一、胎肝中肝干细胞的免疫组织化学研究（论文文献综述）
汤万波[1]（2021）在《Hlf标记的胚胎新生造血干细胞的功能及命运研究》文中提出造血干细胞是包括髓系细胞和淋系细胞在内的多种成熟血细胞的主要来源。小鼠胚胎发育过程中,造血干细胞主要起源于胚胎期第10.5天（embryonic day,E10.5）的主动脉-性腺-中肾区（aorta-gonad-mesonephros region,AGM）区,此时主动脉内皮经过内皮造血转化过程产生造血细胞。在该过程中,一小群特化的生血内皮细胞的形态逐渐由内皮细胞样的扁平转变为造血细胞样的圆形,并通过出芽的方式集结形成造血簇。簇中包含了造血干细胞前体,它们最终会发育为成熟造血干细胞并迁移至胎肝扩增,随后定植到骨髓。在胚胎造血干细胞发育过程中,由于缺乏特异性表面标志分子,一直无法精确捕获造血干细胞及其相关群体。我们前期研究筛选获得高特异性表面标志,结合单细胞诱导移植体系,首次在单细胞水平高效富集造血干细胞前体,并结合单细胞转录组测序,系统解析了造血干细胞发育全程的单细胞动态分子表达特征。本课题进一步挖掘造血干细胞发育全程的单细胞转录组数据,针对胚胎期早期内皮细胞、造血干细胞前体、胎肝和成体造血干细胞群体的单细胞分子表达特征进行分析,得到造血干细胞特化过程中表达上调的基因集合,从中筛选出从造血干细胞前体到造血干细胞阶段逐渐上调并显着高表达在造血干细胞中的Hlf基因（hepatic leukemia factor,Hlf）。新近研究显示Hlf分子特异性的表达在胎肝及成体造血干细胞中,提示Hlf分子亦可能特异性标记胚胎早期的造血干细胞前体和造血干细胞,为此我们构建了 Hlf-tdTomato荧光报告小鼠和Hlf-CrexER谱系示踪小鼠。我们针对新构建的Hlf-tdTomato荧光报告小鼠进行表达图谱的鉴定,组化染色结果显示:在E10.5 AGM区中共表达RUNX1和CD31的造血相关群体表达Hlf-tdTomato,而CD31+的内皮层细胞基本不表达Hlf-tdTomato。流式结果也表明,E10.5 AGM 区内皮细胞群体（CD31+CD41-CD43-CD45-）不表达 Hlf-tdTomato,造血簇（CD31+Kit+）中有超过40%的细胞表达Hlf-tdTomato;E11的AGM区中有接近40%的CD45-造血干细胞前体和几乎所有的CD45+造血干细胞前体都表达Hlf-tdTomato。我们进一步通过诱导移植实验发现:在E10.5的CD31+CD45+Kit+群体中,仅Hlf-tdTomato+亚群在诱导/移植后3到4周存在髓系和淋系重建,而CD31+CD45-Kit+群体中,Hlf-tdTomato+和 Hlf-tdTomato-亚群在移植后3到4周均出现髓系和淋系重建,表明Hlf表达能特异性富集功能性CD45+造血干细胞前体。此外,E11造血簇细胞（CD3 1+Kit+）进行体外孵育后的产物分析结果显示:只有Hlf+细胞能产生造血干细胞表型样的细胞。以上功能实验表明Hlf-tdTomato表达能进一步有效富集CD45+造血干细胞前体。继而,利用新构建Hlf-CrexER与ROSA26报告小鼠杂交,通过在早期胚胎发育的不同时间点进行诱导,对表达Hlf-CrexER的细胞群体进行谱系示踪,以探究早期胚胎Hlf-CrexER阳性细胞对胎肝各造血干祖细胞群体和成体外周血贡献的动力学变化。使用 Lin-Sca-1+Mac-1lowCD201+（LSM201）、CD45+CD201+CD48-CD150+（ESLAM）和 Lin-Sca-1+Kit+CD48.CD150+（LSKSLAM）的表面标志组合进行胎肝造血干细胞的分析,我们发现E8.5诱导后,胎肝造血干细胞基本未被标记上,而E9.5、E10.5、E11.5和E13.5诱导后,胎肝造血干细胞标记比例呈现逐步上升,尤其E9.5和E10.5诱导后,标记比例均值出现跃升。对诱导后出生的成年小鼠外周血各谱系标记比例的持续检测发现,E9.5诱导后外周血各谱系标记比例均值约2%,显着低于E10.5诱导后（约20%）,表明该时间段随着Hlf表达强度的逐渐上升,可能充分标记了 AGM区的造血干细胞前体及造血干细胞群体。因为AGM区造血干细胞前体及造血干细胞群体起源于内皮细胞,我们进一步通过Tie2-Dre与Hlf-CrexER进行交配得到组成型小鼠,再与ROSA26报告小鼠杂交,即可将Hlf标记更加特异性的限定在早期内皮细胞。通过胎肝造血干细胞检测,我们发现组成型小鼠在胎肝造血干细胞中的标记比例不如诱导型中E13.5中造血干细胞标记比例高,并且通过对出生后小鼠外周血各谱系示踪记录比较,发现组成型小鼠外周血各谱系标记比例也低于诱导型小鼠外周血各谱系的标记比例。总之,本研究通过单细胞转录组分析,筛选到在造血干细胞前体、胎肝造血干细胞和成体造血干细胞中特异性表达的Hlf分子,并构建了 Hlf-tdTomato荧光报告小鼠和Hlf-CrexER谱系示踪小鼠。通过荧光报告小鼠模型我们对胚胎早期造血干细胞前体进行了进一步标记分析,并利用谱系示踪模型揭示了不同发育时间点Hlf分子表达标记细胞的造血命运以及对胎肝造血干细胞贡献的动力学变化。并且构建的小鼠模型可与多种基因型小鼠联合使用,谱系示踪小鼠与Confetti小鼠的联合使用能对造血干细胞的起源异质性进行研究,利用荧光报告小鼠可以探究造血干细胞在骨髓微环境中的定位及其与其他分子间相互作用的机制,这对研究造血干细胞的起源及其应用具有重要的借鉴意义。
陈政[2]（2016）在《人生殖干细胞转分化为成熟肝细胞及其信号转导研究》文中研究表明目的:肝细胞移植是遗传性和终末期肝脏疾病的有效治疗方法。但是,原代人类肝细胞来源匮乏、体外难于长期培养和保持功能等问题限制了其临床广泛应用。当前,胚胎干细胞（ES cells）、诱导多能干细胞（iPS cells）和间充质干细胞（MSCs）都能够诱导生成肝细胞。但是,伴随的一些问题限制了它们的临床实际应用,如:伦理学争议、致瘤性、病毒转入的安全性等。因此,寻找更理想、切实可用的肝细胞来源成为当前一个研究热点和迫切需要解决的科学问题。精原干细胞（SSCs）是睾丸内的一种成体干细胞,一旦离开睾丸生精微环境,精原干细胞就能够获得多能性,去分化生成类胚胎干细胞并相继分化为三胚层组织的各种细胞。小鼠精原干细胞在体外能够诱导转分化为成熟肝细胞,显示出其良好的潜在应用前景。然而,人精原干细胞尚没有相关的研究报道。由于人类和小鼠的精原干细胞具有明显的种系差异、细胞类型与生化表型,因此,本论文研究人精原干细胞在体外和体内诱导生成有功能的成熟肝细胞,为肝细胞移植治疗肝脏疾病提供新的细胞来源,并探讨人精原干细胞转分化为成熟肝细胞的信号转导机制。方法:首先采用两步酶消化、差速贴壁与免疫磁珠分选法（MACS）分离获得高纯度和活力的人精原干细胞。然后用添加生长因子和激素的条件培养基模拟体内胎肝发育的微环境体外诱导精原干细胞的转分化。在不同的转分化节点通过RT-PCR、免疫细胞化学和流式细胞术等方法进行其表型鉴定;然后,在功能水平上检测诱导生成的肝细胞是否具有与原代肝细胞相似的功能,包括白蛋白分泌、尿素合成、吲哚菁绿吞噬及排泄。并且,我们探讨β-CATENIN信号分子及相关转录因子是否参与了人精原干细胞转分化为成熟肝细胞。在体外实验结果基础上,我们再将诱导分化转向体内。用四氯化碳（CCl4）构建小鼠肝损伤模型,提供向肝转分化内环境;然后,用肝脏间质细胞提供向肝转分化的微环境（Niche）,人精原干细胞与小鼠肝脏间质细胞通过肾包膜移植,对转分化的细胞进行生化表型鉴定,并评估人精原干细胞移植对受体小鼠重要组织器官的安全性。结果:体外诱导转分化:我们运用MACS分离的细胞表达人类精原干细胞多种特异基因和蛋白标记,如:UCHL1、PLZF、GPR125和MAGEA4等,表明这些细胞在生化表型上为人精原干细胞。第一阶段经过约10天的条件培养基诱导培养,人精原干细胞逐渐失去原有精原干细胞的基因与蛋白的表达,在形态学上变为卵圆形,类似人肝干细胞形态;在转录和翻译水平检测到肝干细胞特异的基因和蛋白表达,包括CK7、CK19、CK8和CK18;流式细胞术发现80%的细胞共表达CK18和CK19;未检测到ES细胞标记物,如TRA1-60、SSEA3和TRA1-81的表达。结果表明,人精原干细胞未去分化生成类胚胎肝细胞,而是直接转分化为肝干细胞。我们进一步用条件培养基诱导肝干细胞向肝细胞分化。分化的细胞持续表达肝细胞特异性基因和蛋白标记,如ALB、AFP、CK18等,逐渐失去胆管细胞标记的表达,如CK19和CK7,显示肝干细胞特异分化为肝细胞,而不是胆上皮细胞。然后,运用HGF、OSM和Dex诱导肝细胞成熟,这些细胞表达CYP1A2、ALB和AAT等,同时具有原代肝细胞相似的功能,包括:白蛋白分泌、尿素合成和ICG吞噬及排泄。上述结果提示,人精原干细胞能在体外转分化为具有形态特征、生化表型和有功能的成熟肝细胞。在分子机制方面,我们发现,β-CATENIN/HNF4A/FOXA1/GATA4信号通路参与了人精原干细胞转分化为成熟肝细胞过程。体内诱导转分化:CCl4能有效地建立小鼠肝损伤模型。RT-PCR显示,分离的小鼠枯否细胞表达Desmin、Emr、v-wf和Acta2;免疫细胞化学检测肝星状细胞表达VIMENTIN和窦内皮细胞表达V-WF;以上结果表明,分离的细胞为小鼠肝脏间质细胞。GFP标记的人类精原干细胞系与小鼠肝脏间质细胞移植到肾包膜4周后,移植细胞生长良好,检测到自发绿色荧光的细胞同时表达肝细胞特异标记蛋白,包括:CK18、ALB、CYP1A2和AAT,同时,未检测到精原干细胞标记物GPR125和VASA的表达。Western blot也检测到ALB、AAT、CYP1A2、AFP、PCNA等蛋白的表达,未检测到GPR125蛋白表达;并且,精原干细胞的移植对受体小鼠重要组织器官,包括心、肾、脑、脾等,未检出明显病变。以上结果显示,人精原干细胞在体内转分化为肝细胞,并具有良好的安全性,具有广泛临床应用前景。结论:我们首次将人精原干细胞体外和体内诱导转分化为生化表型与有功能的成熟肝细胞,为肝细胞移植治疗肝脏疾病和药物筛选提供新的细胞来源;同时,我们揭示β-CATENIN/HNF4A/FOXA1/GATA4通路参与了转分化过程,为肝脏发育和精原干细胞的重编程提供新的分子机制。
徐敏晖[3]（2014）在《炎症环境下胆管反应与肝细胞癌术后预后关系的研究》文中指出第一部分：癌旁胆管反应与临床及病理学关系的研究目的：评估癌旁胆管反应与临床病理资料间的关系。方法：收集2001年1月到2003年6月期间第二军医大学附属东方肝胆外科医院原发性肝细胞癌根治性手术后病理标本106例。运用免疫组织化学方法检测癌旁胆管反应情况。整理肝细胞癌患者的临床及随访资料，分析癌旁胆管反应与肝细胞癌患者临床病理特征的关系。结果：癌旁胆管反应的程度与肿瘤患者血清AFP水平（p=0.01）、血清ALT （p=0.017）、血清ALP （p=0.007）、血清HBsAg （+）（p=4.9E-4）、肿瘤包膜（p=0.027）、肿瘤个数（p=0.004）、镜下血管侵犯（p=0.031）、早期复发（p=0.010）、BCLC分期（p=0.003）和TNM分期（p=0.002）显着相关。结论：癌旁组织中胆管反应的程度与肝细胞癌患者临床病理中肿瘤强侵袭性指标显着相关，癌旁胆管反应高的肿瘤表现出更强的侵袭性。第二部分：癌旁胆管反应与肝癌根治性切除术后预后关系的研究目的：分析肝细胞癌根治性切除术后预后的影响因素。方法：回顾性分析2001年1月到2003年6月期间第二军医大学附属东方肝胆外科医院106例肝细胞癌根治性手术患者临床资料。采用Log-rank法检验进行统计学比较，寿命表法进行生存率分析，运用Cox比例风险模型进行多因素分析。结果：全组患者1、3、5及7年总体生存率分别为71.7%、36.8%、32.1%及20.8%。多因素分析发现，肿瘤大小（﹥5vs≤5cm）、胆管反应（<2vs≥2）和BCLC分期（0/Avs B/C）是影响总生存的独立预后因素（p值分别为1.3E-04、9.3E-06及2.3E-04）。全组患者1、3、5及7年无瘤生存率分别为54.7%、24.5%、19.8%及8.5%。多因素分析发现，肿瘤大小（﹥5/≤5cm）、胆管反应（<2vs≥2）、TNM分期（I vs II/III）和炎症坏死分级（<9vs≥9）是影响无瘤生存的独立预后因素（p值分别为0.031、0.008、8.8E-06及0.023）。结论：癌旁胆管反应程度是影响肝癌患者术后总生存、无瘤生存的独立预后因素。第三部分：癌旁胆管反应与肝脏炎症坏死及肝硬化关系的研究目的：探讨癌旁胆管反应与肝脏炎症坏死及肝硬化的相关性。方法：收集2001年1月到2003年6月期间第二军医大学附属东方肝胆外科医院原发性肝细胞癌根治性手术后病理标本106例。运用免疫组织化学方法检测癌旁非肿瘤肝脏组织中胆管反应的水平，HE染色评价癌旁肝脏组织中炎症坏死及肝硬化情况，并对二者进行相关性分析。结果：癌旁胆管反应程度与癌旁肝脏炎症坏死及肝硬化情况有相关性。癌旁组织中高水平胆管反应的肝癌患者其癌旁肝脏炎症坏死及肝硬化相对较重（r=0.563, p=3.4E-10；r=0.435, p=3.1E-06）。结论：癌旁胆管反应与肝脏炎症坏死及肝硬化程度呈正相关，肝脏的炎症环境可能促进了胆管反应的升高。第四部分：癌旁胆管反应与肝癌细胞的EpCAM表达关系的研究目的：探讨癌旁胆管反应与肝癌细胞的EpCAM表达的相关性。方法：收集2001年1月到2003年6月期间第二军医大学附属东方肝胆外科医院原发性肝细胞癌根治手术后病理标本106例。运用免疫组织化学方法检测癌旁胆管反应的水平和肝癌细胞的EpCAM表达情况，并对二者进行相关性分析。结果：癌旁胆管反应与肝癌细胞的EpCAM的表达有密切相关性。癌旁组织中高水平胆管反应的肝癌患者其癌细胞的EpCAM表达也比较高（p=0.016）。结论：癌旁胆管反应与肝癌细胞的EpCAM表达呈正相关，癌旁胆管反应可能与肝脏祖细胞的激活、增殖有关。
王亚萍[4]（2013）在《鼠胎肝干细胞的体外分离培养及体内移植的实验性研究》文中指出第一章一种改进的大鼠胎肝干细胞分离纯化方法背景干细胞是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞,存在于许多组织中；根据其发育阶段不同分为胚胎干细胞和成体干细胞。肝干细胞（hepatic stem cell,HSC）是成体干细胞的一种,可分化为成熟肝细胞、胆管上皮细胞和胰腺上皮细胞。跟据其起源的不同,可分为肝源性肝干细胞和非肝源性肝干细胞,前者主要包括肝卵圆细胞、小肝细胞,后者主要起源于骨髓干细胞和胚胎干细胞。目前研究肝干细胞已成为世界范围的热点,由于它具有来源广泛、增殖能力强、移植细胞体积小等传统肝细胞无可比拟的优点,可以预测它将替代肝脏移植和肝细胞移植成为治疗器官衰竭的一种重要细胞来源。正是由于肝干细胞治疗各种原因引起的肝病具有无可比拟的优势,因此探讨如何获得高纯度的肝干细胞及其特异性的标志物有重要的现实意义。正常情况下,体内肝干细胞多处于静息期,数量极少,分离时常先经药物或手术造成肝脏损伤,肝脏灌流或联合细胞分离液分离来获得肝干细胞,操作复杂且成本较高。相比较传统的肝干细胞分离培养方法而言,本实验室首次采用先机械剪碎酶消化法分离获得肝干细胞,简单的离心分离法和胰蛋白酶选择性消化法相结合,从孕15天大鼠胎肝组织中成功分离出肝干细胞。此方法在原代即可获得形态均一、增殖速度快、性状稳定的LSCs,且具有操作简单、快捷、实用、对细胞损伤小等优点,为其作为组织工程种子细胞提供了实验基础。目的改进大鼠胎肝干细胞的分离纯化方法,提高肝脏干细胞分离的纯度和活力。方法1、购清洁级别近交系孕15天SD大鼠,利用械剪碎酶消化法分离获得肝干细胞,后经简单的离心分离法以及胰蛋白酶选择性消化法进行进一步的纯化,得到较为纯化的肝干细胞。加入含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养,显微镜下观察细胞贴壁情况及形态学变化。2、将卵圆细胞接种于预先用0.2%明胶处理的盖玻片上置于24孔培养板中,37℃,5%CO2孵箱培养24小时,至细胞长成单层后行免疫荧光化学检测。细胞消化传代,对P10代细胞进行免疫组织化学检测。分别检测P1和P10代肝干细胞表面标志物CD34、C-Kit、0V6、CK19的表达情况结果分离的大鼠胎肝干细胞接种培养瓶24h后开始贴壁,5d后细胞体积增大,呈梭形或多边形。经1-2次差异性消化传代后,细胞呈集落样生长,边缘清晰且折光率强。免疫细胞化学检测示：P1代大鼠胎肝干细胞C-Kit、甲胎蛋白（AFP）抗原、OV6、细胞角蛋白（CK）19呈阳性表达,不表达ALB。P10代肝干细胞C-Kit、 CK19、OV-6及CD34呈阳性表达。结论此方法在原代即可获得形态均一、增殖速度快、性状稳定的LSCs,且具有操作简单、快捷、实用、对细胞损伤小等优点,为深入研究肝干细胞生物学特性和进行体内移植实验提供了物质基础。第二章大鼠肝损伤后成熟肝细胞和卵圆细胞在肝再生中的作用背景长期以来,成熟肝细胞和卵圆细胞在损伤肝的再生中如何发挥作用一直是肝干细胞研究领域的核心问题,对两者在损伤肝再生中的作用也有着不同的观点。一方面,有报道认为部分肝切除（partial hepatectomy, PH）后大鼠肝可在二周内再生并恢复至原来大小,有人连续进行了12次PH后发现仍能完成肝再生：这种肝再生多被认为是单独由成熟肝细胞分裂增殖完成的。另一方面,在损伤肝再生中发挥了作用的、起源于门管区小胆管和Hering’s管的卵圆细胞（OVC）被认为可能是肝内源性的具有肝胆双向分化潜能的成体肝干细胞。目前,为研究成体肝脏中肝干细胞的增殖、分化,研究者们采用各种不同的方法抑制肝细胞增殖,并采用药物（如CCl4）或肝部分切除术等诱导肝脏急性损伤,以激活肝脏干细胞。从而研究肝损伤后成熟肝细胞和卵圆细胞与肝脏再生的关系。本研究鉴于RS是公认的能长期抑制成熟肝细胞分裂增生的肝化学毒剂,而PH又能给予强烈的肝再生需求,我们建立了肝脏切除及其联合应用倒千里光碱导致肝脏急性损伤的大鼠模型,通过对Rs/PH和1/3PH后肝再生过程中成熟肝细胞和卵圆细胞的比较病理学研究,并依据研究中观察到的一系列现象,探讨关于肝损伤后成熟肝细胞和卵圆细胞与肝脏再生的关系。目的联合应用倒千里光碱（RS）和肝脏1/3切除术（1/3PH）建立大鼠肝损伤模型。观察大鼠肝损伤后肝细胞和卵圆细胞增殖情况,探讨关于肝损伤后成熟肝细胞和卵圆细胞与肝脏再生的关系。方法1、30只大鼠随机分为2组,每组15只。倒千里光碱／肝脏1/3切除组（RS/PH组）：取150g左右SD大鼠,腹腔注射倒千里光碱溶液30mg/kg,共注射2次,每次间隔2周。肝脏1/3切除组（1/3PH组）：用生理盐水代替倒千里光碱,腹腔注射30mg/kg,共注射2次,每次间隔2周,第2次腹腔注射4周后,两组大鼠行肝脏1/3切除术。2、分别于术后第3、7、14、20天处死大鼠,10%甲醛固定,石蜡包埋,常规切片,采用苏木精-伊红染色,BrdU注射及BrdU免疫荧光化学检测,CK19、 C-Kit免疫组织化学检测观察两组大鼠术后不同时间点肝脏病理形态变化、细胞增殖情况和CK19、C-kit免疫组化检测情况结果RS/PH组大鼠术后20d体质量仍低于术前,肝脏增大明显小于1/3PH组,HE染色示胞体肿大、胞浆疏松、肝细胞广泛空泡变性,汇管区小胆管周围和肝小叶内可见成簇或散在分布的卵圆细胞增生；1/3PH组术后20d体质量恢复接近术前,肝脏损害较RS/PH组轻,Brdu免疫荧光示成熟肝细胞大量增生,术后14d见肝OVC增生,多出现在肝细胞索中,形态和免疫组化标记与RS/PH组OVC一致。结论成功构建了倒千里光碱联合肝脏1/3切除术的急性肝损伤大鼠模型,实验可见肝脏中毒及中毒后肝干细胞和成熟肝细胞增殖的现象,证实肝细胞更新与损伤后再生是肝流域中肝内外源肝干细胞及成熟肝细胞共同作用的结果。第三章GFP转基因小鼠胎肝干细胞体外分离培养及脾内移植的初步研究背景各种原因引起的急、慢性肝功能衰竭的发病率和死亡率很高,已成为威胁肝病患者生命的主要原因。目前,原位肝移植（OLT）已被证明是治疗各种肝功能失代偿期、肝功能衰竭期最有效的治疗方法,但因为肝源缺乏、费用昂贵、以及移植后并发症多等限制了OLT的广泛应用。近年来,新的干预性治疗不断出现,肝细胞移植已开始应用于一些动物模型和人类临床实验,但由于肝细胞来源不充足,人们仍然希望能够获得大量更安全的细胞来源。肝干细胞的移植为此开拓了新的途径,肝干细胞是一种多能干细胞,它具有自我更新、高度增殖及向肝细胞和胆管细胞分化的能力,在体内可以分化为肝细胞和胆管细胞,参与肝脏的发生发育及损伤后修复等生理病理过程。若能将其大量扩增后再进行移植,就可能从量上解决细胞来源短缺的问题。肝干细胞移植相对于肝细胞具有更大的优势：（1）肝干细胞具有更大的增殖能力,植入受体后增殖能力强,较少的移植细胞数就能达到较好的增殖效果；（2）移植肝内后能分化为肝细胞和胆管上皮细胞,对肝组织结构重建及功能恢复更为有利,更为重要的是,肝细胞增殖需要受肝存在选择压力,而肝干细胞在正常肝脏环境中就能大量增殖,为受体肝脏的再生及肝功能恢复提供机会；（3）肝干细胞分化不成熟,免疫原性更弱,Kubota等研究表明肝母细胞中不表达经典的MHC-1分子,在肝干细胞同种异体移植时能引起免疫逃逸。移植失败现象较肝细胞移植少,对受体影响小；（4）肝干细胞直径（10-12μm）较肝细胞（20-35μm）小,更容易通过肝窦到达肝脏各叶,使其定植及扩增效率增加。而肝细胞移植浓度较高时部分细胞则不能通过汇管区小血管。因此肝干细胞可以作为生物型人工肝和肝细胞移植最理想的细胞来源,从而在肝病基因治疗中发挥重要作用,并有望成为取代严重肝功能衰竭患者肝移植的替代疗法,具有很大的研究前景。本研究对L-CL2MDP/RS/PH处理的大鼠进行GFP转基因小鼠胎肝干细胞移植,结果表明本实验室建立的肝干细胞系能够成功植入L-CL2MDP/RS/PH大鼠肝脏中,植入的细胞能够在受体大鼠肝脏中存活,并且出现不同程度的增殖。而在未作预处理的正常大鼠肝脏中未见GFP+肝干细胞。虽然我们并不能明确移植的胎肝干细胞在肝内增殖程度,但从肝脏中GFP阳性的细胞比例比较,L-CL2MDP/RS/PH实验组比正常对照组具有明显的优势。说明L-CL2MDP/RS/PH模型能够提供一个相对较好的肝干细胞植入的环境。这为研究适用于细胞移植的实验动物模型提供了一些有价值的信息。今后我们将扩展这一研究成果,努力与临床实践相结合,并回答移植研究中尚待解决的排斥免疫学机制问题。目的1、从荧光转基因小鼠胎肝中获得稳定表达GFP蛋白的肝脏干细胞2、联合应用L-CL2MDP/RS/PH,建立适合肝脏干细胞移植的大鼠动物模型,进一步提高肝干细胞的移植效率。方法：1、孕15d绿色荧光蛋白（GFP）转基因小鼠,体重40-60g,SPF级150g左右SD雄性大鼠30只,GFP转基因小鼠胎肝干细胞的分离、体外培养与传代及免疫组化鉴定2、建立L-CL2MDP/RS/PH动物模型,将分离的胎肝干细胞通过脾脏注射移植到大鼠肝脏,检测细胞移植后GFP蛋白的表达,以及免疫组化检测C-Kit、 AFP明确移植的肝干细胞在肝脏内是否增殖。结果1、倒置显微镜下见分离的肝干细胞大小均匀,呈鹅卵石形态。接种培养瓶24h细胞开始贴壁并伸展；培养5d后细胞体积增大,呈梭形或多角形,荧光显微镜可观察到细胞发出绿色荧光。传代3次后,细胞状态良好,在荧光显微镜下可见炫目的绿色荧光,免疫组化检测P3代细胞CD34、AFP呈阳性表达,。2. HSCs经脾脏移植后3d在荧光显微镜下观察两组大鼠的肝脏冰冻切片,发现L-CL2MDP/RS/PH组大鼠肝内散在分布GFP阳性细胞,细胞大小为正常肝细胞的1/3-1/2,与周围细胞相比,呈现高亮度的绿色荧光；而对照组大鼠肝内未见GFP阳性细胞。移植后30d移植大鼠肝脏内仍可见GFP阳性表达,阳性细胞成团聚集、局灶状分布,细胞形态与肝细胞相似。结论1、从GFP转基因小鼠肝脏中成功分离出胎肝干细胞,分离的细胞原代形态均一、增殖速度快、传代3次后均可以稳定而强烈表达绿色荧光,为进一步研究提供了良好的示踪工具。2、成功建立了L-CL2MDP/RS/PH的大鼠模型,植入的细胞能够在受体大鼠肝脏中存活,并且出现不同程度的增殖。说明L-CL2MDP/RS/PH模型能够提供一个相对较好的肝干细胞植入的环境。这为研究适用于细胞移植的实验动物模型提供了一些有价值的信息。小结1、改进大鼠胎肝干细胞的分离纯化方法,提高肝脏干细胞分离的纯度和活力。本研究选择大鼠胚胎肝脏作为细胞来源,采用机械剪碎酶消化法分离获得肝干细胞,后经简单的离心分离法以及胰蛋白酶选择性消化法进一步纯化,得到较纯净的大鼠胎肝干细胞。利用免疫细胞化学方法分别检测P1和P10代肝干细胞表面标志物,证实本研究分离培养的细胞具有干细胞特性,是肝干细胞。2、观察倒千里光碱联合肝脏部分切除术（RS/PH）对肝损伤后再生修复的影响。本实验成功构建了倒千里光碱联合肝脏部分切除术导致肝脏急性损伤的大鼠模型,实验可见肝脏中毒及中毒后肝干细胞增殖的现象,术后H-E染色发现RS/PH组汇管区小胆管周围和肝小叶内可见成簇或散在分布的卵圆细胞增生,CK19、c-kit阳性细胞出现在汇管区,特别是小胆管周围,形态与周围胆管细胞相似。而PH组未见以上表现。证实该模型可抑制成熟肝细胞增殖,同时通过刺激肝卵圆干细胞增殖以实现修复。这为研究适用于肝干细胞移植的动物实验模型提供一些有价值的信息。3、肝干细胞移植的成功率低仍是目前国内外研究中亟待解决的一个问题。为了进一步提高肝干细胞在肝脏中的存活,本实验室完成脂质体包裹的二氯亚甲基二磷酸盐（L-CL2MDP）的制备,通过腹腔注射L-CL2MDP,特异性的清除肝脏及脾脏中的巨噬细胞,并进一步联合应用我们已经构建的倒千里光碱/部分肝切的大鼠肝损伤模型,建立一种新的肝干细胞移植模型。目前,我们从本实验室已有荧光转基因小鼠肝脏分离肝脏干细胞,获得稳定表达GFP的细胞株,将GFP+-LSC细胞通过脾脏注射移植给L-CL2MDP/RS/PH处理的大鼠。观察其在肝内的增殖情况,并对对照组和处理组加以检测及比较,以确定此模型是否能够提高肝干细胞的移植效率。
金成豪,米满吉和,丁伟荣,居石克夫[5]（2010）在《小鼠胎肝中胎肝激酶-1阳性细胞具有血管祖细胞的功能特性》文中认为目的探讨胎肝中胎肝激酶-1（fetal liver kinase 1,FLK-1）阳性细胞的特征和功能。方法免疫磁珠分离胎肝FLK-1阳性细胞,流式细胞术（又称荧光活化细胞分类计数,fluorescenceactivated cell sorter,FACS）检测胎肝FLK-1阳性细胞。体外生长因子诱导培养、测定FLK-1阳性细胞的分化、增殖活性。FLK-1阳性细胞植入75%肝切除的小鼠肝脏模型中,借助荧光解剖显微镜及免疫组织化学方法观察血管形成及细胞分化的情况。结果 FLK-1阳性细胞经生长因子诱导后,可表达典型的血管内皮细胞、平滑肌细胞的标志。75%肝切除的小鼠肝脏模型中,植入的FLK-1阳性细胞在肝脏的纤维囊中分化成血管细胞并形成血管。结论胎鼠肝脏FLK-1阳性细胞具有血管祖细胞的功能,具有潜在的临床应用价值。
刘芳遐[6]（2010）在《人肝源性干细胞在Fah-/-Rag2-/-小鼠中生物学行为的研究》文中认为肝移植是目前终末期肝脏疾病唯一有效的治疗手段,但供肝来源的缺乏使其临床应用受到很大的限制。近二十年来,作为原位肝移植的替代方案,临床上一直致力于开展肝细胞移植技术的研究,并取得了一定的疗效。然而,可用于分离肝细胞的高质量供体肝脏在数量上无法得到保证,严重制约着肝细胞移植的临床应用。干细胞生物学的研究已经表明,干细胞具有呈指数分裂的增殖能力,也具有重新形成干细胞巢,并分化产生特定功能细胞,以重新建立组织的基本生物学特性。特别令人鼓舞的是,在体外实验中已有可能使胚胎干细胞和来源于胎肝组织的肝干细胞分化为肝前体细胞、成熟的肝细胞及胆管细胞,并且在活体动物的移植实验中也观察到了外源的干细胞对损伤肝脏的再殖（repopulation）,能够使损伤肝脏在结构上和功能上得到有效的恢复。这些进展的取得,充分显示了利用干细胞对人类肝脏疾病进行临床治疗的可能性。本实验室以4.5-6周的流产人胚胎作为分离肝干细胞的材料,通过克隆化培养建立了人胎肝来源的干细胞系（hFLSC）。hFLSC具有以下的特性：①具有强大的增殖能力；②表达多种类型的分子标记：不仅表达肝干细胞相关的分子标志（如AFP、ALB、CK8、CK18、CK19、GGT、DPPⅣ、c-Met、Thy-1和c-kit等）,还表达间质细胞的部分分子标志（如CD44、CD29、SDF-1等）,但不表达造血干细胞标志（如CD44、CD29、SDF-1等）；③具有多潜能性：在体外诱导实验中,能分化为肝细胞、胆管细胞、脂肪细胞、成骨细胞；④可以参与小鼠受损肝脏的再生：在四氯化碳急性损伤的重度联合免疫缺陷小鼠体内,检测到标记有绿色荧光蛋白基因的hFLSC细胞。然而,由于四氯化碳诱导的急性肝损伤模型本身的缺陷,不能对hFLSC移植后在小鼠体内的植入、归巢、再殖及其功能进行充分的评价。延胡索酰乙酰乙酸水解酶（fuarylacetoacetate hydrolase, FAH）基因剔除小鼠模型是评价外源性干细胞再殖损伤肝脏的理想动物模型,FAH基因剔除小鼠在细胞移植、再殖肝脏研究方面得到了广泛的应用。该小鼠存在广泛而持续的肝损伤,所造成的肝脏微环境特别适合于移植细胞的增殖。本课题在已建立的hFLSC细胞系基础上,选择FAH基因剔除小鼠模型作为评价hFLSC再殖损伤肝脏的基本动物模型,进一步探索hFLSC在小鼠体内的生物学特性以及其作为肝细胞移植细胞来源的可能性,为人胎肝来源的肝原始细胞的基础研究及临床应用建立基础。本课题分为两个部分：在第一部分实验中,通过对Fah-／-小鼠进行同品系野生型小鼠肝细胞的移植,观察Fah-／-小鼠肝再生环境促进移植肝细胞增殖的作用,为下一步进行hFLSC移植奠定基础。同时,虽然已知Fah-/-小鼠肝细胞自身的损伤是导致外源细胞植入和增殖的主要因素,然而对其病理学变化尤其采用电镜的方法分析肝细胞损伤的特点目前尚未见报道。本研究取Fah-／-小鼠停药后不同时间点的肝脏进行了HE染色和电镜检测,对Fah-/-小鼠肝脏损伤后的病理学变化进行了初步观察。在第二部分实验中,为了获得免疫缺陷的FAH基因剔除小鼠品系用于hFLSC移植,我们应用Fah-／-小鼠与Rag2-/-免疫缺陷小鼠进行杂交,建立了Fah-／-Rag2-／-小鼠品系。流式细胞仪检测表明Fah-/-Rag2-/-小鼠T细胞和B细胞功能缺失,可用于hFLSC的移植。将体外培养hFLSC细胞经脾脏注射移植Fah-／-Rag2-／-小鼠,取不同时间点的小鼠肝脏,通过免疫组织化学的方法检测hFLSC的植入、归巢及再殖效率,评价hFLSC肝向分化的能力。第一部分的研究表明,撤除NTBC的Fah-／-小鼠表现为毛刺、弓背、体重明显下降,撤药6-7周后小鼠死亡；而正常喂养NTBC的Fah-/-小鼠全部健康存活,体重稳定增长,并且具有正常的繁殖能力。我们成功的实现了野生型小鼠肝细胞在撤药的Fah-／-小鼠肝脏中的再殖。FAH免疫组织化学染色表明,肝细胞移植1周后即可在Fah-/-小鼠肝脏内检测到表达FAH蛋白的野生型肝细胞。随着时间的延长,移植肝细胞的再殖程度逐渐增加,3周时肝脏再殖22±6%,4周时肝脏再殖38±11%,6周时肝脏再殖67±8%,8周时肝脏再殖78±17%。8周时移植的肝细胞几乎完全重建了Fah-／-小鼠的肝脏,再殖的肝细胞进入Fah-/-小鼠肝脏结构,但并不破坏肝脏的小叶结构,嵌合体肝脏的肝板结构和肝小叶结构仍然正常,且不形成病理性的结节增生。HE染色和电镜检测进一步证明Fah-／-小鼠自体肝细胞发生进行性、不可逆转的损伤是促进移植肝细胞增殖的内在机制。第二部分的研究表明,首先,我们成功建立了Fah-／-Rag2-/-小鼠品系：以Fah-/-小鼠为参照,以CD3、CD19为标志物,流式细胞仪检测Fah-／-Rag2-/-小鼠骨髓细胞中T细胞（CD3+）、B细胞（CD19+）的数量变化,结果表明Fah-／-Rag2-／-小鼠T细胞和B细胞功能缺失。其次,hFLSC移植Fah-／-Rag2-／-小鼠后,在1、3、5、6、8周,应用Fah免疫组织化学染色都能检测到hFLSC存在,因为FAH酶的表达是检测再殖细胞（Fah+/+）的一个理想标志。我们进一步通过肝细胞功能蛋白——白蛋白免疫组织化学染色的方法,初步评价了hFLSC在Fah-/-Rag2-/-小鼠肝脏中的肝向分化能力。结果表明部分小鼠肝脏标本白蛋白染色为阳性。初步的实验结果提示：移植的hFLSC能够植入到Fah-／-Rag2-/-小鼠受损肝脏中,但其肝脏再殖的效率较低,小鼠的肝脏功能不能恢复正常。本研究的实验结果表明：Fah-／-小鼠是研究肝细胞移植的理想模型,Fah-／-小鼠自体肝细胞发生进行性、不可逆转的损伤是促进移植肝细胞增殖的内在机制；来源于4.5-6周的流产人胚胎的肝原始细胞可能是肝细胞移植的候选细胞之一,但其肝脏再殖效率可能与其成熟程度有密切的关系,临床应用前进行肝向诱导分化可能是必要的程序。
尤楠[7]（2010）在《HNF4α在胎肝干细胞定向分化修复肝组织损伤中作用机理的研究》文中提出目的肝组织损伤是各型肝脏疾病的共同病理基础,严重的肝组织损伤将引起肝功能衰竭;干细胞治疗修复肝组织损伤是目前国内外医学界研究的一个热点,但由于存在体外富集纯化困难、定向分化机制不明等问题而使其应用受到限制。胎肝细胞中富含的具有定向分化功能的干细胞是干细胞治疗研究中的重要细胞来源。本研究拟探讨建立体外扩增大鼠胚胎肝干细胞并抑制其分化的培养条件及方法,并在此基础上,将胎肝干细胞通过门静脉植入肝损伤大鼠体内,观察肝脏修复情况,检测治疗前后HNF4α表达变化,探讨HNF4α在胎肝干细胞促进肝组织损伤修复中的作用。本研究内容共分为两部分:1.体外琼脂克隆培养对胎肝干细胞分化的影响;2.HNF4α在胎肝干细胞促肝组织损伤修复中的作用。探讨这一重要调节过程中分子机理将为临床应用胎肝干细胞移植治疗肝脏疾病奠定重要的基础。方法1.无菌条件下利用Ⅳ型胶原酶结合机械消化法制备14d胎龄大鼠胎肝干细胞悬液。将原代分离得到的大鼠胎肝干细胞分成两组,其中一组胚胎肝干细胞接种至Ⅰ型胶原包被的培养板中,常规贴壁培养。另一组细胞则接种至无血清软琼脂培养基中进行悬浮培养;悬浮培养基分为上下两层,底层为含HGF的1.2%琼脂,顶层为无血清的0.6%琼脂,将胎肝干细胞接种至顶层培养基中培养。倒置显微镜下观察两组细胞的生长。培养2周后收集两组细胞,电镜观察两组细胞超微结构的差异,流式细胞仪检测其CD90.1+、CD49F+等干细胞标志物表达特征,碱性磷酸酶染色检测其分化状态的差异,实时定量PCR检测两组细胞甲胎蛋白（AFP）、白蛋白（ALB）的表达差异。2.为研究HNF4α在胎肝干细胞促肝组织损伤修复中的作用,我们采用四氯化碳制作SD大鼠急性化学性肝损伤模型,造模成功后将肝损伤大鼠随机分为移植组（20只）和对照组（20只）,移植组将胎肝干细胞经门静脉移植至大鼠肝脏,对照组注射等容剂量的生理盐水。分别于注射前6h,注射后1,3,5周检测大鼠血清谷氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）的表达水平;取病理组织切片HE染色,观察肝组织修复情况;取肝组织切片采用免疫组化及提取部分肝组织蛋白用Western blot方法检测肝脏治疗前后HNF4α表达情况。结果1.琼脂克隆培养发现部分胎肝干细胞未能有效增殖并形成克隆的细胞,这部分细胞不能在琼脂培养基中存活,随后发生凋亡崩解。剩余的细胞在2天后开始出现小的由3-5个细胞组成的细胞球,随培养时间的延长,干细胞球不断扩大,球内细胞折光性好,连接紧密,未出现分化表现,从形态上判定为干细胞集落。原代细胞接种后贴壁速度、分裂增生较慢,24 h后相差显微镜下可见细胞贴壁生长,48h后观察到分裂。1周后贴壁细胞体积逐渐增大铺展呈上皮样,形成集落。生长至90%左右时传代后增长速度加快,表现出一些分化的特征。2.电镜下观察,琼脂克隆培养胎肝干细胞直径约7μm13μm,表面可见少量短小的微绒毛状突起,整个细胞大部分被卵圆形胞核所占据,细胞质少,核质比例大,内质网、线粒体、核糖体等细胞器不发达,表现为原始幼稚未分化细胞特征,即所谓的肝干细胞。贴壁培养胎肝干细胞直径明显大于琼脂克隆培养,约2040μm,细胞核浆比例小,细胞质内可见大量内质网、高尔基体、核糖体等发达细胞器,显示出明显的分化特征,与成熟肝细胞相似。通过流式分析发现,悬浮克隆培养的胎肝干细胞球高表达CD90.1、CD49F,明显高于贴壁培养培养的胎肝干细胞。碱性磷酸酶染色,观察细胞表面ALP的表达,结果发现悬浮培养组染色为强阳性,贴壁培养为弱阳性。实时定量PCR检测结果则表明,随着培养时间的增加,贴壁培养组的胎肝干细胞AFP表达明显下降,ALB的表达呈明显上升的趋势（P<0.01）。而悬浮培养组的胎肝干细胞AFP和ALB的表达在培养前后未见明显变化（P>0.05）。3.四氯化碳诱导肝损伤模型后,各组SD大鼠根据肝病理组织显示不同程度的损伤,经胎肝干细胞移植处理后,对照组大鼠肝功能改善缓慢,ALT,AST明显高于移植组,移植组大鼠损伤的肝组织逐渐修复,肝功能恢复正常。第5周移植组大鼠术后存活率显着高于对照组。肝组织损伤后,HNF4α在肝组织的表达明显升高;随着肝组织的逐渐修复,HNF4α表达逐渐下降。Western blot及免疫组化检测亦证实此结果。结论琼脂克隆培养的胎肝干细胞较有血清贴壁培养分化程度低,在琼脂克隆培养条件下能增殖形成具有显着干细胞特征的克隆球。HNF4α在肝脏损伤初期起保护作用。可能系通过促进胎肝干细胞向损坏的肝小叶迁移,定向分化成正常肝细胞并适度增殖,从而替代损伤的肝实质,提高肝损伤后的恢复能力。
徐丽萍,方芳,许贺标,马宁芳[8]（2010）在《E-选择素表达与小鼠胎肝发育及造血功能》文中研究说明背景:E-选择素作为一种细胞黏附分子在细胞间选择性识别黏附、调节白细胞归巢及渗出和肿瘤细胞转移等方面的作用已有研究报道,但胚肝发育过程中E-选择素的定性定位研究、与胚肝造血功能的关系至今未见报道。目的:观察小鼠肝脏发育过程中E-选择素的表达与肝细胞、肝血窦内皮形态分化及胎肝造血作用的关系。方法:取胚胎11.5（E11.5）至出生后15.5d（P15.5）的小鼠胚胎或胎肝,常规制作石蜡切片,行苏木精-伊红染色及免疫组织化学检测。光学显微镜下观察胎肝的组织结构变化及细胞形态;免疫组织化学方法检测发育各期肝组织内E-选择素表达。结果与结论:E11.5肝始祖细胞形成团索样结构,其间有窦样间隙,内有散在的造血干细胞;E12.5d肝始祖细胞开始增殖分化,其后,随着小鼠胎肝的不断发育,肝细胞数量及体积增大,核质比减小,至出生时形成肝小叶结构;窦样间隙由少到多,由宽变窄,窦壁内皮细胞从少量、不连续逐步增殖形成完整的内皮;造血细胞于E12.5开始造血,E13.5～E15.5达高峰,之后造血功能均逐步减弱。E-选择素表达于E11.5～E15.5胎肝的内皮细胞,定位于内皮细胞的胞膜,随内皮细胞发育及肝细胞分化成熟,E-选择素表达渐消失。提示E12.5～E15.5为小鼠胎肝各细胞发育分化的关键时期,E-选择素表达于此阶段的血窦内皮,与肝脏造血及肝细胞分化有密切关系。
陈强[9]（2008）在《肝干细胞体外分化中细胞生长因子调控与肝癌的关系》文中研究指明目前人们对肝干细胞的分化潜能及特性已形成共识,但体外分离培养肝干细胞的方法还不成熟,肝干细胞体外分离培养方法的建立是在体外条件下对肝干细胞的生物学特性进行深入研究的前提和基础。肝细胞生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素、转化生长因子等细胞生长因子对肝干细胞的体外培养、生长和分化可能具有重要的调控作用。肝干细胞在一定条件下可以转化为肝癌细胞,肝干细胞在肝癌的发生中起着非常重要的作用。肝干细胞移植研究为肝细胞移植、生物型人工肝、肝癌靶向基因治疗提供细胞来源。
祝尔建[10]（2008）在《基因修饰胎肝干细胞治疗肝纤维化的实验研究》文中指出研究背景:肝纤维化是肝脏受到慢性损伤时,肝脏细胞外基质分泌与降解失衡,从而在肝细胞的间隙可逆性沉积的结果;是多种肝脏疾病发展至肝硬化的必经阶段;成为诸多肝脏疾病预后与转归的关键。因此,抑制甚至逆转肝纤维化的进展,具有重要意义。多年来,抗肝纤维化的药物层出不穷,但是至今尚未出现理想的治疗药物。近年来以细胞为基础的肝病治疗方面的研究逐渐深入,目前研究较多的是骨髓间充质干细胞、脐带血干细胞及早期胚囊来源的干细胞、中期妊娠的胚胎肝脏来源的干细胞等。干细胞免疫原性低,移植后排斥反应小,更易于基因修饰。胎肝来源的肝母细胞,在治疗肝病方面,具有“天然”优势:移植后靶向性强,在受体肝脏中更容易向肝实质细胞分化。中期妊娠的胎肝肝母细胞含量丰富,它们具有向肝细胞和胆管上皮细胞双向分化的潜能。另外肝纤维化相关因子的基因治疗也呈现出良好前景。从肝母细胞含量丰富的大鼠中期妊娠（ED14.5）的胚胎肝脏中,以机械分离法、OX43/OX44免疫吸附法等分离纯化出肝母细胞并对其进行鉴定;细胞培养:体外培养肝母细胞,分析SCF、bFGF、EGF和LIF等细胞因子对肝母细胞增殖和分化的影响,选出既能刺激肝母细胞增殖同时又抑制其分化的细胞因子（组合）;鉴定细胞的分化状态;载体构建:在pEGFP-C1质粒基础上构建大鼠HGF基因和绿色荧光蛋白基因共同表达的融合载体;转染:用脂质体转染法将该质粒转染到肝母细胞中,通过绿色荧光蛋白和HGF的表达情况检测该质粒的细胞内工作状态;细胞移植:将能够表达HGF的细胞移植到CCl4肝纤维化大鼠体内,检测不同时间段肝纤维化大鼠肝功能和血清肝纤维化指标,血清中HGF及TGFβ1的浓度,肝组织中荧光蛋白数量和分布,肝组织内Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的沉积情况以及肝组织内HGF及其受体和TGFβ1的表达水平。综上所述,本研究在传统方法上改进的肝母细胞分离纯化方法,兼顾操作简单,细胞产量大,细胞活性高的优点,适合用于胎肝来源肝母细胞的规模化生产。HGF是一种具有抗肝纤维化作用的细胞因子,而胎肝来源的肝母细胞具有很强的肝靶向性,移植后能归巢于受体肝脏,并增殖分化。本研究将载有HGF基因的肝母细胞既可以分化为具有正常功能的肝实质细胞而发挥治疗作用,又能够表达HGF,这两个方面互相促进,逆转了肝纤维化,改善了肝功能。
二、胎肝中肝干细胞的免疫组织化学研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、胎肝中肝干细胞的免疫组织化学研究（论文提纲范文）
（1）Hlf标记的胚胎新生造血干细胞的功能及命运研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 造血干细胞前体特征基因的筛选及小鼠构建 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验设计 |
| 1.3 实验材料 |
| 1.3.1 实验动物 |
| 1.3.2 实验试剂与抗体 |
| 1.3.3 仪器和耗材 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 小鼠胚胎发育节点划分 |
| 1.4.2 小鼠胚胎取材及解离成单细胞 |
| 1.4.3 流式分析和分选 |
| 1.4.4 实验用溶液配制 |
| 1.5 实验结果 |
| 1.5.1 造血干细胞前体中特异表达基因的筛选 |
| 1.5.2 构建Hlf-tdTomato和Hlf-CrexER小鼠模型 |
| 第二章 HIf表达群体的造血干细胞潜能 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验设计 |
| 2.3 实验材料 |
| 2.3.1 实验动物 |
| 2.3.2 实验试剂与抗体 |
| 2.3.3 仪器和耗材 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 小鼠胚胎发育节点划分 |
| 2.4.2 小鼠胚胎取材及解离成单细胞 |
| 2.4.3 流式分析和分选 |
| 2.4.4 试剂配制 |
| 2.4.5 免疫组织化学 |
| 2.4.6 OP9-DL1共培养 |
| 2.4.7 孵育产物分析 |
| 2.4.8 尾静脉移植 |
| 2.4.9 移植受体小鼠外周血嵌合检测 |
| 2.4.10 基因型鉴定 |
| 2.4.11 凝胶电泳 |
| 2.5 实验结果 |
| 2.5.1 利用Hlf-tdTomato小鼠进行Hlf基因的表达图谱鉴定 |
| 2.5.2 E10.5时期Hlf-tdTomato小鼠对造血干细胞前体富集检测 |
| 2.5.3 E11时期Hlf-tdTomato小鼠对造血干细胞前体的富集检测 |
| 第三章 表达Hlf的造血干细胞对胚体发育中造血贡献的动力学研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验设计 |
| 3.3 实验材料 |
| 3.3.1 实验动物 |
| 3.3.2 实验试剂与抗体 |
| 3.3.3 仪器与耗材 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.4.1 小鼠胚胎发育节点划分 |
| 3.4.2 小鼠胚胎取材及解离成单细胞 |
| 3.4.3 流式分析 |
| 3.4.4 试剂配制 |
| 3.4.5 免疫组织化学 |
| 3.4.6 全胚胎免疫荧光 |
| 3.4.7 外周血5系检测 |
| 3.4.8 小鼠给药方式 |
| 3.4.9 基因型鉴定 |
| 3.4.10 凝胶电泳 |
| 3.5 实验结果 |
| 3.5.1 对新构建Hlf-CrexER遗传谱系示踪小鼠进行表达谱鉴定 |
| 3.5.2 胚胎早期Hlf表达细胞在E10.5、E11.5造血事件中的贡献 |
| 3.5.3 绘制胚胎早期不同时间点Hlf表达细胞对胎肝中造血干细胞贡献的动力学研究 |
| 3.5.4 描绘胚胎早期不同时间点Hlf标记细胞对成体外周血中各血系贡献的动力学特点 |
| 第四章 利用双谱系示踪系统研究胚胎期造血发育 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验设计 |
| 4.3 实验材料 |
| 4.3.1 实验动物 |
| 4.3.2 实验试剂与抗体 |
| 4.3.3 仪器与耗材 |
| 4.4 实验方法 |
| 4.4.1 小鼠胚胎发育节点划分 |
| 4.4.2 小鼠胚胎取材及解离成单细胞 |
| 4.4.3 流式分析 |
| 4.4.4 试剂配制 |
| 4.4.5 外周血各系检测 |
| 4.4.6 基因型鉴定 |
| 4.4.7 凝胶电泳 |
| 4.5 实验结果 |
| 4.5.1 利用双谱系示踪系统小鼠研究Hlf在早期胚胎中的造血贡献 |
| 4.5.2 利用双谱系示踪系统小鼠研究Hlf在胎肝中的造血贡献 |
| 4.5.3 利用双谱系示踪系统小鼠研究Hlf在外周血中的造血贡献 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（2）人生殖干细胞转分化为成熟肝细胞及其信号转导研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 绪论 |
| 第一章 人精原干细胞体外诱导转分化为成熟肝细胞及其信号转导研究 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.2.1 实验材料 |
| 1.2.2 实验方法 |
| 1.2.3 统计学分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 人精原干细胞的分离和鉴定 |
| 1.3.2 人精原干细胞诱导体外转分化为肝干细胞 |
| 1.3.3 人肝干细胞诱导分化为小肝细胞 |
| 1.3.4 小肝细胞分化为成熟的肝细胞 |
| 1.3.5 人精原干细胞来源的成熟肝细胞的功能分析 |
| 1.3.6 β-CATENIN/HNF4A/FOXA1/GATA4 信号通路参与了人精原干细胞诱导转分化为成熟肝细胞的过程 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 人精原干细胞体内诱导转分化为肝细胞 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 肝脏间质细胞的分离和鉴定 |
| 2.3.2 肝损伤模型的建立 |
| 2.3.3 人精原干细胞和肝间质细胞重组 |
| 2.3.4 人精原干细胞和肝间质细胞的肾包膜移植 |
| 2.3.5 移植4周后转化细胞的鉴定 |
| 2.3.6 人精原干细胞体内移植的安全性检测 |
| 2.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（3）炎症环境下胆管反应与肝细胞癌术后预后关系的研究（论文提纲范文）
| 中文提要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 癌旁胆管反应与临床及病理学关系的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 癌旁胆管反应与肝癌根治切除术后预后关系的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 癌旁胆管反应与肝脏炎症坏死及肝硬化关系的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四部分 癌旁胆管反应与肝癌细胞的 EPCAM 表达关系的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 综述 肝脏炎症损伤、细胞衰老及干/祖细胞激活在肝癌发生发展中的作用 |
| 参考文献 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 博士期间发表论文及参加课题 |
| 致谢 |
（4）鼠胎肝干细胞的体外分离培养及体内移植的实验性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 一种改进的大鼠胎肝干细胞分离纯化方法 |
| 前言 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 大鼠肝损伤后成熟肝细胞和卵圆细胞在肝再生中的作用 |
| 前言 |
| 一、材料和方法 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 GFP转基因小鼠胎肝干细胞体外分离培养及脾内移植的初步研究 |
| 前言 |
| 一、材料和方法 |
| 二、实验方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词 |
| 成果 |
| 致谢 |
（6）人肝源性干细胞在Fah-/-Rag2-/-小鼠中生物学行为的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 一、主要器材和设备 |
| 二、主要试剂及其制备 |
| 三、实验动物 |
| 实验方法 |
| 一、Fah~(-/-)Rag2~(-/-)小鼠品系的建立 |
| 二、肝细胞分离 |
| 三、hFLSC细胞培养 |
| 四、细胞移植 |
| 五、RT-PCR分析 |
| 六、免疫组织化学 |
| 七、电镜观察 |
| 八、体重曲线 |
| 九、统计分析 |
| 实验结果 |
| 一、小鼠肝细胞移植 |
| 二、Fah~(-/-)小鼠停药后肝脏的病理学变化 |
| 三、Fah~(-/-)Rag2~(-/-)小鼠的鉴定及分析 |
| 四、hFLSC移植 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述:肝损伤模型及胎肝祖细胞的研究进展 |
| 致谢 |
（7）HNF4α在胎肝干细胞定向分化修复肝组织损伤中作用机理的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 正文 |
| 实验一 体外琼脂克隆培养对胎肝干细胞分化的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 实验二 HNF4Α在胎肝干细胞促肝组织损伤修复中的作用 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（8）E-选择素表达与小鼠胎肝发育及造血功能（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同发育时期肝脏的光镜结构特点 |
| 2.2 免疫组织化学结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 胎肝发育过程中形态结构变化及意义 |
| 3.2 E-选择素的表达及意义 |
（9）肝干细胞体外分化中细胞生长因子调控与肝癌的关系（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 学术背景 |
| 2 目的 |
| 3 资料和方法 |
| 3.1 文献检索 |
| 3.2 检索方法 |
| 4 文献证据综合提炼 |
| 4.1 细胞生长因子与肝干细胞体外分离培养的调控 |
| 4.1.1 肝干细胞的表面标志物及分离培养方法 |
| 4.1.2 细胞生长因子在肝干细胞诱导分化中的调控作用 |
| 4.2 肝干细胞移植与肝脏疾病 |
| 4.2.1 肝干细胞对肝脏的修复作用 |
| 4.2.2 骨髓来源肝细胞与肝癌 |
| 5结论 |
（10）基因修饰胎肝干细胞治疗肝纤维化的实验研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| 英文缩写词表 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一节 肝纤维化发病机制的研究进展 |
| 第二节 肝纤维化的HGF 基因治疗的研究进展 |
| 第三节 肝脏疾病的细胞治疗 |
| 第四节 制备胎肝来源肝母细胞的研究进展 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第一章 肝母细胞的制备与体外培养研究 |
| 前言 |
| 1、材料与方法 |
| 2、结果 |
| 3、讨论 |
| 第二章HGF 的克隆、重组质粒构建与原代肝母细胞转染研究 |
| 前言 |
| 第一节 HGF 的克隆与重组质粒构建 |
| 1、材料与方法 |
| 2、结果 |
| 3、讨论 |
| 第二节 重组体的原代肝母细胞转染 |
| 1、材料和方法 |
| 2、结果 |
| 3、讨论 |
| 第三章 转染重组体的大鼠肝母细胞移植治疗大鼠肝纤维化的实验研究 |
| 前言 |
| 1、材料与方法 |
| 2、结果 |
| 3、讨论 |
| 结论 |
| 本研究中的创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文及其他成果 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 致谢 |
四、胎肝中肝干细胞的免疫组织化学研究（论文参考文献）
- [1]Hlf标记的胚胎新生造血干细胞的功能及命运研究[D]. 汤万波. 军事科学院, 2021(02)
- [2]人生殖干细胞转分化为成熟肝细胞及其信号转导研究[D]. 陈政. 上海交通大学, 2016(03)
- [3]炎症环境下胆管反应与肝细胞癌术后预后关系的研究[D]. 徐敏晖. 苏州大学, 2014(10)
- [4]鼠胎肝干细胞的体外分离培养及体内移植的实验性研究[D]. 王亚萍. 南方医科大学, 2013(03)
- [5]小鼠胎肝中胎肝激酶-1阳性细胞具有血管祖细胞的功能特性[J]. 金成豪,米满吉和,丁伟荣,居石克夫. 中华心血管病杂志, 2010(12)
- [6]人肝源性干细胞在Fah-/-Rag2-/-小鼠中生物学行为的研究[D]. 刘芳遐. 第二军医大学, 2010(12)
- [7]HNF4α在胎肝干细胞定向分化修复肝组织损伤中作用机理的研究[D]. 尤楠. 第四军医大学, 2010(06)
- [8]E-选择素表达与小鼠胎肝发育及造血功能[J]. 徐丽萍,方芳,许贺标,马宁芳. 中国组织工程研究与临床康复, 2010(10)
- [9]肝干细胞体外分化中细胞生长因子调控与肝癌的关系[J]. 陈强. 中国组织工程研究与临床康复, 2008(16)
- [10]基因修饰胎肝干细胞治疗肝纤维化的实验研究[D]. 祝尔建. 吉林大学, 2008(11)