一、M-CSF受体配基结合区基因克隆及其在烟草中的表达（论文文献综述）
李枝玲[1]（2020）在《海岛棉不育系H276A查尔酮合成酶基因及恢复系H268 PPR基因家族特征分析》文中研究说明棉花是重要的纤维作物,在特定杂交组合中表现出显着的杂种优势。细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterility,CMS）是植物杂种优势利用的重要途径。但由于棉花CMS类型较少,其杂种优势利用受到极大限制。因此,开展棉花CMS分子机制研究对于棉花种质创新和杂种优势利用具有重要意义。查尔酮合成酶（chalcone synthase,CHS）是植物类黄酮生物合成过程中一种关键酶,与植物花粉发育和CMS有着密切的联系。PPR（Pentatricopeptide repeat）基因家族作为恢复基因的一种重要基因来源,在植物的生长发育和细胞器基因的表达调控等多种生物学过程中发挥着至关重要的作用。在胞质雄性不育系统中,CMS诱导基因能够表达产生疏水的CMS特异性多肽（CMS-specific pelypeptide）,Rf育性恢复基因（restorers of fertility）能够编码产生PPR蛋白,PPR蛋白能够调控相应的CMS诱导基因的表达水平,通过降低或抑制不育相关基因的转录,降低有毒蛋白的水平,从而能够使得CMS植株恢复育性,然而,对海岛棉（G.barbadense L）CHS基因家族和PPR基因基因家族系统、全面的分析,特别是与CMS关系的研究还有待完善。本研究利用海岛棉基因组信息,对海岛棉CHS和PPR基因家族特征进行了研究。对海岛棉不同组织器官及不育系H276A花粉败育不同阶段的CHS家族基因表达进行了分析,该研究结果将为花粉发育及花粉败育分子机制阐明提供重要理论基础。此外,还通过对海岛棉不育系H276A及其育性恢复材料H268进行PPR蛋白家族基因比较分析,获得序列差异PPR蛋白编码基因。为后续育性恢复基因的发掘提供理论基础。主要研究结果如下:（1）为了探索海岛棉查尔酮合成酶家族基因的特征,我们对海岛棉蛋白质数据库进行了搜索分析,共鉴定到20个Gb CHS基因,并根据Gb CHS蛋白序列的无根系统发育树将所有的Gb CHSs分为了五大类;基因结构分析表明,大部分Gb CHS基因由两个外显子和一个内含子组成;Blast分析发现Gb CHSs序列与Ms CHSs序列具有很高的相似性,说明CHS家族在物种间是保守的;共鉴定出20个基序,基序1、3、5和6属于Chal-sti-syntu-N结构域,基序2、4和7属于Chal-sti-syntu-C结构域;探讨了Gb CHS基因家族的扩增机制,共鉴定出25个重复事件（12个Gb CHS基因）,包括23个片段重复事件和2个串联重复事件,Gb CHS基因家族扩增主要发生于片段重复事件,进化缓慢。（2）利用q RT-PCR方法对20个Gb CHS基因进行组织特异性表达分析。结果表明,Gb CHS家族基因在棉花不同器官中表达模式呈现多样性。进一步分析不育系与保持系中基因表达,并结合功能分析,推测Gb CHS06、10、16和19的异常表达可能与海岛棉不育系花粉败育有关。（3）以海岛棉H276A c DNA为模板,克隆Gb CHS16的CDS全长序列,Gb CHS16扩增片段长度为1158bp,并构建了p BI121-Gb CHS16-EGFP过表达载体基因。（4）通过生物信息学手段鉴定海岛棉PPR蛋白编码基因,并对其进行亚细胞定位预测与基因功能分析,进一步采用高通量测序技术,对海岛棉H276A及H268进行PPR蛋白家族基因鉴定,将获得的PPR序列与目前已获得的具有育性恢复的氨基酸序列进行同源比对并构建系统进化树。鉴定获得了912个PPR蛋白编码基因,其中846个在H276A和H268之间存在序列差异,一共获得7226个SNP和301个In Del差异位点,其中作用于线粒体的有2143个SNP和134个In Del差异位点。与植物已鉴定的具有育性恢复功能的PPR氨基酸序列进行同源比对,结果表明:xp＿016708712（LOC107923023）,xp＿016710013（LOC107924193）与多个植物已鉴定的具有育性恢复功能的PPR氨基酸序列同源性达33%以上,且具有较近亲缘关系。
田原[2]（2017）在《小麦生长素结合蛋白TaABP1的克隆及功能鉴定》文中指出生长素作为植物生长发育的过程中最重要的一类激素,能够促进细胞生长、器官发育以及果实成熟等,因此,克隆并研究生长素相关基因的作用机制,对深入理解生长素调控植物生长发育的机制具有重要意义。目前已分离并鉴定了许多生长素相关的功能基因,但生长素受体蛋白TaABP1基因是如何与生长素结合来参与植物几乎所有的生长发育过程仍未清楚解析。此外,寻找并发现与TaABP1互作的蛋白有助于解释其多样化功能。本研究首次分离得到小麦TaABP1基因,通过生物信息学分析、亚细胞定位、原核表达等方法对TaABP1进行了分子生物学特性分析,进一步利用转基因技术在拟南芥中对TaABP1的功能进行探究。此外,以TaABP1基因为诱饵,利用泛素分离系统筛选得到与其互作的候选基因psaO,光系统I O亚基的结构基因,对其进行了初步的分子生物学特性分析。本研究共取得如下结果:1.小麦生长素结合蛋白TaABP1（1）通过RT-PCR结合RACE从小麦愈伤组织中分离得到TaABP1基因,全长621bp,编码206个氨基酸,含有ABP1家族的典型cupin结构域;（2）氨基酸同源比对结果表明ABP1蛋白在不同植物间的同源性较高;（3）亚细胞定位显示TaABP1蛋白主要分布在细胞膜和细胞质中;（4）利用大肠杆菌的原核表达系统成功诱导出23 kDa的TaABP1蛋白,并对目的蛋白进行了质谱鉴定;（5）通过qRT-PCR分析发现TaABP1基因的表达不具有组织特异性,但在细胞分裂旺盛的愈伤组织和幼嫩的花器官中表达水平较高;（6）利用农杆菌转化法构建转TaABP1拟南芥植株对其功能进行鉴定,结果表明过表达TaABP1能在外源生长素存在下调控拟南芥植株主根和侧根的生长,即低浓度（0.1μM）促进主根伸长而高浓度（10μM）促进侧根发育、诱导生长素信号通路的早期响应基因快速上调表达以及在正常条件下培养的拟南芥叶片的发育:真叶叶缘（莲座叶）下卷和叶柄上翘、莲座叶数量增加、叶面积减少和叶边缘向离轴面（背面）卷曲等表型,以上结果表明TaABP1可能参与拟南芥中生长素介导的快速基因响应过程。2.光系统I O亚基PsaO（1）利用酵母双交技术获得小麦psaO基因,该基因全长659 bp,编码144个氨基酸,小麦PsaO蛋白存在2个跨膜区域,是一种分泌型膜蛋白;（2）PsaO蛋白的同源进化分析表明其氨基酸序列较为保守;（3）qRT-PCR分析表明小麦psaO的表达具有明显的组织特异性,在叶片中表达量最高而愈伤组织中几乎不表达;（4）在ABA、干旱、盐、过氧化氢、黑暗胁迫处理下,小麦psaO均有响应,表明它可能参与小麦的光合作用和抗逆应答反应。以上结果表明,TaABP1参与生长素的快速应答反应,并能扩大生长素信号,最终调控植株根和叶的生长表型。
王卫青[3]（2011）在《一个油菜菌核病抗病相关基因的功能初步分析》文中指出油菜（Brassica napus）是世界上主要的油料作物和重要的经济作物,在经济和农业生产中具有重要作用。核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）引起的油菜菌核病是油菜生产上的重要病害,但至今未发现免疫或者是高抗品种。小繁缕（Stellaria apetala Ucria）是一种常见的田间杂草,对核盘菌表现免疫性。研究核盘菌与小繁缕非寄主互作、与油菜寄主互作的分子机制,寻找抗病或者致病相关基因,对菌核病的防治有着重要的意义。Sspg1d是多聚半乳糖醛酸酶的一种,在核盘菌侵染寄主早期发挥作用的一个重要致病因子。本课题组将sspg1d作为诱饵,利用酵母双杂交方法筛选小繁缕cDNA文库,筛选到1个膜蛋白（命名为ppn20）。经实验证明,ppn20是一个G蛋白偶联受体,小繁缕在受到核盘菌诱导后表达量明显增加。本研究主要致力于研究ppn20的功能,利用农杆菌介导法对油菜与烟草进行转化,获得转基因植株,通过分子检测及表型分析推断ppn20基因的功能。我们将携带有ppn20基因的植物表达载体ppn20-pBinplus转化农杆菌后用农杆菌介导法对甘蓝型油菜进行遗传转化,经过kan+抗性筛选,成功获得10株阳性植株,其中7株成活；对阳性植株进行PCR和RT-PCR检测,发现目的基因成功导入油菜植株,大部分能顺利表达；对幼苗进行接种表型鉴定,结合分子鉴定结果,发现表达ppn20基因的植株均未能明显抵抗核盘菌的侵染或扩展,与非转基因的对照植株对核盘菌抵抗能力无明显差别。转基因烟草对核盘菌的抵抗能力与对照相似。将基因ppn20构建到植物表达载体PVX上,转化农杆菌后注射烟草,使基因ppn20在烟草中瞬时表达,然后对注射区域接种核盘菌,观察发现注射含ppn20基因农杆菌区域与注射含对照载体农杆菌区域抗病性无明显差别。利用基于泛素的酵母双杂交体系初步验证膜蛋白ppn20与G蛋白可能并不存在相互作用,这可能是造成ppn20基因的表达在油菜与烟草中不能正常表现对核盘菌抗性的原因。
李胜军[4]（2008）在《香蕉NBS类RGAs和NPR1基因的克隆与分析》文中研究说明香蕉是重要的粮食作物,也是倍受人们喜爱的热带水果,但由于病虫害,尤其是枯萎病的发生,对香蕉产业造成了巨大损失。基因工程技术的发展为作物改良提供了有效途径,但目前用于香蕉抗枯萎病基因工程的基因资源还非常有限,对香蕉抗病分子机理的研究还较少。鉴于中山大蕉抗逆性强,尤其高抗枯萎病4号小种,本研究利用同源序列法克隆NBS类抗病基因和系统获得抗性途径中的主要抗病信号元件MuNPR1-1基因,取得如下结果:1.中山大蕉NBS类RGAs的克隆与分析根据NBS类抗病基因的保守结构设计简并引物,以中山大蕉基因组DNA为模板,PCR扩增获得了98条NBS序列,进化树分析将其分为12类,与已知的20种NBS类抗病基因的NBS区的进化树结果显示,这12类MuRGAs分布在5个不同的区域,其中的nT subclass 2区域只包括了7类MuRGAs,这可能是不同于其它作物中的一类新的抗病基因。利用RT-PCR检测了12类MuRGAs在不同基因型香蕉中的表达,发现其中的10类均在转录水平表达,但有两类明显不同,MuRGA-I只存在于抗病的中山大蕉和贡蕉基因组中并表达,MuRGA-K只存在于中山大蕉的基因组中并表达,而且这两段序列在进化树的nT subclass 2区域,这揭示了在抗病的中山大蕉和贡蕉中存在着与不抗病的栽培香蕉中不同的NBS类序列,可能与抗病性相关。在对香蕉中NBS-LRR的研究中,发现了不同基因型的中山大蕉（ABB）、贡蕉（AA）、信宜野蕉（BB）、粉蕉（AAB）、泰蕉（AAA）的NBS都属于non-TIR-NBS,首次揭示了香蕉中所有NBS结构均为non-TIR-NBS类。2.中山大蕉MuNPR1-1基因的克隆与分析NPR1是SAR途径中的中心元件,其功能定位在SA积累之后、SAR基因表达之前。利用同源克隆法和RACE技术获得了中山大蕉的MuNPR1-1基因,该基因DNA全长4349bp,有4个外显子,3个内含子,cDNA全长2189bp,阅读框为1725bp,推定的编码蛋白为574个氨基酸,分子量大小为64kD。推定的MuNPR1-1蛋白与已知NPR1基因的氨基酸相似性低于42%,与玉米NPR1的氨基酸相似性为69%。NCBI中rpsBLAST搜索发现MuNPR1-1推定的氨基酸含有BTB/POZ和锚蛋白重复序列,命名为MuNPR1-1 （GenBank登录号:EU7478883）。构建了35S组成型启动子驱动的植物表达载体pCamMuNPR1-1,利用农杆菌转化法转入烟草品种NC89,获得了40个转基因植株,PCR和PT-PCR表明,MuNPR1-1基因已整合到烟草基因组中并能够表达。
罗雯,吴兴安,李莺,徐志凯[5]（2007）在《抗汉坦病毒单链抗体基因向拟南芥遗传转化的初步研究》文中研究表明目的构建抗汉坦病毒mAb1A8scFv的转基因拟南芥植株。方法从含有1A8scFv基因的重组质粒中酶切获得携带Nos终止子的抗体基因片段,将其与CaMV35S启动子相连克隆入载体pCAMBIA2301,构建1A8scFv基因的植物表达载体1A8scFv-pCAMBIA2301。通过农杆菌介导的花粉管法将其转入拟南芥,PCR及Dotblot检测是否获得转基因植株,ELISA和固相酶联斑点实验检测表达产物的生物学活性。结果酶切鉴定结果证明1A8scFv基因被成功克隆入植物表达载体pCAMBIA2301,构建获得1A8scFv-pCAMBIA2301重组质粒。PCR及Dotblot检测证明获得抗汉坦病毒mAb1A8scFv的转基因拟南芥植株。ELISA和固相酶联斑点实验结果证明在转基因拟南芥中成功表达了具有生物学活性的抗汉坦病毒mAb1A8scFv片段。结论成功地将外源基因转入拟南芥中并表达,为进一步研究利用植物表达医用抗体奠定了基础。
祝钦泷[6]（2007）在《彩叶草（Solenostemon scutellarioides）叶色形成相关的花色素苷生物合成途径的分子调控研究》文中研究说明彩叶草（Solenostemon scutellarioides）是唇形花科（Lamiaceae）鞘蕊花属（Solenostemon）的多年生草本植物，具有丰富多彩的独特叶色，是一种重要的观叶植物，在园林绿化中广泛应用，备受关注。目前人们对彩叶植物叶色形成的分子机理的研究相当缺乏，对彩叶草不同品种间颜色差异的分子机制也不清楚，没有彩叶草叶色形成相关基因的克隆和表达调控的相关报道。这极大的限制了以彩叶草为代表的彩叶植物的分子育种和叶色基因工程的开展。由于花色素苷对彩叶植物叶色多彩的形成起主要作用，因此本论文对彩叶草花色素苷生物合成途径的分子调控进行了研究，从彩叶草红色品种（C4）叶片中克隆了控制花色素苷生物合成的四个关键酶基因，和两个可能参与苯丙氨酸不同支路调控的MYB R2R3转录调控因子，采用生物信息学分析、分子杂交、RT-PCR表达分析和在烟草中转基因表达等方法系统分析了它们的分子特征、表达特性和功能活性等。主要结果如下：1、彩叶草查尔酮合成酶基因（SsCHS）的克隆及其在烟草中的表达查尔酮合成酶是整个类黄酮和花色素苷合成途径的第一个关键酶。采用RACE方法，从彩叶草中首次克隆了查尔酮合成酶基因SsCHS的全长cDNA序列和对应基因组序列（Genbank登录号分别为EF522149和EF522150）。SsCHS基因由两个外显子和一个内含子组成，具有CHS基因的典型结构特征。NCBI blast及Vector NT I Suite 10.0分析表明，SsSHS基因编码蛋白序列与许多已知的植物CHS蛋白具有很高的相似性，尤其与同为唇形花科的紫苏的2个CHS蛋白的同源性最高。对SsCHS基因编码蛋白的高级结构的预测分析，发现推测SsCHS蛋白和结构与功能均己知的紫花苜蓿MsCHS2蛋白具有完全相同的必需活性位点和几乎完全相同的高级结构。Southern分析表明，SsCHS基因在彩叶草中可能含有5-8个拷贝，属于多基因家族。半定量RT-PCR分析表明，在红色品种中SsCHS基因在茎、叶和花中表达，并且在叶中表达水平均较高，而在根中未检测到表达。白光诱导和干旱胁迫条件下，SsCHS基因在红色品种的叶中均表达上调。构建了SsCHS基因的正义、反义和RNAi植物表达载体，并分别对烟草W38进行了转化，对正义转基因烟草做了进一步分析。在检测的45个转基因单株中，有近71％的类黄酮有显着提高，最高可达对照的3倍，表明超量表达SsCHS基因能够促进总黄酮的合成。然而也观察到约有11％的类黄酮显着下降，这可能是外源SsCHS基因与烟草内源的CHS基因发生共抑制（cosupresssion）所致。对SsCHS表达促进黄酮积累的32个株系的叶片花色素苷相对含量的检测表明，有22个株系得到显着提高，但也有6个株系变化不明显和4个株系显着下降，说明在转基因烟草的叶片中存在其它因素调控黄酮不同支路产物的分配。2、彩叶草黄烷酮3-羟化酶基因家族（SsF3H）的克隆及表达分析黄烷酮3-羟化酶是类黄酮和花色素苷生物合成途径的第三个关键酶，处于整个类黄酮和花色素苷生物合成途径的中枢位置。采用RACE方法，从彩叶草中克隆了SsF3H基因家族的两个成员的全长cDNA序列和对应基因组序列（SsF3H1 Genbank登录号分别为EF522151和EF522152；SsF3H2 Genbank登录号分别为EF522153和EF522154）。两个SsF3H基因都分别含有2个内含子，符合标准的GT-AG剪接方式。SsF3H1基因组全长1454bp，全长cDNA为1101bp（不含polyA），含有一个1092bp的ORF，编码一个363个aa的蛋白；SsF3H2基因组全长1495bp，全长cDNA为1175bp（不含polyA），含有一个1095bp的ORF，编码一个364个aa的蛋白。NCBI blastn和blastp表明，两个SsF3H基因的核酸及蛋白序列与已知的F3H基因核酸及蛋白序列有高度的同源性，尤其与紫苏F3H基因最相似。NCBI保守域搜索表明，SsF3H1和SsF3H2都含有保守的2OG-FeIIOxy结构域和PcbC结构域，具有结合亚铁离子的保守氨基酸H、D和H，以及结合酮戊二酸的RXS基序，与已知其它F3H蛋白一致，属于依赖于2-酮戊二酸的双加氧酶家族（2-ODD，2-oxoglutarate dependent dioxygenase），其反应都要依赖Fe2+、氧、2-酮戊二酸等作为辅因子。其编码的蛋白的高级结构预测表明，它们与已知功能的其它F3H蛋白和2-ODD酶具有十分相似的高级结构。Southern分析表明，SsF3H基因在彩叶草中可能含有2-3个拷贝。半定量RT-PCR分析表明，SsF3H基因在红色品种的茎、叶和花中都有的总体表达，在根中都没有检测到表达，SsF3H基因的总体表达与各成员的表达情况基本一致。在红色叶中，SsF3H基因在白光诱导和干旱胁迫条件下，都总体表达上调。构建了SsF3H2基因的正义和反义植物表达载体，分别对烟草W38进行了转化，初步得到转正义SsF3H2基因的76个Km抗性单株和转反义SsF3H2基因的64个Km抗性单株。3、彩叶草二氢黄酮醇4-还原酶基因（SsDFR）的克隆及其在烟草中的表达二氢黄酮醇4-还原酶是花色素苷生物合成途径中后期表达的第一个关键酶。采用RACE方法，从彩叶草中克隆了首个二氢黄酮醇4-还原酶基因SsDFR的全长cDNA序列和对应基因组序列（Genbank登录号分别为EF522155和EF522156）。SsDFR基因组全长1792bp，含有5个内含子，所有内含子符合标准的GT-AG剪接方式。其全长cDNA为1322bp（不含polyA），含有一个1101bp的ORF，编码一个366个aa的蛋白。NCBI的blastn和blastp表明，SsDFR基因的核酸及蛋白序列与已知的DFR基因核酸及蛋白序列有高度的同源性，尤其与紫苏DFR基因最相似。NCBI保守结构域搜索表明，SsDFR基因编码蛋白含有典型的3BetaHSD（3-beta hydroxysteroid dehydrogenase／isomerase family）结构域，属于3-β-羟基类固醇脱氢酶超家族（superfamily）。SsDFR中含有高度保守的与NADPH结合的保守基序（V10-Y33）和26个氨基酸组成的底物特异结合的保守基序（T134-K159），与其它DFR蛋白的保守结构一致。其编码的蛋白的高级结构预测表明，与已知结构和功能的葡萄VvDFR蛋白的活性位点和高级结构几乎相同。Southern分析表明，SsDFR基因在彩叶草中可能只有2个拷贝。半定量RT-PCR分析表明，SsDFR基因在红色品种的茎、叶和花中均有较强表达，并且在叶中表达水平相对较高，而在根中未检测到表达。在红色品种的叶中，白光诱导和干旱胁迫都能诱导SsDFR基因表达上调。构建了SsDFR基因的正义和反义植物表达载体，并分别对烟草W38进行了转化，对正义转基因烟草做了分析。在检测的35株超量表达SsDFR基因的转基因烟草中，叶片总黄酮含量都有不同程度的提高，增量为0.019％到49.78％之间，其中有28株显着增加（P＜0.01或0.05）。进一步对转基因烟草叶片的花色素苷相对含量的检测表明，所有转基因株系花色素苷相对含量都得到提高，增幅为2.88％到282.81％，其中有27个株系的含量显着高于对照（P＜0.01或0.05），表明SsDFR基因的超量表达能够显着提高叶片的花色素苷的含量。4、彩叶草花色素合成酶基因家族（SsANS）的克隆及其在烟草中的表达花色素合成酶是花色素苷生物合成途径中后期表达的第二个关键酶。采用RACE方法，从彩叶草中首次克隆了花色素合成酶基因家族（SsANS）的2个成员的全长cDNA序列和对应基因组序列（SsANS1 Genbank登录号分别为EF522157和EF5221528；SsANS2 Genbank登录号分别为EF522159和EF522160）。两个SsANS基因各含有1个内含子，符合标准的GT-AG剪接方式。SsANS1基因组全长为1655bp，cDNA全长为1184bp（不含polyA）；SsANS2基因组全长为1627bp，cDNA全长为1193bp（不含polyA）。它们均含有一个1101bp的ORF，均编码一个366个aa的蛋白。NCBI的blastn和blastp多序列比对显示，SsANS1和SsANS2基因核酸序列与编码蛋白质序列与已知的ANS基因的核酸与蛋白序列具有很高的相似性，与同为唇形花科的紫苏PfANS蛋白的同源性最高。两个基因编码蛋白都含有保守的2OG-FeIIOxy结构域和PcbC结构域，都具有结合亚铁离子的保守氨基酸H、D和H，和结合酮戊二酸的RXS基序，与其它已知ANS蛋白一致，与F3H蛋白均属于2-ODD酶家族，其反应也都依赖Fe2+、氧、2-酮戊二酸等作为辅因子。SsANS1和SsANS2蛋白的高级结构预测分析表明，它们与已知结构和功能的拟南芥AtANS蛋白的高级结构非常相似。Southern分析表明，SsANS基因在彩叶草中有2个拷贝，与分离的两个ANS基因相对应。半定量RT-PCR分析表明，SsANS基因在红色品种的茎、叶和花中都有强的总体表达，在根中没有检测到表达，各成员表达情况与总体表达相似，其中SsANS1在叶中表达较强，而SsANS2在花中表达较强。在红色品种叶中，白光诱导和干旱胁迫，都能使SsANS基因总体表达上调。在白光诱导和干旱胁迫条件下，彩叶草的SsCHS、SsF3H、SsDFR和SsANS转活性都被增强，暗示它们可能具有协同表达的特征。构建了SsANS1基因的正义和反义植物表达载体，并分别对烟草W38进行了转化，对正义转基因烟草做了分析。在检测的22株转基因烟草中，不同转基因株系的叶片总黄酮含量都有不同程度的提高，增量为0.12％到48.25％之间，其中有13株显着增加（P＜0.01或0.05），与超量表达DFR基因的转基因烟草的总黄酮增量相当。进一步对转基因烟草叶片的花色素苷的检测表明，所有转基因株系花色素苷相对含量都得到不同程度的提高，增幅为2.88％到246.58％，其中有18个株系的含量显着高于对照(（P＜0.01或0.05）。花色素苷相对含量增幅与转SsDFR基因的烟草相近，表明SsANS1基因的超量表达能够显着提高叶片中的花色素苷的含量。5、彩叶草MYB R2R3家族转录调控因子（SsMYB2和SsMYB3）的克隆及其在烟草中的表达采用RACE方法，从彩叶草中首次克隆了两个MYB R2R3家族转录调控因子SsMYB2和SsMYB3的全长cDNA序列和对应基因组序列（SsMYB2 Genbank登录号分别为EF522160和EF522161；SsMYB3 Genbank登录号分别为EF522163和EF522164）。两个SsMYB基因各含有1个内含子，符合标准的GT-AG剪接方式。SsMYB2基因组全长1108bp，cDNA全长994bp（不含polyA），含有一个732bp的ORF，编码243个氨基酸。SsMYB3基因组全长931bp，cDNA全长826bp（不含polyA），含有一个747bp的ORF，编码248个氨基酸。NCBI保守域搜索表明，SsMYB2蛋白和SsMYB3蛋白在N-端都含有两个典型的R2R3 MYB DNA结合结构域。SsMYB2蛋白与葡萄VvMYB4（ABL61515）同源性最高，全长一致性是75.0％而R2R3保守结构域一致性是98.1％。SsMYB2 N-端R3保守结构域含有一个保守的bHLH基序（[D／E]Lx2[R／K]x3Lx6Lx3R），非保守C-端具有与功能相关的保守的C1基序（LlsrGIDPxT／SH RxI／1），C2基序（pdLNLD／ElxiG／S）和锌指结构(CX1-2CX7-12CX1-2C)，其中C2基序可能涉及到了目的基因的表达抑制。在系统进化树中，SsMYB2与AmMYB308聚为一小支，与AtMYB4和FaMYB1聚为一大组，属于MYB R2R3家族第4亚家族，其功能可能与苯丙氨酸代谢途径的木质素合成抑制有关。SsMYB3蛋白同源性最高的是葡萄VvMYBPA1（CAJ90831），全长一致性是59％，其中与R2R3部分的一致性高达82.9％。SsMYB3蛋白N-端R3保守结构域中也含有一个保守的bHLH基序，但非保守C-端不具有保守结构，系统进化树中与VvMYBPA1聚为一小支，与ZmP和AtMYB12构成一组，其功能可能与参与类黄酮某一支路的代谢调控，如原花色素或黄酮醇途径的调控。半定量RT-PCR分析表明，在红色彩叶草中，SsMYB2基因在根、茎、叶和花中都有表达，其中在叶和花中表达较强，而在根和茎中表达较弱。在白光诱导下SsMYB2表达上调，并且在弱光处理前，就能检测到SsMYB2基因的弱表达。干旱胁迫下SsMYB2表达下调，比对照减小约1／3。SsMYB3基因在茎、叶和花中都有表达，其中在叶中表达较强，在根中未检测到表达。白光能诱导条件下SsMYB3基因表达上调，在1-24h内表达量增加迅速。干旱诱导下SsMYB3基因表达下调。分别构建了SsMYB2基因和SsMYB3基因的正义表达载体，用于烟草的遗传转化研究。超量表达SsMYB2基因的烟草表型与对照相比，表现出茎的节间变短，生长缓慢，叶变小且颜色较浅，叶面出现明显的白色病变（white lesions）斑块等特征，与超量表达AtMYB4和Am308而使木质素合成相关基因受抑制的烟草表型相似。在检测的13株转基因烟草中，不同株系叶片的总黄酮含量都不同程度的增高，其中有10株显着增加（P＜0.01），最高为对照的3倍。超量表达SsMYB3基因的转基因烟草具有正常的植株形态和生长特征，其叶片颜色与对照无明显差别。转基因烟草叶片总黄酮含量测定结果显示，在检测的17株转基因烟草中，不同转基因株系的叶片总黄酮含量相差较大，其中有12株显着增加（P＜0.01或0.05），最高为对照的3.2倍，3株变化不显着（P＞0.05），2株显着下降（P＜0.05）。这表明在转基因烟草中超量表达SsMYB2基因和SsMYB3基因，能有效调控烟草苯丙氨酸次生代谢的不同途径。6、彩叶草绿色品种茎与叶的颜色形成与SsDFR基因和SsANS基因的表达水平有关采用半定量RT-PCR对彩叶草绿色品种的根、茎、叶和花中的SsCHS、SsF3H、SsDFR和SsANS基因的转录水平进行了检测和比较。结果表明，四个基因在花中都表达较强，在根中都不表达，在茎和叶中有不同的表达模式。SsCHS基因表达在叶和花中较高，在茎中较弱。SsF3H基因家族的总体表达在花中最高，叶次之，茎中最弱；两个成员在花中表达也较强，在叶中表达较弱，SsF3H2基因在茎中不表达。SsDFR基因在花中表达较强，在茎中表达很弱，而在叶中未检测到表达。SsANS基因家族总体表达在花中较强，在叶中很弱，在茎中没有检测到表达，其中SsANS1基因在叶中的表达比SsANS2基因强，而在花中的表达比SsANS2基因弱。绿色品种在干旱胁迫处理后，叶和茎都出现了显着的花色素苷的积累而变红。RT-PCR分析表明，这四个基因在诱导变色的叶中都表达上调，其中SsDFR和SsANS基因的表达水平显着增加，干旱胁迫能激活SsDFR和SsANS基因的表达。由此可知，SsCHS和SsF3H基因家族的转录表达不是引起彩叶草红绿两个品种叶和茎颜色差异的原因。彩叶草绿色品种叶中SsDFR基因的转录失活和SsANS基因家族的表达下调，和茎中SsANS基因家族的转录失活则分别是导致叶片和茎不能正常积累花色素苷而呈绿色的重要原因之一。推测，这可能与绿色品种茎和叶中，分别调控SsDFR和SsANS的不同转录因子发生突变失活有关。
郑国光,杨应华,饶青,林永敏,吴克复[7]（2005）在《M-CSF可溶性受体在烟草中的表达及其抗M-CSF作用研究》文中认为目的：在烟草中高效表达人M-CSF可溶性受体并研究其抗M-CSF活性。方法：采用基因重组技术构建表达C端含组氨酸标签和内质网滞留信号的M-CSF可溶性受体植物表达载体,通过根瘤土壤杆菌转化烟草,获得转基因植株。PCR、蛋白印迹实验鉴定转基因植株,ELISA方法测定重组蛋白表达水平,集落形成实验测定重组蛋白活性。结果：获得50余株转基因烟草植株,PCR证实目的基因已整合到烟草基因组中,蛋白印迹实验证实转基因植株表达目的蛋白；M-CSFsR在烟草中获得高效表达,但不同转基因植株的表达水平存在差异,其中表达水平最高的一株M-CSFsR占叶片可溶性蛋白的1．92％；集落形成实验证明M-CSFsR可以抑制J6-1细胞的集落形成。结论：在烟草中高效表达有生物学活性的重组人M-CSFsR。
杨应华[8]（2003）在《人源多肽抗生素LL-37/hCAP-18的初步研究》文中认为天然免疫是机体防御系统的第一道防线。多肽抗生素既是天然免疫的重要组成部分，在宿主抵抗病原物入侵的防御反应中起重要作用；也是开发新型抗生素的理想候选物，在医药工业和培育抗病动物、植物新品种上有着广阔的应用前景。LL-37／hCAP-18是迄今在人体发现的多肽抗生素cathelicidin家族的唯一成员，也是人体内唯一的双亲性α-螺旋结构的多肽抗生素，在血细胞和上皮细胞中广泛表达。LL-37具有广谱抗菌作用，中和内毒素作用和趋化作用。很多感染性疾病与LL-37低表达或功能失活有关。越来越多的资料表明LL-37是开发新型抗生素的理想模板和分子骨架，对治疗感染性疾病有潜在的应用价值。 为了探讨LL-37／hCAP-18在白血病细胞中的表达与白血病患者容易感染的关系，本实验采用半定量RT-PCR、免疫细胞化学和Western blot等方法，对9个代表不同谱系的人白血病细胞系的LL-37／hCAP-18表达进行了初步观测。其中6个细胞系有mRNA水平的表达，表达量差异较大，Raji细胞表达水平最高，Ramos表达水平最低，两者相差8倍之多。然而，在蛋白质水平，只有J6-1和U937细胞系呈阳性。同时发现白血病患者骨髓中LL-37／hCAP-18阳性细胞的比例和阳性指数均较特发性血小板减少性紫瘢患者（对照组）低。这些观察结果提示，LL-37／hCAP-18低表达，可能是白血病患者容易感染的原因之一。 应用RT-PCR技术从人白血病细胞系J6-1克隆了hCAP-18基因编码区cDNA序列，构建hCAP-18重组表达质粒phCAP-18。DNA序列分析显示该cDNA序列与报道的同源性为99％，有两个点突变，一个错义突变(Codon 6，
杨应华,李戈,郑国光,林永敏,饶青,吴克复[9]（2002）在《M-CSF受体配基结合区基因克隆及其在烟草中的表达》文中进行了进一步梳理 巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony-stimu-lating factor,M-CSF）是一种多功能细胞因子,具有促进单核—巨噬细胞生长、增殖、分化等功能。M-CSF以可溶型和膜结合型等多种形式存在,在髓细胞白血病、卵巢癌、乳腺癌等肿瘤细胞中高表达。M-CSF受体（M-CSFR）是原癌基因C-fms编码的跨膜蛋白。近年
赵银萍[10]（2002）在《农杆菌介导的胸腺素α1基因转化烟草和太白米组织培养研究》文中指出胸腺素α1（Thgmosinalpha 1，Tα1）是一种来自胸腺的小分子多肽，它是一种免疫增强剂，临床用途广泛。市售胸腺素的来源主要有两种，一是从小牛胸腺提取，二是化学合成。从小牛胸腺中提取胸腺素不仅成本高，且受材料来源的限制；而人工合成物，除生产成本高外，还污染环境。利用基因工程，包括植物基因工程来生产胸腺素，是降低生产成本、减少污染、进行大规模生产的最佳途径。 本文利用人工合成的胸腺素α1基因，将其串联成四聚体（Tα1④），插入在pCAMBIA2301的HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点间，以CaMV35S为启动子构建成植物表达载体。利用农杆菌介导的叶盘转化法，开展胸腺素α1基因转化烟草的研究。其主要结果如下： 1．利用农杆菌介导的叶盘转化法，将Tα1④基因导入烟草，获得了抗卡那霉素表型的转基因再生植株，植株再生率0.31-2.82。 2．应用组织化学染色法，对每次转化获得的转基因再生植株进行GUS检测，GUS阳性率最高是19.23％，最低是0.85％。从所检测的抗卡那霉素表型的再生植株中，得到了17株GUS阳性植株。 3．对GUS阳性植株进行Southern Dot Blot杂交，得到了13株含胸腺素Tα1基因的转基因烟草植株。 4．所获得的13株转基因植株已移栽成活，现已开花。 通过本项研究，主要获得以下结论：1，农杆菌介导的叶盘法，可以将外源基因转入烟草基因组中，并由此建立了转胸腺素α1基因的烟草高频再生体系；2．建立了转Tα1基因的烟草的GUS检测方法；3．Southern Dot Blot杂交证实，Tα1基因已成功地整合到烟草基因组上，在国内首次获得了转胸腺素Tα1基因的烟草植株；4．我们在实验中建立起了一种烟草DNA的提取方法，应用此法提取的DNA不仅浓度高，并且很少有RNA污染。 该项研究结果为继续研究烟草中Tα1的表达活性及利用植物作为生物反应器生产Tα1和医用活性多肽蛋白奠定了基础。 中药太白米属民间珍稀草药，近年来发现其具有抗肿瘤镇痛等生理活性，并对治疗慢性胃炎有特殊的功效，市场需求日益扩大。但太白米资源较少，加之生 长于高山，药源供应受到限制。利用现代生物技术，开展其组织培养快速繁殖及 工厂化生产其有效成分，为这一民间药物的大规模开发利用开辟了广阔的前景。 本实验较系统地开展了太白米的组织培养及植株再生研究。结果显示： 1．利用太白米的地下鳞茎，经 0．1％HgC Iz灭菌，接种在 MS附力。不同浓度比的 KT、BA、IAA、NAA、2，4－D的 8种培养基上，可诱导产生愈伤组织，其中在m＋NAA 0．sing几北T 0．ling儿的培养基上愈伤组织诱导率最高，且生长快； 2．培养在眺d，4o．0 mg／L＋KT 0．ling／L培养基上的鳞茎可经不定根直．接发育成新的鳞茎，由此建立了太白米的鳞茎再生体系，鳞茎再生率最高达2．17， 最低为1．一。 实验证实，组织培养可有效地保存太白米种质资源。该实验为太白米的大规 模人工快速繁殖和细胞培养工厂化生产其有效成分奠定了基础。
二、M-CSF受体配基结合区基因克隆及其在烟草中的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、M-CSF受体配基结合区基因克隆及其在烟草中的表达（论文提纲范文）
（1）海岛棉不育系H276A查尔酮合成酶基因及恢复系H268 PPR基因家族特征分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 植物雄性不育基本概述 |
| 1.1.1 植物细胞质雄性不育 |
| 1.1.2 植物雄性不育花粉发育过程及花药发育相关基因研究 |
| 1.1.3 棉花细胞质雄性不育研究进展 |
| 1.2 查尔酮合成酶(CHS)研究进展 |
| 1.2.1 CHS基因的研究进展 |
| 1.2.2 CHS基因及蛋白结构研究 |
| 1.2.3 查尔酮合成酶基因家族及其进化研究 |
| 1.2.4 查尔酮合成酶基因表达及调控研究 |
| 1.2.5 查尔酮合成酶基因工程研究 |
| 1.3 PPR基因家族研究进展 |
| 1.3.1 PPR基因家族的结构特点 |
| 1.3.2 PPR蛋白对叶绿体和线粒体基因的调控作用 |
| 1.4 植物基因工程研究方法 |
| 1.4.1 基因克隆技术研究概况 |
| 1.4.2 荧光定量技术的研究概况 |
| 1.4.3 SNP/In Dels研究 |
| 1.4.4 植物表达载体构建技术及方法研究 |
| 1.5 查尔酮合成酶在细胞质雄性不育中的研究进展 |
| 1.6 PPR基因家族CMS关系研究 |
| 1.7 本研究的目的意义 |
| 2 海岛棉不育系H276A查尔酮合成酶基因家族分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料、仪器及试剂 |
| 2.1.2 GbCHS基因家族鉴定 |
| 2.1.3 染色体位置及进化分析 |
| 2.1.4 基因结构,GO分析,保守motifs及基因重复分析 |
| 2.1.5 核酸提取 |
| 2.1.6 .RNA提取 |
| 2.1.7 cDNA获取 |
| 2.1.8 荧光定量分析 |
| 2.1.9 棉花GbCHS过表达载体的构建 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 GbCHS家族基因鉴定及染色体位置分析 |
| 2.2.2 Gb CHSs进化及结构分析 |
| 2.2.3 GbCHS基因家族的基因复制 |
| 2.2.4 GbCHS基因家族的基因注释和保守基序分析 |
| 2.2.5 GbCHS基因的组织特异性表达谱分析 |
| 2.2.6 GbCHS基因在花粉败育过程中的表达谱分析 |
| 2.2.7 海岛棉GbCHS16的克隆与过表达载体构建 |
| 2.3 小结与讨论 |
| 2.3.1 GbCHS基因家族成员分析 |
| 2.3.2 GbCHS基因家族进化关系分析 |
| 2.3.3 花粉发育与GbCHS基因家族特异性表达分析 |
| 2.3.4 GbCHS基因与花粉败育分析 |
| 3 海岛棉恢复系H268PPR基因家族特征分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 PPR蛋白家族鉴定 |
| 3.1.3 cDNA文库构建 |
| 3.1.4 生物信息学分析 |
| 3.1.5 PPR蛋白基因克隆验证 |
| 3.1.6 海岛棉PPR基因家族育性恢复基因进化树分析参数说明 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 PPR蛋白家族鉴定 |
| 3.2.2 海岛棉H268转录组测序 |
| 3.2.3 PPR基因家族的生物信息学分析 |
| 3.2.4 与线粒体相关的PPR蛋白基因SNP/In Del分析 |
| 3.2.5 SNP/In Del克隆验证 |
| 3.2.6 海岛棉PPR基因家族育性恢复基因候选分析 |
| 3.3 讨论与小结 |
| 3.3.1 PPR基因家族鉴定 |
| 3.3.2 SNP/In Del分析 |
| 3.3.3 差异线粒体PPR与育性恢复 |
| 4 结论与讨论 |
| 4.1 主要结论 |
| 4.2 创新点 |
| 4.3 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（2）小麦生长素结合蛋白TaABP1的克隆及功能鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 生长素与植物生长发育 |
| 1.1.1 生长素的合成与代谢 |
| 1.1.2 生长素的极性运输 |
| 1.1.3 生长素的信号转导 |
| 1.1.4 生长素在植物发育过程的作用 |
| 1.2生长素结合蛋白ABP1 |
| 1.2.1 ABP1的结构和性质 |
| 1.2.2 ABP1的定位 |
| 1.2.3 ABP1参与生长素信号转导的作用 |
| 1.3 本研究所用的主要技术 |
| 1.3.1 cDNA末端快速扩增技术 |
| 1.3.2 亚细胞定位技术 |
| 1.3.3 实时荧光定量技术 |
| 1.3.4 转基因技术 |
| 1.3.5 酵母双杂交技术 |
| 1.4 本研究的目的、意义及技术路线 |
| 1.4.1 目的与意义 |
| 1.4.2 技术路线 |
| 第二章 TaABP1基因的克隆及功能分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 总RNA提取及反转录 |
| 2.1.3 TaABP1基因的克隆及序列分析 |
| 2.1.4 亚细胞定位 |
| 2.1.5 原核表达及质谱鉴定 |
| 2.1.6 实时荧光定量PCR |
| 2.1.7 转TaABP1拟南芥植株的获得 |
| 2.1.8 拟南芥突变体的鉴定 |
| 2.1.9 转TaABP1拟南芥的功能鉴定 |
| 2.1.10 TaABP1过表达小麦植株的获得 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 TaABP1基因的全长克隆及序列分析 |
| 2.2.2 TaABP1 蛋白的序列比对及3D结构 |
| 2.2.3 TaABP1的聚类分析及氨基酸保守基序 |
| 2.2.4 TaABP1的启动子克隆及顺式作用元件分析 |
| 2.2.5 TaABP1的亚细胞定位 |
| 2.2.6 TaABP1的原核表达及质谱鉴定 |
| 2.2.7 TaABP1的表达特性分析 |
| 2.2.8 转TaABP1及突变体拟南芥的鉴定 |
| 2.2.9 转TaABP1拟南芥的功能鉴定 |
| 2.2.10 TaABP1过表达小麦植株的获得 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 TaABP1 互作候选基因TapsaO的克隆及特性分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 酵母感受态细胞的制备及共转化 |
| 3.1.3 小麦psaO基因克隆 |
| 3.1.4 TapsaO基因的序列分析 |
| 3.1.5 实时荧光定量PCR |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 TaABP1互作蛋白的筛选 |
| 3.2.2 TapsaO基因的全长克隆及序列分析 |
| 3.2.3 小麦PsaO蛋白的系统进化分析及氨基酸保守基序 |
| 3.2.4 TapsaO启动子的顺式作用元件分析 |
| 3.2.5 TapsaO基因的组织特异性表达分析 |
| 3.2.6 不同外源胁迫下TapsaO的表达特性分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 4.1 结论 |
| 4.1.1 TaABP1基因的克隆及功能分析 |
| 4.1.2 TapsaO基因的克隆及特性分析 |
| 4.2 创新点与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）一个油菜菌核病抗病相关基因的功能初步分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词对照表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 引言 |
| 第一章 核盘菌以及植物抗病防卫机制的研究进展 |
| 1 核盘菌的特征与致病机理 |
| 1.1 核盘菌的分类与生物学特性 |
| 1.2 核盘菌的致病机理 |
| 1.3 核盘菌对寄主的侵染条件与侵染途径 |
| 1.4 核盘菌所致菌核病的症状及危害 |
| 1.5 油菜菌核病的防治意义 |
| 2 植物抗病防卫机制的研究进展 |
| 2.1 过敏性反应(hypersensitive reaction,HR) |
| 2.2 系统获得性抗性(system acquired resistance SAR) |
| 2.3 植物的非宿主抗性——宿主与病原物的互作机制 |
| 2.4 植物抗病反应的信号传导途径 |
| 第二章 植物离体组织培养与细胞再生的研究进展 |
| 1 植物组织培养的原理 |
| 1.1 植物细胞的全能性 |
| 1.2 细胞分化与形态建成 |
| 1.3 植株的再生 |
| 2 植株再生的途径 |
| 2.1 胚状体途径 |
| 2.2 器官发生途径 |
| 2.2.1 器官间接发生途径 |
| 2.2.2 器官直接发生途径 |
| 3 植物转基因的研究进展 |
| 第三章 G蛋白与G蛋白偶联受体(GPCRs)的研究进展 |
| 1 G蛋白的结构与功能 |
| 1.1 异源三聚体G蛋白的结构 |
| 1.2 异源三聚体G蛋白的功能研究 |
| 2 G蛋白偶联受体(GPCRs)的研究进展 |
| 2.1 GPCRs的结构与分类 |
| 2.1.1 GPCRs的结构 |
| 2.1.2 GPCRs的分类 |
| 2.2 GPCRs激活的分子机制 |
| 2.3 GPCRs二聚化的功能 |
| 3 基于分离泛素的杂交系统(split-ubiquitin system) |
| 第二部分 研究报告 |
| 第四章 G蛋白偶联受体功能的初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物品种 |
| 1.2 基因来源 |
| 1.3 菌株和质粒 |
| 1.4 实验仪器与试剂 |
| 1.5 培养基 |
| 1.5.1 细菌培养基 |
| 1.5.2 植物培养基 |
| 1.6 大肠杆菌质粒DNA提取(碱裂解法)参考《分子克隆实验指南》 |
| 1.7 质粒DNA的酶切与PCR验证 |
| 1.8 质粒DNA与连接产物的转化 |
| 1.9 植物表达载体的农杆菌转化 |
| 1.10 农杆菌质粒的提取 |
| 1.11 农杆菌介导的油菜遗传转化 |
| 1.11.1 无菌苗制备 |
| 1.11.2 农杆菌培养 |
| 1.11.3 农杆菌侵染和共培养 |
| 1.11.4 芽诱导与愈伤组织诱导 |
| 1.11.5 愈伤组织的分化和植株再生 |
| 1.12 农杆菌介导的烟草遗传转化 |
| 1.12.1 无菌外植体制备 |
| 1.12.3 农杆菌培养 |
| 1.12.4 农杆菌侵染和共培养 |
| 1.12.5 愈伤组织诱导 |
| 1.12.6 愈伤组织的分化和植株再生 |
| 1.13 再生植株的PCR检测 |
| 1.13.1 油菜、烟草基因组DNA的提取方法(CTAB法) |
| 1.13.2 再生植株的PCR检测扩增 |
| 1.14 转基因植株RNA的提取以及RT-PCR检测 |
| 1.14.1 油菜、烟草总RNA的提取方法(Trizol法) |
| 1.14.2 总RNA的DNA消化 |
| 1.14.3 mRNA反转录为cDNA |
| 1.14.4 RT-PCR检测 |
| 1.15 转基因植株的抗性鉴定 |
| 1.16 小繁缕膜蛋ppn20与油菜G蛋白的互作 |
| 1.16.1 小量LiAc/PEG法制备酵母感受态细胞 |
| 1.16.2 质粒转化酵母感受态细胞 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 ppn20-pBplus载体PCR鉴定 |
| 2.2 植物表达载体的农杆菌转化 |
| 2.3 植株遗传转化转基因植株的获得 |
| 2.3.1 ppn20基因的油菜遗传转化及转基因植株的获得 |
| 2.3.2 ppn20基因的烟草遗传转化及转基因植株的获得 |
| 2.4 转基因植株的PCR检测 |
| 2.4.1 转基因油菜PCR检测 |
| 2.4.2 转基因烟草PCR检测 |
| 2.5 转基因植株核盘菌抗性鉴定 |
| 2.5.1 转基因油菜的离体叶片接种鉴定 |
| 2.5.2 转基因烟草的离体叶片接种鉴定 |
| 2.6 转基因植株的RT-PCR检测 |
| 2.6.1 转基因油菜的RT-PCR检测 |
| 2.6.2 转基因烟草的RT-PCR检测 |
| 2.7 ppn20与油菜G蛋白之间的相互作用 |
| 3 讨论 |
| 第五章 通过瞬时表达研究ppn20的功能 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物品种 |
| 1.2 菌株和质粒 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 农杆菌表达载体ppn20-PVX的构建 |
| 1.4.1 质粒DNA的酶切 |
| 1.4.2 目的片段的回收 |
| 1.4.3 连接反应 |
| 1.4.4 连接产物的转化 |
| 1.4.5 重组质粒的鉴定 |
| 1.4.6 表达载体的农杆菌转化 |
| 1.4.7 农杆菌质粒的提取 |
| 1.4.8 菌落的PCR检测 |
| 1.5 农杆菌介导的植物瞬时表达抗病性鉴定 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 农杆菌表达载体的构建与鉴定 |
| 2.1.1 ppn20-PVX载体构建 |
| 2.1.2 ppn20-PVX载体PCR鉴定 |
| 2.1.3 植物表达载体的农杆菌转化 |
| 2.1.4 农杆菌介导ppn20基因在烟草中瞬时表达 |
| 3. 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（4）香蕉NBS类RGAs和NPR1基因的克隆与分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 综述 |
| 1.1 植物抗病的分子机理 |
| 1.1.1 植物的R 基因 |
| 1.1.2 植物抗病信号传导 |
| 1.1.3 植物抗病信号传导相关基因 |
| 1.1.4 植物防卫反应基因 |
| 1.2 香蕉抗病基因工程 |
| 1.2.1 影响香蕉生产的主要病害 |
| 1.2.2 香蕉遗传转化 |
| 1.2.3 香蕉抗病基因的克隆 |
| 1.3 本研究的目的意义 |
| 第二章 香蕉NBS 类RGAs 的克隆与分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 RGAs 的分离 |
| 2.2.2 RGAs 的聚类分析 |
| 2.2.3 RGAs 和已知R 基因NBS 区的序列比对 |
| 2.2.4 RGAs 和已知R 基因的进化分析 |
| 2.2.5 12 种RGAs 在五个香蕉品种中的鉴定 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 香蕉NPR1 基因的克隆与分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 NPR1 基因中间片段的获得 |
| 3.2.2 NPR1 基因全长的获得 |
| 3.2.3 NPR1 基因的序列分析 |
| 3.2.4 植物表达载体的构建 |
| 3.2.5 烟草的遗传转化及再生植株的分子检测 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 全文结论与创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）抗汉坦病毒单链抗体基因向拟南芥遗传转化的初步研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌种及质粒 |
| 1.2 工具酶及试剂 |
| 1.3 重组植物表达载体的构建及鉴定 |
| 1.4 植物的遗传转化与转基因植株的筛选 |
| 1.5 转基因植株的PCR分析 |
| 1.6 转基因植株的Dot blot检测 |
| 1.7 转基因植株的ELISA检测 |
| 1.8 转基因植株的固相酶联斑点检测 |
| 2 结 果 |
| 2. 1 重组植物表达载体的构建和转化 |
| 2. 2 转基因植株的筛选和分子验证 |
| 2.3 目的蛋白在转基因植株中的表达检测 |
| 3 讨 论 |
（6）彩叶草（Solenostemon scutellarioides）叶色形成相关的花色素苷生物合成途径的分子调控研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 绪论 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 彩叶植物研究进展 |
| 1.1.1 组织结构方面的研究 |
| 1.1.2 彩叶的生理生化研究 |
| 1.1.3 彩叶植物呈色机理的研究 |
| 1.1.4 环境因素对叶片呈色的影响 |
| 1.1.5 彩叶植物光合特性的研究 |
| 1.1.6 彩叶植物的遗传稳定性 |
| 1.1.7 其它相关因子的研究 |
| 1.1.8 彩叶草研究进展 |
| 1.1.9 今后研究方向展望 |
| 1.2 花色素苷研究进展 |
| 1.2.1 花色素苷的结构与理化性质 |
| 1.2.2 花色素苷在叶片中的产生与分布 |
| 1.2.3 花色素苷的诱导及其在叶片中的功能 |
| 1.2.4 花色苷生物合成的基本途径 |
| 1.2.5 叶色的基因工程改良研究展望 |
| 第二章 引言 |
| 第二部分 彩叶草花色素苷生物合成途径关键基因和MYB R2R3家族转录调控因子的克隆及功能的初步鉴定 |
| 第一章 彩叶草查尔酮合成酶基因(SsCHS)的克隆及其在烟草中的表达 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.1.1 植物材料 |
| 1.1.2 菌株与载体 |
| 1.1.3 主要仪器和设备 |
| 1.1.4 试剂盒及购买的试剂 |
| 1.1.5 常用标准试剂配方 |
| 1.1.6 自配的其它试剂 |
| 1.1.7 烟草转化基本培养基 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 各材料总RNA的提取 |
| 1.2.2 各材料总DNA的提取 |
| 1.2.3 彩叶草叶片的RACE反转录 |
| 1.2.4 DNA片段的回收、连接、克隆和测序 |
| 1.2.5 基因的生物信息学分析 |
| 1.2.6 SsCHS基因保守片断扩增 |
| 1.2.7 SsCHS基因cDNA 5’末端和3’末端扩增 |
| 1.2.8 SsCHS基因全长cDNA及对应的基因组的扩增 |
| 1.2.9 SsCHS基因的Southern blot分析 |
| 1.2.10 SsCHS基因的表达分析 |
| 1.2.11 SsCHS基因植物表达载体构建与对烟草的转化 |
| 1.2.12 SsCHS基因功能的初步验证 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.3.1 SsCHS基因的克隆 |
| 1.3.2 SsCHS基因的核酸序列和编码的蛋白分析 |
| 1.3.3 SsCHS基因数的Southern-blot鉴定 |
| 1.3.4 SsCHS基因转录的表达特性 |
| 1.3.5 SsCHS基因正义、反义和RNAi植物表达载体构建 |
| 1.3.6 SsCHS基因导入烟草及转化植株的获得 |
| 1.3.7 转SsCHS基因烟草总黄酮、叶绿素、类胡罗卜素和花色素苷的测定 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 彩叶草黄烷酮-3-羟化酶基因家族(SsF3H)的克隆及表达分析 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 材料的准备、各个材料RNA和DNA的抽提和反转录 |
| 2.2.2 SsF3H基因保守片断扩增 |
| 2.2.3 SsF3H基因cDNA 5’末端和3’末端扩增 |
| 2.2.4 SsF3H基因全长cDNA及对应的基因组的扩增 |
| 2.2.5 SsF3H基因的Southern blot分析 |
| 2.2.6 SsF3H基因的表达分析 |
| 2.2.7 SsF3H2基因植物表达载体构建与对烟草的转化 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 SsF3H基因家族的克隆 |
| 2.3.2 SsF3H1和SsF3H2基因的核酸序列和编码的蛋白特征分析 |
| 2.3.3 SsF3H基因的Southern blot鉴定 |
| 2.3.4 SsF3H基因家族转录的表达特性 |
| 2.3.5 SsF3H2基因正义和反义植物表达载体构建 |
| 2.3.6 转化SsF3H2基因的烟草获得 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 彩叶草二氢黄酮醇-4-还原酶基因(SsDFR)的克隆及其在烟草中的表达 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 材料的准备、各个材料RNA和DNA的抽提和反转录 |
| 3.2.2 SsDFR基因保守片断扩增 |
| 3.2.3 SsDFR基因cDNA 5’末端和3’末端扩增 |
| 3.2.4 SsDFR基因全长cDNA及对应的基因组的扩增 |
| 3.2.5 SsDFR基因的Southern blot分析 |
| 3.2.6 SsDFR基因的表达分析 |
| 3.2.7 SsDFR基因植物表达载体构建与对烟草的转化 |
| 3.2.8 SsDFR基因功能的初步验证 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 SsDFR基因的克隆 |
| 3.3.2 SsDFR基因的核酸序列和编码的蛋白特征分析 |
| 3.3.3 SsDFR基因的Southern blot鉴定 |
| 3.3.4 SsDFR基因转录的表达特性 |
| 3.3.5 SsDFR基因正义和反义植物表达载体构建 |
| 3.3.6 转SsDFR基因烟草的获得及转基因烟草总黄酮和花色素苷的测定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 彩叶草花色素合成酶基因家族(SsANS)的克隆及其在烟草中的表达 |
| 4.1 材料与试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 材料的准备、各个材料RNA和DNA的抽提和反转录 |
| 4.2.2 SsANS基因保守片断扩增 |
| 4.2.3 SsANS基因cDNA 5’末端和3’末端扩增 |
| 4.2.4 SsANS基因全长cDNA及对应的基因组的扩增 |
| 4.2.5 SsANS基因的Southern blot分析 |
| 4.2.6 SsANS基因的表达分析 |
| 4.2.7 SsANS基因植物表达载体构建与对烟草的转化 |
| 4.2.8 SsANS1基因功能的初步验证 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 SsANS基因家族的克隆 |
| 4.3.2 SsANS1和SsANS2基因的核酸序列和编码的蛋白特征 |
| 4.3.3 SsANS基因的Southern blot鉴定 |
| 4.3.4 SsANS基因转录的表达特性 |
| 4.3.5 SsANS1基因正义和反义植物表达载体构建 |
| 4.3.6 转SsANS1基因烟草的获得及转基因烟草总黄酮和花色素苷的测定 |
| 4.3.7 彩叶草可能的花色素苷生物合成途径 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 彩叶草MYB R2R3家族转录调控因子(SsMYB2和SsMYB3)的克隆及其在烟草中的表达 |
| 5.1 材料与试剂 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 材料的准备、各个材料RNA和DNA的抽提和反转录 |
| 5.2.2 SsMYB基因保守片断扩增、测序与分析 |
| 5.2.3 SsMYB2和SsMYB3基因cDNA 5’末端和3’末端扩增 |
| 5.2.4 SsMYB2和SsMYB3基因全长cDNA及对应的基因组的扩增 |
| 5.2.5 SsMYB2和SsMYB3基因的表达分析 |
| 5.2.6 SsMYB2和SsMYB3基因的植物表达载体构建与对烟草的转化 |
| 5.2.7 SsMYB2和SsMYB3基因的功能的初步验证 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 SsMYB基因保守区扩增与序列分析 |
| 5.3.2 SsMYB2基因和SsMYB3基因的克隆 |
| 5.3.3 SsMYB2和SsMYB3基因的核酸序列和编码的蛋白分析 |
| 5.3.4 SsMYB2和SsMYB3基因在红色彩叶草中的表达 |
| 5.3.5 SsMYB2和SsMYB3基因植物表达载体构建 |
| 5.3.6 转SsMYB2和SsMYB3基因烟草的获得与转基因烟草叶片总黄酮的测定 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 总结 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 主要创新点 |
| 参考文献 |
| 附录1 缩略词 |
| 附录2 学习期间发表的论文和参加的科研项目 |
| 致谢 |
（8）人源多肽抗生素LL-37/hCAP-18的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一节 LL-37／hCAP-18在白血病细胞中的表达 |
| 第二节 hCAP-18的分子克隆与真核表达 |
| 第三节 利用原核表达系统表达有活性的LL-37 |
| 第四节 LL-37基因在烟草中的表达 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 论文综述 |
| 缩写词表 |
| 博士生期间发表论文题录 |
| 致谢 |
（10）农杆菌介导的胸腺素α1基因转化烟草和太白米组织培养研究（论文提纲范文）
| 引言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 转基因烟草研究 |
| 1.1.1 转基因方法研究 |
| 1.1.2 不同基因对烟草的转化 |
| 1.2 太白米的研究 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 胸腺素α_1基因转化烟草 |
| 2.2 太白米组织培养与植株再生 |
| 3 结果 |
| 3.1 胸腺素α_1基因转化烟草 |
| 3.1.1 含胸腺素α_1基因的植物表达载体的构建 |
| 3.1.2 烟草叶片的转化及转化植株再生体系建立 |
| 3.1.3 GUS检测 |
| 3.1.4 烟草DNA提取 |
| 3.1.5 转基因烟草PCR检测 |
| 3.1.6 标记探针的检测 |
| 3.1.7 转基因植株的Southern dot blot分析 |
| 3.2 太白米组织培养与植株再生 |
| 3.2.1 太白米鳞茎萌发与植株再生 |
| 3.2.2 愈伤组织的诱导 |
| 4 讨论 |
| 4.1 胸腺素α_1基因转化烟草 |
| 4.1.1 影响转化的因素 |
| 4.1.2 GUS检测 |
| 4.1.3 Southern杂交 |
| 4.2 太白米组织培养与植株再生 |
| 总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 图版及图版说明 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 |
四、M-CSF受体配基结合区基因克隆及其在烟草中的表达（论文参考文献）
- [1]海岛棉不育系H276A查尔酮合成酶基因及恢复系H268 PPR基因家族特征分析[D]. 李枝玲. 广西大学, 2020(02)
- [2]小麦生长素结合蛋白TaABP1的克隆及功能鉴定[D]. 田原. 西北农林科技大学, 2017
- [3]一个油菜菌核病抗病相关基因的功能初步分析[D]. 王卫青. 南京农业大学, 2011(06)
- [4]香蕉NBS类RGAs和NPR1基因的克隆与分析[D]. 李胜军. 中国农业科学院, 2008(10)
- [5]抗汉坦病毒单链抗体基因向拟南芥遗传转化的初步研究[J]. 罗雯,吴兴安,李莺,徐志凯. 中国人兽共患病学报, 2007(12)
- [6]彩叶草（Solenostemon scutellarioides）叶色形成相关的花色素苷生物合成途径的分子调控研究[D]. 祝钦泷. 西南大学, 2007(05)
- [7]M-CSF可溶性受体在烟草中的表达及其抗M-CSF作用研究[J]. 郑国光,杨应华,饶青,林永敏,吴克复. 中国肿瘤生物治疗杂志, 2005(04)
- [8]人源多肽抗生素LL-37/hCAP-18的初步研究[D]. 杨应华. 中国协和医科大学, 2003(12)
- [9]M-CSF受体配基结合区基因克隆及其在烟草中的表达[J]. 杨应华,李戈,郑国光,林永敏,饶青,吴克复. 中国肿瘤生物治疗杂志, 2002(04)
- [10]农杆菌介导的胸腺素α1基因转化烟草和太白米组织培养研究[D]. 赵银萍. 陕西师范大学, 2002(02)