一、肿瘤坏死因子受体分子生物学研究及临床应用（论文文献综述）
朱安娜[1]（2021）在《基于网络药理学探究麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的显效成分和作用机制》文中研究指明目的:基于网络药理学研究方法,探究麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的显效成分和作用机制。方法:（1）通过TCMSP数据库及查阅文献搜集整理麻黄附子细辛汤化学成分及相关潜在靶点信息,对未搜集到靶点的成分应用Swiss Target Prediction数据库预测补充,综合得到麻黄附子细辛汤化学成分及潜在靶点数据集;（2）于Gene Cards数据库筛选得到病态窦房结综合征相关靶点,整理得到病态窦房结综合征相关的疾病靶点数据集;（3）利用Cytoscape软件展示中药、化学成分和疾病靶点间的关系,构建“麻黄附子细辛汤药物-化学成分-靶点-病态窦房结综合征”生物网络,通过Cyto NCA拓扑分析,得到麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的显效成分及相关靶点;（4）应用Ledock软件进行分子对接验证关键化学成分与核心靶点结合的可靠性;（5）利用DAVID、Metascape数据库,分别对作用靶点进行GO功能注释和KEGG通路富集分析,预测麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的作用机制。结果:（1）通过对麻黄附子细辛汤作用于病态窦房结综合征相关靶点的生物网络进行分析,预测得到麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的199个显效成分,包括芦丁、去甲乌药碱、β-细辛醚等;（2）由拓扑分析得到网络中木犀草素、准葛尔乌头碱、山奈酚等10个关键化学成分及ADRB2、SCN5A、AR等10个核心靶点;（3）经分子对接证实了除外KCNH2的9个核心靶点与关键化学成分都具有较强结合活性,佐证了关键化学成分与核心靶点的可靠性;（4）通过GO功能注释和KEGG通路富集分析,推测麻黄附子细辛汤治疗SSS的作用机制可能为:（1）调节细胞因子活性,抑制甚逆转心肌纤维化,改善SSS发生的病理基础;（2）调节细胞对炎性刺激、缺氧、老化的反应,保护心肌细胞,减轻窦房结及其周围组织的功能单位损伤;（3）调控蛋白质活力和细胞对机械刺激的反应,诱导质膜受体表达,增强窦房结细胞“钙钟”“膜钟”活性,扩张血管,促进窦房结细胞电生理活动正常,改善心律失常和组织器官血流灌注不足症状;（4）影响可能导致SSS发生的相关疾病,限制多疾病对SSS发生的诱导、加重。结论:本研究通过对麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的网络药理学分析及分子对接验证,初步预测了麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的显效成分和作用机制,为麻黄附子细辛汤的临床应用提供了分子生物学层面的理论支持,为其治疗SSS作用机制的深入研究和复方的二次开发提供了一定量的参考信息。
陈晓晨[2]（2020）在《PD-1和TIM-3在耗竭T细胞介导B系淋巴瘤免疫逃逸中的作用机制及临床应用研究》文中指出研究背景及目的淋巴瘤是目前发病率最高的血液恶性肿瘤,严重威胁人类健康。淋巴瘤异质性强,病理分型复杂。弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是其中最常见的亚型,发病率约占所有淋巴瘤30%。R-CHOP方案作为标准一线方案应用临床,明显改善了DLBCL患者的疗效和生存,但复发难治（R/R）DLBCL仍然是临床面临的棘手问题。免疫治疗的临床应用,尤其是免疫检查点治疗和嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy,CAR-T）的突破性进展,给R/R DLBCL患者带来新的希望。程序性细胞死亡1受体（PD-1）是关键的免疫检查点分子之一。PD-1单抗治疗R/R霍奇金淋巴瘤的总反应率高达90%。然而,目前PD-1单抗治疗DLBCL的临床数据尚不多见,有待进一步探索和研究。此外,当前CAR-T治疗R/R DLBCL的临床试验也正在国内外广泛开展中。T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3（TIM-3）是另一个重要的免疫检查点分子。文献报道,PD-1单抗治疗后,患者效应T细胞诱导性表达TIM-3上调,这可能是PD-1单抗继发性耐药的机制之一。本课题关注于免疫治疗R/R DLBCL,拟探究T细胞表达PD-1水平对于DLBCL的临床意义;分析PD-1靶向阻断策略（PD-1单抗及PD-1基因敲减CD19 CAR-T细胞）临床治疗R/R DLBCL患者的疗效、安全性、预测生物标记物及耐药机制;并进一步探索PD-1单抗和TIM-3单抗联合治疗B系淋巴瘤的疗效和免疫学机制,为未来相关临床应用提供实验基础。研究方法（1）应用流式细胞仪检测DLBCL患者外周血（40例）和淋巴结（30例）T细胞亚群分布及其细胞表面PD-1表达情况;应用ELISA方法检测患者血浆（40例）可溶性PD-1及PD-L1水平及动态演变。将患者的上述指标与对照组（正常人群及淋巴结反应性增生患者）对比,分析PD-1（膜表达和可溶性表达）以及可溶性PD-L1在DLBCL发病机制中的作用;对DLBCL患者进行临床特征（病理亚型,IPI评分）亚组分析和生存分析,以进一步探究PD-1/PD-L1对DLBCL患者临床特征和生存的影响。（2）应用PD-1靶向阻断策略（PD-1单抗及PD-1基因敲减CD19 CAR-T细胞）治疗R/R DLBCL患者,观察疗效和毒副反应情况;并应用外显子基因捕获二代测序、寡核苷酸阵列芯片和免疫组化技术对患者淋巴结组织进行检测,以探寻PD-1靶向治疗相关的预测生物标记物;应用流式细胞仪监测患者治疗前后外周血T细胞表达PD-1和TIM-3的动态变化,以进一步探究PD-1靶向治疗耐药与耗竭T细胞可能的相关机制。（3）建立BALB/c小鼠A20细胞淋巴瘤皮下模型,观察肿瘤成瘤率及生长速度;分别应用阻断性PD-1单抗单药和PD-1单抗+TIM-3单抗联合方案治疗成瘤小鼠,观察各组治疗效果和生存情况;并应用CD8+磁珠分选、流式细胞仪、ELISA、CCK8等方法进一步探究PD-1+TIM-3单抗联合方案治疗的免疫学机制。研究结果（1）与正常对照组相比,初诊DLBCL患者外周血CD4+T细胞占CD3+T细胞的比例明显下降（45.47±10.07%VS.61.91±10.52%,P=0.036）,而CD8+T细胞比例则相应升高（43.99±9.32%VS.31.94±6.50%,P=0.045）,且CD4+T细胞及CD8+T细胞表达PD-1水平均明显上调（CD4+PD-1+:16.30±4.58%VS.8.96±2.95%,P=0.017;CD8+PD-1+:18.12±5.43%VS.10.13±3.30,P=0.023）。与淋巴结反应性增生患者相比,DLBCL患者淋巴结CD3+T细胞比例明显下降（23.55±15.62%VS.56.65±10.36%,P=0.002）;CD4+和CD8+T细胞占CD3+T细胞的比例差异无显着性（P>0.05）,但CD4+和CD8+T细胞表达PD-1水平均明显上调（CD4+PD-1+:45.95±11.61%VS.18.26±3.61%,P=0.001;CD8+PD-1+:55.11±13.45%VS.19.32±3.78%,P=0.001）。与正常对照组相比,DLBCL患者初诊时血浆可溶性PD-1明显上升（4.49±3.53ng/ml VS.0.47±0.36ng/ml,P=0.002）,PD-L1水平也明显上升（1.21±1.03ng/ml VS.0.26±0.24ng/ml,P=0.039）。对DLBCL患者进行临床特征亚组分析显示PD-1（膜表达和可溶性表达）以及可溶性PD-L1水平和患者临床特征（病理亚型,IPI评分）相关;生存分析显示PD-1（膜表达和可溶性表达）以及可溶性PD-L1高表达组的OS和PFS均明显低于低表达组（P<0.05）;动态分析患者血浆可溶性PD-1及PD-L1水平显示,其与患者病情状态密切相关。（2）应用PD-1靶向阻断策略（PD-1单抗及PD-1基因敲减CD19 CAR-T细胞）治疗R/R DLBCL,部分患者获得了明显疗效（PD-1单抗治疗ORR达33%;PD-1基因敲减CD19 CAR-T细胞治疗ORR达72%）,总体耐受性好,毒副反应较轻;外显子基因捕获二代测序和寡核苷酸阵列芯片分析提示患者肿瘤染色体及基因突变程度高者对PD-1单抗治疗更加敏感（P<0.05）;免疫组化提示肿瘤浸润T细胞数量或/和PD-L1表达高者,对PD-1单抗治疗反应更好（P<0.05）。患者治疗前后外周血T细胞表达PD-1和TIM-3呈动态变化,随着PD-1单抗治疗的进行,T细胞PD-1表达下调,但TIM-3表达上调,且疗效不佳组患者T细胞表达TIM-3上调更加明显（CD4+TIM-3+:29.12±3.52%VS.20.10±2.71%,P=0.001;CD8+TIM-3+:30.12±3.65%VS.19.93±3.52%,P=0.001）。（3）成功建立BALB/c小鼠A20细胞淋巴瘤皮下模型;PD-1单抗+TIM-3单抗联合组疗效和生存明显优于PD-1单抗单药组和对照组;免疫学机制研究提示:PD-1单与PD-1单抗单药组和对照组相比,PD-1+TIM-3单抗联合组瘤体中CD8+T细胞浸润增加（30.12±2.15%VS.14.94±1.42%VS.4.99±0.95%,P=0.001）,且其TIM-3表达明显下调（20.55±1.46%VS.60.14±2.98%VS.40.01±2.52%,P=0.001）;体外T细胞功能学实验提示PD-1+TIM-3单抗联合组瘤体中CD8+T细胞增殖及杀伤能力明显强于PD-1单抗单药组和对照组（P<0.05）;凋亡明显低于另外两组（P<0.05）;PD-1+TIM-3单抗联合组血浆IL-2、IFN-γ及TNF-α动态水平也明显高于另外两组（P<0.05）。结论（1）DLBCL患者T细胞表达PD-1上调和血浆可溶性PD-1/PD-L1水平升高在DLBCL发病机制中发挥重要作用;上述指标与患者临床特征（病理亚型,IPI评分）及生存（OS/PFS）密切相关;患者血浆可溶性PD-1及PD-L1水平动态变化与其病情状态密切相关,可将其作为DLBCL病情监测的潜在生物标记物。（2）应用PD-1靶向阻断策略（PD-1单抗及PD-1基因敲减CD19 CAR-T细胞）治疗R/R DLBCL总体耐受性好,毒副反应较轻,但仅对部分患者有效;外显子基因捕获二代测序、寡核苷酸阵列芯片分析及免疫组化分析提示:患者肿瘤突变程度、肿瘤浸润T细胞数量和肿瘤微环境PD-L1表达等因素,与PD-1单抗疗效密切相关,提示上述指标有可能成为预测PD-1单抗疗效的潜在生物标记物;PD-1单抗治疗后,患者效应T细胞将诱导性上调TIM-3分子表达,这可能是PD-1单抗继发性耐药的机制之一。（3）BALB/c小鼠A20细胞淋巴瘤皮下模型中,PD-1单抗+TIM-3单抗联合组的疗效及生存明显优于PD-1单抗单药组和对照组,从而提示:PD-1单抗和TIM-3单抗联合应用能够发挥更强的抗肿瘤作用。免疫学机制研究进一步揭示:PD-1+TIM-3单抗联合可以抑制效应T细胞的TIM-3诱导性表达,并通过增强CD8+T细胞增殖及杀伤能力、抑制CD8+T细胞凋亡、上调多种因子表达（IL-2、IFN-γ及TNF-α）等机制,避免T细胞耗竭从而增强T细胞抗肿瘤效应。
张博荀[3]（2020）在《基于“肠道菌群—黏膜屏障”研究“黄芩—黄连”药对治疗T2DM的疗效机制及配伍效应》文中指出目的:以“肠道菌群—黏膜屏障”为着眼点,对中医经典药对“黄芩—黄连”治疗2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）的相关问题进行研究。拟在进一步明确芩-连通过抑制脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）介导的代谢性炎症而发挥T2DM治疗效用的基础上,探索芩-连修复T2DM肠黏膜损伤的分子机制;应用16Sr RNA高通量测序及SD大鼠、ICR小鼠两种动物模型,探索芩-连的药理作用是否是通过靶向某种肠菌而实现的;另外,亦从“肠菌—黏膜”视角探究芩-连配伍（相须为用）、量效（重剂起沉疴）以及副作用（戕伐脾土）的相关证据,为芩-连在临床的合理运用提供参考。方法:本研究以高脂饮食+链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）诱导的T2DM大鼠及小鼠为实验对象。其中大鼠实验分为空白对照组（NC组）,T2DM模型组（DC组）,T2DM+芩-连高、中、低剂量组(8.4,4.2和2.1g·kg-1·day-1,DHSC,DMSC和DLSC组),正常大鼠+芩连中剂量组(4.2g·kg-1·day-1,NSC组),二甲双胍组(194.25mg·kg-1·day-1,DME组)。通过观察/记录/检测大鼠的一般情况、饮食饮水量、体重、血糖等评估整体状态;通过检测血清胰岛素水平、计算胰岛素抵抗稳态模型（Homeostasis model assessment-insulin resistance,HOMA-IR）指数、葡萄糖耐量实验（Oral glucose tolerance test,OGTT）、胰岛素耐量实验（Insulin tolerance test,IPITT）、血脂及游离脂肪酸（Free fatty acids,FFAs）水平评估大鼠的糖脂代谢情况;应用HE染色+光镜观察胰腺、回肠、结肠组织的病理变化;应用Elisa法检测血清肠黏膜损伤标志物LPS、二胺氧化酶（diamine oxidase,DAO）、D-乳酸（D-lactate,D-LA）以及血清、肠道组织的炎症因子白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6（Interleukin-6,IL-6）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）水平;应用生化法检测回肠组织超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）、过氧化氢酶（Catalase,CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase,GSH-PX）、丙二醛（Malonaldehyde,MDA）水平;应用免疫组织化学法检测回肠组织紧密连接蛋白Claudin-1、ZO-1、Occludin水平;应用蛋白免疫印迹法检测胰腺组织Toll样受体4（Toll like receptor-4,TLR-4）、核因子-κBp65（Nuclear factor kappa Bp65,NF-κBp65）以及回肠组织TLR-4、TRIF相关接头分子（TRIF-related adaptor molecule,TRAM）、β-干扰素TIR结构域衔接蛋白（β-interferon TIR domain adaptor protein,TRIF）、肿瘤坏死因子受体1(Tumor necrosis factor receptor 1,TNFR-1)、TNFR相关因子2（TNFR-associated factor 2,TRAF-2）、受体相互作用蛋白激酶1(Receptor-interacting serine/threonine protein kinases,RIPK-1)、磷酸化的核因子-κB抑制物激酶（Phosphorylated inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase,p-IKKβ）以及NF-κBp65蛋白水平;应用16S r RNA扩增子测序检测肠道菌群变化;应用高效液相色谱法检测大鼠粪便乙酸、丙酸、丁酸含量。小鼠实验分为空白对照组（NC组）,T2DM模型组（MC组）,黄芩组(6.7g·kg-1·day-1,DS组)、黄连组(6.7g·kg-1·day-1,DC组)、芩-连组(13.4g·kg-1·day-1,DSC组)及二甲双胍组(308.3mg·kg-1·day-1,DME组)。通过观察/记录/检测小鼠的一般情况、饮食饮水量、体重、血糖等评估整体状态;通过检测血清胰岛素水平、计算HOMA-IR指数、OGTT、ITT等评估胰岛素敏感性;应用HE染色+光镜观察回肠、结肠组织的病理变化;应用Elisa法检测血清肠黏膜损伤标志物LPS、DAO、D-LA以及肠道组织的炎症因子IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平;应用RT-PCR检测回肠组织紧密连接蛋白Claudin-1、Claudin-2、ZO-1、Occludin基因表达,运用免疫荧光法检测ZO-1、Occludin蛋白表达水平;应用16S r RNA扩增子测序检测肠道菌群变化;应用高效液相色谱法检测小鼠粪便乙酸、丙酸、丁酸含量。结果:1.芩-连对T2DM糖脂代谢的影响芩连药对可显着降低T2DM大鼠的血糖及体重、改善血脂（TG、TC、LDL-C、HDL-C）及FFA水平,可促进胰岛素分泌,缓解胰岛素抵抗,且DHSC组效果最佳;芩、连单用及合用均可明显改善T2DM小鼠糖代谢紊乱,且以黄连组及芩-连合用组效果较好。2.芩-连对T2DM代谢性炎症的影响芩连药对可显着降低T2DM大鼠血清LPS及炎症因子IL-6、TNF-α水平（P<0.05,且DHSC组效果最佳）;可明显改善T2DM大鼠胰岛细胞变性坏死及炎细胞浸润;可显着下调T2DM大鼠胰腺组织TLR-4以及NF-κBp65蛋白表达,且DHSC组疗效最佳,呈现出明显的量效差异;相关性分析提示,血清LPS水平与空腹血糖、HOMA-IR、TC、LDL-C、TG、FFA、IL-6、TNF-α存在正相关关系,与体重、胰岛素水平存在负相关关系。3.芩-连对T2DM肠道黏膜屏障的影响3.1.血清标志物DAO、D-LA水平大鼠实验中,相较于NC组,DC组DAO、D-LA水平显着上升（P<0.05）,芩-连干预后,DAO、D-LA水平皆成下降趋势,但仅DHSC组全部数据具有统计学意义（P<0.05）;小鼠实验的结果也呈现出类似的趋势。3.2.肠道组织病理学大鼠、小鼠实验均提示,在高脂饲料+STZ诱导的T2DM动物模型中,回肠和结肠组织呈现出上皮细胞坏死,胞核固缩、碎裂,炎性细胞浸润,肠腺萎缩等病理表现,在芩-连干预组,上述病理改变均有不同程度的缓解。3.3.肠道紧密连接蛋白大鼠免疫组化结果提示:较之NC组,DC组的ZO-1、Occludin及Claudin-1蛋白表达量显着降低（P<0.05）,经芩-连干预后,蛋白表达量均呈现出上升趋势（P<0.05）,且中药高剂量的效果更加明显（P<0.001）;小鼠RT-PCR及免疫荧光结果提示MC组ZO-1、Occludin、Claudin-1水平明显降低,但Claudin-2水平显着升高,芩连干预后,相应的基因及蛋白表达都有向空白组恢复的趋势。4.芩-连改善T2DM肠黏膜损伤的分子机制4.1.抗炎大鼠实验结果提示:较之NC组,DC组结肠、回肠组织的IL-1β、IL-6、TNF-α表达显着升高（P<0.05）,经芩-连干预后,炎症因子水平显着下降（其中DHSC组P值均<0.01）;小鼠实验结果提示,较之NC组,MC组回肠组织的IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-18表达显着升高（P<0.05）,经芩-连干预后,炎症因子水平显着下降（P<0.05）。4.2.抗氧化大鼠实验结果提示:较之NC组,DC组SOD、CAT、GSH-Px水平降低,MDA水平升高（P<0.05）,芩-连干预可明显改善CAT及MDA水平。4.3.TLR-4/TRIF及TNFR-1/NF-κB信号通路大鼠实验结果提示:较之NC组,DC组TLR-4、TRAM、TRIF、TNFR-1、TRAF-2、RIPK-1蛋白表达显着上调（P<0.05）,芩-连干预可显着抑制上述分子表达,且DHSC组效果最佳,呈现出明显的量效差异。5.芩-连对肠道菌群的影响5.1.正常大鼠模型芩-连可降低正常大鼠肠道菌群数量及多样性;门水平上,增加Firmicutes/Bacteroides（F/B）,降低Proteobacteria丰度;科属水平上,增加Lachnospiraceae、Erysipelotrichaceae、Lachnospiraceae NK4A136 group、Prevotellaceae UCG-003丰度,降低Lactobacillaceae、Enterobacteriaceae、Lactobacillus、Escherichia-Shigella丰度;对肠道短链脂肪酸（Short chain fatty acids,SCFAs）的产生有抑制作用。5.2.T2DM大鼠模型芩-连可降低T2DM大鼠肠道菌群数量及多样性;门水平上,可降低Proteobacteria丰度;科水平上,可增加Lachnospiraceae、Prevotellaceae、Erysipelotrichaceae的丰度,且随着中药剂量的提高,芩连促Prevotellaceae增殖的作用逐渐增强,而促Lachnospiraceae增殖的作用逐渐减弱;抑制Enterobacteriaceae,Lactobacillaceae,Bifidobacteriaceae丰度。属水平上,可增加Lachnospiraceae NK4A136group、Prevotella 9、Prevotellaceae UCG-003、Alloprevotella、Prevotellaceae NK3B31 group、Prevotella 1、Coprococcus 2丰度,降低Lactobacillus、Ruminococcaceae UCG-005、Escherichia-Shigella、Ruminococcus 2、Enterobacter、Enterococcus等丰度;可增加肠道SCFAs含量,但差异无统计学意义。5.3.T2DM小鼠模型芩-连可增加T2DM小鼠肠道菌群数量及多样性;门水平上,增加F/B,降低Proteobacteria丰度;科水平上,可显着增加Lachnospiraceae、Rikenellaceae及Ruminococcaceae的丰度,同时降低Enterobacteriaceae的丰度;属水平上,促进Alistipes、Ruminiclostridium 9、Lactobacillus、Lachnospiraceae NK4A136 group增殖,同时下调Escherichia-Shigella、Enterobacter、Desulfovibrio丰度;可增加肠道SCFAs含量,其中丁酸具有统计学意义（P<0.05）。6.芩-连的配伍效应6.1.基于肠黏膜屏障小鼠实验证实,较之单用芩、连,合用能够降低血清LPS、DAO、D-LA水平,改善肠道黏膜损伤,抑制肠道炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β以及IL-18表达。6.2.基于肠道菌群小鼠实验证实,较之单用芩-连,合用更能促进Lachnospiraceae、Rikenellaceae、Ruminococcaceae、Alistipes、Ruminiclostridium 9、Lactobacillus的增殖以及肠道内丁酸盐的富集;同时,加强对潜在致病菌Proteobacteria、Enterobacteriaceae、Escherichia-Shigella、Enterobacter、Desulfovibrio等的抑制作用;相关性分析提示,上述致病菌与肠道炎症因子水平具有正相关关系。结论:1.肠道菌群紊乱与T2DM“火热浊毒”具有相关性,清热药对“黄芩—黄连”可通过调节肠道菌群,改善黏膜屏障,抑制肠道LPS“渗漏”,纠正T2DM胰腺炎症反应及糖脂代谢紊乱;2.芩-连可通过抑制肠道组织炎症反应及氧化应激修复T2DM肠黏膜损伤,其分子机制涉及对TLR-4/TRIF/NF-κB及和TNFR-1/NF-κB通路的调控,且高剂量效果最佳。3.芩-连可通过抑制有害菌,增加SCFAs产生菌及抗炎菌来修复肠道黏膜、改善糖脂代谢;较之单用,芩-连配伍可增强上述药理作用,这可能是芩-连“相须为用”的重要原因。4.无论在大鼠还是小鼠模型中,芩-连均可提高Lachnospiraceae和Lachnospiraceae NK4A136 group的丰度,抑制Proteobacteria、Enterobacteriaceae、Escherichia-Shigella以及Enterobacter的增殖,这些肠菌可能为芩-连的“靶向菌群”。5.大鼠实验提示,芩-连“戕伐脾土”机制或与抑制肠道菌群增殖及其多样性、抑制有益菌Bifidobacteriaceae,Lactobacillus的丰度有关,但小鼠实验结果不支持该结论。
陶善东[4]（2020）在《急性髓系白血病化疗疗效分析与耐药机制研究》文中研究说明目的通过分析急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）患者临床特征、分子及细胞遗传学改变、治疗方案、近期及远期疗效等,综合评估AML的预后影响因素及对策。同时研究肿瘤坏死因子受体相关因子2（Tumor necrosis factor receptor-associated factor 2,TRAF2）在AML患者白血病细胞中的表达,评价其表达水平变化在AML中的意义;进一步研究抑制TRAF2对AML细胞增殖与凋亡的影响,探索AML可能耐药机制,以期解决AML临床耐药问题,提高复发或难治（Relapsed and refractory,R/R）AML的疗效。方法1.AML患者临床研究:1.1 R/R AML:收集2014年6月至2019年12月在本院确诊的49例R/R AML患者临床资料（包括染色体核型、危险分层、疾病状态等）,分析评估预后影响因素;采用Kaplan-Meier生存函数分析患者总生存期（Overall survival,OS）;比较不同挽救性治疗组之间差异,评价疗效。1.2 FLT3-ITD突变AML:分析103例成人AML患者（包括23例FLT3-ITD突变）的临床数据;比较FLT3-ITD基因突变组与非突变组、单纯FLT3-ITD基因突变组与合并其他分子学异常组、正常核型与异常核型组患者治疗反应率、无复发生存（Relapse-free survival,RFS）、OS;并评估索拉菲尼在FLT3-ITD突变AML患者中的疗效。2.AML临床标本与细胞系实验:2.1差异表达蛋白的筛选:3例化疗敏感和3例R/R AML患者骨髓单个核细胞（BMMC）标本用于蛋白质组学实验,经液相质谱分析、构建蛋白质数据库、鉴定蛋白质、注释蛋白质功能及筛选差异蛋白质等数据分析流程,并通过KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,是系统分析基因产物和化合物在细胞中代谢途径及基因产物功能的数据库）对差异蛋白质进行信号通路富集分析（发现TRAF2在R/R AML中表达上调）。2.2临床标本验证:采用Western Blot检测AML患者BMMC标本中TRAF2蛋白质表达水平,评价TRAF2表达水平与预后的相关性。2.3设计与合成TRAF2 si RNA:根据目标基因TRAF2的靶序列,设计3对针对TRAF2的si RNA与阴性对照si RNA。2.4 TRAF2功能实验:在AML细胞系HL-60细胞中,敲降TRAF2,实验分组:空白组、阴性对照组、转染TRAF2 si RNA组,通过CCK-8、流式细胞术检测细胞增殖与凋亡。2.5 TRAF2在AML耐药中的作用机制:荧光定量PCR检测各组细胞中TRAF2及耐药基因MDR1表达水平;Western Blot检测多药耐药蛋白P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）和TRAF2、PI3K、AKT、NFκB、Bcl-x L、C-IAP1、Caspase-3等相关分子表达。结果1.临床研究结果:1.1 49例R/R AML患者经挽救性治疗后,15例患者获得CR,34例未缓解（No remission,NR）,CR率为30.61%（15/49）,16例患者目前处于生存状态;多因素分析显示危险分层、CD7表达、染色体核型及FLT3基因突变是影响AML诱导缓解率和OS的重要预后因素;生存分析表明新药化疗组中位OS为20个月,较传统药物化疗组（中位OS 11.5个月）延长,但无统计学差异（p=0.091）。1.2 FLT3-ITD合并预后良好分子生物学表型较单纯FLT3-ITD突变患者的中位OS明显延长（12个月vs 3个月,p=0.036）、中位RFS亦明显延长（12个月vs 4个月,p=0.043）。与单纯化疗相比,索拉菲尼联合化疗可以改善FLT3-ITD突变AML患者的CR率与总反应率（Overall response rate,ORR）,但不能改善患者的OS与RFS。2.AML蛋白质组学与临床样本实验结果:蛋白质组学筛选出TRAF2在R/R AML患者中表达上调（12.33倍）,临床样本验证发现化疗敏感AML患者较R/R AML患者的TRAF2表达水平低,生存分析提示TRAF2高表达患者的OS较短。3.AML细胞系实验结果:3.1空白组、阴性对照组、TRAF2 si RNA转染组凋亡率分别为:（7.1333±0.1785）%、（13.0333±0.4522）%、（30.8000±0.6978）%,阴性对照组与TRAF2si RNA转染组比较差异有统计学意义（p=0.021）,提示TRAF2 si RNA可以促进HL-60细胞凋亡;3.2比较不同时间（12、24、36、48、60、72h）各组的细胞活力,转染TRAF2 si RNA组细胞活力较阴性对照组降低（（0.7400±0.0396）%vs（0.8717±0.0224）%,p=0.010）;3.3在转染TRAF2 si RNA的HL-60细胞中,TRAF2与MDR1 m RNA表达下调;TRAF2、PI3K、AKT、NFκB、P-gp、Bcl-x L、C-IAP1蛋白表达下调,Caspase-3蛋白表达上调。结论1.CD7高表达、染色体核型复杂异常及FLT3-ITD基因突变是影响AML疗效与预后的关键因素;2.预后良好分子表型可部分克服FLT3-ITD突变高危风险,而FLT3-ITD突变合并其他预后不良分子或细胞遗传学异常的AML患者预后更差;3.新型靶向药物如索拉菲尼联合化疗可提高R/R AML的缓解率,患者的RFS、OS较单纯化疗无明显差异。4.TRAF2在R/R AML患者中表达增高,TRAF2高表达AML患者的预后差。5.TRAF2 si RNA可以促进AML细胞系HL-60细胞凋亡、抑制其增殖。6.TRAF2致AML耐药的可能机制是通过作用PI3K/AKT、NFκB信号通路,上调PI3K、AKT、NFκB、P-gp、Bcl-x L、C-IAP1,下调Caspase-3。
王翀[5]（2020）在《尤文肉瘤的差异蛋白质组学研究》文中指出目的:建立尤文肉瘤（Ewing’s sarcoma;ES）差异蛋白质谱,试图从分子水平寻找治疗ES的有效方法。本研究通过目前较为热门的同位素相对标记和绝对定量（Isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ）技术及蛋白质免疫印迹（Western Blotting）技术进行尤文肉瘤患者血液的蛋白组学研究,分析研究尤文肉瘤相关的特异性蛋白分子,进而协助疾病的诊断、治疗及预后评估。方法:第一步:筛选出2016年1月-2019年1月就诊于本院且符合纳入标准的尤文肉瘤患者4例,年龄范围8-35岁。收集该4例尤文肉瘤患者化疗前全血标本8份（每位患者两份全血标本）、化疗后的全血标本4份及正常人的血标本4份。化疗后的患者为已行4个周期VAC/IE的患者,运用iTRAQ技术分析尤文肉瘤患者的差异蛋白质;第二步:运用Western Blotting对筛选出的差异蛋白进行蛋白组学验证;第三步:通过观察尤文肉瘤患者化疗后的血清乳酸脱氢酶指标、瘤体径线测量值、三维重建后肿瘤体积的大小的变化及肿瘤坏死率,进一步验证目标蛋白的特异性。结果:第一部分:运用iTRAQ技术,基于尤文肉瘤患者与正常健康人群的全血标本,我们共鉴定出了差异蛋白127个。其中上调蛋白数量为91个,下调蛋白数量为36个。对于尤文肉瘤患者化疗前后的全血标本,我们共鉴定出了差异蛋白136个。其中上调的蛋白数量为101个,下调蛋白数量为35个;第二部分:运用Western Blotting技术验证,我们发现,与正常对照组相比,COL1α1、SOD1在尤文肉瘤化疗前组中蛋白表达量显着升高,差异有统计学意义;同时,在与尤文肉瘤化疗前组相比,COL1α1、SOD1在尤文肉瘤化疗后组中蛋白表达量显着降低,差异有统计学意义;COL1α1及SOD1的表达在尤文肉瘤中具有一定的特异性;第三部分:通过对尤文肉瘤化疗前后血清LDH、瘤体径线测量值、三维重建后肿瘤体积的变化及肿瘤坏死率的分析,该四例尤文肉瘤患者经VAC/IE的化疗方案治疗后疗效较好,进一步验证了目标蛋白（COL1α1及SOD1）与尤文肉瘤的相关性。结论:运用iTRAQ技术鉴定尤文肉瘤患者全血样本,获得的了其差异蛋白表达谱,通过Western Blotting和VAC/IE化疗方案进一步验证了目标蛋白（COL1α1、SOD1）的特异性,为尤文肉瘤的发病机制、诊断及治疗、疾病进展动态监测及预后评价奠定了一定的理论基础。
高亚贤[6]（2019）在《TL1A在胃癌中过表达并通过PI3K/Akt信号通路促进胃癌增殖与迁移》文中认为胃癌（Gastric cancer,GC）是一种高发病率、高死亡率的恶性肿瘤,治疗的整体疗效不佳,5年生存率仍较低。胃癌已发现一系列危险因素,如饮食因素、Epstein-Barr病毒、幽门螺杆菌感染等,遗传因素及其对细胞过程下游效应在胃癌进展中发挥了重要作用,但胃癌的发病机制仍然复杂。尽管在癌症的诊断和治疗方面取得了一定的进展,但胃癌患者的预后仍不理想,5年生存率低于30%。因此,寻找新的生物标志物和有效的治疗靶点成为胃癌患者迫切需要解决的问题。随着生物信息学领域和基因组测序技术的发展,人们对肿瘤发病机制、诊断、治疗和预防的进一步探索带来了希望。肿瘤坏死因子样配体1A（TNF-like ligand 1A,TL1A）,又称TNFSF15,是由内皮细胞、活化的T细胞、巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞产生,其作用是抑制内皮细胞的增殖和血管生成,被报道参与调节血管内稳态和炎症。既往研究报道TL1A在风湿性关节炎（RA）、哮喘、炎症性肠病等多种自身免疫性炎症疾病中发挥重要作用。此外,TL1A已被证实参与多种肿瘤的发展,因此被认为是癌症治疗的潜在治疗靶点。近有报道称TL1A表达降低与乳腺癌患者预后不良有关。然而,TL1A在胃癌中的表达情况及其在肿瘤发生发展中的作用仍不清楚,难以明确且鲜有报道。目的:在本研究中,我们旨在通过利用肿瘤相关数据库和生物信息学方法,以及免疫组织化学、Western Blot、qPCR等分子生物学实验技术方法,对胃癌组织中TL1A的表达量,与临床病理因素之间的关系及预后进行分析,明确TL1A在胃癌发展中的作用。并且,通过体外实验探讨TL1A对胃癌细胞生物学行为的影响,旨在阐明TL1A在胃癌中发挥作用的可能机制,为诊断和治疗胃癌提供新的靶点。研究方法:1、通过应用肿瘤基因组图谱（TCGA）、GEPIA和UALCAN在线数据库检索胃癌组织样本和癌旁正常组织样本RNA-seq基因表达数据,比较TL1A在胃癌组织与癌旁正常组织mRNA水平表达上的差异,分析其与临床病理因素之间的关系,并登录Kaplan-Meier网站（http://kmplot.com）分析评价TL1A基因在胃癌中预后价值。2、收集104例近三年承德医学院附属医院行手术治疗切除胃腺癌患者的癌组织及34例癌旁正常组织（距癌组织5 cm）石蜡包埋标本,采用免疫组织化学染色方法检测TL1A的表达,分析其与临床病理因素之间的关系。另外收集2017年手术切除的20例新鲜胃癌组织标本,采用实时荧光定量PCR（qPCR）及Western Blot检测mRNA和蛋白水平的表达。3、我们应用免疫荧光共聚焦应用免疫荧光染色及激光扫描共聚焦荧光显微镜,观察胃癌细胞系AGS、MGC803、BGC823、SGC7901、HGC27及胃正常上皮细胞株GES-1内TL1A表达及定位。4、在了解了TL1A在胃癌组织中的表达及其与临床病理相关性后,为了进一步印证TL1A的表达情况,也为下一步体外进行生物学行为作用和分子生物学功能的探讨,我们采用qPCR技术及Western Blot技术进一步检测胃癌细胞系AGS、MGC803、BGC823、SGC7901、HGC27及胃正常上皮细胞系GES-1内TL1A表达情况。以上均为明确TL1A在胃癌中的表达情况及与胃癌发生发展的关系。5、为了进一步明确TL1A对胃癌细胞的生物学功能,我们选用胃癌细胞系Western Blot检测结果中显着高表达的两株细胞系AGS和MGC803分别双向转染TL1A shRNA（3条）和过表达TL1A质粒。通过荧光显微镜,qPCR和Western Blot对转染效率进行观察和验证。选出sh1-TL1A,sh3-TL1A两条shRNA和过表达TL1A质粒进行细胞功能学检测。6、为了进一步确定,我们选择敲减效率最好的一条TL1A-shRNA包装成慢病毒,建立TL1A稳转敲减AGS细胞系,进行细胞功能学的的再次观察。7、为了深入的研究TL1A在胃癌中的作用机制,我们通过两条shRNA敲减质粒和TL1A过表达质粒双向转染AGS和MGC803,Western Blot实验技术检测在肿瘤生物学功能中发挥重要作用的相关蛋白。8、有变化趋势的蛋白与PI3K/Akt信号通路密切相关,我们用Western Blot检测PI3K/Akt通路相关蛋白,并应用PI3K/Akt信号通路的蛋白激酶抑制剂LY294002进行干预,应用CCK8、平板克隆形成、Transwell实验方法来检测对胃癌细胞增殖和迁移的作用,Western Blot检测相关蛋白变化,旨在明确TL1A在胃癌中的作用机制。结果:1、基于TCGA数据库检索收集375例胃癌肿瘤患者样本和50例正常胃组织样本RNA-seq基因表达数据及临床资料,多维标度（multidimensional scaling,MDS）分析显示,与癌旁正常组织相比,胃癌肿瘤标本集中在图像中部。TL1A在胃癌组织样本中的表达高于癌旁正常组织（Log FC=1.07）,差异有统计学意义（P<0.05,P=8.90E-07）。基于GEPIA在线数据库中检索到408例胃癌组织样本和211例正常组织样本,分析得到,与癌旁正常组织相比,胃癌组织样本中的TL1AmRNA明显高表达,差异具有统计学意义（P<0.01）,此外,TL1A的表达与胃癌临床分期的关系无统计学意义。应用UALCAN在线数据库对检索到的胃癌组织样本和正常胃组织样本分与胃癌临床病理因素进行分析,结果分析显示TL1A的表达与胃癌分化程度及幽门螺旋杆菌感染状态有关,差异具有统计学意义（P<0.01,P<0.01）。接着为评价TL1A基因在胃癌中预后价值,利用JetSet best probe set（仅含HGU133+2.0微阵列数据）进行KM plot（http://kmplot.com）分析,根据基因表达的中位数,将数据库中876例胃癌患者分为TL1A的高表达组和低表达组。结果表明,TL1A高水平的患者整体生存率（OS）明显低于低水平的患者,呈明显负相关（P<0.01,P=2.6E-07）。这些生物信息学分析结果充分说明,TL1A在胃癌中的表达有重要意义。2、通过免疫组织化学染色实验检测,在收集的104例胃癌组织中,TL1A在细胞膜、细胞浆、细胞核均有表达。其中,TL1A高表达76例,低表达28例。34例癌旁正常组织主要以细胞膜和细胞浆表达为主,其中TL1A低表达32例,高表达2例。与癌旁正常组织相比,TL1A在胃癌中表达明显升高（P<0.05）。此外,在染色结果中注意到随着胃癌分化越低,TL1A的表达越高。Western Blot及qPCR结果也显示胃癌组织中的TL1A表达显着高于配对癌旁正常组织（P<0.01,P<0.01）,表明TL1A升高可能与胃癌的发生有关。进而,我们又分析了TL1A表达与胃癌临床各病理因素的相关性,分析结果证实TL1A表达与胃癌分化程度、肿瘤大小存在相关关系,其它没有统计学意义,与生物信息学分析结果一致,提示TL1A与胃癌的发展有关。3、应用免疫荧光染色及激光扫描共聚焦荧光显微镜观察结果显示,TL1A蛋白在GES-1中主要定位于细胞膜和细胞浆,在其他胃癌细胞系AGS、MGC803、BGC823、SGC7901、HGC27中定位以细胞浆为主,细胞膜和细胞核也有表达,此外,胃癌细胞系中的TL1A呈高表达。所得结果与免疫组织化学染色结果一致。4、采用Western Blot技术及qPCR技术进一步检测胃癌细胞系AGS、MGC803、BGC823、SGC7901、HGC27及胃正常上皮细胞系GES-1内TL1A表达情况。结果显示:与GES-1相比,AGS、MGC803细胞TL1A基因和蛋白显着高表达。我们还检测了各胃癌细胞系分离提取胞浆蛋白及核蛋白中TL1A的表达情况,结果显示与总蛋白趋势一致,更加进一步证实TL1A在胃癌中表达于胞浆和胞核。5、下调AGS细胞中TL1A时,3条TL1A-shRNA（sh1-TL1A,sh2-TL1A,sh3-TL1A）组与阴性对照shRNA（sh-NC）组相比,mRNA水平敲减效率分别为:0.1626±0.04,2.729±0.41,0.3037±0.04,具有统计学差异（P<0.01）。蛋白水平验证结果与其一致。下调MGC803细胞中TL1A时,3条TL1A-shRNA（sh1-TL1A,sh2-TL1A,sh3-TL1A）组与阴性对照shRNA（sh-NC）组相比,mRNA水平敲减效率分别为:0.0767±0.06,3.156±0.58,0.3136±0.013,具有统计学差异（P<0.01）。蛋白水平验证结果与其一致。因此,我们在后续的实验中选用sh1-TL1A,sh3-TL1A两条shRNA进行功能学实验检测。上调AGS、MGC803细胞TL1A时,TL1A过表达质粒pHBLV-TL1A（OE-TL1A）组与pHBLV空载体（OE-NC）组相比,mRNA水平转染效率分别为623.7±23.74,29.82±10.3,具有统计学差异（P<0.01,P<0.01）。蛋白水平验证结果与其一致。通过CCK8和平板克隆形成和Transwell实验检测分析得出TL1A可以促进胃癌细胞的增殖和迁移能力。6、选择敲减效率最好的一条TL1A-shRNA包装成慢病毒,建立TL1A稳转敲减AGS细胞系,mRNA水平敲减效率为0.3756±0.077,蛋白水平验证结果一致。利用AGS TL1A敲减稳转细胞系,共转染TL1A过表达质粒,分为四组:LV-NC-NC、LV-NC-TL1A、LV-TL1A-RNAi-NC、LV-TL1A-RNAi-TL1A进行TL1A表达回复,进一步验证TL1A在胃癌细胞系中生物学功能,得到了一致的结果。因此,我们确定,TL1A在胃癌中过表达,促进胃癌的增殖和迁移,深入研究TL1A有很大意义。7、为了深入的研究TL1A在胃癌中的作用机制,我们通过两条shRNA敲减质粒和TL1A过表达质粒双向转染AGS和MGC803,Western Blot实验检测结果发现与阴性对照组shRNA（sh-NC）相比,转染TL1A-shRNA（sh1-TL1A,sh3-TL1A）的胃癌细胞AGS和MGC803的PCNA、CDK2、ROCK1、RhoA表达降低,p21、p27表达升高;与只转载空载体（OE-NC）组相比,OE-TL1A组的PCNA、CDK2、ROCK1、RhoA表达升高,p21、p27表达降低。这些差异蛋白分析后,发现与PI3K/Akt这条信号通路密切相关。8、我们应用Western Blot检测了PI3K/Akt信号通路中的PI3K 110β和85α以及p-Akt,结果发现,与阴性对照组shRNA（sh-NC）相比,转染TL1A-shRNA（sh1-TL1A,sh3-TL1A）的胃癌细胞AGS和MGC803在TL1A被敲减后,PI3K110β、PI3K85α、p-Akt表达也随之降低;与只转载空载体（OE-NC）组相比,OE-TL1A组的PI3K110β、PI3K85α、p-Akt表达也随之升高。结果说明,TL1A促进胃癌的增殖和迁移与PI3K/Akt信号通路有关系。为了进一步证实,我们应用了PI3K/Akt细胞信号传导通路的蛋白激酶抑制剂LY294002。结果证实,在DMSO对照组中,过表达TL1A促进胃癌细胞AGS和MGC803的增殖,使用PI3K/Akt信号通路的蛋白激酶抑制剂LY294002后,细胞生长及迁移能力被抑制,Western Blot检测结果显示:在DMSO对照组中,过表达TL1A后,PI3K110β、PI3K85α、p-Akt、PCNA、CDK2、ROCK1、RhoA表达也随之升高,p21、p27表达降低,使用PI3K/Akt信号通路的蛋白激酶抑制剂LY294002后,这些表达变化被抑制。以上实验结果证实TL1A可以通过PI3K/Akt信号通路促进胃癌细胞的增殖和迁移能力。结论:1、TL1A在胃癌中主要定位于细胞浆、细胞核并且高表达。2、TL1A高表达与胃癌患者的分化程度、肿瘤大小正相关,与胃癌患者生存率呈明显负相关。3、TL1A促进胃癌的增殖和迁移。4、TL1A通过PI3K/Akt信号通路促进胃癌的增殖和迁移。
张东华[7]（2019）在《Caenorhabditis elegans中肿瘤坏死因子超家族信号途径的同源基因在AD发病机制中的作用》文中研究说明阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种年龄相关的、慢性神经退行性病变,主要引起老年痴呆症,其典型的病理特征是神经元间由β淀粉样多肽（amyloid β peptide）聚集而成的老年斑（senile plaques,SP）和神经元内过磷酸化Tau蛋白聚集而成的神经纤维缠结（neurofibrillary tangles,NFT）。随着全球人口老龄化问题的不断加深,AD也日益成为严重的医疗及社会问题。AD病因复杂,目前主要有Aβ毒性假说、Tau蛋白毒性假说、炎症反应假说等。其中炎症假说受到了越来越多的关注,肿瘤坏死因子超家族（TNF superfamily）信号途径的过度激活及激活的转录因子NF-κB介导过量生成的TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-17等细胞因子对神经组织造成的损伤在AD发病过程中起着不容忽视的作用。然而秀丽隐杆线虫C.elegans中并不存在与哺乳动物相同的完整肿瘤坏死因子超家族信号通路:线虫不具有肿瘤坏死因子超家族配、受体的同源基因,也无与肿瘤坏死因子受体（TNFR）结合的适配体蛋白FADD或TRADD的同源基因;下游还缺乏与炎症反应相关的主要转录因子NF-κB。但C.elegans具有与TNFR结合的肿瘤坏死因子受体相关因子（TRAFs）的同源基因rtf-1和trf-2。而有研究发现,在线虫AD模型中,Aβ142导致TNF-α诱导蛋白1（TNFAIP1）的同源基因F22E5.6转录水平显着升高。由此产生一系列疑问:人体中TNFAIP1是被TNF-α诱导表达的,而线虫中并不能产生TNF-α,F22E5.6通过何种途径调节升高?C.elegans不完整的肿瘤坏死因子超家族信号通路在AD线虫模型中是否参与致病过程?若参与,该途径在线虫中不存在转录因子NF-κB的条件下,通过怎样的生物学过程影响AD进程?其上游受体和下游通路具体如何?针对以上问题,我们开展了相关研究。1)通过RNAi与基因突变分析方法,证实C.elegaans中不完整的肿瘤坏死因子信号通路中,包括trf-1、pmk-3、vhp-1和src-2参与Aβ2对C.elegans致病过程,且非受体酪氨酸激酶Src-2位于p38上游,并对其磷酸化起调节作用。2)尽管C.elegans缺乏哺乳动物肿瘤坏死因子超家族信号通路的配、受体,我们的研究提示,Aβ1-42可以通过toll样受体家族成员Tol-1介导Aβ1-42的致病过程。进而通过tol-1回复和过表达对AD线虫表型的影响发现,tol-1位于肿瘤坏死因子超家族信号通路trf-1/src-2/pmk-3的上游。此外,在AD线虫中表达显着上调的TNF-oα诱导蛋白1（F22E5.6）也受tol-1/trf-1/src-2/pmk-3的调控。3)既然转录因子NF-κB所介导的多种细胞因子生成途径不是C.elegans中肿瘤坏死因子超家族信号通路的下游,我们通过RNAi干扰的表型检测、qPCR、Western杂交等实验发现,aap-1、akt-2及let-363均参与了 Aβ1-42导致的线虫麻痹现象;且Akt-2的磷酸化水平受Src-2的调控,提示Aβ1-42是通过肿瘤坏死因子超家族信号通路作用于P13K/Akt-2/let-363途径从而介导线虫发病。4)mTOR作为调节细胞生长和代谢的核心途径,可直接调节线粒体功能。Aβ1-42是否通过Src-2/Akt-2/let-363作用于线粒体,而导致线粒体功能受损。针对以上问题,我们采用分子生物学以及细胞生物学相关方法研究显示:线虫AD模型中,Aβ1-42的诱导表达增加了线虫体内ROS的产生并且导致线粒体动态平衡被打破,线粒体出现片段化损伤。然而,干扰肿瘤坏死因子超家族信号通路中的基因src-2和pmk-3,则能减少线虫体内ROS的产生、延缓Aβ1-42对线粒体的片段化的损伤,表明AD线虫模型中,Aβ1-42通过肿瘤坏死因子超家族信号途径作用于线粒体并使其功能受损,进而促进了线虫AD病情的发展。本研究阐明了在C.elegans中肿瘤坏死因子超家族信号途径在AD发病机制中的作用。论文主要创新点如下:1.在秀丽隐杆线虫AD模型中,肿瘤坏死因子超家族信号途径参与Aβ1-42的致病,且该信号途径与哺乳动物模型存在显着不同;2.线虫AD模型中,肿瘤坏死因子超家族是通过PI3K/Akt-2/let-363途径作用于线粒体并使其功能受损,进而促进AD病情的发展。
王军胜[8]（2019）在《蒙花苷对破骨细胞的作用及分子机制研究》文中研究说明研究背景骨质疏松症（osteoporosis）是一种以骨强度下降、脆性增加为特征,继而导致高骨折风险的代谢性骨病。严重的骨质疏松症常伴随着较高的骨折发病率、致残率和死亡率,给患者、家庭、社会带来了巨大的痛苦、负担和压力。随着老龄人口的增加,骨质疏松症已成为最常见的全球性公共卫生问题之一。据估计,到2020年,我国骨质疏松患者将达到2.86亿,到2050年,这一数字将超过5亿,而亚洲将会出现全球约一半以上的骨质疏松性骨折患者。由于没有任何方法能充分补充这种疾病导致的骨密度下降,因此,骨质疏松症目前是无法治愈的。所以,正确认识骨质疏松症,早期采取确实有效的干预措施显得尤为重要和迫切。骨骼是一个高度动态的组织,在各种因素的调节下,它进行着持续的重塑,形成骨稳态,这种稳态由成骨细胞和破骨细胞共同维持。一旦破骨细胞数量增加或骨吸收功能增强,这种稳态即被打破,引起骨量过度丢失,导致骨质疏松症、Paget病、骨关节炎、类风湿性关节炎、恶性肿瘤骨转移等多种疾病。因此,破骨细胞成为治疗骨质过度吸收性病变的主要靶点。破骨细胞由骨髓造血干细胞的单核-巨噬细胞前体,在巨噬细胞集落刺激因子（macrophage-colony stimulating factor,M-CSF）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）等作用下逐步增值、分化、融合而形成。核因子-κB受体活化因子（RANK）属于TNF受体家族,核因子-κB受体活化因子配体（RANKL）与RANK结合,募集并激活衔接分子TRAF6,使IKK2磷酸化并降解IκBα,激活NF-κB转入细胞核启动转录。活化T细胞核因子细胞质1（NFATc1）是破骨细胞形成和维持功能的主要转录和调节因子。因此,NF-κB和NFAT的表达量能够反映RANKL/RANK信号通路的激活情况。目前,临床上抑制破骨细胞的药物有双膦酸盐类、降钙素、雌激素、选择性雌激素受体拮抗剂、RANKL单克隆抗体等。尽管以上药物对于溶骨性病变的治疗均有一定的疗效,但长期使用这些药物可能发生严重的副作用。如双膦酸盐类可引起下颌骨坏死、股骨非典型骨折和食管癌;雌激素可增加乳腺癌和心脏病变等。因此,寻找既安全又能有效地治疗溶骨性疾病的药物一直是研究的热点。由于天然提取物副作用较小,而且与化学合成药物相比,更适合长期使用,因此,中药中潜在的骨活性化合物越来越受到关注。蒙花苷是一种天然黄酮苷,据报道具有促进成骨细胞分化、保护成骨细胞的作用。但其对破骨细胞的影响,尚未见相关研究。因此,本研究通过体外实验,研究蒙花苷对破骨细胞的作用,探讨其发挥作用的分子生物学机制,为临床转化应用提供充分的理论基础。目的1.利用RAW264.7细胞和小鼠骨髓来源巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophages,BMMs）建立破骨细胞分化模型,体外观察蒙花苷对破骨细胞分化和活性是否具有抑制作用。2.初步探讨蒙花苷抑制破骨细胞分化的分子机制。方法1.从8周龄C57BL/6小鼠的长骨中分离骨髓巨噬细胞,构建破骨细胞体外培养体系,经RANKL和M-CSF诱导后,用抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate resistant acid phosphatase,TRAP）染色,3个或3个以上核染色阳性的细胞即为破骨细胞。2.用CCK-8试剂盒测定在24h、48h和5d时蒙花苷对BMMs细胞的毒性,计算半抑制浓度,确定蒙花苷的体外实验浓度。3.将不同浓度（0,0.1,1,and 10 μg/mL）的蒙花苷加入破骨细胞体外培养体系,检测蒙花苷对破骨细胞形成和分化的影响。使用24孔骨吸收板测定不同浓度蒙花苷对破骨细胞骨吸收功能的影响,并对骨吸收面积进行统计分析。4.使用qRT-PCR测定破骨细胞相关基因（NFATc1,TRAP,c-Fos,OSCAR）在不同浓度（0,0.1,1,and 10 μg/mL）蒙花苷作用下的表达量。5.为了检测蒙花苷对NFATc1的蛋白水平影响,RAW264.7细胞经10μg/mL的蒙花苷预处理4小时后再加入50 ng/mL的RANKL共培养,在加入0、1和3天分别用Western blot分析NFATc1的蛋白水平变化。6.RAW264.7细胞经0,0.1,1和10 μg/mL的蒙花苷预处理后,用RANKL诱导,然后用Western blot分析蒙花苷对RANKL诱导的破骨细胞分化过程中NF-κB通路的影响。结果1.当蒙花苷浓度从0.1 μg/mL增加到15 μg/mL时,在24 h至5d内,与对照组相比,BMMs细胞活性无明显影响（P>0.05）;当蒙花苷浓度达到20 μg/mL时,BMMs细胞活性显着减小（P<0.0001）。因此确定蒙花苷浓度在15 μg/mL以内对破骨细胞生成的抑制效应非药物细胞毒性所致。2.骨髓巨噬细胞与蒙花苷共培养后,TRAP染色阳性多核细胞数明显减少,且细胞体积变小。说明蒙花苷能有效抑制破骨细胞的分化,且蒙花苷浓度越大,抑制作用越强（F=300.4,P<0.0001）。骨板吸收试验显示0.1 μg/mL的蒙花苷作用于破骨细胞时,破骨细胞骨吸收面积明显减少,说明蒙花苷能有效抑制破骨细胞的活性（F=277.3,P<0.0001）。3.通过RT-qPCR检测,与阳性对照组相比,蒙花苷明显减少了破骨细胞相关基因mRNA的表达量。当蒙花苷浓度为0.1 μg/mL时,NFATc1、TRAP的表达明显下降（t=12.1 9,P=0.0067;t=5.14,P=0.0358）,而 c-Fos 和 OSCAR 无明显变化（t=0.11,P=0.9213;t=0.01,P=0.9945）。当蒙花苷浓度达到 10μg/mL 时,NFATc1、TRAP、c-Fos 和 OSCAR 的表达量均明显下降（分别为 t=19.44,P=0.0026;t=9.83,P=0.01;t=14.33,P=0.0007;t=8.01,P=0.004）。4.Western blot分析用10 μg/mL的蒙花苷预处理的RAW264.7细胞,在加入RANKL的当天,与阳性对照组（RANKL）相比,NFATc1 的蛋白水平无明显变化（P>0.05）,但在第1天和第3天NFATc1的蛋白表达量却明显减少（F=181.2,P<0.0001）。说明蒙花苷对NFATc1的蛋白表达量不但呈剂量依赖性,且呈时间依赖性。5.RAW264.7细胞向破骨细胞分化模型中加入RANKL后,在5到30分钟时间段内p-p65/p65显着升高,在15分钟时达到顶峰（2.134±0.368）;而加入蒙花苷处理后p-p65/p65显着降低,在15分钟时达到低谷（0.116±0.072）。说明蒙花苷明显抑制了 RANKL诱导的NF-κB信号通路。6.蒙花苷加入破骨细胞培养体系后,RANKL诱导的NF-κBp65的核转位随着蒙花苷浓度的增加而逐渐减低（F=42.7,P<0.0001）,说明蒙花苷抑制NF-κB p65的核转位呈浓度依赖性。结论1.在体外破骨细胞分化模型中,蒙花苷能够明显抑制破骨细胞的形成、分化和骨吸收功能,并能够抑制分化过程中破骨细胞相关基因的表达。2.蒙花苷在破骨细胞形成的早期阶段即可发生抑制作用,其作用机理与抑制RANKL诱导的NF-κB信号通路有关。3.蒙花苷有治疗溶骨性疾病的潜在价值。
吴国柱[9]（2018）在《瘤体周边滋养血管对乳腺癌的诊断价值及与分子标记物相关性研究》文中认为研究背景:女性乳腺癌的患病风险有全球化性加剧的态势,而我国女性乳腺癌患病趋势有自身特色,即呈现显着的农村化和年轻化[1-2]。造成的后果就是乳腺癌患者的死亡率随之增高,这不但给患者家庭造成严重影响,而且给社会同样带来沉重负担。因此,医务工作者一直把对乳腺癌的预防和治疗作为重点和热点领域展开研究。乳腺肿瘤分泌血管内皮生长因子促进大量血管生成,导致肿瘤边缘带和肿瘤中心区域的血管分布存在异质性。目前的研究认为肿瘤血管的异质性由肿瘤的类型和微环境决定,微环境中肿瘤相关基质细胞的主动调节起到了关键作用,这种调节在空间、时间表达水平的不协调性导致肿瘤血管生成与生理状态下的血管生成存在显着差异[3]。以往的研究证实恶性乳腺瘤体周边区域的血流灌注强度比肿瘤中心区域显着增大,周边区域的血管分布更密集[3-4]。乳腺癌肿块生长速度快,内部血流供应不足,出现坏死区致使内部血管稀疏,血流灌注相对瘤体周边区域少。以往的研究及肿瘤治疗手段更多聚焦于肿瘤内部血管[5],而报道乳腺瘤体周边滋养动脉在良恶性肿瘤间的差异的研究并不多。恶性乳腺肿瘤生长旺盛,瘤体周边地带存在大量走行迂曲的放射状或环绕型的滋养血管,这种滋养动脉决定肿瘤生长速度的快慢和侵袭性的强弱。乳腺恶性肿瘤瘤体周边滋养动脉管径往往较粗且走形不规则,并向瘤内多个分支供应足够的血液以保障乳腺恶性肿瘤迅速生长的需求,乳腺恶性肿瘤的滋养血管是肿瘤细胞扩增和侵袭的关键因素。随着高频超声的分别率愈来愈高,超声检出直径在10mm以下的乳腺恶性结节的能力也越来越强,但这些直径较小的恶性结节在二维声像图中并不是都具有典型的声像图表现。再者,乳腺的恶性肿瘤生长迅速者,内部出现坏死液化区时,超声检测瘤体内部血管提供的诊断信息有限。以上这些情况都会影响常规超声对乳腺良恶性肿瘤的鉴别,这时候乳腺瘤体周边滋养血管对肿块的良恶性鉴别或许能提供一些有价值的信息,目前鲜有文献报道超声测量所得的肿物周边滋养动脉血流频谱在乳腺良恶性肿瘤之间的差异。随着科学技术的进步,分子生物学得以快速发展,医务工作者逐步认识到在乳腺癌的形成和发展过程中,肿瘤分子标记物对监测肿瘤的侵袭性和生长性具有显着的作用。乳腺癌的重要的分子标记物有孕激素受体（progesterone receptor,PR）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growthfactor,VEGF）、雌激素受体（estrogen receptor,ER）、人类表皮生长因子受体2（human epidermalgrowth factor receptor-2,HER2,C-erbB-2是HER2的Neu亚型）及Ki-67等,这些分子标记物在乳腺癌个体化诊断、临床治疗方案选择和预后疗效评估中对临床医师具有重要的参考价值[6-7]。目前对部分乳腺恶性肿瘤,临床提出了先进行新辅助放化疗后再进行手术的方案,以上这些分子标记物的表达情况是该疗效是否满意的直接证据[8]。但是,需要通过病理学以及免疫组化技术对组织标本观察来判断肿瘤的分子标记物表达状况,而这些组织标本必须通过穿刺活检或手术切除获得。因此,如何利用无创性影像学检查方法,通过研究肿瘤在宏观影像学形态改变与乳腺肿瘤相关的分子标记物表达的关系,以此利用无创的影像学方法间接地反映肿瘤的生物学行为进而为临床进一步治疗提供依据,是目前国内外乳腺癌影像学研究领域的重点和热点。有学者[9]将肿瘤血管分成三个区域:①肿瘤中心带,血管稀少,很少有分支或吻合支,存在大片无血管区,认为中心带与肿瘤坏死有关。②肿瘤外带,血管密集,窦状扩张,相互吻合成拌,提示外带是肿瘤细胞生长旺盛区。③肿瘤周围组织带,血管粗大迂曲,互相融合成片状、胚窦样。血管粗大的区域多位于肿瘤边缘,边缘区域的血管化程度有高于中心区域的趋势。以往的研究证实肿瘤内部血管与这些分子标记物阳性表达有关[10-12],但很少文献报道瘤体周边滋养血管与肿瘤分子标记物的关系。因此,如果寻找出乳腺癌和纤维腺瘤肿物周边滋养动脉血流频谱的差异,不但对对鉴别肿瘤良恶性的有价值,而且对乳腺内无血流信号显示、恶性征象不显着的微小癌以及发生坏死液化的癌灶的诊断有参考价值。如果能找到肿瘤周围滋养血管与肿瘤病理学标志物之间的关联性,我们在今后的工作中,就可以利用超声检查乳腺恶性瘤体周边滋养动脉观察新辅助放化疗的前后变化,利用无创的这种影像学方法就能间接地反映肿瘤的生物学行为进而为临床进一步治疗提供依据。正是基于以上因素考量,本文对乳腺肿瘤周围滋养血管及其与肿瘤分子标志物的关系展开了研究。研究内容:第一部分瘤体周围滋养动脉及超声造影肿物周缘区对乳腺良恶性肿物的诊断价值目的探讨乳腺瘤体周围滋养动脉的血流峰值流速及阻力指数对鉴别诊断乳腺良恶性肿物的可行性及应用价值;通过对乳腺肿瘤周缘区域进行超声造影,探讨乳腺肿瘤周围区域的造影增对区分肿物良恶性的应用价值。方法应用超声测定220个乳腺病灶瘤体周围滋养动脉的血流峰值流速（PSV）及阻力指数（RI）,所有病例均经手术治疗,并经术后病理证实。应用组内相关系数（intraclass correlation coefficient,ICC）对反复测量3次的滋养动脉PSV、RI所得数据进行可重复性评估,构建受试者工作曲线,得出诊断相对符合临床实际的诊断乳腺癌临界值。对其中的46个乳腺病灶周缘区行超声造影检查,对比分析乳腺良恶性肿瘤周缘区造影增强强度及造影参数的差异。结果220例乳腺肿物中有97个乳腺癌病灶,肿块直径7～52 mm,平均（23.7±10.8）mm;有123个良性病灶,肿块直径9～39 mm,平均（19.5±4.8）mm。乳腺实性瘤体周围滋养动脉血流频谱的PSV、RI的3次测值ICC大于0.75。乳腺癌周围滋养动脉频谱测值的PSV和RI均比乳腺良性肿瘤的数值高,差异有统计学意义（P<0.05）。乳腺癌周边滋养动脉多呈放射状走行,而乳腺良性瘤体周边滋养动脉多呈环绕状走行,乳腺癌与乳腺纤维腺瘤周边滋养动脉走行方式差异有统计学意义（P<0.05）。乳腺癌周边滋养动脉的PSV的诊断临届值为16.5 cm/,敏感度为86.60%,特异度较低,约为56.60%,84.15%的阴性预测值较为理想,阳性预测值差,61.31%;滋养动脉RI的诊断临界值为0.715,与之相对应的数值分别为91.75%、79.51%、92.38%和78.07%。对其中的46个乳腺病灶周缘区进行超声造影显示,乳腺癌周缘区多表现为高增强,而纤维腺瘤周缘区多为低增强或等增强（P<0.05）;与乳腺纤维腺瘤相比,乳腺癌周缘区多为放射状灌注,差异有统计学意义（P<0.05）;在造影参数的比较中,乳腺癌周缘区造影参数中的达峰时间比纤维腺瘤快,且曲线下面积大,差异有统计学意义（P<0.001）。结论超声测量乳腺瘤体周围滋养动脉稳定性良好,可成为二维超声诊断及鉴别乳腺良恶性肿块基础上的一种补充手段。乳腺肿瘤周缘区超声造影对乳腺良恶性病灶的区分有一定临床价值,也进一步印证乳腺良恶性肿瘤周围区域血管分布不同。第二部分分子标记物C-erbB-2、ki-67及VEGF的表达对判断乳腺浸润性导管癌预后的影响目的探讨分子标记物中的C-erbB-2、ki-67及VEGF的表达情况对乳腺浸润性导管癌（infiltrating ductal carcinoma,IDC）腋窝淋巴结转移、病理组织学分级的影响,为临床评估乳腺IDC预后及对瘤体周边滋养血管的研究提供理论依据。方法选取122例行乳腺癌切除术的女性患者的临床资料,该组病灶被病理证实为乳腺IDC或IDC混合型。采用回顾分析的方法对122个病灶研究,分析肿瘤相关因子ER、C-erbB-2、VEGF及ki-67及表达与乳腺浸润性导管癌腋窝淋巴结转移的关系及其对病理组织学分级的影响。结果122例乳腺IDC患者的年龄为年龄29～80岁,平均（52.6±11.3）岁;122个IDC病灶直径7～68mm,平均（24.0±11.6）mm,病灶直径≥20mm的有64个,<20mm的58个;C-erbB-2阳性表达者占39.3%（48/122）,C-erbB-2表达阴性占总数的60.7%（74/122）;组织学分级≥II级的为75个,<II级为47个;发生腋窝淋巴结者61例;ER和PR的阳性表达的病灶分别为58和54个;Ki-67阳性表达者为97例,占79.5%（97/122）,Ki-67表达阴性者为25例,占总数的20.5%（25/122）;VEGF阳性表达者占63.1%（77/122）,VEGF表达阴性者占总数的36.9%（45/122）。C-erbB-2和Ki-67阳性表达者多数病理组织分级≥II级,也更容易发生腋窝淋巴结转移（P<0.05）。C-erbB-2阳性表达者,其ER和PR多数表现为阳性（P<0.05）。Ki-67和VEGF表达阳性时,肿瘤直径多数≥20 mm（P＜0.005）,当乳腺IDC的VEGF表达阳性时,患者多数容易发生腋窝淋巴结转移（P<0.05）。结论分子标记物C-erbB-2、Ki-67在乳腺IDC中表达为阳性时,病灶的组织学分级多数≥Ⅱ级,而且多数出现腋窝淋巴结的转移的情况;当C-erbB-2呈现出阳性表达时,病灶雌激素受体ER、PR大多数呈阳性表达;Ki-67及VEGF的阳性表达者,肿瘤多数往往生长迅速,大多数肿块直径≥20 mm。因此,分子标记物C-erbB-2、Ki-67、VEGF是否阳性表达影响着乳腺IDC组织学分级及向远处转移。第三部分乳腺浸润性导管癌肿块周边滋养血管与C-erbB-2阳性表达强度分级的关系目的探讨超声检测的乳腺浸润性导管癌（infiltrating ductal carcinoma,IDC）瘤体周边滋养动脉的PSV及RI与人类表皮生长因子受体2的亚型C-erbB-2阳性表达强度分级的关系。方法回顾分析122个乳腺IDC肿物周围滋养动脉的峰值流速（PSV）及阻力指数（RI）等参数,选取同期138个乳腺纤维腺瘤作为对照分析,所有病例均经手术及病理证实,对肿瘤标本用免疫组化方法测定C-erbB-2表达情况,分为强阳性、阳性、弱阳性、阴性4个等级,分别用“+++”、“++”、“+”、“-”表示,分析其与瘤体周围滋养动脉PSV、RI之间的关系。结果乳腺IDC组肿块周边滋养动脉PSV为（20.99±8.14）cm/s,RI为0.80±0.06,纤维腺瘤组病灶周边滋养动脉的PSV为（15.56±3.68）cm/s,RI为0.66±0.07,乳腺IDC组肿物周围滋养动脉的PSV及RI均高于纤维腺瘤组肿块周边滋养动脉的PSV和RI,差异有统计学意义（P<0.001）。乳腺IDC瘤体周边滋养动脉的PSV及RI与C-erbB-2表达强度分级呈正相关（r值分别为0.323和0.360）,纤维腺瘤病灶周缘区域滋养动脉PSV及RI的大小与C-erbB-2阳性表达强度分级均无相关性（r值均为0.001）。结论乳腺IDC瘤体周边滋养动脉频谱形态呈高速高阻型,乳腺IDC滋养动脉的PSV和RI的高低与C-erbB-2表达强度分级有关第四部分乳腺浸润性导管癌病灶周围滋养动脉的PSV和RI与肿瘤直径及Ki-67表达强度的关系目的探讨乳腺浸润性导管癌（infiltrating ductal carcinoma,IDC）肿物周围区域滋养血管的PSV、RI与肿瘤直径及细胞增殖抗原标记物（Ki-67）表达强度的关系。方法回顾分析137例乳腺IDC肿物直径及周围滋养动脉的峰值流速（PSV）及阻力指数（RI）等相关参数,所有病例均经手术及病理证实,术后对肿瘤标本用免疫组化方法测定Ki-67表达情况,根据免疫组化图中显示的细胞染色数量的多少把Ki-67分成4个等级（强阳性、阳性、弱阳性和阴性）,分别用“+++”、“++”、“+”和“-”表示,分析137个病灶周边滋养动脉的PSV、RI与肿块直径及Ki-67表达等级的关系。结果137例乳腺IDC肿块直径7～68mm,平均（24.0±11.6）mm,Ki-67阳性表达率81%（111/137）.瘤体周边滋养动脉的RI和肿瘤直径在Ki-67的“-”组、“++”组、“+”组和“+++”组间比较结果不同,差异有统计学意义（F=3.52和2.76,P=0.017和0.045）。随着结节直径及瘤体周边滋养血管的PSV和RI增高,Ki-67阳性表达强度分级增高,即存在正相关性（r值分别为0.283、0.271和0.361,P值均<0.001）,137个乳腺病灶直径与周边滋养动脉的PSV呈正相关（r=0.409,P<0.001）,与 RI 呈正相关（r=0.361,P<0.001）。结论乳腺IDC的瘤体周边滋养血管的PSV和RI与肿瘤直径与Ki-67阳性表达强度呈正相关性。肿瘤直径的大小与乳腺癌病灶周边滋养PSV和RI的高低呈正相关性。
吴光亮[10]（2017）在《Toll样受体信号通路关键基因与缺血性中风及其中医证候易感性的关联性研究》文中研究表明目的:本研究旨在通过基因富集技术筛选出影响缺血性中风病的重要通路-Toll样受体信号通路（Toll-like receptor signaling pathway）并对其2个关键基因:肿瘤坏死因子受体相关因子 6（Tumor necrosis factor receptor-associated factor6,TRAF6）基因及Toll样受体4（Toll-like receptors4,TLR4）单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms,SNP）与缺血性中风（Ischemic Stroke,IS）及其中医证候的相关性进行分析,此外,我们还对其关键基因多态性与血清血脂水平的相关性进行了分析,我们希望本研究可以为进一步研究缺血性中风的遗传机制奠定一定的基础,以及为揭示缺血性中风病中医辨证分型的科学内涵提供一定的遗传学依据。方法:本研究运用遗传流行病学的方法采用基因组富集（Gene set enrichment analysis,GSEA）等生物信息学方法筛选出符合纳入排除标准的基因芯片表达谱数据,并初步筛选出在转录水平上影响缺血性中风的通路及基因;继而采用病例对照研究设计,共纳入缺血性中风病患者184例,对照组116例。运用Sanger基因分型技术对研究对象的外周静脉血的TRTF6基因rs5030411、rs5030416功能SNPs、以及TLR4基因的rs10759932、rs11536889和rs1927914多态性进行基因分型检测。使用SPSS17.0 for windows、STATA（STATA College Station,Texas,USA）软件进行统计分析。结果:1.经过筛查后,本研究在GEO数据库中筛选到了 1套芯片数据,即GSE16561,对此套数据直接进行基因组富集分析,得到了影响缺血性中风的关键通路Toll样受体信号通路及该通路上的关键差异基因（TLR4、TR4F6）。2.哈温平衡（Hardy-WeinbergEquilibrium,HWE）检验:所研究的5个基因位点在对照组中的基因型分布均符合HWE平衡定律（P>0.050）。3.TR F6基因单位点多态性与缺血性中风易感性的分析结果（1）TRTF6基因的rs5030411和rs5030416多态性与缺血性中风易感性的不存在关联,差异无统计学意义（均为P>0.050）。（2）TF6基因的rs5030411和rs5030416多态性与男性、女性缺血性中风易感性的不存在关联,差异均无统计学意义（均为P>0.050）。4.TLR4基因单位点多态性与缺血性中风易感性的分析结果（1）对rs10759932的研究,我们发现其3种遗传模型与缺血性中风易感性相关:其中,在杂合子遗传模型（Model 2:OR=0.095,95%CI:0.022-0.414,P=0.002）和纯合子模型（Model 2:OR=0.130,95%CI:0.029-0.581,P=0.008）其多态性与性缺血性中风的易感性相关;在隐性遗传模型中,rs10759932多态性与性缺血性中风的易感性相关,差异有统计学意义（Model 2:OR=9.120,95%CI:2.224-37.396,P=0.002）。（2）对rs1927914分析,结果提示:纯合子遗传模型,我们发现rs1927914多态性与缺血性中风易感性相关（Model 2:OR=0.226,95%CI:0.067-0.764,P=0.017）;而隐性遗传模型,我们发现rs1927914与缺血性中风易感性相关（Model 1:OR=2.246,95%CI:1.214-4.158,P=0.010,Model 2:OR=3.522,95%CI:1.128-10.996,P=0.030）。（3）TLR4基因rs1 1536889多态性与缺血性中风易感性的不存在关联,差异无统计学意义（均为P>0.050）。（4）在女性分层的研究中,结果示:TLR4基因rs10759932多态性与女性缺血性中风的易感性相关。杂合子模型:（Model 2:OR=0.024,95%CI:0.002-0.364,P=0.007）;纯合子遗传模型结果为（Model 2:OR=0.014,95%CI:0.001-0.234,P=0.003）;此外,隐性遗传模型中,在经过多因素调整的的Model 2中,结果示rs10759932多态性与女性缺血性中风的易感性相关（OR=52.29,95%CI:3.753-728.48,P=0.003）。（5）在女性分层的研究中,结果示:TLR4基因rs1927914多态性与女性缺血性中风的易感性相关:杂合子遗传模型（Model 2:OR=0.070,95%CI:0.006-0.865,P=0.038）;纯合子遗传模型（Model 2:OR=0.065,95%CI:0.007-0.630,P=0.018）;此外,在隐性遗传模型的中,我们发现其多态性与缺血性中风易感性相关:（OR=15.078,95%CI:1.621-140.25,P=0.017）。（6）在男性的分层分析中,结果示:在经过多因素校正的显性遗传模型的Model 2,TLR4基因rs1927914多态性与男性缺血性中风的易感性相关（OR:0.147,95%CI:0.023-0.952,P=0.044）。5.Toll样信号通路关键基因位点多态性与缺血性中风不同中医证候的分析结果（1）风证:在对缺血性中风风证及非风证的研究中,我们的研究结果表明:TRAF6基因rs5030411、rs5030416 多态性,以及 TLR4基因 rs10759932、rs11536889 和rs1927914多态性与缺血性中风痰证易感性不存在关联,差异无统计学意义（P>0.050）。（2）痰证:在对痰证及非痰证缺血性中风患者的分析中,研究结果表明TRAF6、TLR4基因所候选的5个基因位点多态性均与缺血性中风痰证易感性不存在关联,差异无统计学意义（P>0.050）。（3）血瘀证:在对血瘀证及非血瘀证缺血性中风患者的分析中,研究结果表明TRAF6基因 rs5030411、rs5030416 多态性,以及TLR4基因 rs10759932、rs11536889多态性与缺血性中风痰证易感性的不存在关联,差异无统计学意义（P>0.050）。而在对TLR4财基因rs1927914多态性的研究中,我们发现其显性模型在校正性别、年龄的Model 1中,其与缺血性中风痰证易感性有统计学意义（OR=2.182,95%CI:1.026-4.639,P=0.043）,但是在多因素校正的Model 2,这一统计学关联则未被重复。（4）气虚证:在对气虚与非气虚证缺血性中风患者的研究中,我们的研究结果表明:TRAF6、TLR4基因多态性与缺血性中风气虚证易感性的不存在关联,差异无统计学意义（P>0.050）。6.TRAF6、TLR4基因位点多态性与缺血性中风患者血脂水平的分析结果研究发现TLR4基因rs11536889多态性均与缺血性中风患者血清LDL水平存在关联,差异有统计学意义（Padj2=0.046）。结论:（1）Toll样受体信号通路可能是影响缺血性中风的关键通路。（2）TLR4基因rs10759932多态性可能与汉族人群缺血性中风有关,其A1A2和A2A2基因型可能是汉族人群缺血性中风的保护因素,可能会降低汉族人群、特别是汉族女性人群缺血性中风易感性的风险。（3）TLR4基因rs1927914多态性可能与汉族人群缺血性中风有关,其A1A2和A2A2基因型可能是汉族人群缺血性中风的保护因素,可能会降低汉族人群、特别是汉族女性人群缺血性中风易感性的风险;此结果在汉族男性人群同样可以得到验证。（4）TRAF6、TLR4基因rs5030411和rs5030416多态性可能与缺血性中风风证、痰证、气虚证、血瘀证易感性风险无关。（5）TLR4基因rs10759932、rs11536889以及rs1927914多态性可能与缺血性中风风证、痰证、气虚证、血瘀证易感性风险无关。（6）TLR4基因rs11536889多态性可能与缺血性中风患者血清低密度脂蛋白代谢相关。
二、肿瘤坏死因子受体分子生物学研究及临床应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肿瘤坏死因子受体分子生物学研究及临床应用（论文提纲范文）
（1）基于网络药理学探究麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的显效成分和作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 综述 |
| 1.1 病态窦房结综合征研究现状 |
| 1.1.1 病态窦房结综合征的发病机制研究 |
| 1.1.2 SSS的分型与临床表现 |
| 1.1.3 SSS的西医治疗 |
| 1.1.4 SSS的中医学研究现状 |
| 1.2 麻黄附子细辛汤研究现状 |
| 1.2.1 麻黄附子细辛汤的现代药理作用研究 |
| 1.2.2 麻黄附子细辛汤在SSS治疗中的应用 |
| 1.3 网络药理学简介及其在中医药研究中的应用 |
| 1.3.1 网络药理学概述 |
| 1.3.2 网络药理学常用数据库及研究方法 |
| 1.3.3 网络药理学与中医药研究 |
| 第二章 基于网络药理学探究麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的显效成分和作用机制 |
| 2.1 数据收集与研究方法 |
| 2.1.1 流程图 |
| 2.1.2 数据收集 |
| 2.1.3 网络构建与分析 |
| 2.1.4 分子对接验证 |
| 2.1.5 靶点通路注释分析 |
| 2.2 研究结果 |
| 2.2.1 构建麻黄附子细辛汤化学成分及潜在靶点数据集 |
| 2.2.2 构建SSS相关的疾病靶点数据集 |
| 2.2.3 麻黄附子细辛汤化学成分潜在靶点与SSS相关靶点的交集基因 |
| 2.2.4 麻黄附子细辛汤-化学成分-靶点-SSS网络及显效成分 |
| 2.2.5 麻黄附子细辛汤治疗SSS的关键化学成分和核心靶点 |
| 2.2.6 分子对接结果 |
| 2.2.7 靶点通路注释分析 |
| 2.3 分析与结论 |
| 2.3.1 麻黄附子细辛汤治疗SSS的显效成分分析 |
| 2.3.2 麻黄附子细辛汤治疗SSS的关键成分和核心靶点分析 |
| 2.3.3 靶点通路注释分析 |
| 2.3.4 结论 |
| 2.3.5 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（2）PD-1和TIM-3在耗竭T细胞介导B系淋巴瘤免疫逃逸中的作用机制及临床应用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 外周血和淋巴结中T细胞PD-1表达以及血浆中可溶性PD-1和PD-L1水平动态变化对弥漫大B细胞淋巴瘤患者预后影响的分析研究 |
| 一、外周血和淋巴结中T细胞PD-1表达对弥漫大B细胞淋巴瘤患者预后影响的分析研究 |
| (一)材料和仪器 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 二、血浆中可溶性PD-1和PD-L1水平动态变化对弥漫大B细胞淋巴瘤患者预后影响的分析研究 |
| (一)材料和仪器 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 第二部分 PD-1阻断策略临床应用于难治/复发弥漫大B细胞淋巴瘤的疗效和安全性分析及其预后生物标记物和耐药机制研究 |
| 一、PD-1单抗临床应用难治/复发弥漫大B细胞淋巴瘤的疗效和安全性分析及其预后生物标记物和耐药机制研究 |
| (一)材料和仪器 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 二、PD-1基因敲减的CAR-CD19T细胞临床应用难治/复发弥漫大B细胞淋巴瘤的疗效和安全性分析及耐药机制研究 |
| (一)材料和仪器 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 第三部分 小鼠模型中PD-1及TIM-3单抗联合干预的疗效观察及机制研究 |
| 一、小鼠模型中PD-1及TIM-3单抗联合干预的疗效观察 |
| (一)材料和仪器 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 二、小鼠模型中PD-1及TIM-3单抗联合干预的机制研究 |
| (一)材料和仪器 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 淋巴瘤免疫治疗的现状及展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（3）基于“肠道菌群—黏膜屏障”研究“黄芩—黄连”药对治疗T2DM的疗效机制及配伍效应（论文提纲范文）
| 摘要(中文) |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献研究与理论探讨 |
| 第一节. 研究背景 |
| 1. T2DM治疗的挑战与机遇 |
| 2. T2DM的中医治疗 |
| 第二节. T2DM与“肠道菌群—黏膜屏障”的关系 |
| 1. T2DM与肠道菌群 |
| 1.1. 肠道菌群的生理作用及在DM中的病理改变 |
| 1.2. 肠道菌群紊乱与T2DM的关系 |
| 1.3. 小结 |
| 2. T2DM与肠道屏障 |
| 2.1. 肠黏膜屏障的生理作用及在DM中的病理改变 |
| 2.2. 肠黏膜损伤及LPS“渗漏”与T2DM的关系 |
| 2.3. 小结 |
| 第三节. 肠道黏膜屏障的影响因素及损伤修复机制 |
| 1. 肠黏膜屏障的影响因素 |
| 1.1. 饮食/饮酒 |
| 1.2. 压力 |
| 1.3. 运动 |
| 1.4. 疾病/药物 |
| 2. 肠黏膜屏障的损伤修复机制 |
| 2.1. 肠道菌群 |
| 2.2. 炎症反应 |
| 2.3. 氧化应激 |
| 2.4. 激素分泌 |
| 2.5. 细胞内稳态 |
| 第四节. 肠道菌群视角下的T2DM“火热浊毒”病机新识 |
| 1. 从“肠道菌群—宿主”的交互作用探析“消渴早期当从火断” |
| 1.1. T2DM“火热”证候的研究概况 |
| 1.2.“菌群—宿主”的交互作用与T2DM的火热证候 |
| 1.3. 小结 |
| 2. 从肠道菌群探析T2DM“精—浊—毒”的病理演变 |
| 2.1. 肠道菌群与T2DM“精易浊” |
| 2.2. 肠道菌群与T2DM“浊生毒” |
| 2.3. 小结 |
| 第五节.“黄芩—黄连”药对治疗T2DM的研究进展 |
| 1. 本草溯源 |
| 1.1. 直折火热 |
| 1.2. 化浊解毒 |
| 1.3. 治疗消渴 |
| 1.4. 戕伐脾胃 |
| 2. 临床证据 |
| 3. 分子机制 |
| 4. 配伍及量效关系 |
| 参考文献 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 引言 |
| 1. 研究目的与意义 |
| 2. 研究内容及技术路线图 |
| 第二节.“黄芩—黄连”改善T2DM大鼠代谢性炎症的实验研究 |
| 1. 材料及设备 |
| 1.1. 实验动物 |
| 1.2. 实验药物 |
| 1.3. 主要试剂 |
| 1.4. 仪器及耗材 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1. 药品制备 |
| 2.2. 造模及分组 |
| 2.3. 取材及样品制备 |
| 2.4. 指标测定 |
| 2.5. 统计分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1.芩-连对T2DM大鼠基本情况的影响 |
| 3.2.芩-连对T2DM大鼠血糖及胰岛素的影响 |
| 3.3.芩-连对T2DM大鼠血脂及游离脂肪酸的影响 |
| 3.4.芩-连对T2DM大鼠血清代谢性炎症指标的影响 |
| 3.5.血清LPS与T2DM大鼠代谢及炎症指标的相关性 |
| 3.6. 芩-连对T2DM大鼠胰腺组织的影响 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第三节.“黄芩—黄连”对T2DM大鼠肠黏膜损伤修复机制的研究 |
| 1. 材料及设备 |
| 1.1. 实验动物 |
| 1.2. 实验药物 |
| 1.3. 主要试剂 |
| 1.4. 仪器及耗材 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1. 药品制备 |
| 2.2. 造模及分组 |
| 2.3. 取材及样品制备 |
| 2.4. 指标测定 |
| 2.5. 统计分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1. 芩-连对T2DM大鼠肠黏膜损伤血清标志物的影响 |
| 3.2. 芩-连对T2DM肠道组织病理的影响 |
| 3.3. 芩-连对T2DM大鼠肠道紧密连接蛋白的影响 |
| 3.4. 芩-连对T2DM大鼠肠道组织炎症指标的影响 |
| 3.5. 芩-连对T2DM大鼠肠道氧化应激指标的影响 |
| 3.6. 芩-连改善T2DM大鼠肠道损伤的机制 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第四节.“黄芩—黄连”对大鼠肠道菌群及短链脂肪酸影响的研究 |
| 1. 材料及设备 |
| 1.1. 实验动物 |
| 1.2. 实验药物 |
| 1.3. 主要试剂 |
| 1.4. 实验仪器及耗材 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1. 药品制备 |
| 2.2. 造模及分组 |
| 2.3. 取材及样品制备 |
| 2.4. 指标测定 |
| 2.5. 统计分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1. 芩-连对T2DM大鼠肠道菌群的影响 |
| 3.2. 芩-连对正常大鼠肠道菌群的影响 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第五节. 基于“菌群—屏障”探索“黄芩—黄连”改善T2DM的配伍效应 |
| 1. 材料及设备 |
| 1.1. 实验动物 |
| 1.2. 实验药物 |
| 1.3. 主要试剂 |
| 1.4. 实验仪器及耗材 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1. 药品制备 |
| 2.2. 造模及分组 |
| 2.3. 取材及样品制备 |
| 2.4. 指标测定 |
| 2.5. 统计分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1. 对体重、血糖及胰岛素水平的影响 |
| 3.2. 对肠黏膜屏障的影响 |
| 3.3. 对肠道菌群的影响 |
| 3.4. 肠道菌群与肠道炎症的相关性分析 |
| 3.5. SD大鼠及ICR小鼠的肠道菌群差异性研究 |
| 4. 讨论 |
| 5.小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 特色与创新 |
| 不足与展望 |
| 致谢 |
| 文献综述 肠道菌群,中药治疗糖尿病的新靶点 |
| 1. 糖尿病与肠道菌群的关系 |
| 2. 研究综述 |
| 3. 机制探索 |
| 4. 讨论和展望 |
| 5. 总结 |
| 参考文献 |
| 附件 1:在读期间公开发表的学术论文及专着 |
（4）急性髓系白血病化疗疗效分析与耐药机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 复发或难治性急性髓系白血病临床特征与疗效分析 |
| 引言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 FLT3-ITD基因突变急性髓系白血病患者预后分析 |
| 引言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 TRAF2在急性髓系白血病耐药中的作用与机制研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 文献综述 复发或难治性急性髓系白血病治疗进展 |
| 参考文献 |
| 附录 英文缩写中英文全名对照表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（5）尤文肉瘤的差异蛋白质组学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 运用iTRAQ技术寻找差异蛋白 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 附技术路线图 |
| 1.4 质量控制 |
| 1.5 数据分析及处理 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 运用Western Blotting进行目标蛋白验证 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 附技术路线图 |
| 1.4 质量控制 |
| 1.5 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 VAC/IE方案治疗尤文肉瘤的相关资料分析 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 质量控制 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（6）TL1A在胃癌中过表达并通过PI3K/Akt信号通路促进胃癌增殖与迁移（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:TL1A在胃癌中过表达且与胃癌发生发展及预后相关 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 数据库、实验对象、材料与试剂 |
| 2.1.1 数据库及在线网站 |
| 2.1.2 临床胃癌病例信息及组织样本收集 |
| 2.1.3 细胞 |
| 2.1.4 主要实验试剂 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 数据库分析 |
| 2.2.2 免疫组织化学染色 |
| 2.2.3 胃癌细胞系细胞培养 |
| 2.2.4 免疫荧光染色及激光扫描共聚焦显微镜观察胃癌细胞系内TL1A表达及定位 |
| 2.2.5 胃癌组织总RNA提取及实时荧光定量PCR |
| 2.2.6 胃癌组织总蛋白提取及Western Blot |
| 2.2.7 胃癌细胞系总 RNA 的提取及实时荧光定量 PCR |
| 2.2.8 胃癌细胞系总蛋白、胞浆蛋白、核蛋白提取及Western Blot |
| 2.2.9 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 基于TCGA数据库分析TL1A在胃癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织 |
| 3.2 基于GEPIA在线数据库分析TL1A在胃癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织 |
| 3.3 基于 UALCAN 在线数据库分析 TL1A 在胃癌组织中的表达与胃癌分化程度及幽门螺旋杆菌感染状态有关 |
| 3.4 Kaplan-Meier 对 TL1A 基因进行胃癌中预后分析 |
| 3.5 免疫组化检测TL1A在胃癌中高表达 |
| 3.6 TL1A在胃癌中的表达与临床各病理因素间的关系 |
| 3.7 免疫荧光检测TL1A在胃癌细胞系中的表达及定位 |
| 3.8 临床配对样本中 TL1A 的表达 |
| 3.9 胃癌细胞系中TL1A的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:TL1A通过促进PI3K/Akt信号通路促进胃癌增殖与迁移 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 质粒构建与转染 |
| 2.2.3 实时荧光定量PCR和 Western Blot验证转染效率 |
| 2.2.4 CCK8 实验 |
| 2.2.5 平板克隆形成实验 |
| 2.2.6 细胞迁移实验 |
| 2.2.7 建立TL1A敲减稳转细胞系 |
| 2.2.8 TL1A 敲减稳转细胞系转染过表达质粒 |
| 2.2.9 Western Blot检测相关蛋白 |
| 2.2.10 Western Blot检测PI3K/Akt通路相关蛋白 |
| 2.2.11 应用PI3K/Akt通路抑制剂LY294002 干预后观察细胞功能学及相关蛋白变化 |
| 2.2.12 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 双向转染TL1A效率检测 |
| 3.2 TL1A促进胃癌细胞的增殖能力 |
| 3.3 TL1A 促进胃癌细胞的迁移能力 |
| 3.4 慢病毒转染AGS建立TL1A敲减稳转细胞系及转染效率检测 |
| 3.5 TL1A敲减稳转细胞系转染TL1A过表达质粒 |
| 3.6 Western Blot检测细胞增殖、迁移相关蛋白 |
| 3.7 Western Blot检测PI3K/Akt通路相关蛋白 |
| 3.8 应用PI3K/Akt蛋白激酶抑制剂LY294002 处理后观察胃癌细胞功能学及相关蛋白的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）Caenorhabditis elegans中肿瘤坏死因子超家族信号途径的同源基因在AD发病机制中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1. 阿尔茨海默病的概况 |
| 2. 有关AD发病机制的假说 |
| 3. TNF superfamily signaling pathway在AD发病过程中的作用 |
| 4. C.elegans在AD发病机制研究中的应用及其优势 |
| 5. C.elegans的肿瘤坏死因子超家族及本研究的必要性 |
| 第二章 肿瘤坏死因子超家族信号途径参与Aβ致病过程 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1 实验材料(仪器、试剂、培养基) |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要试剂盒 |
| 2.1.4 培养基及其配制 |
| 2.1.5 主要试剂及其配制 |
| 2.2.6 实验用线虫株 |
| 2.2.7 实验用菌种 |
| 2.2.8 实验用引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 线虫的培养 |
| 2.2.2 线虫的同步化 |
| 2.2.3 线虫的冻存 |
| 2.2.4 线虫的RNAi |
| 2.2.5 线虫AD模型株CL4176的麻痹实验 |
| 2.2.6 线虫AD模型株CL2355气味学习实验 |
| 2.2.7 趋化实验 |
| 2.3.8 线虫的杂交 |
| 2.2.9 单线虫PCR |
| 2.2.10 实时定量PCR |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 线虫中肿瘤坏死因子诱导蛋白1(TNFARP1)同源基因F22E5.6与Aβ的毒性 |
| 3.1.1 Aβ_(1-42)对F22E5.6转录水平的影响 |
| 3.1.2 线虫基因F22E5.6与Aβ_(1-42)毒性 |
| 3.2 肿瘤坏死因子超家族信号途径与Aβ_(1-42)的毒性 |
| 3.2.1 TRAFs的线虫同源基因与Aβ_(1-42)毒性 |
| 3.2.2 NF-KB途径中线虫同源基因与Aβ_(1-42)毒性 |
| 3.2.3 Src的同源基因与Aβ_(1-42)的毒性 |
| 3.2.4 TAB途径与Aβ_(1-42)的毒性 |
| 3.2.5 JNK的线虫同源基因与Aβ_(1-42)毒性 |
| 3.2.6 p38的线虫同源基因与Aβ_(1-42)毒性 |
| 3.3 Aβ_(1-42)对与肿瘤坏死因子超家族信号中致病相关基因转录水平的影响 |
| 3.3.1 线虫总RNA的提取 |
| 3.3.2 Aβ_(1-42)调节肿瘤坏死因子超家族信号中与毒性相关基因的转录水平 |
| 3.4 与Aβ_(1-42)毒性相关基因的缺失突变 |
| 3.4.1 AD模型线虫与突变株的杂交 |
| 3.4.2 Aβ毒性相关肿瘤坏死因子超家族信号线虫同源基因突变的麻痹实验 |
| 3.4.3 Aβ毒性相关肿瘤坏死因子超家族信号的线虫同源基因与气味联想性学习 |
| 3.4.4 线虫中Src-2位于Pmk-3上游并调节其磷酸化水平 |
| 4. 讨论 |
| 第三章 Aβ通过tol-1调节线虫中肿瘤坏死因子超家族途径的同源基因 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 仪器设备 |
| 2.1.2 实验药品与试剂 |
| 2.1.3 试剂配制 |
| 2.1.4 主要试剂盒 |
| 2.1.5 实验所用线虫株 |
| 2.1.6 实验引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 线虫培养 |
| 2.2.2 定量PCR |
| 2.2.3 线虫麻痹实验 |
| 2.2.4 tol-1表达载体的构建 |
| 2.2.5 显微注射(microinjection) |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 tol-1参与Aβ_(1-42)的致病过程 |
| 3.1.1 Aβ_(1-42)对tol-1转录水平的影响 |
| 3.1.2 tol-1敲除株的构建 |
| 3.1.3 tol-1在AD线虫肌肉麻痹中的作用 |
| 3.1.4 tol-1对AD线虫气味联想性学习的作用 |
| 3.2 tol-1与线虫中肿瘤坏死因子超家族信号通路的同源基因的上下游关系 |
| 3.2.1 tol-1对肿瘤坏死因子超家族信号通路同源基因的转录水平的调节 |
| 3.2.2 tol-1表达载体的显微注射 |
| 3.2.3 tol-1与肿瘤坏死因子超家族信号途径的上下游关系 |
| 3.3 tol-1及肿瘤坏死因子信号途径对F22E5.6转录水平的调节 |
| 4. 讨论 |
| 第四章 线虫中Aβ通过肿瘤坏死因子超家族信号途径作用于PI3K/Akt/mTOR途径 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 仪器设备 |
| 2.1.2 实验药品与试剂 |
| 2.1.3 试剂的配制 |
| 2.1.4 主要试剂盒 |
| 2.1.5 实验引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 线虫的培养 |
| 2.2.2 AD线虫CL4176的麻痹实验 |
| 2.2.3 定量PCR分析 |
| 2.2.4 Western Blot |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 线虫中PI3K与Aβ_(1-42)的毒性 |
| 3.2 Akt的线虫同源基因与Aβ_(1-42)毒性 |
| 3.3 mTOR的线虫同源基因let-363与Aβ的毒性 |
| 3.4 诱导表达Aβ_(1-42)后基因akt转录水平的变化 |
| 3.5 Akt-2蛋白磷酸化水平的检测 |
| 4. 讨论 |
| 第五章 肿瘤坏死因子超家族信号途径对线虫线粒体的影响 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要的仪器设备 |
| 2.1.2 实验药品与试剂 |
| 2.1.3 试剂的配制方法 |
| 2.1.4 主要试剂盒 |
| 2.1.5 实验所用线虫株 |
| 2.1.6 实验所用细菌菌种 |
| 2.1.7 实验所用引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 线虫ROS的检测 |
| 2.2.2 线粒体形态观察 |
| 2.2.3 线粒体片段化定量统计 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 Aβ_(1-42)通过肿瘤坏死因子超家族信号导致skn-1的转录水平的改变 |
| 3.2 Aβ_(1-42)通过肿瘤坏死因子超家族信号途径调节线虫体内ROS的水平 |
| 3.3 Aβ_(1-42)通过肿瘤坏死因子超家族信号的同源基因导致线虫线粒体的片段化 |
| 4. 讨论 |
| 全文总结与讨论 |
| 附录 |
| 1. CL4176和CL802线虫总RNA的提取 |
| 2. 杂交突变株与突变株的突变基因序列比对 |
| 3. hsp16.48启动子序列 |
| 4. tol-1编码区基因序列 |
| 5. tol-1表达载体的构建 |
| 5.1 hsp16.48启动子及tol-1编码区基因的扩增 |
| 5.2 启动子与载体pPD95_75的连接 |
| 5.3 tol-1编码区基因与载体的连接 |
| 5.4 所构建tol-1表达载体的融合片段基因序列准确性的验证 |
| 6. 不同线虫株总RNA的提取 |
| 7. 术语字母对照表 |
| 参考文献 |
| 博士在读期间在科研成果 |
| 致谢 |
（8）蒙花苷对破骨细胞的作用及分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 前言 |
| 第二部分 蒙花苷对破骨细胞的作用观察 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 破骨细胞培养和鉴定 |
| 2.2.4 蒙花苷对BMMs细胞的毒性试验 |
| 2.2.5 蒙花苷对破骨细胞的形成和分化的影响 |
| 2.2.6 蒙花苷对破骨细胞活性的影响(骨板吸收试验) |
| 2.2.7 蒙花苷对破骨细胞相关基因表达的影响 |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 破骨细胞形态学观察 |
| 2.3.2 蒙花苷对BMMs细胞的毒性检测 |
| 2.3.3 蒙花苷抑制破骨细胞的形成和分化 |
| 2.3.4 蒙花苷抑制RANKL诱导的破骨细胞的骨吸收活性 |
| 2.3.5 蒙花苷抑制破骨细胞形成过程中相关基因的表达 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 骨质疏松症与骨免疫 |
| 2.4.2 骨质疏松症的治疗现状 |
| 2.4.3 蒙花苷对成骨细胞的作用 |
| 2.4.4 蒙花苷抑制破骨细胞的分化、形成及功能 |
| 2.5 小结 |
| 第三部分 蒙花苷抑制破骨细胞分化的分子机制 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 Western blot检测蒙花苷对RANKL诱导的NFATc1蛋白表达的影响 |
| 3.2.3 Western blot检测蒙花苷对RANKL诱导的NF-κB p65蛋白表达的影响 |
| 3.2.4 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 蒙花苷抑制RANKL诱导的NFATc1蛋白的表达 |
| 3.3.2 蒙花苷抑制RANKL诱导的NF-κB p65蛋白的表达 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 NF-κB的组成及激活途径 |
| 3.4.2 NF-κB的作用 |
| 3.4.3 NF-κB信号通路与破骨细胞 |
| 3.4.4 蒙花苷通过抑制NF-κB信号通路抑制破骨细胞的形成 |
| 3.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 蒙花苷的药理活性研究进展 |
| 1 引言 |
| 2 药理学活性 |
| 2.1 抗炎作用 |
| 2.2 抗癌作用 |
| 2.3 器官保护作用 |
| 2.4 调节血压 |
| 2.5 抗骨质疏松 |
| 2.6 其它作用 |
| 3 展望 |
| 4 参考文献 |
| 文献综述二 NF-κB通路研究进展 |
| 1 引言 |
| 2 在炎症性骨病中的作用 |
| 3 在氧化应激反应中的作用 |
| 4 在肿瘤中的作用 |
| 5 在自身免疫中的作用 |
| 6 展望 |
| 7 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（9）瘤体周边滋养血管对乳腺癌的诊断价值及与分子标记物相关性研究（论文提纲范文）
| 论文创新之点 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 超声检查乳腺瘤体周围滋养动脉及超声造影肿物周缘区对鉴别肿物良恶性的应用价值 |
| 1 资料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 分子标记物C-erbB-2、ki-67及VEGF的表达对判断乳腺浸润性导管癌预后的影响 |
| 1 资料及方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 乳腺浸润性导管癌肿块周边滋养动脉与C-erbB-2表达的相关性分析 |
| 1 资料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第四部分 乳腺浸润性导管癌周围滋养动脉与肿瘤直径及Ki-67表达的关系 |
| 1 资料及方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的科研成果目录 |
| 致谢 |
（10）Toll样受体信号通路关键基因与缺血性中风及其中医证候易感性的关联性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 研究背景 |
| 1.1 中风病疾病负担尤其严重 |
| 1.2 中风病遗传学机制研究尚未完全阐明 |
| 1.3 中医证候与基因组学有相似之处,利用分子通路研究中风病遗传学机制更科学 |
| 1.4 基因芯片及其在医学领域的应用 |
| 1.4.1 基因芯片 |
| 1.4.2 基因芯片在医学上的应用 |
| 第二部分 影响缺血性中风遗传机制重要通路及基因筛选 |
| 2.1 利用通过基因组富集法筛选出影响缺血性中风的重要通路Toll样受体信号通路及关键基因 |
| 2.2 分子通路可能是研究缺血性中风中医证候遗传机制的良好结合点之一 |
| 2.3 TLR4、TRAF6对神经系统的作用机制 |
| 2.4 单核苷酸多态性(SNP)的选择 |
| 第三部分 TRAF6、TLR4多态性与缺血性中风及其中医证候易感性的关联分析 |
| 3.1 研究对象与研究方法 |
| 3.1.1 筛选影响缺血性中风遗传机制的重要通路及其关键基因和位点 |
| 3.1.2 研究对象的来源 |
| 3.1.3 纳入及排除标准 |
| 3.1.4 诊断标准 |
| 3.1.5 临床资料的收集 |
| 3.1.6 实验材料 |
| 3.1.7 质量控制 |
| 3.1.8 统计学分析 |
| 3.2 研究结果 |
| 3.2.1 研究对象基本特征 |
| 3.2.2 Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE)检验 |
| 3.2.3 病例组各中医证型基因型分布情况 |
| 3.2.4 Toll样信号通路关键基因单位点多态性与缺血性中风的关联分析 |
| 3.2.5 Toll样信号通路关键基因位点多态性与缺血性中风不同中医证候的关联分析 |
| 3.2.6 TRAF6、TLR4基因位点多态性与缺血性中风患者血脂水平的关联性分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 Toll样信号通路介导缺血性中风后的炎症反应 |
| 3.3.2 基因(TRAF6、TLR4)多态性与缺血性中风的相关性 |
| 3.3.3 基因多态性与缺血性中风中医证的相关性 |
| 3.3.4 基因多态性与缺血性中风患者血脂水平相关性 |
| 3.3.5 本研究的创新性 |
| 3.3.6 本研究的局限性及展望 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
四、肿瘤坏死因子受体分子生物学研究及临床应用（论文参考文献）
- [1]基于网络药理学探究麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的显效成分和作用机制[D]. 朱安娜. 河北大学, 2021(11)
- [2]PD-1和TIM-3在耗竭T细胞介导B系淋巴瘤免疫逃逸中的作用机制及临床应用研究[D]. 陈晓晨. 苏州大学, 2020(06)
- [3]基于“肠道菌群—黏膜屏障”研究“黄芩—黄连”药对治疗T2DM的疗效机制及配伍效应[D]. 张博荀. 成都中医药大学, 2020
- [4]急性髓系白血病化疗疗效分析与耐药机制研究[D]. 陶善东. 南京医科大学, 2020(06)
- [5]尤文肉瘤的差异蛋白质组学研究[D]. 王翀. 新疆医科大学, 2020(07)
- [6]TL1A在胃癌中过表达并通过PI3K/Akt信号通路促进胃癌增殖与迁移[D]. 高亚贤. 中国医科大学, 2019(04)
- [7]Caenorhabditis elegans中肿瘤坏死因子超家族信号途径的同源基因在AD发病机制中的作用[D]. 张东华. 云南大学, 2019(09)
- [8]蒙花苷对破骨细胞的作用及分子机制研究[D]. 王军胜. 苏州大学, 2019(06)
- [9]瘤体周边滋养血管对乳腺癌的诊断价值及与分子标记物相关性研究[D]. 吴国柱. 武汉大学, 2018(06)
- [10]Toll样受体信号通路关键基因与缺血性中风及其中医证候易感性的关联性研究[D]. 吴光亮. 广州中医药大学, 2017(01)