一、动脉血栓靶向定位的实验研究（论文文献综述）
史张[1]（2021）在《基于高分辨率磁共振对动脉粥样硬化不稳定斑块诊疗的临床及实验研究》文中研究指明第一部分基于高分辨率磁共振管壁成像对颅内动脉粥样硬化所致卒中复发及预后评估的临床研究第一章:颅内动脉粥样硬化斑块特征预测复发性脑卒中的前瞻性研究目的:颅内动脉粥样硬化引起的缺血性脑卒中复发率较高。然而,目前很少有研究利用高分辨率磁共振管壁成像（high-resolution vessel wall magnetic resonance imaging,hr-VW-MRI）技术预测复发性脑卒中。本研究旨在评估hr-VW-MRI在预测颅内动脉粥样硬化所致复发性脑血管缺血事件风险的价值。材料与方法:本研究前瞻性纳入首次发生急性/亚急性缺血性脑卒中的患者共58例（平均年龄57.7±11.5岁;男性45例）。所有患者分别在初次入院前及临床规范治疗大于三个月后行hr-VW-MRI检查,并对每个患者进行临床随访直到急性缺血性脑血管事件或短暂性缺血发作（transient ischemic attack,TIA）再次发生,随访时间不超过48个月。通过hr-VW-MRI评估并记录责任动脉最狭窄层面的狭窄率、斑块负荷（plaque burden,PB）、最小管腔面积（minimum luminal area,MLA）、斑块强化率及各种指标前后变化的百分比。PB的定义为（1-MLA/最狭窄层面的管壁面积）×100%。统计分析采用单因素及多因素Cox回归预测复发性脑卒中,并计算风险比（hazard ratio,HR）和95%置信区间（95%confidence interval,95%CI）。结果:基线和随访两次hr-VW-MRI扫描的平均时间间隔为6.2±4.1个月,其中12例患者（占总人数的20.7%）在10.9±9.2个月内发生了同侧责任血管的复发性TIA或缺血性脑卒中。单因素分析表明基线的甘油三酯、PB变化百分比和PB进展与卒中复发显着相关（所有P<0.05）。多因素Cox回归发现PB进展（HR,6.293;95%CI,1.620-24.444;P=0.001）是复发性缺血事件预测的独立影像学特征。结论:PB进展与复发性缺血性脑血管事件独立相关,hr-VW-MRI有助于复发性脑卒中患者的预测和风险分层。第二章:强化药物治疗后对复发性脑卒中预测及神经功能预后评估的前瞻性研究目的:前期研究认为高分辨率磁共振成像技术有助于预测（intracranial atherosclerotic disease,ICAD）引起的复发性脑卒中,但采用二维非全脑成像技术和缺乏规范临床随访及预后评估是其主要缺陷。本章研究旨在基于三维hr-VW-MRI通过短期随访和长期随访两个时间维度,探讨经强化药物治疗后患者临床和影像特征的变化规律,并评估复发性缺血性脑血管事件和神经功能残障的独立危险因素。材料与方法:本研究前瞻性分析因急性缺血性脑卒中入院治疗的患者,所有患者均在入院前行三维头颈联合hr-VW-MRI检查,并要求患者在强化药物治疗3个月后进行临床指标（包括体育运动及与动脉粥样硬化相关的临床症状和血液指标）和hr-VW-MRI影像特征的复查评估。随后在2021年3月1日前以电话采访形式进行患者症状和残障评估。通过改良兰金量表（modified rankin scale,m RS）来确定预后不佳和神经功能残障。统计分析采用单因素及多因素Cox回归预测复发性脑卒中、单因素及多因素Logistic回归评估预后情况,并计算风险比（HR）、优势比（odds ratio,OR）和95%置信区间（95%CI）。结果:最终纳入研究的患者为80人（平均年龄:59.64±12.03）,两次MRI扫描的平均时间间隔为92.4±15.9天,长期随访的平均天数为583.4±130.8天。强化药物治疗后,斑块活性减弱（强化率减低,P<0.001;直方图均数值升高,P=0.012）。在复发性卒中的高危因素研究中,凸月形斑块与短期卒中复发显着相关（HR=7.137;95%CI,1.531-33.277;P=0.047）,而在长期随访中体育运动与否则是卒中复发的独立危险因素（HR=0.104;95%CI,0.018-0.591;P=0.010）。在神经功能预后评估中,短期治疗后的预后优劣与患者高危因素控制不佳（OR=4.544;95%CI,1.238-24.761;P=0.045）、总运动代谢当量（OR=0.678;95%CI,0.465-0.990;P=0.044）和熵（OR=0.073;95%CI,0.011-0.473;P=0.006）显着相关,而斑块位于第二象限（OR=9.617;95%,2.0159-44.911;P=0.004）、服药依从性（OR=0.135;95%,0.030-0.610;P=0.009）和高危因素控制不佳（OR=6.234;95%,1.723-22.553;P=0.005）则与其长期治疗后神经功能残障有关。结论:hr-VW-MRI可评估强化药物治疗后斑块变化情况,并有助于ICAD引起的缺血性脑卒中患者复发风险预测和功能残障评估。第二部分多功能纳米脂质体靶向巨噬细胞对动脉粥样硬化不稳定斑块的诊治一体化实验研究目的:不稳定动脉粥样硬化斑块破裂造成的心脑血管疾病是全球死亡的主要原因,而M1型巨噬细胞向M2型的极化可能会使斑块的不稳定性转为稳定。我们设想构建一种共载125碘-氧化铁纳米粒(125I-ION)和姜黄素（Cur）的纳米粒脂质体(9-CCN(125I-ION/Cur)-LNPs),通过单光子发射断层扫描（SPECT）和磁共振成像（MRI）联合的多模态成像手段,将姜黄素靶向输送至动脉粥样硬化斑块,达到诊治一体化目的。材料与方法:首先,制备9-CCN(125I-ION/Cur)-LNPs,并检测铁和姜黄素的包封率、载药率以及该纳米脂质体的物理稳定性、放射化学稳定性和弛豫时间。其次,对该纳米脂质体进行体外评估,检测分析9-CCN(125I-ION/Cur)-LNPs在巨噬细胞中的摄取情况,并分离兔主动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞。进而,建立新西兰大白兔的动脉粥硬化动物模型,在注射前及每10天注射靶向纳米粒脂质体后,分别在注射后6h及36h进行体内SPECT和MRI扫描,评估斑块情况。最后,离体兔主动脉,进行病理切片、染色,分析斑块的病理学特征。结果:透射电镜显示9-CCN(125I-ION/Cur)-LNPs粒度均一、超顺磁性好、放射化学纯度为97.2%,且在体内循环中较为稳定。体外摄取研究发现,姜黄素和核素放射性均在RAW264.7细胞中摄取较高,而MRI图中ION的摄取在两种细胞中几乎相同,并且体外实验表明9-CCN(125I-ION/Cur)-LNPs和姜黄素可促进巨噬细胞极化为M2表型。此外,体内实验表明,9-CCN(125I-ION/Cur)-LNPs可以特异性地与动脉粥样硬化斑块中的促炎M1型巨噬细胞结合,并将125I-ION和姜黄素传递到巨噬细胞中。由于M1向M2极化,不稳定的动脉粥样硬化斑块变得稳定,导致纳米粒脂质体的吸收显着减少,SPECT/CT核素摄取显着下降。结论:9-CCN(125I-ION/Cur)-LNPs实现了同时检测和改善动脉粥样硬化斑块易损性,核医学和磁共振联合成像的方式可精准检测斑块并评估疗效,实现动脉粥样硬化疾病的诊治一体化。
张雅楠[2]（2021）在《纤维蛋白靶向纳米粒光声成像用于检测心肌梗死区的实验研究》文中提出第一部分纤维蛋白靶向纳米粒的制备、基本性质检测和生物安全性评价目的:制备一种由CREKA五肽修饰并包裹ICG的纤维蛋白靶向纳米粒（CREKA-ICG-LIP NPs）,检测其纳米粒基本性质、稳定性及生物安全性。方法:采用薄膜水化-声震法制备CREKA五肽修饰的脂质外壳并包裹ICG的纳米粒（CREKA-ICG-LIP NPs）;光镜及透射电镜观察纳米粒的形态和结构;使用Malvern粒径仪检测纳米粒的粒径、表面电位、聚合物分散指数（Polymer dispersity index,PDI）及稳定性;紫外分光光度计检测ICG,CREKA-LIP NPs和CREKA-ICG-LIP NPs溶液的紫外光谱图,计算靶向纳米粒中ICG的包封率（Encapsulation efficiency,EE）;采用CCK-8法检测不同浓度CREKA-ICG-LIP NPs对H9C2细胞的毒性;检测对照组和注射纳米粒1天、3天、7天14天组SD大鼠（n=5只/组）的血常规和血生化指标,HE染色观察对照组及14天组重要脏器（心、肝、脾、肺、肾）进行安全性评价。结果:靶向纳米粒CREKA-ICG-LIP NPs外观呈暗绿色混悬液;光镜及透射电镜下观察CREKA-ICG-LIP NPs呈球形,大小均匀,分散性好;Malvern粒径仪检测CREKA-ICG-LIP NPs纳米粒平均粒径及PDI分为260.77±9.00nm（PDI=0.138）,表面电位分别为-30.50±0.78 m V,纳米粒的平均粒径随时间变化的差异无统计学意义（P<0.05）;ICG的标准曲线为:Y=0.1538X+0.0607（R2=0.9957）,纳米粒ICG的EE为86.72%;CCK-8法检测纳米粒处理后细胞活性均在90%以上;与对照组血常规及血生化指标相比,实验组指标无异常升高,14天组重要脏器HE切片无明显病理改变。结论:本研究通过薄膜水化-声震法成功制备了靶向纳米粒CREKA-ICG-LIP NPs,纳米粒具有大小均一、分散性较好、稳定性强及生物安全性高等特点。第二部分纤维蛋白靶向纳米粒靶向能力及体内分布的实验研究目的:建立并验证心肌缺血再灌注（ischemia reperfusion,IR）模型,评价靶向纳米粒（CREKA-ICG-LIP NPs）的体内外靶向能力并观察体内分布情况。方法:通过结扎SD大鼠冠状动脉左前降支-移除结扎线的方式建立IR模型,使用心电图、TTC染色、HE染色及Masson染色等方法验证模型制备;体外靶向实验,分别将带有DiI的靶向纳米粒CREKAICG-LIP/DiI NPs、非靶向纳米粒ICG-LIP/DiI NPs及PBS溶液与纤维蛋白膜共孵育,观察荧光信号情况;体内靶向实验,6只IR和6只NC的SD大鼠随机分为:NC靶向组、NC非靶向组、IR靶向组及IR非靶向组（n=3只/组）,尾静脉注射纳米粒溶（CREKA-ICG-LIP/DiI NPs or ICG-LIP/DiI NPs,1ml,4mg/ml）,制备心脏冰冻切片,观察纳米粒和纤维蛋白分布及共定位情况;体内分布实验,靶向荧光纳米粒通过尾静脉注射到SD大鼠体内,分别在注射后1、6及24h取SD大鼠主要器官（心、肝、脾、肺、肾）制作冰冻切片观察纳米粒分布情况。结果:IR模型结扎后心电图显示Ⅲ导联ST段抬高,术后TTC染色存在心肌缺血区,术后3周HE染色及Masson染色存在心肌纤维化,提示IR模型成功建立;体外靶向实验发现,靶向组比非靶向组及PBS组纤维蛋白膜荧光信号强;体内靶向实验发现,与NC组相比IR组损伤区纤维蛋白信号更强（P<0.0001）,与IR非靶向组相比IR靶向组发现大量纳米粒信号（P<0.0001）且纳米粒与纤维蛋白有良好的共定位;体内分布实验发现,循环1h后,肝脏和脾脏出现较弱荧光信号,循环6h,肝脏和脾脏信号强度增加,肾脏出现微弱荧光信号,循环24h,肝、脾和肾荧光信号较前均降低,心肺未见明显信号。结论:靶向纳米粒CREKA-ICG-LIP NPs与纤维蛋白结合能力强,体内实验发现其能通过血管内皮间隙,有效的与心肌损伤区出现的纤维蛋白结合,证实CREKA-ICG-LIP NPs纳米粒具有良好的体内外靶向能力;纳米粒体内分布主要出现在肝、脾及肾,表明其经过肝-脾系统代谢及肾脏排泄。第三部分纤维蛋白靶向纳米粒光声成像用于检测心肌梗死区的实验研究目的:制备纤维蛋白靶向纳米粒（CREKA-ICG-LIP NPs）,评价其用于检测心肌梗死区的光声成像的效果。方法:体外光声成像实验,使用光声成像仪在680nm-970nm扫描CREKA-ICG-LIP NPs（ICG,200μg/ml）纳米粒溶液,确定最佳激发波长;采集不同浓度CREKA-ICG-LIP NPs（ICG,0-400μg/ml）、CREKA-LIP NPs（2mg/ml）及PBS溶液的光声图像,并使用系统软件测量每个感兴趣区ROI（region of interest,ROI）的光声信号值;收集CREKA-ICG-LIP NPs（ICG,200μg/ml）随时间延长（0、4、8、12h）的光声图像并测量光声信号值以检测纳米粒光声稳定性;体内光声成像实验,制6只IR模型大鼠并随机分为:靶向组和非靶向组（n=3只/组）,经尾静脉注射靶向或非靶向纳米粒（CREKA-ICG-LIP NPs或ICG-LIP NPs,1ml,4mg/ml）,收集其在手术前、手术后、注射后0min及注射后60min心脏区域的光声图像并测量光声信号强度,图像收集完毕后,取心脏进行TTC染色。结果:体外光声成像实验发现,835nm是CREKA-ICG-LIP NPs光声成像的最佳激发波长;未包裹ICG的纳米粒（CREKA-LIP NPs）及PBS溶液无光声信号,而包裹ICG的纳米粒（CREKA-ICG-LIP NPs）有光声信号出现,其光声信号强度与纳米粒浓度有良好的线性关系,线性回归方程:Y=0.0068X+0.0983（R2=0.9943）,且CREKA-ICG-LIP NPs（ICG,200μg/ml）的光声信号强度不会随时间推移而改变;体内光声成像实验发现,靶向组和非靶向组大鼠术前和术后心脏区域均未观察到光声信号,纳米粒体内循环60min后,靶向组的心脏前壁区域发现有光声信号存在,而非靶向组心脏前壁区域未见光声信号,靶向组比非靶向组光声信号值有统计学意义上升高（P<0.0001）,TTC染色观察靶向组与非靶向组均存在心肌缺血区。结论:纤维蛋白靶向纳米粒（CREKA-ICG-LIP NPs）体外激发后可以产生光声信号并具有良好光声稳定性,体内循环后可通过损伤区增宽的血管内皮间隙到达心肌损伤区,并与纤维蛋白结合实现对损伤区特异性的光声成像。
李聃丹[3]（2020）在《两亲性鲁米诺/二氢卟吩e6偶联物自组装纳米粒的构建及其防治动脉粥样硬化的作用与机制研究》文中研究表明心血管疾病是全世界最常见的死亡原因,主要并发症为缺血性中风、心肌梗死和外周血管疾病。在与心血管疾病相关的死亡中,约50%是由冠状动脉病变引起的。动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是引起冠状动脉病变的病理生理基础,是心血管疾病发展过程中最重要的病理过程。动脉粥样硬化致病因素很多,如血脂异常、血糖异常、高血压、肥胖和糖尿病等。现有研究证实,动脉粥样硬化不仅与代谢障碍相关,也是动脉壁的慢性炎症过程,是由血液中的脂蛋白在受损的内皮下沉积引起的。血液中单核细胞受到炎症影响透过活化内皮细胞进入内膜,分化成巨噬细胞。巨噬细胞氧化沉积的脂质并将其吞噬入胞形成泡沫细胞,诱导脂纹形成,这是动脉粥样硬化发展的开始。除此之外,被巨噬细胞氧化的脂蛋白进一步诱导泡沫细胞坏死,形成坏死核心,促进斑块破裂引发血栓生成,加速动脉粥样硬化发展进程。目前治疗动脉粥样硬化的药物主要有调节血脂类、抗氧化剂类、抗血小板类、扩张血管类和抗炎类。但是这些药物会导致肝肾功能异常、消化道出血、腹泻和低血压等副作用,限制了它们在临床广泛使用。因此靶向药物成为治疗动脉粥样硬化的研究热门。我们课题组前期合成了两亲性二氢卟吩e6（Ce6）、鲁米诺和聚乙二醇（PEG）偶联物（CLP）,发现该药物具有抗炎和抑制中性粒细胞和巨噬细胞迁移的作用。动脉粥样硬化是一个慢性的炎症过程。血管内皮细胞受到炎症影响,内皮功能发生障碍,循环低密度脂蛋白渗入血管内膜后被氧化。经过氧化修饰的低密度脂蛋白激活免疫细胞,导致趋化因子和粘附分子的表达,吸引单核细胞聚集到内皮损伤部位,使它粘附并迁移至内膜。此时单核细胞分化为巨噬细胞。巨噬细胞在内膜下迁移并吞噬氧化低密度脂蛋白后形成泡沫细胞。积累的泡沫细胞坏死后,逐渐形成血栓和促炎坏死核心,促进斑块破裂引发血栓生成,导致动脉粥样硬化进一步发展。因此我们设想CLP纳米粒具有抗炎作用,且能抑制巨噬细胞迁移,那么CLP纳米粒是否具有靶向斑块达到防治动脉粥样硬化的效果。是否在加入靶向基团后增强纳米粒的疗效。方法1.CLP及CLP-cRGD偶联物的合成与表征使用N-羟基丁二酰亚胺（NHS）和N-（3-二甲基氨基丙基）-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）活化Ce6羧基后,分别与鲁米诺和甲氧基氨基聚乙二醇的氨基缩合得到两亲性CLP偶联物。使用N-羟基丁二酰亚胺（NHS）和N-（3-二甲基氨基丙基）-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）活化Ce6羧基后,分别与鲁米诺和马来酰亚胺氨基聚乙二醇的氨基缩合得到两亲性CLP-MAL偶联物。继续在CLP主链上通过马来酰亚胺（MAL）和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸环肽（cRGD）的巯基键合得到CLP键合cRGD聚合物（CLP-cRGD）。通过对CLP和CLP-cRGD偶联物的红外光谱、核磁图谱、基质辅助激光解析电离飞行时间图谱、紫外吸收光谱和荧光光谱分析验证其结构。2.CLP纳米粒和CLP-cRGD纳米粒的合成及表征将CLP和CLP-cRGD偶联物溶于水溶液中即可获得自组装CLP纳米粒（CLP NP）和CLP-cRGD纳米粒（CLP-cRGD NP）。通过透射电镜和马尔文粒径仪对纳米粒的粒径分布、粒径大小及Zeta电位进行测定。3.CLP纳米粒和CLP-cRGD纳米粒在动脉粥样硬化斑块中的靶向效应和脏器组织分布摘取动脉粥样硬化治疗结束后的小鼠心脏、主动脉和主要脏器进行活体成像和共聚焦成像,考察CLP纳米粒和CLP-cRGD纳米粒对心脏和血管中斑块的靶向作用和脏器分布情况。4.CLP纳米粒治疗动脉粥样硬化药效学研究使用Apo E-/-小鼠建立动脉粥样硬化模型。采用尾静脉注射（i.v.）、腹腔注射（i.p.）和口服给药（p.o.）三种给药方式,给予CLP纳米粒治疗80天后,测定主动脉、主动脉根及头臂干的斑块面积,考察主动脉根斑块稳定性,确定CLP纳米粒治疗动脉粥样硬化的有效给药方式。5.CLP-cRGD纳米粒治疗动脉粥样硬化药效学研究Apo E-/-小鼠成功建立动脉粥样硬化模型后,尾静脉分别给予CLP纳米粒和CLP-cRGD纳米粒治疗60天。测定主动脉、主动脉根和头臂干斑块面积,考察主动脉根斑块稳定性,评价CLP纳米粒及CLP-cRGD纳米粒的药效。6.CLP纳米粒治疗动脉粥样硬化机制研究采用与动脉粥样硬化相关的小鼠巨噬细胞（RAW.264.7细胞）、小鼠主动脉血管内皮细胞（MOVAS细胞）和人脐静脉内皮细胞（HUVEC细胞）,验证CLP纳米粒在细胞中的吞噬效应。采用脂多糖（LPS）诱导RAW264.7巨噬细胞建立炎性细胞模型,通过趋化因子蛋白芯片筛选出CLP纳米粒处理后变化最显着的MIP-2蛋白,并使用ELISA试剂盒、荧光定量PCR和Western blot验证其结果。使用炎症模型,验证CLP纳米粒对炎症因子的影响。使用单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和胎牛血清（FBS）作为趋化因子,验证CLP纳米粒对RAW26.47细胞、MOVAS细胞和中性粒细胞迁移的影响。使用氧化低密度脂蛋白（ox LDL）诱导泡沫细胞形成,验证CLP纳米粒对泡沫细胞形成的影响。7.CLP纳米粒和CLP-cRGD纳米粒初步安全性评价通过CCK8法检测CLP纳米粒对RAW264.7细胞和MOVAS细胞的毒性作用。Apo E-/-小鼠抗AS治疗结束后,记录体重变化、统计脏器指数、分析血常规和肝肾功能及观察主要脏器H&E染色,考察CLP纳米粒和CLP-cRGD纳米粒治疗AS的安全性。Balb/c小鼠尾静脉一次性分别给予1000 mg/kg、500 mg/kg和250 mg/kg CLP纳米粒,统计15天体重变化和脏器指数,统计血常规和生化指标,观察主要脏器H&E染色,考察CLP纳米粒急性毒性实验。结果1.光谱结合质谱分析Ce6、鲁米诺和甲氧基氨基聚乙二醇能成功构建CLP偶联物。利用马来酰亚胺可将cRGD环肽键合到CLP主链上,成功构建CLP-cRGD聚合物。CLP纳米粒和CLP-cRGD纳米粒的平均粒径分别为170±4 nm和156±3 nm,表面电位（Zeta电位）分别为-19.2±0.2 m V和-16.1±0.3 m V。2.CLP纳米粒和CLP-cRGD纳米粒均能靶向到血管斑块部位。引入cRGD靶向单元后,CLP-cRGD纳米粒增强了纳米粒的斑块靶向效应。静脉注射CLP纳米粒能抑制动脉粥样硬化斑块生成,维持斑块稳定。CLP-cRGD纳米粒与之相比,效果更佳。3.CLP纳米粒能被RAW264.7巨噬细胞、MOVAS细胞和HUVEC细胞吞噬入胞发挥作用。CLP纳米粒能降低炎症细胞中巨噬细胞炎性蛋白-2（Macrophage inflammatory protein-2,MIP-2）和炎症因子的含量。CLP纳米粒和CLP-cRGD纳米粒均能有效抑制RAW264.7巨噬细胞、MOVAS细胞和腹腔中性粒细胞迁移,并且CLP-cRGD纳米粒的抑制效果更强。CLP纳米粒还能有效抑制RAW264.7巨噬细胞摄取ox LDL,抑制泡沫细胞形成。4.CLP纳米粒和CLP-cRGD纳米粒在体内外具有良好的安全性。研究结论1.本课题成功构建了CLP偶联物和CLP-cRGD聚合物。2.CLP纳米粒和CLP-cRGD纳米粒能靶向到斑块部位,与CLP纳米粒相比,CLP-cRGD纳米粒靶向性更强。静脉注射CLP纳米粒能有效治疗动脉粥样硬化。增加靶向单元的CLP-cRGD纳米粒治疗效果更好。3.CLP纳米粒能有效抑制小鼠巨噬细胞（RAW.264.7细胞）、小鼠主动脉血管内皮细胞（MOVAS细胞）和腹腔中性粒细胞等炎性相关细胞迁移,且靶向纳米粒抑制效果更加显着。除此之外,CLP纳米粒还能有效抑制泡沫细胞形成,降低炎症细胞分泌的炎症因子和趋化因子MIP-2含量,抑制动脉粥样硬化发展。4.初步的体内外实验研究结果表明,CLP纳米粒在组织和细胞方面具有良好的安全性。
刘瑶[4]（2020）在《黄芪-丹参药对活性成分在高血压肾损害中调控microRNA-200c-3p保护肾动脉内皮机制研究》文中提出目的:通过收集高血压肾损害患者的四诊资料及处方用药,综合分析纳入患者的中医证候要素分布规律及其与相关实验室指标的关系,明确导师治疗高血压肾损害的用药规律及核心药对,为高血压肾损害的规范化诊疗提供客观数据。在上述研究基础上,以血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）干预大鼠肾动脉内皮细胞（RRAECs）构建血管内皮损伤模型,通过高通量miRNA-m RNA联合测序技术,从miRNA角度及转录后水平研究AngⅡ诱导血管内皮细胞功能障碍的分子机制。筛选确定补气活血中药黄芪-丹参药对代表性活性成分毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA的最佳配伍比例,探讨其改善AngⅡ诱导的内皮细胞功能障碍的作用靶点和调节机制,为阐明黄芪-丹参药对改善血管内皮功能、防治高血压肾损害的药理机制提供理论依据和实验支撑。方法:1.高血压肾损害患者的中医证候要素分布特点及导师用药规律研究:收集120例高血压肾损害患者的临床资料,使用SPSS软件对患者基本资料、证候要素分布进行统计分析,阐明高血压肾损害患者的中医证素分布规律,并系统分析各证素与患者年龄、高血压病史及血清胱抑素C（Cystatin C）、尿微量白蛋白（m ALB）、尿β2-微球蛋白（β2-MG）及估算肾小球滤过率（e GFR）等实验室指标的关系,探讨高血压肾损害的中医证素特征和基本病机。同时,统计导师临证处方,借助中医传承辅助平台软件,分析用药频次、药物之间的关联规则和组方规律,探索导师治疗高血压肾损害的用药经验,并筛选出核心药对,进行下一步的实验研究。2.AngⅡ诱导的肾动脉内皮细胞损伤中miRNA差异表达谱的构建与生物信息学分析:以AngⅡ体外诱导RRAECs 24 h建立血管内皮损伤模型。基于高通量miRNA-m RNA联合测序,筛选在Ang Ⅱ诱导的内皮细胞功能障碍中发挥关键作用的差异表达（DE）miRNA,分析Ang Ⅱ对内皮细胞miRNA表达谱的影响,并寻找其下游靶基因,通过生物信息学方法分析,构建DE miRNA与其靶基因的局部网络图,探讨miRNA在Ang Ⅱ诱导的血管内皮功能障碍中的调控机制,筛选出关键miRNA进行下一步研究。3.miRNA-200c-3p靶向ZEB2参与Ang Ⅱ诱导的RRAECs功能障碍的机制研究:采用生物信息学方法进行分子对接,预测ZEB2是否是miRNA-200c-3p的靶基因。构建ZEB2-3’UTR质粒,在HEK293T细胞内进行转染,应用双荧光素酶报告基因系统检测miRNA-200c-3p对ZEB2的靶向作用。荧光定量PCR（qPCR）评估细胞内转染效率后,采用MTT法和transwell实验分别检测miRNA-200c-3p对Ang Ⅱ诱导的RRAECs增殖和迁移能力的影响。应用qPCR和Western Blot技术分别检测两组细胞中ZEB2的m RNA和蛋白表达,并观察ZEB2对Ang Ⅱ诱导的RRAECs增殖和迁移功能的影响。同样,应用上述方法检测miRNA-200c-3p对Ang Ⅱ诱导的RRAECs中ZEB2 mRNA和蛋白表达的影响,进一步明确miRNA-200c-3p对ZEB2的靶向调控作用。4.毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍对AngⅡ诱导RRAECs的保护作用研究:采用MTT法筛选毛蕊异黄酮（0.5 mg/L、1.5 mg/L、5 mg/L、15 mg/L、50 mg/L）和丹参酮ⅡA（1 mg/L、3 mg/L、10 mg/L、30 mg/L、100 mg/L）改善AngⅡ诱导的RRAECs功能障碍的最佳药物浓度,继而将毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA按比例进行配伍,确定药对活性成分的最佳配伍比例。在此基础上,探讨毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍对AngⅡ诱导的RRAECs功能障碍的保护作用,观察其对细胞凋亡、细胞迁移、活性氧生成、线粒体自噬及线粒体膜电位的影响。5.毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍通过miRNA-200c-3p靶向ZEB2对Ang Ⅱ诱导RRAECs的保护机制研究:采用miRNA-mRNA联合测序技术,运用生物信息学分析方法,构建毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍组与模型组中miRNA的差异表达谱,筛选毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍改善Ang Ⅱ诱导的RRAECs功能障碍的作用靶点。分别采用MTT法和transwell实验观察毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对Ang Ⅱ诱导的RRAECs增殖和迁移能力的影响。qPCR技术检测毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对Ang Ⅱ诱导的RRAECs中miRNA-200c-3p和ZEB2 mRNA表达的影响;Western Blot方法检测毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对Ang Ⅱ诱导的RRAECs中ZEB2蛋白表达的影响。结果:1.通过对120例高血压肾损害患者的一般资料进行分析发现,男性患者66例,女性患者54例,男女比例为1.22:1,男性患者比例高于女性。纳入患者的平均年龄为64.40±10.39岁,其中,最大年龄为89岁,最小年龄为47岁。60岁以上的老年人为高血压肾损害的主要发病人群,占比70.83%。所有纳入患者的高血压平均病史为12.2±8.65年,其中,最短病史为5年,最长病史为40年。合并症方面,高血压肾损害合并冠心病的患者数量最多,为38例;其次为合并血脂异常的患者,共36例。纳入患者中,使用最多的降压药物为钙离子通道阻滞剂（CCB）,其次为血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（ARB）。两类药物联用方案中,采用ARB+CCB治疗的患者例数最多;其次为β受体阻滞剂+CCB组合;三药联用方案中,采用ARB+CCB+β受体阻滞剂治疗的患者例数最多;其次为ARB+CCB+利尿剂组合。纳入患者的虚性证候要素主要由气虚、阴虚和阳虚构成,其中,气虚证素的患者例数最多,共100例,占比83.33%。实性证候要素主要由血瘀、湿热、肝火（阳）和痰浊构成,其中,血瘀证素的患者例数最多,共67例,占比55.83%。在所有纳入的高血压肾损害患者中,单一证素患者最少,共4例,肝火（阳）患者3例,湿热患者1例,占总例数的3.33%。双证素患者最多,共63例,占总例数的52.5%,其中,气虚+血瘀患者例数最多,共28例,占比44.44%。三证素患者共53例,占总例数的44.27%,其中,气虚+血瘀+湿热患者例数最多,共20例,占比37.74%。各证素患者的平均年龄、尿β2-MG及e GFR在组间的比较有统计学差异,而在高血压病史、血清Cystatin C及尿m ALB方面,各证素的组间差异无统计学意义。气虚证素患者的尿β2-MG均值最高,其次为血瘀。血瘀证素患者的平均年龄明显高于其他证素患者,而e GFR水平则显着低于其他证素患者。血瘀、气虚证素患者的血清Cystatin C、尿m ALB水平均高于其他证素患者。用药规律方面,丹参、黄芪分别是导师治疗高血压肾损害应用频率最高的活血、补气中药,黄芪-丹参是应用频率最高的药对组合。治疗高血压肾损害的核心药物包括丹参、黄芪、当归、川芎、黄连、大黄。2.以5x10-7mol/L AngⅡ诱导RRAECs 24 h建立血管内皮损伤模型。经miRNA-m RNA联合测序检测,AngⅡ诱导后共筛选出443个DE m RNA,其中66个上调,377个下调（fold change>1.5 or<0.67,P<0.05）;共检测到58个DE miRNA,其中,55个上调,3个下调（fold change>1.5 or<0.67,P<0.05）。与对照组相比,属于miRNA-200家族不同成熟体的miRNA-200a-3p、miRNA-200b-3p、miRNA-200c-3p、miRNA-429在Ang Ⅱ组中均差异高表达,提示miRNA-200家族在AngⅡ诱导的RRAECs损伤中具有重要作用,故后续实验选用家族中最显着高表达的miRNA-200c-3p作为重点研究对象。此外,DE miRNA靶基因富集的GO条目与DE m RNA的富集结果相类似,均涉及细胞迁移、细胞增殖及小分子结合等方面;KEGG Pathway分析显示AngⅡ可能调控的靶基因与m TOR、AMPK、自噬等信号通路密切相关。3.生物信息学软件预测miRNA-200c-3p与ZEB2 3’UTR序列之间存在结合位点,双荧光素酶报告基因检测结果显示,miRNA-200c-3p能够负调控ZEB2的表达。与对照组比较,Ang Ⅱ诱导的RRAECs中,miRNA-200c-3p的表达显着升高（P<0.001）,ZEB2的m RNA（P<0.01）和蛋白（P<0.001）表达明显降低。敲减miRNA-200c-3p可上调Ang Ⅱ诱导的RRAECs中ZEB2 m RNA（P<0.001）和蛋白（P<0.01）的表达,显着减弱Ang Ⅱ对细胞增殖（24 h、48 h、72 h、96 h四个时间点的比较,分别为P>0.05,P<0.05,P<0.05,P<0.05）和迁移（P<0.001）能力的抑制作用;反之,过表达miRNA-200c-3p,则下调Ang Ⅱ诱导的RRAECs中ZEB2 m RNA（P<0.05）和蛋白（P<0.001）的表达,且明显增强Ang Ⅱ对RRAECs增殖（24 h、48 h、72 h、96 h四个时间点的比较,分别为P>0.05,P<0.05,P<0.01,P<0.01）和迁移（P<0.05）能力的抑制功效。上调ZEB2表达至少可部分逆转miRNA-200c-3p对Ang Ⅱ诱导的RRAECs增殖和迁移能力的抑制作用。4.AngⅡ诱导RRAECs功能障碍,可使RRAECs凋亡率升高,细胞迁移能力下降,活性氧生成增多,线粒体自噬激活,线粒体膜电位降低。毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍可在一定程度上改善AngⅡ诱导的RRAECs功能障碍,降低细胞凋亡率,促进细胞迁移,减少活性氧生成,抑制线粒体自噬,升高线粒体膜电位。5.测序结果显示,毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对AngⅡ诱导RRAECs功能障碍的保护机制可能与miRNA调控细胞凋亡、炎症等相关基因及细胞因子有关。与模型组比较,毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍组miRNA-200c-3p的表达水平显着下调（P<0.001）,ZEB2的m RNA（P<0.05）和蛋白（P<0.01）表达均有上调;同时,毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍干预可显着减弱AngⅡ对RRAECs增殖（在24 h、48 h、72 h、96 h四个时间点的比较,分别为P<0.05,P<0.01,P<0.05,P<0.01）和迁移能力（P<0.01）的抑制作用。结论:1.临床研究:高血压肾损害患者各证候要素分布由多至少依次为气虚、血瘀、湿热、肝火（阳）、阴虚、痰浊、阳虚。气虚+血瘀为高血压肾损害患者中占比最高的证素组合。各证素患者在年龄、尿β2-MG、e GFR方面的组间比较有统计学差异。本病病机总属本虚标实、虚实夹杂,气虚血瘀为其基本病机。导师治疗高血压肾损害以补气活血为主,兼以清热化湿、通腑排毒;黄芪-丹参为其应用频率最高的药对组合。2.实验研究:（1）AngⅡ通过升高miRNA-200c-3p水平下调靶基因ZEB2的表达,抑制RRAECs的增殖和迁移能力,使血管内皮功能受损。（2）毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍可在一定程度上改善AngⅡ诱导的RRAECs功能障碍,降低细胞凋亡率,促进细胞迁移,减少活性氧生成,抑制线粒体自噬,升高线粒体膜电位。（3）毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍显着增强AngⅡ诱导的RRAECs增殖和迁移能力的机制可能与其下调miRNA-200c-3p从而靶向上调ZEB2表达密切相关。
张姗[5]（2020）在《纳米级AMH靶向超声造影剂的制备及其对大鼠移植卵巢靶向显影的初步研究》文中研究表明目的:通过制备AMH靶向超声造影剂(AMH-Targeted nanobubbles,NBAMH),实现大鼠移植卵巢的靶向显影,并进一步借助NBAMH超声分子影像评价AMH分子在卵巢组织中的表达水平,实现移植卵巢存活状态的早期检测和量化评价。方法:1)第一部分:将脂质材料按一定比例混合,采用“薄膜水化法”、“机械震荡法”及“离心分离法”制备纯纳米粒径的造影剂（NBs）。通过“亲和素-生物素桥接”法将抗AMH的抗体AMH-antibody以不同的比例偶联于纳米微泡的表面制备出NBAMH。通过倒置显微镜和扫描电镜观察纳米微泡形态;马尔文粒度/电位分析仪检测微泡粒径、分散度及稳定性;荧光显微镜检测及流式细胞计数仪检测微泡携带抗体的情况及分析最佳抗体携带量及携带率;2)第二部分:体外培养大鼠卵巢颗粒细胞,首先将NBAMH以不同浓度与大鼠卵巢颗粒细胞共孵育,通过CCK-8法检测纳米微泡对细胞的毒性反应。为了模拟卵巢移植后的缺氧状态,在体外建立卵巢颗粒细胞缺氧/复氧（H/R）模型,ELISA检测AMH表达水平并确定最佳的H/R时间点。将建模细胞与NBAMH共孵育,普通光镜及荧光显微镜下观察检测NBAMH对卵巢颗粒细胞的黏附性;流式细胞计数仪检测NBAMH与细胞的结合率;3)第三部分:建立大鼠卵巢移植模型,20只SD大鼠（正常大鼠10只,卵巢移植模型大鼠10只）每只大鼠经尾静脉分别随机注射NBAMH和NBs,每种造影剂注射间隔30min。超声诊断仪观察每种造影剂在大鼠卵巢组织中的增强显影效果并对造影强度进行定量分析。小动物荧光成像系统观察NBAMH在体内的分布代谢情况。病理切片激光共聚焦显微镜观察NBAMH在移植卵巢中的分布情况。在体内靶向性实验之后,再次建立大鼠卵巢皮下移植模型,移植后6h将40只大鼠随机分为4组,即移植后3天组、5天组、7天组和10天组,每组10只。通过NBAMH超声分子影像,AMH分子免疫荧光以及Western Blot进一步检测卵巢移植后不同时间点AMH分子表达水平的检测。结果:1)第一部分:通过质量控制纯纳米脂质微泡粒径为478.24±28.02nm,AMH靶向纳米微泡粒径为549.33±28.53nm,其在光学显微镜及扫描电镜下呈大小均一的纳米级空心颗粒。且在室温条件下至少60min其粒径和浓度保持稳定状态。荧光显微镜显示AMH抗体成功耦连于微泡表面;流式细胞计数仪显示AMH抗体与NBs的最佳结合率为65.3±2.7%,最佳配比为1:5;2)第二部分:不同浓度的NBs与大鼠卵巢颗粒细胞共孵育未见明显细胞毒性。细胞建模后,H/R组细胞活性明显低于对照组（常氧组）,表示体外H/R建模成功。ELISA结果显示常氧及缺氧状态下卵巢颗粒细胞均表达AMH,且其表达量至少在缺氧12h内随缺氧时间的增加而增加。最佳缺氧和复氧时间为H6/R3。体外靶向性实验显示,普通光镜及荧光显微镜下观察到NBAMH组每个颗粒细胞周边的纳米泡的数量为（35.59±2.46）明显高于NBs组和NBIg G组（P<0.001）,流式细胞计数仪显示NBAMH与细胞结合率为23.97±0.15%,明显高于NBs组和NBIg G组,差异具有统计学意义（P<0.001）;3)第三部分:体内超声造分子影像表明,在移植卵巢中NBAMH的造影强度是NBs的2.17倍（P<0.001）。小动物成像仪结果进一步证实了NBAMH在卵巢组织中的特异性分布,并在注射后30min时其荧光强度是NBs组的4.28倍。移植卵巢病理组织切片及AMH免疫荧光表明NBAMH能够进入移植卵巢组织间隙并与AMH分子特异性结合。此外,通过AMH超声分子影像监测卵巢移植后3,5,7和10天的造影信号强度。移植卵巢中的造影强度从3天到10天显着增强（P<0.001）。为验证超声检查结果,对移植卵巢组织进行组织学检查和Western Blot分析。卵泡计数以及微血管密度检测显示随着移植天数的增加卵巢组织卵泡数量以及微血管密度逐渐增加。AMH分子免疫荧光和Western Blot结果均显示相同的趋势,与超声分子成像结果相似。结论:1.本研究成功制备了AMH靶向纳米微泡并优化了其最佳配比。2.NBAMH在体外与卵巢颗粒细胞具有明显的靶向黏附作用。3.NBAMH在体内能明显增强的移植卵巢显影。4.NBAMH可用于AMH分子的在体显影和量化评价从而反映移植卵巢的存活状态。NBAMH的超声分子影像为在体、无创的动态监测移植卵巢存活状态提供了一种新的方法。
张润军[6]（2019）在《pH和ROS双响应性靶向纳米药物的构建及其防治血管再狭窄的应用研究》文中提出研究背景:心血管疾病（CVD）是全世界发病率和死亡率的主要原因。据估计,心血管病每年可导致1790万人死亡,约占全球死亡总数的31%。研究表明,血管炎症与多种心血管疾病的发病机制密切相关,如动脉粥样硬化、心肌梗死、再狭窄、颅内动脉瘤和主动脉瘤、卒中和外周动脉疾病。通过调节参与炎症反应的不同分子和细胞过程,已经有大量的治疗方法被研究用来预防和治疗心血管病。尽管在临床前研究方面取得了重大成果,但大多数已检测的抗炎药物的理想疗效尚未在临床实践中得到充分证明。在很大程度上,这可能与治疗分子递送到血管炎症部位的效率低下有关,这是由于它们的非特异性分布和从循环中被快速消除造成的。即使是炎症血管内局部吸收的药物,由于扩散不受控制,滞留时间也很短。近年来,基于纳米粒的靶向治疗被认为是一种很有前景的策略,可以特异性地递送不同的治疗和成像药物,用于检测或治疗血管炎症。尤其广泛的纳米粒已被设计作为靶向载体治疗动脉粥样硬化、心肌梗死、心力衰竭、缺血再灌注损伤、严重的肢体缺血、再狭窄、腹主动脉瘤和缺血性卒中。在这些例子当中,聚合脂质纳米粒、脂质体、重组高密度脂蛋白、来源于细胞的囊泡、无机纳米粒和金属纳米粒以及混合纳米粒被用于递送治疗药物,从小分子药物、多肽/蛋白质到核酸,治疗与血管炎症相关的心血管疾病。除了通过受损的内皮细胞层或EPR效应被动靶向到血管病变部位,纳米粒还可通过调节它们的物理性质（如几何结构和顺应性）,分子基团的修饰或特殊细胞膜的功能化,使血管靶向效率得到进一步提高。另一方面,可以根据血管炎症部位异常变化的生物化学信号,设计合成纳米粒的组成成份,有针对性地释放药物载荷。然而,这些血管靶向纳米治疗的转化仍然具有很大的挑战性。虽然直接调控抗原特异性亲和力可以增强纳米粒在血管的聚集,但仅用分子基团修饰后,纳米粒的靶向效率仍然非常有限。对于以细胞膜为基础的仿生策略衍生的纳米药物治疗,其相对复杂的配方流程和不明确的成分可能会妨碍其后续的大规模生产和临床研究。此外,需要进一步改进对感兴趣的血管病变部位的不可控的释放。越来越多的证据表明,双重或多重刺激响应性纳米粒能够在其作用的部位更精准地控制负载药物的释放,大大提高了药物的递送效率。在这方面,对多种生物化学信号或生物化学/物理信号敏感的纳米粒已被广泛用于肿瘤、糖尿病、炎症等多种疾病的靶向治疗。然而,基于这些响应性纳米粒治疗的临床转化并不简单,在很大程度上主要是由于更复杂的药物研发,尤其是在可重复性和质量控制方面。此外,针对目前大多数靶向血管的响应性纳米载体,体内安全性是另外一个重要的问题,尤其对于慢性疾病的治疗,因为大多数静脉注射纳米粒被单核吞噬细胞系统清除并聚集于肝脏和脾脏等器官。因此,亟待开发能够响应与血管炎症相关的生物化学信号,具有理想的靶向能力和良好的药物控释性能且更为有效和安全的纳米药物递送平台。通过对环糊精的化学功能化,最近开发了一系列在酸性和氧化应激条件下具有高度可调控水解行为的响应性材料。体外细胞培养和不同动物模型的在体实验研究结果证明,基于这些载体材料构建的纳米粒对低pH值和高ROS刺激具有较好的响应性及良好的生物安全性。鉴于血管内皮损伤后局部存在炎症微酸性环境和增高的氧化应激,通过整合优化活性氧和pH响应性的环糊精材料的比例,构建活性氧和pH双响应性纳米粒,可以作为一种新型有效和安全的纳米平台,用于血管炎症部位的药物递送。此外,结合分子靶向策略还可以进一步增强血管的靶向性和体内双响应性纳米粒治疗的有效性。本研究课题基于前期合成的pH响应性和活性氧（ROS）响应性的载体材料,以雷帕霉素为模型药物,构建了pH和ROS双响应的纳米药物递送系统,在大鼠颈动脉球囊损伤的血管炎症模型中,通过与非响应性、pH或ROS单一响应性纳米粒治疗比较,考察和评价了pH和ROS双响应性纳米粒的治疗优势以及双响应性主动靶向载药纳米粒在体防治血管再狭窄的效果。研究内容:1.基于β-CD的载体材料的合成1.1 pH响应性β-环糊精材料（ACD）的合成先将1 g β-CD 溶解在8 mL无水DMSO中,然后加入4 mL的2-甲氧基丙烯（MP）,磁力搅拌溶解并与有机试剂充分混匀,最后加入16 mg的吡啶对甲苯磺酸盐（PTS）。室温条件下反应3 h,然后加入0.3 mL三乙胺终止反应。得到的产物加超纯水沉淀,离心,洗涤3次冻干得到白色粉末。1.2 活性氧响应性β-环糊精材料（OCD）的合成将5.55 g 4-PBAP加入到36 mL无水二氯甲烷（DCM）中充分溶解,然后加入7.65 g 1,1’-羰基二咪唑（CDI）。室温条件下磁力搅拌反应0.5 h,再加入40 mL DCM,用30 mL超纯水洗涤三次。再用饱和NaCL洗涤有机相,无水Na2SO4干燥,真空浓缩得到 CDI 活化的 PBAP（CDI-PBAP）。随后,将 250 mg β-CD 和 1.52 g CDI-PBAP 加入至20 mL无水二甲基亚砜中,再加入800 mg DMAP反应过夜。最后,加入超纯水沉淀、离心收集,洗涤三次后冻干得到白色粉末。采用FT-IR和1H NMR对合成的上述两种响应性载体材料进行表征。2.不同纳米粒的制备采用纳米沉淀/自组装法制备基于不同材料的载RAP纳米粒。具体过程如下:精确称取 50 mg PLGA,ACD,OCD或ACD/OCD以不同的质量比混合（80:20、60:40、50:50、40:60、20:80）的载体材料和10 mg RAP共同溶于2 mL有机溶剂中,得到有机相。对于PLGA和ACD纳米粒,使用乙腈;OCD纳米粒,使用无水甲醇;ACD/OCD采用1:1（v/v）无水甲醇和乙腈混合溶剂制备有机相。另将0.6 mL卵磷脂无水乙醇溶液（10mg/mL）和9 mg DSPE-PEG2000溶解在10 mL的去离子水中,油浴加热至65℃ 1 h。然后,将有机相缓慢加入至上述的预热溶液中,磁力搅拌2 h。最后获得的纳米粒溶液用去离子水透析24 h,冻干后即得到不同的载RAP纳米粒（RAP/ACD NP,RAP/AOCD NP,RAP/OCD NP及RAP/PLGA NP）。空白纳米粒,Cy5或Cy7.5荧光标记的纳米粒均通过类似的方法制备获得3.不同纳米粒的表征不同NPs在水溶液中的粒径及粒径分布,Zeta电位通过马尔文粒径仪检测。取新鲜制备的纳米混悬液,滴加到载膜铜网上,室温晾干后透射电子显微镜下观察纳米粒子形态并拍照采集图像。同样将制备好的纳米粒混悬液滴加至云母片,喷金晾干后采用透射电子显微镜观察纳米粒形态并拍照采集图像。载RAP纳米粒在加入适量无水甲醇和乙腈混合溶液后离心,取上清通过高效液相色谱法（HPLC）检测RAP载药量。此外,Cy5或Cy7.5的含量通过荧光光谱仪测定。4.不同空白纳米粒体外水解实验将不同的纳米粒分别分散于pH 5、pH 6、pH 7.4以及加入1 mM H202 0.01 M的PBS缓冲液中。37℃孵育不同时间后,于设定时间点采集样品测定纳米粒溶液在500 nm波长处的透光率。最后,根据透光率计算纳米粒的水解百分比。5.载雷帕霉素纳米粒的体外药物释放实验将新鲜制备冻干的pH/ROS双响应性载RAP纳米粒5 mg分别分散在8 mL不同pH值（pH 5、pH 6、pH 7.4）以及加入 1 mM H2O2 0.01 M 的 PBS 缓冲液中,置于37℃孵箱内震荡混匀。在既定的不同时间点,将含有纳米粒的溶液以19118 g离心,取适量上清液并补充等量相同介质。HPLC检测RAP药物浓度,绘制纳米粒的药物累积释放曲线。单一响应性载药纳米粒RAP/ACD NP和RAP/OCD NP仍用相同的方法检测其不同时间点的累积药物释放量,绘制相应药物释放曲线。6.纳米粒的细胞吞噬实验将鼠主动脉血管平滑肌细胞株（MOVAS）以2×105个/孔的密度接种于12孔板中,孵育24小时后,去除培养基并加入相同浓度的Cy5荧光标记的不同纳米粒,在37℃条件下与平滑肌细胞孵育不同的时间。观察前,用溶酶体探针LysoTracker Green染色标记晚期核内体和溶酶体,DAPI染色细胞核。采用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察并采集荧光图像。同样,在平滑肌细胞孵育24小时后,加入不同浓度梯度的Cy5标记基于不同载体制备的纳米粒与细胞共同孵育6小时后,考察细胞对纳米粒的剂量依赖性吞噬。另外,通过流式细胞术定量细胞对Cy5标记的不同纳米粒的吞噬,荧光活化细胞分选（FACS）测定荧光强度。考察孵育时间及纳米粒剂量对血管平滑肌细胞吞噬行为的影响。7.不同载雷帕霉素纳米粒体外抑制rVSMCs增殖和迁移的作用研究MOVAS细胞以5000个/孔的密度接种于96孔板,37℃孵箱培养24 h后,改为含有0.5%FBS的新鲜DMEM培养基,同时加入血小板源生长因子PDGF-BB（20 ng/mL）及RAP终浓度为1 μM的不同载RAP纳米药物（RAP,RAP/PLGA NP,RAP/ACD NP,RAP/OCD NP及RAP/AOCD NP）。正常对照组加入培养基,阳性对照组仅加入PDGF-BB,继续培养24h后,用CCK-8法检测细胞活性。采用8 μm孔径的Transwell小室评价载不同RAP纳米粒对PDGF-BB诱导的大鼠VSMCs迁移的影响。将MOVAS细胞以2×105个/孔的密度接种于12孔板中。37℃卵孵箱培养24 h后,改为含有0.5%FBS的新鲜DMEM培养基,同时加入血小板源生长因子PDGF-BB（20 ng/mL）及RAP终浓度为1 μM的不同载RAP纳米药物（RAP,RAP/PLGA NP,RAP/ACD NP,RAP/OCD NP 及 RAP/AOCD NP）与平滑肌细胞共同孵育。阳性对照组加入PDGF-BB,而正常对照组不加PDGF-BB和游离的雷帕霉素。6 h后,胰酶消化收集细胞,200μL培养基重悬,将不同治疗组的细胞分别加至Transwell上室,下室则加入600 μL含0.5%FBS和20 ng/mL PDGF-BB的培养基。孵箱内静置8 h后,用棉签轻轻擦去Transwell膜上方未迁移的细胞。4%多聚甲醛固定细胞,0.1%结晶紫染色。最后光学显微镜下观察拍照,随机选取5个视野计数染色细胞的数量并进行统计学分析。8.细胞周期检测MOVAS细胞以5×105个/孔的密度接种于6孔板,37℃孵箱培养24 h后,改为含有0.5%FBS的新鲜DMEM培养基,同时加入血小板源生长因子PDGF-BB及RAP终浓度为1 μM的不同载RAP纳米药物（RAP,RAP/PLGA NP,RAP/ACD NP,RAP/OCD NP及RAP/AOCD NP）。正常对照组加入培养基,阳性对照组加入PDGF-BB。细胞与不同载药纳米粒共同孵育24 h后,胰酶消化并收集细胞,70%乙醇固定,4℃孵育过夜。通过洗涤后,将不同载药纳米粒干预的细胞与RNase在37℃条件下孵育30分钟,然后用碘化丙啶在4℃避光条件下进行细胞染色30分钟。最后通过流式细胞术检测平滑肌细胞在G1、S、G2/M期的比例并进行统计分析。9.免疫印迹分析将MOVAS细胞分别与不同载RAP纳米粒共同孵育24 h后,胰酶消化细胞,加入细胞裂解液,使细胞完全裂解,然后4℃条件下,12000 g离心30 min,收集上清,用BCA试剂盒测定蛋白浓度,进一步通过Western blotting检测细胞周期相关蛋白的表达水平。将含有50 μg蛋白的样本在10%十二烷基磺酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶上分离,电泳转移到硝酸纤维素膜上。5%脱脂牛奶封闭,在4℃条件下,将膜与一抗体孵育过夜:（1）Cyclin D1 抗体,稀释1:200;（2）p27kip1抗体,稀释1:250;（3）β-actin抗体,稀释1:1000。然后在37℃条件下,将膜与辣根过氧化物酶标记的二抗共同孵育1 h,二抗稀释倍数为1:1500。洗涤三次后,通过增强型化学发光试剂盒荧光成像显示特异性条带,同时进行半定量分析。10.不同纳米粒的细胞毒性实验研究将MOVAS细胞以10000个/孔的密度接种于96孔板,培养24 h后,加入不同浓度梯度的空白纳米粒（PLGA NP,ACD NP,OCD NP及AOCD NP）,共同孵育24 h后,CCK-8法检测细胞的活性。11.SD大鼠颈动脉球囊损伤再狭窄模型的建立雄性SD大鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉起效后,颈部脱毛备皮,消毒,行颈前部正中切口,钝性分离皮下软组织及颈前肌肉组织,暴露颈动脉分叉,游离左侧颈总动脉及颈内、颈外动脉,将2F Fogarty取栓球囊导管由颈外动脉切口插入至颈总动脉近心端,PTCA压力泵以适当压力充盈球囊,旋转并回撤球囊至颈外动脉,重复三次,完全剥脱颈总动脉血管内皮。然后,尾静脉注射伊文思蓝评价血管内皮损伤情况。12.颈动脉损伤部位酸性炎症微环境和氧化应激水平的考察与评价采用细胞内pH荧光探针BCECF-AM对颈动脉损伤部位组织的pH值变化进行定性评价。在颈动脉球囊损伤模型建立后,于不同时间点取材损伤的颈动脉组织,O.C.T.包埋后,冰冻组织切片（8 pm）。然后,用10 μM ROS荧光探针DCFDA或5μM超氧阴离子荧光探针DHE分别对组织切片进行染色,检测球囊损伤局部组织ROS及超氧阴离子水平。另外,采用相应诊断试剂盒分别对损伤局部组织过氧化氢（H202）水平和超氧化物歧化酶（SOD）活性进行检测。ELISA试剂盒分别检测丙二醛（MDA）和髓过氧化物酶（MPO）的表达水平。同样,典型促炎细胞因子α-肿瘤坏死因子（TNF-α）和白细胞介素1 β（IL-1 β）的表达水平也通过ELISA试剂盒分别检测。13.靶向Ⅳ型胶原的双响应性载RAP纳米粒的构建将靶向血管内皮下Ⅳ型胶原的多肽（KLWVLPKGGGC-Am）溶解在含有5 mmol/L EDTA的中性PBS缓冲液中,以二硫键/TCEP摩尔比1:1的比例,加入适量的TCEP断键溶液还原。然后,将多肽和DSPE-PEG-MAL以5:4的摩尔比,在4%乙醇溶液中,室温条件下磁力搅拌反应4h,合成KLWVLPKGGGC-DSPE-PEG三嵌段共聚物,未结合的游离肽通过透析去除。最后,将载体材料OCD/ACD以80:20质量比,DSPE-PEG-peptide/DSPE-PEG以1:9摩尔比混合,采用纳米沉淀自组装的方法,制备靶向IV型胶原的双响应性载RAP纳米粒。14.靶向纳米粒体外胶原结合实验的研究将Ⅳ型胶原溶解在0.25%醋酸中,配制浓度为0.5 mg/mL的胶原溶液。将100μL胶原溶液加入到96孔板中,4℃条件下孵育过夜。在胶原涂层或没有胶原涂层的孔板中先用50%血清封闭1 h后,再加入100μL用25%牛血清配制的Cy7.5荧光标记的双响应性靶向纳米粒（Cy7.5/TAOCD NP）,纳米粒浓度（0.2 mg/ml）。孵育1 h后,用包含0.05%吐温20的PBS缓冲液洗板3次。最后,通过IVIS光谱系统观察并拍摄孔板荧光图像。15.纳米粒体内靶向血管内皮损伤部位的研究大鼠颈动脉球囊损伤模型建立后,即刻经尾静脉分别注射Cy7.5荧光标记的不同纳米粒（Cy7.5/PLGA NP,Cy7.5/ACD NP,Cy7.5/OCD NP 及 Cy7.5/AOCD NP）,在体循环8 h后,取材完整的颈动脉及主要脏器,进行小动物活体荧光成像（IVIS）观察纳米粒在血管内皮损伤部位的荧光强度及组织分布情况并进行定量分析。另外,在颈动脉球囊损伤后,经尾静脉注射Cy7.5荧光标记的双响应性纳米粒（Cy7.5/AOCD NP）,在预设不同观察时间点取材损伤的颈动脉组织,离体成像观察和定量分析荧光强度,评价纳米粒的靶向和滞留时间变化情况。16.靶向纳米颗粒与损伤颈动脉的特异性结合的评价在大鼠颈动脉球囊损伤模型建立后,即刻经尾静脉注射Cy5荧光标记的靶向纳米粒（Cy5/TAOCD NP,25 μg/kg）。在体循环0.5 h后,给予安乐死,取材颈动脉组织,Tissue-Tek O.C.T.包埋,冰冻组织切片（5μm）,FITC标记的抗体染色血管内皮下IV型胶原,DAPI染核后,盖玻片封片,通过CLSM观察颈动脉组织荧光分布及靶向纳米粒与胶原共定位情况。17.不同载雷帕霉素纳米粒对SD大鼠颈动脉球囊损伤的疗效评价将30只雄性SD大鼠随机分为6组（n=5）,包括假手术组（正常组）、生理盐水治疗组（模型组）,以及RAP/PLGA纳米粒组、RAP/ACD纳米粒组、RAP/OCD纳米粒组及RAP/AOCD纳米粒组。除假手术组外,其余各组大鼠均按上述方法实施颈动脉球囊损伤。在颈动脉球囊血管成形术后,分别于术后即刻（0d）,4 d,8 d,12 d尾静脉注射RAP终浓度为1 mg/kg的不同载RAP纳米粒。在另一项单独设计的实验研究中,RAP/AOCD纳米粒或RAP/TAOCD纳米粒在大鼠颈动脉球囊损伤后即刻（0 d）,5 d,10 d分别以终浓度1 mg/kg的RAP经尾静脉注射给药。在血管成形术后第14 d,给予大鼠安乐死。原位灌注后取材损伤的颈动脉段及主要脏器,进行组织学和免疫组化研究,考察相关标志物表达水平。18.双响应性纳米粒的急性毒性和载雷帕霉素纳米药物治疗对SD大鼠的长期毒性评价实验12只雄性SD大鼠（180-250g）随机分为4组（n=3）。在AOCD纳米粒组,尾静脉注射不同剂量（250、500或1000 mg/kg）AOCD纳米粒。正常对照组给予尾静脉注射生理盐水。仔细观察各组动物的相关毒性症状和行为活动状况。在规定的时间点称量检测体重变化。在给药后第14 d,给予大鼠实施安乐死,即刻采集血样进行血液学和生化相关指标分析。收集主要脏器并称重,分析计算脏器指数（每只大鼠的器官重量与体重之比）,同时制作组织切片H&E染色观察其病理变化。健康雄性SD大鼠16只,体重（180-250 g）随机分为4组（n=4）。空白纳米粒组按11.5 mg/kg AOCD NP治疗（相当于RAP纳米粒的治疗剂量1 mg/kg）,另外两组分别按1 mg/kg RAP/AOCD NP或 3 mg/kg RAP/AOCD NP,尾静脉注射,每周 2 次,连续 12周。正常对照组大鼠则给予静脉注射生理盐水。治疗期间,每天动态观察各组动物死亡率、外貌、全身状况和行为异常等情况。每周记录食物和水的消耗以及体重变化情况。第12周,给予安乐死。采集血液样本,化验分析具有代表性的血液学和生化指标。取主要脏器包括心、肝、脾、肺、肾并称重计算脏器指数。同时制备组织学切片,H&E染色观察病理变化。另外,用抗CD3抗体和抗CD19抗体对脾脏组织切片进行免疫组化染色,评价长期载RAP纳米药物对SD鼠免疫功能的影响。19.双响应性载雷帕霉素纳米粒长期治疗后小鼠脾脏T、B淋巴细胞的定量研究实验将24只雄性C57BL/6J小鼠（18-22 g）随机分为4组（n=6）。正常对照组给予生理盐水,空白纳米粒组按11.5 mg/kg（相当于载RAP纳米粒治疗剂量1 mg/kg）剂量尾静脉注射AOCD NP。另外两组小鼠分别给予RAP/AOCD NP,1 mg/kg或3 mg/kg,尾静脉注射,每周2次,连续给药12周。在治疗期间,观察小鼠的一般身体状况的任何变化,包括外貌,摄食、饮水,行为活动及死亡率等。第12周,对小鼠实施安乐死。取脾脏并将分离的脾脏组切成小块,加入无菌PBS缓冲液,对组织进行彻底研磨,然后在淋巴细胞分离培养基中离心收集细胞。将FITC标记的抗CD3抗体及PE标记的抗CD19抗体在4℃条件下,与脾脏组织提取的淋巴细胞共同避光孵育30 min后,用流式细胞染色缓冲液洗涤细胞2次,PBS缓冲液重悬细胞。最后,采用流式细胞仪对脾脏组织中T细胞和B细胞的百分率进行定量分析,评价RAP/AOCD NP治疗对适应性免疫系统的影响。研究结果:1.pH和ROS双响应性纳米粒的制备基于β-环糊精（β-CD）,通过单步缩醛化反应合成pH响应性的载体材料（ACD）,傅里叶红外光谱和核磁共振氢谱检测证实ACD被成功合成。根据ACD 1H NMR谱计算,环缩醛与线性缩醛的摩尔比约为0.62,缩醛化度约为90%。此外,（OCD）通过在β-CD分子上将氧化敏感性苯硼酸酯单元4-PBAP以羰基键合的方式引入β-CD合成ROS响应性载体材料,1H NMR谱证实,每个β-CD分子大约有7个PBAP单元。采用改良的纳米沉淀/自组装法制备基于上述两种不同响应性的载体材料的双响应性纳米粒,将ACD和OCD以不同重量配比,构建了 pH/ROS双响应性纳米粒。基于ACD/OCD的不同纳米粒,在质量比为 100:0、80:20、60:40、50:50、40:60、20:80、0:100 时,分别命名为 ACD NP、AOCD8020 NP、AOCD6040 NP、AOCD5050 NP、AOCD4060 NP、AOCD2080 NP和OCD NP。透射电镜（TEM）观察,在不考虑组成分差异的情况下,所制备的纳米粒均为球形,形态规则,粒径均一。马尔文粒径电位检测显示所有制备的纳米粒Zeta-potential均为负值,平均流体力学粒径变化范围从121±2到186±4 nm。不同纳米粒的粒径分布相对较窄。提示ACD与OCD载体材料具有良好的混合相容性。2.不同双响应性纳米粒的体外水解特性基于载体材料ACD和OCD构建的pH/ROS双响应纳米粒的体外水解,在含有1mM H2O2及不同pH值的PBS缓冲液中进行。对于ACD NP,在pH 5或pH 6的微酸性条件下均表现出明显的快速水解,而H2O2的存在对其水解几乎无任何影响,具有良好的响应低pH的特性。相对于ACD NP,OCD NP的水解则与pH无关,在H202存在的条件下,OCD NP水解迅速。相比在不同的pH值,OCD NP在pH值为5、6或7.4时均表现出类似的水解特性。基于载体材料ACD和OCD构建的双响应性纳米粒,它们的水解行为依赖于pH和H202,通过在含有1 mM H2O2及不同pH条件的PBS缓冲液中,比较基于不同比例ACD和OCD载体材料制备的双响应性纳米粒水解试验的结果,提示基于ACD/OCD的纳米粒具有pH和ROS双重响应的能力。AOCD2080 NP和AOCD8020 NP在1 mM H2O2和pH 5、6或7.4环境中,表现出更为理想的双响应的特性。此外,在H202存在的情况下,AOCD2080 NP在不同pH值条件下表现出较好的水解行为,因此,AOCD2080纳米粒进一步被用于后续的课题研究。采用基于ACD和OCD的复合材料,成功地构建了 pH/ROS双响应性纳米药物递送平台。值得注意的是,通过改变ACD/OCD的质量比,可以很容易地调控制备得到的纳米载体的精确的水解敏感性。3.pH和ROS双响应性载药纳米粒的制备和表征通过不同响应性空白纳米粒制备响应的载RAP纳米粒。同时,利用PLGA制备了非响应性载药纳米粒作为对照。与相应的空白纳米粒相似,四种载药纳米粒Zeta-potential均为负值,平均流体力学粒径变化范围从121±2到179±6 nm。RAP/PLGA纳米粒、RAP/ACD纳米粒、RAP/OCD纳米粒、RAP/AOCD纳米粒的载药量分别为4.5±0.4%、9.4±0.2%、8.2±0.1%、8.7±0.4%。通过体外药物释放实验研究检测了不同纳米药物的响应性释放行为。对于RAP/AOCD NP,与中性（pH=7.4）PBS缓冲液相比,RAP的释放在微酸性（pH=5或pH=6）PBS缓冲液中明显加快。同时,无论在上述三种不同pH值的PBS缓冲液中,在1mM H2O2存在的条件下都显着增加了载药纳米粒的药物释放速度。因此,RAP/AOCD NP表现出理想的pH/ROS双响应的释药能力,这与相应的空白纳米粒AOCD2080 NP的双响应性水解特性相吻合。另外,单一响应性载药纳米粒RAP/ACD NP和RAP/OCD NP药物释放也同样符合相应纳米载体的水解性能。通过利用基于pH响应性和ROS响应性材料设计的纳米复合材料可以简单、成功地构建出pH/ROS双响应性载RAP纳米粒。4.体外rVSMCs对双响应纳米粒的摄取Cy5标记的双响应性纳米粒（Cy5/AOCD NP）与VSMCs孵育1 h后,VSMCs中的荧光信号随着Cy5/AOCD纳米粒的剂量的增加而明显增强,提示细胞对纳米粒的内吞呈现剂量依赖性的特点。与激光共聚焦显微镜观察结果一致,流式细胞术荧光激活细胞分选（FACS）定量进一步证实了 VSMCs对Cy5/AOCD NP的有效细胞摄取呈剂量依赖的方式。在相同剂量的Cy5/AOCD NP下,随着孵育时间的延长,Cy5荧光在VSMCs中的分布也随之增加。而且,通过溶酶体探针Lysotracker对晚期核内体和溶酶体进行染色,发现血管平滑肌中内吞Cy5/AOCD NP从核内体/溶酶体转运到细胞质中（核内体/溶酶体逃逸现象）。同样,FACS的分析表明,随着孵育时间的增加,VSMCs内吞Cy5/AOCDNP的作用增强。这些结果充分表明,大鼠VSMCs可以有效地内吞基于ACD和OCD材料构建的pH/ROS双响应性纳米粒。在酸性和氧化应激微环境的亚细胞细胞器中,与pH响应性或ROS响应性的纳米粒相比,双响应性纳米粒能够更快地释放负载的药物分子。5.双响应性载药纳米粒的体外生物学效应不同响应性纳米粒的细胞毒性均较PLGA纳米粒低。载雷帕霉素纳米粒在相对低剂量下具有较低的细胞毒性。经RAP原料药和不同的RAP纳米粒治疗24小时,可显着抑制VSMCs的迁移。值得注意的是,与游离RAP相比,所有载药纳米粒都显示出明显更强的抑制VSMCs迁移效果。此外,响应性载药纳米粒对VSMCs迁移的抑制作用比非响应性载药纳米粒（RAP/PLGA NP）更为显着。值得注意的是,双响应性纳米药物治疗（RAP/AOCD NP）的抑制血管平滑肌细胞增殖的效果最好,与单一响应性纳米粒治疗相比差异显着。而且,不同载药纳米粒治疗对细胞周期的影响的实验表明,载RAP纳米粒主要通过抑制细胞G1/S的转化从而抑制VSMCs的增殖。载RAP纳米粒使细胞周期停滞在G1期的机制研究表明,双响应性载RAP纳米粒抑制VSMCs增殖通过上调p27Kip1和下调cyclin D1表达使细胞停滞于G1期。6.双响应性载RAP纳米粒在体靶向治疗血管再狭窄以大鼠颈动脉球囊损伤为模型,建立大鼠血管炎症性疾病模型,并通过Evan’s蓝染色证实明显的内皮剥脱损伤。pH敏感性荧光探针检测颈动脉损伤局部pH值的变化显示:正常动脉显示明显的绿色荧光,而球囊损伤后第1、7、14天分离的动脉组织荧光信号明显较弱,表明损伤动脉中存在相对酸性的微环境。用DHE和DCFHDA荧光探针对大鼠颈动脉冰冻组织切片进行染色,与正常动脉相比,球囊损伤后第1天颈动脉荧光强度轻度升高。而在损伤后第7天和第14天,可以观察到明显的增强荧光。这些结果证实动脉损伤部位存在氧化应激,很大程度与炎症的进展有关。双响应性纳米粒对损伤颈动脉的靶向性研究表明,纳米粒对内皮损伤的颈动脉具有靶向性,定量分析显示,非响应性纳米粒和响应性纳米粒治疗组间差异并无统计学意义。载RAP纳米粒给血管再狭窄治疗带来不同程度的获益,颈动脉管腔面积显着增加,而内膜面积和增殖指数明显减少,中膜面积无明显变化。在各组载RAP纳米粒的治疗中,双响应性载药纳米粒疗效最佳。在不同的载RAP纳米粒治疗后,免疫组织化显示:总α-SMA阳性细胞数量明显减少。此外,所有纳米药物治疗组的PCNA均显着降低,但以RAP/AOCD NP组的效果最好。MMP-2结果与PCNA相似。而且,在给予响应性载药纳米粒治疗的大鼠动脉中的8-OHdG表达显着降低。定量分析显示,在双响应性载药纳米粒治疗后,动脉组织中典型的氧化应激相关标志物,包括H202、MDA和MPO的水平显着降低。另一方面,损伤颈动脉SOD活性明显降低,经RAP/AOCD NP治疗后,SOD活性得到有效恢复。同时,与模型组相比,组织损伤部位的促炎细胞因子包括肿瘤坏死因子（TNF-α）和白介素（IL）1 β的表达水平在RAP/AOCD NP治疗后也发生了显着降低。7.pH和ROS双响应性靶向Ⅳ型胶原的载药纳米粒的制备与表征通过巯基-马来酰亚胺键合,将多肽KLWVLPKGGGC与DSPE-PEG结合。通过类似改良的纳米沉淀法/自组装法成功构建了靶向Ⅳ型胶原、p H-/RO S-双响应性纳米粒（TAOCDNP）。经TEM和SEM检测,TAOCDNP呈球形,具有较窄的粒径分布。平均流体力学直径131 nm,Zeta电位-27.2±0.3 mV。雷帕霉素可以包载到TAOCD NP中,形成一种靶向、双响应性载药纳米粒（RAP/TAOCD NP）,球形结构、粒径分布窄,能够有效负载雷帕霉素。8.TAOCD NP的体内外靶向能力评价与非靶向NPs（AOCD NP）相似。共聚焦显微镜观察和流式细胞术定量分析均显示VSMCs对Cy5/TAOCD NP的吞噬呈剂量依赖性和时间依赖性方式。这些结果证实了靶向肽的加入对AOCD NP的细胞摄取行为没有显着影响。Cy7.5/TAOCD NP在体外对ⅣV型胶原的粘附表明,引入到TAOCD NP上的靶向肽维持了其对ⅣV型胶原的特异性结合能力。TAOCD NP在体靶向能力表明,Cy7.5/TAOCD NP组在血管内皮损伤部位的荧光强度明显高于Cy7.5/AOCD NP组。动脉组织切片的显微镜观察也显示Cy5/TAOCD NP有相对较强的荧光。大鼠颈动脉冰冻组织切片Ⅳ型胶原抗体免疫荧光染色显示损伤动脉中Ⅳ型胶原（绿色荧光）与红色Cy5荧光共定位,而正常动脉中未见Cy5荧光。总之,这些结果证明,经靶向Ⅳ型胶原多肽修饰可显着增强pH和ROS双响应性纳米载体对损伤颈动脉的被动靶向聚集。9.双响应性载RAP靶向纳米粒靶向治疗血管再狭窄颈动脉H&E染色显示,RAP/AOCD NP或RAP/TAOCD NP治疗均能明显抑制血管新生内膜增生。与RAP/AOCD NP治疗组相比,RAP/TAOCD NP组在增加管腔面积、减少内膜面积及降低增殖指数方面均有显着差异。同样,免疫组化分析显示,与RAP/AOCD NP相比,RAP/TAOCD NP能更有效抑制VSMCs在血管内膜的增殖,显着降低了 MMP-2和8-OHdG的表达。这些结果表明,pH-/ROS-双响应性纳米药物治疗的体内防治血管再狭窄效果可以通过靶向单元修饰进一步增强。10.安全性评价将不同浓度的AOCD NP与红细胞孵育2 h,即使在浓度为2 mg/mL时,直接观察和定量分析均未见溶血。体内急性毒性试验显示,所有AOCD NP组均正常摄食和饮水,无异常行为。所有AOCD NP治疗大鼠的脏器指数（主要脏器）均与生理盐水组相当。此外,AOCD NP组血常规及肝功能,生化等相关指标与生理盐水组比较,各组间差异无统计学意义此外,对主要脏器的病理组织切片H&E染色表明,AOCD NP治疗的大鼠没有明显的病理改变。另外,对双重响应性载药纳米粒（RAP/AOCD NP）也进行了体内安全性研究。生理盐水组与空白纳米粒（AOCDNP）组及RAP/AOCDNP组脏器指数无显着差异。同样,经AOCD NP或RAP/AOCD NP治疗的大鼠在血常规及肝肾功能相关的生物标志物方面与生理盐水组比较,各组间差异无统计学意义。主要脏器的H&E染色切片显示几乎没有损伤。此外,鉴于RAP的免疫抑制活性,长期应用双响应载RAP纳米粒对大鼠脾脏T、B淋巴细胞数量无明显影响。而且,对C57BL6J小鼠进行类似的纳米粒长期给药治疗后,流式细胞术检测小鼠脾脏中T细胞和B细胞的数量,结果显示在RAP/AOCD NP作用下,小鼠脾脏中T细胞和B细胞的数量并没有显着变化。这些结果提示,相对低剂量的RAP/AOCD NP治疗对适应性免疫系统没有显着的负面影响。总体而言,AOCDNP和RAP/AOCD NP均具有出良好的生物安全性。研究结论:1.通过联合基于β环糊精合成的pH响应性和ROS响应性材料,同时设计了一种简单和有效的方法成功构建了 pH和ROS双响应的纳米载体。2.通过优化pH响应性材料（ACD）和ROS响应性材料（OCD）的投料质量比,制备了最佳的pH和ROS响应能力的纳米粒。3.双响应性纳米粒AOCD NP能够有效地负载RAP,在低pH值或ROS较高的环境下,触发RAP/AOCD NP释放负载的RAP。RAP/AOCD NP可以通过被rVSMCs有效内吞并在亚细胞细胞器的敏感释放,增强药物分子在细胞内的递送。相比于游离RAP,非响应性和单响应性载RAP纳米粒,RAP/AOCD NP显着的抑制了血管平滑肌细胞的增殖和迁移。4.AOCD NP能够靶向聚集在大鼠颈动脉球囊损伤的部位,通过在动脉损伤部位被动靶向和触发释放RAP,与其他载药纳米粒比较,RAP/AOCD NP在大鼠中表现出更理想的抗再狭窄作用。5.通过靶向ⅣV型胶原多肽的修饰,进一步提高了AOCD NP的靶向能力,成功制备了 pH/ROS双响应的靶向纳米递送平台TAOCD NP。负载RAP的TAOCD NP比相比RAP/AOCD NP,更有效地抑制了大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜的形成。6.AOCD NP和RAP/AOCD NP均具有良好的生物安全性。本课题研究设计的pH/ROS双响应纳米载体和构建的纳米药物递送系统有望进一步用于治疗血管再狭窄和其他与血管炎症相关的心血管疾病。
车雪瑜[7]（2019）在《携RGDS载尿激酶靶向微泡造影剂的实验研究》文中提出目的:探究利用直接法制备携带精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸—丝氨酸（Arg-Gly-Asp-Ser,RGDS）肽段并且可以运载尿激酶（Urokinase,UK）的靶向微泡造影剂的可行性;检测靶向微泡造影剂的一般理化性质;探究影响靶向微泡造影剂携带率的可能因素。方法:（1）用荧光染料FITC对UK进行荧光标记,制成FITC-UK;用荧光染料5-TAMRA对RGDS进行荧光标记,制成5-TAMRA-RGDS。（2）通过直接法配置靶向微泡造影剂,并通过对靶向微泡造影剂外观的观察、PH测定、光学显微镜观察、粒径细胞仪测定等来检测靶向微泡造影剂的一般理化性质。（3）利用流式细胞仪检测荧光标记靶向微泡造影剂中RGDS及尿激酶的携带率,找出可能的相关影响因素。①成分比例及孵育时间的影响:根据成分比例分组,造影剂/尿激酶/RGDS分为A组（1:1:1）、B组（1:2:1）、C组（1:1:2）、D 组（2:1:1）、E 组（2:2:1）、F 组（2:1:2）、G 组（1:2:2）。将不同分组的溶液分别加入5ml试管中,待溶液充分混匀后室温下避光孵育。每个组分为三份。分别孵育0小时、孵育1小时、孵育2小时。用流式细胞仪检测不同组别各样本孵育Oh、孵育1h、孵育2h时UK携带率、RGDS携带率及UK和RGDS双携带率。②加药顺序的影响:实验按照不同的加药顺序分为A组（先加UK组）、B组（先加RGDS组）、对照组（同时加药组）。用流式细胞仪检测不同加药顺序的三组溶液UK携带率、RGDS携带率及UK、RGDS双携带率。③洗涤的影响:将孵育后的7组比例不同的靶向造影剂溶液用悬浮洗涤法洗涤后,用流式细胞仪检测7组不同比例靶向造影剂洗涤后UK携带率、RGDS携带率、UK及RGDS双携带率,并与洗涤前的携带率相比较。结果:（1）配置好的FITC-UK溶液呈鲜亮金黄色,5-TAMRA-RGDS溶液呈鲜亮的深玫红色。（2）携RGDS载尿激酶靶向微泡造影剂的一般理化性质:①肉眼观察配置完成的靶向微泡造影剂,为白色乳状混悬液,静止后可分两层。上层为白色、细腻,大小较均一的微泡,多聚集于试管壁周围。下层为透明略偏白色溶液。轻轻震荡,溶液立刻变为白色乳状混悬液。按声诺维、尿激酶及RGDS不同比例配制的7组靶向微泡造影剂外观均呈粉红色凝乳状,不透明,静置后容易分层,上层为白色、细腻、大小较均一凝乳状的微泡,下层为微浑、半透明的不同鲜亮程度的淡粉红色液体。②声诺维造影剂pH值为6.98。靶向微泡造影剂pH为7.3,中性溶液。③光学显微镜下见靶向微泡造影剂中微泡为中央透光的圆形结构,外有深色膜状壳包裹,分布较集中,大小较均一。④靶向微泡造影剂粒平均粒径大小1415nm,较声诺维造影剂平均粒径有所增大,但仍为纳米级。Zata电位-5.86mv,靶向微泡造影剂溶液带负电荷。⑤声诺维与FITC-UK及5-TAMRA-RGDS以不同比例配置,双荧光标记后的靶向造影剂在荧光显微镜下均能被激发出绿色荧光及红色荧光。（3）携RGDS载尿激酶靶向微泡造影剂携带率的影响因素:①7组不同比例配置的靶向微泡造影剂在不同孵育时间（Oh,1h,2h）所测得UK的携带率差异不具有统计学意义（F时间=2.362,P=0.210）;RGDS的携带率的差异不具有统计学意义（F时间=0.530,P=0.640）;UK及RGDS双携带率的差异不具有统计学意义（F时间=0.521,P=0.629）。不同成分比例声诺维、UK、RGDS混合制得的靶向微泡造影剂对应的UK的携带率的差异有统计学意义（F分组=11.533,P=0.000）、RGDS的携带率的差异有统计学意义（F分组=18.835,P=0.000）、UK及RGDS双携带率的差异有统计学意义（F分组=8.272,P=.001）。在声诺维:UK:RGDS混合比例为1:2:1时,UK的携带率最大。在声诺维:UK:RGDS混合比例为1:2:2时,RGDS的携带率最大。在声诺维:UK:RGDS混合比例为1:2:1时,UK及RGDS双携带率最大。②加药顺序的影响:不同加药顺序制备出的靶向微泡造影剂UK携带率的差异有统计学意义（F=26.861,P=0.00）;RGDS携带率的差异有统计学意义（F=17.392,P=0.00）;UK及RGDS双携带率的差异有统计学意义（F=31.240,P=0.00）。对照组UK的携带率高于A组及B组,B组UK的携带率高于A组,差异均具有统计学意义（P<0.05）。B组RGDS的携带率高于A组及对照组,差异均具有统计学意义（P<0.05）。对照组UK及RGDS双携带率高于A组及B组,B组UK及RGDS的双携带率高于A组。差异均有统计学意义（P<0.05）。同时加入UK及RGDS的加药顺序配制出的靶向造影剂的UK携带率、UK及RGDS的双携带率高于其他两种加药顺序配置出的靶向造影剂的UK携带率及双携带率。先加RGDS的加药顺序配制出的靶向造影剂的RGDS携带率高于其他两种加药顺序配置出的靶向造影剂的RGDS携带率。③洗涤对携带率的影响:7组不同比例声诺维、UK、RGDS配制的靶向造影剂在孵育2小时后用悬浮洗涤法洗涤,每组洗涤前后UK携带率、UK及RGDS双携带率的变化差异均有统计学意义（P<0.05）,各组洗涤后的UK携带率、UK及RGDS双携带率均低于洗涤前。B组洗涤前后RGDS携带率的差异有统计学意义（P<0.05）A组、C组、D组、E组、F组、G组洗涤前后RGDS携带率的差异不具有统计学意义（P>0.05）。结论:（1）直接法制备携RGDS载尿激酶靶向造影剂的方法可行。（2）声诺维、UK、RGDS三者的成分比例对UK携带率、RGDS的携带率、UK及RGDS双携带率有影响。本次实验最后结果是,在声诺维:UK:RGDE比例为1:2:1配置下的靶向造影剂UK携带率、UK及RGDS双携带率最高。在声诺维:UK:RGDS混合比例为1:2:2时,RGDS的携带率最高。（3）孵育时间对靶向造影剂UK携带率、RGDS的携带率、UK及RGDS的双携带率均无影响。（4）UK及RGDS添加顺序对靶向造影剂UK携带率、RGDS携带率、UK及RGDS双携带率有影响。本次实验结果为同时加入UK及RGDS的加药顺序配制出的靶向造影剂UK携带率、UK及RGDS双携带率高于其他两种加药顺序。先加RGDS的加药顺序配制出的靶向造影剂的RGDS携带率高于其他两种加药顺序。（5）洗涤对UK携带率、UK及RGDS双携带率有影响。洗涤后UK携带率、UK及RGDS双携带率均降低,间接表明了直接法制备的靶向造影剂的稳定性较差,当遇到水流等冲击,造影剂上所载药物容易脱落。
黄秋红[8]（2019）在《快速检测技术在石油废水重金属离子诱发慢性疾病中的应用研究》文中认为石油作为现代工业的“血液”,在工业生产、交通运输等各个方面起着重要作用。然而,随之而来的石油污染也不容忽视,其中石油废水中的重金属离子污染就是危害较大的一种。石油中的重金属离子随着废水排出散布于环境中,在动植物体内积聚,通过食物链进入人体,直接或者间接引发各种慢性疾病,危害人体健康。而慢性疾病具有初期不易被人察觉,后期不易治疗,治疗费用大的特点,因此慢性疾病的早期快速检查十分重要。所以,本文为防治石油废水中重金属离子污染引起的人类慢性疾病、为快速诊断和治疗重金属离子引起的慢性疾病,开展了石油废水中的重金属离子的快速检测研究,和重金属离子引起的慢性疾病新的医疗检测技术方法的研究。具体工作开展如下:首先,采用创新性实验合成了特异性识别重金属离子Pb2+和Cd2+的金属纳米簇,并将其与微流控芯片结合,利用荧光分析仪,研究了对石油废水中重金属离子Pb2+和Cd2+的高通量、快速、方便的检测。实验内容包括:采用“一步共混法”技术合成了作为Pb2+、Cd2+的可视化检测探针的谷胱甘肽金纳米簇（GSH-AuNCs）和半胱氨酸-谷胱甘肽金纳米簇（Cys-GSH-AuNCs）;同时,开发设计了高通量快速检测Pb2+、Cd2+的微流控检测芯片,以配合Pb2+、Cd2+的特异性、高灵敏度检测;最后,采用实地采集的石油废水对上述实验和设计研究进行了验证实验。实验结果显示GSH-AuNCs对Pb2+的检测范围在5μM-60μM,对Cd2+的检测范围在5μM-30μM。并实地采集石油废水对金属纳米簇进行性能验证微流控芯片设计合理,能实现对石油废水中重金属离子Pb2+、Cd2+的高通量快速检测。其次,针对石油废水中的Pb2+能直接或间接引发人体血管的血栓病变,研究利用超声造影剂对血栓的靶向病灶显影特性,开发一种新型检测血栓的医疗检测方法。实验组分选用具有良好生物相容性的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly（lactic-co-glycolic acid）,PLGA）为微球载体材料,包裹相变的液态氟碳,负载可以形成磁性靶向的超顺磁性氧化铁（γ-Fe2O3）和多位点结合的精氨酸（arginine,R）-甘氨酸（glycine,G）-天冬氨酸（aspatic acid,D）,RGD),采用双乳化法制备相变RGD-γ-Fe2O3-PLGA靶向超声微球,对制备的微球分别用扫描电子显微镜、透射电子显微镜进行形貌、粒径等表征,并进行聚焦超声显影检测实验、生物相容性和体外靶向检测实验的研究。实验结果显示:制备相变RGD-γ-Fe2O3-PLGA靶向超声微球的粒径约为396.7 nm,微球尺寸均匀、分散性好,有利于微球穿过血管进入靶向细胞;微球能够超声相变和热致相变,相变显影最优参数是在连续超声模式1.5 w 7 min时,或温度55℃水浴6 min时;细胞毒性检测（Cell Counting Kit-8,CCK-8）实验证明,微球具有良好的生物相容性;激光共聚焦显微镜证明微球细胞靶向效果满足检测要求。研究制备的相变RGD-γ-Fe2O3-PLGA靶向超声微球具有良好的造影效果和靶向血栓病灶的特性,具有实现对血栓的靶向病灶造影的潜力,为血栓的早期无创检测提供一个新的检测技术方法。最后,针对石油废水中的Cd2+致肾损伤形成慢性肾病,以肾脏疾病诊断重要判断信息尿沉渣的快速、准确的检测为目标,采用改进的自动染色系统和采用人工智能（AI）识别技术,开展全自动尿沉渣分析仪智能训练实验工作。实验结果证明,改进的全自动尿沉渣分析仪的细胞识别率、精确度都有明显的提高,尿沉渣细胞种类和形态能在一定程度上反映肾脏疾病的病理变化。综上所述,本论文针对石油废水中诱发慢性疾病的重金属离子,进行了主要重金属离子Pb2+和Cd2+的高通量、快速检测技术的应用研究;针对重金属Pb2+诱发的血栓性疾病的检测,进行了制备相变靶向超声微球快速检测的研究;针对重金属Cd2+诱发的肾脏疾病检测,进行了采用AI技术改进全自动尿沉渣分析仪快速检测的研究。这些快速检测技术的应用研究,不仅对石油废水中重金属离子诱发的慢性疾病的防治有重要意义,而且为慢性疾病的早期快速检测提供了新的思路和途径,并为其它重金属离子和慢性疾病的快速检测提供了实验及应用参考。研究成果具有十分良好的应用前景。
孙月[9]（2019）在《携IL-6和IL-8抗体靶向微泡在减轻兔心肌缺血/再灌注损伤中的作用》文中提出第一部分IL-6与IL-8在兔心肌缺血/再灌注损伤中的表达[目 的]探讨简单有效的兔心肌缺血/再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI）模型的制备方法,成功建立MIRI模型,并检测IL-6和IL-8在兔MIRI中的水平。[方 法]将168只日本大耳兔随机分为3组:缺血/再灌注组（I/R组）112只、假手术组（S组）28只、正常组（N组）28只,I/R组根据再灌注时间又分为4个亚组,分别为再灌注30 min组、再灌注60 min组、再灌注120 min组及再灌注180 min组。I/R组阻断冠状动脉左前降支30 min后解除阻断使其再灌注,S组同一部位只穿线不阻断。术前及术后对各组兔行心电图和超声心动图检查,ELISA检测血清中IL-6和IL-8的水平。从每组中抽取4只兔处死,取心肌组织,行HE染色和扫描电镜（scanning electron microscopy,SEM）病理组织学检查。[结 果]1.心电图 缺血30 min时ST段呈弓背向上抬高,再灌注30 min内ST段未见明显下降,再灌注45 min时ST段略有下降,再灌注60 min时ST段明显下降至等电位线,再灌注120min及再灌注180 min时ST段降至等电位线,心电图基本接近正常。2.超声心动图 缺血30 min和再灌注30 min左室前壁造模节段出现室壁运动异常,室壁增厚率明显减低,再灌注60 min后,缺血区室壁运动及室壁增厚率恢复正常。3.ELISA I/R各组血清中IL-6和IL-8的水平明显高于S组及N组,差异均有统计学意义（均P<0.05）。I/R各组随着再灌注时间的延长,血清中IL-6和IL-8的水平逐渐增高,IL-6的水平于再灌注180 min达高峰,差异均有统计学意义（均P=0.000）;IL-8的水平于再灌注120min和再灌注180 min达高峰,差异均有统计学意义（P=0.000）,再灌注120 min与再灌注180 min差异无统计学意义（P=0.336）。S组与N组间差异均无统计学意义（均P>0.05）。4.病理组织学检查 HE染色及SEM均显示I/R组有心肌损伤的病理表现,随着再灌注时间的延长,损伤程度逐渐加重。再灌注120min和再灌注180 min时损伤最重,且损伤程度相近。[结 论]通过阻断兔冠状动脉左前降支30 min后解除阻断可成功制备MIRI模型。缺血/再灌注可导致兔心肌组织受损及血清中IL-6和IL-8的水平升高,为本课题组对MIRI的进一步研究奠定基础。第二部分携IL-6和IL-8抗体靶向微泡评价兔心肌缺血/再灌注损伤[目 的]制备携IL-6和IL-8单抗及双抗靶向微泡,应用靶向心肌声学造影（myocardial contrast echocardiography,MCE）评价兔 MIRI。[方 法]沿用第一部分剩余的144只动物模型,在此分组基础上,又随机平均分为四个亚组:裸微泡组（MBc）、携IL-6单克隆抗体微泡组（MBIL6）、携IL-8单克隆抗体微泡组（MBIL-8）和携IL-6与IL-8双抗体微泡组（MBd）,每组36只。流式细胞仪通过检测不同剂量抗体与微泡的结合率,得出最佳配伍比,按此配伍比,应用“生物素-亲和素”桥接法,将生物素化的IL-6和IL-8单克隆抗体分别及共同偶联到Targestar-SA微泡上,构建携IL-6和IL-8单抗及双抗靶向微泡。经兔耳缘静脉注射上述微泡,行MCE检查,Qlab软件分析前壁心肌的视频强度（video intensity,Ⅵ）,其结果与第一部分ELISA检测的血清中IL-6和IL-8的水平做相关性分析。[结 果]1.流式细胞仪检测结合率三组靶向微泡抗体与Targestar-SA微泡的最佳结合效率均在80%以上。2.靶向微泡的制备应用“生物素-亲和素”桥接法成功构建携单抗及双抗靶向微泡,四组微泡的大小、形态、性状基本相似,微泡粒径均一,分布均匀。3.靶向MCE MBc微泡I/R各组前壁Ⅵ与S组和N组差异均无统计学意义（均P>0.05）。三种靶向微泡I/R各组前壁Ⅵ明显高于S组和N组,且随着再灌注时间的延长,Ⅵ逐渐升高,MBIL-6微泡和MBd微泡于再灌注180min达高峰,MBIL-8微泡于再灌注120 min和再灌注180min达高峰。同一再灌注时间,四种微泡Ⅵ从高到低依次为:MBd>MBIL-8>MBIL-6>MBc。4.相关性分析三种靶向微泡I/R组前壁Ⅵ与ELISA检测的IL-6与IL-8水平均呈强相关性（均r>0.7,P<0.05）。[结 论]应用“生物素-亲和素”桥接法成功制备携IL-6与IL-8单抗及双抗靶向微泡,靶向微泡对MIRI的显像敏感性更高、靶向性更强,且携双抗靶向微泡相比携单抗靶向微泡有更好的显像特性。靶向MCE通过定量分析前壁VI,可间接反应MIRI中IL-6与IL-8的水平,实现无创和定量评价MIRI的炎症反应程度。第三部分携IL-6和IL-8抗体靶向微泡在减轻兔心肌缺血/再灌注损伤中的作用[目 的]探讨超声靶向微泡破坏（ultrsound targeted microbubble destruction,UTMD）技术介导携IL-6和IL-8单抗及双抗靶向微泡在减轻兔心肌缺血/再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI）中的作用。[方 法]沿用第二部分行MCE检查的144只动物模型,各组兔分别经耳缘静脉注射裸微泡（MBc）、携IL-6单抗微泡（MBIL6）、携IL-8单抗微泡（MBIL-8）及携IL-6与IL-8双抗微泡（MBd）,观察心肌显影并存储图像。待微泡稳定附着后,使用低功率聚焦超声实验装置经兔胸壁行超声辐照干预。辐照完毕后经兔耳中动脉采血,ELISA检测血清中IL-6与IL-8的水平。3天后处死动物,取心肌组织,行病理组织学检查。[结 果]1.MBc微泡辐照后,各组Ⅵ、血清中IL-6和IL-8的水平均无明显变化,差异均无统计学意义（均P>0.05）。2.MBIL-6微泡辐照后,I/R各组Ⅵ和血清中IL-6的水平均较辐照前明显减低,差异均有统计学意义（均P<0.05）,而IL-8的水平均无明显变化,差异均无统计学意义（均P>0.05）。3.MBIL-8微泡辐照后,I/R各组Ⅵ和血清中IL-8的水平均较辐照前明显减低,差异均有统计学意义（均P<0.05）,而IL-6的水平均无明显变化,差异均无统计学意义（均P>0.05）。4.MBd微泡辐照后,I/R各组Ⅵ、血清中IL-6和IL-8的水平均较辐照前明显减低,差异均有统计学意义（均P<0.05）。5.比较四种微泡I/R各组辐照前、后视频强度差值,MBd>MBIL-6和MBIL-8>MBc,差异均有统计学意义（均P<0.05）,MBIL-6和MBIL-8微泡各组差异均无统计学意义（均P>0.05）。6.三种靶向微泡I/R各组辐照前、后视频强度变化率及IL-6和IL-8中和率均为再灌注30 min时最高,随着再灌注时间的延长,视频强度变化率和炎症因子中和率均逐渐降低。[结 论]应用UTMD技术介导携IL-6和IL-8单抗及双抗靶向微泡,可在缺血再灌注损伤区定点释放IL-6和IL-8单克隆抗体以中和靶区的炎症因子,通过抗原抗体中和作用有效减轻MIRI的炎症反应。携双抗靶向微泡的干预效果优于携单抗靶向微泡,且越早辐照干预,减轻炎症反应的效果越好。以上为临床寻找安全、高效的减轻MIRI的方法提供了更有力的实验基础,并有望成为临床治疗MIRI的新方法。
田利丽[10]（2019）在《急性缺血性卒中血管再灌注及神经保护的研究》文中认为目的:急性缺血性卒中（acute ischemic stroke,AIS）发生后,无法获得快速且有效的脑血流重建是脑梗死灶进展的主要原因。近年来,由于脑梗死急性期血管内治疗材料的更新、技术的改进及普及,显着提高了急性期大血管闭塞性缺血性卒中患者脑血流的重建几率,部分抑制病灶进展的发生。但是,患者的临床预后转归与较高的血管再通率相比是不匹配的,部分原因可能是由于脑微循环内炎性微血栓的形成,致使脑微循环灌注水平无法有效改善。由于磁敏感加权成像（susceptibility weighted imaging,SWI）的发展,极大地提高了细小血管如脑髓质静脉和小静脉的可视性。然而,SWI最开始不能用于体内动脉血管的评估。主要原因是动脉和周围组织的磁敏感差异太小。因此,为使动脉像静脉一样可视,我们使用新型造影剂超小型超顺磁性氧化铁（ultra-small superparamagnetic iron oxide,USPIO）增强磁敏感加权成像（USPIO-SWI）,诱导血管内磁敏感性的偏移。多项动物研究均提示,免疫调节剂如芬戈莫德（fingolimod）和抗CD49d单克隆抗体在不同的缺血性脑卒中动物模型上有显着疗效。基于这些颇具前景的研究结果,我们和其他团队均开展了免疫调节剂治疗缺血性脑卒中病人的可行性研究。然而,这些研究结果不一。因此,本研究的目的是在大鼠血栓栓塞性大脑中动脉闭塞模型上开展一种评估血管造影显示的再灌注水平的新型MRI体系,并且通过随机、盲法、安慰剂对照的前临床研究（pRCT）比较阿替普酶单独或联合芬戈莫德对脑血管造影灌注水平的差别。白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF）是细胞因子白介素-6（interleukin-6,IL-6）家族的成员之一,可以刺激或抑制细胞增殖、分化和存活。LIF可以促进神经干细胞（neural stem cells,NSCs）的自我更新,对神经支持细胞的功能维持发挥重要作用。LIF是NSCs在缺血性脑梗死中发挥神经保护作用的主要因子。本部分研究对LIF转染NSCs（LIF-transfected NSCs,LIF-NSCs）是否可以减轻缺血性脑梗死大鼠的脑损伤,发挥促神经保护作用进行了探讨。方法:第一部分:为建立MRI评估脑血管造影灌注水平的方法体系,我们研究了15只成年大鼠。其中,9只正常大鼠用于确定USPIO强化SWI序列上动脉显影的最佳剂量。另外6只大鼠用于诱导血栓栓塞性脑梗死模型,以评估最优USPIO剂量在局灶性脑梗死病灶部位显影脑动脉的可行性。第二部分:通过前临床随机、盲法、安慰剂对照（preclinical randomized,blinded,placebo-controlled,pRCT）的实验研究,以明确芬戈莫德是否可以增强组织型纤维蛋白溶酶原激活剂（tissue plasminogen activator,tPA）治疗急性缺血性卒中的疗效。诱导血栓栓塞性大脑中动脉闭塞模型（embolic middle cerebral artery occlusion,eMCAO）,术后2小时经磁共振血管成像显示血管闭塞且SWI无颅内出血的大鼠纳入研究。初级终点事件是24小时内脑梗死体积的增加以及24小时内脑出血转化的分型往有利的方向转变。探索终点事件是血管造影再灌注水平向有利的方向转变。样本量是每组30只大鼠。第三部分:我们将携带LIF基因的慢病毒转染NSCs以使其稳定过表达LIF。本研究分体外和体内两部分,体外研究LIF NSCs的增殖及分化能力。建立氧糖剥夺（oxygen glucose deprivation,OGD）模型以体外模拟缺血性脑梗死的病理生理条件,观察OGD条件下,LIF-NSCs分泌LIF的水平及抗凋亡能力。体内部分,我们建立大鼠短暂性大脑中动脉闭塞模型（middle cerebral artery occlusion,MCAO）,术后6小时,经尾静脉注射LIF-NSCs。在术后1天、3天和28天,分别通过磁共振的ADC（apparent diffusion coefficient,表观扩散系数）、T2以及DTI（diffusion tensor imaging,弥散张量成像）序列评估脑梗死体积及脑白质损伤情况。在术后7天、14天、21天和28天,经mNSS（modified neurological severity score,改良神经功能缺损评分）评估大鼠神经功能恢复情况。然后经免疫化学染色,观察大鼠脑内LIF的表达水平,以及胶质细胞增生情况。结果:当USPIO剂量为300μmol/kg时,USPIO-SWI序列可清楚成像大鼠脑内小动脉,而且此剂量下评估eMCAO大鼠脑动脉造影再灌注水平是可行的。本pRCT研究结果进一步证实了tPA联合芬戈莫德治疗eMCAO大鼠,可显着抑制脑梗死灶的进展（梗死灶进展的平均体积:34 mm3 vs 18 mm3,p=0.015）,改善脑血管造影灌注水平（mTICI:69%vs 17%,p=0.001）,且不增加颅内出血转化的风险。本研究结果提示LIF-NSCs在体外可稳定且持续表达LIF,且可促进NSCs的增殖。在OGD条件下,LIF-NSCs可以增加LIF的表达水平,减轻caspase 3的活化以抵抗细胞凋亡。通过尾静脉向MCAO大鼠体内注射LIF-NSCs可实现大鼠脑内过表达LIF,而且LIF-NSCs和其分化生成的星形胶质细胞均可持续分泌较高水平的LIF。此外,我们还发现LIF-NSCs治疗MCAO大鼠可以促进其神经功能的恢复,减小MRI图像上脑梗死体积。而且,病理分析结果表明,LIF-NSCs治疗可以促进大鼠白质损伤的修复,增加胶质细胞的再生。结论:本研究通过实施pRCT研究,揭示了USPIO-SWI评估缺血性脑卒中血管再通治疗后脑血管造影灌注水平的转化研究的可行性。而且,本研究提示靶向淋巴细胞的干预手段的疗效可能有赖于其血管保护效果以及改善脑血管造影灌注水平。LIF修饰的NSCs移植可以减轻OGD条件下细胞的凋亡,减小MCAO大鼠脑梗死体积,促进其神经功能的恢复,还可以减轻脑白质损伤。LIF-NSCs对缺血性脑梗死大鼠的脑保护效果,可能是由于NSCs作为载体增加缺血侧LIF的表达水平,提示LIF-NSCs有望成为今后治疗缺血性脑卒中的新型治疗手段。
二、动脉血栓靶向定位的实验研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、动脉血栓靶向定位的实验研究（论文提纲范文）
（1）基于高分辨率磁共振对动脉粥样硬化不稳定斑块诊疗的临床及实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 基于高分辨率磁共振管壁成像对颅内动脉粥样硬化所致卒中复发及预后评估的临床研究 |
| 第一章 颅内动脉粥样硬化斑块特征预测复发性脑卒中的前瞻性研究 |
| 一、引言 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 第二章 强化药物治疗后对复发性脑卒中预测及神经功能预后评估的前瞻性研究 |
| 一、引言 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 多功能纳米脂质体靶向巨噬细胞对动脉粥样硬化不稳定斑块的诊治一体化实验研究 |
| 一、引言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述一 动脉粥样硬化成像技术的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 多功能纳米粒在动脉粥样硬化疾病诊治中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 博士在读期间的科研成果 |
| 致谢 |
（2）纤维蛋白靶向纳米粒光声成像用于检测心肌梗死区的实验研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 纤维蛋白靶向纳米粒的制备、基本性质检测和生物安全性评价 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 纤维蛋白靶向纳米粒的靶向能力及体内分布的实验研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 纤维蛋白靶向纳米粒光声成像用于检测心肌梗死区的实验研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 纳米粒在心血管疾病成像中的应用进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间的学术论文 |
（3）两亲性鲁米诺/二氢卟吩e6偶联物自组装纳米粒的构建及其防治动脉粥样硬化的作用与机制研究（论文提纲范文）
| 缩写词表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 两亲性鲁米诺/二氢卟吩e6偶联物的合成及其自组装纳米粒的制备与表征 |
| 2.1 两亲性CLP偶联物和CLP-cRGD聚合物的合成和表征 |
| 2.2 CLP纳米粒的理化性能和表征 |
| 2.3 本章小结 |
| 第三章 CLP纳米粒和CLP-cRGD纳米粒治疗动脉粥样硬化体内药效学研究 |
| 3.1 CLP纳米粒在动脉粥样硬化斑块中靶向效应和脏器中的组织分布 |
| 3.2 CLP-cRGD纳米粒在动脉粥样硬化斑块中靶向效应和脏器中的组织分布 |
| 3.3 CLP纳米粒治疗动脉粥样硬化体内药效学研究 |
| 3.4 CLP-cRGD纳米粒治疗动脉粥样硬化体内药效学研究 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 CLP纳米粒治疗动脉粥样硬化的机制研究 |
| 4.1 CLP纳米粒的细胞内吞噬 |
| 4.2 CLP纳米粒抑制RAW264.7 细胞炎症因子分泌 |
| 4.3 CLP纳米粒抑制RAW264.7 细胞对ox LDL的摄取 |
| 4.4 CLP纳米粒治疗动脉粥样硬化机制研究 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 CLP纳米粒治疗动脉粥样硬化生物安全性评价 |
| 5.1 CLP纳米粒的细胞毒性评价 |
| 5.2 CLP纳米粒和CLP-cRGD纳米粒的治疗动脉粥样硬化体内安全性评价 |
| 5.3 CLP纳米粒急性毒性评价 |
| 5.4 本章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 靶向效应纳米粒在动脉粥样硬化中应用研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间研究成果 |
| 致谢 |
（4）黄芪-丹参药对活性成分在高血压肾损害中调控microRNA-200c-3p保护肾动脉内皮机制研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| abstract |
| 英文词缩略表 |
| 引言 |
| 第一部分 理论探讨 |
| 1 血管内皮细胞功能障碍是高血压肾损害的关键因素 |
| 2 miRNA在高血压及肾脏疾病中的调控作用研究进展 |
| 2.1 miRNA的生物学特点 |
| 2.2 miRNA参与高血压血管内皮功能障碍 |
| 2.3 miRNA对肾脏稳态与肾脏疾病的调控作用 |
| 3 中医对高血压肾损害的认识 |
| 3.1 中医对高血压肾损害病机的认识 |
| 3.2 黄芪、丹参及其活性成分治疗高血压肾损害的研究进展 |
| 第二部分 临床研究 |
| 1 研究目的 |
| 2 研究对象及病例来源 |
| 3 诊断标准 |
| 3.1 西医诊断标准 |
| 3.2 中医证候要素诊断标准 |
| 3.3 CKD分期标准 |
| 4 纳入标准 |
| 5 排除标准 |
| 6 研究方法 |
| 6.1 病例收集 |
| 6.2 观察指标 |
| 6.3 数据处理 |
| 7 结果 |
| 7.1 性别分布 |
| 7.2 年龄分布 |
| 7.3 患者高血压病史及血压达标情况 |
| 7.4 合并症分布情况 |
| 7.5 降压药物应用情况 |
| 7.6 中医证候要素分析 |
| 7.7 各证候要素与一般资料的关系 |
| 7.8 各证候要素与实验室指标的关系 |
| 7.9 用药统计分析 |
| 8 讨论 |
| 8.1 证素在高血压肾损害患者中医病机研究中的应用 |
| 8.2 关联规则分析在疾病用药规律研究中的应用 |
| 8.3 研究结果分析 |
| 9 结论 |
| 第三部分 实验研究 |
| 实验一 AngⅡ诱导的肾动脉内皮细胞损伤中miRNA差异表达谱的构建及其生物信息学分析 |
| 1 实验目的 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 细胞株 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器及耗材 |
| 2.4 实验用药物和试剂的配制 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 MTT比色实验 |
| 3.3 高通量miRNA-m RNA联合测序 |
| 3.4 统计学方法 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 Ang Ⅱ对 RRAEECs存活力的影响 |
| 4.2 AngⅡ诱导RRAECs中差异基因表达谱的生物信息学分析 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 实验二 miRNA-200c-3p靶向ZEB2 参与Ang Ⅱ诱导的肾动脉内皮细胞功能障碍的机制研究 |
| 1 实验目的 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 细胞株 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器及耗材 |
| 2.4 实验用药物和试剂的配制 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 细胞转染 |
| 3.3 细胞增殖功能检测 |
| 3.4 Transwell细胞迁移功能检测 |
| 3.5 双荧光素酶报告基因检测miRNA-200c-3p与 ZEB2 的靶向关系 |
| 3.6 qPCR实验 |
| 3.7 Western Blot实验 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 Ang Ⅱ体外诱导活化的RRAECs中 miRNA-200c-3p的表达变化 |
| 4.2 miRNA-200c-3p对 Ang Ⅱ诱导的RRAECs增殖和迁移功能的影响 |
| 4.3 ZEB2是miRNA-200c-3p的直接潜在功能性靶基因 |
| 4.4 Ang Ⅱ体外诱导活化的RRAECs中 ZEB2 的表达变化 |
| 4.5 ZEB2对Ang Ⅱ诱导的RRAECs增殖和迁移功能的影响 |
| 4.6 ZEB2 的异常表达可逆转miRNA-200c-3p对 Ang Ⅱ诱导的RRAECs增殖和迁移能力的抑制作用 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 实验三 毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍对AngⅡ诱导的肾动脉内皮细胞的保护作用研究 |
| 1 实验目的 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 细胞株 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器及耗材 |
| 2.4 实验用药物和试剂的配制 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 MTT比色实验 |
| 3.3 细胞功能检测实验分组 |
| 3.4 细胞凋亡实验 |
| 3.5 细胞划痕实验 |
| 3.6 活性氧检测实验 |
| 3.7 线粒体/溶酶体/核染色观察RRAECs内线粒体自噬的变化 |
| 3.8 线粒体膜电位(JC-1)检测实验 |
| 3.9 统计学方法 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 毛蕊异黄酮不同浓度作用对细胞存活力的影响 |
| 4.2 丹参酮ⅡA不同浓度作用下对细胞存活力的影响 |
| 4.3 毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA不同浓度配比作用下对细胞存活力的影响 |
| 4.4 毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍对AngⅡ诱导的RRAECs凋亡的影响 |
| 4.5 毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍对AngⅡ诱导的RRAECs迁移的影响 |
| 4.6 毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍对AngⅡ诱导的RRAECs活性氧的影响 |
| 4.7 毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍对AngⅡ诱导的RRAECs内线粒体自噬的影响 |
| 4.8 毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍对AngⅡ诱导的RRAECs线粒体膜电位(Δψ_m)的影响 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 实验四 毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍通过miRNA-200c-3p靶向ZEB2对Ang Ⅱ诱导的肾动脉内皮细胞的保护机制研究 |
| 1 实验目的 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对Ang Ⅱ诱导的RRAECs miRNA差异表达谱的影响 |
| 3.3 细胞转染 |
| 3.4 细胞增殖功能检测 |
| 3.5 Transwell细胞迁移功能检测 |
| 3.6 qPCR实验 |
| 3.7 Western Blot实验 |
| 3.8 统计学方法 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对Ang Ⅱ诱导的RRAECs miRNA差异表达谱的影响 |
| 4.2 毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍通过miRNA-200c-3p靶向ZEB2 改善Ang Ⅱ诱导的肾动脉内皮细胞功能障碍 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 综述 高血压肾损害的发病机制与中医病机研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 查新报告 |
| 论文着作 |
（5）纳米级AMH靶向超声造影剂的制备及其对大鼠移植卵巢靶向显影的初步研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 纳米级AMH靶向超声造影剂的制备及特性研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 AMH靶向纳米泡对大鼠卵巢颗粒细胞的体外靶向性研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 AMH靶向纳米微泡对大鼠移植卵巢的体内超声分子影像研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 超声分子影像学研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（6）pH和ROS双响应性靶向纳米药物的构建及其防治血管再狭窄的应用研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 前言 |
| 第一章 pH和 ROS双响应性纳米粒的构建及其表征 |
| 1.1 pH响应性和ROS响应性β-环糊精载体材料的合成及其理化性质表征 |
| 1.2 pH和 ROS双响应性纳米粒的构建及其表征 |
| 1.3 pH和 ROS双响应性纳米药物的体外水解及药物释放 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 本章小结 |
| 第二章 pH和 ROS双响应性纳米药物的体外生物学功能评价 |
| 2.1 SD大鼠主动脉VSMCs对纳米粒的吞噬作用研究 |
| 2.2 双响应性载RAP纳米粒对SD大鼠VSMCs增殖和迁移的影响 |
| 2.3 双响应性载RAP纳米粒对PDGF-BB诱导大鼠的VSMCs相关蛋白表达的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 pH和 ROS双响应性纳米药物在SD大鼠颈动脉球囊损伤部位的靶向能力及抑制血管新生内膜增生的疗效评价 |
| 3.1 SD大鼠颈动脉球囊损伤模型的建立 |
| 3.2 p H和 ROS双响应性纳米粒对大鼠颈动脉内皮损伤部位的靶向能力评价 |
| 3.3 pH和 ROS双响应性载RAP纳米粒对SD大鼠颈动脉球囊损伤部位炎症及氧化应激水平的影响 |
| 3.4 pH和 ROS双响应性载RAP纳米药物在SD大鼠颈动脉球囊损伤模型中抑制血管新生内膜增生的疗效观察 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 pH和 ROS双响应性靶向纳米药物的构建、靶向性及其防治PTA术后再狭窄的疗效 |
| 4.1 pH和 ROS双响应性靶向纳米药物的构建及表征 |
| 4.2 pH和 ROS双响应性靶向纳米粒对SD大鼠颈动脉内皮损伤部位的靶向研究 |
| 4.3 pH和 ROS双响应性靶向纳米药物在SD大鼠颈动脉PTA术后血管再狭窄防治中的疗效评价 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 pH和 ROS双响应性载RAP纳米药物的初步安全性评价 |
| 5.1 pH和 ROS双响应性空白纳米粒的急性毒性评价 |
| 5.2 pH和 ROS双响应性纳米药物的长期毒性评价 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 纳米药物递送系统在血管再狭窄防治中的应用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（7）携RGDS载尿激酶靶向微泡造影剂的实验研究（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 统计学方法 |
| 结果 |
| 1. 荧光标记UK及RGDS |
| 2. RGDS载尿激酶靶向造影剂的一般理化性质 |
| 3. 携RGDS载尿激酶靶向造影剂携带率的影响因素 |
| 讨论 |
| 1. VTE |
| 2. 超声微泡造影剂 |
| 3. 尿激酶 |
| 4. RGDS |
| 5. 靶向的连接 |
| 6. 血栓靶向制剂的研究 |
| 7. 本实验的创新性 |
| 8. 本实验局限性 |
| 9.本研究不足之处 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略语表 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文情况 |
（8）快速检测技术在石油废水重金属离子诱发慢性疾病中的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 绪论 |
| 1.1 研究背景及意义 |
| 1.2 石油废水中重金属离子诱发的慢性疾病 |
| 1.2.1 重金属离子污染与慢性病 |
| 1.2.2 重金属离子Pb~(2+)、Cd~(2+)的危害 |
| 1.3 快速检测技术在石油废水重金属离子诱发慢性疾病检测中的应用 |
| 1.3.1 在石油废水中重金属离子Pb~(2+)、Cd~(2+)检测中的应用 |
| 1.3.2 在血栓快速检测的应用 |
| 1.3.3 在尿沉渣细胞形态与肾脏慢性病中的应用 |
| 1.4 研究内容及实施方案 |
| 1.4.1 研究内容 |
| 1.4.2 实施方案 |
| 2 石油废水中重金属离子Pb~(2+)、Cd~(2+)的高通量快速检测系统研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.1.1 石油废水重金属离子检测研究现状 |
| 2.1.2 金属纳米簇装配的微流控芯片的重金属离子检测 |
| 2.1.3 实验内容及创新 |
| 2.2 实验过程 |
| 2.2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.2.2 金属纳米簇的制备与表征 |
| 2.2.3 金属纳米簇对重金属离子Pb~(2+) 、Cd~(2+)的检测 |
| 2.2.4 微流控芯片的设计与金属纳米簇对石油废水的检测 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 金属纳米簇的荧光特性 |
| 2.3.2 金属纳米簇对重金属离子检测结果 |
| 2.3.3 微流控芯片的设计与优化 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 相变PLGA微球对血栓的快速靶向检测技术研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.1.1 Pb~(2+)对人体的危害 |
| 3.1.2 血栓的危害及检测技术 |
| 3.1.3 超声造影在快速检测血栓的中应用 |
| 3.1.4 实验内容及创新 |
| 3.2 实验过程 |
| 3.2.1 主要试剂和仪器 |
| 3.2.2 RGD修饰磁性γ-Fe2O3颗粒及表征 |
| 3.2.3 微球的制备及表征 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 靶向RGD-γ-Fe_2O_3表征结果 |
| 3.3.2 微球具备血栓快速靶向检测表征结果 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 快速检测尿沉渣细胞形态与肾脏慢性病的相关性分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.1.1 Cd~(2+)致肾损伤的机理 |
| 4.1.2 慢性肾病的现状 |
| 4.1.3 尿沉渣检测分析发展现状 |
| 4.1.4 人工智能(AI)识别技术 |
| 4.1.5 实验内容及创新 |
| 4.2 实验过程 |
| 4.2.1 主要试剂和仪器 |
| 4.2.2 尿液临床样本的采集 |
| 4.2.3 染色系统临床样本测试 |
| 4.2.4 人工智能(AI)识别临床样本测试 |
| 4.2.5 肾脏疾病的临床样本测试 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 临床尿液样本统计 |
| 4.3.2 染色标本形态学图像分析 |
| 4.3.3 人工智能(AI)系统有形成分识别率 |
| 4.3.4 肾脏疾病尿液样本分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 总结与展望 |
| 5.1 主要成果 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者在攻读学位期间发表的论着及取得的科研成果 |
（9）携IL-6和IL-8抗体靶向微泡在减轻兔心肌缺血/再灌注损伤中的作用（论文提纲范文）
| 缩略词表(以字母顺序排列) |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 IL-6和IL-8在兔心肌缺血/再灌注损伤中的表达 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 携IL-6和IL-8抗体靶向微泡评价兔心肌缺血/再灌注损伤 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 携IL-6和IL-8抗体靶向微泡在减轻兔心肌缺血/再灌注损伤中的作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（10）急性缺血性卒中血管再灌注及神经保护的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、建立USPIO-SWI评估脑血管灌注的方法体系 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 血栓栓塞性大脑中动脉闭塞模型 |
| 1.1.3 TTC染色 |
| 1.1.4 磁共振评估脑侧枝循环 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 USPIO-SWI可对正常大鼠脑微血管清晰成像 |
| 1.2.2 USPIO-SWI可对e MCAO大鼠脑小动脉清晰成像 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、芬戈莫德增强tPA溶栓脑血管再灌注水平的前临床研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 动物模型和实验方案 |
| 2.1.2 磁共振评估脑侧支循环 |
| 2.1.3 神经功能评估 |
| 2.1.4 TTC染色 |
| 2.1.5 免疫荧光染色 |
| 2.1.6 H&E染色 |
| 2.1.7 流式细胞术检测脑内炎症细胞 |
| 2.1.8 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 多模式磁共振评估下芬戈莫德增加tPA的疗效 |
| 2.2.2 USPIO-SWI显??芬??莫德改善tPA溶栓后的??管造影再灌注??平… |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、LIF转染NSCs促进脑梗死大鼠神经保护作用 |
| 研究目的、方法 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 准备NSCs |
| 3.1.1.1 小鼠胚胎脑NSCs的分离和培养 |
| 3.1.1.2 小鼠胚胎脑NSCs的传代 |
| 3.1.1.3 NSCs的免疫细胞化学鉴定 |
| 3.1.2 病毒包被和构建LIF-NSCs |
| 3.1.2.1 LIF过表达慢病毒和对照组慢病毒质粒的构建 |
| 3.1.2.2 病毒包装、浓缩和定量 |
| 3.1.2.3 病毒转染NSCs |
| 3.1.3 氧糖剥夺(Oxygen Glucose Deprivation,OGD) |
| 3.1.4 免疫细胞化学染色 |
| 3.1.5 缺血性脑梗死模型和NSCs治疗 |
| 3.1.6 MRI评估 |
| 3.1.7 免疫组织化学染色分析 |
| 3.1.8 统计分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 LIF-NSCs持续分泌LIF并促进NSCs增殖 |
| 3.2.2 LIF-NSCs减轻体外OGD条件下细胞的凋亡 |
| 3.2.3 LIF-NSCs减轻脑梗死体积和白质损伤,改善长期神经功能预后… |
| 3.2.4 LIF-NSCs增加大鼠体内LIF的表达,促进胶质细胞再生 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 急性缺血性卒中与炎性微血栓 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、动脉血栓靶向定位的实验研究（论文参考文献）
- [1]基于高分辨率磁共振对动脉粥样硬化不稳定斑块诊疗的临床及实验研究[D]. 史张. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [2]纤维蛋白靶向纳米粒光声成像用于检测心肌梗死区的实验研究[D]. 张雅楠. 重庆医科大学, 2021(01)
- [3]两亲性鲁米诺/二氢卟吩e6偶联物自组装纳米粒的构建及其防治动脉粥样硬化的作用与机制研究[D]. 李聃丹. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(07)
- [4]黄芪-丹参药对活性成分在高血压肾损害中调控microRNA-200c-3p保护肾动脉内皮机制研究[D]. 刘瑶. 山东中医药大学, 2020(01)
- [5]纳米级AMH靶向超声造影剂的制备及其对大鼠移植卵巢靶向显影的初步研究[D]. 张姗. 新疆医科大学, 2020(03)
- [6]pH和ROS双响应性靶向纳米药物的构建及其防治血管再狭窄的应用研究[D]. 张润军. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [7]携RGDS载尿激酶靶向微泡造影剂的实验研究[D]. 车雪瑜. 广西医科大学, 2019(08)
- [8]快速检测技术在石油废水重金属离子诱发慢性疾病中的应用研究[D]. 黄秋红. 重庆科技学院, 2019(11)
- [9]携IL-6和IL-8抗体靶向微泡在减轻兔心肌缺血/再灌注损伤中的作用[D]. 孙月. 昆明医科大学, 2019(05)
- [10]急性缺血性卒中血管再灌注及神经保护的研究[D]. 田利丽. 天津医科大学, 2019(02)