一、大鼠心肌缺血再灌注损伤模型几种开胸方法评述（论文文献综述）
宋欣丽[1]（2021）在《龙牙楤木总皂苷抗MIRI机制研究及中成药防治MIRI的系统评价》文中研究说明研究目的1.通过建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型,观察龙牙楤木总皂苷对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用;并且探讨其保护作用是否与线粒体功能障碍以及内质网应激有关。2.通过Meta分析方法对中成药治疗心肌缺血再灌注损伤疗效进行系统评价,为临床使用中成药治疗心肌缺血再灌注损伤治疗提供循证医学依据。研究方法1.实验研究:采用随机数字表法将Wistar大鼠随机分为5组,分别为假手术组、模型组、龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组,通过结扎左前降支30min后复灌,构建大鼠在体心肌缺血再灌注损伤模型,假手术组、模型组予生理盐水灌胃,龙牙楤木总皂苷剂量组分别按50、100、200mg/（kg·d）灌胃处理。2,3,5—氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC）染色法测定大鼠心肌梗死面积,酶联免疫法检测各组大鼠肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌钙蛋白T（cTnT）的含量,TUNEL（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）染色法观察心肌组织细胞凋亡指数;使用透射电镜观察心肌组织中线粒体结构和形态变化,提取各组大鼠心肌组织线粒体,活性氧荧光（DCFH-DA）探针法观察线粒体活性氧簇（Reactive Oxygen Species,ROS）的生成变化、JC-1荧光探针法观察线粒体膜电位变化、比色法观察腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosine Triphosphate,ATP）的形成及琥珀酸脱氢酶（Succinate dehydrogenase,SDH）活性变化情况。免疫组织化学检测法、蛋白质印迹法（Western blot）法检测内质网经典信号通路PERK-eIF2α通路中蛋白激酶R样内质网激酶（proteinkinase R-like ER kinase,PERK）、p-蛋白激酶R 样内质网激酶（p-protein kinase R-like ER kinase,p-PERK）、真核起始因子 2（eukaryotic initiation factor 2,eIF2α）、p-真核起始因子 2（p-eukaryotic initiation factor 2,p-eIF2α）相关蛋白的表达,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测PERK、eIF2α中mRNA的含量。2.临床研究:通过全面搜索并筛选数据库中自建库到2021年1月1日以来发表的关于中成药治疗心肌缺血再灌注损伤患者的随机临床对照试验,对相关结局指标利用RevMan5.3软件进行系统评价。评价指标包括心肌损伤标志物:肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌钙蛋白I（cTNI）、肌钙蛋白T（cTNT）、再灌注心律失常发生率、不良事件发生率、左室射血分数（LVEF）、高敏C-反应蛋白（hs-CRP）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）、乳酸脱氢酶（LDH）等。研究结果实验研究:实验一:TTC染色结果显示,sham组、I/R组、龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组心肌梗死面积占总心肌面积百分比分别为:0%、72%、56%、52%、31%。其中,与sham组相比较,I/R组、龙牙楤木总皂苷低、中、高组心肌梗死面积所占比例明显增加,I/R组差异具有显着统计学意义（P<0.01）,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组提示差异不具有统计学意义（P>0.05,P>0.05,P>0.05）;龙牙楤木总皂苷各剂量组和I/R组相比较,从各组心肌梗死面积所占百分比可见,龙牙楤木总皂苷各组梗死面积比值均低于I/R组,并且随着龙牙楤木总皂苷剂量的增加,心肌梗死面积所占比值逐渐降低,统计学分析显示,龙牙楤木总皂苷低剂量组统计结果显示无统计学差异（P>0.05）;龙牙楤木总皂苷中剂量组结果显示具有统计学意义（P<0.05）,而龙牙楤木总皂苷高剂量组结果提示具有显着统计学意义（P<0.01）。TUNEL染色结果显示,从颜色上看,sham组:大部分心肌细胞的细胞核呈现为蓝色;I/R组:大部分心肌细胞的细胞核呈现为黄褐色;龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量黄褐色细胞核所占比例介于sham组和I/R组之间,但呈逐渐减少的趋势。sham组细胞凋亡很不明显,可见存在少量散在凋亡细胞;具体的凋亡细胞百分比见下表。与sham组比较,I/R组、龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组大鼠心肌细胞凋亡百分比则明显增加,阳性凋亡细胞数明显升高,统计学分析结果显示,I/R组差异具有显着统计学意义（P<0.01）,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组提示差异不具有统计学意义（P>0.05,P>0.05,P>0.05）;与I/R组相比,龙牙楤木总皂苷低剂量组差异具有统计学意义（P<0.05）,中、高剂量组差异具有显着统计学意义（P<0.01,P<0.01）。酶联免疫法结果显示,和sham组进行比较,I/R组、龙牙楤木总皂苷低、中、高CK-MB、cTnT含量,均有所显着升高,统计分析结果显示,I/R组差异具有显着统计学意义（P<0.01、P<0.01）,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组差异不具有统计学意义（P>0.05,P>0.05,P>0.05;P>0.05,P>0.05,P>0.05）;与I/R组相比,龙牙楤木总皂苷低剂量组差异无明显统计学意义（P>0.05;P>0.05）,龙牙楤木总皂苷中剂量组差异具有统计学意义（P<0.05;P<0.05）,龙牙楤木总皂苷高剂量组差异具有显着统计学意义（P<0.01;P<0.01）。实验二:透射电镜结果显示:sham组心肌细胞大小及形态基本规则,肌原纤维排列规则;肌细胞内线粒体丰富,线粒体结构完整、形态规则,线粒体内脊排列密集、结构清晰。I/R组心肌细胞大小及形态有较大差异,可见萎缩及坏死肌细胞,肌原纤维排列紊乱;肌细胞内线粒体分布不均,部分聚集,线粒体大小及形态有较大差异,内脊大多模糊。龙牙楤木总皂苷低剂量组心肌细胞形态有一定差异,肌原纤维排列不规则;肌细胞内线粒体丰富,线粒体肿胀,内脊扩张、大多结构模糊;中剂量组心肌细胞大小及形态稍不规则,细胞核呈长梭形,肌原纤维排列稍不规则;肌细胞内线粒体丰富,线粒体结构完整、形态规则,线粒体内脊部分结构清晰、部分模糊;高剂量组心肌细胞大小及形态基本规则,肌原纤维排列规则;肌细胞内线粒体丰富,线粒体结构完整、形态规则,线粒体内脊排列密集、结构清晰。DCFH-DA探针法检测ROS水平结果显示,和sham组进行比较,I/R组、龙牙楤木总皂苷低、中、高ROS水平均显着升高,统计分析结果显示,I/R组差异具有显着统计学意义（P<0.01）,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组差异不具有统计学意义（P>0.05,P>0.05,P>0.05）;与I/R组相比,随着龙牙楤木总皂苷剂量的增高,ROS水平呈现出逐步走低的趋势;统计分析结果显示,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组差异均具有显着统计学意义（P<0.01,P<0.01,P<0.01）。比色法观察ATP水平结果显示,和sham组进行比较,I/R组、龙牙楤木总皂苷低、中、高ATP水平均有所降低,统计分析结果显示,I/R组差异具有显着统计学意义（P<0.01）,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组差异不具有统计学意义（P>0.05,P>0.05,P>0.05）;与I/R组相比,随着龙牙楤木总皂苷剂量的增高,ATP水平呈现出逐步增高的趋势;统计分析结果显示,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组差异均具有显着统计学意义（P<0.01,P<0.01,P<0.01）;JC-1荧光探针法观察线粒体膜电位水平结果显示,和sham组进行比较,I/R组、龙牙楤木总皂苷低、中、高线粒体膜电位水平水平均有所降低,统计分析结果显示,I/R组差异具有显着统计学意义（P<0.01）,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组差异不具有统计学意义（P>0.05,P>0.05,P>0.05）;与I/R组相比,随着龙牙楤木总皂苷剂量的增高,线粒体膜电位水平水平呈现出逐步增高的趋势;统计分析结果显示,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组差异均具有显着统计学意义（P<0.01,P<0.01,P<0.01）;比色法观察SDH活性水平结果显示,和sham组进行比较,I/R组、龙牙楤木总皂苷低、中、高SDH活性水平均有所升高,统计分析结果显示,I/R组差异具有显着统计学意义（P<0.01）,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组差异不具有统计学意义（P>0.05,P>0.05,P>0.05）;与I/R组相比,随着龙牙楤木总皂苷剂量的增高,SDH活性水平呈现出逐步走低的趋势;统计分析结果显示,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组差异均具有显着统计学意义（P<0.01,P<0.01,P<0.01）。实验三:Western blot方法检测心肌组织中PERK、eIF2α的表达。结果显示:与sham组相比,I/R组、龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组PERK、eIF2α的表达没有明显变化,统计学分析结果显示,差异均不具有统计学意义（P>0.05,P>0.05,P>0.05,P>0.05;P>0.05,P>0.05,P>0.05,P>0.05）。而与I/R组相比较,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组PERK的表达也没有明显改变,统计学分析显示,差异也不具有统计学意义（P>0.05,P>0.05,P>0.05,P>0.05;P>0.05,P>0.05,P>0.05,P>0.05）。Western blot方法检测心肌组织中p-PERK、p-eIF2α的表达结果显示,和sham组进行比较,I/R组、龙牙楤木总皂苷低、中、高p-PERK、p-eIF2α表达水平均显着升高,统计分析结果显示,I/R组差异具有显着统计学意义（P<0.01、P<0.01）,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组差异不具有统计学意义（P>0.05,P>0.05,P>0.05）;与I/R组相比,随着龙牙楤木总皂苷剂量的增高,p-PERK、p-eIF2α表达水平呈现出逐步走低的趋势;统计分析结果显示,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组差异均具有显着统计学意义（P<0.01,P<0.01,P<0.01;P<0.01,P<0.01,P<0.01）。qRT-PCR 方法检测心肌组织中PERK、eIF2αmRNA的表达,结果显示,和sham组进行比较,I/R组、龙牙楤木总皂苷低、中、高PERK、eIF2α表达水平均显着升高,统计分析结果显示,I/R组差异具有显着统计学意义（P<0.01;P<0.01）,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组差异不具有统计学意义（P>0.05,P>0.05,P>0.05;P>0.05,P>0.05,P>0.05）;与I/R组相比,随着龙牙楤木总皂苷剂量的增高,PERK、eIF2α表达水平呈现出逐步走低的趋势;统计分析结果显示,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组差异均具有显着统计学意义（P<0.01,P<0.01,P<0.01;P<0.01,P<0.01,P<0.01）。免疫组化结果显示:与 sham组相比,I/R组、龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组PERK、eIF2α的表达没有明显改变,统计学分析结果显示,差异均不具有统计学意义（P>0.05,P>0.05,P>0.05,P>0.05;P>0.05,P>0.05,P>0.05,P>0.05）。而与I/R组相比较,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组PERK、eIF2α的表达也没有太大差异,统计学分析显示,差异也不具有统计学意义（P>0.05,P>0.05,P>0.05;P>0.05,P>0.05,P>0.05）。免疫组化方法检测心肌组织中p-PERK的表达。结果显示,和sham组进行比较,I/R组、龙牙楤木总皂苷低、中、高p-PERK表达水平均显着升高,I/R组差异具有显着统计学意义（P<0.01）,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组差异不具有统计学意义（P>0.05,P>0.05,P>0.05）;与I/R组相比,随着龙牙楤木总皂苷剂量的增高,p-PERK表达水平呈现出逐步走低的趋势;统计分析结果显示,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组差异均具有显着统计学意义（P<0.01,P<0.01,P<0.01）。免疫组化方法检测心肌组织中p-eIF2α的表达。结果显示,和sham组进行比较,I/R组、龙牙楤木总皂苷低、中、高p-eIF2α表达水平均显着升高,统计分析结果显示,I/R组差异具有统计学意义（P<0.05）,龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量组差异不具有统计学意义（P>0.05,P>0.05,P>0.05）;与I/R组相比,随着龙牙楤木总皂苷剂量的增高,p-eIF2α表达水平呈现出逐步走低的趋势;统计分析结果显示,龙牙楤木总皂苷中、高剂量组差异均具有统计学意义（P<0.05,P<0.05）,龙牙楤木总皂苷低剂量组差异不具有统计学意义（P>0.05）。临床研究:最终纳入研究96项,中文文献92篇,英文文献4篇。Meta分析结果显示:CK-MB（SMD:-1.86,95%CI:[-2.33,-1.38],I2=95%,P<0.00001）;CK（SMD:-102.21,95%CI:[-129.34,-75.09],I2=100%,P<0.00001）;cTnI（SMD:-0.80,95%CI:[-0.97,-0.62],I2=99%,P<0.00001）,cTnT（SMD:-1.55,95%CI:[-1.8,-1.3],I2=100%,P<0.00001）;再灌注心律失常发生率（MD:-0.42,95%CI:[-0.34,-0.51],I2=45%,P<0.00001）;不良事件发生率（MD:-0.28,95%CI:[-0.22,-0.36],I2=12%,P<0.00001）;LVEF（SMD:-4.89,95%CI:[-3.9,-5.87],I2=86%,P<0.00001）;HsCRP（SMD:-5.04,95%CI:[-6.92,-3.16],I2=99%,P<0.00001）;MDA（SMD:-4.25,95%CI:[-5.22,-3.28],I2=99%,P<0.00001）;SOD（SMD:-15.26,95%CI:[-10.74,-19.78],I2=99%,P<0.00001）;NO（SMD:-15.26,95%CI:[-5.29,-7.51],I2=97%,P<0.00001）;LDH（MD:-13.83,95%CI:[-20.31,-7.35],I2=0%,P<0.00001）。研究结论1.龙牙楤木总皂苷对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有一定的保护作用,可减少心肌酶漏出,抑制心肌细胞凋亡,改善损伤心肌组织和线粒体结构,抑制SDH活性,同时降低ROS生成,减缓蛋白磷酸化,其机制可能与降低线粒体功能障碍、抑制内质网应激的过度激活有关。龙牙楤木总皂苷的保护作用与剂量呈正相关,发挥大鼠抗心肌缺血再灌注损伤作用的最适有效剂量在200mg/（kg·d）左右。2.中成药联合西医常规治疗心肌缺血再灌注损伤疗效肯定,尤其在降低再灌注性心律失常和不良事件发生率方面效果显着,但鉴于纳入研究数量偏少、样本量较小、方法学质量偏低,未来需要更多高质量的随机对照试验来证实。
蒋礼祥[2]（2021）在《大鼠病态窦房结综合征的模型对比研究》文中研究指明背景:病态窦房结综合征（Sick sinus syndrome,SSS）是一种在临床上较为常见的心律失常疾病。目前治疗SSS主要为心脏起搏器的植入,而由此产生的医疗费用也加重了医保负担。本研究拟通过对比多种大鼠病态窦房结综合征模型,研究窦房结的结构与功能改变以及相关机制,旨在探寻导致窦房结功能障碍的影响因素,并期望为临床病态窦房结综合征找到干预和治疗的靶点。目的:1.明确大鼠窦房结（Sinoatrial node,SAN）解剖位置和组织细胞形态学特点,通过用多种方法制作SD大鼠SSS模型,观察SSS大鼠心率变化情况、SAN形态结构改变、SAN区组织中纤维化情况以及窦房结特异性标记物超极化激活的环状核苷酸门控通道4（Hyperpolarisation activated cyclic nucleotidegated channel 4,HCN4）的表达情况。2.对比多种病态窦房结综合征造模方法的成功率及死亡率,及造模前后对膜钟及钙钟起搏相关基因表达的影响,以期病态窦房结综合征临床治疗研究提供理论基础。方法:1.取250-300g雄性SD大鼠窦房结组织、窦房结周围心房组织、及心室组织,采用HE染色、Masson染色观察窦房结区域细胞形态及周围组织纤维化情况。采用Western Blot检测三个部位组织的超极化激活的环状核苷酸门控通道4（Hyperpolarisation activated cyclic nucleotidegated channel 4,HCN4）、缝隙连接蛋白43（Connexin 43,CX43）的蛋白表达情况。2.建立病态窦房结综合征模型分组:（1）对照组（n=25）;（2）20%氢氧化钠湿敷组（n=30）;（3）10%氢氧化钠静脉注射组（n=27）;（4）40%甲醛湿敷组（n=25）;（5）窦房结缺血再灌注损伤组（n=23）;（6）伊伐布雷定灌胃组（n=25）,（7）窦房结动脉结扎组（n=20）,检测各组造模前后大鼠的心率变化;在采用HE染色、Masson染色检测各组窦房结区域细胞形态变化及纤维化情况,并对比造模的成功率及死亡率及优越性。采用WB检测各组窦房结组织HCN4蛋白表达情况。3.采用PCR技术检测各组窦房结组织的膜钟离子通道基因（超极化激活的环状核苷酸门控通道4（Hyperpolarisation activated cyclic nucleotidegated channel 4HCN4）（编码HCN4离子通道）、超极化激活的环状核苷酸门控通道1（Hyperpolarisation-activated cyclic nucleotidegated channel 1,HCN1）（编码HCN1离子通道）、钠电压门控通道α亚基5（Sodium voltage-gated channel alpha subunit 5SCN5A）（编码Nav1.5钠离子通道）、钾内向整流通道亚家族J成员5（Potassium inwardly rectifying channel subfamily J member 5 Kcnj5）（编码内向整流钾离子通道Kir3.4）、钙电压门控通道亚基α1C（Calcium voltage-gated channel subunit alpha1 C Cacna1c）（编码L型钙离子通道Cav1.2）、钙电压门控通道亚基α1H（Calcium voltage-gated channel subunit alpha1 H Cacna1h）（编码T型钙离子通道Cav3.2））以及钙钟离子通道基因(ATPase肌浆/内质网Ca2+转运2(ATPase sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+transporting 2 Atp2a2)（编码肌浆网钙ATP酶）、兰尼碱受体2（Ryanodine receptor Ry R2）（编码兰尼碱受体）的m RNA表达情况。结果:1.取大鼠窦房结区域及窦房结周围区域心房组织及心室组织,HE染色结果显示窦房结区域窦房结细胞形态与心房肌细胞类似,窦房结区域细胞外间质稍疏松,窦房结和心房肌分界不清;Masson染色显示窦房结区域未见明显纤维化。采用Western Blot检测HCN4蛋白表达,结果显示:窦房结区域HCN4与窦房结周围心房组织及心室相比明显高表达（P<0.05）,周围心房区域少量表达、心室区域几乎不表达;CX43显示窦房结区域与窦房结周围心房组织及心室组织相比明显低表达（P<0.05）。2.在20%氢氧化钠湿敷法、10%氢氧化钠静脉注射法、40%甲醛湿敷法和缺血再灌注损伤法中,各组大鼠心率在造模后及1周后、2周后心率都明显减慢且心率低于造模前30%视为造模成功。HE染色结果显示窦房结细胞减少且间质组织增生,Masson染色结果显示窦房结区域明显纤维化。Western Blot显示四种造模方法窦房结区域HCN4表达都明显减低（P<0.05）,故四种方法都可以成功制作病态窦房结综合征模型,其中以20%氢氧化钠湿敷法的成功率最高（62%）,缺血再灌注损伤法成功率最低（23%）。伊伐布雷定灌胃法可以导致心率减慢,HE染色未见窦房结细胞减少,也未见间质增生,Masson染色窦房结未见纤维化,WB及PCR未发现HCN4表达变化,由于心率减低为SSS的最主要的临床表现,故可以认为伊伐布雷定能够制作大鼠SSS模型。窦房结动脉结扎法可以导致SD大鼠心率减慢,但造模一周后大鼠心率完全恢复,HE染色未见细胞减少及间质增生,但可见窦房结区域新生血管形成,故该方法不能制作SSS模型。3.本研究用20%氢氧化钠湿敷法、10%氢氧化钠静脉注射法、40%甲醛湿敷法和缺血再灌注损伤法造模后用PCR检测窦房结组织的膜钟、钙钟相关起搏基因均明显减低。结论:1.20%氢氧化钠湿敷法、10%氢氧化钠静脉注射法、40%甲醛湿敷法、缺血再灌注损伤法、伊伐布雷定灌胃法五种方法均可以制作稳定的病态窦房结综合征大鼠模型,其中以伊伐布雷定灌胃法成功率最高,其次为20%氢氧化钠湿敷法。此外,窦房结动脉结扎法可以使大鼠心率减低,但1周后心率完全恢复,故不能成功制作SSS模型。2.采用上述四种传统方法造模后,大鼠窦房结组织中膜钟相关起搏基因:HCN4、HCN1、SCN5A、Kcnj5、Cacna1c、Cacna1h以及钙钟相关起搏基因Atp2a2、Ry R2表达均明显降低,这表明膜钟和钙钟离子通道功能异常与SSS有很大的相关性。
黄表华[3]（2021）在《龙血竭总黄酮对心肌缺血再灌注损伤大鼠的保护作用及PI3K/AKT表达的影响》文中进行了进一步梳理目的:通过构建大鼠心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI）模型,并经龙血竭（Sanguis Draconis flavones,SDF）干预后,明确磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B,PI3K/AKT）信号通路与MIRI的关系,明确龙血竭干预后,PI3K/AKT信号通路的变化及其对MIRI的影响。方法:（1）将80只SD大鼠按随机数字表法分为4组:空白对照组（control check,Control组）,20只;假手术组（sham surgery,Sham组）,20只;缺血再灌注组（Ischemia/reperfusion,I/R）,20只;缺血再灌注+龙血竭总黄酮干预（即通过灌胃法将龙血竭混悬液注入大鼠胃内）组（Sanguis Draconis flavones-I/R,SDF-I/R）,20只。（2）第29天手术,术前禁食禁水12小时;空白对照组（Control组）不需手术处理。假手术组的动物手术全过程与其他组相同,但只穿线不结扎冠脉,并在穿线后将心脏放回胸腔,适当闭合胸腔切口。I/R组及SDF-I/R组进行缺血30min后,抽去塑料管,进行再灌注120min,造成心肌缺血再灌注损伤（MIRI）造模。（3）所有大鼠均在（1）实验造模0分钟、30分钟、再灌注120分钟三个时间点采集体表心电图数据;（2）所有动物直接从腹主动脉取2～4 mL血液,离心得到血清,检测各组造模后再灌注120分钟的血清炎性细胞因子肌酸激酶（Creatine Kinase,CK）、肌酸激酶同功酶（creatine kinase isoenzymes,CK-MB）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）水平;用ELISA法测定血清中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）和炎症因子白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）含量;（3）最后放血法处死大鼠后立即取出心脏,留取结扎水平线下相应梗死部位心肌组织进行苏木精-伊红染色法染色（hematoxylin-eosin staining,HE）,显微高倍镜下观察其病理变化。心肌梗死面积测量:实验结束后分离出心脏,将心脏横切成3～4片,采用1%2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride,TTC）染色检测心肌梗死面积。（4）通过实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,q PCR）检测心肌组织中各组PI3K、AKT的信使核糖核酸（Messenger RNA,m RNA）表达量;（5）Western Blot检测心肌组织中各组PI3K、AKT的蛋白水平。所有计量资料用均数±标准差（（?）±S）表示,多组间比较用One-Way ANOVA方法进行统计分析,多组间两两比较采用SNK法,以P<0.05为差异具有统计学意义。结果:（1）血清酶学检测:各组心肌酶学检测情况比较,LDH、CK、CK-MB指标中,I/R组、SDF-I/R组比Control组、Sham组检测结果均高水平（P<0.05）;其中在指标LDH中,SDF-I/R组检测结果比I/R组低下（P<0.05）;在指标CK中,SDF-I/R组检测结果比I/R组低下（P<0.05）;在指标CK-MB中,SDF-I/R组检测结果比I/R组低下（P<0.05）。（2）检测炎症因子TNF-α、IL-6含量:I/R组和SDF-I/R组的TNF-α检测结果与Control组以及Sham组比较有升高,差异具有统计学意义（P<0.001）;而SDF-I/R组TNF-α检测结果比I/R组的TNF-α检测结果低下（P<0.001）;Sham组的IL-6检测结果与Control组比较有升高（P<0.001）;I/R组和SDF-I/R组的IL-6检测结果与Control组以及Sham组比较均有升高（P<0.001）;而SDF-I/R组IL-6检测结果较I/R组的IL-6检测结果低下（P<0.05）。（3）HE染色:大鼠目标心肌组织HE染色通过高倍显微镜下阅片比较各组结果,I/R组的结构最为紊乱,肌纤维有明显断裂,心肌核周空泡化、心肌间质水肿最明显;SDF-I/R组与I/R对比,其心肌排列较规整、断裂较少,组织间隙水肿较轻。（4）TTC染色:Control组、Sham组间比较,P>0.05,梗死面积差异无统计学意义;I/R组、SDF-I/R组与Control组、Sham组间两两比较,SDF-I/R组梗死面积大于Control组、Sham组（P<0.001）;而SDF-I/R组与I/R组比较,SDF-I/R组梗死面积小于I/R组（P<0.001）。（5）q PCR检测PI3K、AKT的m RNA表达量:PI3K的检测中Control组、Sham组扩增率之间的比较,差异无统计学意义（P>0.05）;SDF-I/R组表达水平比I/R组表达水平低下（P<0.001）;AKT的检测中Control组、Sham组的扩增率尚可认为差异有统计学意义（P=0.034<0.05）;I/R组检测水平结果高表达,SDF-I/R组表达水平比I/R组表达水平低下（P<0.001）。（6）Western Blot检测PI3K、AKT的蛋白水平:PI3K蛋白表达量的检测中,Control组、Sham组的表达量差异无统计学意义（P>0.05）,SDF-I/R组比Control组的表达量高（P<0.05）;I/R组表达量升高,而SDF-I/R组表达量比较I/R组表达结果低下（P<0.001）;AKT的检测中Control组、Sham组的表达量之间比较同样的差异无统计学意义（P>0.05）;I/R组、SDF-I/R组与Control组、Sham组比较表达量均有上调,SDF-I/R组表达量比Control组的表达量高（P<0.05）;SDF-I/R组与Sham组的表达量差异无统计学意义（P>0.05）;SDF-I/R组表达量比I/R组表达量低下（P<0.001）。结论:1.龙血竭总黄酮可能通过抑制肿瘤炎症因子TNF-α、IL-6释放的机制,在心肌缺血再灌注损伤大鼠中,保护心肌细胞组织结构的完整性,并能稳定心肌细胞膜功能结构,减少心肌酶LDH、CK、CK-MB的释放。2.心肌缺血再灌注损伤大鼠的PI3K/AKT信号通路被激活;前期干预的龙血竭总黄酮对心肌细胞组织损伤的保护作用,可能部分下调了PI3K/AKT信号通路的活化程度。
梁仪琳[4]（2021）在《龙血竭总黄酮对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞焦亡及NLRP3炎症小体表达的影响》文中提出目的:观察龙血竭总黄酮（Sanguis Draconis Flavones,SDF）对心肌缺血再灌注损伤（Myocardial Ischemia Reperfusion Injury,MIRI）大鼠心肌细胞焦亡（Pyroptosis）及核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（Nucleotide-binding Oligomerization Domain-like Receptor Protein 3,NLRP3）炎症小体表达的影响。方法:将60只SD大鼠随机分为正常（Normal）组、假手术（Sham）组、心肌缺血再灌注模型（MIRI）组、龙血竭总黄酮低剂量（SDF-L）组、龙血竭总黄酮中剂量（SDF-M）组、龙血竭总黄酮高剂量（SDF-H）组6组,SDF的给药剂量分别为90mg·kg-1、180mg·kg-1、360mg·kg-1,每组10只。连续经胃灌药14天,末次给药后制备大鼠心肌缺血再灌注模型。采用全自动生化分析仪测定血清肌酸激酶同工酶（Creatine Kinase-MB,CK-MB）、乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase,LDH）水平;苏木素-伊红（Hematoxylin-eosin,HE）染色法观察心肌损伤病理特征;2,3,5—氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride,TTC）染色法测定心肌梗死面积;脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（Terminal-deoxynucleotidyl Transferase Mediated Nick End Labeling,TUNEL）测定心肌细胞焦亡率;实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time Fluorescent Quantitative Polymerase Chain Reaction,q-PCR）法检测心肌组织NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）、凋亡相关斑点样蛋白（Apoptosis-associated Speck-like Protein Containing a CARD,ASC）、白细胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）的m RNA表达。结果:与Normal组、Sham组比较,MIRI组大鼠的CK-MB、LDH的水平、心肌梗死面积、心肌细胞焦亡率、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β的m RNA表达水平均明显升高（P<0.01）。与MIRI模型组比较,SDF不同剂量干预组大鼠的CK-MB、LDH水平,心肌梗死面积、心肌细胞焦亡率、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β的m RNA表达水平均明显降低（P<0.05或P<0.01）;HE染色结果表明,SDF各剂量组能明显改善大鼠再灌注损伤造成的心肌组织病理损伤,其中以中、高剂量组效果更明显。结论:SDF能明显减轻MIRI导致的心肌组织病理损伤及炎症反应、减少心肌梗死及细胞焦亡,对抗MIRI而发挥有效的保护作用,其作用可能与抑制心肌细胞焦亡及NLRP3炎症小体的表达有关。
王文俊[5]（2021）在《腺苷激酶及4-羟基壬烯醛在心脏缺血再灌注损伤中作用及机制研究》文中研究说明研究背景急性心肌梗死（Acute myocardial infarction,AMI）可能导致恶性心律失常、心源性休克、猝死等严重不良心血管事件,是威胁人类健康的主要原因之一。再灌注治疗,如溶栓和经皮冠状动脉介入治疗,能够开通堵塞的冠状动脉,恢复心脏组织血运,挽救缺血心脏组织,减少心肌梗死面积,改善患者预后。因此,再灌注治疗成为治疗AMI最有效的手段。然而,再灌注治疗本身也可对心脏组织产生损伤,即定义为心脏缺血再灌注损伤（Myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI）。MIRI主要表现为包括室性期前收缩、室性心动过速等在内的心律失常、心功能持续障碍、微血管阻塞和程序性心肌细胞死亡。在MIRI中程序性心肌细胞的死亡方式包括细胞凋亡、程序性坏死、焦亡、铁坏死等多种,其中以细胞凋亡和程序性坏死最为重要。已经证明再灌注引起的程序性心肌细胞的死亡可能会导致心肌梗死的面积最终增加近一倍。因此,减少再灌注引起的心肌细胞的死亡是减少缺血再灌注损伤的关键。但现仍未找到有效的减少心肌细胞死亡的方式。由此深入探讨心肌缺血再灌注损伤中细胞死亡发生与调节的机制,寻找有效的减轻缺血再灌注损伤的靶点和方法,是目前心肌保护领域的研究热点。腺苷激酶（Adenosinekinase,ADK）是人体内代谢腺苷的关键酶类之一。腺苷能够在缺血、低氧、创伤等条件下发挥细胞保护作用,有效防止缺血再灌注引起的心肌损伤。由于腺苷在体内半衰期很短等原因,因此腺苷至今仍未能有效地在临床用于预防心肌缺血再灌注损伤的治疗。ADK是哺乳动物细胞中表达量最多的核苷激酶之一,广泛表达在心脏、肝、脑等器官组织中。ADK可以将心肌细胞中大约90%的腺苷经转化为单磷酸腺苷（Adenosinemonophosphate,AMP）,因此,ADK活性的高低决定了心肌中腺苷的浓度。除此之外,ADK还有调节炎性物质表达,以及潜在的磷酸化激酶的作用。已经有研究证明ADK在癫痫发作、脑缺血过程中发挥了重要的作用。腺苷激酶在MIRI中是如何变化的,以及发挥了怎样的作用,如何发挥作用还未可知。研究目的本课题的主要目的在于探讨:1.抑制ADK对于MIRI的保护作用。2.抑制ADK是否可以减少MIRI中的细胞死亡。3.抑制ADK如何影响MIRI中的细胞死亡。研究方法我们在小鼠心脏缺血再灌注模型中抑制ADK活性或减少ADK表达后,以探究ADK对MIRI后心脏损伤以及心功能的影响,之后又探究了抑制ADK后对MIRI中细胞程序性死亡的作用。使用H9c2（大鼠心肌细胞系）以及乳大鼠原代心肌细胞构建缺氧/复氧（Hypoxia/reoxygenation,H/R）模型,围绕抑制ADK活性如何调节MIRI中细胞程序性死亡展开研究。（一）动物实验1.动物实验方案:方案一抑制ADK酶活性:将小鼠随机分为4组,分别为假手术组（sham组）,药物注射组（ABT702组）,缺血再灌注组（IR组）和缺血再灌注加药物注射组（ABT702+IR）。对于ABT702组和ABT702+IR组,在手术操作前半小时,给予ADK激酶抑制剂ABT702（2 mg/Kg）腹腔内注射。对于sham组和IR组在术前半小时给予同等剂量的DMSO。方案二减少ADK在体表达:将小鼠随机分为3组,分别为假手术组（sham组）,病毒对照组（AAV9-GFP+IR）,病毒组（AAV9-shADK+IR）。对于病毒组在术前3周,给小鼠经尾静脉注射带有心脏特异性启动子的AAV9-shADK,病毒对照组注射AAV9-GFP。在实验方案中,依据不同研究目调整最后取材时间。于MIRI后2 h取血测量LDH指标。于MIRI后24h取材测量心功能。其他指标于MIRI后4h取材进行检测。2.小鼠MIRI模型建立:选取6-8周龄左右成年C57BL/6雄性小鼠,开胸暴露心脏后用结扎线结扎左前降支30 min后,打开活结。对于假手术组,仅将线穿过动脉,但并不结扎,其余操作相同。分别于再灌注2h、4h、24h后,用0.8%戊巴比妥钠再次麻醉小鼠并取材。3.心功能的检测:使用小动物心脏彩超评价心功能。在小鼠MIRI后24 h进行测定,在小动物心脏超声M超模式下进行测定,通过检测数据计算心脏左室射血分数（Left ventricular ejection fraction,LVEF）和短轴缩短率（Left ventricular fraction shortening,LVFS）进行判断。4.心梗死面积和缺血危险区检测:心脏MIRI取材后,采用伊文氏蓝（Evansblue,EBD）和2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC）染色的方法观察心肌缺血危险区和梗死区。5.血浆乳酸盐脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）和腺苷同型半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine,SAH）检测:用EDTA抗凝采血管采血,将全血在4℃以2500 g离心15 min,收集上清后使用相应ELISA试剂盒检测。6.电镜检测:小鼠MIRI后于缺血再灌注区域取1立方微米心肌组织后用戊二醛溶液进行固定后,在山东大学电子显微镜中心使用透射电镜进行检测。7.心肌细胞凋亡检测:在动物实验中,将心肌组织取材后首先将组织浸泡于4%多聚甲醛进行固定,之后用石蜡包埋、切片。采用TUNEL免疫组化染色的方法检测凋亡心肌细胞数量。8.心肌细胞坏死检测:心肌组织中采用EBD和微囊蛋白（Caveolin 3,CaV3）联合免疫荧光染色法测定坏死细胞。9.蛋白检测:用心肌组织提取30μg蛋白后,利用10%-15%SDS-PAGE电泳进行分离、转膜、一抗、二抗孵育后进行检测。10.mRNA检测:提取心肌组织中RNA,通过RT-qPCR进行检测。11.统计分析:计量资料数据以均数±标准误（Means±SEM）表示,应用GraphPad Prism软件对面积大小、分子表达、活性等数据进行统计学分析,包括t检验、方差分析等,P<0.05为差异具有统计学意义。（二）细胞实验1.细胞实验方案:为了研究ADK对于MIRI中细胞死亡的作用及其机制,我们使用H9c2细胞和大鼠原代心肌细胞建立缺氧/复氧（Hypoxia/reoxygenation,H/R）模型,通过TUNEL染色和细胞流式术检测凋亡和坏死的细胞,此外检测了凋亡通路和坏死通路重要蛋白的调节情况。为了确定ADK是否通过连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP）来调节 MIRI 中的细胞死亡,我们使用XIAP蛋白的小干扰RNA,之后再检测细胞凋亡和程序性坏死比例以及凋亡和程序性坏死通路重要蛋白的调节情况。为了确定是通过腺苷通路上哪个受体发挥作用,首先通过PCR检测了 MIRI后受体的变化情况,之后用A2B受体的抑制剂,继而检测发生程序性坏死和凋亡的细胞数量。最后为了检测,ADK对MIRI中线粒体的影响,检测了线粒体膜电位,线粒体ROS产生以及线粒体通道转化孔的开放情况。2.细胞H/R处理:细胞饥饿12 h后放入缺氧培养箱（气体成分为94%氮气+5%二氧化碳+1%氧气）。将细胞放入缺氧培养箱培养12h后,放入正常培养箱后再培养1-4h,收取细胞。3.通过小干扰减少小鼠体内XIAP蛋白:通过对细胞转染XIAP小干扰,减少XIAP蛋白含量。4.线粒体活性氧的检测:使用MitoSOXRed检测线粒体ROS水平。5.线粒体膜电位检测:使用JC-1染色检测线粒体膜电位水平。6.细胞坏死检测:对于心肌细胞,用Annexin V/PI染色后用细胞流式分析仪分析测定坏死细胞。7.细胞凋亡检测:在细胞实验中,细胞爬片后,经过H/R刺激,用TUNEL免疫荧光方法进行H9c2心肌细胞的凋亡检测。8.ATP含量检测:细胞经相应处理后充分裂解并收集,使用ATP检测试剂盒对ATP进行检测,反应完成后使用多功能酶标仪对吸光度进行检测,并通过标准曲线标化后计算结果。9.线粒体通道转化孔检测:通过Calcein-AM和Cocl2共同染色检测线粒体通道转化孔开放的情况。10.蛋白、RNA检测:同动物实验步骤。11.统计分析:同动物实验步骤。研究结果1.在MIRI中抑制ADK活性可以减少心梗面积,改善心功能ADK在再灌注2-4 h一过性升高,在再灌注后6 h恢复正常。使用ADK激酶抑制剂ABT-702或干扰ADK体内表达可以明显减少MIRI后心肌梗死面积。ADK抑制剂同样可以减少血浆中LDH水平和改善心脏LVEF,LVFS指标。同样,电镜观察发现ADK抑制剂可以改善MIRI后肌节和线粒体损伤。此外我们也观察到,ADK抑制剂会减慢小鼠的心率,但对血压没有影响。2.抑制ADK活性可以减少小鼠MIRI中细胞凋亡和程序性坏死TUNEL染色发现,抑制ADK活性可以减少心脏组织缺血危险区凋亡细胞数量。此外抑制ADK活性可以减少caspase-8,caspase-9,caspase-3的增加,但对caspas-12没有影响。再者抑制ADK活性对Bax和Bcl-2的蛋白量没有调节作用,但是可以提高p-P38蛋白含量。EBD-CaV3染色发现ADK抑制剂使坏死细胞减少。且 ADK 抑制剂可以减少 RIP3,p-RIP3,MLKL,p-MLKL,p-CaMKII蛋白量,但是对RIP1,p-RIP1,CaMKⅡ蛋白量没有影响。3.抑制ADK活性可以减少H9c2 H/R模型中细胞凋亡和程序性坏死在细胞实验中我们同样可以观察到,抑制ADK活性可以减少凋亡细胞。且可以减少活化的caspase-9,caspase-8和caspase-3蛋白量。同样ADK抑制剂可以减少P38 MAPK的磷酸化,但对Bax,Bcl-2和MAPK的含量没有明显作用。细胞流式发现,ADK抑制剂减少了 H/R诱导的细胞程序性坏死,同时减少了程序性坏死通路的RIP3,p-RIP3,MLKL,p-MLKL和p-CaMKII蛋白量。4.抑制ADK活性对细胞凋亡和程序性坏死的调控是通过XIAP介导为了探讨ADK是如何调控细胞凋亡和坏死,实验结果发现,抑制ADK活性可以增加XIAP,p-XIAP的蛋白含量。此外ADK活性抑制可以增加p-AKT的蛋白含量。而使用AKT抑制剂MK-2206可以减少ADK抑制剂对XIAP,p-XIAP的作用。而使用siRNA干扰XIAP的表达后,也可以削弱ADK抑制剂对凋亡以及程序性坏死的调控。5.抑制ADK活性对于H/R诱导的细胞死亡的调节作用是由腺苷受体来介导使用腺苷受体抑制剂后可发现抑制ADK活性后对XIAP以及p-XIAP的调节作用消失。RT-qPCR检测小鼠组织和心肌细胞发现A2B的mRNA变化最为明显,其次为A1受体。使用A2B受体拮抗剂后发现抑制ADK活性后对XIAP和p-Akt、p-XIAP的调节作用以及对细胞凋亡和坏死的调节作用下降。6.抑制ADK活性可以改善H/R后线粒体功能,并且可以减少ROS的产生使用ADK活性抑制剂后可发现细胞H/R后线粒体膜电位的去极化减弱。Calcein-AM染色发现mPTP孔道的开放减少,此外线粒体ROS的生成减少,ATP的生成也可以被改善。电镜观察也可以发现抑制ADK活性可以改善心肌细胞处线粒体损伤和肿胀。研究结论1.抑制ADK激酶活性可以在MIRI中发挥保护心脏作用。2.抑制ADK减少MIRI中心肌细胞的凋亡和程序性坏死。3.抑制ADK可以通过腺苷受体A2B/Akt/XIAP发挥作用。4.ADK可以成为治疗MIRI的潜在靶点。研究背景由前述可知,再灌注治疗是急性心肌梗死（Acute myocardial infarction,AMI）最有效的治疗手段。然而再灌注本身也可导致心肌的损伤称为心脏缺血再灌注损伤（Myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI）。针对 MIRI 进行治疗,对于改善AMI患者愈后,减少患者心衰的发生具有重要的意义。而心肌细胞程序性死亡是MIRI中重要的环节,针对MIRI中的心肌细胞程序性死亡对于减轻MIRI损伤具有重要意义,而程序性坏死又是心肌细胞程序性死亡的重要的方式之一。4-羟基壬烯醛（4-hydroxynonenal,4-HNE）是细胞内毒性最强的醛类物质之一。4-HNE是脂质过氧化的重要产物。具有超强的生物反应活性,生成后可以迅速和细胞内磷脂,核酸,蛋白发生加成反应,影响其生物功能。在生理状态下4-HNE的浓度为0.3-5 μM,并在多种生理功能中起到信号调节因子的作用。在氧化应激的情况下,4-HNE可以增加10-100倍,并通过抑制基因表达和修饰蛋白从而发挥细胞毒性作用。在MIRI损伤中,4-HNE可以增加为原来的6倍。已知.4-HNE对于MIRI中细胞凋亡、自噬都有着调节作用,但其对MIRI中细胞程序性坏死的调节作用以及如何发挥这种调节作用还未可知。研究目的本课题的主要目的在于探讨:1.在MIRI中程序性坏死和4-HNE的变化。2.4-HNE是否调节MIRI中程序性坏死。3.4-HNE通过何种机制调节MIRI中程序性坏死。研究方法我们采用小鼠心脏缺血再灌注模型以及离体心脏灌流模型研究了减少或增加4-HNE后对MIRI中细胞程序性坏死的影响;使用大鼠心肌细胞系H9c2,围绕提高4-HNE如何调节MIRI中细胞程序性坏死展开研究。（一）动物实验1.动物实验方案:在体小鼠心脏缺血再灌注模型:将6-8周C57BL/6小鼠（Wide type,WT）和乙醛脱氢酶过表达小鼠（ALDH2-transgenic,ALDH2-Tg）随机分为3组,分别为假手术组（sham组）,缺血再灌注组（I/R组）和乙醛脱氢酶过表达+缺血再灌组（ALDH2-Tg+I/R）。离体小鼠灌流模型:将6-8周C57BL/6小鼠随机分为2组,分别为假手术组（sham 组）,4-HNE 灌流组。2.小鼠心脏缺血再灌注模型的建立:同前构建小鼠缺血再灌注模型和假手术模型。在结扎后30 min,恢复冠脉血流,之后4 h用0.8%戊巴比妥钠麻醉小鼠并取材。3.离体小鼠心脏灌流模型:取6-8周成年雄性C57BL/6小鼠,注射戊巴比妥钠肝素溶液,将小鼠进行麻醉以及肝素化。小鼠固定后,由剑突下开胸并迅速分离心脏。将心脏置于4℃Krebs-Henseleit（KH）液中清洗并分离主动脉。将主动脉连接到Langendorff离体心脏灌流系统,以恒温（37℃）KH缓冲液进行灌流。切开左心耳,将充水的乳胶球囊插入,另一端连接压力转换器,并由Labchart对信号进行分析。将心脏固定到Langendorff离体心脏灌流系统后稳定20 min,继而根据分组不同用含有4-HNE或者安慰剂的KH液进行灌流。稳定灌流1 h后收集心脏。4.心功能的检测:用小动物心脏超声机检测小鼠心脏LVFS,LVEF指标,反应检测小鼠MIRI后24 h心功能情况。5.心梗死面积和缺血危险区检测:心脏MIRI取材后,采用伊文氏蓝（Evansblue,EBD）和 2,3,5-三苯基氯化四氮唑染色（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC）的方法观察心肌缺血危险区和梗死区。6.血浆乳酸盐脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）检测:用EDTA抗凝采血管采血,将全血在4℃以2500 g离心15 min,收集上清后使用相应ELISA试剂盒检测。7.心肌细胞坏死检测:心肌组织中采用EBD和微囊蛋白（Caveolin 3,CaV3）联合免疫荧光染色法测定坏死细胞。8.免疫组化:心脏组织经石蜡包埋切片后,经烤片、梯度酒精脱蜡后,牛血清白蛋白（Bovine serum albumin,BSA）封闭后,一抗、二抗孵育。最后3,3氮二氨基联苯胺盐酸盐（3,3N-diaminobenzidine tetrahydrochloride,DAB）显色后苏木素染核。显微镜观察后拍照分析。9.蛋白检测:提取30μg蛋白后,利用10%-15%SDS-PAGE电泳、转膜、一抗、二抗孵育后进行检测。10.免疫共沉淀:通过免疫共沉淀的方法检测蛋白-蛋白之间相互作用。通过正常步骤提取蛋白后,将蛋白先后和一抗、beads共同孵育。孵育结束后,离心弃上清,加入稀释好的1xloadingbuffer,加热后同上蛋白检测步骤进行检测。11.mRNA检测:取心肌组织中RNA,通过RT-qPCR进行检测。12.统计分析:计量资料数据以均数±标准误（MeanSEM）表示,应用GrapPad Prism软件对面积大小、分子表达、活性等数据进行统计学分析,包括t检验、方差分析等,P<0.05为差异具有统计学意义。（二）细胞实验1.细胞实验方案:为了研究4-HNE对于MIRI中细胞程序性死亡的作用及其机制,我们使用H9c2细胞并给予不同浓度和不同时间梯度的4-HNE刺激,检测了细胞程序性坏死以及程序性坏死通路相关蛋白的调节情况。为了确定4-HNE是否通过RIP1蛋白来调节MIRI中的细胞死亡,我们使用RIP1蛋白的小干扰RNA,之后再检测细胞坏死情况以及程序性坏死通路上相关蛋白的调节情况。之后为了明确,4-HNE是如何调节RIP1蛋白含量的,检测了 RIP1蛋白的mRNA水平以及蛋白代谢率还有其泛素化修饰情况。2.细胞4-HNE处理:细胞饥饿12 h后根据实验目的给予不同浓度4-HNE（20μM,40 μM,60 μM,80 μM）培养 1-6 h,收取细胞。3.细胞缺氧/复氧（H/R）模型建立:细胞饥饿12 h后放入缺氧培养箱（气体成分为94%氮气+5%二氧化碳+1%氧气）进行缺氧处理。将细胞缺氧培养12 h后,在正常条件下再培养1-6h,收取细胞。4.心肌细胞坏死检测:对于心肌细胞,用Annexin V/PI染色后用细胞流式分析仪分析测定坏死细胞。5.通过小干扰减少小鼠体内RIP1蛋白:通过对细胞转染RIP1小干扰,减少RIP1蛋白含量。6.蛋白检测和免疫共沉淀:同动物实验。7.统计分析:同动物实验。研究结果1.MIRI增加了小鼠心脏中的细胞程序性坏死和4-HNE产生EBD-CaV3双染结果显示,MIRI后,心肌坏死面积增加。此外,体内体外结果显示坏死通路 RIP1,p-RIP1,RIP3,p-RIP3,MLKL,p-MLKL,p-CaMKII在MIRI后均升高。同时,我们用免疫印迹的方法和免疫组化的方法证明了 MIRI后心脏组织处4-HNE的上升。在细胞实验中也应证了这个结果。2.减少4-HNE水平可以减轻MIRI中的程序性坏死在ALDH2-Tg小鼠中,MIRI损伤后4-HNE含量下降。同时,ALDH2-Tg可以改善MIRI后心功能。此外,ALDH2过表达可以减少MIRI后心梗面积和血浆LDH含量。EBD-CaV3染色显示MIRI后心脏坏死面积在ALDH2-Tg小鼠中缩小。与此同时,RIP1,p-RIP1,RIP3,p-RIP3,MLKL,p-MLKL,p-CaMKII也在ALDH2-Tg小鼠中下降。免疫共沉淀显示,MIRI后坏死小体的形成也在ALDH2-Tg小鼠中下降。3.在离体灌流模型中,4-HNE刺激增加离体心脏中的细胞程序性坏死免疫组化以及免疫荧光显示在4-HNE灌流的心脏中,4-HNE的含量明显上升。此外,LVDP,dp/dt结果显示4-HNE灌流后心功能下降。同时,免疫印迹显示 4-HNE 灌流增加了心脏组织中RIP1,p-RIP1,p-RIP3,MLKL,p-MLKL,和p-CaMKII的蛋白含量以及坏死小体的形成。4.4-HNE刺激增加H9c2细胞的程序性坏死细胞流式结果显示,4-HNE刺激后造成H9c2细胞坏死增加。同时不同时间梯度4-HNE进行刺激时,RIP1,p-RIP1,和p-RIP3呈梯度递增。而以不同浓度4-HNE 刺激时,RIP1,p-RIP1,p-RIP3,MLKL,p-MLKL,和 p-CaMKII 呈梯度递增。5.4-HNE刺激对心肌程序性坏死的调节是通过RIP1介导的为了明确RIP1蛋白的作用,用RIP1小干扰减少RIP1蛋白表达。细胞流式术显示减少RIP1蛋白可以减低4-HNE刺激下细胞程序性坏死的发生。通过蛋白免疫印迹法也可发现4-HNE刺激下p-RIP1,p-RIP3,MLKL,p-MLKL和p-CaMKII等蛋白的上升可以被RIP1 siRNA减弱。6.4-HNE刺激可以减少RIP1蛋白的泛素依赖性降解RT-qPCR发现4-HNE刺激后RIP1 mRNA含量没有明显改变。用放线菌酮（Cycloheximide,CHX）抑制DNA转录后发现4-HNE可以减少RIP1蛋白的降解。同时蛋白共沉淀检测RIP1蛋白的k-48多聚泛素化发现4-HNE可以减少RIP1的K-48多聚泛素化修饰。同时我们检测了 cIAP1,cIAP2E3泛素连接酶和RIP1蛋白的结合,发现4-HNE并不影响RIP1蛋白和泛素连接酶之间的结合。因此可以推断4-HNE可以减少RIP1和泛素之间的结合。同时,4-HNE可以使RIP1蛋白的羰基化修饰增加。研究结论1.4-HNE可以增加MIRI中细胞程序性坏死。2.4-HNE通过提高RIP1增加MIRI中细胞程序性坏死。3.4-HNE通过减少RIP1蛋白的K-48多聚泛素化依赖性途径降解,增加细胞程序性坏死。
李晨[6]（2021）在《电针预处理对心肌缺血再灌注大鼠的保护作用及FXR/SHP通路的调控作用》文中研究说明目的 基于“中医治未病”思想及“心胸内关谋”经典理论,在前期研究基础上,以心肌缺血再灌注损伤模型大鼠为研究对象,从细胞凋亡、细胞焦亡以及细胞自噬的角度出发,观察电针“内关”“足三里”“关元”穴预处理对心肌缺血再灌注大鼠的保护作用及其作用机制。并借用FXR/SHP凋亡信号通路激动剂GW4064及抑制剂Z-guggulsterone从FXR/SHP信号转导通路的角度探讨其作用机制,以及细胞凋亡、焦亡和自噬的联系,为电针预处理防治MIRI提供新的理论依据和治疗靶点。方法 一理论探讨:以中医学和现代医学理论为基础,从心肌细胞焦亡、自噬及凋亡角度出发,探讨电针预处理对心肌缺血再灌注大鼠的保护作用及其机制;从FXR/SHP凋亡信号通路的角度出发,探讨FXR/SHP通路对心肌细胞凋亡、焦亡以及自噬的影响及其作用机制,以及三者间的联系。二动物实验:将Wistar大鼠80只（雄性,SPF级）按照“随机数字表法”进行随机分组,平均分为4组,分别是:正常组（N组）、假手术组（S组）、模型组（M组）和电针预处理组（EA组）,20只为一组。所有实验动物适应性喂养1周后,开始正式实验。通过左侧冠状动脉结扎法制备MIRI大鼠模型,每组大鼠给予相应的干预措施。再增加40只Wistar大鼠（雄性,SPF级）,随机分为2组,每组20只,分别为电针+GW4064激动剂组（EA+GW组）和电针+z-Guggulsterone抑制剂组（EA+Z组）,每组大鼠给予相应的干预措施。实验1:采用HE染色观察各组心肌组织的形态结构;采用TTC染色测量各组心肌梗死面积和心肌梗死质量;采用TUNEL染色计算各组心肌细胞凋亡指数,采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验法（ELISA法）进行各组心肌损伤标志物（LDH、CK和c Tn I）的测定;从而探讨电针预处理对MIRI大鼠的保护作用。实验2:采用Western-blot法检测各组NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D蛋白等焦亡相关指标的表达,初步探讨电针预处理对MIRI大鼠心肌细胞焦亡通路的调节作用实验3:采用Western-blot法检测各组Beclin1、LC3I、LC3Ⅱ蛋白表达以及LC3Ⅱ/LC3I比值,研究电针预处理对心肌细胞的保护作用,初步探讨电针预处理对MIRI大鼠心肌细胞自噬通路的调节作用。实验4:采用Western-blot法检测各组Bcl-2、Bax蛋白表达,同时用荧光定量PCR法检测各组Caspases-9m RNA、Caspases-3m RNA表达,研究电针预处理对MIRI大鼠模型的保护作用,初步探讨电针预处理对MIRI大鼠心肌细胞凋亡通路的调节作用。实验5:采用TUNEL染色法计算各组心肌细胞凋亡指数,采用荧光定量PCR法检测凋亡相关指标FXRm RNA、SHPm RNA表达,采用Western-blot法检测各组凋亡相关指标Bcl-2、Bax、Caspase3蛋白表达,焦亡相关指标Gasdermin D、IL-1β、IL-18蛋白表达以及自噬相关指标Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值,探讨电针预处理对MIRI模型大鼠FXR/SHP信号通路的影响,以及FXR/SHP信号通路对细胞凋亡、焦亡、自噬的影响及三者间的联系。结果 实验1电针预处理对MIRI大鼠心肌损伤标志物、心肌细胞凋亡指数及形态学影响（1）HE染色:光镜下观察与比较各组大鼠心肌细胞形态学结果如下:N组和S组大鼠心肌纤维走向整齐,横纹清晰可见,细胞结构完整,形态正常,无炎性浸润,细胞核位置正常,无空泡样变性;M组心肌纤维走形紊乱、可见心肌纤维断裂现象,心肌细胞结构不完整,炎性细胞浸润明显,可见空泡样变性;EA组大鼠心肌组织大体形态正常,破坏减轻,心肌纤维排列稍显杂乱,少许纤维断裂,少量炎性细胞浸润,少量细胞水肿坏死。表明电针预处理能有效缓解心肌缺血再灌注模型大鼠心肌组织损伤。N组和S组大鼠心肌纤维走向整齐,横纹清晰可见,细胞结构完整,形态正常,无炎性浸润,细胞核位置正常,无空泡样变性;M组心肌纤维走形紊乱、可见心肌纤维断裂现象,心肌细胞结构不完整,炎性细胞浸润明显,可见空泡样变性;EA组大鼠心肌组织大体形态正常,破坏减轻,心肌纤维排列稍显杂乱,少许纤维断裂,少量炎性细胞浸润,少量细胞水肿坏死。表明电针预处理能有效缓解心肌缺血再灌注模型大鼠心肌组织损伤。（2）心肌梗死面积:与N组相比较,S组梗死面积变化不大,差异无统计学意义（P>0.05）;与N组相比较,M组的梗死面积显着增加（P<0.01）;与M组相比较,EA组的梗死面积显着减小（P<0.01）。（3）心肌梗死质量;与N组相比较,S组梗死质量变化不大,差异无统计学意义（P>0.05）;与N组相比较,M组的梗死质量显着增加（P<0.01）;与M组相比较,EA组的梗死质量显着减小（P<0.01）。（4）心肌细胞凋亡指数:N组和S组心肌组织中,可见极少量凋亡细胞核,M组中存在大量凋亡细胞,细胞核形态不规则,成碎片状,EA组可见少量凋亡细胞核。与N组和S组比较,M组心肌细胞凋亡指数明显上升（P<0.01）,与M组比较,EA组心肌细胞凋亡指数明显下降（P<0.01）。（5）血清LDH、CK、c Tn I含量:与N组相比较,S组血清LDH、CK、c Tn I含量变化不大,差异均无统计学意义（均P>0.05）;与N组比较,M组、EA组血清LDH、CK、c Tn I含量均上调（均P<0.01）,EA组血清LDH、CK、c Tn I含量均低于M组（均P<0.01）。实验2电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠焦亡通路的调控作用（1）心肌组织NLRP3、ASC蛋白表达情况:与N组、S组相比较,M组、EA组的NLRP3、ASC蛋白表达均升高（均P<0.05）,与M组比较,EA组NLRP3、ASC蛋白表达均显着下降（均P<0.05）。（2）心肌组织Caspase-1、Gasdermin D蛋白表达情况:与N组、S组相比较,M组、EA组的Caspase-1、Gasdermin D蛋白表达均升高（均P<0.05）,与M组比较,EA组Caspase-1、Gasdermin D蛋白表达均显着下降（均P<0.05）。实验3电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠自噬通路的调控作用（1）心肌组织Beclin-1蛋白表达情况:与N组、S组比较,M组、EA组Beclin-1蛋白表达明显升高（P<0.05）,与M组相比,EA组Beclin-1蛋白表达明显降低（P<0.05）。（2）心肌组织LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值情况:与N组、S组比较,M组、EA组LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明显升高（均P<0.05）,与M组相比,EA组LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明显降低（P<0.05）。实验4电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠细胞凋亡的影响（1）心肌组织Bcl-2蛋白表达情况:与N组、S组比较,M组、EA组Bcl-2蛋白表达水平均下降（均P<0.05）。与M组比较,EA组Bcl-2蛋白表达水平显着升高（P<0.05）。（2）心肌组织Caspases-9m RNA、Caspases-3m RNA及Bax蛋白表达情况:与N组、S组比较,M组和EA组Caspase-9m RNA、Caspases-3m RNA及Bax蛋白表达显着升高（均P<0.05）,与M组比较,EA组的Caspase-9m RNA、Caspases-3m RNA及Bax蛋白表达水平均显着降低（均P<0.05）。实验5电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠FXR/SHP信号通路的影响（1）心肌细胞凋亡指数:与N组、S组比较,M组、EA组、EA+GW组、EA+Z组心肌细胞凋亡指数明显升高（P<0.05）;与M组比较,EA组、EA+GW组、EA+Z组心肌细胞凋亡指数均明显降低（均P<0.05）;与EA组比较,EA+Z组心肌细胞凋亡指数明显下降（P<0.05）,EA+GW组心肌细胞凋亡指数明显升高（P<0.05）。（2）心肌组织FXRm RNA、SHPm RNA表达情况:与N组、S组比较,M组、EA组及EA+GW组大鼠心肌细胞FXRm RNA、SHPm RNA表达水平均明显升高（均P<0.05）;与M组比较,EA组、EA+GW组、EA+Z组的FXRm RNA、SHPm RNA表达均有显着性降低（均P<0.05）;与EA组比较,EA+Z组FXR、SHPm RNA表达水平显着降低（P<0.05）,EA+GW组FXR、SHPm RNA表达水平明显升高（P<0.05）。（3）心肌组织Bcl-2、Bax、Caspases-3蛋白表达情况:与N组、S组比较,M组、EA组、EA+GM组及EA+Z组大鼠心肌细胞Bcl-2蛋白表达水平均下降（均P<0.05）,Bax、Caspase-3蛋白表达水平均显着升高（均P<0.05）。与M组比较,EA组、EA+GW组及EA+Z组的Bcl-2蛋白表达水平均明显升高（均P<0.05）,Bax、Caspase-3蛋白表达水平均明显降低（均P<0.05）,与EA组比较,EA+Z组Bcl-2蛋白表达水平显着升高（P<0.05）,EA+GW组Bax、Caspases-3蛋白表达水平均显着降低（均P<0.05）。（4）心肌组织Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值情况:与N组、S组比较,M组、EA组、EA+GW组及EA+Z组Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明显升高（均P<0.05）,与M组相比,EA组、EA+GW组及EA+Z组Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明显降低（均P<0.05）,与EA组比较,EA+Z组Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均显着降低（均P<0.05）,EA+GW组均显着升高（均P<0.05）。（5）心肌组织Gasdermin D、IL-1β、IL-18蛋白表达情况:与N组、S组比较,M组、EA组、EA+GW组及EA+Z组大鼠心肌细胞Gasdermin D、IL-1β、IL-18蛋白表达水平均明显升高（均P<0.05）;与M组比较,EA组、EA+GW组及EA+Z组的Gasdermin D、IL-1β、IL-18蛋白表达均有显着性降低（均P<0.05）;与EA组比较,EA+Z组Gasdermin D、IL-1β、IL-18蛋白表达水平均显着降低（均P<0.05）,EA+GW组均显着升高（均P<0.05）。结论 1.电针预处理能使MIRI模型大鼠心肌梗死面积及梗死程度明显下降,降低凋亡指数,病理形态学检测提示电针可显着改善受损心肌组织的病理损害程度。2.电针预处理能下调MIRI模型大鼠血清中LDH、CK及c Tn I的含量,保护大鼠心肌组织。3.电针预处理能抑制MIRI模型大鼠NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D蛋白表达,通过抑制细胞焦亡,保护心肌组织。4.电针预处理能抑制MIRI模型大鼠Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值过度升高,通过抑制细胞过度自噬,保护心肌组织。5.电针预处理能下调MIRI模型大鼠Bax蛋白表达、Caspases-9m RNA、Caspases-3m RNA表达,上调Bcl-2蛋白表达,通过抑制细胞凋亡,保护心肌组织。6.电针预处理能通过抑制FXR/SHP凋亡信号通路从而抑制心肌细胞凋亡,抑制凋亡,能起到抑制细胞焦亡和抑制细胞过度自噬的作用,从该角度探讨三者间的联系,进一步说明电针预处理对MIRI的保护机制可能是多层次、多途径的综合效应。
熊伟[7]（2021）在《肥大细胞参与右美托咪定心脏保护效应的炎性调控机制研究》文中研究指明第一部分右美托咪定在体外循环心脏瓣膜置换术中的心脏保护效应:随机对照双盲研究[目的]探讨右美托咪定在体外循环心脏瓣膜置换术中的心脏保护作用。[方法]选取择期体外循环下行主动脉瓣或二尖瓣机械瓣膜置换术的40例成年患者,随机对照双盲分为2组（N=20例/组）,对照组（CON组）给予等体积0.9%氯化钠注射液持续泵注;右美托咪定组（DEX组）在麻醉诱导前10 min内予以右美托咪定1 μg/kg负荷量,然后0.5μg/kg/h持续泵注至术毕。统计两组患者的一般资料。观察注射负荷量药物、切皮、锯开胸骨前后SBP及HR变化情况,注射负荷量药物后高血压、低血压和严重心动过缓发生率,血管活性药物使用情况,以及术后主要心血管不良事件（PMACE）发生率。在术前和术后检测血常规,在术前、停机时、术毕和出ICU时检测患者外周血中cTnI和TPS浓度。采用多元logistic回归分析术后cTnI、TPS和NLR预测PMACE的准确性。[结果]两组患者间一般资料无统计学差异（P>0.05）。注射负荷量药物后,SBP和HR变化率DEX组高于CON组;但切皮和锯开胸骨后,SBP和HR变化率DEX组低于CON组（P<0.05）。DEX组较CON组的高血压和严重心动过缓发生率高,而低血压发生率低（P<0.05）。去氧肾上腺素使用率和多巴胺使用量,DEX组低于CON组;而阿托品使用率,DEX组高于CON组（P<0.05）。DEX组的低心排综合征和恶性心律失常发生率较CON组低（P<0.05）。与CON组比较,DEX组在停机时、术后即刻和出ICU前的外周血中cTnI和TPS的浓度降低（P<0.05）,且 cTnI 和 TPS 呈正相关（R2>0.9）。NEUT、MONO 和 WBC绝对值变化率DEX组高于CON组,而LYMPH绝对值和NLR变化率DEX组低于CON组（P<0.05）。单独使用NLR、TPS和cTnI预测PMACE具有较高准确性（AUC分别为0.831、0.833和0.848）。另外,联合使用NLR、TPS和cTnI构建多元回归模型用于预测PMACE可以提高预测的准确性,其中联合cTnI和NLR,TPS 和 NLR,cTnI、TPS 和 NLR 的 AUC 分别为 0.902、0.892和 0.895。[结论]右美托咪定治疗体外循环下心脏瓣膜置换术患者可抑制切皮和开胸刺激,减少术中血管活性药物使用率和术后心血管不良事件发生率,降低术后cTnI、TPS和NLR,联合cTnI、TPS和NLR在预测PMACE中具有一定准确性。第二部分右美托咪定预处理抑制肥大细胞脱颗粒对抗大鼠在体心肌缺血/再灌注损伤[目的]探讨右美托咪定预处理抑制肥大细胞脱颗粒对抗大鼠在体心肌缺血/再灌注（Ischemia/reperfusion,I/R）损伤（Myocardial ischemia/reperfusion injury,MIRI）的保护机制。[方法]采用结扎冠状动脉左前降支30min（缺血）和再通120min（再灌注）构建大鼠在体心肌缺血/再灌注损伤模型,分别予以右美托咪定和肥大细胞促分泌剂C48/80处理。在体预实验分为五组（N=6只/组）,Sham组、MIRI组、Group Ⅰ 组（C48/80 0.1 mg/kg.i.v.）、Group Ⅱ 组（C48/80 0.5mg/kg.i.v.）和 GroupⅢ组（C48/80 1 mg/kg.i.v）。在体正式实验分为五组（N=12只/组）,Sham组、I/R 组、DEX+I/R 组（DEX20 μg/kg.i.v.）、C48/80+I/R 组（C48/800.5 mg/kg.i.v.）和 DEX+C48/80+I/R 组（DEX 20 μg/kg.i.v.+C48/80 0.5 mg/kg.i.v.）。观察术中血流动力学和心律失常,以及术后左心室功能改变,并采用TTC法、ELISA法、透射电镜、HE染色、甲苯胺蓝和TUNEL染色,以及免疫组化染色、QRT-PCR和Western blot进行检测。[结果]结扎冠状动脉左前降支缺血30 min和再灌注120 min成功构建大鼠在体MIRI模型,C48/80在一定范围内（0.1、0.5、1.0mg/kg.i.v.）可以加重I/R损伤,且呈剂量依赖性。与Sham组比较,I/R组术中血流动力学紊乱和心律失常严重程度评分明显升高,术后左心室功能障碍和心肌梗死面积比明显增加,cTnl和TPS含量明显升高;而这些损伤在C48/80+I/R组中明显加重,在DEX+I/R组中明显减轻（P<0.05）。另外,I/R组较Sham组病理组织学评分和肥大细胞脱颗粒比明显升高,心肌纤维波状扭曲、水肿,炎性细胞浸润,左室心肌和冠状动脉超微结构明显损伤,在右美托咪定预处理后有所改善,但C48/80可以加重这种损伤。然而,这些损伤在DEX+C48/80+I/R组中较C48/80+I/R组部分逆转。与Sham组比较,I/R组细胞凋亡率升高,心肌组织中HMGB1、TLR4和NF-κB p65的阳性细胞率、mRNA和蛋白相对表达量明显升高（P<0.05）。与I/R组比较,DEX+I/R组中这些改变被部分逆转,而C48/80+I/R组中加剧了这些改变（P<0.05）。另外,DEX+C48/80+I/R组中较C48/80+I/R组细胞凋亡率和HMGB1、TLR4和NF-κBp65表达水平明显降低（P<0.05）。[结论]右美托咪定预处理可能通过抑制肥大细胞脱颗粒,抑制炎性相关因子级联释放和心肌细胞凋亡,从而对抗大鼠在体I/R损伤。第三部分右美托咪定预处理抑制心脏常驻肥大细胞脱颗粒减轻大鼠离体心肌缺血/再灌注损伤[目的]探讨右美托咪定预处理抑制心脏常驻肥大细胞脱颗粒减轻大鼠离体MIRI的保护机制。[方法]采用大鼠离体心脏Langendorff灌流模型停止灌注30 min（全心缺血）和复灌60 min（再灌注）构建大鼠心脏离体MIRI模型。离体预实验分为五组（N=6 只/组）,Control 组、MIRI 组、GroupⅠ 组[（C48/80 1 μg/mL×5 min+KHB × 5 min）× 4]、Group Ⅱ 组（C48/80 1 μg/mL × 5 min+KHB × 5 min）和 GroupⅢ组（20 μg C48/80）。离体正式实验分为五组（N=12只/组）,Control组、I/R组、DEX+I/R 组（10 nM DEX × 30 min）、C48/80+I/R 组（C48/80 1 μg/mL × 5 min）和 DEX+C48/80+I/R 组（10 nM DEX × 30 min+C48/80 1μg/mL × 5 min）。观察血流动力学、心律失常和心肌水含量改变,并采用TTC法、ELISA法、透射电镜、HE染色、甲苯胺蓝和TUNEL染色,以及免疫组化染色、QRT-PCR和Western blot进行检测。[结果]大鼠离体心脏Langendorff灌流模型停止灌注30 min（全心缺血）和复灌60 min（再灌注）成功构建大鼠离体MIRI模型。离体预实验中Group I组中反复的C48/80干预洗脱,可改善MIRI引起的血流动力学紊乱、心律失常、心肌水肿和梗死,而Group Ⅱ和Group Ⅲ经短时程C48/80干预激发肥大细胞脱颗粒,可加重I/R损伤（P<0.05）。离体正式实验中,与Control组比较,I/R组血流动力学紊乱、心律失常、心肌水肿和梗死升高,cTnI和TPS含量升高（P<0.05）。I/R组较Control组病理组织学评分和肥大细胞脱颗粒比升高,心肌纤维波状扭曲、水肿,炎性细胞浸润,左室心肌和冠状动脉超微结构明显损伤。与Control组比较,I/R组细胞凋亡率升高,心肌组织中HMGB1、TLR4和NF-κBp65的阳性细胞率、mRNA和蛋白相对表达量升高（P<0.05）。上述改变在右美托咪定预处理后有所改善,但C48/80可以加重这种损伤;同时,DEX+C48/80+I/R组较C48/80+I/R组上述改变被部分逆转（P<0.05）。[结论]右美托咪定预处理可能通过抑制心脏常驻肥大细胞脱颗粒,抑制炎性相关因子级联释放和心肌细胞凋亡,从而对抗大鼠离体I/R损伤。第四部分 右美托咪定预处理抑制肥大细胞脱颗粒介导的心肌细胞损伤[目的]探讨右美托咪定预处理抑制肥大细胞脱颗粒介导的心肌细胞损伤的保护机制。[方法]构建大鼠心肌细胞H9C2（2-1）和大鼠肥大细胞RBL-2H3共培养体系,分别予以右美托咪定10 nM和肥大细胞促分泌剂C48/80 10 μg/mL预处理。实验分为三组（N=6孔/组）:S组（不予以任何药物处理）、C组（C48/8010μg/mL 干预 30 min）和 DC 组（10 nM DEX 预处理 60 min,然后 C48/80 10μg/mL干预30min）。倒置显微镜观察细胞形态学改变,MTT法检测细胞活性,流式细胞仪及TUNEL染色检测细胞凋亡率,ELISA法检测培养上清液中心肌损伤标志物cTnI和肥大细胞标志物TPS含量,细胞免疫组织化学染色、QRT-PCR和Western blot检测心肌细胞中HMGB1、TLR4和NF-κBp65的阳性细胞率、mRNA和蛋白的相对表达量。[结果]C组较S组的H9C2（2-1）和RBL-2H3细胞活性明显下降,细胞凋亡率明显升高,cTnI和TPS释放明显升高,而右美托咪定预处理后DC组可部分抑制（P<0.05）。另外,C组较S组的心肌细胞中HMGB1、TLR4和NF-κB p65的阳性细胞率、mRNA和蛋白相对表达量明显增加,而右美托咪定预处理后DC组中降低（P<0.05）。[结论]右美托咪定预处理可能通过抑制肥大细胞脱颗粒以及炎性相关信号通路HMGB1/TLR4/NF-κB,从而减轻肥大细胞脱颗粒介导的心肌细胞损伤。
胡文锋[8]（2021）在《14-3-3γ/phospho-GSK3β/β-catenin通路在内毒素耐受交叉保护SD大鼠心肌缺血/再灌注损伤的机制研究》文中指出目的:在动物水平上揭示受14-3-3γ/phospho-GSK3β/β-catenin调控的炎症相关信号通路网络,以进一步阐明内毒素耐受交叉保护心肌I/R损伤的主要机制,从抗炎角度为防治心脏I/R的损伤提供新的靶点。方法:我们采用的是SD大鼠,心肌内注射转染慢病毒,构建整体I/R损伤模型。分组为:Sham group;I/R group;LPS+I/R group;NC+LPS+I/R group;siRNA14-3-3γ+LPS+I/R group,其中每组各10只进行试验。1.首先构建了siRNA-14-3-3γ慢病毒,然后采用心肌内5点注射法使大鼠心脏转染带绿色荧光（GFP）的阴性对照（negative control,简称NC）慢病毒。作为对照,我们以同样的方法使大鼠心脏转染不带绿色荧光的阴性对照慢病毒。15天后,取心肌样本用OCT包埋后做冰冻切片。在固定曝光时间的条件下,观察各组荧光表达情况。2.为了寻找最合适的病毒转染剂量,我们分别将不同剂量的siRNA-14-3-3γ慢病毒转染至大鼠左心室心肌内,并以假手术组和心肌内注射阴性对照慢病毒组为对照。15天后取心肌组织提取蛋白,检测14-3-3γ表达情况,根据沉默目的蛋白效果较好且大鼠能承受的剂量作为慢病毒转染剂量。3.为了构建内毒素耐受保护模型,我们腹腔注射不同剂量的LPS进行预处理,24 h后行I/R损伤处理,检测心肌组织14-3-3γ表达情况,筛选出能使14-3-3γ蛋白表达量最高的给药剂量,从而构建内毒素耐受保护模型。4.1%TTC染色法检测在不同处理下心肌的梗死面积,HE染色法评估心肌细胞的损伤情况,TUNEL法检测心肌细胞的凋亡情况,并采用Western Blotting法检测14-3-3γ、phospho-GSK3β和β-catenin蛋白在不同处理下的表达情况及采用免疫共沉淀法检测14-3-3γ与phospho-GSK3β之间的相互作用关系。5.提取各处理组的血清之后,检测血清中LDH、GSH-PX、SOD和MDA的活性;最后用Elisa法检测TNF-α和IL-6的分泌水平。结果:1.我们构建的siRNA-14-3-3γ慢病毒序列为Ywhag-RNAi（44876-1）,在同样曝光时间内,我们观察到注射不带荧光阴性空载慢病毒的心肌组织冰冻切片无明显荧光,而注射带绿色荧光阴性空载慢病毒的心肌组织冰冻切片有明显的绿色荧光。证实心肌内5点注射法能将慢病毒成功转染至大鼠心肌内。2.经不同剂量慢病毒注射后检测心肌14-3-3γ表达情况,结果显示当心肌内注射病毒剂量为60μL（病毒滴度:5×10?8 TU/m L）时,对14-3-3γ表达有明显沉默效果,且阴性对照组慢病毒对14-3-3γ蛋白表达无明显影响。3.经不同剂量的LPS预处理后,取心肌组织采用Western Blotting法检测14-3-3γ表达情况,结果显示:当我们预处理给予的LPS剂量为0.5mg/kg时,14-3-3γ表达水平最高。前期我们实验已经证实当给予小剂量LPS预处理后,14-3-3γ蛋白表达水平增加,故我们选取预先给予的LPS剂量为0.5mg/kg构建SD大鼠内毒素耐受模型。4.与I/R组相比,1%TTC染色结果显示:LPS+I/R、NC+LPS+I/R组的心肌梗死面积明显减小,当心肌内注射慢病毒后,内毒素耐受交叉保护作用被逆转。与I/R组相比,HE染色和TUNEL法检测结果显示:LPS+I/R、NC+LPS+I/R组的心肌细胞肿胀与变形程度明显降低,且心肌细胞的凋亡水平明显降低,当心肌内注射慢病毒后,内毒素耐受交叉保护作用被逆转。与I/R组相比,Western Blotting检测结果显示:LPS+I/R、NC+LPS+I/R组的14-3-3γ、phospho-GSK3β和β-catenin蛋白表达水平明显增加,表明在LPS预处理后14-3-3γ、phospho-GSK3β和β-catenin的蛋白浓度显着升高。Co-IP结果显示,只有在LPS预处理后,14-3-3-γ和phospho-GSK3β才会出现相互作用。5.检测血清中LDH、MDA、GSH-PX、SOD、TNF-α和IL-6的活性结果显示,与I/R组相比LPS+I/R、NC+LPS+I/R组的LDH、MDA、TNF-α和IL-6的活性明显降低,GSH-PX和SOD活性明显升高。而心肌内注射siRNA14-3-3γ慢病毒后,内毒素耐受交叉保护作用被逆转。结论:内毒素耐受对SD大鼠心肌I/R损伤处理后存在保护作用,其作用是通过14-3-3γ/phospho-GSK3β/β-catenin调控炎症相关信号通路网络,从而影响炎性相关基因的转录和翻译,最终产生保护作用。
白桦[9]（2021）在《基于炎性反应动态变化的电针预处理抗心肌缺血再灌注损伤机制研究》文中研究指明目的:观察电针预处理对心肌缺血再灌注损伤（MIRI）大鼠的心肌保护效应,并以炎性反应动态变化为切入点探讨电针预处理减轻MIRI的相关机制。方法:1.以雄性SD大鼠为研究对象,随机分为正常（Normal）组、假手术（Sham）组、心肌缺血再灌注损伤（MIRI）组、电针预处理+心肌缺血再灌注损伤（EMIRI）组。其中Sham组、MIRI组、EMIRI组又分为再灌注6h、24h和3d三个观察时间点。结扎冠状动脉左前降支（LAD）30min后打开丝线结制备心肌缺血再灌注模型。EMIRI组大鼠造模前接受双侧内关穴连续4d电针预处理,电针参数为2/100Hz,2mA,20min/次,1次/天。通过超声心动图、心脏重量指数、心肌酶、心肌梗死面积和心肌组织HE染色评价电针预处理对MIRI大鼠的心肌保护效应。2.采用实时荧光定量PCR技术检测血浆中游离线粒体DNA（mtDNA）含量,采用Western-blot技术检测心肌组织线粒体细胞色素C（mit-cyto C）、胞质色素C（cyt-cyto C）表达情况,观察电针预处理对MIRI大鼠心肌组织线粒体的影响。3.采用Western-blot技术检测心肌组织Toll样受体9（TLR9）、NOD样受体家族蛋白3（NLPR3）、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶原（procaspase-1）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase-1）的表达水平,观察电针预处理对心肌组织NLRP3炎性小体活化的影响。4.采用实时荧光定量PCR技术检测心肌组织中髓过氧化物酶（MPO）水平,采用免疫组化技术检测心肌组织白介素-1β（IL-1β）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、白介素-10（IL-10）、转化生长因子-β（TGF-β）、CD86和CD206的表达情况,观察电针预处理对MIRI大鼠心肌组织急性促炎期向抗炎修复期转化的影响。结果:1.电针内关穴预处理显着提高MIRI大鼠心功能（P<0.001）,降低再灌注3d时心脏重量指数（P<0.05）,降低再灌注各时间点血浆CK-MB和cTnT水平（P<0.05）,减少再灌注各时间点梗死面积比值（P<0.05）,改善MIRI引起的心肌组织形态学改变。2.MIRI后线粒体损伤加重（P<0.05）,外周循环中mtDNA含量增加（P<0.05）;电针内关穴预处理可改善MIRI后再灌注各时间点线粒体损伤（P<0.05）,降低MIRI后再灌注 6h 和 24h 时 mtDNA 水平（P<0.05）。3.MIRI后NLRP3炎性小体活化水平明显增加（P<0.01）;电针内关穴预处理可降低MIRI后再灌注各时间点NLRP3炎性小体活化水平（P<0.05）。4.MIRI后,再灌注各时间点M1巨噬细胞表达增加（P<0.05）,再灌注6h和24h时M2巨噬细胞表达明显减少（P<0.001）,再灌注24h时中性粒细胞浸润增加（P<0.001）;MIRI组内,与再灌注6h时相比,再灌注24h时M1巨噬细胞表达明显增加（P<0.01）,M2巨噬细胞表达明显减少（P<0.001）,中性粒细胞浸润增加（P=0.01）,与再灌注24h时相比,再灌注3d时M2巨噬细胞表达明显上升（P<0.001）,中性粒细胞浸润降低（P<0.05）。电针内关穴预处理可降低MIRI后再灌注24h和3d时M1巨噬细胞的表达（P<0.05）,增加再灌注24h时M2巨噬细胞的表达（P<0.001）,降低再灌注各个时间点中性粒细胞的浸润（P<0.05）;EMIRI组内,与再灌注6h时相比,再灌注24h时M1和M2巨噬细胞的表达均明显上升（P<0.01）。结论:1.电针内关穴预处理对MIRI大鼠具有明显的心脏保护效应。2.电针内关穴预处理抗MIRI心肌保护效应可能与其减轻心肌组织线粒体损伤,调控NLRP3炎性小体活化,促进MIRI后急性促炎期向抗炎修复期平衡和快速转化有关。
肖燕[10]（2020）在《基于mTORC1-ULK1-FUNDC1通路的电针预处理减轻MIRI的线粒体自噬机制研究》文中认为目的:1、比较不同电流强度电针预处理（EAP）对心肌缺血再灌注损伤（MIRI）的影响,并明确其效应差异,探索EAP抗MIRI的相对适宜电流强度。2、探索mTORC1在EAP抗MIRI保护效应中与线粒体自噬的相关性。3、探索EAP调控MIRI大鼠线粒体自噬的mTORC1-ULK1-FUNDC1信号机制。方法:1、将120只SPF级成年雄性SD大鼠随机分为8组:模型组（I/R组）、模型+非电针对照组（I/R+SEA组）、模型+0.2mA电流强度电针预处理4d组（I/R+0.2mA组）、模型+1mA电流强度电针预处理4d组（I/R+1mA组）、模型+2mA电流强度电针预处理4d组（I/R+2mA组）、模型+4mA电流强度电针预处理4d组（I/R+4mA组）、模型+6mA电流强度电针预处理4d组（I/R+6mA组）、模型+8mA电流强度电针预处理4d组（I/R+8mA组）,每组各15只。各电针预处理组分别于MIRI手术前4天（d）干预,选择大鼠双侧“内关”穴（PC6）进行电针（2/100Hz）,20min/次,1次/d。I/R+SEA组每天进行与其他组相同方式、时间的异氟烷吸入麻醉但不电针。各组均于第5d结扎心脏冠状动脉左前降支（LAD）30min,再灌注4h,建立心肌缺血再灌注损伤模型,期间进行心电图（ECG）监测。每天监测大鼠体重变化,再灌注4h后,统计室性心律失常评分（VAS）情况,并对各组大鼠生存情况进行生存曲线分析;采用Evans blue-TTC双染法染色切片,计算心肌梗死面积比（Infarct size,IS%）、风险面积比（Risk size）;利用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌钙蛋白T（cTnT）的浓度。2、在探索了电针预处理抗MIRI的相对适宜电流强度基础上,进行实验二和实验三。实验二将140只SPF级成年雄性SD大鼠,随机分为5组,分别为:假手术组（S组）,除不结扎LAD,余与模型组操作相同;假手术+电针预处理组（S+EA组）,除不结扎LAD,余与模型+电针预处理组操作相同;模型组（I/R组）,同“方法1”中的造模方法;模型+非电针预处理组（I/R+SEA组）,在大鼠两侧PC6皮肤表面贴上与电针同样大小的自制的竹制签子20min/次/d,连续4d,第5天造模;模型+电针预处理组（I/R+EA组）,每天电针1次（2mA,2/100Hz,20min）,连续4d,第5天造模。每组各28只。实验三将196只SPF级成年雄性SD大鼠,随机分为7组,分别为:I/R组,同上;I/R+EA组,同上;空白对照组（B组）,未做干预处理;模型+阴性对照预处理组（I/R+C组）,腹腔注射与抑制剂组等量的助溶剂,1次/d,连续4d,并于第5天造模;模型+阴性对照+电针预处理组（I/R+C+EA组）,每天电针1次、腹腔注射与抑制剂组等量的助溶剂1次,连续4d,第5天造模;模型+mTORC1抑制剂（雷帕霉素,Rapamycin）预处理组（I/R+R组）,腹腔注射雷帕霉素,每天1次,3.0mg/kg,连续3d,并于最后1次注射24h后造模;模型+mTORC1抑制剂+电针预处理组（I/R+R+EA组）,每天电针1次,连续4d;电针第2天,同时开始给予腹腔注射雷帕霉素,每天1次,连续3d,于最后1次注射24h后造模。每组各28只。每天监测大鼠体重变化,并在实验结束后对各组大鼠生存情况进行生存曲线分析;采用ECG检测心脏ST段变化,并对缺血期的前20min和再灌注期的前20min及220-240min进行VAS统计;Evans blue-TTC双染色法观察心肌梗塞面积情况,计算IS%与Risk size;ELISA法测定血清心肌酶谱CK-MB、LDH、cTnT的水平;采用末端脱氧核苷酰转移酶介导的DUTP缺口末端标记法（TUNEL）检测心肌细胞凋亡,评价心肌细胞存活情况,全面充分评价心脏功能情况。在充分明确EAP对MIRI保护效应的基础上,采用透射电镜观察自噬囊泡（即自噬小体）水平;免疫荧光染色法检测线粒体、溶酶体及两者结合情况,评价EAP抗MIRI效应与线粒体自噬的相关性。采用蛋白免疫印迹（WB）、免疫组化法（IHC）分别检测心肌组织线粒体中LC3-I（mito-LC3-I）与LC3-Ⅱ（mito-LC3-Ⅱ）、心肌中mTORC1、ATG13、ULK1、p-ULK1、FUNDC1、p-FUNDC1等物质的分布和表达水平;采用大鼠能量（ATP）ELISA试剂盒检测左心室心肌组织中线粒体的ATP产生情况,整体分析EAP通过mTORC1-ULK1-FUNDC1信号通路调控线粒体自噬从而减轻MIRI的可能潜在机制。结果一:不同电流强度EAP对MIRI的效应差异1、不同电流强度EAP对各组大鼠体重及MIRI术后生存曲线的影响各组大鼠体重变化表明,EAP电流强度为0.2mA、1mA与2mA时,EAP的大鼠体重呈正常增长趋势,而电流强度为4mA、6mA、8mA时大鼠体重随着EAP电流强度的增大,体重出现不增反减的趋势;对生存曲线的分析结果显示,与I/R组比,EAP各组的存活率均升高,但0.2mA、1mA与2mA时的大鼠术后存活率高于4mA、6mA与8mA组。2、不同电流强度EAP抗MIRI的效应研究大鼠VAS、心脏Evans blue-TTC双染色及血清心肌酶谱结果表明,与I/R组比,不同电流强度EAP均可有效降低MIRI。VAS结果显示,EAP（仅I/R+2mA组）可有效降低室性心律失常评分VAS（P<0.05）。Evans blue-TTC染色结果显示,与I/R组比,EAP（I/R+0.2mA 组、I/R+1mA 组、I/R+2mA 组、I/R+4mA 组、I/R+6mA 组、I/R+8mA 组）可明显降低 IS%、Risk size（P<0.05）,其中 I/R+2mA 组的 IS%、Risk size 值最小（P<0.05）;而与 I/R+2mA 组相比,I/R+4mA 组、I/R+6mA 组、I/R+8mA 组的 IS%增加（P<0.05）,其中 I/R+6mA 组、I/R+8mA 组 IS%显着增加（P<0.01）。与 I/R+2mA 组相比,I/R+SEA 组、I/R+0.2mA 组、I/R+1mA 组、I/R+6mA 组、I/R+8mA 组心肌 Risk size 均增加（P<0.05）。血清心肌酶谱结果表明,与I/R组比,不同电流强度EAP均可有效降低血清CK（P<0.05）、CK-MB（P<0.05）、LDH（P<0.05）、cTnT（P<0.05）的水平。其中 I/R+2mA 组的心肌酶谱水平均最低,效应最佳。结果二:EAP调控MIRI大鼠线粒体自噬的效应研究1、EAP对各组大鼠体重及MIRI术后生存曲线的影响各组大鼠体重及术后生存曲线的结果表明,与I/R组比,EAP可促进大鼠体重稳步增长,并有效提高大鼠MIRI术后存活率。2、对 VAS、IS%及 Risk size 的影响结果显示,与I/R组比,EAP可有效降低VAS（P<0.05）、降低IS%（P<0.05）及Risk size（P<0.05）。3、EAP减少MIRI诱导的心肌损伤标志物和细胞凋亡结果显示,与I/R组比,I/R+EA组可降低血清CK-MB（P<0.05）、LDH（P<0.05）、cTnT（P<0.05）的水平,减少心肌细胞凋亡（P<0.05）,从而减轻MIRI,对心脏起到保护作用。4、EAP减弱MIRI诱导的线粒体自噬与S组相比,I/R和I/R+SEA组的自噬囊泡明显增加（P<0.01）。与I/R组相比,EAP（I/R+EA组）显着减少了再灌注240min后心肌组织自噬囊泡的数量（P<0.05）,即EAP可抑制线粒体与溶酶体的结合。5、EAP 调节 mTORC1、ULK1 和 FUNDC1 的表达采用WB、IHC检测心肌组织中的mTORC1、ULK1、FUNDC1蛋白表达,结果初步显示,EAP可促进mTORC1蛋白的表达,抑制线粒体自噬相关蛋白ULK1、FUNDC1的表达水平。结果三:EAP调控MIRI大鼠线粒体自噬的mTORC1-ULK1-FUNDC1信号机制研究1、雷帕霉素阻断了 EAP的心脏保护作用各组大鼠体重及术后生存曲线的结果表明,在应用雷帕霉素抑制mTORC1蛋白后,消除了 EAP促进MIRI大鼠体重稳步增长,并有效提高大鼠MIRI术后存活率这一保护作用。在应用雷帕霉素抑制mTORC1蛋白后,消除了 EAP对MIRI的保护效应:与I/R组比,I/R+R+EA组的VAS升高（P<0.05）、IS%（P<0.05）及Risk size（P<0.05）也升高、血清CK-MB（P<0.05）、LDH（P<0.05）、cTnT（P<0.05）的水平均升高,心肌细胞凋亡率也增加（P<0.05）。2、雷帕霉素减弱EAP抑制的线粒体自噬结果显示,在应用雷帕霉素抑制mTORC1蛋白后,消除了 EAP对MIRI线粒体自噬的抑制效应:I/R+R+EA组的自噬囊泡水平（P<0.05）升高,线粒体与溶酶体的结合（P<0.05）增加,表明线粒体自噬的水平增加,从而使MIRI加重。3、EAP通过mTORC1-ULK1-FUNDC1途径抑制线粒体自噬WB、IHC检测mTORC1-ULK1-FUNDC1信号通路中的相关蛋白:心肌组织mTORC1、ATG13、p-ULK1、ULK1、p-FUNDC1、FUNDC1 及心肌线粒体中 mito-LC3Ⅰ、mito-LC3Ⅱ,结果显示,EAP可促进mTORC1蛋白的表达,抑制线粒体自噬相关蛋白ATG13、p-ULK1、ULK1、p-FUNDC1、FUNDC1、mito-LC3Ⅱ/Ⅰ 的表达水平（全部,P<0.05）,但在应用雷帕霉素抑制mTORC1蛋白后,EAP的这些调节作用则受到抑制（P<0.05）。对ATP（三磷酸腺苷）检测水平的结果显示,心肌缺血再灌注损伤后FUNDC1蛋白诱导的线粒体自噬会通过过度消除线粒体而增加心肌细胞凋亡（P<0.05）,线粒体数量的绝对不足而导致ATP产生障碍。但在PC6上进行EAP可逆转这种情况:EAP可促进线粒体内ATP的产生（P<0.05）,防治MIRI。而应用雷帕霉素后,EAP的这一促进作用则受到抑制。结论:1、不同电流强度EAP“内关”穴4天均可有效抗MIRI,其中2mA电流强度的EAP保护效应最好。2、EAP“内关”穴减轻MIRI大鼠的心肌保护效应可能与其促进心肌组织mTORC1蛋白的表达,同时下调ULK1、FUNDC1蛋白的表达,从而抑制线粒体自噬的发生有关。说明mTORC1在EAP抗MIRI中可能起关键性的作用。3、雷帕霉素抑制mTORC1后消除了 EAP“内关”穴对MIRI大鼠的心肌保护效应,说明EAP对MIRI的心肌保护效应可能是通过mTORC1-ULK1-FUNDC1这一信号通路调控线粒体自噬,进而增加线粒体来源的ATP,改善MIRI后的能量供应来实现的。
二、大鼠心肌缺血再灌注损伤模型几种开胸方法评述（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大鼠心肌缺血再灌注损伤模型几种开胸方法评述（论文提纲范文）
（1）龙牙楤木总皂苷抗MIRI机制研究及中成药防治MIRI的系统评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 上篇 文献综述 |
| 综述一 心肌缺血再灌注损伤与内质网应激 |
| (一) 内质网应激的主要路径 |
| (二) 内质网应激在心肌缺血再灌注损伤中的作用机制 |
| 参考文献 |
| 综述二 线粒体功能障碍与心肌缺血再灌注损伤的研究进展 |
| (一) 线粒体形态动力学异常 |
| (二) 线粒体能量代谢障碍 |
| (三) 活性氧产生过量 |
| (四) 钙稳态异常 |
| (五) 线粒体膜通透性改变 |
| 参考文献 |
| 综述三 心肌缺血再灌注损伤的中西医结合研究进展 |
| 1.中药复方汤剂 |
| 2.中成药 |
| 3.中药单体及有效成分 |
| 4.结语与展望 |
| 参考文献 |
| 下篇 实验研究 |
| 前言 |
| 实验一 龙牙楤木总皂苷对心肌缺血再灌注损伤的保护作用 |
| 1 实验器材和材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 小结 |
| 实验二 基于线粒体功能障碍探讨龙牙楤木总皂苷对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用 |
| 1 主要仪器和材料 |
| 2 实验方法 |
| 3.结果 |
| 4 小结 |
| 实验三 基于内质网应激探讨龙牙楤木总皂苷对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用 |
| 1 主要实验材料和仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 讨论 |
| 1 研究的临床意义 |
| 2 龙牙楤木总皂苷抗MIRI的研究基础 |
| 3 大鼠心肌缺血再灌注损伤模型的选择 |
| 4 研究结果分析 |
| 参考文献 |
| 临床研究 中成药治疗心肌缺血再灌注损伤的系统评价 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）大鼠病态窦房结综合征的模型对比研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 SCN5A 基因突变与心律失常的相关关系 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）龙血竭总黄酮对心肌缺血再灌注损伤大鼠的保护作用及PI3K/AKT表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略词对照表 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验仪器及设备 |
| 1.3 实验所用药物及试剂 |
| 1.4 实验动物分组及预处理 |
| 1.5 药物配制、大鼠MIRI模型的制备及动物取材 |
| 1.6 检测大鼠血清酶学CK、CM-MB、LDH水平 |
| 1.7 心肌组织HE染色及TTC染色 |
| 1.8 ELISA法检测大鼠血清炎症因子TNF-α和IL-6 含量 |
| 1.9 实时荧光定量PCR检测PI3K、AKT的 m RNA扩增表达水平 |
| 1.10 Western Blot 法检测 PI3K、AKT 蛋白表达 |
| 1.11 数据统计与分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 造模大鼠心电图变化情况 |
| 2.2 检测血清酶学CK、CK-MB、LDH水平 |
| 2.3 检测血清中 TNF-α和 IL-6 含量 |
| 2.4 各组大鼠心肌组织H E染色 |
| 2.5 心肌梗死面积TTC染色 |
| 2.6 qPCR检测实验大鼠PI3K、AKT mRNA表达并比较 |
| 2.7 Western Blot检测PI3K、AKT蛋白表达 |
| 3 讨论 |
| 3.1 实验大鼠心肌缺血再灌注损伤造模的意义 |
| 3.2 龙血竭总黄酮 |
| 3.3 PI3K/AKT信号通路 |
| 3.4 龙血竭对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞组织的影响 |
| 3.5 龙血竭对大鼠血清酶学的影响 |
| 3.6 龙血竭对大鼠血清炎症因子TNF-α和IL-6 的影响 |
| 3.7 龙血竭对大鼠心肌细胞PI3K、AKT mRNA及蛋白表达的影响 |
| 3.8 总结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 PI3K/AKT 信号通路在心血管及常见疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及科研经历 |
（4）龙血竭总黄酮对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞焦亡及NLRP3炎症小体表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略词对照表 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 药品及其配制 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 实验仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 大鼠分组与给药 |
| 2.2 大鼠心肌缺血再灌注损伤模型的制备与取材 |
| 2.3 测定血清CK-MB、LDH的水平 |
| 2.4 HE染色法观察心肌组织病理改变 |
| 2.5 TTC染色法测定心肌梗死面积 |
| 2.6 TUNEL染色测定心肌细胞焦亡程度 |
| 2.7 qPCR法检测心肌组织NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β的mRNA表达 |
| 2.8 统计学分析方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 大鼠造模基本情况 |
| 3.2 SDF对 MIRI大鼠血清CK-MB、LDH水平的影响 |
| 3.3 SDF对 MIRI大鼠心肌组织病理形态的影响 |
| 3.4 SDF对 MIRI大鼠心肌梗死面积的影响 |
| 3.5 SDF对MIRI大鼠心肌细胞焦亡率的影响 |
| 3.6 SDF对MIRI大鼠心肌NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β的mRNA表达水平的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 MIRI大鼠模型的构建与评判 |
| 4.2 细胞焦亡、NLRP3 炎症小体在MIRI中的作用 |
| 4.3 龙血竭总黄酮 |
| 4.4 SDF对 MIRI大鼠的保护作用 |
| 4.5 SDF减轻大鼠MIRI可能的机制 |
| 不足与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 NLRP3炎症小体在心肌缺血再灌注损伤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及获得的科研成果 |
（5）腺苷激酶及4-羟基壬烯醛在心脏缺血再灌注损伤中作用及机制研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ 腺苷激酶在心脏缺血再灌注损伤中的作用及机制研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语/符号说明 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.附图 |
| 7.创新性与局限性 |
| 8.参考文献 |
| 论文Ⅱ 4-羟基壬烯醛在心脏缺血再灌注损伤中的作用及机制研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语/符号说明 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.附图 |
| 7.创新性与局限性 |
| 8.参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的SCI论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文1 |
| 外文论文2 |
（6）电针预处理对心肌缺血再灌注大鼠的保护作用及FXR/SHP通路的调控作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 实验一 电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠心肌损伤标志物、凋亡指数和形态学的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠心肌细胞焦亡的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠心肌细胞自噬的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验四 电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠心肌细胞凋亡的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验五 电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠FXR/SHP通路的调控作用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录一 文献综述 心肌缺血再灌注损伤相关信号通路研究进展 |
| 参考文献 |
| 附图二 |
| 附录三 读博期间发表论文、科研情况 |
| 致谢 |
（7）肥大细胞参与右美托咪定心脏保护效应的炎性调控机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 序言 |
| 第一部分 右美托咪定在体外循环心脏瓣膜置换术中的心脏保护效应:随机对照双盲研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 右美托咪定预处理抑制肥大细胞脱颗粒对抗大鼠在体心肌缺血/再灌注损伤 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 右美托咪定预处理抑制心脏常驻肥大细胞脱颗粒减轻大鼠离体心肌缺血/再灌注损伤 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 右美托咪定预处理抑制肥大细胞脱颗粒介导的心肌细胞损伤 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 综述 右美托咪定心脏保护作用的研究进展:从基础到临床 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（8）14-3-3γ/phospho-GSK3β/β-catenin通路在内毒素耐受交叉保护SD大鼠心肌缺血/再灌注损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩写及全称和中文对照表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验主要材料与试剂 |
| 2.3 实验主要仪器和设备 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 实验分组及处理 |
| 2.4.2 SD大鼠心肌缺血/再灌注损伤模型的构建 |
| 2.4.3 免疫印迹(Western Blotting)法检测相关蛋白在SD大鼠心肌组织中的表达水平 |
| 2.4.4 心肌内心肌内五点法注射慢病毒 |
| 2.4.5 慢病毒的转染及冰冻切片的制作与观察 |
| 2.4.6 免疫共沉淀法检测14-3-3γ与 phospho-GSK3β之间相互作用 |
| 2.4.7 1%TTC染色法检测心肌组织梗死面积 |
| 2.4.8 心肌组织石蜡切片的制作 |
| 2.4.9 苏木素-伊红染色法(HE染色法) |
| 2.4.10 TUNEL法检测细胞凋亡情况 |
| 2.4.11 血清的分离提取 |
| 2.4.12 血清中乳酸脱氢酶(LDH)的测定 |
| 2.4.13 血清中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的测定 |
| 2.4.14 血清中丙二醛(MDA)的测定 |
| 2.4.15 血清中超氧化物歧化酶(SOD)的测定 |
| 2.4.16 Elisa法检测血清中炎症因子TNF-α和 IL-6 的分泌水平 |
| 2.5 数据处理 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 SD大鼠心电图的监测 |
| 3.2 心肌内注射带荧光慢病毒转染情况的观察 |
| 3.3 沉默14-3-3γ蛋白慢病毒最佳剂量的筛选 |
| 3.4 整体SD大鼠内毒素耐受模型的构建 |
| 3.5 LPS预处理对SD大鼠心肌组织中14-3-3γ和 phospho-GSK3β蛋白表达水平及相互作用的影响 |
| 3.6 LPS预处理对SD大鼠心肌组织中β-catenin蛋白表达水平的影响 |
| 3.7 LPS预处理对SD大鼠I/R损伤后心肌梗死面积的影响 |
| 3.8 LPS预处理对SD大鼠I/R损伤后心肌细胞形态的影响 |
| 3.9 LPS预处理对SD大鼠I/R损伤后心肌细胞凋亡的影响 |
| 3.10 LPS预处理对SD大鼠I/R损伤后血清中LDH和 MDA的影响 |
| 3.11 LPS预处理对SD大鼠I/R损伤后血清中GSH-PX和 SOD影响 |
| 3.12 LPS预处理对 SD 大鼠 I/R 损伤后对 TNF-α 和 IL-6 分泌水平的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 LPS预处理对抗缺血再灌注损伤方面的研究进展 |
| 参考文献 |
（9）基于炎性反应动态变化的电针预处理抗心肌缺血再灌注损伤机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1. MIRI的中医研究现状 |
| 1.1 MIRI的中医概述 |
| 1.2 中医对MIRI病因病机的认识 |
| 1.3 MIRI的中医防治 |
| 2. MIRI的西医研究现状 |
| 2.1 MIRI的病理过程和临床表现 |
| 2.2 MIRI的发病机制 |
| 3. MIRI过程中炎性反应动态变化 |
| 3.1 急性促炎期 |
| 3.2 急性促炎期向抗炎修复期转化 |
| 3.3 抗炎修复期 |
| 4. 针灸可调节机体炎性反应 |
| 4.1 针灸调节炎性反应的效应研究 |
| 4.2 针灸调节炎性反应的机制研究 |
| 5. 针灸防治MIRI的研究现状 |
| 5.1 针灸防治MIRI的临床研究 |
| 5.2 针灸防治MIRI的实验研究 |
| 5.3 针灸防治MIRI的应用前景 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 电针预处理对MIRI大鼠心肌保护效应评价 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 主要仪器及耗材 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 实验分组 |
| 2.2 MIRI模型的造模方法 |
| 2.3 电针干预方法 |
| 2.4 超声心动图的测量方法 |
| 2.5 心脏Evans blue-TTC双染及心肌梗死面积测定 |
| 2.6 H&E染色 |
| 2.7 ELISA检测 |
| 2.8 统计学分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 电针对正常大鼠体重的影响 |
| 3.2 电针对正常大鼠心功能的影响 |
| 3.3 电针预处理对MIRI大鼠心功能的影响 |
| 3.4 电针预处理对MIRI大鼠心脏重量指数的影响 |
| 3.5 电针预处理对MIRI大鼠CK-MB、cTnT水平的影响 |
| 3.6 电针预处理对MIRI大鼠心肌梗死面积的影响 |
| 3.7 电针预处理对MIRI大鼠心肌组织形态学的影响 |
| 4. 小结 |
| 实验二 电针预处理对MIRI大鼠心肌组织线粒体的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 主要仪器及耗材 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 实验分组 |
| 2.2 MIRI模型的造模方法 |
| 2.3 电针干预方法 |
| 2.4 实时荧光定量PCR (RT-PCR)检测 |
| 2.5 WB检测 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 电针预处理对MIRI大鼠心肌组织中线粒体完整性的影响 |
| 3.2 电针预处理对MIRI大鼠血浆游离mtDNA水平的影响 |
| 4. 小结 |
| 实验三 电针预处理对MIRI大鼠心肌组织NLRP3炎性小体活化的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 主要仪器及耗材 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 实验分组 |
| 2.2 MIRI模型的造模方法 |
| 2.3 电针干预方法 |
| 2.4 WB检测 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 各组大鼠心肌组织NLRP3炎性小体活化水平比较 |
| 3.2 电针预处理对MIRI大鼠心肌组织TLR9表达的影响 |
| 4. 小结 |
| 实验四 电针预处理对MIRI大鼠心肌组织炎性反应动态变化的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 主要仪器及耗材 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 实验分组 |
| 2.2 MIRI模型的造模方法 |
| 2.3 电针干预方法 |
| 2.4 实时荧光定量PCR (RT-PCR)检测 |
| 2.5 免疫组化检测 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 电针预处理对MIRI大鼠心肌组织中性粒细胞浸润的影响 |
| 3.2 电针预处理对MIRI大鼠心肌组织巨噬细胞极化的影响 |
| 4. 小结 |
| 第三部分 讨论 |
| 1. 针灸干预方案 |
| 2. MIRI模型中缺血时间的选择依据 |
| 3. 实验中再灌注期观察时间点的选择依据 |
| 4. 电针预处理对MIRI大鼠心脏保护效应分析 |
| 5. 电针预处理可减轻心肌组织线粒体损伤 |
| 6. 电针预处理通过减轻线粒体损伤调控NLRP3炎性小体活化 |
| 7. 电针预处理调节MIRI过程中炎性反应动态变化 |
| 8. 电针预处理可能通过调节NLRP3炎性小体介导MIRI过程中炎性反应动态变化 |
| 第四部分 总结及展望 |
| 1. 结论 |
| 2. 创新点 |
| 3. 不足及展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（10）基于mTORC1-ULK1-FUNDC1通路的电针预处理减轻MIRI的线粒体自噬机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1.中医学对心肌缺血再灌注损伤(MIRI)的认识 |
| 1.1 MIRI的中医学病名与病因病机 |
| 1.2 针灸“治未病”理论与“心痛” |
| 1.3 MIRI的中医证治概要 |
| 2.现代医学对MIRI的认识 |
| 2.1 流行病学 |
| 2.2 MIRI概述 |
| 2.3 MIRI的发病因素 |
| 2.4 MIRI的发生机制 |
| 3.MIRI的临床表现和治疗概况 |
| 3.1 MIRI的临床表现 |
| 3.2 西医治疗概况 |
| 3.3 中药治疗概况 |
| 4.针灸“治未病”与MIRI防治的研究现状 |
| 4.1 针灸预处理抗MIRI的用穴与电针刺激参数 |
| 4.2 针灸预处理调控MIRI自噬的研究现状 |
| 5.线粒体自噬在MIRI中的作用 |
| 5.1 线粒体自噬的概述 |
| 5.2 线粒体自噬在MIRI中的研究现状 |
| 5.3 mTORC1-ULK1-FUNDC1信号通路与线粒体自噬 |
| 6.EAP调控mTORC1、ULK1蛋白的研究现状 |
| 第二部分 实验研究 |
| 技术路线图 |
| 实验一 不同电流强度EAP对MIRI的效应差异研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 主要实验仪器与耗材 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 实验动物分组与干预 |
| 2.2 电针预处理操作方法 |
| 2.3 MIRI模型制作与评价 |
| 2.4 室性心律失常评分(VAS) |
| 2.5 心脏Evans blue-TTC染色及心肌IS%、Risk size的计算 |
| 2.6 血清心肌酶谱指标检测 |
| 2.7 统计学处理 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 不同电流强度EAP对各组大鼠体重及MIRI大鼠术后生存曲线的影响 |
| 3.2 不同电流强度EAP对各组大鼠心律失常、心梗面积比与风险面积比及血清酶谱的影响 |
| 实验二 EAP对MIRI大鼠线粒体自噬的调控效应研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 主要实验仪器与耗材 |
| 2、实验方法 |
| 2.1 实验动物分组与干预 |
| 2.2 电针预处理方法 |
| 2.3 MIRI模型制作与评价 |
| 2.4 室性心律失常评分(VAS) |
| 2.5 心脏Evans blue-TTC染色及心肌IS%、Rize size的计算 |
| 2.6 血清心肌酶谱指标检测 |
| 2.7 TUNEL染色 |
| 2.8 自噬小体的检测 |
| 2.9 免疫荧光染色(IF) |
| 2.10 石蜡切片免疫组化染色(IHC) |
| 2.11 mTORC1、ULK1、FUNDC1蛋白检测 |
| 2.12 统计学处理 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 EAP对各组大鼠体重及MIRI术后生存曲线的影响 |
| 3.2 EAP对各组大鼠ECG、VAS、IS%及Risk size的影响 |
| 3.3 EAP可减少MIRI诱导的心肌损伤标志物和细胞凋亡 |
| 3.4 EAP减弱了MIRI诱导的线粒体自噬 |
| 3.5 EAP调节mTORC1,ULK1和FUNDC1的表达 |
| 实验三 EAP减轻MIRI大鼠线粒体自噬的mTORC1-ULK1-FUNDC1信号机制研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 主要实验仪器与耗材 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 实验动物分组与干预 |
| 2.2 电针预处理操作方法 |
| 2.3 MIRI模型制作与评价 |
| 2.4 雷帕霉素的配制 |
| 2.5 室性心律失常评分(VAS) |
| 2.6 心脏Evans blue-TTC染色及心肌IS%、Rize size的计算 |
| 2.7 血清心肌酶谱指标检测 |
| 2.8 TUNEL染色 |
| 2.9 自噬小体的检测 |
| 2.10 免疫荧光染色(IF) |
| 2.11 石蜡切片免疫组化染色(IHC) |
| 2.12 心肌组织线粒体的分离提取 |
| 2.13 mTORC1-ULK1-FUNDC1通路蛋白检测 |
| 2.14 ATP水平的检测 |
| 2.15 统计学处理 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 雷帕霉素阻断了EAP的心脏保护作用 |
| 3.2 雷帕霉素减弱EAP抑制的线粒体自噬 |
| 3.3 EAP通过mTORC1-ULK1-FUNDC1途径抑制线粒体自噬 |
| 第三部分 讨论 |
| 1.MIRI实验模型的制作与评价 |
| 2.电针预处理PC6的选择依据 |
| 2.1 PC6的现代研究 |
| 2.2 PC6穴名解析 |
| 2.3 PC6的特异性 |
| 2.4 心脏与心包经的联系 |
| 2.5 电针预处理的选择依据 |
| 3.电针预处理刺激强度的选择 |
| 4.MIRI防治与针灸预处理 |
| 5.mTORC1与MIRI线粒体自噬及电针预处理的干预作用 |
| 6.电针预处理减轻MIRI的mTORC1-ULK1-FUNDC1信号机制 |
| 第四部分 结论 |
| 论文创新点 |
| 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一: 英文缩略词一览表 |
| 攻读博士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、大鼠心肌缺血再灌注损伤模型几种开胸方法评述（论文参考文献）
- [1]龙牙楤木总皂苷抗MIRI机制研究及中成药防治MIRI的系统评价[D]. 宋欣丽. 北京中医药大学, 2021(02)
- [2]大鼠病态窦房结综合征的模型对比研究[D]. 蒋礼祥. 遵义医科大学, 2021(01)
- [3]龙血竭总黄酮对心肌缺血再灌注损伤大鼠的保护作用及PI3K/AKT表达的影响[D]. 黄表华. 右江民族医学院, 2021(01)
- [4]龙血竭总黄酮对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞焦亡及NLRP3炎症小体表达的影响[D]. 梁仪琳. 右江民族医学院, 2021(01)
- [5]腺苷激酶及4-羟基壬烯醛在心脏缺血再灌注损伤中作用及机制研究[D]. 王文俊. 山东大学, 2021(11)
- [6]电针预处理对心肌缺血再灌注大鼠的保护作用及FXR/SHP通路的调控作用[D]. 李晨. 湖北中医药大学, 2021(01)
- [7]肥大细胞参与右美托咪定心脏保护效应的炎性调控机制研究[D]. 熊伟. 昆明医科大学, 2021
- [8]14-3-3γ/phospho-GSK3β/β-catenin通路在内毒素耐受交叉保护SD大鼠心肌缺血/再灌注损伤的机制研究[D]. 胡文锋. 南昌大学, 2021(01)
- [9]基于炎性反应动态变化的电针预处理抗心肌缺血再灌注损伤机制研究[D]. 白桦. 南京中医药大学, 2021(01)
- [10]基于mTORC1-ULK1-FUNDC1通路的电针预处理减轻MIRI的线粒体自噬机制研究[D]. 肖燕. 南京中医药大学, 2020(01)