 4.3.2 双分子荧光互补 |
| 4.3.3 酵母双杂交 |
| 4.3.4 GST Pull-down验证互作 |
| 4.3.5 TaeIF4E蛋白的磷酸化验证 |
| 4.3.6 等温量热滴定法验证互作 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 VIGS沉默TaeIF4E病毒含量分析 |
| 4.4.2 酵母双杂交 |
| 4.4.3 双分子荧光互补 |
| 4.4.4 TaeIF4E蛋白磷酸化位点预测 |
| 4.4.5 GST Pull-down验证互作 |
| 4.4.6 等温量热滴定法验证互作 |
| 4.5 小结与讨论 |
| 第五章 TaCDK3与GAV-MP、TaeIF4E互作结构域的探究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 TaCDK3 结构域的p GADT7 载体构建 |
| 5.2.2 TaCDK3中eIF4E保守区域突变体的pGADT7 载体构建 |
| 5.2.3 结构域互作探究 |
| 5.2.4 TaCDK3 保守序列突变体互作探究 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 TaCDK3 结构域互作分析 |
| 5.3.2 TaCDK3 保守序列突变体互作探究 |
| 5.4 小结与讨论 |
| 第六章 全文结论与展望 |
| 6.1 结论与讨论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（3）辣椒脉黄病毒P4蛋白介导病毒胞间运动功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 黄症病毒科病毒 |
| 1.1.1 黄症病毒属病毒 |
| 1.1.2 耳突花叶病毒属 |
| 1.1.3 马铃薯卷叶病毒属 |
| 1.2 植物病毒运动蛋白的研究进展 |
| 1.2.1 植物病毒编码的运动蛋白 |
| 1.2.2 运动蛋白的分类 |
| 1.2.3 运动蛋白功能研究 |
| 1.3 辣椒脉黄病毒研究进展 |
| 1.3.1 辣椒脉黄病毒的生物学特性 |
| 1.3.2 PeVYV的基因组特征 |
| 1.4 辣椒脉黄病毒P4蛋白的研究进展 |
| 1.4.1 P4蛋白的研究现状 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第2章 辣椒脉黄病毒P4蛋白定位于寄主细胞胞间连丝 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 实验材料 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 P4基因及跨膜结构域缺失/替代突变子引物设计 |
| 2.2.2 Pe VYV总 RNA提取 |
| 2.2.3 cDNA合成 |
| 2.2.4 P4基因扩增 |
| 2.2.5 利用Overlap PCR构建P4基因突变子 |
| 2.2.6 琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 2.2.7 PCR产物的回收 |
| 2.2.8 连接克隆载体 |
| 2.2.9 大肠杆菌DH5α感受态细胞制备 |
| 2.2.10 菌落PCR的验证 |
| 2.2.11 质粒提取 |
| 2.2.12 载体构建 |
| 2.2.13 农杆菌GV3101感受态细胞的制备与转化 |
| 2.2.14 农杆菌阳性转化菌鉴定 |
| 2.2.15 浸润本氏烟 |
| 2.2.16 共聚焦荧光显微镜观察 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 PeVYVP4基因的PCR扩增 |
| 2.3.2 PeVYVP4基因突变子PCR扩增 |
| 2.3.3 测序结果 |
| 2.3.4 PeVYVP4基因及其突变子表达载体构建 |
| 2.3.5 共聚焦显微镜观察亚细胞定位 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第3章 P4蛋白互补CMV运动蛋白缺失突变子的胞间运动 |
| 3.1 实验材料与仪器 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 实验材料 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 原核表达载体的构建 |
| 3.2.2 浸润本氏烟 |
| 3.2.3 紫外灯观察 |
| 3.2.4 共聚焦荧光显微镜观察 |
| 3.2.5 Western Blotting鉴定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 PeVYVP4基因及其突变子基因PCR扩增 |
| 3.3.2 原核表达载体构建 |
| 3.3.3 紫外灯观察蛋白运动情况 |
| 3.3.4 共聚焦显微镜观察CMV胞间运动 |
| 3.3.5 荧光灶统计 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第4章 P4蛋白互作的寄主蛋白筛选与鉴定 |
| 4.1 实验材料与仪器 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 实验材料 |
| 4.1.3 实验试剂 |
| 4.1.4 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 浸润本氏烟 |
| 4.2.2 蛋白纯化 |
| 4.2.3 Western blotting鉴定 |
| 4.2.4 LC-MS/MS蛋白鉴定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 Western blotting蛋白鉴定 |
| 4.3.2 LC-MS/MS鉴定 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 结论及展望 |
| 参考文献 |
| 附录 A:攻读学位期间发表论文 |
| 附录 B:实验仪器 |
| 附录 C:试验试剂配置 |
| 致谢 |
（4）苦苣菜黄网弹状病毒运动及超侵染排阻机理研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 苦苣菜黄网病毒的研究概述 |
| 1.1.1 苦苣菜黄网病毒的分类与理化性质 |
| 1.1.2 苦苣菜黄网病毒的分子生物学特性 |
| 1.1.2.1 病毒结构与编码蛋白 |
| 1.1.2.2 转录与复制过程 |
| 1.1.2.3 病毒组装与运动 |
| 1.2 植物病毒运动蛋白的研究进展 |
| 1.2.1 植物病毒运动蛋白的定义与分类 |
| 1.2.2 植物病毒运动蛋白的鉴定方法 |
| 1.2.3 植物病毒在细胞内的运动 |
| 1.2.3.1 分泌途径 |
| 1.2.3.2 细胞骨架 |
| 1.2.4 植物病毒的胞间运动 |
| 1.2.5 植物病毒的长距离运输 |
| 1.3 植物负链RNA病毒运动的研究进展 |
| 1.3.1 不分节段的植物负链RNA病毒的运动 |
| 1.3.2 分节段的植物负链RNA病毒的运动 |
| 1.4 超侵染排阻现象的研究进展 |
| 1.4.1 超侵染排阻现象的发现和定义 |
| 1.4.2 超侵染排阻现象的机制研究 |
| 1.4.2.1 动物病毒中的超侵染排阻现象 |
| 1.4.2.2 植物病毒中的超侵染排阻现象 |
| 1.4.3 超侵染排阻现象的意义及其应用 |
| 1.5 本论文的研究目的和意义 |
| 2 实验材料与实验方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物及病毒材料 |
| 2.1.2 载体 |
| 2.1.3 常用生化试剂和酶 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 RNA水平实验方法 |
| 2.2.1.1 GFP/ SYNV trailer区RNA体外转录 |
| 2.2.1.2 体外RNA结合实验 |
| 2.2.2 蛋白水平实验方法 |
| 2.2.2.1 植物总蛋白提取 |
| 2.2.2.2 亚细胞分离实验 |
| 2.2.2.3 原核表达蛋白纯化 |
| 2.2.2.4 Western blot |
| 2.2.3 接种实验 |
| 2.2.3.1 SYNV摩擦接种 |
| 2.2.3.2 农杆菌浸润接种 |
| 2.2.4 蛋白互作分析 |
| 2.2.4.1 BIFC |
| 2.2.4.2 分裂泛素化酵母双杂交 |
| 2.2.5 载体构建 |
| 2.2.5.1 PCR扩增 |
| 2.2.5.2 胶回收 |
| 2.2.5.3 In-Fusion克隆 |
| 2.2.5.4 酶切连接 |
| 2.2.5.5 热激转化大肠杆菌 |
| 2.2.5.6 质粒提取 |
| 2.2.5.7 电击转化农杆菌 |
| 2.2.6 荧光观察 |
| 2.2.6.1 亚细胞定位 |
| 2.2.6.2 病毒运动观察分析 |
| 2.2.7 病毒形态相关实验 |
| 2.2.7.1 电镜制片 |
| 2.2.8 载体构建 |
| 2.2.8.1 瞬表载体构建 |
| 2.2.8.2 BIFC载体构建 |
| 2.2.8.3 重组病毒的构建 |
| 2.2.8.4 分裂泛素化酵母双杂载体构建 |
| 2.2.8.5 原核表达载体构建 |
| 3 SYNV运动蛋白SC4特性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 SYNV运动的最小单元是其病毒核心 |
| 3.2.2 sc4在本氏烟上的亚细胞定位 |
| 3.2.3 sc4具有体外非特异性结合ssRNA的能力 |
| 3.2.4 sc4标签融合蛋白丧失对SYNV运动功能的回补能力 |
| 3.2.5 sc4与病毒编码的其他蛋白之间的互作 |
| 3.2.6 BFA破坏ER网腔结构抑制SYNV胞间运动 |
| 3.3 讨论 |
| 4 植物弹状病毒胞间运动模式研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 瞬时表达弹状病毒运动蛋白对ToMV的运动回补 |
| 4.2.2 瞬时表达弹状病毒运动蛋白对PVX的运动回补 |
| 4.2.3 不同运动蛋白对SYNV的运动回补研究 |
| 4.2.4 弹状病毒运动蛋白对TYMaV的运动回补研究 |
| 4.2.5 SYNV sc4、RSMV-P3和TYMaV-P3均为外周膜蛋白 |
| 4.2.6 弹状病毒运动蛋白能够特异性与其自身N蛋白互作 |
| 4.2.7 SYNV N-P复合体在sc4存在下可以定位到细胞周边 |
| 4.3 讨论 |
| 5 SYNV长距离运动的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.0 本氏烟维管束组织染色 |
| 5.2.1 rSYNV-RFP与rSYNV-RFP Gct徒手切片荧光比较 |
| 5.2.2 透射电镜观察SYNV侵染的维管组织 |
| 5.2.3 rSYNV-P sf GFP的构建与侵染性分析 |
| 5.2.4 rSYNV-P sf GFP胞内运动荧光观察 |
| 5.2.5 rSYNV-P sf GFP-RFP Gct和rSYNV-GFP-RFP Gct荧光定位比较 |
| 5.3 讨论 |
| 6 SYNV超侵染排阻及其机理研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 不同荧光标记的SYNV之间存在超侵染排阻现象 |
| 6.2.2 过量表达的SYNVM蛋白抑制SYNV的胞间运动 |
| 6.2.3 rSYNV-RFP-AM突变体的超侵染排阻能力减弱 |
| 6.2.4 M蛋白抑制SYNV MR的转录和复制 |
| 6.2.5 M蛋白对MR表达的抑制是通过与N蛋白的互作实现的 |
| 6.2.6 M蛋白核定位信号突变体不再抑制MR的转录和复制 |
| 6.2.7 携带M蛋白核定位信号突变体的rSYNV的SIE能力减弱 |
| 6.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 英文缩略表 |
| 附录Ⅱ 常用缓冲液及培养基配方 |
| 附录Ⅲ 本论文引物列表 |
（5）大麦黄矮病毒GAV与二穗短柄草互作蛋白的筛选鉴定研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 大麦黄矮病毒研究现状 |
| 1.1.1 概述 |
| 1.1.2 分类地位 |
| 1.1.3 基因组结构 |
| 1.1.4 基因功能及表达 |
| 1.1.4.1 基因功能 |
| 1.1.4.2 基因表达 |
| 1.1.5 蚜虫传播 |
| 1.2 二穗短柄草研究现状 |
| 1.2.1 生物学特性 |
| 1.2.2 细胞学特性 |
| 1.2.3 基因组 |
| 1.2.3.1 基因组的组装及注释 |
| 1.2.3.2 基因组比较分析 |
| 1.2.4 遗传转化体系 |
| 1.2.4.1 转化 |
| 1.2.4.2 T-DNA突变 |
| 1.2.5 病毒诱导的基因沉默体系 |
| 1.2.6 应用 |
| 1.3 病毒与植物寄主的互作机制研究进展 |
| 1.3.1 寄主因子参与病毒粒子解体及病毒基因组翻译 |
| 1.3.2 寄主因子参与病毒基因组复制 |
| 1.3.3 寄主因子参与病毒运输 |
| 1.4 蛋白互作研究技术 |
| 1.4.1 酵母双杂交技术 |
| 1.4.2 Pull-down技术 |
| 1.4.3 免疫共沉淀技术 |
| 1.4.4 双分子荧光互补 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 第二章 BYDV-GAV与二穗短柄草互作体系构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试验材料及试剂、仪器 |
| 2.2.1.1 植物材料 |
| 2.2.1.2 病毒和蚜虫材料 |
| 2.2.1.3 试验试剂 |
| 2.2.2 试验方法 |
| 2.2.2.1 植物培养 |
| 2.2.2.2 病毒接种 |
| 2.2.2.3 症状观察分析 |
| 2.2.2.4 RNA提取及cDNA合成 |
| 2.2.2.5 PCR检测 |
| 2.2.2.6 血清学分析 |
| 2.2.2.7 透射电镜观察 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 BYDV-GAV能够侵染二穗短柄草Bd21-3 |
| 2.3.1.1 症状观察 |
| 2.3.1.2 分子检测 |
| 2.3.1.3 血清学分析 |
| 2.3.1.4 病毒粒子观察 |
| 2.3.1.5 细胞学观察 |
| 2.3.1.6 蚜虫传毒实验 |
| 2.3.2 BYDV-GAV在小麦和二穗短柄草中的侵染过程比较 |
| 2.3.2.1 症状扩展 |
| 2.3.2.2 病毒粒子积累模式分析 |
| 2.4 结论与讨论 |
| 第三章 酵母双杂交筛选BYDV-GAV与二穗短柄草中的互作蛋白 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试验材料及试剂 |
| 3.2.1.1 病毒材料 |
| 3.2.1.2 载体和菌株 |
| 3.2.1.3 试剂 |
| 3.2.2 基因克隆方法 |
| 3.2.2.1 RNA提取 |
| 3.2.2.2 基因扩增 |
| 3.2.2.3 回收纯化 |
| 3.2.2.4 T-A连接 |
| 3.2.2.5 大肠杆菌感受态细胞制备 |
| 3.2.2.6 转化 |
| 3.2.2.7 菌落PCR检测 |
| 3.2.2.8 质粒提取 |
| 3.2.3 酵母文库构建 |
| 3.2.3.1 入门文库转化酵母文库 |
| 3.2.3.2 文库滴度测定 |
| 3.2.3.3 文库质量检测 |
| 3.2.3.4 酵母文库扩增 |
| 3.2.3.5 文库质粒提取 |
| 3.2.4 酵母双杂交 |
| 3.2.4.1 Gateway入门克隆 |
| 3.2.4.2 诱饵载体构建 |
| 3.2.4.3 转化酵母细胞 |
| 3.2.4.4 自激活检测 |
| 3.2.4.5 文库筛选 |
| 3.2.4.6 报告基因检测 |
| 3.2.4.7 猎物质粒挽救 |
| 3.2.4.8 序列比对分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 酵母文库构建 |
| 3.3.1.1 文库滴度测定 |
| 3.3.1.2 文库质量检测 |
| 3.3.1.3 文库扩繁 |
| 3.3.1.4 文库质粒提取 |
| 3.3.2 诱饵载体构建 |
| 3.3.2.1 基因克隆 |
| 3.3.2.2 入门载体构建 |
| 3.3.2.3 诱饵载体构建 |
| 3.3.3 自激活检测 |
| 3.3.4 酵母双杂交筛库 |
| 3.3.4.1 转化效率 |
| 3.3.4.2 文库筛选 |
| 3.3.4.3 报告基因检测 |
| 3.3.4.4 筛选结果分析 |
| 3.3.4.5 重转化互作验证 |
| 3.4 结论与讨论 |
| 第四章 MP与VOZ1的互作验证 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试验材料及试剂 |
| 4.2.1.1 植物材料 |
| 4.2.1.2 载体和菌株 |
| 4.2.1.3 试剂 |
| 4.2.2 BdVOZ1基因的克隆 |
| 4.2.3 生物信息学分析 |
| 4.2.3.1 多序列比对和进化树分析 |
| 4.2.3.2 蛋白质三级结构预测 |
| 4.2.3.3 蛋白亲疏水性分析 |
| 4.2.4 GST pull-down试验方法 |
| 4.2.4.1 原核表达载体构建 |
| 4.2.4.2 蛋白表达及纯化 |
| 4.2.4.3 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 4.2.4.4 Western blot检测 |
| 4.2.4.5 GST pull-down实验 |
| 4.2.5 双分子荧光互补及亚细胞定位 |
| 4.2.5.1 载体构建 |
| 4.2.5.2 农杆菌电转感受态细胞的制备 |
| 4.2.5.3 农杆菌电击转化 |
| 4.2.5.4 农杆菌接种 |
| 4.2.5.5 荧光显微镜观察 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 VOZ1基因的克隆及生物信息学分析 |
| 4.3.2 GST pull-down验证互作 |
| 4.3.2.1 融合蛋白的亲疏水性分析 |
| 4.3.2.2 原核表达载体构建 |
| 4.3.2.3 GST-MP融合蛋白表达及纯化 |
| 4.3.2.4 MBP-BdVOZ1融合蛋白表达 |
| 4.3.2.5 GST pull-down验证互作 |
| 4.3.3 亚细胞定位 |
| 4.3.3.1 亚细胞定位载体构建 |
| 4.3.3.2 MP的亚细胞定位 |
| 4.3.3.3 VOZ1的亚细胞定位 |
| 4.3.4 BiFC验证互作 |
| 4.3.4.1 BiFC载体构建 |
| 4.3.4.2 BiFC验证MP与BdVOZ1的互作 |
| 4.4 结论与讨论 |
| 第五章 全文结论及展望 |
| 5.1 全文结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）华山新麦草对小麦黄矮病抗性研究及BYDV-GAV侵染性克隆构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 大麦黄矮病毒研究进展 |
| 1.1.1 分类地位 |
| 1.1.2 生物学特性 |
| 1.1.2.1 粒子形态与寄主范围 |
| 1.1.2.2 病害症状 |
| 1.1.2.3 传播方式 |
| 1.1.2.4 病害循环 |
| 1.1.3 基因组结构及基因功能 |
| 1.1.3.1 基因组结构 |
| 1.1.3.2 复制蛋白 |
| 1.1.3.3 结构蛋白 |
| 1.1.3.4 运动蛋白 |
| 1.1.3.5 蛋白P6 |
| 1.1.3.6 蛋白P3a |
| 1.1.4 基因表达与调控 |
| 1.1.4.1 亚基因组的合成与调控 |
| 1.1.4.2 不依赖 5’帽子的翻译 |
| 1.1.4.3 移码翻译 |
| 1.1.4.4 通读翻译 |
| 1.1.4.5 渗漏扫描 |
| 1.2 抗黄矮病育种研究进展 |
| 1.2.1 小麦黄矮病防治策略 |
| 1.2.2 BYDVs的自然抗源 |
| 1.2.2.1 小麦、大麦和燕麦中耐BYDVs种质资源 |
| 1.2.2.2 小麦近缘物种中抗BYDVs种质资源 |
| 1.2.3 BYDVs的转基因抗性 |
| 1.2.4 小麦抗黄矮病性鉴定方法 |
| 1.2.4.1 田间抗病性鉴定方法 |
| 1.2.4.2 室内抗病性鉴定方法 |
| 1.2.4.3 抗病基因鉴定方法 |
| 1.3 植物病毒侵染性克隆 |
| 1.3.1 植物病毒侵染性克隆的种类 |
| 1.3.1.1 侵染性体外转录物 |
| 1.3.1.2 侵染性cDNA克隆 |
| 1.3.2 影响侵染性克隆活性的因素 |
| 1.3.2.1 碱基突变对侵染活性的影响 |
| 1.3.2.2 基因组末端结构对侵染活性的影响 |
| 1.3.2.3 接种方法对侵染活性的影响 |
| 1.3.3 植物病毒侵染性克隆的应用 |
| 1.3.3.1 研究病毒基因功能 |
| 1.3.3.2 构建植物表达载体 |
| 1.3.3.3 构建基因沉默载体 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 华山新麦草及小麦-华山新麦草衍生系对BYDV-GAV抗性研究 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 植物材料 |
| 2.1.1.2 病毒毒源 |
| 2.1.1.3 介体昆虫 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 华山新麦草室内抗病虫性鉴定 |
| 2.2.1.1 华山新麦草抗BYDV-GAV鉴定 |
| 2.2.1.2 回传试验 |
| 2.2.1.3 华山新麦草抗麦二叉蚜鉴定 |
| 2.2.2 小麦-华山新麦草衍生系室内抗BYDV-GAV鉴定 |
| 2.2.3 小麦-华山新麦草衍生系田间抗BYDV-GAV鉴定 |
| 2.2.3.1 田间种植 |
| 2.2.3.2 病毒接种 |
| 2.2.3.3 发病调查 |
| 2.2.4 RT-PCR法检测BYDV-GAV |
| 2.2.4.1 植物总RNA的提取 |
| 2.2.4.2 反转录 |
| 2.2.4.3 PCR扩增 |
| 2.2.5 TAS-ELISA法检测BYDV-GAV含量 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 华山新麦草室内抗病虫性鉴定 |
| 2.3.2 小麦-华山新麦草衍生系室内抗BYDV-GAV鉴定 |
| 2.3.3 小麦-华山新麦草衍生系田间抗BYDV-GAV鉴定 |
| 2.4 结论与讨论 |
| 2.4.1 本章结论 |
| 2.4.2 讨论 |
| 第三章 BYDV-GAV基因组扩增及遗传多样性研究 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.1.1 毒源材料 |
| 3.1.1.2 菌株 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 BYDV-GAV基因组近等全长扩增与测序 |
| 3.2.1.1 引物设计 |
| 3.2.1.2 RT-PCR法分段扩增BYDV-GAV基因组 |
| 3.2.1.3 琼脂糖凝胶回收目标DNA片段 |
| 3.2.1.4 TA连接 |
| 3.2.1.5 大肠杆菌热激感受态的制备 |
| 3.2.1.6 重组载体的转化和筛选 |
| 3.2.1.7 质粒提取 |
| 3.2.1.8 序列测定 |
| 3.2.2 BYDV-GAV基因组末端序列扩增与测序 |
| 3.2.2.1 RACE法扩增BYDV-GAV基因组末端序列 |
| 3.2.2.2 RACE扩增片段的克隆与测序 |
| 3.2.3 BYDV-GAV基因组拼接与分析 |
| 3.2.3.1 基因组拼接 |
| 3.2.3.2 多重比对 |
| 3.2.3.3 序列一致性分析 |
| 3.2.3.4 系统发育分析 |
| 3.2.3.5 选择压力分析 |
| 3.2.3.6 重组分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 BYDV-GAV基因组扩增与测序 |
| 3.3.2 BYDV-GAV全基因组序列分析 |
| 3.3.2.1 序列信息收集 |
| 3.3.2.2 序列一致性分析 |
| 3.3.2.3 系统发育分析 |
| 3.3.2.4 选择压力分析 |
| 3.3.2.5 重组分析 |
| 3.4 结论与讨论 |
| 3.4.1 本章结论 |
| 3.4.2 讨论 |
| 第四章 BYDV-GAV侵染性cDNA克隆的构建 |
| 4.1 材料与试剂 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.1.1 植物材料 |
| 4.1.1.2 介体昆虫 |
| 4.1.1.3 载体与菌株 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.1.3 引物 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 载体构建 |
| 4.2.1.1 重叠延伸PCR扩增BYDV-GAV全长cDNA |
| 4.2.1.2 pCass-GAV载体构建 |
| 4.2.1.3 pCass-GAV-RZ载体构建 |
| 4.2.1.4 pCass-HH-G-RZ载体构建 |
| 4.2.1.5 pTCK-GAV-RZ载体构建 |
| 4.2.1.6 pRSS-GAV-RZ载体构建 |
| 4.2.2 农杆菌接种 |
| 4.2.2.1 农杆菌冷激感受态的制备 |
| 4.2.2.2 农杆菌冷激转化与筛选 |
| 4.2.2.3 农杆菌浸润接种 |
| 4.2.2.4 农杆菌真空渗透接种 |
| 4.2.2.5 农杆菌针刺接种 |
| 4.2.3 基因枪接种 |
| 4.2.3.1 微弹制备 |
| 4.2.3.2 基因枪轰击 |
| 4.2.4 接种活性检测 |
| 4.2.4.1 病毒RNA转录情况检测 |
| 4.2.4.2 病毒复制情况检测 |
| 4.2.4.3 病毒蛋白表达情况检测 |
| 4.2.4.4 病毒系统运动情况检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 BYDV-GAV全长cDNA扩增 |
| 4.3.2 BYDV-GAV侵染性克隆载体构建与验证 |
| 4.3.2.1 用于双子叶植物接种的BYDV-GAV侵染性克隆载体 |
| 4.3.2.2 用于单子叶植物接种的BYDV-GAV侵染性克隆载体 |
| 4.3.3 BYDV-GAV侵染性克隆在双子叶植物中的侵染活性 |
| 4.3.3.1 本氏烟中病毒基因组 RNA 的转录 |
| 4.3.3.2 本氏烟中病毒基因组RNA的复制和蛋白表达 |
| 4.3.3.3 本氏烟中病毒的系统运动和症状表现 |
| 4.3.4 BYDV-GAV侵染性克隆在单子叶植物中的侵染活性 |
| 4.3.4.1 接种不同单子叶寄主的侵染活性 |
| 4.3.4.2 不同农杆菌菌株对侵染活性的影响 |
| 4.3.4.3 不同启动子对侵染活性的影响 |
| 4.3.4.4 不同接种方式对侵染活性的影响 |
| 4.4 结论与讨论 |
| 4.4.1 本章结论 |
| 4.4.2 讨论 |
| 第五章 全文结论与创新点 |
| 5.1 全文结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录：培养基及缓冲液配方 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）利用RNAi介导抗BYDV和WDV小麦新种质的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 小麦黄矮病的研究进展 |
| 1.1.1 小麦黄矮病的发生及危害 |
| 1.1.2 小麦黄矮病的病原及其特征 |
| 1.1.3 大麦黄矮病毒的分类地位及株系划分 |
| 1.1.4 大麦黄矮病毒传播特性和发病症状 |
| 1.1.5 大麦黄矮病毒基因组结构及功能 |
| 1.1.6 小麦黄矮病的防治策略 |
| 1.2 小麦矮缩病的研究概况 |
| 1.2.1 小麦矮缩病的发生及危害 |
| 1.2.2 小麦矮缩病的病原及其特征 |
| 1.2.3 小麦矮缩病毒传播特性和发病症状 |
| 1.2.4 小麦矮缩病毒基因组结构及功能 |
| 1.2.5 小麦矮缩病的防治策略 |
| 1.3 小麦基因工程研究进展 |
| 1.3.1 转基因植物国内外发展概况 |
| 1.3.2 小麦基因工程研究进展 |
| 1.3.3 RNAi 的发现 |
| 1.3.4 RNAi 的作用机制 |
| 1.3.5 RNAi 的特点 |
| 1.3.6 外源基因沉默策略 |
| 1.3.7 RNAi 在小麦抗病毒基因工程中的重要性 |
| 1.4 小麦转基因主要方法概述 |
| 1.4.1 农杆菌介导法 |
| 1.4.2 小麦花粉管通道法 |
| 1.4.3 小麦基因枪法 |
| 1.4.4 小麦主要转基因方法的比较 |
| 1.5 无筛选标记及骨架序列转基因小麦培育 |
| 1.5.1 标记基因的安全性问题 |
| 1.5.2 获得无标记转基因植株技术 |
| 1.5.3 基因枪介导的最小表达框转化技术 |
| 1.5.4 基因枪介导的共转化技术 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 第二章 适合基因枪转化的 RNA 干扰载体的构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 病毒分离物 |
| 2.1.2 质粒和菌株 |
| 2.1.3 酶及实验试剂酶及实验试剂： |
| 2.1.4 小麦叶组织总 RNA 的提取 |
| 2.1.5 引物设计 |
| 2.1.6 反转录 PCR（RT-PCR） |
| 2.1.7 PCR 产物的回收、连接及转化感受态细胞 |
| 2.1.8 序列的测定及分析 |
| 2.1.9 正向片段与载体 pMCG161 的连接转化 |
| 2.1.10 反向片段与载体 pMCG161 的连接转化 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 BYDV-GAV CP 全长基因的克隆、测序 |
| 2.2.2 BYDV-GAV CP 基因的部分片段克隆、测序 |
| 2.2.3 WDV-CP 全长基因的克隆、测序 |
| 2.2.4 WDV-CP 部分片段克隆、测序 |
| 2.2.5 BYDV-WDV-CP 串连基因（简写为 BW-CP 基因）的连接、测序 |
| 2.2.6 BYDV-WDV-HCP 串连基因（简写为 HBW-CP 基因）的连接、测序 |
| 2.2.7 pMCG161+/-W 单价干涉载体的构建 |
| 2.2.8 pMCG161+/-BW 双价干涉载体的构建 |
| 2.2.9 pWMB006+/-HBW 双价干涉载体的构建 |
| 2.2.10 +/-HBW 最小表达框的构建： |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 利用基因枪法对小麦品种进行遗传转化 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 小麦品种 |
| 3.1.2 小麦遗传转化用到的培养基： |
| 3.1.3 准备靶材料 |
| 3.1.4 利用基因枪法转化小麦受体 |
| 3.1.5 小麦遗传转化体的筛选和植株的再生 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 小麦基因枪转化小麦幼胚获得转基因植株的流程图 |
| 3.2.2 基因枪转化转基因植株完成情况 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 转基因小麦后代植株的分子检测 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 转基因小麦植株叶片的 DNA 提取 |
| 4.1.3 外源基因的 PCR 检测 |
| 4.1.4 小麦基因组 DNA 的 Southen 杂交 |
| 4.1.5 转基因小麦植株叶片的 RNA 提取 |
| 4.1.6 实时荧光定量 PCR 检测 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 转化 pMCG161+/-BW 干扰载体小麦植株 PCR 检测 |
| 4.2.2 转化 pMCG161+/-W 干扰载体的小麦植株的 PCR 检测 |
| 4.2.3 转 pWMB006HBW-CP 干扰载体的小麦植株的 PCR 检测 |
| 4.2.4 转+/-HBW 最小表达框的 PCR 检测 |
| 4.2.5 转基因小麦植株的基因组 DNA 的 Southe blotting 检测 |
| 4.2.6 转基因植株的 Q-RT-PCR 分析 |
| 4.2.7 转基因小麦分子检测结果和转化率 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 转基因小麦植株的抗病性鉴定 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 研究材料 |
| 5.1.2 接种 |
| 5.1.3 接种后的发病级别调查 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 BYDV-GAV 抗性植株的鉴定 |
| 5.2.2 WDV-CP 抗性植株的鉴定 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）大麦黄矮病毒运动蛋白影响植物生长发育的分子基础（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1. 大麦黄矮病毒概述 |
| 1.1 大麦黄矮病毒的形态、结构及分类 |
| 1.2 大麦黄矮病毒的基因组及产物的功能 |
| 1.3 大麦黄矮病毒运动蛋白的功能 |
| 1.4 大麦黄矮病毒运动蛋白的生物学功能 |
| 1.5 大麦黄矮病毒运动蛋白介导的抗病性 |
| 2. 植物的转基因技术 |
| 2.1 生物学方法 |
| 2.1.1 农杆菌介导法 |
| 2.1.2 花粉管通道法 |
| 2.1.3 子房注射法 |
| 2.2 物理法 |
| 2.2.1 基因枪法 |
| 2.2.2 超声波介导法 |
| 2.3 拟南芥的花序浸染法 |
| 3. 引言 |
| 第二章 原核表达载体构建及蛋白诱导表达 |
| 1. 材料 |
| 1.1 常规菌种 |
| 1.2 载体 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 常用培养基和溶液的配制 |
| 1.4.1 载体构建 |
| 1.4.2 蛋白诱导表达及检测 |
| 2. 方法 |
| 2.1 制备目的基因MP |
| 2.1.1 BYDV-GAV-MP 基因的克隆 |
| 2.1.2 纯化，回收目的基因 |
| 2.1.3 限制性内切酶酶切目的基因及回收 |
| 2.2 制备质粒pET30a |
| 2.2.1 限制性双酶切 |
| 2.2.2 电泳检测 |
| 2.2.3 异丙醇沉淀回收质粒片段 |
| 2.3 重组载体pET30a-MP 的构建 |
| 2.3.1 目的基因和载体连接 |
| 2.3.2 连接体系转化大肠杆菌 DH10B |
| 2.3.3 菌落PCR 检测 |
| 2.3.4 鉴定重组质粒pET30a-MP |
| 2.4 重组质粒 pET30a-MP 转化表达菌株 BL21(DE3)pLysS |
| 2.4.1 制备BL21(DE3)pLysS 感受态细胞 |
| 2.4.2 质粒pET30a-MP 热激法转化BL21(DE3)pLysS |
| 2.4.3 菌落PCR 检测 |
| 2.5 蛋白诱导表达 |
| 2.5.1 IPTG 诱导蛋白表达 |
| 2.5.2 SDS-PAGE |
| 2.5.3 Western-blot |
| 2.6 蛋白回收 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 原核表达载体构建 |
| 3.2 MP 蛋白与组氨酸标签的融合表达 |
| 3.3 Western-blot |
| 3.4 蛋白回收 |
| 4. 小结与讨论 |
| 4.1 小结 |
| 4.2 讨论 |
| 第三章 酵母双杂交验证MP 二聚化 |
| 1. 材料 |
| 1.1 酵母菌株和载体 |
| 1.2 试剂 |
| 2. 方法 |
| 2.1 溶液的配制 |
| 2.2 目的基因制备 |
| 2.2.1 PCR 扩增目的基因 |
| 2.2.2 回收目的基因 |
| 2.2.3 限制性酶切目的基因 |
| 2.3 载体制备 |
| 2.3.1 质粒 pGADT7 转化大肠杆菌 DH10B |
| 2.3.2 质粒提取pGADT7 |
| 2.3.3 酶切载体pGADT7 |
| 2.4 重组载体构建 |
| 2.4.1 连接 |
| 2.4.2 转化大肠杆菌 DH10B |
| 2.4.3 菌落PCR |
| 2.4.4 质粒PCR 和酶切检测 |
| 2.5 质粒自激活和毒性检测 |
| 2.5.1 酵母感受态细胞制备 |
| 2.5.2 PEG/LiAC 法转化酵母细胞 |
| 2.5.3 自激活和毒性检测 |
| 2.6 共转化酵母细胞AH109 |
| 2.6.1 质粒共转化酵母细胞 |
| 2.6.2 互作验证 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 酵母穿梭载体构建 |
| 3.2 MP 自身互作的酵母双杂交验证 |
| 3.2.1 含BD 载体的毒性与自激活检测 |
| 3.2.2 含AD 载体的毒性和自激活检测 |
| 3.2.3 共转化酵母细胞 |
| 4. 小结与讨论 |
| 4.1 小结 |
| 4.2 讨论 |
| 第四章 植物表达载体的构建 |
| 1. 材料 |
| 1.1 载体 |
| 1.2 试剂 |
| 2. 方法 |
| 2.1 中间载体pRNAi69 的构建 |
| 2.1.1 目的基因制备 |
| 2.1.2 pRNAi69 制备 |
| 2.1.3 重组载体构建（MP、NMP、CMP） |
| 2.1.4 重组载体构建（pRNAi69-GFP:MP） |
| 2.2 植物表达载体p27 的构建 |
| 2.2.1 目的片段制备 |
| 2.2.2 p27 制备 |
| 2.2.3 植物表达重组载体构建 |
| 2.3 转化农杆菌GV3101 |
| 2.3.1 制备农杆菌感受态细胞 |
| 2.3.2 冻融法转化农杆菌 |
| 2.3.3 菌落PCR 检测 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 中间载体pRNAi69 构建 |
| 3.2 植物表达载体构建 |
| 3.3 植物表达载体转化农杆菌 |
| 4. 小结与讨论 |
| 第五章 MP 转基因拟南芥植株的分子与生理学分析 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 2.1 拟南芥花序浸染Floral Dip 法转化拟南芥 |
| 2.1.1 拟南芥的种植 |
| 2.1.2 Floral dip 法转化拟南芥 |
| 2.2 转基因植株的筛选 |
| 2.3 转基因植株的鉴定 |
| 2.3.1 植物DNA 提取及PCR 鉴定 |
| 2.3.2 植物RNA 提取及PCR 鉴定 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 转基因植株筛选 |
| 3.2 转基因植株鉴定 |
| 3.2.1 DNA 提取及PCR 检测 |
| 3.2.2 RNA 提取及RT-PCR |
| 3.3 植株生长实验 |
| 3.3.1 转基因植株的生长差异 |
| 3.3.2 CDC48 突变体的生长差异 |
| 3.4 CDC48 在不同转基因系中的表达分析 |
| 4. 小结与讨论 |
| 4.1 小结 |
| 4.2 讨论 |
| 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
（9）BYDVs编码的两种抑制子及其作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 第一章 前言 |
| 1.1 大麦黄矮病毒的研究进展 |
| 1.1.1 大麦黄矮病毒的生物学特性 |
| 1.1.2 大麦黄矮病毒的株系划分 |
| 1.1.3 BYDVs 的分子生物学 |
| 1.2 RNA 沉默与病毒编码的RNA 沉默抑制子 |
| 1.2.1 RNA 沉默的研究进展 |
| 1.2.2 RNA 沉默及主要途径 |
| 1.2.3 RNA 干扰 |
| 1.2.4 病毒诱导的基因沉默 |
| 1.2.5 病毒编码的RNA 沉默抑制子 |
| 1.2.6 植物病毒抑制因子干扰基因沉默机制及其分类 |
| 1.2.7 研究沉默抑制子的方法 |
| 1.2.8 RNA 沉默抑制子研究展望 |
| 1.3 侵染性 cDNA 克隆 |
| 1.3.1 侵染性克隆的研究进展 |
| 1.3.2 侵染性克隆的定义、分类及其特征 |
| 1.3.3 侵染性克隆的方式 |
| 1.3.4 侵染性cDNA 克隆的构建 |
| 1.3.5 影响转录产物侵染活性的因素 |
| 1.3.6 侵染性cDNA 克隆的主要应用 |
| 1.4 本研究的目的与意义 第二章 BYDVs 编码的两种抑制子及其作用机制研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 pGD-UP0 载体的构建 |
| 2.2.2 pGD-UTR-P0 载体转入农杆菌 |
| 2.2.3 农杆菌浸润接种 |
| 2.2.4 GPV-P0,GAV-ORF6 在野生本生烟中抑制局部沉默 |
| 2.2.5 GPV-P0,GAV-ORF6 在转基因烟草 16c 中抑制系统沉默 |
| 2.3 讨论 第三章 BYDVs 侵染性克隆载体体系的构建 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 适用于基因枪转化的侵染性克隆载体的构建 |
| 3.2.2 适用于农杆菌转化的侵染性克隆载体的构建 |
| 3.2.3 结果与分析 |
| 3.3 讨论 第四章 全文总结 |
| 4.1 BYDV 编码的两种抑制子及其作用机制研究 |
| 4.2 BYDVs 侵染性克隆载体体系的构建 参考文献 致谢 作者简历 |
（10）中间偃麦草抗病相关基因TiERF1与TiDPK1的分离与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 植物抗病分子机制 |
| 1.1.1 植物抗病防御反应 |
| 1.1.2 植物抗病防御反应的激素信号转导途径 |
| 1.1.3 植物抗病基因的作用模式与结构特点 |
| 1.2 植物抗病相关ERF转录因子的研究进展 |
| 1.3 植物LRR类受体蛋白激酶的研究进展 |
| 1.3.1 LRR-RLK的亚结构域特征 |
| 1.3.2 LRR-RLK的生物学功能 |
| 1.3.3 LRR-RLK的研究展望 |
| 1.4 小麦抗纹枯病的研究进展 |
| 1.4.1 小麦纹枯病的病原种类及致病力 |
| 1.4.2 小麦纹枯病害发生的症状、规律及影响因素 |
| 1.4.3 小麦对纹枯病的抗病机理与抗病遗传 |
| 1.5 小麦抗黄矮病的研究进展 |
| 1.5.1 小麦黄矮病的危害、症状及发病气候条件 |
| 1.5.2 大麦黄矮病毒的结构和传播特性 |
| 1.5.3 中间偃麦草抗黄矮病基因的研究与利用 |
| 1.6 研究的目的意义与技术路线 |
| 1.6.1 研究的目的意义 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 第二章 TiERF1转录因子的特性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 TiERF1基因的Southern杂交分析 |
| 2.2.2 酵母报告子/效应子菌株的获得 |
| 2.2.3 TiERF1与GCC-box顺式作用元件结合及转录激活活性的定性分析 |
| 2.2.4 TiERF1转录激活域缺失突变效应子载体的构建及转化酵母 |
| 2.2.5 TiERF1△AD转录激活活性的定性和定量分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 TiERF1转录因子的功能与作用机制分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 转TiERF1基因小麦的PCR扩增检测分析 |
| 3.2.2 转TiERF1基因小麦的Southern杂交检测分析 |
| 3.2.3 转TiERF1基因小麦中TiERF1基因的表达特性分析 |
| 3.2.4 转TiERF1基因小麦纹枯病抗性鉴定 |
| 3.2.5 转TiERF1基因小麦中下游PR基因的表达特性分析 |
| 3.2.6 外源激素处理后TiERF1和PR基因的表达特性分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 TiDPK1基因的分离和鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 TiDPK1基因全长序列的获得 |
| 4.2.2 TiDPK1基因编码蛋白的序列分析 |
| 4.2.3 TiDPK1基因特异标记引物的开发 |
| 4.2.4 TiDPK1基因的Southern杂交染色体定位分析 |
| 4.2.5 利用BSMV-VIGS使抗黄矮病材料中TiDPK1基因表达沉默 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 TiDPK1蛋白激酶的分子生物学特性分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 TiDPK1的亚细胞定位 |
| 5.2.2 GST-TiDPK1融合蛋白的诱导表达及纯化回收 |
| 5.2.3 TiDPK1的蛋白激酶自磷酸化活性分析 |
| 5.2.4 酵母双杂交分析TiDPK1与BYDV外壳蛋白的互作 |
| 5.2.5 TiDPK1基因的表达特性分析 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 TiDPK1蛋白激酶的功能分析 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 过量表达TiDPK1转基因载体的构建及小麦转化 |
| 6.2.2 RNA干扰TiDPK1转基因载体的构建及小麦转化 |
| 6.2.3 过量表达TiDPK1转基因小麦的分子检测与黄矮病抗性分析 |
| 6.2.4 RNA干扰TiDPK1转基因小麦的分子检测与黄矮病抗性分析 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 全文结论及创新点 |
| 7.1 全文结论 |
| 7.2 全文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、大麦黄矮病毒外壳蛋白基因和运动蛋白基因酵母表达载体的构建（论文参考文献）
- [1]荻草谷网蚜体内与大麦黄矮病毒互作的蛋白筛选与验证[D]. 仝则乾. 西北农林科技大学, 2021
- [2]BYDV-GAV运动蛋白与小麦TaCDK3蛋白互作对其侵染的影响研究[D]. 李静远. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [3]辣椒脉黄病毒P4蛋白介导病毒胞间运动功能研究[D]. 李桑桑. 湖南大学, 2020(08)
- [4]苦苣菜黄网弹状病毒运动及超侵染排阻机理研究[D]. 周昕. 浙江大学, 2019(01)
- [5]大麦黄矮病毒GAV与二穗短柄草互作蛋白的筛选鉴定研究[D]. 陶烨. 西北农林科技大学, 2016(08)
- [6]华山新麦草对小麦黄矮病抗性研究及BYDV-GAV侵染性克隆构建[D]. 宋爽. 西北农林科技大学, 2016(08)
- [7]利用RNAi介导抗BYDV和WDV小麦新种质的研究[D]. 庞俊兰. 中国农业科学院, 2012(03)
- [8]大麦黄矮病毒运动蛋白影响植物生长发育的分子基础[D]. 曹汝菲. 河南农业大学, 2011(08)
- [9]BYDVs编码的两种抑制子及其作用机制研究[D]. 翟浩. 中国农业科学院, 2011(10)
- [10]中间偃麦草抗病相关基因TiERF1与TiDPK1的分离与功能研究[D]. 陈亮. 中国农业科学院, 2010(10)