一、大肠杆菌菌毛油乳剂苗的实验研究（论文文献综述）
邵启文[1]（2019）在《鸡致病性大肠杆菌脂多糖缺失株三价灭活疫苗佐剂的筛选及免疫持续期的初步研究》文中指出禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic Escherichia coli,APEC）常引起家禽发生多种肠道外疾病如心包炎、气囊炎、肝周炎、蜂窝织炎及败血症,具有较高的感染率和死亡率,给养禽业带来严重损失。以本实验室构建的禽致病性大肠杆菌脂多糖缺失株E516△lpxL△lpxM（O1）、E058△lpxL△lpxM（O2）、E522△lpxL△lpxM（078）株作为制苗菌株等比例混合,分别辅以白油佐剂道达尔170、白油佐剂Marc52和铝胶佐剂研制了相应三价灭活疫苗,并对三种佐剂疫苗进行了安全性和免疫效力比较试验,以确定合适的疫苗佐剂。疫苗佐剂确定后,对该三价疫苗的免疫持续期进行研究。现将研究结果报告如下:1、三种不同佐剂疫苗的安全性比较利用制备的三种不同佐剂灭活疫苗,分别以单剂量0.5 mL/羽和双倍剂量1.0 mL/羽接种14日龄SPF鸡进行安全性试验。试验结果表明,注射白油佐剂灭活疫苗组的鸡,以单剂量0.5 mL/羽免疫,接种疫苗后12-24 h,部分鸡出现短时精神沉郁,之后无任何不良反应:以双倍剂量1 mL/羽免疫时,接种疫苗后5-8 h试验鸡出现精神不佳,24 h内恢复正常,由于双倍剂量组免疫剂量较大,部分试验鸡注射部位出现0.1-1.2 cm大小不等的结节,但未出现全身不良反应,免疫一周注射部位结节逐渐消失,生长状况良好。注射铝胶佐剂灭活疫苗组的鸡,在整个观察期内饮食和精神状态均正常,注射部位亦未见异常。以上结果说明我们所研制的油佐剂疫苗具有良好的安全性。2、三种不同佐剂疫苗的免疫效力试验以三种不同佐剂疫苗对14日龄SPF鸡进行免疫,42日龄时分别以亲本株E516（O1）、E058（02）和E522（078）攻毒,进行免疫保护试验。试验结果表明,白油佐剂道达尔170疫苗组攻毒后保护比均为7/10,白油佐剂Marc52疫苗组攻毒后保护比分别为5/10、5/10和7/10,铝胶佐剂疫苗组攻毒后保护比分别为3/10、3/10和5/10,攻毒对照组攻毒后死亡比均为10/10。以上试验结果表明,铝胶佐剂疫苗对同源野生株攻毒鸡的免疫保护效果差,白油佐剂道达尔170和白油佐剂Marc52疫苗尤其是前者对同源野生株攻毒鸡可以提供良好的免疫保护。综合安全性试验和免疫保护试验,我们确定白油佐剂道达尔170佐剂作为研制疫苗的佐剂。3、鸡致病性大肠杆菌脂多糖缺失株三价灭活疫苗的免疫持续期试验以鸡致病性大肠杆菌脂多糖缺失株三价灭活疫苗对14日龄SPF鸡进行免疫,分别在免疫后第30 d、第60 d和第90 d进行亲本株攻毒试验,对保护效力、特异性抗体水平及组织病理变化进行评价。试验结果表明,免疫后第30 d、第60 d和第90 d攻毒,试验鸡均得到不同程度较好保护。由于成年鸡对致病性大肠杆菌的敏感性降低,90日龄试验鸡攻毒对照组死亡比减少属于正常现象。白羽肉鸡的生长周期一般在9周以内,该疫苗应用在白羽肉鸡上,一次性免疫即可得到有效的保护。综合多因素考虑,我们暂定鸡致病性大肠杆菌脂多糖缺失株三价灭活疫苗的免疫持续期为3个月。
杨德鸿[2]（2018）在《苏北地区猪产肠毒素大肠杆菌（ETEC）流行病学调查及灭活疫苗初步研究》文中进行了进一步梳理产肠毒素大肠杆菌（ETEC）是导致猪场仔猪发生腹泻的一种重要致泻性致病菌,感染后引起初生到保育期间仔猪腹泻和黄白痢,也是目前规模化猪场难以根除的一种肠道致病菌。发病仔猪主要临床表现为腹泻、脱水、消瘦、拉黄痢或白痢,严重可引起死亡,且具有传染性,是一种十分重要的猪大肠杆菌病。经临床调查发现仔猪黄白痢是发生频率最高的猪大肠杆菌病,其病原ETEC存在普遍高耐药性和高致病性,严重危害养猪业健康发展。本研究通过调查苏北地区规模化猪场ETEC流行情况,分析其血清型、耐药性和致病力等生物学特性,研制具有广谱免疫保护效果的O抗原灭活疫苗,对苏北地区规模化猪场ETEC进行监测及有效防控。1苏北地区猪产肠毒素大肠杆菌分离鉴定从苏北地区21个规模化猪场采集初生到30日龄仔猪的新鲜粪样、直肠棉拭子及小肠样共562份,经平板划线、菌落形态观察,其中528份病料分离出792株疑似大肠杆菌。通过显微形态观察、PCR鉴定菌株特异性致病型、16S rRNA测序鉴定确定为ETEC菌株有141株,占总病料数的25.1%。使用PCR方法结合37种标准O抗原血清进行玻板凝集试验鉴定141株ETEC菌株的血清型;用14种常见抗生素标准药敏纸片,分析分离菌株耐药性和敏感性,并做整体耐药性分析;小鼠攻毒试验鉴定分离菌株致病力;研制灭活苗,并进行小鼠免疫保护试验分析灭活疫苗免疫保护效果。使用常规血清型鉴定玻板凝集试验结合PCR分子生物学鉴定方法,使用7种多价O抗原血清和37种单因子ETEC常见O抗原血清,对分离出的141株ETEC菌株进行血清型鉴定。试验结果表明,所分离的141株ETEC菌株具有较多的O抗原血清型,定型85株,占ETEC菌株总数的60.3%,1株自凝,2株出现多价凝集而单价不凝;其中08、0101和0128为优势血清型,分别占定型菌株数的29.4%、20%和占11.8%,占ETEC菌株总数的17.7%、12.1%、7.1%;三个优势血清型占定型菌株数的61.2%,占ETEC菌株总数的36.9%。其他血清型包括09、03、020、0148、0149、0111、0138、0139、0141、025、0115、0119、0153、045、089 等 15 种。2苏北地区猪产肠毒素大肠杆菌生物学特性分析对所分离141株ETEC菌株肠毒素和毒力岛等相关毒力因子进行鉴定,试验结果表明所有ETEC分离菌株均含有ST基因,有25%的菌株含有LT基因,有25%的菌株含有Ler基因,含有Irp2、fyuA、eaeA基因的菌株占10%。药敏试验对141株ETEC进行14种药敏片的耐药性分析,得出所分离的ETEC对新霉素、红霉素、四环素、庆大霉素、强力霉素、阿莫西林、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑高度耐药,分别为 95%（134/141）、100%（141/141）、99.3%（140/141）、80.9%（114/141）、100%（141/141）、92%（130/141）、96.5%（136/141）,耐药菌株比例均在 80%以上;有 50.4%的ETEC对恩诺沙星敏感（71/141）,中等敏感的为多粘菌素B占66%（93/141）、头孢噻肟占51.8%（73/141）;多重耐药主要集中在8耐、9耐、10耐、11耐,占总ETEC的68%（96/141）,分别为 17%（24/141）、16.3%（23/141）、19%（27/141）、15.6%（22/141）,拥有10重耐药性的菌株占比最大。动物实验使用常规的ICR小鼠,小鼠攻毒试验通过初筛141株ETEC致病力,得到9株高致病力菌株,均能以1×107CFU致死小鼠。然后分别筛选优势血清型08和0101强毒株,以5×107CFU攻毒小鼠,发现08血清型中有8株为强毒株,占08血清型菌株总数的38.1%,0101血清型中有5株为强毒株,占0101血清型菌株总数的27.8%;综合初筛和单因子O抗原血清型强毒株筛选结果,测定08血清型一强毒株的半数致死量（LD50）为1.4×107CFU;最低致死量（MLD）为3×107CFU。3苏北地区猪产肠毒素大肠杆菌灭活疫苗的初步研究优势血清型单价灭活疫苗小鼠免疫效果结果显示,单价灭活疫苗对同种血清型的强毒株具有完全的保护,保护率为100%;用优势血清型的2株强毒株经灭活制成二价灭活ETEC疫苗,免疫小鼠能形成有效的保护效果,对两种优势血清型所有强毒株的保护率均在83%以上,对高浓度感染也具有较高保护率,且免疫无应激死亡,对其他血清型强毒株也有部分保护效果。比较免疫前后小鼠血清抗体效价,发现二免后血清抗体效价上升较快,但一免后攻毒小鼠也能形成有效保护;比较不同免疫剂量的免疫效果发现,以2×108CFU免疫小鼠的效果最佳;比较不同致病力菌株灭活疫苗的免疫保护效果发现,三种不同致病力菌株制备的灭活疫苗均能对小鼠形成有效保护。本研究通过对苏北地区猪产肠毒素大肠杆菌的流行病学调查,发现其优势血清型,整体耐药性,并初步研制出可用于防控分离株中大部分致病性ETEC的二价灭活疫苗,给养殖生产业提供了可行的监测和防控参考。
黄立[3]（2017）在《豫南地区鸡大肠杆菌病病原学调查与防控研究》文中研究表明目前,鸡大肠杆菌病作为一种重要的细菌性传染病,对我国养鸡业造成了严重危害。根据信阳市疫病检测工程中心（信阳农林学院市级工程中心）对豫南地区主要养鸡集中区的调查,在规模化养鸡场细菌性疾病当中,大肠杆菌发病率一直居于首位。鸡大肠杆菌血清型众多,耐药菌株也在不断增多,给防治本病增加了难度。因此,开展豫南地区鸡大肠杆菌病病原学调查与分析,对于有效防治鸡大肠杆菌病,具有重要的理论和实践意义。本研究涉及到豫南地区鸡致病性大肠杆菌分离与鉴定、对常用抗菌药物耐药性分析、中药活性成分与氨基糖苷类药物体外联合抗菌作用、利用优势致病菌株研制多价灭活苗等方面。通过系列研究,进一步弄清楚豫南地区鸡大肠杆菌病的流行状况,必将为豫南地区乃至河南的鸡大肠杆菌病科学防治工作,提供重要的理论依据和临床价值。1豫南地区鸡致病性大肠杆菌分离与鉴定对于豫南地区送检的164份病鸡样品,经过常规方法培养、纯化及镜检,并进行生理生化鉴定和PCR鉴定,共分离到鸡大肠杆菌121株,鉴定出88株分离菌株血清型,包括17种血清型;主要血清型是02、078、01、018、026、022,共72株,占总分离株的59.50%。给供试雏鸡接种121株分离菌株后,可见发病症状及剖检病变都与本病特征相符;在121株分离菌株中,有64株高致病性菌株、31株中度致病性菌株、26株低致病性菌株,分别占总试验菌株的52.9%、25.6%、21.5%。2对常用抗菌药物耐药性分析采用标准微量稀释法,测定62株鸡大肠杆菌对18种药物的体外最小抑菌浓度（MIC）,并通过PCR方法扩增I型整合酶基因。结果显示,全部菌株呈现多重耐药,耐药谱型达12种之多;对β-内酰胺类、酚胺醇类、氨基糖苷类、喹诺酮类、磺胺类、四环素类等抗菌药物,均表现出不同程度的耐药性;对土霉素、复方新诺明、磺胺嘧啶、强力霉素四种药物,耐药率分别为95.2%、87.1%、80.6%、72.6%;I型整合酶基因检出率为87.1%。由此表明,鸡大肠杆菌临床分离株,对常用抗菌药物都产生了不同程度的耐药性。3中药活性成分与氨基糖苷类药物体外联合抗菌作用采用棋盘稀释法,了解中药活性成分与氨基糖苷类药物体外联合抗菌作用,进而筛选出具有协同抗菌效果的药物组合,为体内试验提供理论基础。结果表明,穿心莲内酯与氨基糖苷类药物联用,主要表现为协同作用;黄芩苷和小檗碱分别与氨基糖苷类药物联用,主要表现为相加作用;蒲公英提取物与氨基糖苷类药物联用,主要表现为无关作用。由此表明,穿心莲内酯与氨基糖苷类药物联合使用,可提高抗菌药物对耐药大肠杆菌的抗菌效果。4鸡大肠杆菌多价灭活苗制备与评价利用毒力强、免疫原性好、具有地方代表性的O1、O2、O78、O22、O26、O18六种优势血清型菌株,研制鸡大肠杆菌氢氧化铝胶多价灭活苗。免疫攻毒试验结果显示,疫苗对各日龄鸡的安全性较好,采用大肠杆菌菌株攻毒,免疫组可获得完全保护,说明该疫苗对大肠杆菌病免疫效果显着。这些研究成果,对于有效防治豫南地区鸡大肠杆菌病,提高豫南地区整体养鸡水平,具有重要指导意义。
赵兴华[4]（2012）在《适用于蛋鸡免疫的猪源ETEC菌毛蛋白疫苗佐剂的筛选》文中认为为筛选适用于蛋鸡的高效、安全、成本低、易注射、副作用小的免疫佐剂，本试验以ETEC菌毛蛋白(K88、K99和987P)为模式抗原，分别与SPA、SPB、SPC、ISCOMs、弗氏佐剂、黄芪多糖注射液和蜂胶等7种免疫佐剂配合制备猪源ETEC多价菌毛蛋白疫苗，免疫海兰褐壳蛋鸡，并分析该7种佐剂疫苗对蛋鸡产蛋性能、外观形态和注射部位组织的影响，探讨它们在诱导蛋鸡血清抗体和卵黄抗体消长的差异性，主要研究结果摘要如下：1.试验组猪源ETEC多价菌毛蛋白疫苗的制备：采用60～65℃水浴振荡法提取K88、K99和987P，经透析纯化、SDS-PAGE电泳检测，结果显示成功制备了K88、K99和987P三种菌毛蛋白。将K88、K99和987P菌毛蛋白按照特定比例混合作为模式抗原，分别与SPA、SPB、SPC、ISCOMs、弗氏佐剂、黄芪多糖注射液和蜂胶等7种免疫佐剂配合制备猪源ETEC多价菌毛蛋白疫苗，并检验了所制疫苗的外观、色泽、稳定度（有无分层）等理化性状，结果显示： SPA、SPB、SPC、弗氏佐剂疫苗呈乳白色、半透明状，未出现分层现象；ISCOMs佐剂疫苗呈水性白色、透明状，无分层出现；黄芪多糖注射液配配合ISCOMs佐剂疫苗呈黄褐色，透明状，无分层出现；蜂胶佐剂呈深褐色、半透明状，有沉淀出现，所制备的疫苗符合要求，可以用于蛋鸡免疫。2.接种7种猪源ETEC多价菌毛蛋白疫苗后对试验蛋鸡产蛋性能的影响:将由SPA、SPB、SPC、ISCOMs、弗氏佐剂、黄芪多糖注射液和蜂胶佐剂制备的猪源ETEC多价菌毛疫苗免疫蛋鸡，免疫后试验蛋鸡的产蛋率均下降，持续时间为1d或2d，之后恢复正常；除SPB组外，其余各组蛋鸡产蛋率在免疫期内的均值介于71.37%～83.15%，高于免疫前的70%，SPB组蛋鸡在免疫期内的产蛋率均值为50.25%，显着低于其他各组的产蛋率均值（P<0.05）。结果表明与其他佐剂相比，SPB佐剂显着降低蛋鸡的产蛋性能。3.接种7种猪源ETEC多价菌毛蛋白疫苗后各试验组蛋鸡血清抗体消长结果：将由SPA、SPB、SPC、ISCOMs、弗氏佐剂、黄芪多糖注射液和蜂胶佐剂制备的猪源ETEC多价菌毛疫苗免疫试验蛋鸡3次后，检测7组试验蛋鸡的血清抗体效价从高到低依次是： SPB、SPC、弗氏佐剂、SPA、ISCOMs、黄芪多糖注射液和蜂胶佐剂；维持血清抗体时间依次是SPC、SPB、弗氏佐剂、 SPA、ISCOMs、黄芪多糖注射液、蜂胶佐剂。4.接种7种猪源ETEC多价菌毛蛋白疫苗后各试验组蛋鸡卵黄抗体消长结果：将由SPA、SPB、SPC、ISCOMs、弗氏佐剂、黄芪多糖注射液和蜂胶佐剂制备的猪源ETEC多价菌毛疫苗免疫试验蛋鸡3次后，检测7组试验蛋鸡的卵黄抗体效价从高到低依次是：弗氏佐剂、SPC、SPB、 SPA、ISCOMs、黄芪多糖注射液和蜂胶佐剂；维持卵黄抗体时间最长的是SPC和SPB；其次是弗氏佐剂、ISCOMs和SPA；最短的是黄芪多糖注射液和蜂胶佐剂。5.接种7种猪源ETEC多价菌毛蛋白疫苗后对各试验组蛋鸡外观形态和注射部位组织的影响：观察结果显示，注射疫苗后， SPB和SPC佐剂组试验蛋鸡出现持续约2h的热源反应，其余试验组蛋鸡未见明显的异常反应；各组试验蛋鸡饮水、摄食、外观和精神状态均良好；免疫期结束后，每组随机取5只试验蛋鸡，对其免疫注射部位进行局部解剖，可见SPB、SPC和弗氏佐剂组蛋鸡的注射部位组织有清晰的炎性浸润、脂肪结节或脓肿等副反应，比例分别为2/5、5/5、4/5，其余组（包括对照组）未见明显的副反应。综上所述，得出以下结论：与其他6种佐剂相比，SPA佐剂与模式抗原配合制备猪源ETEC多价菌毛蛋白疫苗并免疫蛋鸡后，能够有效提高蛋鸡的血清抗体和卵黄抗体的效价，并能维持免疫期结束后30d以上的高滴度水平；接种该佐剂疫苗对蛋鸡的产蛋性能的影响较小；注射该佐剂疫苗后，无明显的异常反应出现，安全性好，对蛋鸡的外观形态和注射部位肌肉组织无明显影响，不影响蛋鸡的肉用价值；该佐剂疫苗易于制备、易于注射且成本低，使用方便，因此SPA是一种适用于蛋鸡的相对高效、安全、成本低、易注射、副作用小的免疫佐剂。该结果有助于我们选择合适的免疫佐剂制备猪源ETEC多价菌毛蛋白疫苗以获取大量、纯度高的卵黄抗体，用于防治仔猪ETEC性腹泻。
马逊[5]（2010）在《鸭传染性浆膜炎油乳剂灭活疫苗与不同佐剂二联灭活疫苗的免疫原性比较研究》文中研究表明本研究选取我国养鸭生产中广泛流行的血清1型鸭疫里默氏菌（Riemerella anatipestifer, RA）和O78型大肠杆菌（Escherichia Coli, E.coli）为菌种研制了RA油佐剂灭活苗、RA-E.coli二联油佐剂灭活苗和RA-E.coli二联蜂胶佐剂灭活苗,并对这3种疫苗进行了临床试验比较研究,获得如下结果：1.疫苗安全性：3种疫苗分别以0.5ml/只、1ml/只、2ml/只和3ml/只的剂量免疫试验鸭。结果表明,RA油佐剂灭活苗和RA-E.coli二联油佐剂灭活苗免疫组在6倍于正常免疫剂量（0.5ml/只）免疫时,少数试验鸭出现5-8 h的精神稍差,之后迅速恢复,其他组均无异常反应,健康生长。剖杀检查,注射RA油佐剂灭活苗和RA-E.coli二联油佐剂灭活苗的试验组在注射部位有小的炎性结节,但该结节随着雏鸭的生长逐渐变小、消失。因此,所研制的3种疫苗均具有良好的安全性。2.疫苗最佳免疫剂量：分别以0.25ml/只、0.50ml/只、1.00ml/只和2.00ml/只免疫试验鸭,然后分别以109CFU/mL 1型RA强毒株和2.00×108CFU/mL O78型E.coli强毒株进行攻毒保护试验。结果表明,免疫剂量为0.25ml/只时即能获得良好保护效果,而当免疫剂量为0.5ml/只时可获得100%保护。因此,所研制疫苗的最佳免疫剂量为0.5ml/只。3.疫苗免疫效力：3种疫苗经过无菌及安全检查合格后,对8日龄樱桃谷鸭颈背部皮下注射0.5ml/只。于免疫后7d、14d、21d进行攻毒保护试验,1型RA的攻毒菌量为5.20×109CFU,O78型E.coli的攻毒菌量为1.00×109CFU。结果表明,对同源RA的攻击,RA油佐剂灭活苗表现出50%、80%和100%免疫保护;RA-E.coli二联油佐剂灭活苗表现出50%、70%和100%免疫保护；RA-E.coli二联蜂胶佐剂灭活苗表现出60%、80%和100%免疫保护。对同源E.coli的攻击,RA-E.coli二联油佐剂灭活苗表现出60%、80%和100%免疫保护；RA-E.coli二联蜂胶佐剂灭活苗表现出70%、100%和100%免疫保护。所研制的3种疫苗中,RA-E.coli二联蜂胶佐剂灭活苗具有保护力产生速度快,对同源菌攻毒的免疫保护率高的特点,特别适合商品肉鸭的免疫接种。RA油佐剂灭活苗和RA-E.coli二联油佐剂灭活苗,免疫保护力产生速度较慢,对同源菌攻毒的免疫保护率,相对蜂胶苗低。4.抗体消长规律：3种疫苗经过无菌及安全检查合格后,对8日龄樱桃谷鸭颈背部皮下注射0.5ml/只。于免疫后7d、14d、21d、35d、49d、63d、77d、91d测定血清凝集抗体效价。结果表明,所研制的3种疫苗中,RA-E.coli二联蜂胶佐剂灭活苗抗体产生速度最快,于免疫后21d最先达到高峰；RA油佐剂灭活苗和RA-E.coli二联油佐剂灭活苗于免疫后35d达到抗体水平高峰,时间比蜂胶苗要晚7d。至免疫后91d仍能检测出抗体存在。抗体水平达到高峰后,随即开始逐渐下降,此后油佐剂苗的抗体水平要高于蜂胶苗,特别适合种鸭免疫接种,以为下一代雏鸭提供长时间较高水平的母源抗体。3种疫苗均能长时间维持较高的抗体水平。这3种疫苗按免疫原性优良等级的顺序依次为RA-E.coli二联蜂胶佐剂灭活苗、RA油佐剂灭活苗、RA-E.coli二联油佐剂灭活苗。
于珊,张倩,水小溪,于宙亮,赵宝华[6]（2008）在《致病性鸡大肠杆菌pilA基因和外膜蛋白C基因的克隆、表达及其免疫原性》文中研究表明根据GenBank公布的致病性鸡大肠杆菌的Ⅰ型菌毛pilA基因和外膜蛋白C基因序列,分别设计了两对引物,并以分离的致病性鸡大肠杆菌基因组为模板,经PCR特异性扩增出pilA基因和ompC基因,基因产物大小为别为549bp和1104bp,与GenBank报道的参考菌株的两个基因序列的同源性为高达98.18%和97.28%。将扩增得到的两个基因分别定向克隆到原核表达载体pET-28a中,得到两个重组质粒pETpilA和pETompC,转化大肠杆菌BL21（DE3）中,得到重组菌株BL21（pETpilA）和BL21（pETompC）,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析分别可见表达的20kD和40.9kD的特异条带;Westernblotting结果表明,两种蛋白可与抗体发生特异性结合,说明其具有良好的免疫原性。将表达的菌毛蛋白和外膜蛋白的菌株分别制成基因工程疫苗,免疫小鼠后,具有很好的保护能力,表明这两株基因工程菌株有望作为鸡致病性大肠杆菌基因工程疫苗的候选生产菌株。
刘义铃[7]（2008）在《鸭源巴氏杆菌、大肠杆菌二联多价蜂胶灭活疫苗研制及其免疫应答反应的动态研究》文中指出本研究选取鸭致病性大肠杆菌（E.coli）常见血清型O1,O2,O18,O78和三株分离自发病鸭场,毒力强、免疫原性好的巴氏杆菌（P.M）D22,D23,D157作为制苗菌株,分别以5%血琼脂培养基和马丁琼脂培养基进行固体表面培养制备抗原,与蜂胶佐剂高速乳化,制备鸭源多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌二联多价蜂胶灭活疫苗。通过对供试鸭的攻毒保护试验、用ELISA方法对供试鸭特异性抗体消长规律的研究以及用MTT法对供试鸭外周血T淋巴细胞免疫水平的检测三个方面对此疫苗的安全性、免疫原性进行了研究。安全性检验及最佳免疫剂量筛选结果表明,疫苗安全可靠,疫苗最佳免疫剂量为4.2×109 CFU/mL,0.5mL（E.coli约84亿CFU,P.M约63亿CFU）,在4℃可保存12个月。攻毒保护试验结果表明,雏鸭首免后第14d时,一次免疫组对E.coli、P.M的攻毒保护率分别为100%、90%,二免后第14d时,二次免疫组可产生坚强免疫力,攻毒保护率均为100%。本研究采用鸭巴氏杆菌、大肠杆菌全菌裂解抗原为包被抗原,建立检测P.M-E.coli灭活疫苗免疫后的鸭血清中特异性抗体的ELISA方法。确定了巴氏杆菌抗原最佳包被浓度:D22:11μg/mL,D23:17μg/mL,D157:16μg/mL,混合裂解抗原:14.7μg/mL,HRP-羊抗鸭IgG的最佳浓度为0.25μg/mL;大肠杆菌抗原最佳包被浓度:O1:18.86μg/mL,O2:16.76μg/mL,O18:17.43μg/mL,O78:16.32μg/mL,混合裂解抗原:20μg/mL,HRP-羊抗鸭IgG的最佳浓度为0.5μg/mL。免疫鸭抗体消长规律检测结果表明,雏鸭免疫3d后,免疫组四个血清型E.coli抗体水平均极显着（P＜0.01）高于空白对照组,二次免疫组抗体水平显着（P＜0.05）或极显着（P＜0.01）高于一次免疫组,首免后20d左右抗体水平达到高峰,然后逐渐下降,到第54d时抗体水平仍显着高于首免后第9d相应组抗体水平,与第13d抗体水平相当;免疫组三株P.M抗体水平均极显着（P＜0.01）高于空白对照组,二次免疫组抗体水平显着（P＜0.05）或极显着（P＜0.01）高于一次免疫组,首免后20d左右抗体水平达到高峰,然后逐渐下降,到第54d时抗体水平仍高于首免后第13d相应组抗体水平或相当。T淋巴细胞转化试验结果表明,E.coli-P.M二联蜂胶疫苗免疫雏鸭外周血淋巴细胞转化水平在首免后极显着（P＜0.01）或显着（P＜0.05）高于对照组,二次免疫组的细胞免疫水平比一次免疫组高,维持时间在3周左右。
于学辉[8]（2008）在《鸭致病性E.coli外膜蛋白及相关毒力基因和新血清型发现及病原特性研究》文中提出大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）是正常肠道菌群的组成部分,一些特殊血清型的E.coli对人和动物有病原性,动物的E.coli常常通过食物链的途径对人类健康造成严重的危害。随着集约化养殖的普及,鸭致病性E.coli对养鸭业的危害和导致的经济损失日益严重,已成为目前危害养鸭业最严重的传染病之一。现有禽病原性大肠杆菌（Avian Pathogenic Escherichia coli,APEC）的研究资料绝大多数来源于鸡,到目前为止,缺乏鸭源E.coli病原特性的系统研究。本研究旨在对我国西南地区规模化养鸭场鸭大肠杆菌病的致病性E.coli进行分离和血清型鉴定、了解鸭源致病性E.col外膜蛋白型（outer membrane protein patterns,OMP型）特征和相关毒力基因携带情况,对发现的一株致鸭腿水肿为特征的O46分离株的病原特性进行了系统研究,为阐明鸭源致病性E.col的致病机理和该病的防制提供科学数据。1.规模化养鸭场鸭源致病性大肠杆菌的分离鉴定及病原特性和系统发育学分析从我国四川、重庆、云南3个省（市）规模化养鸭场患典型大肠杆菌败血症雏鸭分离的282株致病性E.coli（临床分离株）,通过玻板凝集和试管凝集试验,测定出210个分离株的血清型,占分离株的74.45%,分离株覆盖了37个血清型,其中O93、O78、O92、O76占43.8%（96/210）为优势血清型,O46、O32&O93混合型、O60&O93混合型为首次从鸭群中分离到。35株临床健康雏鸭泄殖腔分离的E.coli（泄殖腔分离株）鉴定出28株（包含14种血清型）,其中O109和O154占46.4%为优势血清型。对207个临床分离株进行了药敏试验,在所选的29种抗生素中,鸭大肠杆菌?分离株耐药性非常严重,平均耐药率28.83%,以多重耐药为主,耐10～18种药物的菌株占59.4%。选取82个分离株（37个血清型,其中优势血清型各选8株共32株,其他血清型50株）进行致病性试验,以每株0.2ml（109CUF/ml）腿部肌肉接种7日龄鸭,确定出高致病株、中等致病株和低致病株分别占受试菌株的80.5%（66/82）、17.1%（14/82）和2.4%（2/82）,四个优势血清型均为高、中致病株分别占受试菌株的84.4%（27/32）、15.6%（5/32）。根据16SrRNA基因的序列同源性,对14个鸭致病性E.coli代表株进行系统发育分析,结果显示:14个代表株形成2个主要分枝,3株鸭致病性E.coli单独形成一个较远的分支:11株鸭致病性E.coli与人及其他动物源E.coli形成一个大的分支,6株与人的O157亲缘关系近,其中有2株与O157sakai聚为一支;另外5株与猪、牛、禽和人源E.coliK12亲缘关系近,同时还发现O血清型与菌株的亲缘关系无直接联系。2.鸭源致病性大肠杆菌外膜蛋白型测定了130株（34个血清型）鸭E.coli临床分离株外膜蛋型（OMP型）,其中O93等优势血清型53株,O46等30个其他血清型77株,这些分离株共产生了4个OMP型,其中OMP-1型81株,占62.3%（81/130）,覆盖O93、O92、O78和O76等29个血清型,为主要OMP型;根据GenBank中大肠杆菌K-12外膜蛋白A基因（ompA）的核苷酸序列设计引物,对9株优势血清型和1株O46血清型分离株的ompA进行克隆、序列测定和分析,发现优势血清型9个菌株的ompA开放性阅读框（ORF）长1053bp,编码由350个氨基酸组成的前外膜蛋白A（pro-OmpA）,前21个氨基酸残基组成信号肽,成熟的OmpA由329个氨基酸残基组成;O46分离株的开放性阅读框全长1041bp,在400bp～411bp的地方缺失了12个碱基,成熟的OmpA由325个氨基酸残基组成;10个分离株的ompA序列其核苷酸序列高度同源,达95.8%～100%。对10个分离株ompA进行系统发育分析,O46分离株单独聚为一支,其他9个分离株聚为一支;菌株血清型、外膜蛋白型与ompA的亲缘关系无直接联系。3.鸭源致病性大肠杆菌相关毒力基因分析应用PCR结合核酸序列测定对210株临床分离株和28株泄殖腔分离株进行包括强毒力岛（HPI）中的鼠疫菌素受体基因（fyuA）和铁调节蛋基因（irp2）、I型菌毛必须蛋白基因（fimC）、P型菌毛结构基因（papA）和血清耐受基因（iss）进行检测,结果表明:fyuA、irp2、fimC、papA和iss在临床分离株的携带率分别为41.0%、43.3%、92.9%、97.6%和96.7%,在泄殖腔分离株的携带率分别为21.4%、25.0%、92.9%、100%和92.9%,临床分离株和泄殖腔分离株Iss、I型菌毛和P型菌毛基因携带率差异不显着（P＞0.05）,但P型菌毛基因的携带率均显着高于其他宿主（鸡、猪和人）源E.coli;HPI毒力岛在鸭源E.coli中分布较广,其携带率表现为临床分离株极显着高于泄殖腔分离株。HPI毒力岛的携带率与菌株的致病性呈明显的正相关,与O78等特定的血清型有一定的关系。临床分离株有37.6%（79/210）同时携带fyuA、irp2、fimC、iss和papA基因,极显着高于泄殖腔分离株14.3%（4/28）（P＜0.01）。4.鸭源致病性大肠杆菌志贺毒素相关基因分子流行病学根据GenBank中编码大肠杆菌stx1（志贺毒素1基因）、stx2（志贺毒素2基因）、hlyA（溶血素基因）和eaeA（黏附素基因）的特异性序列,设计合成4对引物,建立了快速鉴定产志贺毒素大肠杆菌（STEC）多重PCR方法。该方法能直接特异性鉴定多种毒力因子,检测敏感度细菌纯培养物为103CFU/ml。用此方法结合核酸序列测定对210株临床分离株和28株泄殖腔分离株进行相关基因检测,结果表明:临床分离株有6株具有six1序列、4株具有hlyA序列、1株具有eaeA序列;stx1、hlyA和eaeA阳性率分别为2.85%（6/210）、1.90%（4/210）和0.47%（1/210）;5株基因型为stx1+,3株基因型为hlyA+,1株基因型为stx1++hlyA++eaeA+,分别为2.38%（5/210）、1.43%（3/210）和0.47%（1/210）;临床分离株stx2均为阴性。泄殖腔分离株未检出这4种基因。对所有阳性基因进行序列测定及分析,hlyA与GenBank中提供的EHECO157:H7 Sakai株序列的同源性为100%,stx1和eaeA与O157:H7 Sakai株序列高度同源。在发病鸭中发现并分离到O158、O60、O78、O36、O77、O46、O137和O192（携带stx1、hlyA、eaeA）的非-O157的STEC菌株,具有重要的公共卫生学意义。5.一株致鸭腿水肿为特征的O46大肠杆菌的发现及其实验病理模型建立从临床急性死亡,以腿水肿为特征的病鸭群中分离的SYW004株,通过形态学、培养特性、生化特征的研究和血清型鉴定,确定为大肠杆菌O46血清型;16S rRNA基因序列分析表明,该分离株与人源志贺氏菌及大肠杆菌O157:H7的亲缘关系最近,序列同源性为99%～99.5%,而和鸡源E.coli亲缘关系较远;对hlyA等9种毒力基因检测表明,O46分离株携带hlyA、fyuA、irp2、fimC、papA和泌六种毒力基因,是一株携带多种毒力基因的出血性大肠杆菌（EHEC）;该分离株对雏鸭具有高致病性,实验病理模型能复制出与自然感染相同的病例,组织病理学检查表明,肝脏、肺脏、心脏、肾脏、肠道和脑等器官出现不同程度的组织细胞变性、坏死和大面积淤血、出血;超薄切片电镜观察可在心脏、肺脏、脾脏、肝脏和小肠中观察到大肠杆菌,其侵害的主要靶细胞包括淋巴细胞、巨噬细胞、肠道上皮细胞、心肌纤维细胞。超微结构变化最早发生于心脏、肝脏和肠道,各种细胞的变化主要为肿胀、坏死,染色质凝聚,线粒体肿胀,嵴断裂、扭曲变形,心肌肌原纤维间距增宽、溶解断裂,肠腺上皮细胞肿胀,微绒毛脱落、固有层充血出血。6.鸭源致病性大肠杆菌O46分离株对人工感染鸭的侵染规律为了观察O46分离株在人工感染鸭体内的分布,以O46定型血清建立免疫组化方法,应用建立的方法对O46分离株人工感染雏鸭的不同时间的不同组织器官进行观察。结果显示:免疫组化的方法只对大肠杆菌O46感染致死鸭的肝脏、脾脏、肾脏呈现阳性反应而与大肠杆菌O78、鸭瘟、鸭源禽流感、鸭疫里默氏杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌感染致死鸭的肝组织呈现阴性反应,具有直观、敏感、特异性强的优点,能够进行精确抗原定位;实验结果还表明,O46分离株能在鸭体内进行大面积的侵嗜,心脏、肺脏、脾脏、肾脏和肠道是感染的主要靶器官,阳性信号最早出现于心脏,气管未检测到细菌抗原。我们的实验数据可以为大肠杆菌O46分离株在体内分布和复制提供重要的证据,同时可以为O46分离株感染的致病机制提供一定的知识。
刘雪威[9]（2008）在《鸡致病性大肠杆菌FimC基因缺失菌株的构建及其生物学特性的研究》文中提出鸡大肠杆菌病是由大肠埃希氏菌（Escherichia colii,E.coli）所引起的局部或全身性感染的疾病。菌体在体内的定居主要是通过粘附因子—菌毛的吸附进行的。鸡源E.coli的菌毛主要分为两种,Ⅰ型菌毛和P菌毛,在鸡源E.coli的致病过程中,普遍认为菌株在呼吸道中定居主要依靠Ⅰ型菌毛,P菌毛则是在菌株进一步致病过程中发挥作用。研究表明,人源大肠杆菌Ⅰ型菌毛是感染粘附的主要因子。其中fimC基因编码的fimC蛋白是Ⅰ型菌毛的主要亚基,介导Ⅰ型菌毛的装配, fimC基因的变异可导致菌毛合成功能的丧失。已从鸡源大肠杆菌得到类似于人源大肠杆菌fimC基因,并与人源大肠杆菌fimC基因具有很高的同源性。为了进一步研究fimC基因在鸡大肠杆菌致病过程中所起的作用,构建了一株E.coli O2 fimC基因缺失突变株。本实验以E.coli O2为亲本菌种,首先用PCR的方法扩增出缺失了171bp的fimC基因片段,将其克隆到自杀性载体pCVD442中,构建了重组质粒pCVD442::△fimC并转化到宿主菌SM10λpir中,然后通过接合性转导的方法将自杀质粒pCVD442::△fimC从SM10λpir转到O2（NalR）中,利用自杀性载体技术,根据同源重组的原理,敲除了基因组上的fimC基因,构建了fimC基因缺失突变菌株O2（△fimC）。通过菌毛的表达实验、与鸡气管上皮的粘附实验和对雏鸡的致病性实验研究了该缺失突变菌株的特性。研究表明,具有致病性的亲本菌株在营养肉汤中37℃培养72h后,能够表达大量的Ⅰ型菌毛,而缺失菌株在相同的条件下则不能产生菌毛。粘附实验结果显示,亲本菌株与气管环37℃共同培养3h后,有大量细菌牢固地粘附于鸡气管粘膜上;而缺失菌株在相同的培养条件下,仅有少数细菌粘附于鸡气管粘膜上,突变菌的粘附能力大约是亲本菌的1/50。对雏鸡的致病性实验表明,该缺失突变菌株相对于亲本菌株毒力明显降低,但仍具有一定程度的致病性,亲本菌与缺失突变菌对雏鸡的致死率分别是6/8和2/8。通过基因敲除构建缺失突变菌株,为研究fimC基因在鸡大肠杆菌致病机理中所起的作用和fimC基因缺失突变株其它生物学功能奠定了重要物质基础。
于珊[10]（2008）在《鸡致病性大肠杆菌基因工程菌株的构建及其免疫原性的研究》文中提出鸡大肠杆菌病是一种由大肠埃希氏菌为原发性或继发性病原体所致鸡的一类疾病的总称。十二世纪中期以后,随着养鸡业的发展,鸡大肠杆菌病的危害日趋严重,特别是在鸡的几种重要病毒病得到有效控制后,由其造成的损失明显上升,该病已成为危害养鸡业的主要细菌病之一。本文分别对本实验室保存的四株鸡致病性大肠杆菌进行了形态学、生理生化鉴定以及药敏实验、毒力实验的研究,又将此四株菌株按照适当的比例制备了大肠杆菌多价灭活疫苗,所制菌苗产生免疫力较早,免疫保护期较长,具有较好的免疫原性。然后,以这四株菌株为研究对象,根据GenBank公布的致病性鸡大肠杆菌的I型菌毛pilA基因和外膜蛋白C基因序列,分别设计了两对引物,经PCR特异性扩增出pilA基因和OmpC基因,序列分析表明扩增得到的基因与其参考菌株序列高度同源。进而,将扩增得到的两个基因分别定向克隆到原核表达载体pET-28a中,得到两个重组质粒pETpilA和pETOmpC,转化致受体大肠杆菌BL21（DE3）中,得到重组菌株BL21（DE3）（pETpilA）和BL21（DE3）（pETOmpC）,经IPTG诱导后,由SDS-PAGE分析分别可见表达的20Ku和40.9Ku的特异蛋白条带;Westernblot检测说明表达的蛋白具有较好的反应原性。又对已构建的基因工程菌株BL21（DE3）（pET-pilA）和BL21（DE3）（pET-OmpC）,分别从温度、接菌量、诱导时机、IPTG浓度、诱导时间等方面进行诱导条件的优化,结果显示菌株BL21（DE3）（pET-pilA）在40℃,接菌量80μl,诱导时机2h,IPTG浓度为0.96mM,诱导时间4h时得到最大蛋白表达量,而菌株BL21（DE3）（pET-OmpC）的最佳诱导条件为诱导温度37℃,接菌量80μl,诱导时机2.5h,IPTG浓度为0.64mM,诱导时间7h。最后,将表达菌毛pilA蛋白和外膜蛋白C的菌株分别制成基因工程疫苗并进行初步的免疫原性研究,免疫小鼠后,保护能力分别达80%和60%,混合疫苗的保护力尤佳,高达100%。表明这两种基因工程菌株有望作为鸡致病性大肠杆菌基因工程疫苗的候选生产菌株,为进一步研制预防鸡大肠杆菌病的基因工程疫苗奠定了坚实的基础。
二、大肠杆菌菌毛油乳剂苗的实验研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大肠杆菌菌毛油乳剂苗的实验研究（论文提纲范文）
（1）鸡致病性大肠杆菌脂多糖缺失株三价灭活疫苗佐剂的筛选及免疫持续期的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一篇 文献综述 |
| 综述一禽致病性大肠杆菌的研究进展 |
| 1 病原学 |
| 2 毒力因子 |
| 3 流行病学 |
| 4 临床症状及病理变化 |
| 5 防治 |
| 综述二 禽致病性大肠杆菌疫苗的研究进展 |
| 1 灭活疫苗 |
| 2 亚单位疫苗 |
| 3 弱毒疫苗 |
| 4 小结 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第一章 鸡致病性大肠杆菌脂多糖缺失株三价灭活疫苗佐剂的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二章 鸡致病性大肠杆菌脂多糖缺失株三价灭活疫苗的免疫持续期 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（2）苏北地区猪产肠毒素大肠杆菌（ETEC）流行病学调查及灭活疫苗初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略符号 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 产肠毒素大肠杆菌概述 |
| 1 仔猪腹泻特征 |
| 2 产肠毒素大肠杆菌的研究进展 |
| 2.1 病原学 |
| 2.2 形态特征及培养特点 |
| 2.3 鉴定方法 |
| 2.4 血清型 |
| 2.5 毒力因子 |
| 2.6 产肠毒素大肠杆菌的致病机制 |
| 3 大肠杆菌耐药性的研究进展 |
| 3.1 大肠杆菌耐药现状 |
| 3.2 大肠杆菌的耐药机制 |
| 3.3 大肠杆菌耐药性检测技术 |
| 4 猪大肠杆菌疫苗的研究进展 |
| 4.1 大肠杆菌灭活疫苗概况 |
| 5 仔猪腹泻的防治措施 |
| 5.1 饲养管理 |
| 5.2 药物防治 |
| 5.3 免疫防控 |
| 6 结语 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第二章 产肠毒素大肠杆菌的分离鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 临床采样 |
| 1.2 主要仪器与试剂 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 参考菌株 |
| 1.5 引物 |
| 1.6 病料处理 |
| 1.7 分离鉴定 |
| 1.8 血清型鉴定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 采样与疑似菌株的分离 |
| 2.2 分离鉴定 |
| 2.3 血清型鉴定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 产肠毒素大肠杆菌生物学特性分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 菌株和动物 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 引物 |
| 1.5 毒力基因的检测 |
| 1.6 药敏试验 |
| 1.7 致病力测定试验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 毒力基因检测 |
| 2.2 药敏试验 |
| 2.3 致病力测定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 产肠毒素大肠杆菌灭活疫苗初步研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 菌株和动物 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 灭活疫苗的制备方法 |
| 1.5 最适免疫剂量测定 |
| 1.6 单价灭活疫苗的免疫效果评估 |
| 1.7 二价灭活疫苗的免疫效果评估 |
| 1.8 血清抗体效价测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 最适免疫剂量测定 |
| 2.2 不同致病力菌株免疫效果比较 |
| 2.3 单价灭活疫苗免疫效果评估 |
| 2.4 二价灭活疫苗免疫效果评估 |
| 2.5 血清抗体效价比较 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 致谢 |
（3）豫南地区鸡大肠杆菌病病原学调查与防控研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 鸡大肠杆菌病研究进展 |
| 1 研究背景 |
| 2 国内外研究进展 |
| 2.1 鸡大肠杆菌病病原学 |
| 2.2 大肠杆菌耐药性 |
| 2.3 中药抑菌作用及机制 |
| 2.4 鸡大肠杆菌疫苗 |
| 2.5 鸡大肠杆菌病防治 |
| 3 研究内容 |
| 3.1 豫南地区鸡大肠杆菌发病状况分析 |
| 3.2 分离菌株药物敏感性测定 |
| 3.3 中药活性成分联合抗菌药物增效作用研究 |
| 3.4 鸡大肠杆菌分离菌株致病性和免疫原性分析 |
| 3.5 鸡大肠杆菌氢氧化铝多价灭活苗研究 |
| 第二章 豫南地区鸡致病性大肠杆菌分离与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 细菌分离 |
| 2.2 分离培养 |
| 2.3 生化鉴定 |
| 2.4 PCR鉴定 |
| 2.5 血清型鉴定 |
| 2.6 致病性试验 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 鸡致病性大肠杆菌对常用抗菌药物耐药性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 细菌的最佳生长时期 |
| 2.2 β-内酰胺类药物体外抑菌活性 |
| 2.3 氨基糖苷类药物体外抑菌活性 |
| 2.4 酚胺醇类药物体外抑菌活性 |
| 2.5 喹诺酮类药物体外抑菌活性 |
| 2.6 其他药物体外抑菌活性 |
| 2.7 鸡大肠杆菌耐药谱分析 |
| 2.8 大肠杆菌中I型整合酶基因扩增 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 中药活性成分与氨基糖苷类药物体外联合抗菌作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 穿心莲内酯联合抗菌药物体外联合抑菌活性 |
| 2.2 黄芩苷联合抗菌药物体外联合抑菌活性 |
| 2.3 小檗碱联合抗菌药物体外联合抑菌活性 |
| 2.4 蒲公英提取物联合抗菌药物体外联合抑菌活性 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 鸡大肠杆菌多价灭活苗优势菌株筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 毒力试验 |
| 2.2 免疫原性试验 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第六章 鸡大肠杆菌多价灭活苗制备与评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 无菌检验 |
| 2.2 安全检验 |
| 2.3 效力检验 |
| 2.4 免疫持续期试验 |
| 2.5 免疫反应 |
| 2.6 免疫效果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读博士学位期间研究成果 |
（4）适用于蛋鸡免疫的猪源ETEC菌毛蛋白疫苗佐剂的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 免疫佐剂的研究进展 |
| 1.2.1 免疫佐剂的作用及作用机理 |
| 1.2.2 免疫佐剂的分类阐述 |
| 1.2.2.1 矿物质类免疫佐剂 |
| 1.2.2.2 油乳佐剂 |
| 1.2.2.3 微生物及微生物成分佐剂 |
| 1.2.2.3.1 脂多糖（LPS） |
| 1.2.2.3.2 分支杆菌及其组成成分 |
| 1.2.2.3.3 霍乱毒素(CT)和大肠杆菌不耐热肠毒素(LT) |
| 1.2.2.3.4 CpG DNA 佐剂 |
| 1.2.2.4 免疫刺激复合物（ISCOMs） |
| 1.2.2.5 中药免疫佐剂 |
| 1.2.2.5.1 中药多糖类免疫佐剂 |
| 1.2.2.5.2 中药蜂胶免疫佐剂 |
| 1.2.2.5.3 中药皂甙类免疫佐剂 |
| 1.2.2.5.4 中药壳聚糖类免疫佐剂 |
| 1.2.2.6 其他免疫佐剂 |
| 1.2.2.7 免疫佐剂的研究前景和趋势 |
| 1.3 免疫佐剂在制备鸡抗仔猪 ETEC 腹泻卵黄抗体中的研究进展 |
| 1.3.1 免疫佐剂在制备鸡抗仔猪 ETEC 腹泻卵黄抗体中的应用 |
| 1.3.2 产肠毒素性大肠杆菌的相关介绍 |
| 1.3.3 禽卵黄抗体的相关介绍 |
| 1.3.4 蛋鸡卵黄抗体用于防治仔猪腹泻的开发与应用前景 |
| 1.4 本课题的研究目的意义和主要研究内容 |
| 1.4.1 本课题的研究目的意义 |
| 1.4.2 本课题研究的主要内容 |
| 1.5 本研究的技术路线 |
| 第2章 ETEC 多价菌毛蛋白（K_(88)、K_(99)和~(987)P）疫苗的制备 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.1.1 试验菌株 |
| 2.2.1.2 主要培养基和试剂 |
| 2.2.1.3 主要试验仪器与设备 |
| 2.2.1.4 免疫佐剂 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.2.2.1 细菌的复苏与培养 |
| 2.2.2.2 菌毛蛋白（K_(88)、K_(99)和~(987)P）的提取、纯化 |
| 2.2.2.3 菌毛蛋白（K_(88)、K_(99)和~(987)P）的 SDS-PAGE 电泳检测 |
| 2.2.2.4 抗原介质的制备 |
| 2.2.2.5 SPA 佐剂疫苗的制备 |
| 2.2.2.6 SPB 佐剂疫苗的制备 |
| 2.2.2.7 SPC 佐剂疫苗的制备 |
| 2.2.2.8 ISCOMs 佐剂疫苗的制备 |
| 2.2.2.9 弗氏佐剂疫苗的制备 |
| 2.2.2.10 黄芪多糖注射液+ISCOMs 疫苗的制备 |
| 2.2.2.11 蜂胶佐剂疫苗的制备 |
| 2.2.2.12 抗原对照的制备 |
| 2.2.2.13 疫苗的物理性状检验 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 菌毛蛋白（K_(88)、K_(99)和~(987)P）的 SDS-PAGE 结果分析 |
| 2.3.2 疫苗的常规物理性状检测 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 2.4.1 菌毛蛋白（K_(88)、K_(99)和~(987)P）的提取 |
| 2.4.2 佐剂疫苗制备与检测 |
| 第3章 7 种佐剂疫苗对蛋鸡产蛋性能的影响比较 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.1.1 试验动物 |
| 3.2.1.2 主要仪器与设备 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.2.2.1 试验分组 |
| 3.2.2.2 试验蛋鸡免疫程序 |
| 3.2.2.3 试验记录 |
| 3.2.2.4 数据分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 免疫后各试验组蛋鸡产蛋率的结果分析 |
| 3.3.2 免疫期内各试验组蛋鸡产蛋率均值的结果分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 免疫后蛋鸡血清 ELISA 抗体效价的分析比较 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.1.1 抗原 |
| 4.2.1.2 疫苗 |
| 4.2.1.3 试验鸡群 |
| 4.2.1.4 主要试剂和仪器 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.2.2.1 蛋鸡分组及免疫程序 |
| 4.2.2.2 试验组血样采集及血清抗体制备 |
| 4.2.2.3 试验组血清效价的检测 |
| 4.2.2.4 数据处理 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 试验蛋鸡血清 ELISA 抗体效价检测结果 |
| 4.3.2 三免后第 30d 各组试验蛋鸡血清抗体的 ELISA 检测结果分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 7 种免疫佐剂对蛋鸡血清抗体强度的影响 |
| 4.4.2 7 种免疫佐剂对蛋鸡血清抗体持久度的影响 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 免疫后蛋鸡卵黄 ELISA 抗体效价的分析比较 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.1.1 抗原 |
| 5.2.1.2 疫苗 |
| 5.2.1.3 试验鸡群 |
| 5.2.1.4 主要试剂和仪器 |
| 5.2.2 方法 |
| 5.2.2.1 试验蛋鸡分组及免疫程序 |
| 5.2.2.2 卵黄抗体（IgY）样品的采集与制备 |
| 5.2.2.3 卵黄抗体（IgY）效价的检测 |
| 5.2.2.4 数据分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 各组试验蛋鸡的 IgY 的 ELISA 检测结果 |
| 5.3.2 三免后第 30d 试验蛋鸡的 IgY 的 ELISA 检测结果分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 7 种免疫佐剂对蛋鸡卵黄抗体强度的影响 |
| 5.4.2 7 种免疫佐剂对蛋鸡卵黄抗体持久度的影响 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 7 种佐剂对蛋鸡外观形态和注射部位组织的影响 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 材料 |
| 6.2.1.1 试验鸡群 |
| 6.2.1.2 疫苗 |
| 6.2.1.3 主要试剂和仪器 |
| 6.2.2 方法 |
| 6.2.2.1 试验蛋鸡分组与免疫程序 |
| 6.2.2.2 免疫期内各组试验蛋鸡的外观形态观察 |
| 6.2.2.3 免疫期后各组试验蛋鸡注射部位组织的解剖观察 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 免疫期内各组试验蛋鸡的外观形态观察结果 |
| 6.3.2 免疫期后各组试验蛋鸡注射部位组织的解剖结果 |
| 6.4 讨论 |
| 6.4.1 7 种免疫佐剂对试验蛋鸡外观形态的影响 |
| 6.4.2 7 种免疫佐剂对试验蛋鸡注射部位组织的影响 |
| 6.5 小结 |
| 第7章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（5）鸭传染性浆膜炎油乳剂灭活疫苗与不同佐剂二联灭活疫苗的免疫原性比较研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 目录 |
| 第一章 鸭传染性浆膜炎的研究概况 |
| 1 RA血清型的研究 |
| 2 RA分子生物学的研究 |
| 3 RA检测方法的研究 |
| 4 鸭传染性浆膜炎疫苗的研究 |
| 5 展望 |
| 第二章 禽大肠杆菌病的研究概况 |
| 1 E.coli血清型的研究 |
| 2 E.coli外膜蛋白的研究 |
| 3 禽大肠杆菌病疫苗的研究 |
| 4 展望 |
| 第三章 疫苗安全性研究与最佳免疫剂量筛选 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌种 |
| 1.2 供试疫苗及试剂 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 试验动物 |
| 1.5 主要仪器设备及试验器材 |
| 2 方法 |
| 2.1 疫苗制备 |
| 2.2 培养基的配制 |
| 2.3 攻毒用抗原的制备 |
| 2.4 动物试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 疫苗安全性试验 |
| 3.2 疫苗最佳免疫剂量筛选 |
| 4 讨论 |
| 4.1 疫苗安全性 |
| 4.2 疫苗最佳免疫剂量 |
| 第四章 疫苗免疫效力检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 供试疫苗 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 攻毒用菌株 |
| 1.4 试验动物 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 培养基的配制 |
| 2.2 攻毒用菌种的制备 |
| 2.3 攻毒菌量测定 |
| 2.4 攻毒保护试验 |
| 2.5 细菌再分离 |
| 3 结果 |
| 3.1 攻毒菌量测定结果 |
| 3.2 攻毒保护结果 |
| 3.3 死亡鸭的临床症状及剖检结果 |
| 3.4 细菌再分离结果 |
| 4 讨论 |
| 第五章 抗体消长规律检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 供试疫苗 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 攻毒用菌株 |
| 1.4 试验动物 |
| 1.5 主要仪器设备及器材 |
| 2 方法 |
| 2.1 培养基的配制 |
| 2.2 凝集抗原的制备 |
| 2.3 兔抗RA阳性血清的制备 |
| 2.4 抗体消长规律检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 血清RA凝集抗体效价 |
| 3.2 血清E.coli凝集抗体效价 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附图 |
（6）致病性鸡大肠杆菌pilA基因和外膜蛋白C基因的克隆、表达及其免疫原性（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株与质粒 |
| 1.2 酶和试剂 |
| 1.3 Ⅰ型菌毛和外膜蛋白C基因的克隆与序列分析 |
| 1.3.1 细菌基因组DNA和质粒DNA的提取 |
| 1.3.2 引物的设计与合成 |
| 1.3.3 pil A基因和外膜蛋白C基因的克隆 |
| 1.3.4 pil A基因和外膜蛋白C基因的序列分析 |
| 1.4 Ⅰ型菌毛pil A基因和外膜蛋白C基因原核表达载体的构建和表达 |
| 1.4.1 pil A基因和外膜蛋白C基因原核表达载体的构建 |
| 1.4.2 重组菌株pil A基因和外膜蛋白C基因的诱导表达 |
| 1.4.3 表达产物的Western blotting检测 |
| 1.5 鸡大肠杆菌基因疫苗的制备和免疫原性的研究 |
| 1.5.1 疫苗的制备 |
| 1.5.2 安全性测定 |
| 1.5.3 最小致死剂量 (MLD) 的确定 |
| 1.5.4 动物免疫实验 |
| 1.5.5 攻毒实验 |
| 1.5.6 石蜡切片 |
| 2 结果 |
| 2.1 Ⅰ型菌毛pil A基因和外膜蛋白C基因的克隆与序列分析 |
| 2.1.1 pil A基因和外膜蛋白C基因的PCR扩增结果 |
| 2.1.2 pil A基因和外膜蛋白C基因的克隆 |
| 2.1.3 pil A基因和外膜蛋白C基因的序列测定与同源性比较 |
| 2.2 Ⅰ型菌毛和外膜蛋白C基因原核表达载体的构建和表达 |
| 2.2.1 Ⅰ型菌毛和外膜蛋白C基因原核表达载体的构建 |
| 2.2.2 Ⅰ型菌毛和外膜蛋白C基因的原核表达 |
| 2.3 表达产物的Western blotting检测 |
| 2.4 致病性鸡大肠杆菌基因疫苗的制备和免疫原性的研究 |
| 2.4.1 安全性测定 |
| 2.4.2 最小致死剂量 (MLD) 的确定 |
| 2.4.3 间接ELISA检测小鼠抗血清结果 |
| 2.4.4 基因工程菌株的小鼠免疫保护试验结果 |
| 3 讨论 |
（7）鸭源巴氏杆菌、大肠杆菌二联多价蜂胶灭活疫苗研制及其免疫应答反应的动态研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 鸭大肠杆菌病研究概况 |
| 1.1.1 病原学及流行病学 |
| 1.1.2 鸭大肠杆菌病疫苗研究概况 |
| 1.2 鸭巴氏杆菌病概况 |
| 1.2.1 病原学及流行病学 |
| 1.2.2 鸭巴氏杆菌疫苗研究概况 |
| 1.3 间接酶联免疫技术在禽细菌性疾病抗体检测中的应用 |
| 2 本研究的目的意义 |
| 3 实验材料、内容和方法 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 菌株 |
| 3.1.2 试验动物 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器及应用软件 |
| 3.1.5 其它试验材料 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 菌种复壮及毒力测定 |
| 3.2.2 疫苗制备 |
| 3.2.3 疫苗无菌检验 |
| 3.2.4 疫苗安全性检验 |
| 3.2.5 最佳免疫剂量筛选 |
| 3.2.6 疫苗保存期测定 |
| 3.2.7 免疫接种及攻毒保护试验 |
| 3.2.8 体液免疫和细胞免疫检测 |
| 4 试验结果 |
| 4.1 疫苗的物理性状和无菌检验结果 |
| 4.2 疫苗安全性试验结果 |
| 4.3 毒力测定结果 |
| 4.4 疫苗最佳免疫剂量筛选结果 |
| 4.5 免疫效力试验结果 |
| 4.6 疫苗保存期试验结果 |
| 4.7 抗体消长规律检测结果 |
| 4.8 微量凝集检测法与间接ELISA法检测抗体敏感性比较 |
| 4.9 T细胞免疫水平 |
| 5 讨论 |
| 5.1 疫苗制备、最佳免疫剂量和安全性检验 |
| 5.2 E.coli-P.M二联多价蜂胶灭活疫苗的免疫效力 |
| 5.3 E.coli-P.M二联多价蜂胶灭活疫苗免疫鸭后的抗体水平 |
| 5.4 E.coli-P.M二联多价蜂胶灭活疫苗免疫鸭后的T细胞免疫水平 |
| 5.5 蜂胶佐剂对细胞免疫的影响 |
| 5.6 间接ELISA法与微量凝集检测法检测抗体敏感性比较 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位论文期间发表的学术论文目录 |
（8）鸭致病性E.coli外膜蛋白及相关毒力基因和新血清型发现及病原特性研究（论文提纲范文）
| 本论文的创新性工作 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 禽大肠杆菌病研究进展 |
| 1 病原学特性 |
| 2 禽大肠杆菌病的流行特点 |
| 3 禽病原性大肠杆菌的O血清型 |
| 4 临床类型及病理变化 |
| 5 致病机理 |
| 6 大肠杆菌的耐药性 |
| 7 诊断 |
| 8 防制 |
| 8.1 一般性预防措施 |
| 8.2 免疫预防 |
| 8.2.1 灭活苗 |
| 8.2.2 亚单位疫苗 |
| 8.2.3 活菌苗 |
| 8.3 微生态学防制 |
| 8.4 药物防治 |
| 第二章 禽病原性大肠杆菌主要毒力因子研究进展 |
| 1 菌毛 |
| 1.1 Ⅰ型菌毛 |
| 1.1.1 Ⅰ型菌毛的特点 |
| 1.1.2 Ⅰ型菌毛基因结构与功能 |
| 1.1.3 Ⅰ型菌毛的同源性 |
| 1.1.4 Ⅰ型菌毛在感染中的作用 |
| 1.1.5 Ⅰ型菌毛蛋白免疫原性 |
| 1.2 P型菌毛 |
| 1.2.1 P型菌毛的特点 |
| 1.2.2 P型菌毛基因结构的相关研究 |
| 1.2.3 P型菌毛的同源性 |
| 1.2.4 P型菌毛在感染中的作用 |
| 2 外膜蛋白(OMPs) |
| 2.1 外膜蛋白与血清型 |
| 2.2 外膜蛋白的免疫原性 |
| 2.3 外膜蛋白的致病作用 |
| 2.4 外膜蛋白与耐药性 |
| 3 血清抗性蛋白(Iss) |
| 4 志贺毒素(Stx) |
| 4.1 Stx的分子结构 |
| 4.2 Stx的致病机理 |
| 5 溶血素(hly) |
| 6 大肠杆菌素(ColV) |
| 7 毒力岛 |
| 7.1 耶尔森氏菌强毒力岛(HPI) |
| 7.1.1 HPI的基本特点 |
| 7.1.2 HPI的结构与功能 |
| 7.1.3 HPI在其他肠道致病菌中的分布 |
| 7.2 肠细胞脱落位点毒力岛(LEE) |
| 7.2.1 LEE的基本特点 |
| 7.2.2 LEE的结构与功能 |
| 7.2.3 eaeA在其他肠道致病菌中的分布 |
| 8 APEC与ExPEC |
| 9 小结 |
| 10 立题依据 |
| 10.1 研究背景与意义 |
| 10.2 本研究的立题依据与设计思路 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第三章 规模化养鸭场鸭源致病性大肠杆菌的分离鉴定及病原特性和系统发育学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病料和棉拭样品来源 |
| 1.1.2 主要仪器设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 大肠杆菌标准抗O因子血清 |
| 1.1.5 大肠杆菌药敏标准质控菌株 |
| 1.1.6 药敏纸片 |
| 1.1.7 试验鸭 |
| 1.1.8 试剂配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细菌分离培养 |
| 1.2.2 革兰氏染色镜检 |
| 1.2.3 大肠杆菌生化试验 |
| 1.2.4 大肠杆菌O血清型鉴定 |
| 1.2.5 药敏试验 |
| 1.2.6 致病性试验 |
| 1.2.7 16S rRNA基因序列测定与系统发育学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 大肠杆菌分离培养 |
| 2.2 生化试验 |
| 2.3 大肠杆菌分离株O血清型鉴定 |
| 2.4 耐药性测定 |
| 2.4.1 耐药率 |
| 2.4.2 多重耐药率 |
| 2.5 致病性试验 |
| 2.6 16S rRNA基因序列测定与系统发育学分析 |
| 2.6.1 16S rRNA序列扩增 |
| 2.6.2 16S rRNA的基因克隆鉴定 |
| 2.6.3 16S rRNA基因序列与系统发育学 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于鸭源致病性大肠杆菌的血清型 |
| 3.2 鸭源致病性大肠杆菌的耐药性 |
| 3.3 鸭源大肠杆菌的致病性 |
| 3.4 鸭源大肠杆菌的系统发育分析 |
| 4 小结 |
| 第四章 鸭源致病性大肠杆菌外膜蛋白型研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.3 OMPs的提取 |
| 1.4 OMPs的SDS-PAGE |
| 1.5 优势血清型ompA基因克隆和序列分析 |
| 1.5.1 引物 |
| 1.5.2 优势血清型E.coli及其DNA的提取 |
| 1.5.3 ompA基因的PCR扩增 |
| 1.5.4 PCR扩增产物的克隆、酶切鉴定及序列测定 |
| 1.5.5 OmpA及其推导的氨基酸序列分析 |
| 1.5.6 疏水性分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 130个鸭致病性E.coli分离株的OMP型 |
| 2.2 17个O93鸭致病性E.coli分离株的OMP型 |
| 2.3 13个鸭致病性E.coli O78分离株的OMP型 |
| 2.4 15个鸭致病性E.coli O92分离株的OMP型 |
| 2.5 8个鸭致病性E.coli O76分离株的OMP型 |
| 2.6 77个鸭致病性E.coli其他30个血清型分离株的OMP型 |
| 2.7 ompA基因PCR扩增结果 |
| 2.8 ompA基因的克隆鉴定 |
| 2.9 OmpA序列分析 |
| 2.9.1 DNA序列结构分析 |
| 2.9.2 氨基酸序列分析 |
| 2.10 系统发育分析 |
| 2.11 疏水性分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 鸭源致病性大肠杆菌分离株相关毒力基因分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株来源 |
| 1.1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 DNA模板的制备 |
| 1.2.2 毒力基因的PCR检测 |
| 1.2.3 PCR产物的克隆及鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 HPI毒力岛fyuA和irp2的PCR检测 |
| 2.2 fimC、papA和iss的PCR检测 |
| 2.3 不同血清型鸭大肠杆菌病分离株HPI检出率 |
| 2.4 irp2、fyuA、fimC、papA和iss基因的克隆与序列分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 fimC和papA基因在鸭源E.coli中的分布及其公共卫生的意义 |
| 3.2 iss基因与鸭E.coli致病性的关系 |
| 3.3 HPI毒力岛与鸭E.coli致病性 |
| 4 小结 |
| 第六章 鸭源致病性大肠杆菌分离株志贺毒素相关基因分子流行病学研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株来源 |
| 1.1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 DNA模板的制备 |
| 1.2.2 多重PCR的建立 |
| 1.2.3 分子流行病学调查 |
| 1.2.4 PCR产物的克隆及鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 多重PCR的建立 |
| 2.1.1 PCR反应条件 |
| 2.1.2 PCR 特异性检测 |
| 2.1.3 PCR敏感性检测 |
| 2.1.4 PCR重复性检测 |
| 2.2 分子流行病学调查 |
| 2.3 stx1、stx2、eaeA和hiyA基因的克隆与序列分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于多重PCR方法的建立 |
| 3.2 非-O157产志贺毒素大肠杆菌与HUS的关系 |
| 3.3 动物STEC感染在公共卫生的意义 |
| 4 小结 |
| 第七章 一株致鸭腿水肿为特征的O46大肠杆菌的发现及其实验病理模型建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株来源 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.1.4 主要试剂 |
| 1.1.5 大肠杆菌标准抗O因子血清 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 培养鉴定 |
| 1.2.2 生化鉴定 |
| 1.2.3 大肠杆菌O血清型鉴定 |
| 1.2.4 电镜观察 |
| 1.2.5 药敏试验 |
| 1.2.6 16S rRNA基因序列测定与系统发育学分析 |
| 1.2.7 fyuA、irp2、fimC、iss和papA基因的PCR检测及序列测定 |
| 1.2.8 stx1、stx2、eaeA和hlyA基因的PCR检测及序列测定 |
| 1.2.9 实验病理模型建立 |
| 2 结果 |
| 2.1 形态及染色 |
| 2.2 生化特性 |
| 2.3 血清型鉴定 |
| 2.4 电镜观察 |
| 2.5 药敏试验 |
| 2.6 16S rRNA基因序列测定与系统发育学分析 |
| 2.7 毒力基因的PCR检测及序列测定 |
| 2.8 雏鸭人工感染大肠杆菌SYW004株的临床症状 |
| 2.9 雏鸭人工感染大肠杆菌SYW004株的病理解剖变化 |
| 2.10 雏鸭人工感染大肠杆菌SYW004株的组织病理学变化 |
| 2.11 雏鸭人工感染大肠杆菌SYW004株的超微病理观察 |
| 2.11.1 细菌在鸭体内的分布和所感染的细胞 |
| 2.11.2 各器官组织的超微病理观察 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第八章 鸭源致病性大肠杆菌O46分离株对人工感染鸭的侵染规律研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试验菌株 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 高免血清 |
| 1.1.4 主要仪器设备和实验试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 动物实验及实验设计 |
| 1.2.2 样品的采集 |
| 1.2.3 间接免疫酶染色检测大肠杆菌方法的建立 |
| 1.2.4 大肠杆菌感染雏鸭组织内细菌分布的动态观察检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 特异性试验 |
| 2.2 间接酶标抗体染色条件的确定 |
| 2.3 大肠杆菌感染雏鸭组织内定位及动态分布 |
| 2.3.1 不同途经感染雏鸭组织内的定位及动态分布的检测结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 间接免疫组化方法的建立和优化 |
| 3.2 大肠杆菌O46分离株在组织器官的分布特点 |
| 3.3 O46分离株感染的定位与其他APEC的比较 |
| 3.4 O46分离株在肠道内的定位与鸭的其它传染病的比较 |
| 4 小结 |
| 第三部分 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文和承担科研项目 |
（9）鸡致病性大肠杆菌FimC基因缺失菌株的构建及其生物学特性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 鸡大肠杆菌病的概述 |
| 1.1.1 流行特点 |
| 1.1.2 发病原因 |
| 1.1.3 临床症状 |
| 1.1.4 病理变化 |
| 1.1.5 诊断与预防 |
| 1.2 大肠杆菌的主要致病因子 |
| 1.2.1 E.coli 菌毛 |
| 1.2.2 毒素 |
| 1.2.3 外膜蛋白及其他致病因素 |
| 1.3 Ⅰ型菌毛的基因簇结构及其功能 |
| 1.3.1 亚单位FimA |
| 1.3.2 亚单位FimB 和FimE |
| 1.3.3 亚单位FimD |
| 1.3.4 亚单位FimF、FimG、FimH |
| 1.3.5 亚单位FimI |
| 1.3.6 FimC 的研究进展 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 质粒和菌株 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 酶类及主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 PCR 扩增引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌O_2基因组DNA 的提取 |
| 2.2.2 E.coli 02 fimC 基因及其左右翼序列的鉴定 |
| 2.2.3 pCVD442::△fimC 重组自杀质粒的构建 |
| 2.2.4 FimC 基因缺失突变菌株的构建 |
| 2.2.5 菌毛表达实验 |
| 2.2.6 与鸡气管粘膜的粘附实验 |
| 2.2.7 雏鸡的毒力检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 E.COLI 02 FIMC 基因及其左右翼序列的鉴定 |
| 3.1.1 L-fimC-R 基因的PCR 扩增与纯化 |
| 3.1.2 pMD-L-fimC-R 的鉴定 |
| 3.1.3 02 菌株L-fimC-R 基因序列测定及同源性比较 |
| 3.2 PCVD442::△FIMC 自杀质粒的构建 |
| 3.2.1 FimC 基因左右臂片段的扩增 |
| 3.2.2 FimC 基因1716p 缺失片段的扩增 |
| 3.2.3 pMD-△fimC 克隆载体的鉴定 |
| 3.2.4 重组自杀质粒pCVD442::△fimC 的鉴定 |
| 3.3 FIMC 基因缺失突变菌株的构建 |
| 3.3.1 菌株O_2（pCVD442::△fimC）的筛选 |
| 3.3.2 重组菌株O_2（△fimC）（Nal~R）的筛选 |
| 3.3.3 O_2（△fimC）菌株的鉴定 |
| 3.4 菌毛表达实验 |
| 3.5 与鸡气管粘膜的粘附实验 |
| 3.6 雏鸡的毒力检测 |
| 3.6.1 亲本菌O_2最小致死量的测定 |
| 3.6.2 雏鸡的致病性实验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 pCVD442 自杀载体的生物学功能 |
| 4.2 缺失突变菌株的菌毛表达 |
| 4.3 缺失突变菌株对鸡气管上皮的粘附特性 |
| 4.4 FimC 基因的缺失对鸡大肠杆菌致病力的影响 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（10）鸡致病性大肠杆菌基因工程菌株的构建及其免疫原性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 绪论 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 鸡大肠杆菌病的发病特点 |
| 1.2 鸡大肠杆菌病病因和致病因子 |
| 1.2.1 鸡大肠杆菌病病原 |
| 1.2.2 鸡大肠杆菌病的致病因子 |
| 1.2.2.1 菌毛蛋白 |
| 1.2.2.2 毒素的致病作用 |
| 1.2.2.3 内毒素 |
| 1.2.2.4 热敏肠毒素（LT）和Vero 毒素 |
| 1.2.2.5 外膜蛋白（Omp） |
| 1.2.2.6 铁转运系统 |
| 1.2.2.7 C01V 质粒 |
| 1.3 鸡大肠杆菌病的防治 |
| 1.3.1 一般性防治措施 |
| 1.3.2 药物的应用 |
| 1.3.2.1 一般药物防治 |
| 1.3.2.2 中草药防治 |
| 1.3.3 抗病育种 |
| 1.3.4 研制菌苗免疫 |
| 1.3.4.1 活菌苗免疫 |
| 1.3.4.2 灭活苗免疫 |
| 1.3.4.3 抗原提取苗免疫 |
| 1.3.4.4 基因工程疫苗防治 |
| 2 大肠杆菌的分离鉴定、药敏和致病力实验 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 病料 |
| 2.1.1.2 培养基和试剂 |
| 2.1.1.3 供试动物 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.2.1 病原菌的分离和培养 |
| 2.1.2.2 病原菌的鉴定 |
| 2.1.2.2.1 细菌形态观察 |
| 2.1.2.2.2 三糖铁琼脂生化试验 |
| 2.1.2.2.3 微量生化试验 |
| 2.1.2.2.4 血清型鉴定试验 |
| 2.1.2.3 致病力试验 |
| 2.1.2.4 药物敏感试验 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 病原菌的分离结果 |
| 2.2.2 病原菌的鉴定结果 |
| 2.2.2.1 细菌镜检结果 |
| 2.2.2.2 克氏三糖铁生化试验结果 |
| 2.2.2.3 微量生化试验鉴定结果 |
| 2.2.2.4 血清型鉴定结果 |
| 2.2.3 药敏试验结果 |
| 2.2.4 致病力实验结果 |
| 2.3 小结 |
| 3 鸡致病性大肠杆菌多价灭活苗的研制 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.1.1 菌种 |
| 3.1.1.2 培养基和试剂 |
| 3.1.1.3 供试动物 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.2.1 动物接种试验 |
| 3.1.2.2 肠毒素鉴定 |
| 3.1.2.3 制备攻毒菌液 |
| 3.1.2.4 鸡大肠杆菌灭活苗的制备与检验 |
| 3.1.2.4.1 菌种增殖 |
| 3.1.2.4.2 纯粹检验 |
| 3.1.2.4.3 活菌计数 |
| 3.1.2.4.4 菌悬液的制备 |
| 3.1.2.4.5 灭活 |
| 3.1.2.4.6 无菌检验 |
| 3.1.2.4.7 菌苗制备 |
| 3.1.2.4.8 安全检验 |
| 3.1.2.4.9 效力试验 |
| 3.1.2.4.10 保存期试验 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 动物接种试验 |
| 3.2.2 肠毒素鉴定 |
| 3.2.3 纯粹检验和活菌计数 |
| 3.2.4 鸡大肠杆菌灭活苗的实验室检验 |
| 3.2.4.1 无菌检验 |
| 3.2.4.2 安全检验 |
| 3.2.4.3 稳定性测定 |
| 3.2.4.4 免疫剂量 |
| 3.2.4.5 效力检验 |
| 3.2.4.6 免疫期试验 |
| 3.2.5 保存期试验 |
| 3.3 小结 |
| 4 鸡大肠杆菌I 型菌毛PILA 基因和外膜蛋白C 基因的克隆和序列分析 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.1.1 菌株与质粒 |
| 4.1.1.2 酶和试剂 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.2.1 引物的设计与合成 |
| 4.1.2.2 琼脂糖凝胶电泳 |
| 4.1.2.3 I 型菌毛pilA 基因和外膜蛋白C 基因PCR 产物的回收 |
| 4.1.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 4.1.2.5 I 型菌毛pilA 基因和外膜蛋白C 基因PCR 产物的连接反应 |
| 4.1.2.6 大肠杆菌的转化 |
| 4.1.2.7 质粒的小量制备 |
| 4.1.2.8 重组子的筛选和酶切鉴定 |
| 4.1.2.9 质粒DNA 的定量技术 |
| 4.1.2.10 I 型菌毛基因和外膜蛋白基因的序列测定与同源性分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 I 型菌毛pilA 基因的克隆及测序结果 |
| 4.2.1.1 I 型菌毛pilA 基因的PCR 扩增结果 |
| 4.2.1.2 I 型菌毛pilA 基因重组质粒的酶切鉴定 |
| 4.2.1.3 阳性重组子所含I 型菌毛基因的序列测定与同源性比较 |
| 4.2.2 外膜蛋白C 基因的克隆及测序结果 |
| 4.2.2.1 外膜蛋白C 基因的PCR 扩增结果 |
| 4.2.2.2 外膜蛋白C 基因重组质粒的酶切鉴定 |
| 4.2.2.3 阳性重组子所含外膜蛋白C 基因的序列测定与同源性比较 |
| 4.3 小结 |
| 5 鸡大肠杆菌I 型菌毛PILA 基因和外膜蛋白C 基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.1.1 菌株与质粒 |
| 5.1.1.2 酶和试剂 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.1.2.1 含目的基因的重组质粒pUCmT-pilA，pUCmT-OmpC 及表达载体质粒pET-28a 的提取与纯化（方法同前） |
| 5.1.2.2 目的片段及表达载体质粒的酶切 |
| 5.1.2.3 酶切后目的片段及载体的回收，连接和转化 |
| 5.1.2.4 阳性重组子的筛选和鉴定（方法同前） |
| 5.1.2.5 二价基因工程菌株的构建 |
| 5.1.2.6 重组菌株的诱导表达 |
| 5.1.2.7 表达产物的SDS-PAGE 检测 |
| 5.1.2.8 表达产物在大肠杆菌细胞中的分布 |
| 5.1.2.9 表达产物的Western blot 分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 鸡大肠杆菌 O_1I 型菌毛 pilA 基因重组质粒的酶切鉴定 |
| 5.2.2 鸡大肠杆菌 O_1外膜蛋白 C 基因重组表达质粒的酶切鉴定 |
| 5.2.3 二价基因工程融合质粒的构建 |
| 5.2.4 表达产物的SDS-PAGE 检测 |
| 5.2.5 表达产物在大肠杆菌中的分布 |
| 5.2.6 表达产物的Western blot 检测 |
| 5.3 小结 |
| 6 鸡致病性大肠杆菌基因工程菌株诱导条件的优化 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.1.1 菌株 |
| 6.1.1.2 试剂 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.1.2.1 菌株的活化 |
| 6.1.2.2 诱导条件的优化 |
| 6.1.2.2.1 温度 |
| 6.1.2.2.2 接菌量 |
| 6.1.2.2.3 诱导时机 |
| 6.1.2.2.4 IPTG 浓度 |
| 6.1.2.2.5 诱导时间 |
| 6.1.2.3 制蛋白样 |
| 6.1.2.4 SDS-PAGE 检测 |
| 6.1.2.5 蛋白表达量的测定 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 SDS-PAGE 结果 |
| 6.2.2 蛋白含检测量结果 |
| 6.3 小结 |
| 7 鸡大肠杆菌病基因工程菌株的保护性实验 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.1.1 实验动物 |
| 7.1.1.2 试剂 |
| 7.1.1.3 器械 |
| 7.1.1.4 载玻片的清洗 |
| 7.1.1.5 多聚甲醛固定液的配制 |
| 7.1.1.6 苏木精染液的配制 |
| 7.1.1.7 伊红染液的配制 |
| 7.1.1.8 蛋白甘油粘贴剂的配制 |
| 7.1.2 方法 |
| 7.1.2.1 疫苗的制备 |
| 7.1.2.2 攻毒菌株的复壮 |
| 7.1.2.3 保护性实验 |
| 7.1.2.4 ELISA |
| 7.1.2.5 石蜡切片 |
| 7.1.2.5.1 组织取材、固定、脱水和石蜡包埋流程 |
| 7.1.2.5.2 组织切片、H-E 染色流程 |
| 7.1.2.6 鸡体效力实验 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 基因工程菌株安全性实验 |
| 7.2.2 疫苗的安全性检验 |
| 7.2.3 间接ELISA 检测小鼠抗血清结果 |
| 7.2.4 基因工程菌株的小鼠免疫保护试验结果 |
| 7.2.5 鸡体免疫实验 |
| 7.3 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间取得的科研成果清单 |
四、大肠杆菌菌毛油乳剂苗的实验研究（论文参考文献）
- [1]鸡致病性大肠杆菌脂多糖缺失株三价灭活疫苗佐剂的筛选及免疫持续期的初步研究[D]. 邵启文. 扬州大学, 2019(02)
- [2]苏北地区猪产肠毒素大肠杆菌（ETEC）流行病学调查及灭活疫苗初步研究[D]. 杨德鸿. 南京农业大学, 2018(07)
- [3]豫南地区鸡大肠杆菌病病原学调查与防控研究[D]. 黄立. 南京农业大学, 2017(07)
- [4]适用于蛋鸡免疫的猪源ETEC菌毛蛋白疫苗佐剂的筛选[D]. 赵兴华. 福建农林大学, 2012(12)
- [5]鸭传染性浆膜炎油乳剂灭活疫苗与不同佐剂二联灭活疫苗的免疫原性比较研究[D]. 马逊. 四川农业大学, 2010(04)
- [6]致病性鸡大肠杆菌pilA基因和外膜蛋白C基因的克隆、表达及其免疫原性[J]. 于珊,张倩,水小溪,于宙亮,赵宝华. 生物工程学报, 2008(09)
- [7]鸭源巴氏杆菌、大肠杆菌二联多价蜂胶灭活疫苗研制及其免疫应答反应的动态研究[D]. 刘义铃. 四川农业大学, 2008(03)
- [8]鸭致病性E.coli外膜蛋白及相关毒力基因和新血清型发现及病原特性研究[D]. 于学辉. 四川农业大学, 2008(01)
- [9]鸡致病性大肠杆菌FimC基因缺失菌株的构建及其生物学特性的研究[D]. 刘雪威. 东北农业大学, 2008(03)
- [10]鸡致病性大肠杆菌基因工程菌株的构建及其免疫原性的研究[D]. 于珊. 河北师范大学, 2008(01)