Dimension AR专用通道微量蛋白检测试剂的研制

一、Dimension AR专用通道微量蛋白测定试剂的研制（论文文献综述）

李姣^[1]（2021）在《BRD4天然抑制剂3’，4’，7, 8-Tetrahydroxyflavone的发现及其抑制急性髓系白血病的机制研究》文中研究说明近年来,随着基因测序与蛋白结构解析技术的不断提高,针对恶性肿瘤的相关研究取得了不少进展。大量研究表明恶性肿瘤发病过程中极其复杂的生物学行为运用单纯的中心法则已经无法解释清楚,而表观遗传学的发展使得对恶性肿瘤发病机制的认识更加深刻。表观遗传（epigenetic inheritance）是指在不改变遗传物质DNA序列的情况下改变遗传性状的可遗传变化。目前表观遗传主要是通过对组蛋白翻译后修饰、DNA修饰和非编码RNA的调控等方式进行。近年来随着对癌症发展过程中关键表观事件的研究不断深入,新的表观遗传学关键靶点不断被发现,设计研发针对这些靶点的新一代药物是表观靶向治疗学的主要策略和方向。溴结构域识别蛋白4（Bromodomain-containing protein 4,BRD4）是溴结构域超末端蛋白（Bromodomain and extra terminal protein,BET）众家族成员中研究最为广泛的一员,它可以通过两个结构域（BD1和BD2）识别并结合组蛋白氮端尾部的乙酰化赖氨酸残基,参与表观遗传组蛋白翻译后修饰乙酰化信号的传递,调控下游基因转录。当BD1和/或BD2被抑制时会导致不同的表型,说明两个结构域具有不同的生物学功能。目前为止,虽然已有部分BRD4抑制剂进入了临床研究阶段,但相似的结构骨架可能为该类靶向抑制剂将来的临床应用带来潜在的耐药性风险,因此发现全新结构骨架的BRD4抑制剂仍具有重大意义。而天然化合物作为大自然进化产生的“天然分子库”,具有多样的化学骨架、广泛的生物活性、丰富的资源等优点,长期以来都是人类药物的重要来源。因此,本文基于BRD4蛋白重要的生物学功能带来的科学问题,充分发挥天然化合物自身优势,从筛选结构新颖的天然抑制剂、探索苗头化合物的生物活性及作用机制等角度着手,进行BRD4天然抑制剂的研究。本论文主要包含了以下几个方面的工作:1.利用AlpHaScreen assay从天然黄酮类化合物中筛选了 一个全新结构骨架的BRD4天然抑制剂-3’,4’,7,8-Tetrahydroxyflavone（以下简写 3478）,并结合 Counter assay 分析3478分别对BD1及BD2的亲和作用。结果表明3478对BRD4具有较好亲和活性,而其他结构相似的天然黄酮类化合物及衍生物无明显活性,这说明3478自身特异的结构骨架对BRD4的亲和作用具有非常重要的意义,这种亲和作用并非黄酮类化合物普遍存在的性能。同时,3478对BD2的亲和活性（IC50=204nM）约是对BD1（IC50=17.9μM）的100倍,具有BRD4-BD2选择性;2.选用急性骨髓性白血病细胞MV4-11作为研究对象,观察3478在体外对MV4-11细胞增殖、凋亡、原癌基因c-Myc及BRD4表达等的影响,探索3478的生物活性及可能的分子调控机制。结果显示3478可以抑制MV4-11细胞增殖、促进MV4-11细胞凋亡,同时可以下调原癌基因c-Myc mRNA水平以及c-Myc表达;3.构建急性骨髓性白血病小鼠模型,研究3478在体内对干预白血病细胞皮下移植瘤组织生长的作用及潜在的分子调控机制,为天然化合物3478可能干预急性骨髓性白血病提供客观的实验依据。结果发现3478在不影响小鼠体重及脏器指数的情况下可以减缓皮下移植瘤组织体积及重量的增长,同时也可以下调原癌基因c-Myc mRNA水平,降低细胞核和细胞质中c-Myc的表达;4.利用蛋白质晶体学的技术手段,通过解析3478分别与BD1及BD2的复合物结构、分析他们在结合模式、结合特点等方面的差异,解释3478对BRD4亲和活性及潜在选择性背后的分子机制。本研究中解析了 3478分别与BD1和BD2 1.3 A和1.73 A的高分辨率复合物晶体结构,发现3478与BD1和BD2的结合方式非常相似,与BD1 N140及BD2的N433均形成氢键,且通过水分子与BD1 Y97位及BD2的Y390均形成氢键,同时化合物的7-羟基与BD1 P82及BD2 P375均形成氢键,这3个氢键分别将化合物骨架环紧紧固定在 BD1 及 BD2 口袋内。另外,BD1 的 V87、1146、194 及 BD2 的 V380、V439、L387 与3478均形成较强的疏水相互作用。这些结合特点从分子水平阐明了 3478对BD1及BD2均具有亲和活性的机理。此外,在BD1-3478复合物晶体中,化合物的苯基电子密度较弱,表明该苯基与BD1相互作用较弱,相比之下,其密度在BD2中明显较好,表明3478在BD2中具有更稳定的构象且相互作用更强。并且BD2 N433附近的水分子与3478形成一个额外的氢键,同时H437的NH指向化合物苯环上的两个碳原子,可能会形成疏水作用,而在BD1中的对应位置为D144,其侧链距离化合物太远,无法建立有效的相互作用。近来研究也发现BD2 H437是设计BD2选择性抑制剂的重要氨基酸位点,这些结构特点揭示了 3478对BRD4-BD2的活性明显高于BRD4-BD1的分子机理。3478的化学骨架及其与BRD4溴域的结合模式,与迄今为止报道过的BRD4抑制剂截然不同。鉴于3478对BRD4不同结构域均具有较好的亲和活性,化学骨架及与BRD4活性口袋的的结合模式均较新颖,对BD2具有一定的选择性,且分子量也较小（MW:286.24）,还有较大的结构改造和结构优化的空间等优点,该化合物值得作为BRD4先导化合物进行进一步探索,以启发癌症及其他BRD4相关疾病的药物研发。

李涛^[2]（2021）在《应用于废水处理的磁性分离新技术研究》文中研究指明重金属铬（Cr）是一种对人体健康危害极大的致癌物质,水系中超标的铬也会对水生生物造成极大的危害。我国是一个铬矿产资源贫乏的国家,制革企业每年产生大量的含铬废水和含铬固体危险废弃物,造成严重的铬资源浪费和由铬引起的环境污染。河北省开始执行《制革及毛皮加工工业水污染物排放标准GB 30486-2013》,该标准将总铬排放标准从1.5 mg/L减小到0.5 mg/L。目前,制革企业处理含Cr（Ⅲ）废水的方法难以使处理后废水出口总铬浓度小于0.5 mg/L,同时还会产生大量的含铬危险废弃物,铬资源也不能回收。本论文提出了一种用磁性Fe3O4纳米颗粒处理制革含Cr（Ⅲ）废水的新机理,设计制造了一种新型钕铁硼（Nd-Fe-B）高强磁棒式磁分离器,系统地研究了磁性Fe3O4纳米颗粒处理制革含Cr（Ⅲ）废水工艺,开展了实验室规模和中试规模制革含Cr（Ⅲ）废水处理实验,建成了制革含Cr（Ⅲ）废水处理示范工程。提出了一种新的去除制革含铬废水中Cr（Ⅲ）的“Fe3O4-Cr（OH）3”团簇机理。这种机理跟传统的吸附机理有着本质的区别,其对Cr（Ⅲ）具有高选择性和超高的捕获容量。磁性Fe3O4纳米颗粒和“水合Cr（OH）3胶体团簇”结合形成“纳米团簇”的数目和尺寸不受磁性纳米颗粒比表面积的限制,因而理论上来说磁性纳米颗粒对“水合Cr（OH）3胶体团簇”的捕获容量是无限的,其对Cr（Ⅲ）的分离效率是巨大的,所以才能够实现对废水中Cr（Ⅲ）如此大的捕获容量。在pH 8时,表面裸露磁性Fe3O4纳米颗粒对Cr（Ⅲ）的最大捕获容量为452.6mg/L。设计制造了一种新型的钕铁硼（Nd-Fe-B）高强磁棒式磁性分离器。磁性分离器主体是由呈正三角形垂直排列的磁棒组成。该磁性分离器具有体积小、处理量大、能耗低等优点,能在不移动磁棒的情况下实现磁棒表面的清洁。采用加入磁性Fe3O4纳米颗粒的水作为模拟液,研究了磁性分离器捕获磁性Fe3O4纳米颗粒的效率。当磁性Fe3O4纳米颗粒浓度小于400mg/L、流速小于18 L/h、磁棒间距小于30 mm时,在3小时内,磁性分离器对磁性Fe3O4纳米颗粒的捕获率大于99.4%。在此基础上,设计制造了处理量分别为2-5 m3/h和10-15 m3/h的中试和示范工程规模的磁性分离器。进行连续流动处理制革含Cr（Ⅲ）废水实验室规模实验,磁棒间距30mm,入口流速18 L/h,两级处理后废水总铬浓度降低至0.2 mg/L左右,满足排放标准。用10%的次氯酸钠（NaClO）溶液对使用后的磁性Fe3O4纳米颗粒进行再生,可实现对磁性Fe3O4纳米颗粒接近100%再生和对废水中的铬99%以上回收,无危险废弃物产生。再生磁性Fe3O4纳米颗粒循环用于制革含Cr（Ⅲ）废水处理,处理后废水总铬浓度稳定小于0.5 mg/L。中试实验以2 m3/h的流速运行,每天工作8小时,每4小时启动原位清洁装置清洗磁棒,连续运行15天。处理后废水总铬浓度稳定小于0.5 mg/L。示范工程以10 m3/h的流速运行,连续7天间歇和连续稳定运行,全程处理后废水总铬浓度低于0.5 mg/L。建成了与示范工程配套的生产量为300 kg/天的磁性Fe304纳米颗粒生产线和处理量为300kg/天的“磁-铬”解离生产线。此外,传统废水处理技术难以使油田采出水COD小于50mg/L,或者成本很高。本论文提出了用磁性Fe3O4-IDA-Cu2+纳米颗粒去除经传统废水处理工艺处理后的油田采出水COD新机理。将磁性分离器用于去除COD的连续流动实验,COD去除率可达66.7%,处理后油田采出水COD稳定小于50 mg/L。使用后的磁性Fe3O4-IDA-Cu2+纳米颗粒能再生循环回用,再生循环回用6次,出口 COD浓度稳定小于50 mg/L。

钟鹏程^[3]（2021）在《艾可清颗粒减轻环磷酰胺心脏毒性的作用及机制研究》文中提出目的:作为一线肿瘤化疗药物及强力免疫抑制剂,环磷酰胺（Cyclophosphamide,CTX）广泛应用于多种恶性肿瘤及自身免疫性疾病的治疗。然而,CTX在发挥治疗作用的同时也可引起多种严重不良反应,如骨髓抑制、心脏毒性、肝功能损害、出血性膀胱炎等。此外,在中医药基础科研领域,CTX常被用作复制中医阳虚、血虚证候动物模型的药物。目前针对CTX毒副反应尚无特效药物,预防或缓解CTX化疗导致的毒副反应对于提高肿瘤治疗效果具有重要的临床意义。艾可清颗粒（AKQ）作为广州中医药大学热带医学研究所创制的专利复方,在艾滋病治疗方面已运用多年,具有增强艾滋病患者免疫力、提高生活质量的作用。本课题组认为AKQ扶阳益气、补肾健脾的功效用于CTX引起的气阳两虚、脾肾双亏副作用的“纠偏”,在理论上具有针对性。基于此,本研究以AKQ为研究对象,通过体内、体外实验结合网络药理学分析、代谢组学以及肠道菌群分析,期望达到以下研究目的:1.明确AKQ对CTX引起的正常与荷瘤小鼠的毒性反应是否具有减毒作用及减毒效应的主要靶器官。2.评估AKQ对CTX毒性代谢产物丙烯醛（ACR）诱导的H9c2心肌细胞损伤是否具有保护作用。3.探索AKQ在上述动物和细胞水平减轻CTX毒性的机制,为中医异病同治理论提供实验依据。方法:1.体内（动物）实验1:观察AKQ对CTX所致昆明小鼠毒性反应的影响。（1）昆明小鼠CTX中毒模型的建立:8周龄,体重25±3g的健康昆明小鼠CTX连续4天腹腔注射给药:第1、2天100 mg/kg/d,第3、4天50 mg/kg/d。（2）分组处理及一般状况观察:健康昆明小鼠24只,随机分为3组,每组8只:正常对照组（第1-4天生理盐水0.3 mL/次/d腹腔注射+第1-7天纯水0.3 mL/次/d灌胃）,模型组（第1-4天CTX注射造模+第1-7天纯水灌胃0.3 mL/次/d）,艾可清组（第1-4天CTX注射造模+第1-7天AKQ灌胃1.3 g/kg/d）,实验周期8天,每日观察并记录各组小鼠一般状况及死亡数。艾可清给予小鼠1.3 g/kg/d相当于人临床剂量的9倍。（3）血液及生化指标的测定:实验结束后处死各组小鼠,取全血及血清,血细胞分析仪及生化分析仪检测WBC、RBC、PLT、HGB、LYM、MON、AST、ALT、CRE、CK。（4）主要脏器组织病理学观察:实验结束后处死各组小鼠,取各组小鼠心、肝、脾、肺、肾组织进行HE染色并观察。2.体内（动物）实验2:观察AKQ对CTX中毒小鼠心脏毒性的影响（1）CTX中毒小鼠心脏毒性模型的建立及分组:8周龄,体重25±3 g的健康昆明小鼠50只,随机分为5组,每组10只,CTX连续4天（第8-11天）腹腔注射造模（方案同体内实验1）。动物分组为正常组（第8-11天N.S 0.3 mL/次/d腹腔注射+第1-13天纯水0.3 mL/次/d灌胃）,模型组（第8-11天CTX注射造模+第1-13天纯水灌胃0.3 mL/次/d）,艾可清低剂量组（第8-11天CTX腹腔注射+第1-13天AKQ灌胃0.65 g/kg/d）,艾可清中剂量组（第8-11天CTX腹腔注射+第1-13天AKQ灌胃1.3g/kg/d）,艾可清高剂量组（第8-11天CTX腹腔注射+第1-13天AKQ灌胃2.6 g/kg/d）,实验周期14天,14天后取血清及心脏,进行相关检测。艾可清给予小鼠低、中、高剂量相当于人临床剂量的4.5、9、18倍。（2）心脏指数的测定:各组小鼠取心脏称重,计算心脏指数。（3）心肌酶及氧化指标的测定:各组小鼠取血清检测CK、CK-MB、GSH、SOD、MDA。（4）心脏的组织病理学观察:取各组小鼠心脏组织进行HE染色并观察。（5）心脏组织凋亡检测:Western blot检测各组小鼠心脏组织中Bax及Bcl-2的表达。3.体外（细胞）实验:观察AKQ对ACR诱导的H9c2毒性损伤的影响及机制探索（1）AKQ对H9c2活力影响的观察:AKQ颗粒甲醇提取物,加DMSO溶解,加细胞培养基稀释,配成不同浓度梯度,加入H9c2培养液,共孵育24、48及72小时,CCK8法测定细胞活力。（2）ACR对H9c2 IC50测定:将不同浓度梯度ACR溶液加入H9c2培养液培养,24小时后CCK8法测定细胞活力。（3）AKQ对ACR诱导的H9c2毒性损伤影响的观察:H9c2细胞分5组:对照组（正常培养）,ACR组（ACR 20μmol/L干预培养）,ACR+AKQ低剂量组（ACR+AKQ 20μg/mL）,ACR+AKQ 中剂量组（ACR+AKQ 40 μg/mL）,ACR+AKQ 高剂量组（ACR+AKQ 80 μg/mL）。培养24小时后观察细胞形态,进行CCK8检测、Hochest染色、流式Annexin V-FITC/PI双染及WB检测bax、Caspase3、Caspase9及bcl-2表达。（4）AKQ缓解CTX心脏毒性的网络药理学分析:进行CTX心脏毒性相关疾病靶点及AKQ药物成分治病靶点筛选并映射,构建药物-成分-靶点网络及PPI网络,对靶点进行GO分析和KEGG通路富集分析。（5）网络药理学分析的实验验证:用RT-qPCR及WB技术验证网络药理学分析富集的通路靶点表达水平。（6）AKQ对ACR诱导的H9c2毒性损伤机制的探索:H9c2细胞分4组:对照组（正常培养）,ACR组（ACR20 μmol/L干预培养）,ACR+AKQ组（ACR+AKQ 80μg/mL）,AKQ+LY294002 组（ACR+AKQ 80 μg/mL+LY294002 10 μmol/L）。培养 24小时后RT-qPCR及WB检测相关通路蛋白及凋亡蛋白的表达。4.体内（动物）实验3:AKQ对CTX化疗的荷瘤小鼠心脏毒性的影响及机制研究（1）荷瘤小鼠模型的建立:将密度为1× 107个/mL的S180肉瘤细胞悬液以0.2 mL/只的体积皮下接种于昆明小鼠后颈部。（2）动物分组及处理:将肿瘤体积范围为40-100 mm3的S180荷瘤小鼠24只随机分为3组,每组8只:肿瘤模型对照组（第1-13天纯水0.3 mL/次/d灌胃+第8-11天连续N.S 0.3 mL/次/d腹腔注射）,CTX单独化疗组（第8-11天连续CTX腹腔注射,CTX注射方案同前+第1-13天纯水灌胃0.3mL/次/d）,CTX化疗联合AKQ治疗组（第8-11天CTX连续腹腔注射+第1-13天艾可清2.6g/kg/d灌胃）。实验周期14天,第12天收集新鲜粪便,第14天取血清及心脏,进行后续检测。（3）心肌酶及氧化指标的测定:各组小鼠取血清检测CK、CK-MB、SOD、MDA。（4）心脏组织病理学观察:取各组小鼠心脏组织进行HE染色并观察。（5）心脏凋亡相关蛋白检测:WB检测各组小鼠心脏组织bax及bcl-2。（6）心脏通路蛋白检测:WB及免疫组化检测各组小鼠心脏组织相关通路靶点蛋白表达。（7）荷瘤小鼠瘤体重量测定:实验结束后取各组小鼠瘤体称重。（8）荷瘤小鼠血清代谢组学研究:各组小鼠取血清做GC/MS非靶向代谢组学分析。（9）荷瘤小鼠肠道菌群分析:接取小鼠新鲜未污染粪便做肠道菌群16SrRNA测序分析。结果:1.昆明小鼠腹腔注射环磷酰胺（100 mg/kg/d×2d,50 mg/kg/d×2d）后可见活动减少,畏寒蜷缩,毛发蓬松、竖立,进食减少,体重减轻等明显的中毒症状,加服AKQ后,上述中毒症状减轻,且死亡率较模型组明显下降（P=0.0028）。昆明小鼠予环磷酰胺注射后白细胞、血小板及淋巴细胞可出现显着减少（P<0.001,P<0.001,P<0.01）,而红细胞、血红蛋白及单核细胞无明显变化;AST、ALT及CRE无明显改变,CK出现显着上升（P<0.05）,加服AKQ 口服后,CK上升情况较模型组明显缓解（P<0.05）,其他血液生化指标比较无显着性差异。HE染色显示各组小鼠肝、脾、肺、肾组织病理改变无明显差异;模型组可见明显心肌损伤改变,加服AKQ后心肌病变程度减轻。2.昆明小鼠腹腔注射环磷酰胺（100 mg/kg/d ×2d,50 mg/kg/d×2d）后心脏指数较正常组明显增大（P<0.05）,AKQ低、中、高剂量组心脏指数较模型组均有显着性减小（P<0.05,P<0.01,P<0.01）。模型组CK-MB、MDA较正常组显着升高（P<0.001,P<0.001）,GSH 及 SOD 明显降低（P<0.05,P<0.001）,加服 AKQ 后,AKQ 各剂量组上述指标得到不同程度改善,其中以高剂量组改善最明显,高剂量组CK、CK-MB、MDA较模型组均显着下降（P<0.05,P<0.001,P<0.001）,而GSH及SOD明显上升（P<0.05,P<0.001）。模型组心脏HE染色可见明显心肌损伤改变,艾可清低、中、高剂量组心肌病变程度较模型组依次减轻。与正常组比较,模型组小鼠心脏组织中Bax表达增强,Bcl-2的表达减弱,AKQ各剂量组Bax表达与模型组相比呈剂量依赖性减弱,Bcl-2的表达呈剂量依赖性增强。3.AKQ醇提物在0-80 μg/mL浓度范围呈浓度依赖性促进H9c2细胞的增殖,ACR对H9c2细胞24小时IC50为20.37 μM。ACR作用于H9c2细胞24小时,引起的细胞损伤涉及:形态改变、细胞活力下降、Hochest染色阳性数目增多、流式Annexin V-FITC/PI双阳性细胞比例增加,凋亡蛋白Bax、Caspase3、Caspase9表达增强及抗凋亡蛋白Bcl-2表达减弱。H9c2细胞予AKQ处理后,与模型组相比,可剂量依赖性地改善H9c2细胞损伤形态、增强细胞活力、减少Hochest染色阳性及Annexin V-FITC/PI双阳性细胞比例,抑制Bax、Caspase3、Caspase9表达而增强Bcl-2表达。网络药理学分析结果显示:通过靶点筛选及映射得到192个靶点为AKQ主要成分治疗CTX心脏毒性损伤的作用靶点;通过构建AKQ药物-活性化合物-治病靶点网络图,得到15个关键化合物（包括等槲皮素、木犀草素、山奈酚、丹参酮Ⅱa、柚皮素等）;通过构建PPI网络得到30个核心靶点;GO分析显示靶点涉及的生物学功能主要包括调控细胞增殖/凋亡过程及氧化/炎症反应等。KEGG通路富集分析显示排名前10的信号通路涉及PI3K-AKT、TNF及MAPK通路。RT-qPCR显示上述3条通路关键靶点中的PI3K及AKT在AKQ组中表达较ACR组显着上调（P<0.001）,WB实验也观察到PI3K及AKT总蛋白及磷酸化蛋白水平均显着高于ACR组。AKQ+ACR组加入抑制剂LY294002后,上调的PI3K及AKT mRNA及蛋白水平被逆转;AKQ+ACR组较ACR组中上调的bax、Caspase3、Caspase9及下调的bcl-2同样被逆转。4.以密度为1×107个/mL的S180肉瘤细胞悬液,按0.2mL/只皮下接种于昆明小鼠后颈部,约6天后可成模。CTX单独化疗组CK-MB、MDA较肿瘤模型对照组显着升高（P<0.001,P<0.001）,SOD明显降低（P<0.001）,CTX化疗联合AKQ治疗组CK、CK-MB、MDA较CTX单独化疗组显着下降（P<0.01,P<0.001,P<0.001）,而SOD明显上升（P<0.001）。CTX单独化疗组心脏HE染色可见显着的心肌损伤,CTX化疗联合AKQ治疗组心肌病变程度较CTX单独化疗组明显减轻。与肿瘤模型对照组相比,CTX单独化疗组小鼠心脏组织Bax表达上调,Bcl-2、PI3K及AKT表达下调,加服AKQ后,Bax表达减弱,Bcl-2、PI3K及AKT表达增强。实验结束后,CTX化疗联合AKQ治疗组瘤体重量较单独化疗组显着减轻（P<0.05）。血清代谢组学分析在三组间共鉴定出44个差异代谢产物,AKQ干预能使CTX化疗改变的L-谷氨酸、L-天冬氨酸、柠檬酸、甘氨酸、鸟氨酸等代谢物轮廓向肿瘤模型对照组靠近;CTX联合AKQ治疗后显着增强的代谢通路包括:柠檬酸循环、精氨酸生物合成、丙氨酸天冬氨酸和谷氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、氨酰tRNA生物合成、谷胱甘肽代谢、组氨酸代谢、D-谷氨酰胺与D-谷氨酸代谢。肠道菌群分析显示CTX单独化疗组鞘氨醇单胞菌（Sphingomonadales）、溶杆菌（Lysobacter）相对丰度下调,普雷沃菌9（Prevotella9）上调,CTX 化疗联合 AKQ 治疗后,Sphingomonadales及Lysobacter 丰度上调,Prevotella9丰度下调。CTX单独化疗组中显着下调的p53信号通路、倍半萜生物合成、胆汁分泌及咖啡因代谢等通路,在AKQ干预后重新被显着上调。结论:1.AKQ能改善CTX引起的昆明小鼠中毒症状,显着降低死亡率;AKQ能降低CTX引起的心肌酶异常升高,减轻氧化应激失衡、减少心肌细胞凋亡,改善CTX诱导的心脏病理形态改变。2.AKQ能促进H9c2心肌细胞增殖,激活PI3K/AKT通路而减少ACR诱导的H9c2凋亡。3.荷瘤小鼠CTX化疗可引起心肌酶异常升高、氧化应激失衡、心肌细胞凋亡增加及PI3K/AKT表达下调,联用AKQ能改善上述病变,且能增强CTX抑瘤效果。4.AKQ可调节CTX化疗的荷瘤小鼠L-谷氨酸、L-天冬氨酸、柠檬酸、甘氨酸、鸟氨酸等44种差异代谢物表达,增强TCA循环,精氨酸生物合成,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢等16条代谢通路功能;上调有益菌（目水平Sphingomonadales、属水平Lysobacter）,下调有害菌（属水平Prevotella 9）丰度,增强肠道菌p53信号通路、胆汁分泌等功能从而发挥减轻CTX心脏毒性的作用。

谢新生^[4]（2021）在《Arl13b调控VEGFR2信号促进神经胶质细胞瘤生长的分子机制》文中研究表明研究背景及目的:神经胶质细胞瘤简称胶质瘤,是发生于神经外胚层的肿瘤,为一种具高度侵袭性,增殖能力强,最具破坏性和致命性的肿瘤之一。目前传统的治疗手段包括手术切除、放疗和放疗。尽管通过手术、放疗和替莫唑胺化疗等多种方式进行治疗,但大多数脑胶质瘤患者的预后仍然不佳,中位生存期很少超过16个月,整个病程的生活质量较差。在对胶质瘤的研究中,人们发现胶质瘤患者中主要有TERT、PTEN、Tp53、EGFR、IDH、VEGF、TSC和CDKN2A等基因发生突变,但其发病的机制仍然不是很清楚。Arl13b为一个小分子GTP酶,被认定为纤毛的一个标志蛋白,高度富集于纤毛,它在个体的生长发育中发挥重要作用,其突变将导致Joubert综合征。近年来,研究还证实Arl13b在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。VEGFR2为血管内皮生长因子受体家族成员之一,主要功能是在各种生理病理情况下诱导内皮细胞的增殖及迁移,介导血管的新生。通过生物信息学分析以及对临床样本研究,我们发现Arl13b在胶质瘤中高表达且与患者预后呈负相关。通过酵母双杂交筛选与Arl13b相互作用蛋白发现Arl13b与VEGFR2具有相互作用。胶质瘤瘤体中血管异常丰富,近年来针对抗肿瘤血管生成这一治疗策略引起人们极大的关注,并且也取得不错的效果。Arl13b是否调控VEGFR2促进肿瘤血管生成进而促进肿瘤生长为本研究论证的重点。本次研究从生物信息学、分子细胞生物学、临床队列研究等多方位进行探索验证,试图阐明Arl13b调控VEGFR2的分子机制,并证明Arl13b-VEGFR2信号轴在调控胶质瘤恶性生长过程中的重要作用及靶点价值。本研究将有助于明确胶质瘤恶性增殖的分子机制,为未来胶质瘤的分子诊断和靶向治疗提供重要理论依据。研究方法与结果:第一部分:酵母双杂交寻找与Arl13b相互作用蛋白方法:1.利用酵母双杂交的方法筛选与Arl13b相互作用的蛋白分子,通过基因功能查询分析选取出感兴趣的基因,利用GST Pull-Down、CO-IP及免疫荧光等方法验证相互作用。2.对Arl13b与VEGFR2各自功能结构域进行分段,寻找它们之间各自结合的区段,以为后期临床转化提供理论基础。结果:1.我们钓取到VEGFR2这个蛋白,经GST Pull-Down、CO-IP、免疫荧光等实验证实它们之间具有相互作用。2.分别纯化Arl13b和VEGFR2后进行MBP Pull-Down实验进一步证实它们之间具有直接相互作用。3.分别对VEGFR2和Arl13b进行分段,CO-IP实验证实Arl13b与VEGFR2的胞内酪氨酸激酶区段结合,VEGFR2与Arl13b全长结合。第二部分:在动物水平探索Arl13b是否调控血管形成方法:1.我们分别将Arl13b条件敲入(Rosa26LSL-Arl13b/+)或条件敲除(Arl13bFL/FL)的转基因小鼠与血管内皮细胞特异表达Cre重组酶转基因小鼠Tie2-Cre/Tek-Cre杂交,分别构建在血管内皮细胞中特异高表达Arl13b和特异敲除Arl13b的转基因小鼠模型,运用视网膜血管染色技术检测Arl13b高表达或敲除的小鼠视网膜血管的形态、分布和密度等情况。2.进一步,我们分别将Arl13b条件敲入(Rosa26LSL-Arl13b/+)或条件敲除(Arl13bFL/FL)的转基因小鼠与诱导型Tek-Cre ERT2杂交,分别构建在血管内皮细胞中特异高表达Arl13b和特异敲除Arl13b的转基因小鼠模型,Tamoxifen诱导,运用免疫荧光技术检测Arl13b高表达或敲除的小鼠脑组织中血管的形态、分布和密度等情况。结果:1.在血管内皮细胞中特异高表达Arl13b,幼鼠眼球视网膜血管脉络前端血管微丝生成增多,同时动静脉血管面积增大;在血管内皮细胞中特异敲除Arl13b后幼鼠眼球视网膜血管脉络辐射半径减小,尖端血管微丝生成减少,动静脉血管面积减小。2.同样,在血管内皮细胞中特异高表达Arl13b后,小鼠脑组织血管数量、面积、分支及出芽数量均增加,内皮细胞之间的连接变松弛;相反,在血管内皮细胞中特异敲除Arl13b后,小鼠脑组织血管数量、面积、分支及出芽数量均减少,血管基膜、周皮覆盖度增加,内皮细胞之间的连接变紧密。第三部分:在动物水平研究Arl13b是否通过影响肿瘤血管生成调控肿瘤生长方法:1.我们将Arl13b条件敲入(Rosa26LSL-Arl13b/+)的转基因小鼠与诱导型Tek-Cre ERT2小鼠杂交,构建在血管内皮细胞中特异高表达Arl13b的转基因小鼠模型(Rosa26LSL-Arl13b/+;Tek-Cre ERT2+),将鼠源的表达荧光素酶的神经胶质瘤细胞GL261-Red-Fluc定位注射到Rosa26LSL-Arl13b/+;Tek-Cre ERT2+及对照小鼠的大脑纹状体区,小动物活体成像监测神经胶质瘤细胞的生长,观察小鼠的生存期。利用免疫荧光方法检测Rosa26LSL-Arl13b/+;Tek-Cre ERT2+和对照小鼠神经胶质瘤组织中血管的形态、分布和密度等情况。2.将Arl13b条件敲除(Arl13bFL/FL)的小鼠与Tek-Cre ERT2杂交,构建在血管内皮细胞中敲除Arl13b的小鼠模型(Arl13bFL/FL;Tek-Cre ERT2+),将鼠源的表达荧光素酶的神经胶质瘤细胞GL261-Red-Fluc定位注射到Arl13bFL/FL;Tek-Cre ERT2+及对照小鼠大脑纹状体区,小动物活体成像监测神经胶质瘤细胞的生长,观察小鼠的生存期。利用免疫荧光方法检测Arl13bFL/FL;Tek-Cre ERT2+和对照小鼠神经胶质瘤组织中血管的形态、分布和密度等情况。3.将Arl13b条件敲除(Arl13bFL/FL)的转基因小鼠与血管内皮细胞特异表达Cre重组酶转基因小鼠Tie2-Cre/Tek-Cre杂交,构建在血管内皮细胞中特异敲除Arl13b的转基因小鼠模型,在敲除Arl13b的小鼠及对照小鼠皮下移植黑色素瘤细胞,监测瘤体的生长情况并运用免疫荧光技术检测Arl13b敲除及对照小鼠瘤体组织中血管的形态、分布和密度等情况。结果:1.在血管内皮细胞中特异高表达Arl13b,小鼠脑部胶质瘤瘤体组织中血管数量、面积及血管芽体数量均增加,血管基膜覆盖度降低,瘤体生长速度快于对照组,小鼠生存期缩短。2.在血管内皮细胞中特异敲除Arl13b,小鼠脑部胶质瘤瘤体生长速度慢于对照组,小鼠生存期得到延长。3.在血管内皮细胞中特异敲除Arl13b后,小鼠皮下黑色素瘤瘤体组织生长速度慢于对照组。敲除Arl13b后,瘤体组织血管数量和面积均减少,血管基膜、周皮覆盖度增加,内皮细胞之间的连接变紧密。第四部分:在血管内皮细胞中研究Arl13b调控VEGFR2信号通路的分子机制方法:1.构建脐静脉内皮细胞ECV304干扰Arl13b的稳定细胞系,免疫荧光检测干扰Arl13b后Arl13b和VEGFR2在细胞纤毛中定位的变化。2.在HEK293T细胞中外转Flag-VEGFR2质粒,同时共转GFP-Arl13b或对照质粒,检测VEGFR2及其下游分子活化水平。3.检测过表达及干扰Arl13b的稳定细胞系中VEGFR2及其下游分子活化水平,同时检测干扰Arl13b后对ECV304细胞迁移、侵袭和血管形成能力的影响。4.在HEK293T细胞中外转Flag-VEGFR2质粒,同时共转HA-Arl13b或对照质粒,检测VEGFR2在细胞膜上定位的变化。结果:1.Arl13b和VEGFR2共定位于纤毛中,干扰Arl13b后VEGFR2在纤毛中的定位减少。2.Arl13b与VEGFR2相互作用,促进VEGF-VEGFR2通路活化。3.Arl13b影响VEGFR2的内吞,过表达Arl13b,细胞膜上VEGFR2量增多。第五部分:探索神经胶质瘤临床样本中Arl13b表达情况及其与患者预后关系方法:1.通过生物信息学方法对GEO数据库中神经胶质瘤相关数据进行分析,明确Arl13b在神经胶质瘤中表达水平。2.收集神经胶质瘤患者的临床组织样本,通过免疫组织化学染色分析Arl13b在人神经胶质瘤组织样本中表达情况。3.采用―德国半定量系统‖评分方法对免疫组织化学结果进行评分统计,通过Kaplan-Meier生存曲线及Log rank检验分析Arl13b表达水平与神经胶质瘤患者生存预后的关系。结果:1.生物信息学分析显示Arl13b在神经胶质瘤中的表达高于其他肿瘤。2.在GEO数据库神经胶质瘤单细胞测序数据中,Arl13b在神经胶质瘤细胞中表达水平高于正常脑组织细胞。3.免疫组织化学染色检测Arl13b在不同分级的人神经胶质瘤组织样本中的表达水平,结果显示Arl13b在神经胶质瘤患者瘤体组织中高表达,且Arl13b的表达水平与神经胶质瘤的分级相关。4.生存分析显示Arl13b在神经胶质瘤中表达水平与患者预后相关,Arl13b表达越高,患者总生存期和无病生存期越短。第六部分:在神经胶质瘤细胞中研究Arl13b促进肿瘤生长的分子机制方法:1.检测不同神经胶质瘤细胞株中Arl13b的表达情况,选取Arl13b低表达的细胞株用过表达Arl13b的慢病毒感染构建过表达Arl13b稳定细胞株。2.利用细胞增殖和迁移实验检测神经胶质瘤细胞过表达Arl13b后对细胞增殖和迁移的影响,以及用Hedgehog通路抑制剂GANT61处理后对细胞增殖和迁移的影响。3.检测过表达Arl13b的神经胶质瘤稳定细胞系中Hedgehog靶基因的表达量,同时检测VEGF-A的表达量变化。4.用慢病毒感染U118-MG和U87-MG细胞构建过表达Gli2激活形式（Gli2A）的稳定细胞系,检测Hedgehog靶基因的表达量,同时检测VEGF-A的表达量变化。同时利用Hedgehog通路抑制剂GANT61抑制通路活性,检测VEGF-A的表达量变化。5.构建VEGF-A启动子区荧光素酶报告基因质粒,双荧光素酶报告基因实验验证Gli2是否调控VEGF-A。6.免疫荧光检测过表达Arl13b的神经胶质瘤稳定细胞系中Arl13b在外泌体中定位情况。收集培养上清,提取上清中外泌体,检测Arl13b是否随外泌体分泌。7.用提取的外泌体培养血管内皮细胞ECV304,免疫荧光检测Arl13b是否随外泌体被ECV304细胞摄取,并检测ECV304细胞中VEGFR2及其下游分子活化水平。结果:1.在检测的4株神经胶质瘤细胞系中,U87-MG细胞系中Arl13b表达量最低,用过表达Arl13b慢病毒感染U87-MG细胞系后,细胞中Hedgehog通路被激活。2.过表达Arl13b后,U87-MG细胞的增殖能力增强,用GANT61抑制通路活性后,U87-MG细胞的增殖能力受到抑制。3.过表达Arl13b后,U87-MG细胞的迁移能力加强,用GANT61抑制通路活性后,U87-MG细胞的迁移能力受到抑制。4.过表达Arl13b后,U87-MG细胞中Hedgehog通路被激活促进VEGF-A的表达。5.在神经胶质瘤细胞U118-MG和U87-MG中,过表达Gli2A激活Hedgehog通路并促进VEGF-A的表达。用GANT61抑制通路活性后,VEGF-A表达下调。6.双荧光素酶报告基因实验证实Hedgehog通路能够调控VEGF-A的表达。7.在神经胶质瘤细胞中,异常高表达的Arl13b能够随外泌体分泌至胞外,并且能够被血管内皮细胞摄取,促进VEGF-VEGFR2通路活化。结论:1.Arl13b激活Hedgehog信号通路促进神经胶质瘤生长,活化的Hedgehog通路促进VEGF-A的表达促进瘤体血管生成。2.神经胶质瘤细胞中Arl13b以外泌体形式分泌至组织间隙中被血管内皮细胞摄取,摄取的Arl13b与VEGFR2结合激活VEGF-VEGFR2通路,促进瘤体血管生成。3.Arl13b与VEGFR2相互作用协同VEGF激活VEGF-VEGFR2通路,促进神经胶质瘤血管生成,促进瘤体的生长。

张文超^[5]（2021）在《抑制TMAO生成对慢性肾脏病及相关心血管损害的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景肠道微生物菌群与人类健康的关系在近年来受到了广泛关注。氧化三甲胺（Trimethylamine N-oxide,TMAO）是一种肠道微生物菌群代谢产物,胆碱或左旋肉碱等食物前体进入人体肠道以后,在肠道微生物菌群的作用下分解为中间产物三甲胺（Trimethylamine,TMA）,TMA吸收入血后进一步在肝脏含黄素单加氧酶（Flavin-containing monooxygenases,FMO）作用下氧化为 TMAO。几宗大型的临床研究显示,TMAO与心血管疾病（Cardiovascular disease,CVD）的关系十分密切,CVD患者的血浆TMAO水平与对照组相比明显升高,并且与动脉粥样硬化的严重程度呈剂量依赖性关系,可显着增加主要不良心血管事件（Major adverse cardiovascular events,MACE）如死亡、心肌梗死、中风等的发病风险。动物实验亦显示,采用胆碱或TMAO喂养小鼠可引起小鼠TMAO循环水平的增高,导致或加重动脉粥样硬化,诱导心肌细胞肥大、加重心肌纤维化及心脏功能恶化。在TMAO生成过程中,肠道菌群TMA裂解酶将胆碱等前体物质转换为TMA是整个代谢过程中最为关键的步骤。碘甲基胆碱（Iodomethylcholine,IMC）是Stanley Hazen等人通过长期研究和设计筛选出的肠道菌群TMA裂解酶抑制剂,可通过抑制TMA裂解酶的活性有效减少胆碱饮食小鼠体内TMA乃至TMAO的生成,降低动脉粥样硬化及血栓栓塞风险。慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）是全球范围内严重影响人类健康的主要疾病之一。CKD与CVD的关系十分密切,研究显示随着CKD患者肾功能的不断恶化,其心血管事件的发病率亦明显增加,并且与以CVD为主要病因的早死密切相关。人体循环中的TMAO主要经肾脏排泄,CKD时肾功能的减退导致TMAO排泄减少和清除不足,从而导致TMAO在体内蓄积,使得CKD患者成为了天然的高TMAO人群。研究表明,高循环水平的TMAO可显着增加CKD患者的CVD发病风险及死亡风险。因此,如能有效降低CKD患者的TMAO循环水平,极有可能在一定程度上减轻CKD相关的心血管损害。另一方面,有研究发现,胆碱或TMAO饮食可直接引发小鼠的肾脏纤维化和肾功能损害,提示升高的TMAO循环水平不仅是肾脏功能减退的结果,更可以作为病因反过来进一步加重肾脏损害,造成恶性循环。因此,降低CKD患者的TMAO循环水平,可能不仅有利于减少CKD相关的心血管并发症,更有利于保护肾脏本身,延缓CKD的肾脏病变进展。鉴于TMAO对人类健康与疾病的重大影响,广大研究学者一直不断探索和寻找TMAO发挥生物学效应的具体分子机制。Marcus Seldin等人已经证明TMAO可以诱发血管内皮细胞炎症,其中NF-κB信号通路的激活在这一反应中发挥了重要作用。最近,Sifan Chen等人在肝细胞中证明了TMAO可以参与细胞内质网未折叠蛋白反应（Unfolding protein response,UPR）中的一条通路,即TMAO可直接与肝细胞内质网的PERK蛋白相结合,证实了 PERK为TMAO的直接作用靶点,这为研究TMAO的生物学效应及分子机制提供了新的思路。以往的研究表明,PERK信号通路在NF-κB的激活方面具有重要作用:正常情况下NF-κB被IκBα结合以维持其非激活状态,而PERK可通过激活其下游的eIF2α而降低IκBα的转录水平,导致未被结合的自由形式的NF-κB含量增多,于是有更多的NF-κB进入细胞核而被活化。鉴于以上理论基础我们不禁联想,如果TMAO能对NF-κB信号通路起激活作用,那很有可能是通过PERK信号途径实现的,然而目前尚未见类似方面的报道。为此,本课题拟从整体动物水平和细胞水平两个层面,研究肠道菌群TMA裂解酶抑制剂IMC能否有效降低CKD小鼠的TMAO循环水平,以及抑制TMAO生成后能否延缓CKD小鼠的肾脏病变进展并对CKD相关心血管损害起到改善作用,同时利用体外实验探讨PERK、NF-κB信号通路在TMAO诱导的肾脏损伤中的作用,阐明TMAO导致肾脏损伤的具体分子机制,为揭示TMAO的生物学效应提供新的思路,为CKD及相关心血管损害的干预和治疗提供新的靶点,为TMA裂解酶抑制剂应用于临床提供理论依据。研究目的（1）通过腺嘌呤喂养构建CKD的小鼠模型,观察TMAO水平与肾脏损伤的关系,同时探讨IMC抑制TMAO生成后,能否延缓CKD小鼠的肾脏病变进展,改善肾功能;（2）体外条件下,研究TMAO对肾脏上皮细胞的损伤作用,通过观察PERK、NF-κB信号通路的改变及相关抑制剂的阻断作用,探索TMAO导致肾脏损伤的具体分子机制;（3）观察CKD小鼠相关心血管损害的表现及严重程度,明确IMC抑制TMAO生成能否改善CKD相关的心血管并发症。研究方法1动物模型动物实验1:采用腺嘌呤喂养的方法建立CKD小鼠模型。选择4周龄的健康雌性apoE敲除小鼠,按照以下饮食随机分为4组:（1）普通饮食组（Con组）;（2）普通饮食+0.06%IMC组（Con+IMC组）;（3）普通饮食+0.2%腺嘌呤组（Ade组）;（4）普通饮食+0.2%腺嘌吟+0.06%IMC组（Ade+IMC组）。喂养12周末,将每只小鼠单独放入代谢笼中过夜,收集24h尿液。喂养14周末,处死小鼠并留取组织及空腹血,称取各器官重量。动物实验2:选择4周龄的健康雌性apoE敲除小鼠,按照以下饮食随机分为2组:（1）普通饮食组（Con组）;（2）普通饮食+腺嘌呤组（Ade组）,共喂养24周,其中Ade组前14周饮食中腺嘌呤的含量为0.2%,后10周腺嘌呤的含量为0.15%,Con组饮食保持不变。喂养24周末,行小鼠超声心动图检查后处死小鼠,留取血液标本及组织用于后续实验。2超声心动图检查采用二维、M型超声心动图技术观察小鼠左室肥厚情况,获取小鼠心脏的室间隔（Interventricular septum,IVS）厚度、左室内径（Left ventricular internal dimension,LVID）、左室后壁（Left ventricular posterior wall,LVPW）厚度、左室体积（Left ventricular volume,LV Vol）、左室质量（LV mass）、左室质量/体重比值（LV mass/Body weight）、左室射血分数（LV ejection fraction,LVEF）等指标。3生化指标检测质谱分析法检测血浆TMA、TMAO、肌酐和吲哚酚硫酸盐的含量。比色法检测血浆尿素水平。ELISA法检测血浆成纤维细胞生长因子23（Fibroblast growth factor 23,FGF23）、胱抑素C的含量。尿白蛋白及尿肌酐水平分别用ELISA和比色法进行测定,计算尿白蛋白/肌酐比值（Albumin to creatinine ratio,ACR）。采用酶比色法检测血浆总胆固醇（Total cholesterol,TC）、高密度脂蛋白胆固醇（High density lipoprotein cholesterol,HDL-C）、甘油三酯（Triglyceride,TG）的含量,计算极低密度/中间密度/低密度脂蛋白胆固醇（Very low density/Intermediate density/Low density lipoprotein cholesterol,VLDL/IDL/LDL-C）的含量。TNF-α 和IL6的测定采用ELISA方法进行。4 组织病理学检测小鼠肾脏组织石蜡切片,Masson染色检测小鼠肾脏的胶原沉积,计算胶原含量及肾皮质瘢痕面积。小鼠主动脉根部冰冻切片,油红O染色观察小鼠主动脉根部的脂质染色区域并对其进行定量（斑块面积）。小鼠主动脉根部冰冻切片,茜素红染色观察小鼠主动脉根部的阳性染色区域并对其进行定量（钙化面积）。5细胞培养与实验分别培养小鼠肾脏内髓集合管上皮细胞（Murine inner renal medullary collecting duct cells,mIMCD3）、正常人原代肾近曲小管上皮细胞（Normal human primary renal proximal tubule epithelial cells,RPTEC）和 Madin-Darby 犬肾脏 Ⅱ 型上皮细胞（Madin-Darby canine kidneyⅡcells,MDCKⅡ）,采用不同浓度的 TMAO刺激上述3种肾脏上皮细胞,留取细胞用于提取RNA或总蛋白。另取MDCKⅡ细胞,于6孔板中培养24h后,分为以下4组进行抑制剂干预实验:（1）Control组:正常培养液;（2）Inh组:正常培养液+100nMNF-κB抑制因子Ⅳ;（3）TMAO组:正常培养液+200μM TMAO;（4）TMAO+Inh组:正常培养液+200μM TMAO+100nMNF-κB抑制因子Ⅳ。给予上述刺激48h后,留取细胞用于提取细胞RNA。最后培养小鼠RAW264.7巨噬细胞,采用不同浓度的TMAO进行刺激,留取细胞用于提取RNA。6 RNA提取及实时定量RT-PCR根据制造商提供的说明,使用miRNeasy Mini试剂盒或Qiazol法从组织或细胞样本中分离总RNA。采用高效cDNA反转录试剂盒合成cDNA。应用基因特异性引物和SYBR green荧光染料在罗氏Lightcycler 480系统中进行实时定量RT-PCR。7 RNA测序使用Illumina（?）TruSeqTM试剂盒制备RNA文库。插入条形码后,采用50bp单端测序法在HiSeq4000上进行测序。使用FastQC软件对测序数据进行质控分析。使用STAR aligner version 2.3.1将序列读断对比到小鼠基因组上。计数数据采用DESeq2比率中值法进行标准化。使用DEseq2进行差异表达分析。采用DAVID 6.8进行基因本体分析,获得富集的信号通路。8 Western blot分离并提取处理后的MDCKII细胞蛋白。Western blot检测磷酸化NF-κB p65、总 NF-κB p65、磷酸化 PERK、总 PERK、磷酸化 eIF2α、总 eIF2α、磷酸化 IRE1α、总IRE1α、ATF4和GAPDH的蛋白表达水平。9统计分析两组间比较采用独立样本t检验。对于单因素实验设计,采用单因素ANOVA方差分析及Turkey多重检验,对于双因素实验设计,采用双因素ANOVA方差分析及Holm-Sidak post hoc多重检验。所有的统计过程均通过软件GraphPad Prism version 8完成,以P<0.05为差异具有统计学意义。研究结果1IMC可降低CKD小鼠的血浆TMAO水平14周喂养结束后（动物实验1）,与Con组相比,Con+IMC组小鼠的血浆TMAO水平明显下降,TMA水平亦具有下降趋势,证明了 IMC抑制TMAO生成的有效性。与Con组相比,Ade组小鼠的血浆TMAO水平明显升高,提示CKD小鼠体内存在TMAO的蓄积。而Ade+IMC组小鼠的血浆TMAO水平较Ade组明显下降,且TMA水平与Ade组相比亦具有下降趋势,提示IMC可有效降低CKD小鼠的血浆TMAO水平。2抑制TMAO生成可改善CKD小鼠的肾脏功能与Con组相比,Ade组小鼠的血浆肌酐、尿素、胱抑素C等肾脏损伤标志物的水平明显升高,提示腺嘌吟可引起小鼠肾脏功能损害,导致CKD。而Ade+IMC组小鼠与Ade组相比,上述标志物的循环水平显着下降,提示IMC减轻了腺嘌呤导致的肾脏功能损害。另外,Ade组小鼠的吲哚酚硫酸盐毒素的循环水平较Con组升高,尿ACR亦显着增加,而Ade+IMC组小鼠的上述指标明显降低,提示抑制TMAO生成可显着改善CKD小鼠的肾脏功能。同时,各组小鼠的日平均进食量没有明显差别,排除了饮食摄入不平衡对实验结果的影响。3抑制TMAO生成可减轻CKD小鼠的肾脏病理改变Masson染色检测小鼠肾脏组织中的胶原沉积,计算胶原含量及皮质瘢痕面积。结果显示,Con组及Con+IMC组小鼠的肾脏组织学基本正常,而Ade组和Ade+IMC组小鼠肾脏中均出现了胶原的沉积及皮质瘢痕等病理改变。定量结果进一步显示,Ade+IMC组小鼠肾脏的胶原含量及皮质瘢痕面积虽较Con组增加,但仍显着少于Ade组,提示抑制TMAO生成可在一定程度上减轻腺嘌呤导致的肾脏病理改变。4抑制TMAO生成可减轻腺嘌吟引起的肾脏炎症和纤维化、改善肾脏代谢状态实时定量RT-PCR结果显示,Ade组小鼠肾脏中Ccl2、Ccl20、Lcn2等炎症基因及Col1a1、Col3a1等纤维化基因的表达显着增加,而IMC可显着降低上述基因的表达水平。RNA测序及David通路分析结果显示,与Ade组相比,Ade+IMC组小鼠肾脏中细胞外基质、蛋白酶抑制剂、补体与凝血级联、免疫、细胞因子等方面的表达水平下调,而在脂质代谢、线粒体、离子转运、内质网、细胞水稳态等方面的表达水平上调,提示IMC可减轻腺嘌呤引起的肾脏炎症和纤维化,并显着改善CKD小鼠肾脏的整体代谢状态。5 TMAO可导致肾脏上皮细胞炎症采用不同浓度的TMAO处理上述3种类型的肾脏上皮细胞。在mIMCD3细胞中,与空白对照组相比,20mM TMAO组细胞内Il1β基因的表达水平明显上调,40mMTMAO组细胞内Il1β、MIP2和Lcn2基因的表达水平均明显上调。在RPTEC细胞中,与空白对照组相比,200μMTMAO组细胞内CCL2基因的表达明显上调,400μM TMAO组细胞内CCL2和TNF-α基因的表达明显上调。在MDCKⅡ细胞中,实时定量RT-PCR结果显示,与空白对照组相比,50μM、100μM、200μMTMAO组细胞内多个炎症基因的表达水平均显着增加,包括IL8、CCL2、CCL20等。通过以上结果可以确定,TMAO可导致肾脏上皮细胞炎症。而UPR反应中PERK信号通路下游相关基因的表达并没有明显变化,包括ATF4和CHOP。6 TMAO可激活肾脏上皮细胞的NF-κB信号通路采用200μM TMAO刺激MDCKⅡ细胞48h,Western blot检测相关通路的蛋白含量。结果显示,TMAO刺激48h后MDCKⅡ细胞内磷酸化NF-κB p65及磷酸化NF-κB p65/总NF-κB p65的比值均显着增加,提示TMAO可能通过激活肾脏上皮细胞的NF-κB信号通路发挥生物学效应。而内质网应激相关通路蛋白,包括磷酸化PERK/总PERK、磷酸化eIF2α/总eIF2α、磷酸化IRE1α/总IRE1α及ATF4的表达均未见明显变化,提示内质网未折叠蛋白反应可能与TMAO导致的肾脏上皮细胞炎症并无明显关联。7 NF-κB抑制剂可阻断TMAO的促炎作用将 MDCKⅡ 细胞分为 Control 组、Inh 组、TMAO 组、TMAO+Inh 组（详见上述方法部分）。实时定量RT-PCR检测各组细胞中炎症基因的表达情况。结果显示,TMAO组细胞内炎症基因的表达水平显着增高,与上述结果相一致;而TMAO+Inh组与TMAO组相比,其细胞内炎症基因包括IL8、CCL2、CCL20的表达水平显着降低,提示NF-κB抑制剂可以阻断TMAO对MDCKⅡ细胞的促炎作用,证实了 NF-κB信号通路在TMAO生物学效应中的关键作用。8 TMAO对巨噬细胞亦具有促炎作用巨噬细胞在腺嘌呤诱导的CKD形成过程中发挥重要作用。为明确TMAO是否亦对巨噬细胞产生影响,我们采用含200μM TMAO的培养液孵育RAW264.7巨噬细胞,24h后发现其细胞内炎症基因的表达水平明显上调,包括Cox2、Il1β、MIP2和TNF-α等。因此,TMAO不仅对肾脏固有上皮细胞具有促炎作用,亦可诱发巨噬细胞炎症,从多个方面加重肾脏损伤。9抑制TMAO生成可减轻CKD小鼠的心肌肥厚喂养14周末,分别称取Con组、Con+IMC组、Ade组、Ade+IMC组各组小鼠的体重及心脏重量,计算心脏/体重比值。结果显示,Con组与Con+IMC组小鼠的心脏/体重比值无明显差异,而Ade组小鼠的心脏/体重比值显着增加,提示CKD小鼠存在心肌肥厚。与Ade组相比,Ade+IMC组小鼠的心脏/体重比值明显下降,达正常水平,提示抑制TMAO生成可减轻CKD小鼠的心肌肥厚。FGF23是一种骨源性激素,已被证明可引起左心室肥厚。我们检测了各组小鼠体内FGF23的循环水平,结果显示,与Con组相比,Ade组小鼠的FGF23循环水平显着增加,而Ade+IMC组小鼠的FGF23循环水平较Ade组相比显着下降,提示补充IMC可显着降低腺嘌呤喂养导致的高FGF23血症,部分解释了 Ade+IMC组小鼠心肌肥厚改善的原因。10抑制TMAO生成可改善CKD小鼠的血脂代谢紊乱测量上述4组小鼠的血脂水平。结果显示,与Con组相比,Ade组小鼠的TG、TC、VLDLIDLLDL-C的含量均明显上升,提示腺嘌呤喂养加重了 apoE敲除小鼠的高脂血症。而Ade+IMC组与Ade组相比,其TC、VLDLIDLLDL-C的水平均显着下降,提示抑制TMAO生成可改善CKD小鼠的血脂代谢紊乱。11抑制TMAO生成对CKD小鼠血管病变的影响采用油红O染色对小鼠主动脉根部动脉粥样硬化斑块面积进行检测和定量分析,结果显示以上4组小鼠的平均动脉粥样硬化斑块面积并没有明显差异。采用茜素红染色对小鼠主动脉根部动脉钙化面积进行检测和定量分析,各组小鼠的平均动脉钙化面积亦没有明显差异。以上结果提示腺嘌呤所致的CKD小鼠模型并没有出现动脉粥样硬化或动脉钙化的加剧,因而本次实验无法观察抑制TMAO生成对CKD小鼠动脉粥样硬化及动脉钙化的影响。提取各组小鼠主动脉RNA行实时定量RT-PCR。结果显示,与Con组、Con+IMC组相比,Ade组、Ade+IMC组小鼠主动脉中炎症基因Ccl2、Cox2、116、Vcam1的表达水平均显着降低,表明腺嘌呤本身可显着降低小鼠主动脉局部的炎症反应。腺嘌呤是腺苷代谢合成的底物,腺苷受体在抑制血管炎症方面具有重要作用。我们检测了小鼠主动脉中腺苷受体基因的表达水平,结果发现,与Con组相比,Ade组小鼠主动脉中A2B型腺苷受体的表达具有明显变化,提示腺苷-腺苷受体途径可能参与了腺嘌呤对动脉粥样硬化的保护过程。12延长腺嘌吟喂养周期对CKD小鼠动脉粥样硬化的影响动物实验2中我们将腺嘌呤喂养周期延长到24周。生存曲线显示Con组小鼠在整个实验周期中未发生死亡,Ade组小鼠在实验结束时,有半数的小鼠出现死亡。从第12周起,两组小鼠的体重开始出现差异,Ade组小鼠的体重水平显着低于Con组。实验结束时,Ade组小鼠体内的血浆肌酐、尿素、胱抑素C和TMAO水平较Con组显着升高,并且其血浆TNF-α和IL6的水平也显着升高,提示腺嘌呤喂养加重了 apoE敲除小鼠的炎症状态。再次采用油红O染色对小鼠主动脉根部动脉粥样硬化斑块面积进行检测和定量分析,结果发现,Con组与Ade组小鼠之间的平均动脉粥样硬化斑块面积仍然没有明显差异。13延长腺嘌吟喂养周期对CKD小鼠心肌肥厚的影响实验结束时对小鼠进行心脏超声检测,结果显示,与Con组相比,Ade组小鼠心脏舒张末期的 IVS、LVID、LV Vol、LV mass 和 LV mass/Body weight 均显着增加,LVPW具有增加趋势但尚未达统计学意义,LVEF在两组之间没有明显差别。小鼠处死后称取实际的心脏重量,计算心脏/体重比值,Ade组小鼠的心脏/体重比值显着高于Con组。上述结果再次证实了腺嘌呤诱导的CKD小鼠模型存在心肌肥厚的并发症,由于心室壁厚度和心室腔内径几乎同比例增加,因而此模型下的心肌肥厚可能以离心型肥厚为主要改变。研究结论（1）腺嘌呤诱导的CKD小鼠模型中存在TMAO循环水平的增高,肠道菌群TMA裂解酶抑制剂IMC可通过抑制TMAO生成减轻CKD小鼠的肾脏炎症及纤维化等损伤,并显着改善肾功能;（2）体外实验证实TMAO可诱导肾脏上皮细胞炎症,其中NF-κB信号通路在此过程中发挥了关键作用,巨噬细胞炎症也可能参与了TMAO导致的肾脏损伤过程;（3）腺嘌呤诱导的CKD小鼠模型存在心肌肥厚并发症,应用IMC抑制TMAO生成可显着改善心肌肥厚,减轻CKD相关心血管损害。

李成盼^[6]（2021）在《早期肿瘤行为片上建模研究》文中认为癌症是全球的主要死亡原因,严重威胁人类健康。癌症是一种阶段性演进的复杂疾病,涉及肿瘤早期生长和晚期转移。处于肿瘤早期的患者,通过手术、化疗、放疗等手段的干预可以取得较好的预后。然而,大部分肿瘤患者在早期通常没有明显的临床不适症状,初次就诊时己处于肿瘤晚期。由于缺乏有效的转移肿瘤治疗方案,导致患者生存率极低。因此,全面了解原发肿瘤早期发展以及转移肿瘤的早期形成,对于肿瘤的治疗具有重要意义。当前,研究体内肿瘤行为的常规方法是肿瘤成像,然而成像仪器仅能检测大小为毫米量级以上的肿瘤,从肿瘤发生至肿瘤生长为毫米尺度这一过程中（本文定义为肿瘤早期）,由于无法成像,肿瘤的发展及肿瘤细胞的行为仍不清楚。类似地,肿瘤在经血管远端转移并定植的过程中,肿瘤细胞经内渗、外渗及定植形成转移肿瘤的动态过程也因难以跟踪而少有报道。传统的二维细胞培养模型无法复现体内的肿瘤微环境,动物模型又与人存在种属差异且无法可视化。因此,构建新型体外肿瘤模型十分必要。近年来,随着微流控技术的发展,在芯片上模拟肿瘤行为成为可能。然而,当前的片上肿瘤尺寸依然较大（直径大于300 μm）,不仅不能揭示肿瘤极早期行为,也很少涉及转移肿瘤的形成过程。据此,本文设计制作了微流控芯片,分别用于原发肿瘤早期（直径小至30μm）发展以及转移肿瘤（继发肿瘤）早期形成的建模研究,主要研究内容如下:首先,设计制作了一款微流控芯片,将原代内皮细胞及细胞外基质混合注入芯片中进行动态培养以构建血管芯片。主要结果显示,内皮细胞通过自组装形成了片上微血管网络,内皮细胞密度及流动影响着微血管网络的结构,血管内皮生长因子能够诱导血管出芽。其次,基于研制的血管芯片,整合芯片外制备的肿瘤球,研究了原发肿瘤的早期发展。主要结果表明,血管生成和成纤维细胞能够促进原发肿瘤生长和肿瘤细胞迁移,肿瘤尺寸越小,肿瘤细胞迁移能力越强。肿瘤的演进会导致肿瘤周围血管异常,如血管密度低、管径不一、杂乱无章等。此外,本研究首次片上复现了肿瘤细胞上皮间质转化的动态过程以及血管拟态的形成。最后,设计制作了另一款微流控芯片,将肝细胞、肝星状细胞、原代内皮细胞及细胞外基质混合注入芯片中进行三维动态共培养,以构建血管化肝脏微环境。基于该芯片,研究了转移肿瘤的早期发展过程,可视化展示了乳腺癌细胞内渗进入血管、外渗出血管并定植生长的动态过程。主要结果显示,转移肿瘤的形成会影响转移部位的细胞功能。本文不但体外模拟了早期肿瘤行为,也展示了肿瘤细胞的转移定植过程,为原发肿瘤早期发展及转移肿瘤早期形成的研究提供了新思路。本研究对肿瘤芯片构建、肿瘤药物筛选以及肿瘤诊断治疗具有重要的参考价值。

梁宇^[7]（2021）在《流感病毒载体重组肺炎支原体P基因及其免疫原性的研究》文中指出肺炎支原体（MP）是影响老年人长寿和儿童健康最重要的病原体之一,但针对MP的人用疫苗全球尚未研发成功,其原因包括MP灭活疫苗免疫原性较差且有免疫激化副反应,亚单位疫苗保护效果不佳,而MP减毒活疫苗存在残留毒力和毒力返祖等副作用。因此本研究提出以流感病毒株作为载体研制MP基因工程疫苗的新思路。流感病毒甲型毒株A/Puerto Rico/8/34（H1N1）（简称PR8）是鸡胚适应株,世界卫生组织将其推荐为流感病毒疫苗株供体株。本课题以PR8流感病毒株为载体,在非结构蛋白NS基因中插入MP粘附因子P1、P30的主要抗原基因P1a、P30a,构建重组载体NS-P1a或NS-P30a,连同PR8的其余7个片段的重组质粒共转染HEK293T细胞后,接种鸡胚培养并拯救出重组流感病毒rFLU-P1a和rFLU-P30a。对重组病毒做RT-PCR鉴定扩增出P1a（693bp）、P30a（774bp）、NSP1a（1992bp）和 NSP30a（2073bp）条带,测序结果正确。在鸡胚中连续传5代并测血凝效价,rFLU-P1a和rFLU-P30a分别稳定在1:128和1:32,PCR鉴定扩增出P1a、P30a条带,表明重组病毒可以稳定传代。rFLU-P1a和rFLU-P30a大规模接种鸡胚培养收获尿囊液,经连续流离心澄清、0.45μm滤柱、超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心、脱糖和0.2μm除菌过滤后,收获病毒纯化液,进行血凝效价、卵清蛋白等的检测,结果显示rFLU-P1a、rFLU-P30a病毒纯化液血凝效价分别为1:1024和1:256,卵清蛋白均<31.3 ng/mL。电镜观察重组病毒形态,可见病毒具有囊膜。测定rFLU-P1a和rFLU-P30a感染性滴度lgTCID50/mL分别为8.3和8.2。将高（原倍）、中（106TCID50）、低（1 05TCID50）剂量的重组病毒分别滴鼻/肌注接种BALB/c小鼠,25μl/只,免疫两次（间隔21天）,并设置空白对照组和PR8病毒对照组,进行如下免疫原性评价实验:①酶联免疫吸附实验检测血清中MP抗体,一免结果显示rFLU-P1a和rFLU-P30a组OD值均显着高于空白对照组（0.0710±0.01039）和 PR8 对照组（0.07825±0.006065）（P<0.05）,其中以 rFLU-P1a 和rFLU-P30a高剂量滴鼻组最为显着（分别为0.5815±0.03402和0.6151±0.03011）,同剂量滴鼻组抗体水平高于肌注组,二免与一免结果无显着差异。②MP代谢抑制实验结果显示rFLU-P1a滴鼻组和肌注组高、中、低剂量一免血清几何平均滴度（GMT）分别为 13.93、8、2、6.96、2.30 和 0,rFLU-P30a 的 GMT 分别为 13.93、6.96、2、6.06、2.30和0,可见同剂量滴鼻组高于肌注组,高、中剂量组结果显着高于低剂量组,且都高于空白对照组和PR8对照组,二免与一免结果相似。③免疫荧光法检测MP粘附抑制实验,可在荧光显微镜下看到rFLU-P1a和rFLU-P30a高、中剂量组血清能抑制MP对A549细胞的粘附。④血凝抑制（HI）试验结果显示PR8对照组、rFLU-P1a和rFLU-P30a滴鼻组HI抗体效价水平均高于1:40,显着高于空白对照组（P<0.05）。⑤对小鼠进行MP攻毒实验,测量湿重肺指数、肺组织MP计数、肺组织病理学切片等,结果表明rFLU-P1a和rFLU-P30a滴鼻免疫小鼠能保护MP对其的损伤。本研究首次在流感病毒载体NS基因内插入肺炎支原体P基因,拯救出的重组病毒免疫小鼠能够产生抗MP和抗流感的免疫应答,为MP疫苗的研制奠定了基础,具有重要的社会意义和应用价值。

吴泽^[8]（2021）在《基于智能手机的免疫传感方法的研究及其在体外诊断中的应用》文中研究指明背景随着生活水平的提升,人们越来越关注自身的健康问题,对体外诊断技术尤其是可在现场使用的快速诊断技术的需求也越来越旺盛。近年来,归功于日益强大的功能及越来越高的普及度,智能手机已在体外诊断领域得到了广泛应用。目的研发新型的基于智能手机的免疫传感诊断系统,并应用于临床验证。方法制作两种基于智能手机的便携式免疫传感检测平台:（1）设计研制基于智能手机的酶联免疫层析传感器（ELICS）,对传感系统的制作工艺以及检测流程进行优化,并对癌胚抗原（CEA）进行检测验证,以判断其在临床诊断中的应用可行性。（2）设计研制基于智能手机的高通量光纤免疫传感器（HFIS）,并设计了配套的手机应用程序,对组成结构的制作组装过程进行了优化,并论证了它们的可行性和稳定性,然后整合系统应用于SARS-CoV-2结合抗体（IgG）和核衣壳蛋白（N蛋白）的检测分析。结果（1）成功建立了低成本可靠的基于智能手机的ELICS平台,该便携式传感系统由特殊设计的一次性免疫层析装置和结果阅读装置两个部分组成,在免疫层析装置上进行免疫测定和酶催化显色以形成生物传感通道,通过传感通道的透射光强度被智能手机上的环境光传感器直接读取。对于CEA的线性检测范围（LDR）为 0.031-1.95 ng/ml,检测限（LOD）为 0.016 ng/ml,并能实际用于临床样本的即时检测,检测结果与常规ELISA结果的相关性好（R2=0.999）。（2）成功建立了基于智能手机的可用于高通量检测的光纤免疫传感（HFIS）平台,该传感平台由基于径迹蚀刻膜（TE膜）的免疫学高通量检测板及基于光纤的微孔板阅读仪构成,利用TE膜的高效滤过及低吸附特性,配合免疫微球进行高通量快速免疫检测后酶催化底物显色,再利用光纤优秀的导光特性将透射光信号集中到一起,从而能利用手机近距离进行大规模信号捕捉,配合相应的APP进行结果数据处理及分析。对于SARS-CoV-2 IgG的临床样本检测结果与ELISA相关性好（R2=0.9362）,检出率更高,无需繁杂洗涤及孵育步骤;对于N蛋白标准品的检测LDR为7.8-1000pg/ml,LOD为7.5 pg/ml,比传统ELISA的检测灵敏度更高,线性范围更宽,检测结果与Simple western结果相关性好（R2=0.9781）。结论（1）提出的ELICS平台装置小巧,对于小批量样本能实现更快速和直接数字定量检测。（2）提出的HFIS平台检测灵敏度高,便携且操作简单,适合于批量样本快速痕量检测分析。研发的两种基于智能手机的免疫传感平台均能实现快速检测,且不依赖大型仪器,灵敏度高,制作及使用成本低,适用于现场检测。均具有很好的平台适用性,通过更换对应的抗体或配体,在临床诊断及初筛、个性医疗、环境监测、食品安全检测等领域都具有很好的应用前景。

刘远远^[9]（2020）在《壳聚糖功能载体构建及其溶菌酶与蛋白酶固定化研究》文中指出我国禽蛋资源丰富,目前食品工业中蛋清液使用量非常巨大,但是其加工方式相对传统,导致蛋清资源利用率较低。因此,通过科学、先进的加工技术提高蛋清液的综合利用价值意义重大。本文提出利用固定化酶技术提高蛋清液的利用价值的思路,并选择在食品领域应用广泛的壳聚糖作为构建功能载体的基质材料。本研究通过纳米二氧化硅杂化法和p H诱导法对壳聚糖膜的性能进行改善,使其适用于溶菌酶的包埋固定化,以期制备出性能良好的抑菌型食品包装膜,提高蛋清溶菌酶的应用效能。选择壳聚糖微球作为蛋白酶固定化载体,开展壳膜粉/壳聚糖复合微球的制备,设计和构建了新型多孔壳聚糖微球,使其多孔结构更加丰富,固定化蛋白酶催化活性升高,能有效应用于蛋清酶解改性,对实现蛋清液的高效和可控酶解具有良好的应用价值,对禽蛋产业发展具有一定的科学意义。主要研究内容和结果如下:（1）通过有机-无机杂化的方法,向壳聚糖膜中加入不同含量纳米二氧化硅,并利用传统的中和法对复合膜进行氢氧化钠溶液浸泡处理。纳米二氧化硅与壳聚糖分子通过物理相互作用增加了膜内分子网络结构的交联程度,降低了壳聚糖复合膜的溶胀率。当二氧化硅含量为25%时,复合膜拉伸强度提升最大,相当于纯壳聚糖膜的212.88%。但是,传统的氢氧化钠处理会导致壳聚糖/纳米二氧化硅复合膜固定化溶菌酶的活性比未经氢氧化钠处理的下降超过90%,并且对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的生长都没有显着的抑制作用。（2）利用p H诱导法处理壳聚糖成膜溶液,随着成膜溶液的p H值增加,壳聚糖分子链所带电荷减少,分子间作用力增加,所得壳聚糖膜在未经任何处理的情况下,溶胀率显着下降。p H 6.5时所制备壳聚糖膜的机械性能最好,断裂伸长率相当于未经p H诱导的CS膜的122.98%,同时其溶胀率仅为CS膜的36.64%。当p H值大于6.5时,溶液中壳聚糖分子内和分子间作用力增加发生团聚,导致成膜后内部结构的均匀性和连续性被破坏,膜的性能下降。（3）结合有机-无机杂化和p H诱导两种方法,向p H调节至6.5的壳聚糖/纳米二氧化复合膜中加入溶菌酶制备CSNSLs复合膜。溶菌酶的加入可以提升复合膜的耐水性能、透光度和表面平整度,并在一定范围提高复合膜的机械性能。当溶菌酶含量为4%时拉伸强度和断裂伸长率分别为未添加溶菌酶时的126.36%和116.78%,且溶胀率低于25%。p H诱导法制备的CSNSL复合膜不会对溶菌酶产生破坏,其溶菌酶活性和抑菌性能都随着溶菌酶含量的增加而显着升高。（4）以鸡蛋壳内膜粉替代部分壳聚糖,制备出复合微球CSESM,壳内膜粉的加入显着提高了复合微球的固定化酶负载量。同时壳内膜粉的加入会改变壳聚糖微球的内部孔状结构,随着壳内膜粉含量增加,复合微球内部大孔孔径逐渐减小,密度增大,均匀性提高,介孔尺寸随着壳内膜粉含量增加而变大。所得CSESM2固定化酶的载体活性和比酶活最大,分别为CSM的156.37%和111.95%。（5）前期研究发现载体的孔隙结构对规定化酶的催化性能有重要影响。采用乙酸铵作为气体致孔剂对传统壳聚糖多孔微球的孔隙结构进行调节和改善。乙酸铵的加入显着改善了多孔壳聚糖微球的内部孔隙结构,可以有效提高多孔微球的孔隙率和孔径大小。气体致孔剂的加入提高了多孔壳聚糖微球的热稳定性,但是机械强度和机械稳定性增加逐渐降低。木瓜蛋白酶分子在壳聚糖微球中的固定化速率主要受到化学结合的影响。气孔法制备的多孔壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶的催化活性显着增加,多孔壳聚糖微球CSPM-AG9固定化酶的比酶活为未加入气体致孔剂的微球CSPM的170%。（6）基于乙酸铵作为致孔剂的多孔壳聚糖微球,利用碳酸钠作为第二气体致孔剂,双气孔法制备的壳聚糖多孔微球的外层网络结构疏松、孔径随着碳酸钠的加入而提高。CSPM-DAG4固定化酶的载体活性和比酶活分别为CSPM-DAG0固定化酶的141.70%和143.22%,且机械稳定性较好。CSPM-DAG4固定化蛋白酶的p H和温度适应范围都比游离酶宽,且热稳定性和储藏稳定性高于游离酶。CSPM-DAG4固定化木瓜蛋白酶可以有效水解蛋清液,将其从酶解蛋清液中分离后,酶解后蛋清液的分子量不再发生明显减小,初步实现对蛋清液的可控酶解。

林小龙^[10]（2020）在《2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉在急性脊髓损伤大鼠模型中的神经保护作用及其机制研究》文中认为第一部分2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉在脊髓损伤大鼠模型中的作用目的:既往研究表明2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉（2-（-2-benzofuranyl）-2-imidazoline,2-BFI）在多种病理生理过程中参与抗氧化、抗炎症、抗凋亡。但是2-BFI在脊髓损伤模型中的作用尚不清楚。因此本实验采用钳夹法建立脊髓损伤（spinalcord injury,SCI）大鼠模型并利用该模型探讨2-BFI在脊髓损伤大鼠模型中潜在作用。方法:实验用成年雄性SD大鼠随机分为3组:（1）假手术组（Sham组）;（2）对照组（SCI+vehicle组）;（3）实验组（SCI+2-BFI组）。参照既往文献,建立了脊髓损伤大鼠实验模型。将大鼠麻醉后俯卧位固定置于专用手术台上。取后正中切口,从T10椎板到T12椎板行椎板切除术,充分暴露脊髓。假手术组仅仅行T10-T12椎板切除术,暴露脊髓而不引起脊髓损伤为标准。对照组及实验组大鼠利用70g闭合力Yasargil动脉瘤夹钳夹脊髓60秒,损伤成功的指标包括局部脊髓出现红肿、压迫后双后肢立即抽动、大鼠清醒时双侧后肢麻痹。药物注射（2-BFI腹腔注射3 mg/kg或0.9%生理盐水,每日2次,共3日）由一名对实验分组不熟悉的研究人员进行。所有大鼠在造模后第1、2、3、7、14、21天进行神经功能评估。神经功能评估采用BBB（Basso、Beattie and Bresnahan）神经功能评分量表,评分范围从0分到21分。结果:SCI大鼠运动神经功能采用BBB运动能力评定量表进行评定。假手术组术后即刻、术后1-3天、7天、14天、21天得分均为21分。在SCI发生后第1天,对照组和实验组的BBB运动能力评分均迅速下降,分别为0.17±0.41及0.17±0.41,相对于假手术组,两组的BBB评分呈显着性下降（p<0.05）,但两组之间并无统计学差异（P>0.05）。虽然在SCI发生后第3天,实验组的BBB评分高于对照组,分别为2.00±1.09及1.33±0.82,但两组之间仍无统计学差异（P>0.05）。但在SCI发生后第7天,实验组的BBB评分则高于对照组,且两者差异存在统计学意义（分别为4.33±0.52及3.33±0.52,p<0.05）。同样的结果也出现在SCI发生后第14天,实验组的BBB评分明显高于对照组（6.17±0.98及4.67±0.822,p<0.05）。将观察期延迟到SCI发生后的第21天,实验组的BBB评分明显大于对照组,且两组之间的差距更加明显（8.00±1.10及 6.17±0.98,p<0.01）。结论:通过2-BFI处理后SCI大鼠的BBB评分明显高于对照组,说明腹腔注射2-BFI（3mg/kg）后可显着改善SCI后BBB神经功能评分,在脊髓损伤大鼠模型中具有神经保护作用。第二部分 2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉在脊髓损伤大鼠模型中的神经保护作用机制目的:本部分实验采用钳夹法建立脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）大鼠模型并利用该模型证实 2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉（2-（-2-benzofuranyl）-2-imidazoline,2-BFI）对脊髓损伤大鼠的神经保护作用,并探讨2-BFI神经保护作用机制。方法:根据第一部分实验结论的进一步延续,采用动脉瘤夹钳夹脊髓的方法造模。实验用成年雄性SD大鼠随机分为3组:（1）假手术组（Sham组）;（2）对照组（SCI+vehicle组）;（3）实验组（SCI+2-BFI组）。SCI+vehicle组大鼠腹腔注射0.9%生理盐水,每日2次,共3日;SCI+2-BFI组大鼠腹腔注射2-BFI溶液,剂量为3 mg/kg,每日2次,共3日。药物注射由一名对实验分组不熟悉的研究人员进行。假手术组仅仅行T10-T12椎板切除术,暴露脊髓而不引起脊髓损伤为标准。在脊髓损伤后第3天,所有大鼠均行腹腔注射戊巴比妥钠（100mg/kg）深度麻醉并处死。损伤部位周围脊髓组织立即取出并置于冰面上用200m14℃0.9%生理盐水灌洗。Western blot检测Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白。使用ELISA试剂盒,对脊髓组织样本中超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性进行检测。FJB染色和TUNEL染色检测损伤部位周围脊髓组织的细胞坏死和凋亡。结果:与假手术组相比,对照组SOD和GPx活性均明显降低（P<0.01）。同时,SOD和GPx活性在使用2-BFI后明显升高（P<0.05）。脊髓损伤大鼠脊髓组织中Bax蛋白及cleaved caspase-3蛋白水平（p 19和p 17）明显升高,Bcl-2蛋白水平明显降低（P<0.01和P<0.05）。而2-BFI的应用显着提高了 SCI后Bcl-2蛋白水平（P<0.01）,Bax蛋白和cleaved caspase-3蛋白水平（p19和p17）都被下调。与此同时,对照组与假手术组相比,Bcl-2/Bax比值在SCI后明显降低,而在使用2-BFI后,实验组较对照组Bcl-2/Bax比值明显升高（P<0.01）。假手术组脊髓切片未见FJB阳性或TUNEL阳性细胞,然而在对照组中可见大量FJB阳性细胞和TUNEL阳性细胞,使用2-BFI治疗后FJB阳性细胞和TUNEL 阳性细胞数量显着降低（P<0.05和P<0.01）。结论:2-BFI的应用上调SOD和GPx的活性,上调Bcl-2蛋白的表达,下调Bax蛋白和cleaved caspase3（p17和p19）蛋白的表达,进一步证实其神经保护作用。此外,FJB染色和TUNEL染色显示细胞坏死和凋亡水平降低也佐证了 2-BFI的神经保护作用。综上所述,这些结果提示2-BFI可能通过抑制氧化应激反应和细胞凋亡坏死来减轻脊髓损伤,从而提高脊髓损伤后的功能恢复。第三部分 2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉在脊髓损伤大鼠模型中神经保护作用的调节机制目的:本部分实验采用钳夹法建立脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）大鼠模型并利用该模型证实 2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉（2-（-2-benzofuranyl）-2-imidazoline,2-BFI）是否通过激活核转录因子-E2相关因子/血红素加氧酶（Nrf2/HO-1）信号通路,引起下游抗氧化、抗凋亡相应蛋白变化从而保护神经细胞。方法:根据第二部分实验结果的进一步延续,采用动脉瘤夹钳夹脊髓的方法造模。实验用成年雄性SD大鼠随机分为3组:（1）假手术组（Sham组）;（2）对照组（SCI+vehicle组）;（3）实验组（SCI+2-BFI组）。对照组大鼠腹腔注射0.9%生理盐水,每日2次,共3日;实验组大鼠腹腔注射2-BFI溶液,剂量为3mg/kg,每日2次,共3日。药物注射由一名对实验分组不熟悉的研究人员进行。假手术组仅仅行T10-T12椎板切除术,暴露脊髓而不引起脊髓损伤为标准。在脊髓损伤后第3天,所有大鼠均行腹腔注射戊巴比妥钠（100mg/kg）深度麻醉并处死。损伤部位周围脊髓组织立即取出并置于冰面上用200ml4℃0.9%生理盐水灌洗。Westernblot检测Nrf2、HO-1和NQO1蛋白。利用免疫荧光染色技术定位Nrf2蛋白,观察损伤部位周围脊髓组织神经元细胞和星形胶质细胞中的Nrf2表达量变化。结果:与假手术组相比,对照组和实验组脊髓组织中无论Nrf2蛋白还是HO-1蛋白都有明显升高（P<0.01）,而与假手术组相比,对照组NQO1蛋白表达降低（P<0.01）。此外,与对照组相比,实验组Nrf2和HO-1进一步显着升高（P<0.01）。但对照组与实验组NQO1表达差异无统计学意义（P>0.05）。免疫荧光染色显示,Nrf2蛋白无论在神经元细胞还是星形胶质细胞中的表达,对照组及实验组均显着高于假手术组（P<0.01）。此外,实验组神经元细胞内、星形胶质细胞内Nrf2水平明显高于对照组（P<0.01）。结论:脊髓损伤后2-BFI处理增加了 Nrf2蛋白和HO-1蛋白的表达,表明2-BFI可激活Nrf2/HO-1信号保护脊髓损伤后的神经细胞。总之,这些结果为2-BFI通过激活Nrf2/HO-1信号通路减轻脊髓损伤,提高脊髓损伤后的功能恢复提供了有力证据。

二、Dimension AR专用通道微量蛋白测定试剂的研制（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、Dimension AR专用通道微量蛋白测定试剂的研制（论文提纲范文）

（1）BRD4天然抑制剂3’，4’，7, 8-Tetrahydroxyflavone的发现及其抑制急性髓系白血病的机制研究（论文提纲范文）

（2）应用于废水处理的磁性分离新技术研究（论文提纲范文）

（3）艾可清颗粒减轻环磷酰胺心脏毒性的作用及机制研究（论文提纲范文）

（4）Arl13b调控VEGFR2信号促进神经胶质细胞瘤生长的分子机制（论文提纲范文）

（5）抑制TMAO生成对慢性肾脏病及相关心血管损害的作用及机制研究（论文提纲范文）

（6）早期肿瘤行为片上建模研究（论文提纲范文）

（7）流感病毒载体重组肺炎支原体P基因及其免疫原性的研究（论文提纲范文）

（8）基于智能手机的免疫传感方法的研究及其在体外诊断中的应用（论文提纲范文）

（9）壳聚糖功能载体构建及其溶菌酶与蛋白酶固定化研究（论文提纲范文）

（10）2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉在急性脊髓损伤大鼠模型中的神经保护作用及其机制研究（论文提纲范文）

四、Dimension AR专用通道微量蛋白测定试剂的研制（论文参考文献）

• [1]BRD4天然抑制剂3’，4’，7, 8-Tetrahydroxyflavone的发现及其抑制急性髓系白血病的机制研究[D]. 李姣. 南京中医药大学, 2021(02)
• [2]应用于废水处理的磁性分离新技术研究[D]. 李涛. 北京科技大学, 2021(08)
• [3]艾可清颗粒减轻环磷酰胺心脏毒性的作用及机制研究[D]. 钟鹏程. 广州中医药大学, 2021(02)
• [4]Arl13b调控VEGFR2信号促进神经胶质细胞瘤生长的分子机制[D]. 谢新生. 南昌大学, 2021(01)
• [5]抑制TMAO生成对慢性肾脏病及相关心血管损害的作用及机制研究[D]. 张文超. 山东大学, 2021(11)
• [6]早期肿瘤行为片上建模研究[D]. 李成盼. 中国科学技术大学, 2021(09)
• [7]流感病毒载体重组肺炎支原体P基因及其免疫原性的研究[D]. 梁宇. 北京协和医学院, 2021(02)
• [8]基于智能手机的免疫传感方法的研究及其在体外诊断中的应用[D]. 吴泽. 南方医科大学, 2021
• [9]壳聚糖功能载体构建及其溶菌酶与蛋白酶固定化研究[D]. 刘远远. 华中农业大学, 2020(04)
• [10]2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉在急性脊髓损伤大鼠模型中的神经保护作用及其机制研究[D]. 林小龙. 苏州大学, 2020(06)

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