一、VES抑制Raji细胞增殖中对CDK2和Bcl-2/Bax蛋白表达的影响（论文文献综述）
刘景晨[1]（2021）在《三七总皂苷对视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖、凋亡及PI3K/AKT信号通路的影响》文中进行了进一步梳理视网膜母细胞瘤是具有高度侵袭性的眼部肿瘤,多见于5岁以内儿童。视网膜母细胞瘤的治疗效果依赖于早期发现和早期治疗,但由于社会经济及医疗条件的限制,很多患儿在临床的中晚期才获得诊治,疗效不佳且致盲率和致残率极高。目前对视网膜母细胞瘤的治疗主要有化疗、放疗、手术治疗及免疫治疗等,其中以化疗为基础的联合治疗是中晚期患儿最常用的方案。在临床治疗中,由于化疗药物的耐药性和毒副作用的存在,导致部分患儿难于得到及时而有效的治疗,因此需寻找毒副作用小且可负担的治疗手段或药物。三七总皂苷是从传统中药三七中提取的生物活性成分,广泛用于糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞等眼科疾病的治疗。近年来在肝癌、乳腺癌、骨肉瘤、淋巴瘤、胰腺癌等肿瘤细胞的研究中证实三七总皂苷具有明确的抗肿瘤活性,但目前尚未发现其用于眼部肿瘤研究的报道。目的:研究三七总皂苷对视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖、凋亡及PI3K/AKT信号通路的影响,以探索三七总皂苷抑制视网膜母细胞瘤的作用机制。方法:1.采用CCK-8实验分别检测三七总皂苷及卡铂对Y79细胞增殖的影响,并计算出两种药物的IC50值。参考CCK-8实验结果,实验分为阴性对照组、不同浓度（200、400、600ug/ml）三七总皂苷组及卡铂阳性对照组,使用流式细胞仪检测三七总皂苷对Y79细胞凋亡的影响,Western blot、实时荧光定量PCR检测细胞凋亡相关基因的m RNA和蛋白表达。2.在信号通路的研究中,通过CCK-8实验分析PI3K抑制剂LY294002对Y79细胞增殖的影响并计算出IC50。检测阴性对照组和浓度梯度为200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml的三七总皂苷组细胞中PI3K/AKT信号通路蛋白的表达。然后按阴性对照组、三七总皂苷组、联合药物组及PI3K抑制剂组对Y79细胞进行分组处理,检测各组Y79细胞的凋亡情况和细胞中PI3K/AKT通路蛋白及凋亡相关蛋白的表达。3.使用流式细胞仪对阴性对照组、三七总皂苷组（浓度分别为200、400、600ug/ml）及卡铂阳性对照组中Y79细胞的细胞周期进行检测,应用Western blot、实时荧光定量PCR检测细胞周期相关基因的m RNA和蛋白表达。结果:1.与阴性对照组相比,三七总皂苷可以有效抑制Y79细胞的增殖（P<0.05）,CCK-8实验结果计算出24小时、48小时及72小时三七总皂苷对Y79细胞的半数抑制浓度值（IC50）分别为429.2ug/ml;343.8ug/ml,271.5ug/ml。卡铂对Y79细胞的24小时IC50值为63.60ug/ml。三七总皂苷作用于Y79细胞后,细胞的凋亡率随药物浓度增加而升高（P<0.05）,其中600ug/ml三七总皂苷促Y79细胞凋亡的作用最明显,其细胞凋亡率为22.30±1.08%。与阴性组相比,三七总皂苷处理后的Y79细胞中凋亡相关基因Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的m RNA和蛋白表达明显升高（P<0.05）,促凋亡蛋白的活化蛋白Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8、Cleaved caspase-9的表达量也显着增加（P<0.05）,而凋亡抑制基因Bcl-2的m RNA和蛋白表达则受到抑制（P<0.05）,组间对比结果显示,600ug/ml三七总皂苷对促凋亡基因的m RNA和蛋白表达的诱导作用最强（P<0.05）,对Bcl-2的m RNA和蛋白抑制作用也最明显（P<0.05）。三七总皂苷处理后的Y79细胞中Bax/Bcl-2值较阴性组明显升高（P<0.01）,600ug/ml三七总皂苷组中的Bax/Bcl-2值高于200ug/ml组（P<0.001）和400ug/ml组（P<0.005）。2.CCK8细胞增殖实验结果显示PI3K抑制剂LY294002可以有效抑制Y79细胞的增殖,其对Y79细胞的24小时IC50值为26.25umol/L。细胞凋亡检测结果显示三七总皂苷组、LY294002组及联合用药组的细胞凋亡率均高于阴性对照组（P<0.001）,联合用药组中Y79细胞的凋亡率最高,为35.59±0.85%。三七总皂苷处理Y79细胞后,细胞内PI3K及AKT1的总蛋白表达量与阴性组相比未见差异（P>0.05）,但PI3K/AKT通路中的磷酸化蛋白p-PI3K、p-AKT（Thr308）、p-AKT（Ser473）及p-m TOR的表达量明显低于阴性对照组（P<0.05）,在三七总皂苷处理组中的磷酸化蛋白表达量随药物浓度的增加而梯度下降（P<0.05）。与阴性组相比,200ug/ml三七总皂苷对PI3K/AKT通路拮抗蛋白PTEN的表达无明显影响（P>0.05）,但400ug/ml和600ug/ml三七总皂苷组中PTEN蛋白的表达量均明显升高（P<0.01）。三七总皂苷组、联合药物组及PI3K抑制剂组中的促凋亡蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9及活化蛋白Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8、Cleaved caspase-9的表达量较阴性组明显增加（P<0.05）。联合药物组中促凋亡蛋白的表达量高于三七总皂苷组和LY294002组（P<0.05）,各药物处理组细胞的Bcl-2蛋白表达量则均低于阴性组（P<0.01）,组间对比显示联合用药对Bcl-2蛋白的抑制作用最强（P<0.005）,药物处理后的Y79细胞内Bax/Bcl-2值均明显高于阴性组（P<0.005）,在联合用药组中的Bax/Bcl-2比值最高,为阴性组的2.62±0.16倍。3.按实验分组处理后,三七总皂苷各药物组处于G0/G1期的Y79细胞百分率均显着高于阴性组（P<0.01）,在600ug/ml三七总皂苷组中,G0/G1期Y79细胞所占百分比最高,为72.42±0.65%,而S期及G2/M期的细胞比例均低于阴性对照组（P<0.05）。三七总皂苷处理Y79细胞后,细胞内G0/G1期相关基因Cyclin D1、CDK4、CDK6的m RNA和蛋白的表达量较阴性组均明显下降（P<0.05）,并具有浓度依赖性,在600ug/ml三七总皂苷组中下降最显着（P<0.05）。结论:1.三七总皂苷能抑制视网膜母细胞瘤Y79细胞的增殖、促进细胞的凋亡。2.三七总皂苷对Y79细胞的促凋亡作用可能是通过抑制PI3K/AKT信号通路,进而调控凋亡相关基因的表达来实现。3.三七总皂苷能通过抑制Cyclin D1、CDK4、CDK6的m RNA和蛋白的表达,诱导Y79细胞发生G0/G1期阻滞。
杨利蓉[2]（2021）在《IL-7促进抗CD19 CAR-T细胞的增殖作用及其机制研究》文中研究表明[目的]癌症是全球范围内导致人类死亡的主要原因之一,细胞免疫疗法主要通过调节免疫细胞的功能使其靶向杀伤癌细胞,且副作用较小。近年来,嵌合抗原受体T细胞（CAR-T,Chimeric Antigen Receptor T cell）由于有明确的靶向性,已被证明是治疗癌症最有希望的免疫细胞。特别是靶向CD19的CAR-T细胞在治疗B系白血病和淋巴细胞瘤方面取得显着疗效。但CAR-T细胞如何在体外进一步优化增殖效率及延长其体内持久性仍是急需解决的问题。磁珠与人工抗原提呈细胞（aAPC,artificial antigen-presenting cells）是两种最常用于体外扩增刺激CAR-T细胞的方法,但两种方法培养出的CAR-T细胞各自的特点未见系统比较报道。此外,细胞因子白介素-7（IL-7）作为诱导T细胞活化、增殖和细胞毒活性的关键组成部分,已被证明能够显着增强CAR-T细胞的记忆活性,但促进CAR-T细胞增殖及其具体机制还有待验证及进一步阐述。miRNAs参与T细胞的激活和免疫应答,在T细胞活性和提高存活率中起到重要作用。然而miRNA是否参与到IL-7对CAR-T细胞的激活暂未见报道。基于我们的前期研究以及文献调研,本课题提出以下科学问题:1)磁珠与aAPC刺激培养的抗CD19 CAR-T细胞是否具有相同增殖效率,细胞表型及记忆功能和耗竭性?2)IL-7是否能促进抗CD19 CAR-T细胞的增殖?3)寻找参与IL-7对抗CD19 CAR-T细胞调控的关键miRNA,并了解其具体调控机制。为了验证及阐明以上科学问题,本研究拟利用同一捐赠者（重复样本5-6）的外周血白细胞分别采用两种扩增方法（磁珠与aAPC）对piggyBac转座子酶电转构建的第三代CAR-T细胞的增殖效率、记忆表型及耗竭分子表达进行比较;将从IL-7细胞因子增强T细胞存活与稳态增殖的基础上,利用全转录组测序寻找IL-7调控CAR-T激活的关键miRNA与基因;进一步阐述IL-7通过增加miRNA-98-5p的表达诱导关键基因CDKN1A减少,从而影响下游蛋白CDKs/Cyclins表达水平,最终促进CAR-T细胞的存活与稳态增殖。本课题研究结果将优化piggyBac电转构建的抗CD19 CAR-T细胞的培养,并对CAR-T细胞的功能及活性调控分子机制做出阐述,为其能够更好的在临床上应用提供科学依据及技术支持。[方法]第一部分:利用电穿孔转染技术将构建的CD19 PiggyBac转座子与转座酶质粒转入T细胞体内进行修饰改造,并将CAR-T细胞与人工抗原提呈细胞CD19CD137LCD86CD64mIL-15-K562或抗 CD3/CD28 磁珠按照一定的比例进行共培养,加入相应的细胞因子。镜下观察两组CAR-T细胞生长状态与增殖情况。qPCR及琼脂糖凝胶实验验证aAPC在培养CAR-T细胞中的残留,以及流式细胞术观察aAPC的GFP表达。在刺激的过程中采用流式细胞检测术检测CD3,CD4,CD8分群情况,CAR标志myc的表达,CAR-T细胞的记忆亚群表达,及CAR-T细胞的耗竭情况。利用荧光素酶杀瘤实验检测CAR-T细胞的抗肿瘤效应,采用Elisa实验验证两种方法刺激的CAR-T细胞分泌的细胞因子。电镜观察CAR-T细胞杀伤Raji肿瘤细胞,利用蛋白免疫印迹（western blot,WB）验证CAR-T细胞杀伤肿瘤的机制。第二部分:同样利用电穿孔转染技术将构建的CD1 9PiggyBac转座子与转座酶质粒转入T细胞进行修饰改造,按照一定的比例加入抗CD3/CD28磁珠刺激扩增CAR-T细胞,分为两组分别加入不同的细胞因子（IL-7+IL-2+IL-21 VS IL-2+IL-21）。镜下观察两组CAR-T细胞生长状态与增殖情况。在刺激的过程中采用流式细胞检测术检测CD3,CD4,CD8表达情况,CAR标志myc的表达,CAR-T细胞的记忆亚群表达,CAR-T细胞的耗竭分布。利用荧光素酶杀瘤实-验检测CAR-T细胞的抗肿瘤效应,采用Elisa实验验证两种方法刺激的CAR-T细胞分泌的细胞因子。通过尾静脉注射NAMALWA肿瘤细胞构建NAMALWA异种移植小鼠模型,再次尾静脉注射两组1.8×107个CAR-T细胞与对照组T细胞。第三部分:利用第二部分相同方法刺激两组CAR-T细胞,提取两组CAR-T细胞的RNA,采用全转录组测序技术对其测序,利用生物信息学技术寻找有差异的mRNA与miRNA,扩大样本量,qPCR实验验证mRNA与miRNA的表达,筛选出显着高表达的目的mRNA与miRNA。利用GO与KEGG富集分析,选取与增殖相关的基因CDKN1A,通过WB检测下游增殖相关的标志:CDK2、CDK4、CyclinDl、CyclinE1,利用EdU与流式检测细胞的增殖与周期。通过TargetScan与miRanda软件预测CDKN1A的相关miRNA,再转染相关miRNA的mimics与抑制剂,WB检测下游增殖相关的标志:CDK2、CDK4、CyclinD1、CyclinE1,利用EdU与流式检测细胞的增殖与周期。[结果]第一部分:通过aAPC与抗CD3/CD28磁珠两种刺激扩增的方法,成功获得两组CAR-T细胞。aAPC刺激培养的CAR-T细胞生长状态比磁珠组扩增的更良好及增殖倍数更高,qPCR及琼脂糖凝胶实验验证aAPC在培养CAR-T细胞中没有存在残留,以及流式细胞术未观察到aAPC的GFP表达。流式细胞术检测aAPC刺激培养的CAR-T细胞能改变CD4+CAR/CD8+CAR-T细胞的比例,CD45RO+CAR-T记忆细胞亚群表达更多。qRT-PCR验证aAPC刺激培养的CAR-T细胞耗竭分子CTLA-4表达更低。体外杀瘤实验检测磁珠刺激培养的CAR-T细胞抗肿瘤效应更强,Elisa实验验证两组CAR-T细胞分泌的细胞因子无较大差异。WB验证CAR-T组显着增加STAT1、裂解-caspase 3和Bax的表达,而caspase 3的表达下降到检测不到的水平。第二部分:在磁珠刺激扩增CAR-T细胞的前提下,通过利用两组不同细胞因子组合进行共培养刺激,成功获得两组CAR-T细胞。IL-7刺激培养的CAR-T细胞生长状态比未加IL-7刺激扩增的更良好及增殖倍数更高,流式细胞术检测IL-7刺激培养的CAR-T细胞能改变CD4+CAR/CD8+CAR-T细胞的比例,记忆细胞亚群与耗竭分子表达无显着差异。体外杀瘤实验表明未加IL-7刺激培养的CAR-T细胞抗肿瘤效应更强,Elisa实验验证两组CAR-T细胞分泌的细胞因子无较大差异。而体内实验NAMALWA肿瘤异种移植瘤模型证明IL-7刺激培养的CAR-T细胞在后续表现出显着的抗肿瘤作用。第三部分:通过全转录组测序及生物信息学分析,结果表明有52个mRNA和8个miRNA具有显着差异。qPCR验证,我们发现CDKN1A、FAM110A、GPC1、KLHL29、TSN具有显着差异,其中KLHL29在IL-7组中上调,CDKN1A、FAM110A、GPC1、与TSN在IL-7组中下调,其中通过WB检测CDKN1A可能影响CAR-T细胞的增殖。同时生物信息学分析及qPCR验证,发现has-miR-320a-5p与has-miR-1973具有显着差异,在IL-7组中下调,但has-miR-98-5p在IL-7组中升高。模拟miR-98-5p与抑制miR-98-5p均会改变CDKN1A及下游相关增殖蛋白CDK2、CDK4、CyclinD1、CyclinE1的表达,流式周期检测发现IL-7会影响细胞周期S期的比例。同时发现IL-7也会影响T细胞的增殖。我们猜测IL-7可能通过miRNA下调CDKN1A的表达从而影响CAR-T细胞的增殖。[结论]1、与磁珠刺激CAR-T细胞相比较,aAPCs更能显着增强CAR-T细胞增殖,记忆表型表达更高和耗竭分子表达更低;aAPCs刺激的CAR-T细胞可通过激活细胞因子IFN-γ等及凋亡相关途径发挥体外抗肿瘤效应;在移植肿瘤小鼠模型表现出显着的抗肿瘤作用。2、IL-7能促进CAR-T细胞增殖,与aAPCs刺激组的CAR-T细胞扩增倍数相比无显着差别,并能改变CD4+CAR/CD8+CAR-T细胞的比例,在体内实验表现出显着的抗肿瘤作用。3、通过全转录组测序及验证发现IL-7能通过介导miRNA-98-5p下调CDKN1A增殖基因表达从而影响CAR-T细胞的增殖。
王文平[3]（2021）在《重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性评价及重楼皂苷Ⅰ的肝毒性机制探究》文中进行了进一步梳理研究目的:药源性肝损伤是一项严重的公共卫生问题,据调查统计,我国药源性肝损伤的发病率逐年升高;重楼是一种临床常用中药,因其抗肿瘤活性日益受到重视。重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ是重楼中3种重要的皂苷类成分,越来越多的研究和报道显示其对多种肿瘤细胞均具有杀伤作用。但重楼在抗肿瘤作用的同时毒副作用研究较少,尤其是其单体类成分。本研究围绕重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的潜在毒性及其作用机制进行深入的探索。以期为中药重楼的临床合理应用以及基于重楼皂苷单体的药物研发提供借鉴和参考。研究方法:（1）从细胞、模式生物-斑马鱼、动物3个层面进行了重楼皂苷单体的毒性评价。首先选择了 9种细胞考察了重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的细胞毒性情况,包括3种肝细胞（HepaRG、HL-7702和WRL-68细胞）,3种肾细胞（HK-2、HKC和293T细胞）和3种心脏细胞（H9c2、HUVEC和HCMEC细胞）;利用模式生物-斑马鱼模型考察不同浓度重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ对斑马鱼生存率的影响,确定了 LC50、LC10与最大非致死浓度（MNLC）;体视荧光显微镜观察重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ给药前后肝脏、肾脏和心脏的形态,统计斑马鱼的肾脏水肿率、心率和心包水肿率。利用Image-Pro Plus 5.1.0软件统计给予重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ前后斑马鱼肝脏面积和荧光强度、肾脏面积和荧光强度、心脏SV-BA距离,评价重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的潜在肝、肾、心毒性;通过HE染色和TUNEL染色观察斑马鱼给药前后肝组织病理情况及肝细胞凋亡情况;通过小鼠的急性毒性实验,得出LC50值。然后进行小鼠血清生化检测和组织病理切片分析。各个层面数据相互支持,补充验证,使研究基础更加全面可靠,结论更加合理。（2）选用HepaRG细胞研究重楼皂苷Ⅰ的肝细胞毒性机制。利用酶标仪、流式细胞仪、倒置荧光显微镜等对HepaRG细胞乳酸脱氢酶（LDH）释放、DAPI染色、活性氧（ROS）、线粒体膜电位（MMP）、细胞凋亡及细胞周期等进行测定,利用Western blot对凋亡相关蛋白进行检测;选用HUVEC细胞研究重楼皂苷Ⅰ的心血管毒性机制。从抑制新血管生成和促进心血管细胞凋亡两个方面评价了重楼皂苷Ⅰ的血管毒性机制。进行了LDH释放、细胞迁移、细胞凋亡、DAPI染色、细胞周期以及体外血管生成等研究,测定了近30个相关蛋白的表达。（3）利用TMT标记定量蛋白质组学技术检测给药组和对照组小鼠肝脏组织中的差异蛋白,对差异蛋白进行GO及Pathway通路富集分析;利用STRING11.0构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络;采用IPA软件进一步筛选出与表型相关的潜在生物标志物;利用Q300靶向代谢组学技术研究给药组和对照组小鼠血清样本中内源性代谢物的变化情况。采用PCA、OPLS-DA等分析小鼠内源性代谢物的轮廓变化。比较给药前后小鼠血清样本代谢谱的差异,寻找与重楼皂苷Ⅰ致肝毒性相关的代谢差异物及代谢调控网络。使用Cytoscape对蛋白组学和代谢组学做关联分析。采用PCR和Western blot技术对肝毒性机制中的关键蛋白进行进一步的验证。研究结果:（1）重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ毒性实验结果:重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ均具有明显的细胞毒性,能显着的促进H9c2细胞外其余8种细胞的凋亡,且呈现浓度和时间依赖性。对于H9c2细胞,3种皂苷均呈现出低剂量促进增殖,高剂量抑制增殖的作用;斑马鱼实验结果:重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ对斑马鱼的LC50分别为121、213、570 ng/mL,LC10分别为109、178、456ng/mL,MNLC分别为99、146、357ng/mL;毒性器官评价方面,重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ对斑马鱼具有显着的肝脏毒性,能明显降低斑马鱼肝脏面积和荧光强度;重楼皂苷Ⅰ能显着影响斑马鱼的心率,提示其具有心血管毒性;重楼皂苷Ⅰ和Ⅶ能降低斑马鱼肾脏面积和荧光强度,具有一定的肾毒性,但3种皂苷均未造成肾水肿;斑马鱼病理切片显示重楼皂苷Ⅰ给药组的肝组织出现空泡和严重的肝细胞坏死;TUNEL染色结果显示重楼皂苷Ⅰ给药组出现了肝细胞凋亡;动物实验结果:小鼠体内实验发现,重楼皂苷Ⅰ具有体内毒性,其LC50为24.5 mg/kg;给药组血清中ALT、AST显着升高,SOD降低;给药组病理切片显示出显着的肝细胞损伤和脂肪样变性以及一定的心脏毒性。（2）重楼皂苷Ⅰ肝细胞毒性机制:重楼皂苷Ⅰ显着升高了 HepaRG细胞中ROS水平,引起MMP下降,Cyt c从线粒体向胞浆中释放,早期及晚期凋亡细胞增多,LDH的释放量升高。改变了周期蛋白P21、cyclinA、cyclinE和CDK2的表达,诱导细胞周期阻滞。并且明显激活了凋亡通路蛋白Fas、P53、caspase-3、caspase-8、caspase-9的表达,且呈现剂量依赖关系;重楼皂苷Ⅰ血管毒性机制:重楼皂苷Ⅰ显着促进了心血管细胞LDH的释放,抑制细胞迁移和血管生成,改变周期分布,诱导细胞凋亡。给药后的细胞中VEGFR2、p-VEGFR2、Src、p-Src、PI3K、Src、P38、PLCy 等近 30 种蛋白的表达均发生了改变。（3）蛋白组学结果:共筛选出302个差异蛋白,其中上调蛋白182个,下调蛋白120个。差异蛋白具有氧化还原酶活性、催化活性等分子功能,参与了脂肪酸代谢、有机酸的代谢、药物代谢、氧化还原过程等生物过程。主要分布在细胞质和细胞内膜结合细胞器包括线粒体、内质网等;Pathway结果显示,差异蛋白在细胞色素P450酶对药物的代谢、细胞色素P450对外源物质的代谢、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPARγ）等途径上富集程度较高;PPI网络分析发现差异蛋白主要聚集在三个功能区域,包括细胞色素P450酶、脂质代谢过程、氧化还原过程;IPA商业数据库筛选出9个与肝毒性相关的差异蛋白作为潜在生物标志物;代谢组学结果:给药组代谢物轮廓明显偏离对照组;通过多维和单维的差异代谢物的交集,筛选并初步鉴定出97种差异代谢物,25条代谢通路。结果归纳显示重楼皂苷Ⅰ造成了体内5个方面的代谢异常,包括氨基酸代谢、脂肪酸代谢、谷胱甘肽代谢、能量代谢、蛋白质合成;其中D-谷氨酰胺与D-谷氨酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,花生四烯酸代谢,氨酰tRNA生物合成等代谢通路影响值相对较高;代表性差异代谢物为花生四烯酸、焦谷氨酸、乙醇酸、酰基肉碱等。对全文中研究的重楼皂苷Ⅰ的肝毒性情况进行了综合分析,总结并推测了重楼皂苷Ⅰ造成肝毒性的机制。采用qPCR及Western blot验证了关键蛋白Bax、CYP1A2、P53、Fas的表达,对推测的肝损伤机制进行了初步验证。研究结论:（1）细胞实验研究发现重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ均具有肝脏、肾脏、心血管细胞毒性;斑马鱼实验研究确定了 3种皂苷中毒性最强的为重楼皂苷Ⅰ,毒性最明确的毒性靶部位是肝脏和心血管;斑马鱼肝脏病理切片、TUNEL染色,小鼠生化指标、病理切片检测进一步验证了重楼皂苷Ⅰ的肝脏和心脏毒性;（2）重楼皂苷Ⅰ肝细胞毒性机制为ROS应激通路和死亡受体通路介导的细胞凋亡;心血管毒性主要作用通路为VEGFR2激活的下游PI3K/AKT/mTOR、Src/eNOS、PLCy/ERK/MEK、P38信号通路,JAK2/STAT3信号传导通路和Bcl-2家族介导的凋亡通路,从诱导心血管细胞凋亡和抑制新生血管两方面产生心血管毒性。（3）蛋白质组学和代谢组学实验结果结合全文数据推测重楼皂苷Ⅰ诱导的肝毒性机制可能为CYP450酶和脂质代谢介导的线粒体功能障碍为主体的肝细胞损伤。药物影响了:①多种CYP450酶。主要包括Ⅰ相代谢酶CYP1A1、CYP1A2和Ⅱ相代谢酶GSTA3和UGT1A1表达紊乱,呈现下调趋势。药物在体内的水解、代谢过程被减慢,随着作用时间的延长,药物毒性反应增加。未被代谢的药物作用可能作用于线粒体,造成线粒体功能障碍;也很有可能是Ⅱ相药物代谢酶下调,产生的毒性代谢中间产物作用于线粒体,进一步产生了肝脏毒性;②脂质代谢。线粒体损伤后β-氧化的功能受到影响,体内的游离脂肪酸不能被氧化而转化成甘油三脂,导致了体内脂质的蓄积。同时ATP合成减少,供能障碍。脂质蓄积还能产生脂毒性进一步影响线粒体功能,产生过量ROS;③线粒体氧化应激。过量的ROS生成诱导线粒体氧化应激,释放Cyt c,升高Bax,降低Bcl-2,进而激活caspase家族导致肝细胞凋亡。Western blot验证结果显示药物代谢酶CYP1A2显着下调以及凋亡关键蛋白Bax表达上调。qPCR结果显示凋亡相关基因P53、Bax以及Fas的表达均显着上调,验证实验佐证了机制推论的合理性。
胡博[4]（2021）在《长链非编码RNA CYTOR通过调节miR-125b-5p/KIAA1522轴影响肝细胞癌增殖、凋亡和细胞周期的机制研究》文中研究表明背景:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一种原发性肝脏恶性肿瘤,在世界范围内发病率高、治疗效果欠佳。随着靶向治疗药物如索拉非尼、伦伐替尼,以及免疫治疗药物如免疫检查点抑制剂的出现,其预后得到一定的改善,但5年生存率仍旧不高。竞争性内源性RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）揭示了RNA间相互作用的新机制,即以长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）为主的非编码RNA通过竞争性共享微小RNA（microRNA,miRNA）来调节mRNA（messenger RNA,信使RNA）的表达,这种调节机制在癌症的发病机理中扮演了重要的角色。但是,ceRNA在HCC中的功能作用及调节机制仍未被完全解释,新的ceRNA调控轴亟待探究。lncRNA CYTOR是一种已被证实在多种肿瘤中发挥促进细胞增殖、迁移等作用的非编码基因,并可作为多种miRNA的内源性海绵。然而,lncRNACYTOR作为ceRNA在HCC发生、发展中的作用及调控网络目前仍不十分清楚。因此,本研究以lncRNACYTOR为起点,探索ceRNA调节机制在HCC中的应用。材料与方法:通过检索癌症基因组图谱数据库（The Cancer Genome Atlas,TCGA）,获得人类HCC的lncRNA、mRNA和miRNA数据集表达数据和相应临床信息。下载基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus database,GEO）数据库中GSE62232和GSE84402的HCC相关RNA数据用于后续验证。借助在线数据分析工具,分析lncRNA CYTOR在多种肿瘤类型及HCC相关数据集中的表达情况。借助R语言分析lncRNA CYTOR在TCGA数据库中HCC肿瘤组织及癌旁正常肝组织中的差异表达情况,以及其表达水平与TCGA数据库HCC患者总生存期（overall survival,OS）之间的关系。分析lncRNA CYTOR与常用临床病理参数,如性别、年龄、肿瘤分级、临床分期和T、N、M分期之间的关联性,并进一步整合这些参数,通过单因素及多因素Cox回归分析探究lncRNA CYTOR独立预测患者预后的能力。之后,识别TCGA数据库HCC样品中差异表达的miRNA,同时使用ENCORI软件（starbase3.0）预测目标lncRNA的靶向的miRNA,选择差异分析中表达下调的miRNA与预测的miRNA做交集后得出候选miRNA。同理,基于TCGA数据库分析HCC样品中差异表达的mRNA,并基于ENCORI软件使用6个数据库（PITA、miRNAmap、DIANA-microT、miRanda、PicTar 和 TargetScan）预测候选 miRNA 靶向的mRNA,选择差异分析中表达上调的mRNA与预测的mRNA做交集后得出候选的mRNA。使用基因集富分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）来识别与所筛选出的mRNA高表达相关的基因集和通路途径,探索其潜在的功能。结果:lncRNACYTOR在多种癌症的肿瘤组织（如结肠癌、肾透明细胞癌、膀胱尿路上皮癌等）及多个HCC相关数据集中（如GSE54236、GSE64041、GSE36376等）相较于癌旁组织表达上调。在TCGA数据库中,与癌旁正常组织相比,HCC组织中的lncRNACYTOR表达水平显着增高（P<0.001）;且高表达患者组的OS较低表达患者组显着缩短（P<0.001）。临床病理参数关联性分析显示,lncRNACYTOR的表达水平与病理分级（Grade）显着相关,且G2与G1（P<0.01）、G3与G2（P<0.05）、G3与G1（P<0.001）和G4与G1（P<0.05）之间存在显着性差异;该基因在临床Ⅱ期（StageⅡ）的表达水平较临床Ⅰ期（StageⅠ）显着上调（P<0.001）,在T2期及T4期的表达水平较T1期显着上调（P<0.001;P<0.05）。独立预后分析表明lncRNA可独立于上述临床参数来预测HCC患者的预后（P<0.05）。ENCORI软件分析得出miR-125b-5p可作为lncRNA CYTOR的靶向miRNA,后续6个数据库综合分析得出KIAA1522及PODXL可作为miR-125b-5p的候选靶向mRNA。对二者进行差异分析、生存分析及与miR-125b-5p的相关分析后,选择KIAA1522作为目标靶向mRNA。相较于癌旁组织,KIAA1522在GSE62232和GSE84402的HCC组织中表达显着上调（P<0.001）。GSEA富集分析结果表明,cell cycle信号通路、adherens junction信号通路、Notch信号通路、mTOR信号通路、Wnt信号通路、MAPK信号通路、VEGF信号通路、apoptosis信号通路和tight junction信号通路相关的基因集在高KIAA1522表达的表型中显着富集。结论:探究lncRNA的表达情况、生物学功能,构建新的lncRNA/miRNA/mRNA调控轴是研究HCC发病机制的有效手段。lncRNA在HCC组织中表达水平显着上调,与多种临床病理参数相关,且可作为HCC患者潜在的预后生物标志物。此外,lncRNA CYTOR可通过靶向miR-125b-5p进而调节KIAA1522的表达参与HCC的发生发展。背景:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一种由多种病因引起肿瘤,目前仍是人类最常见、最致命的恶性肿瘤之一。因此,寻找新的、临床上有效的HCC诊断及预后生物标志物至关重要。本实验的主要目的是基于第一部分生物信息学分析的结果,探索长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）CYTOR、微小RNA（microRNA,miRNA）miR-125b-5p 以及蛋白编码信使 RNA（messenger RNA,mRNA）KIAA1522的靶向调控作用及该调控轴在HCC发生、发展中的作用。材料与方法:通过脂质体将目的基因相关载体转染至正常肝细胞（HHL-5）及几种HCC细胞（SK-Hep-1、Hep3b和Huh-7）后,采用实时荧光定量聚合酶链式反应（real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）检测 HCC 细胞中 lncRNA CYTOR、miR-125b-5p和KIAA1522的表达,并筛选实验细胞。免疫组化检测KIAA1522在HCC组织及癌旁正常组织中的表达情况。采用双荧光素酶报告基因检测试验证实lncRNA CYTOR、miR-125b-5p和KIAA1522间的调控关系。之后,利用CCK-8细胞增殖毒性检测试剂盒（Cell Counting Kit-8,CCK-8）检测不同转染条件下HCC细胞的增殖情况,采用流式细胞仪分析转染后HCC细胞周期的变化,使用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidy l transferase mediated nick end labeling,TUNEL）观察转染后 HCC 细胞的凋亡情况;并通过蛋白免疫印迹实验（western blot,WB）分析检测细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡等相关蛋白的表达。结果:转染后,相较于HHL-5细胞,Hep3b细胞中上述基因的表达均是最为显着的,故选择Hep3b细胞进行下一步实验。双荧光素酶报告基因检测实验的结果显示miR-125b-5p mimic+CYTOR-wt 共转染组和miR-125b-5p mimic+KIAA1522-wt 共转染组Hep3b细胞的荧光素酶活性显着降低;lncRNA CYTOR可直接作用于miR-125b-5p,而miR-125b-5p可直接靶向KIAA1522。CCK-8实验结合WB检测结果显示敲低lncRNACYTOR抑制了 HCC细胞的增殖,并下调了 Ki-67和PCNA的蛋白表达;抑制miR-125b-5p或KIAA1522的过度表达则促进了细胞的增殖并上调了 Ki-67和PCNA的蛋白表达。流式细胞仪分析结合WB检测结果显示敲低lncRNA CYTOR 降低了 S期及G2/M期比值,下调了 cyclin D1及cyclin E等蛋白的表达而上调了 p21表达;抑制miR-125b-5p或KIAA1522的过度表达则升高了 S期及G2/M期比值,并上调了 cyclin D1等蛋白的表达并下调了 p21表达。TUNEL细胞凋亡检测结合WB检测提示敲低lncRNA CYTOR可促进Hep3b细胞凋亡,下调Bcl-2的表达同时上调 Bax 的表达及 cleaved caspase3/caspase 3、cleaved caspase9/caspase 9;而抑制miR-125b-5p或KIAA1522的过表达则抑制Hep3b细胞凋亡,上调Bcl-2的表达并下调 Bax 的表达及 cleaved caspase 3/caspase 3、cleaved caspase 9/caspase 9。结论:综上所述,HCC中过表达的lncRNA CYTOR可通过靶向抑制miR-125b-5p进而上调KIAA1522的表达水平,促进HCC细胞增殖、影响细胞周期并抑制细胞凋亡。本研究为肝细胞癌的发生机制注入了新的见解。
李文聪[5]（2021）在《益气活血方促进肝再生的作用及机制研究》文中研究说明肝再生（liver regeneration,LR）是指在多种物理、化学及生物因素造成肝脏损伤后,肝脏细胞（尤其肝细胞）迅速被激活,通过脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid,DNA）合成和有丝分裂增殖,重建肝脏组织结构,恢复肝功能的生理过程,该过程包括多种细胞增殖,是由多条通路、多种因素共同参与调控的复杂且精确的过程。目前,小鼠或大鼠部分肝切除术（partial hepatectomy,PH）是构建肝再生动物模型最常用的方法,此外,胆道结扎模型、化学所致肝毒性损伤或药理模型以及转基因动物模型等也广泛应用。临床上,PH已成为多数肝脏肿瘤患者的根治性方案,然而,肝脏肿瘤患者常常合并不同病因的肝炎、肝纤维化甚至肝硬化,尤其肝硬化患者,肝再生能力明显下降,增加了PH术后肝衰竭的发病率及病死率。因此,肝再生能力的提高将是PH术后患者良好治疗的基础,亦是其术后能够生存的关键。已有研究发现,胶原降解、肝细胞再生和血管重建是肝纤维化逆转的三大机制,可见肝纤维化的逆转也有赖于肝再生功能的提高。我国传统中医药在治疗肝纤维化方面取得了巨大的成果,多项研究已显示,丹参/丹参素、赤芍、扶正化瘀复方等中草药/中成药具有促进肝细胞增殖及再生的作用。益气活血方（Yiqi Huoxue recipe,YQHX）由丹参、赤芍、黄芪等中草药组成,既往研究发现,该方可调节自噬,抑制肝星状细胞的活化和胶原沉积,逆转四氯化碳（carbon tetrachloride,CCl4）诱导的大鼠肝纤维化。但尚缺乏其对肝再生影响的观察和研究。基于上述背景,本研究通过慢性乙型病毒性肝炎肝纤维化患者应用益气活血方治疗前后肝穿病理结果的对比分析,验证益气活血方促进肝再生、逆转肝纤维化的作用,并通过2/3PH术构建大鼠肝再生模型,以益气活血方对正常大鼠2/3PH术后肝再生的影响及其可能作用机制为研究切入点,以扶正化瘀复方冲剂（Fuzheng Huayu decoction,FZHY）作为阳性对照药物,运用病理形态学、分子生物学等方法动态分析大鼠2/3PH术后不同时间节点肝脏组织学、肝再生相关信号通路中细胞因子的变化,分析益气活血方对大鼠肝再生的作用。同时,以CCl4腹腔注射构建肝硬化大鼠模型,研究益气活血方在肝硬化模型中对肝再生的作用,为该方剂的临床应用提供理论依据。第一部分益气活血方促进肝再生改善肝纤维化的临床研究目的:验证益气活血方促进肝再生、改善肝纤维化的临床效果。方法:选择慢性乙型病毒性肝炎纤维化（F≥2）患者31例,分为恩替卡韦治疗组（ETV,n=18）、恩替卡韦联合益气活血方治疗组（YQHX+ETV,n=13例）,疗程24～52周。采用HE、Masson染色评定肝脏的炎症及纤维化程度;应用免疫组织化学染色方法测定肝脏细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、ki67、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）的蛋白表达水平。分析治疗前后肝脏生化学、肝纤维化逆转及肝再生情况。结果:YOHX+ETV和ETV治疗患者血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT）、谷氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase,AST）、谷氨酰转肽酶水平显着降低（P<0.05）,白蛋白水平显着增高（P<0.05）。YQHX+ETV治疗后纤维化分期显着下降（P<0.05）,肝组织Cyclin D1、ki67和PCNA的表达显着高于治疗前的水平（P<0.05）;ETV治疗患者肝组织Cyclin D1表达显着升高（P<0.05）,ki67的表达显着下降（P<0.05）,但肝纤维化无显着改善。小结:益气活血方联合ETV治疗可显着提高慢性乙型肝炎肝纤维化患者肝再生能力,并可逆转纤维化。第二部分益气活血方对大鼠部分肝切除术后肝再生的作用研究目的:明确益气活血方对大鼠肝再生的影响。方法:以2/3 PH术构建Wistar大鼠肝再生模型。选取SPF级雄性Wistar大鼠48只,随机分为4组:假手术组（Sham）、2/3肝部分切除术组（PH）、益气活血方+2/3肝部分切除术组（YQHX+PH）、扶正化瘀复方冲剂+2/3肝部分切除术组（FZHY+PH）。PH术前3天,Sham组和PH组大鼠给予0.90%氯化钠溶液（0.50ml/100g）灌胃,YQHX+PH组和FZHY+PH组大鼠分别YQHX（0.50ml/100g）和FZHY（0.50ml/100g）灌胃,每日1次。各组分别于PH术后24h、72h、96h、168h处死大鼠,切除全部肝组织称湿重,计算肝脏再生速度。应用免疫组织化学染色测定肝组织Cyclin D1的表达水平。结果:1.益气活血方可显着提高PH术后大鼠肝再生率PH术后,各组间大鼠肝再生率随时间的延长均呈递增趋势,YQHX+PH和FZHY+PH组的总体趋势较PH组明显增加,但两中药干预组组间比较均无显着差异（P>0.05）。PH术后24h,YQHX+PH组（25.41±4.03%）和FZHY+PH组（30.86±0.11%）大鼠肝再生率均显着高于PH组（14.20±2.02%,P<0.05）。PH术后96h,YQHX+PH组大鼠肝再生率较PH组显着升高（56.97±7.69%vs.38.96±4.21%,P<0.05）。PH术后168h,FZHY+PH组大鼠肝再生率较PH组显着升高（65.80±3.37%vs.53.02±4.32%,P<0.05）。2.益气活血方可显着提高PH术后大鼠肝脏Cyclin D1的表达PH术后24h、72h、96h和168h,PH组大鼠肝脏Cyclin D1的表达均显着高于Sham组（P<0.05）。其中PH术后24h,YQHX+PH和FZHY+PH组大鼠肝脏Cyclin D1的表达显着升高,但与PH组比较无统计学差异（P>0.05）。PH术后72h和96h,YQHX+PH组大鼠肝脏Cyclin D1的表达高于PH组,但无统计学差异（P>0.05）,FZHY+PH组大鼠肝脏Cyclin D1的表达显着高于PH组和YQHX+PH组（P<0.05）。术后168h,各组大鼠肝脏Cyclin D1的表达均较之前的时间节点下降,YQHX+PH和FZHY+PH组大鼠肝脏Cyclin D1的表达较Sham组升高,但与PH组比较无统计学差异（P>0.05）。小结:益气活血方可显着提高PH术后大鼠肝再生率及肝组织Cyclin D1的表达水平,促进肝脏细胞分裂、增殖,迅速恢复原有的体积和功能。第三部分益气活血方促进大鼠部分肝切除术后肝再生的分子机制研究目的:探讨益气活血方促进PH术后大鼠肝再生的相关机制。方法:动物模型的建立及分组处理同第二部分。应用免疫组织化学染色方法测定肝脏c-jun的表达水平;采用western blot方法测定肝组织c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）1/2、p-JNK1/2、c-jun、p-c-jun、B细胞淋巴瘤-2（B cell lymphoma-2,Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2associated x-protein,Bax）的蛋白表达水平;采用PCR方法测定肝组织JNK1、JNK2、c-jun、Bcl-2、Bax的m RNA表达水平。结果:1.PH术后不同时间节点各组大鼠肝脏c-jun表达量的比较PH术后24h、72h、96h,PH组大鼠肝脏c-jun的表达显着高于Sham组（P<0.05）,而PH术后168h,PH组大鼠肝脏c-jun表达量与Sham组比较无显着差异（P>0.05）。PH术后24h,与PH组比较,YQHX+PH组大鼠肝脏c-jun的表达下降,但无统计学差异（P>0.05）,FZHY+PH组大鼠肝脏c-jun的表达量显着下降（P<0.05）。PH术后72h,YQHX+PH组大鼠肝脏c-jun的表达量显着低于PH组和FZHY+PH组（P<0.05）。PH术后96h,YQHX+PH组和FZHY+PH组大鼠肝脏c-jun的表达显着高于PH组（P<0.05）,且YQHX+PH组大鼠肝脏c-jun的表达量较FZHY+PH组显着增高（P<0.05）。PH术后168h,各组大鼠肝脏c-jun的表达量均减低,FZHY+PH组大鼠肝脏c-jun表达量较PH组和YQHX+PH组显着升高（P<0.05）。2.PH术后不同时间节点各组大鼠肝脏JNK通路相关因子的表达在PH术后不同时间节点,YQHX及FZHY干预对JNK1、JNK2及c-jun的肝脏m RNA表达水平无显着影响。经JNK1/2和c-jun蛋白水平的检测,发现磷酸化指标在肝再生过程中起到了主导作用。在PH术后24h、72h及168h,PH组大鼠肝组织p-JNK1/2蛋白表达水平明显高于Sham组（P<0.05）,而YQHX+PH组和FZHY+PH组大鼠肝组织p-JNK1/2蛋白表达量显着高于PH组（P<0.05）,FZHY+PH组的表达量显着高于YQHX+PH组（P<0.05）。在PH术后96h,PH组大鼠肝组织p-JNK1/2蛋白表达水平明显高于Sham组（P<0.05）,FZHY+PH组表达量显着高于PH组和YQHX+PH组（P<0.05）,而YQHX+PH组与PH组比较无明显差异（P>0.05）。在p-c-jun肝组织蛋白表达水平方面,结果显示:在PH术后72h,PH组大鼠肝组织p-c-jun蛋白水平显着高于Sham组（P<0.05）,YQHX+PH组和FZHY+PH组表达量显着高于PH组（P<0.05）,其中FZHY+PH组表达量更高,但与YQHX+PH组比较无统计学意义（P>0.05）。在PH术后24h,各组p-c-jun的表达趋势与PH术后72h相同,但各组间差异均无统计学意义（P>0.05）。在PH术后96h和168h,PH组大鼠肝组织p-c-jun蛋白表达量显着高于Sham组（P<0.05）,FZHY+PH组表达量显着高于PH组和YQHX+PH组（P<0.05）,而YQHX+PH组与PH组比较无明显差异（P>0.05）。3.PH术后不同时间节点各组大鼠肝脏凋亡通路相关因子的表达在PH术后24h、72h、96h和168h,PH组大鼠肝脏Bax蛋白表达水平均显着低于Sham组（P<0.05）,FZHY+PH组大鼠肝脏Bax蛋白表达水平均显着低于PH组和YQHX+PH组（P<0.05）。值得注意的是,在PH术后24h和96h,YQHX+PH组大鼠肝脏Bax蛋白表达水平显着低于PH组（P<0.05）,而在PH术后72h和168h,与PH组比较无明显差异（P>0.05）。各组大鼠肝脏Bax的m RNA表达趋势与蛋白表达基本相同。在PH术后24h、72h、96h和168h,PH组大鼠肝脏Bcl-2蛋白表达水平均显着高于Sham组（P<0.05）。在PH术后24h、72h、96h,YQHX+PH组和FZHY+PH组大鼠肝脏Bcl-2蛋白表达水平均显着高于PH组（P<0.05）;在PH术后168h,仅FZHY+PH组大鼠肝脏Bcl-2蛋白表达水平显着高于PH组（P<0.05）。除了PH术后24h,YQHX+PH组大鼠肝脏Bcl-2蛋白表达水平显着高于FXHY+PH（P<0.05）外,其余各时间点,均显着低于FZHY+PH组（P<0.05）。Bcl-2的m RNA表达趋势与蛋白表达趋势相近。小结:1.益气活血方可显着提高PH术后大鼠肝组织p-JNK1/2、p-c-jun的蛋白表达水平,通过JNK通路促进肝再生;2.益气活血方可显着降低PH术后大鼠肝组织Bax的表达,同时显着升高Bcl-2的表达,进而抑制肝细胞凋亡的发生,促进肝再生。第四部分益气活血方促进肝再生改善肝纤维化的作用及机制研究目的:探讨益气活血方对肝硬化中肝再生的影响及机制。方法:选取雄性SPF级Wistar大鼠36只,随机分为4组:（1）对照组（Control）:橄榄油腹腔注射（0.20ml/100g）,2次/周,同时予1ml/100g生理盐水灌胃,1次/日;（2）模型组（CCl4）:30%CCl4橄榄油溶液腹腔注射（0.20ml/100g）,2次/周,同时予1ml/100g生理盐水灌胃,1次/日;（3）益气活血方干预组（CCl4+YQHX）:30%CCl4橄榄油溶液腹腔注射加益气活血方（3.40g/10ml/kg·d）冲剂灌胃;（4）扶正化瘀方干预组（CCl4+FZHY）:30%CCl4橄榄油溶液腹腔注射加扶正化瘀（0.46g/10ml/kg·d）冲剂灌胃。喂养8周后,各组大鼠在10%水合氯醛麻醉下被处死,留取血清,测定血清ALT、AST水平;采用HE、Masson染色评定肝脏的炎症及纤维化程度;采用western blot方法测定肝组织Cyclin D1的蛋白表达水平;应用免疫组织化学染色方法测定肝脏细胞角蛋白19（cytokeratin 19,CK19）、Cyclin D1、ki67、PCNA的表达水平。结果:1.益气活血方显着降低肝硬化大鼠血清转氨酶水平模型组大鼠血清ALT（80.14±35.73U/L vs.41.43±9.76U/L）和AST（258.40±90.80U/L vs.114.33±15.47U/L）水平显着高于对照组（P<0.05）。益气活血方与扶正化瘀复方冲剂的干预可显着改善CCl4造成的ALT（55.67±17.91 U/L,63.20±27.60 U/L）和AST（138.50±47.31 U/L,178.50±42.24 U/L）升高,其中AST水平较CCl4组比较均显着下降（P<0.05）,但两种中药复方干预组比较均无统计学意义（P>0.05）。2.益气活血方可显着改善实验大鼠肝纤维化程度对照组大鼠肝组织结构完整,肝细胞排列整齐;模型组大鼠肝小叶结构破坏,炎性细胞增多,部分肝细胞脂肪变性;纤维组织增生,形成大小不等的假小叶;CCl4+YQHX组大鼠肝组织纤维增生,肝小叶被破坏,可见小灶状炎性浸润;CCl4+FZHY组正常肝小叶结构破坏,分割成大小不等的假小叶。但总体来看,益气活血方和扶正化瘀复方冲剂干预组纤维间隔较模型组纤细,假小叶体积明显较模型组增大,可见益气活血方可显着改善CCl4诱导的肝纤维化程度,并有效促进肝脏再生。3.益气活血方显着上调肝硬化大鼠肝再生基因的表达在肝硬化模型组发现CK19标记阳性的Hering管,即为胆管反应,主要集中在汇管区。而益气活血方及扶正化瘀复方冲剂干预组并未显着上调胆管反应。Western blot结果显示,CCl4组大鼠肝组织Cyclin D1的蛋白表达显着低于对照组（P<0.05）,CCl4+YQHX组大鼠肝组织Cyclin D1的蛋白表达水平显着高于CCl4组及CCl4+FZHY组（P<0.05）。进一步通过免疫组织化学方法测定大鼠肝脏Cyclin D1的表达水平,结果与western blot的趋势基本相同。此外,免疫组织化学染色结果显示,CCl4组大鼠肝脏ki67及PCNA的表达水平显着低于对照组（P<0.05）,YQHX和FZHY干预组较CCl4组显着上调了大鼠肝脏ki67及PCNA的表达（P<0.05）,其中CCl4+YQHX组显着高于CCl4+FZHY组（P<0.05）。小结:1.益气活血方可显着改善CCl4诱导的肝组织炎症及肝纤维化程度;2.益气活血方可显着提高肝组织Cyclin D1、ki67、PCNA的表达水平,促进肝硬化大鼠的肝细胞再生,起到改善肝脏炎症、纤维化的作用。结论:1.临床应用益气活血方可显着改善慢性乙型病毒性肝炎肝纤维化的纤维化程度,加强肝细胞再生,为临床中终末期肝病的治疗提供了理论依据;2.通过大鼠2/3PH术构建肝再生模型,及CCl4腹腔注射诱导的肝硬化模型,均证实益气活血方具有显着促进肝细胞再生的作用,并显着改善肝硬化的肝再生能力,逆转肝纤维化;3.益气活血方有望成为肝硬化肝再生方面的治疗药物,其具体机制仍有待进一步的验证。
杜金童[6]（2020）在《CDK1在胰腺癌中的生物学功能、临床意义及相关抑制剂研究》文中进行了进一步梳理研究背景胰腺癌是恶性程度极高的消化道肿瘤之一,其总体5年生存率不足8%。近年来,随着研究的深入,越来越多的治疗方案被不断提出,但胰腺癌患者的预后并未得到明显的改善。目前,传统的化疗药物对胰腺癌患者疗效有限,胰腺癌的靶向治疗也一直举步维艰。2005年FDA批准了“吉西他滨+厄洛替尼”用于局部晚期不可切除或有远处转移的胰腺癌患者的治疗,然而仅约10天的生存期提高使得厄洛替尼在胰腺癌治疗中难以取得较大的临床获益。2019年12月,FDA批准了 PARP抑制剂奥拉帕利用于携带BRCA基因突变的转移性胰腺癌患者的维持治疗,然而携带有BRCA基因突变的转移性胰腺癌患者人群数量有限。因此,有必要继续探索新的抗胰腺癌靶点,为未来胰腺癌的临床治疗研究提供一定的基础。细胞周期蛋白依赖性激酶（Cyclin-dependent kinases,CDKs）在细胞周期的调控中处于核心地位。目前,在人体中已发现的CDKs包含20个亚型,其中CDK1～6和CDK14～18直接参与细胞周期调控,其它CDKs则主要调控基因转录。已有研究证实,CDKs的异常激活可导致细胞周期进程的失调,从而导致肿瘤细胞异常增殖。近年来,已有多个CDK4/6的选择性小分子抑制剂被FDA批准上市,用于晚期或转移性乳腺癌患者。有研究发现了 CDKs在胰腺癌的发生和发展中具有重要作用。CDK5在胰腺腺癌中过度表达,可促进胰腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移。KRAS突变可刺激CDK8的表达,通过Wnt/β-catenin信号通路促进胰腺癌细胞的侵袭和迁移。在众多的CDKs中,CDK1则具有不可替代的位置。在正常生理条件下,CDK1与Cyclin A或Cyclin B形成复合物,调控细胞周期G2/M,而CDK1异常激活则与肿瘤的发生发展密切相关。CDK1在结直肠癌、肝癌和肺癌等多种肿瘤中过表达,并且与患者的不良预后有关。CDK1选择性抑制剂RO3306对白血病、乳腺癌等多种肿瘤细胞具有良好的抗增殖活性。然而CDK1在胰腺癌中的研究仍然较少。有研究发现,磷酸酶CDC25B的抑制剂可抑制胰腺癌细胞生长,并观察到CDK1磷酸化水平增高以及细胞G2/M期阻滞。CDK1在胰腺癌患者组织中高表达,且与患者较差的预后有关。目前仍未有研究阐明抑制CDK1对胰腺癌生长的影响,CDK1在胰腺癌中的生物学功能与临床意义有待进一步探索。此外,尽管已有研究发现CDKs泛抑制剂具有良好的抗胰腺癌活性,然而靶向CDK1的选择性抑制剂RO3306在胰腺癌中的抗肿瘤活性及作用机制尚未见报道。因此,仍需进一步研究CDK1成为抗胰腺癌靶点的潜力,探索新的抗胰腺癌策略。另一方面,细胞凋亡的异常调控也是胰腺癌发生发展的重要原因。有研究表明,抗凋亡蛋白Mcl-1在胰腺癌中异常表达,抑制Mcl-1可抑制胰腺癌的生长。对Mcl-1蛋白及内源性细胞凋亡通路的调控是CDKs抑制剂诱导肿瘤细胞凋亡的重要机制。因此,可通过研究CDK1抑制剂RO3306对Mcl-1蛋白的影响,进而分析其作用机制。另外,多项研究表明,Mcl-1小分子抑制剂具有较好的抗胰腺癌活性。因此,进一步筛选新型Mcl-1抑制剂有助于将来探索新的抗胰腺癌策略。研究目的本课题旨在研究CDK1作为新型抗胰腺癌靶点的潜力,探索新的抗胰腺癌策略,为将来胰腺癌的临床转化研究提供一定的基础。首先,研究CDK1在胰腺癌中的生物学功能;其次,研究CDK1在胰腺癌患者中的表达及临床意义;再次,进一步对已知的CDK1抑制剂RO3306进行抗胰腺癌活性研究,通过研究RO3306对Mcl-1等相关蛋白的影响以探索其作用机制;最后,筛选新型CDK1抑制剂和Mcl-1抑制剂,并对其进行靶点抑制活性及抗胰腺癌活性研究。研究方法和结果第一部分敲减CDK1对胰腺癌体内外生长的影响1、首先,通过生物信息学分析、基因敲减和细胞增殖实验,发现敲减CDK1能够在体外显着抑制胰腺癌细胞的增殖。（1）基于TCGA数据中170余例胰腺癌患者的mRNA表达谱数据,通过生物学信息学GEPIA平台分析了CDK1-CDK10在胰腺癌组织和正常组织中的表达情况,发现CDK1、CDK2和CDK6在胰腺癌患者组织中高表达（p<0.01）,且其高表达与患者差的生存期相关（p<0.05）。（2）通过Celigo细胞增殖实验,分别研究了敲减CDK1、CDK2和CDK6对Panc-1胰腺癌细胞增殖的影响,发现敲减CDK1对Panc-1细胞增殖的抑制效果最为明显（p<0.005）。2、进一步研究了敲减CDK1对胰腺癌细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡及细胞迁移的作用。通过MTT细胞增殖实验,发现了敲减CDK1可抑制胰腺癌细胞（Panc-1和Aspc-1）的增殖（p<0.05）。使用流式细胞仪进行细胞周期和细胞凋亡实验,结果表明,敲减CDK1可将胰腺癌细胞（Panc-1和Aspc-1）阻滞在G2/M期（p<0.05）,但对细胞凋亡无明显影响（p>0.05）。通过Transwell实验表明,敲减CDK1能够抑制Panc-1细胞迁移（p<0.05）,而对Aspc-1细胞的迁移没有影响（p>0.05）。3、使用肿瘤异种移植模型研究了敲减CDK1对裸鼠胰腺癌体内生长的影响,结果表明,与对照组相比,敲减CDK1的瘤体生长速度及重量均低于对照组（p<0.05）。第二部分CDK1在胰腺癌患者中的表达与临床意义1、首先,通过免疫组化方法检测了 CDK1在90例胰腺癌术后患者的胰腺癌组织及对应的60例癌旁组织中的表达。结果显示,在44例有配对癌旁组织的患者中,CDK1在胰腺癌患者中高表达,其细胞浆表达高于细胞核表达（p<0.05）。2、进一步分析了 73例胰腺癌患者中CDK1的表达与临床病理特点的关系。结果示,CDK1在细胞浆中的表达与组织学分级、p53和Ki67表达有关（p<0.05）;CDK1在细胞核中的表达与p53表达有关（p<0.05）。3、最后,分析了 CDK1的表达与73例胰腺癌患者预后的关系。Kaplan-Meier曲线法及单因素分析表明,CDK1细胞浆高表达的患者具有更短的总生存期（p<0.05）。COX多因素分析表明组织学分级和N分期是总生存期的独立预后因子（p<0.05）,而CDK1不是总生存期的独立预后因子（p>0.05）。CDK1细胞核表达与胰腺癌患者的总生存期无关（p>0.05）。第三部分CDK1抑制剂RO3306的抗胰腺癌活性及作用机制研究1、首先,研究了 RO3306在胰腺癌细胞中的抗增殖活性。(1通过Western-blot实验,检测了 CDK1在五种胰腺癌细胞系中的表达,发现了 CDK1在SW1990细胞系中表达量最高。（2）通过SRB细胞增殖实验,发现了 RO3306能够抑制五种胰腺癌细胞的增殖,且其对SW1990细胞的抗增殖效果最佳（IC50=2.9 μM）,优于化疗药物5-Fu（IC50=4.9 μM）。2、进一步研究了 RO3306抗胰腺癌的作用机制。（1）使用流式细胞仪检测了 RO3306对SW1990细胞周期的影响,结果发现,RO3306能够将细胞周期阻滞在G2/M和S期（p<0.05）。通过Western-blot实验表明,RO3306可能是通过激活p53-p21信号通路实现对细胞周期S期的阻滞。（2）使用流式细胞仪检测了RO3306对SW1990细胞凋亡的影响,结果发现,RO3306能够诱导SW1990细胞凋亡（p<0.005）。通过Western-blot实验表明,RO3306可能通过影响Bcl-2-Bax信号通路以及调控Mcl-1蛋白的磷酸化水平,进而诱导胰腺癌细胞凋亡。3、最后,通过SRB抗增殖实验研究了 RO3306与四种化疗药物（5-Fu、吉西他滨、紫杉醇或奥沙利铂）的联合用药效果,结果表明RO3306能够增强5-Fu和紫杉醇对胰腺癌细胞SW1990的抗增殖活性。第四部分新型CDK1抑制剂及Mcl-1抑制剂的研究1、通过计算机虚拟筛选平台进行了 CDK1抑制剂以及Mcl-1抑制剂的筛选。综合运用三维药效团和分子对接技术,分别构建了针对CDK1小分子抑制剂和Mcl-1小分子抑制剂的虚拟筛选平台,对商业化合物库中21万个分子进行了虚拟筛选。通过对筛选到的命中化合物进行活性测试,发现了初步具有CDK1抑制活性的化合物,以及与阳性药Gossypol活性相当的Mcl-1抑制剂M02（Ki=5.4μM）和 M08（Ki=0.53μM）。2、进一步研究了新型Mcl-1抑制剂M02和M08的抗胰腺癌活性。Western-blot实验表明,Mcl-1蛋白在五种胰腺癌细胞中均有表达,在SW1990细胞中表达最高。SRB实验表明,M02和M08在胰腺腺癌细胞SW1990中具有一定的抗增殖活性（IC 50=44.4-48.4μM）。细胞周期和细胞凋亡实验表明,M02和M08不仅能够诱导SW1990细胞凋亡（p<0.005）,而且可将细胞周期阻滞在G2/M期（p<0.05）。进一步的联合用药实验表明,M08能够提高吉西他滨或5-Fu对胰腺癌细胞的抗增殖活性,而M02对吉西他滨或5-Fu的抗增殖活性影响较小。研究结论1、敲减CDK1对胰腺癌细胞具有抗增殖活性,可将胰腺癌细胞阻滞在G2/M期,并且在小鼠肿瘤异种移植模型中具有较好的肿瘤生长抑制效果,表明CDK1有望成为新型抗胰腺癌靶点。2、CDK1在胰腺癌患者中高表达,其细胞浆表达高于细胞核表达。细胞浆表达与肿瘤级别、p53表达和Ki67表达等临床病理特征有关,细胞核表达与p53的表达有关。细胞浆高表达CDK1的患者具有更短的总生存期。提示CDK1可作为胰腺癌潜在的生物学标志物。3、CDK1抑制剂RO3306在多种胰腺癌细胞系中均具有抗增殖活性。RO3306对胰腺癌细胞周期阻滞的作用与p53-p21信号通路有关。RO3306还可通过影响Bcl-2-Bax信号通路以及下调Mcl-1蛋白的磷酸化水平,进而诱导胰腺癌细胞凋亡。此外,RO3306能够增强5-Fu或紫杉醇对胰腺癌细胞的抗增殖活性。4、发现了新型具有CDK1抑制活性的化合物,以及与阳性药活性相当的Mcl-1新型抑制剂M02和M08。特别是,M02和M08具有抗胰腺癌活性,且M08可增强吉西他滨或5-Fu对胰腺癌细胞的抗增殖活性。
曾琼瑶[7]（2020）在《百里酚通过Wnt/β-catenin信号通路抗结直肠癌作用研究》文中研究指明目的:结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是最常见的恶性肿瘤之一。过去5-10年中由于饮食结构的改变、老龄化及环境污染等因素,我国结直肠癌的发病率和死亡率迅速上升。对于早期结直肠癌患者手术切除是首选的治疗方案。但在我国约20-25%的结直肠癌患者被诊断时即为IV期出现了转移,另有25%左右的患者在治疗期间出现转移,失去根治性手术治疗的机会,该类型的患者如果不给予任何治疗,其平均生存期仅为6-9个月。除外科手术外,药物治疗在结直肠癌的生长和转移抑制中具有重要的地位。目前化疗联合西妥昔单抗或者贝伐珠单抗在一定程度上能够阻止结直肠癌的进展,但由于肿瘤细胞耐药性的出现及药物本身的毒副作用,导致长期效果差,结直肠癌的术后复发率和死亡率仍较高。因此,寻找一种新的、安全有效的药物显得尤为重要。百里酚（Thymol）是一种天然酚类化合物,在食品、医疗和化妆品领域被认为是安全无毒的。既往研究表明,百里酚在肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等多种肿瘤中具有明显的抑制作用,但其作用机制尚不明确。而且,百里酚对结直肠癌是否具有抑制作用、潜在作用机制如何,目前研究甚少。方法:首先利用甲醇对百里香全株进行提取,然后经柱层析及半制备型HPLC纯化后获得活性成分百里酚。利用CCK-8检测百里酚对HCT116和Lovo细胞的增殖抑制及对FHC的细胞毒性作用;平板克隆形成实验检测百里酚对HCT116和Lovo细胞克隆形成能力的影响;流式细胞术检测百里酚对HCT116和Lovo细胞周期分布和凋亡的影响;Transwell迁移和侵袭实验检测百里酚对HCT116和Lovo细胞迁移和侵袭能力的抑制作用。利用针对β-catenin的过表达质粒和小干扰RNA（small interference RNA,si RNA）将HCT116和Lovo细胞中的β-catenin基因分别进行过表达和沉默,进一步分析改变β-catenin的表达对百里酚CRC细胞增殖、迁移和侵袭抑制作用的影响。另外通过皮下注射和尾静脉注射HCT116细胞构建裸鼠皮下移植瘤模型和结直肠癌转移模型,分析百里酚对裸鼠移植瘤生长和结直肠癌血行播散转移的抑制作用。进一步我们采用实时荧光定量PCR、免疫印迹以及免疫组化的方法,从m RNA水平和蛋白水平上检测百里酚对CRC细胞内、瘤体组织及肺转移组织中增殖、凋亡及转移相关基因表达的影响。结果:百里香中主要活性成分-百里酚对HCT116和Lovo细胞的增殖具有明显的抑制作用,且这种抑制作用呈现出一定的时间和浓度依耐性。百里酚（0-120mg/ml）对正常结直肠粘膜FHC细胞无明显的细胞毒作用。与对照组相比较,百里酚各组中细胞克隆形成数明显降低,有显着统计学差异（P<0.001）。细胞周期实验结果显示,百里酚能够有效地将HCT116和Lovo细胞阻滞于G0/G1期。Hoechst33258染色和流式细胞技术分析结果显示百里酚能够诱导CRC细胞的凋亡。Transwell小室迁移和侵袭实验结果显示百里酚能够降低HCT116和Lovo细胞的迁移和侵袭能力,且具有剂量依耐性。百里酚能够通过激活Bax/Bcl-2信号通路诱导CRC细胞凋亡。此外,百里酚能够通过抑制Wnt/β-catenin通路的激活,抑制CRC细胞上皮-间质转化（EMT）、侵袭和转移;β-catenin的过表达能够部分阻遏百里酚对结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT抑制作用,反之,β-catenin的沉默能够增加百里酚对结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT抑制作用。另外,在体内百里酚能够剂量依耐性的抑制裸鼠移植瘤的生长,同时抑制结直肠癌HCT116细胞的肺转移,其机制可能与百里酚抑制Wnt/β-catenin通路的激活,从而抑制CRC细胞增殖、迁移、侵袭和EMT有关。结论:本研究以百里酚为研究对象,采用多种研究方法证实了百里酚体内外对结直肠癌细胞生长和转移的抑制作用及机制。百里酚能有效的将HCT116和Lovo细胞周期阻滞于G0/G1期,从而抑制增殖。百里酚能够通过下调CRC细胞内Bcl-2/Bax比值,诱导HCT116和Lovo细胞凋亡。百里酚能够降低HCT116和Lovo的迁移和侵袭能力,阻碍EMT进程。在体内百里酚能够抑制裸鼠移植瘤的生长及结直肠癌的肺转移。百里酚抑制CRC细胞的增殖、转移和EMT,其机制可能与百里酚抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性有关,β-catenin介导了百里酚的抗结直肠癌作用。综上所述,百里酚能够显着抑制结直肠癌的细胞增殖、侵袭、转移和EMT,其机制可能是通过抑制Wnt/β-catenin通路来实现的;百里酚有望能够作为单一药物或与其他抗癌药物联合用于CRC的治疗。
郭长权[8]（2020）在《细胞因子bFGF和LIF对雏鸡原始卵泡发育的调节作用及其机理的研究》文中研究表明家禽卵巢中早期卵泡的发育与卵母细胞及颗粒细胞之间的物质传递和信息通讯密切相关,而细胞因子在其中扮演了重要的媒介作用。细胞因子能促进细胞的增殖和生长,而且还可以调节细胞的迁移、分化和有丝分裂。细胞因子包含很多种类,各种细胞因子经由旁分泌或自分泌以及卵母细胞和颗粒细胞间的物质运输、信号通讯对卵泡形成发育产生作用:调控颗粒细胞的增殖分化、激素分泌和其他细胞因子生成等。而细胞因子参与家禽早期卵泡生长发育相关的研究很少。同时家禽的繁殖性能是畜牧业上比较关注的问题,而早期卵泡发育对于最终的繁殖性能是有决定性影响的。所以对细胞因子在早期卵泡发育中的调控作用开展深入研究是有意义的。本实验以雏鸡为研究对象,检测雏鸡卵泡发育中基因的表达量变化以及利用已经建立的体外培养的卵巢模型来研究两种细胞因子,即碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor,bFGF）和白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor,LIF）在雏鸡早期卵泡发育中的调控作用和其中的机理,为家禽产蛋性能的后续研究提供理论依据。1.雏鸡卵巢早期卵泡发育中miRNA表达的变化雏鸡早期卵泡的形成和发育涉及许多基因表达的变化。本实验以不同日龄的雏鸡卵巢作为实验样品,利用RNA-seq的实验技术来研究早期雏鸡卵巢中miRNA的表达。取D0、D4、D7的雏鸡卵巢各三个,用于RNA-seq分析。在RNA-seq建库结果中对miRNA进行质检,筛选出有显着差异表达的基因来进行RT-qPCR的验证,验证结果是趋势一致,RNA-seq结果可信。结果显示,与D0卵巢组织相比较,D4卵巢组织共有10种表达显着差异的miRNA,包括8条上调基因,2条下调基因;与D0卵巢组织相比较,D7卵巢组织共有50种表达显着差异的miRNA,包括35条上调基因,15条下调基因;与D4卵巢组织相比较,D7卵巢组织共有18种表达显着差异的miRNA,包括12条上调基因,6条下调基因。对差异表达miRNA的靶基因做汇总,结果显示,D4vs D0中,靶基因与细胞的抗凋亡和细胞因子作用相关;D7vs D0中,靶基因与细胞抗凋亡、细胞因子作用和激素合成相关;D7vs D4中,靶基因与缝隙连接、细胞因子作用、MAPK信号通路相关,其中涉及的靶基因有GJA5、HLF、MAP3K14等。上述结果表明,miRNA可通过缝隙连接、细胞抗凋亡、卵巢发育信号相关通路和细胞因子作用等方面来影响雏鸡卵泡的发育。2.雏鸡卵巢早期卵泡发育中lncRNA表达的变化本实验以不同日龄的雏鸡卵巢作为实验材料,用RNA-seq来分析雏鸡卵巢中lncRNA水平随时间的变化。并像上一章一样筛选出有显着差异表达的基因并用RT-qPCR来进行验证,使用GO数据库把有表达差异的lncRNA靶基因做富集处理分析,使用KEGG数据库给表达差异的lncRNA靶基因做通路注释。结果显示,与D0卵巢组织相比较,D4卵巢组织共有106种表达显着差异的基因,包括65条上调基因,41条下调基因;与D0卵巢组织相比较,D7卵巢组织共有305种表达显着差异的基因,包括214条上调基因,91条下调基因;与D4卵巢组织相比较,D7卵巢组织共有109种表达显着差异的基因,包括52条上调基因,57条下调基因。RT-qPCR的验证实验证实了 RNA-seq结果的可靠性。GO数据库的结果表明差异表达的lncRNA靶基因大多富集于抗原受体介导的信号通路、细胞因子的合成和非膜跨蛋白酪氨酸激酶活性等生理活动,KEGG数据库结果显示差异的表达lncRNA靶基因大多与细胞因子-细胞因子受体间的相互作用、细胞黏附分子和卵泡发育相关的信号通路有关。其中D7 vs D4结果显示,不少靶基因为细胞因子或细胞因子受体的lncRNA表达明显增加,其中包括了FGF2,IL6R以及GDF9等。上述结果表明,lncRNA可通过细胞因子、细胞连接以及卵泡生长相关的信号通路等方面促进早期雏鸡卵泡的形成和发育,其中相关的细胞因子有FGF2,LIF和GDF9等。3.bFGF对雏鸡原始卵泡发育的调控作用许多细胞因子在雌性原始卵泡激活的过程中发挥重要的促进作用。而RNA-seq结果显示,D4雏鸡卵巢发育到D7的过程中表达明显增加的lncRNA的靶基因中有FGF2。同时先前也有研究报道,FGF2在大鼠中可以促进原始卵泡的激活。FGF2在禽类调节原始卵泡激活的作用研究很少。本实验检测了细胞因子bFGF和FSH对原始卵泡发育的相互刺激作用及其可能的信号机制,包括蛋白激酶B（AKT）和细胞外调节蛋白激酶（ERK）通路。对4日龄雏鸡卵巢进行3天的bFGF和FSH处理,观察bFGF和FSH对卵泡发育的影响。本研究采用HE染色、免疫组化、实时定量PCR（qRT-PCR）、Western blot、免疫荧光等方法。在鸡早期卵巢中发现,bFGF受体（FGFR1）mRNA表达和原始卵泡激活的时间进程之间有变化的相关性。bFGF与FSH的相互刺激作用在原始卵泡的激活过程中表现为促进颗粒细胞的增殖、减少细胞的凋亡。FGFR1的抑制剂SU5402减弱了 bFGF的促进作用,降低了生长卵泡的比例。AKT和ERK信号通路介导了 bFGF和FSH促进原始卵泡激活的作用。上述研究结果表明,细胞因子bFGF和FSH通过PI3K-AKT和ERK信号通路对鸡早期卵巢颗粒细胞的增殖和抗凋亡产生相互刺激作用,促进原始卵泡激活。4.LIF对雏鸡原始卵泡发育的调控作用RNA-seq结果显示,D4雏鸡卵巢发育到D7的过程中表达明显增加的lncRNA的靶基因也有IL6R,IL6R与LIF的受体组成有关。LIF对雏鸡原始卵泡激活的作用研究较少。本实验检测了细胞因子LIF和bFGF在原始卵泡发育过程中的作用和相互之间的关联,以及涉及到的信号通路,包括了 AKT、ERK和Wnt/β-catenin信号通路。对出雏后4天的雏鸡进行卵巢组织的取材,并用LIF和bFGF单独或者联合处理3天,观察卵泡发育情况的变化。本研究采用HE染色、免疫组化、Western blot、透射电镜、免疫荧光等实验方法。结果显示,LIF以及其受体（LIFR）蛋白表达的变化与早期卵泡的发育过程之间有一定的时间相关性。LIF和bFGF的对于促进原始卵泡的激活有一定的协同作用,而具体的表现是促进卵泡细胞的增殖、同时减少卵泡细胞的凋亡。而LIFR的抑制剂SC144能够抑制LIF的这种促进原始卵泡激活的作用。同时AKT和ERK信号通路也参与了 LIF和bFGF这两者促增殖抑凋亡的过程,而Wnt/β-catenin信号通路在其中也有一定的介导作用。上述研究结果表明,LIF和bFGF可通过促进雏鸡卵泡细胞的增殖和抑制其凋亡,并产生协同作用从而促进原始卵泡的激活,这一过程中会涉及到AKT,ERK和Wnt/β-catenin信号通路。本实验利用RNA-seq来检测雏鸡卵巢卵泡发育过程中基因表达量的变化,将有显着表达差异的lncRNA与miRNA汇总并进行对比补充,发现在雏鸡原始卵泡激活阶段,靶基因与FGF2和LIF有关的lncRNA表达显着增加;利用已建立的卵巢组织体外培养模型,研究bFGF和LIF在雏鸡卵巢中原始卵泡激活的调控作用,发现FSH与bFGF发挥协同作用,可通过PI3K-AKT和ERK信号通路对雏鸡早期卵巢中颗粒细胞的增殖和抗凋亡的刺激作用从而促进卵泡激活;而LIF和bFGF可通过协同作用促进卵泡细胞增殖并抑制其凋亡,再通过AKT、ERK和Wnt/β-catenin信号通路促进卵泡激活。这些结果将为后续深入研究家禽卵泡发育的调控机制以及提高家禽产蛋性能奠定一定的理论基础。
刘香佚[9]（2020）在《S4TdR/UVA对乳腺癌细胞MCF-7的抑制作用及机制研究》文中进行了进一步梳理乳腺癌是一种受雌性激素影响的高异质性恶性肿瘤疾病,发病率位居我国乃至全球女性癌症发病率第一位,且发病率呈逐年上升趋势,已成为危害全球女性身心健康的最大威胁之一。目前常见的乳腺癌治疗方法存在着创面大、靶向差、副作用明显、受适面窄、预后差和易复发等缺陷,常达不到最佳治疗效果。有研究表明四硫胸苷（4-thiothymidine,S4TdR）具有低毒性和弱诱变性等特点,当与长波长紫外光（UVA）联合作用时,可有选择性地破坏某些表皮类癌细胞的DNA,诱导细胞凋亡。这种具有前景的新兴光动力疗法是否可以应用与乳腺癌的治疗,目前尚未见相关研究报道。为探讨S4TdR/UVA联合作用对乳腺癌治疗的可行性,本论文选用人乳腺癌细胞系MCF-7为实验材料,通过体外暴露实验,检测S4TdR/UVA对MCF-7细胞活性及周期的影响,并对P53诱导的P53-Mdm2-P21和P53-Bax/B cl-2-Caspase 3两条通路进行定量分析,探究S4TdR/UVA联合作用对MCF-7活性影响的分子机制。细胞活性检测发现,10-5及10-6M浓度S4TdR与15KJ/m2 UVA协同作用,均可对由雌二醇（Estradiol,E2）引起的MCF-7细胞增殖产生极显着性的抑制作用,且10-6M的抑制效果更为明显。细胞周期的检测进一步证明,10-6M S4TdR/UVA对MCF-7的抑制作用可能是通过引起G1期细胞数增加和S期细胞数减少,进而影响细胞的复制过程所致。对凋亡相关分子的定量分析表明,10-6MS4TdR/UVA能够促进P53的表达,同时抑制P53的负反馈调节因子Mdm2的表达,并激活下游的P21,使其与P53构成细胞周期检查点,引起细胞周期阻滞;另外,P53还能激活下游的促凋亡蛋白Bax,并抑制其拮抗分子Bcl-2,通过上调Bax/Bcl-2的表达比例,激活下游凋亡执行蛋白Caspase-3,诱导细胞凋亡。本课题的研究首次通过体外实验证明了 S4TdR/UVA联合作用对乳腺癌细胞MCF-7具有显着性增殖抑制效果,为新型高靶向抗肿瘤光敏剂的开发提供了基础研究数据,为阐明S4TdR/UVA对乳腺癌细胞靶向治疗的分子机制提供了依据。
任苎[10]（2020）在《茶树花皂苷Chakasaponin Ⅰ、Ⅳ对人卵巢癌细胞增殖抑制及其分子机制》文中研究表明茶树花是一种新资源食品,其产量在我国十分可观,但目前利用率较低。皂苷作为茶树花中的重要功能成分和特征性组分,具有多种生物活性,其抗肿瘤的活性也渐渐受到关注。但由于茶树花皂苷分离难度较大,至今为止关于其抗肿瘤活性的研究较少。卵巢癌是世界范围内致死率高、预后差的恶性肿瘤。本文在前人研究基础上,分离纯化并得到了高纯度茶树花皂苷（Purified tea flower saponins,PTFSs）,且对其进行了结构鉴定。本文以卵巢癌细胞为体外模型,研究了PTFSs对其增殖生长的抑制作用及相关分子机制。主要成果如下:1.分离、纯化并鉴定了茶树花皂苷PTFSs的主要成分。PTFSs中Chakasaponin I占80.1%,Chakasaponin IV占8.1%,Floratheasaponin A占1.4%。2.探明了PTFSs可有效抑制卵巢癌细胞的增殖生长。MTS法的结果显示经过24小时3.5μg/mL PTFSs处理之后,卵巢癌细胞A2780/CP70和3-OVCAR存活率分别降至20.28%和6.52%,而正常卵巢细胞IOSE-364存活率为53.64%。3.明确了PTFSs诱导卵巢癌细胞发生S期阻滞及其分子机制。作用机理为PTFSs下调癌细胞中Cyclin A2、CDK2和CyclinD1蛋白表达,导致CyclinECDK2复合体减少,从而引起癌细胞的S期阻滞。4.阐明了PTFSs促进卵巢癌细胞发生内凋亡的分子机制。采用Hoechst33342染色、AnnexinV-FITC和PI双染法、JC-1染色法和blotWestern等实验证实了PTFSs可以诱导A2780/CP70和3-OVCAR细胞发生凋亡,又通过caspase酶活检测实验、blotWestern进一步在分子水平上证明该诱导作用通过内凋亡而非外凋亡途径。5.发现了p53蛋白在PTFSs诱导的卵巢癌细胞内凋亡和S期阻滞中起的关键作用。在前述实验的基础上,采用p53抑制剂PFT-α预处理和p53 siRNA转染的方法,反向验证了p53蛋白的关键作用。6.研究了PTFSs对卵巢癌干细胞的抑制作用及机理。PTFSs能抑制卵巢癌A2780/CP70干细胞增殖生长、减弱其干细胞特性,而且可以引起其凋亡。同时发现其分子作用机制为,PTFSs下调A2780/CP70中干细胞β-Catenin、p-GSK-3β蛋白表达,上调p-β-catenin蛋白表达,从而实现PTFSs对A2780/CP70干细胞的抑制作用。综上,本文首次从茶树花中分离出含有80.1%Chakasaponin I的茶树花皂苷PTFSs,并发现其对卵巢癌细胞的抑制作用,包括诱导卵巢癌细胞发生p53通路相关的S期阻滞和内源性凋亡。本文还发现了PTFSs对卵巢癌干细胞的增殖及其干性的抑制作用。本文为茶树花皂苷的抗肿瘤功效研究提供了新的理论依据。
二、VES抑制Raji细胞增殖中对CDK2和Bcl-2/Bax蛋白表达的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、VES抑制Raji细胞增殖中对CDK2和Bcl-2/Bax蛋白表达的影响（论文提纲范文）
（1）三七总皂苷对视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖、凋亡及PI3K/AKT信号通路的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词 |
| 前言 |
| 第1部分 三七总皂苷对Y79 细胞凋亡的影响 |
| 1.1 背景与目的 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.2.1 细胞系 |
| 1.2.2 实验药品及试剂 |
| 1.2.3 实验仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 细胞培养及实验分组 |
| 1.3.2 三七总皂苷对Y79 细胞增殖的影响 |
| 1.3.3 三七总皂苷对Y79 细胞凋亡的影响 |
| 1.3.4 三七总皂苷对Y79 细胞凋亡基因m RNA表达的影响 |
| 1.3.5 三七总皂苷对Y79 细胞凋亡基因蛋白表达的影响 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 三七总皂苷抑制Y79 细胞的增殖 |
| 1.4.2 三七总皂苷促进Y79 细胞的凋亡 |
| 1.4.3 三七总皂苷影响Y79 细胞凋亡基因m RNA的表达 |
| 1.4.4 三七总皂苷诱导Y79 细胞凋亡基因蛋白表达的改变 |
| 1.5 讨论 |
| 1.5.1 三七总皂苷对Y79 细胞增殖的抑制作用 |
| 1.5.2 三七总皂苷对Y79 细胞凋亡的诱导作用 |
| 1.6 结论 |
| 第2部分 三七总皂苷对Y79 细胞PI3K/AKT信号通路的影响 |
| 2.1 背景与目的 |
| 2.2 主要试剂和耗材 |
| 2.2.1 细胞系 |
| 2.2.2 实验药品及试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 PI3K抑制剂LY294002对Y79 细胞增殖的影响 |
| 2.3.2 PI3K抑制剂对Y79 细胞凋亡的影响 |
| 2.3.3 三七总皂苷对Y79 细胞PI3K/AKT通路蛋白的影响 |
| 2.3.4 抑制PI3K/AKT通路对Y79 细胞凋亡相关蛋白的影响 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 LY294002 具有抑制Y79 细胞增殖的作用 |
| 2.4.2 LY294002 与三七总皂苷能协同促进Y79 细胞的凋亡 |
| 2.4.3 三七总皂苷影响Y79 细胞PI3K/AKT通路蛋白表达 |
| 2.4.4 抑制PI3K/AKT通路影响Y79 细胞凋亡蛋白的表达 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 抑制PI3K/AKT通路能促进Y79 细胞的凋亡 |
| 2.5.2 三七总皂苷对PI3K/AKT信号通路具有抑制作用 |
| 2.5.3 三七总皂苷抑制PI3K/AKT通路诱导Y79 细胞凋亡 |
| 2.6 结论 |
| 第3部分 三七总皂苷对Y79 细胞的细胞周期影响 |
| 3.1 背景与目的 |
| 3.2 主要试剂和耗材 |
| 3.2.1 细胞系 |
| 3.2.2 实验药品及试剂 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞复苏 |
| 3.3.2 实验分组 |
| 3.3.3 三七总皂苷处理Y79 细胞后对细胞周期的影响 |
| 3.3.4 三七总皂苷对Y79 细胞周期基因m RNA表达的影响 |
| 3.3.5 三七总皂苷对Y79 细胞周期基因蛋白表达的影响 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 三七总皂苷诱导Y79 细胞阻滞于G0/G1期 |
| 3.4.2 三七总皂苷影响Y79 细胞中周期相关m RNA的表达 |
| 3.4.3 三七总皂苷影响Y79 细胞中周期相关蛋白的表达 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 细胞周期的调控机制 |
| 3.5.2 三七总皂苷对Y79 细胞的周期阻滞作用 |
| 3.6 结论 |
| 问题与展望 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 综述 植物源性天然产物抗视网膜母细胞瘤研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（2）IL-7促进抗CD19 CAR-T细胞的增殖作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 aAPCs或磁珠在体外扩增抗CD19 CAR-T细胞的评估 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 研究对象 |
| 2. 材料与仪器 |
| 3. 实验方法 |
| 结果 |
| 1. aAPCs或磁珠刺激抗CD19 CAR-T细胞增殖 |
| 2. aAPCs或磁珠刺激抗CD19 CAR-T细胞后的亚群分化 |
| 3. aAPCs或磁珠刺激抗CD19 CAR-T细胞后的功能验证 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分：IL-7加强抗CD19 CAR-T细胞增殖 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 研究对象 |
| 2. 材料与仪器 |
| 3. 实验方法 |
| 结果 |
| 1. IL-7促进抗CD19 CAR-T细胞的增殖 |
| 2. IL-7影响CD4~+/CD8~+CAR-T细胞的比例 |
| 3. IL-7对CAR-T细胞的记忆与耗竭影响 |
| 4. IL-7对CAR-T细胞的细胞因子分泌与杀瘤功能影响 |
| 5. IL-7刺激培养的CAR-T细胞在体内的杀瘤功能 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 IL-7调控miRNA/CDKN1A促进抗CD19 CAR-T细胞增殖 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 研究对象 |
| 2. 材料与仪器 |
| 3. 实验方法 |
| 结果 |
| 1. 测序验证 |
| 2. qPCR验证miRNA与mRNA表达 |
| 3. IL-7能通过抑制CDKN1A的表达促进CAR-T细胞周期S期增加 |
| 4. IL-7在T细胞中的作用 |
| 5. IL-7通过miRNA-98-5p影响CAR-T细胞CDKN1A的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 伦理审查批件-科研项目审批表 |
| 综述 抗CD19 CAR-T细胞的临床应用及副反应 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（3）重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性评价及重楼皂苷Ⅰ的肝毒性机制探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 重楼的药效成分、药理作用和不良反应研究现状 |
| 1 药效成分 |
| 2 药理作用 |
| 3 不良反应研究现状 |
| 4 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 综述二 中药药源性肝损伤机制研究进展 |
| 1 CYP代谢 |
| 2 线粒体稳态 |
| 3 氧化损伤 |
| 4 细胞凋亡 |
| 5 胆汁淤积 |
| 6 Ca~(2+)浓度平衡破坏 |
| 7 免疫激活介导的炎症因子释放 |
| 8 特异反应 |
| 9 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 技术路线图 |
| 第一章 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的体内外毒性评价 |
| 第一节 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的细胞毒性实验 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第二节 模式生物-斑马鱼评价重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第三节 重楼皂苷Ⅰ的小鼠毒性实验研究 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第四节 小结与讨论 |
| 1 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的细胞毒性实验 |
| 2 模式生物-斑马鱼评价重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性 |
| 3 重楼皂苷Ⅰ的小鼠毒性实验研究 |
| 本章总结与讨论 |
| 第二章 重楼皂苷Ⅰ的细胞毒性机制研究 |
| 第一节 肝细胞毒性机制研究 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第二节 心血管细胞毒性机制研究 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第三节 小结与讨论 |
| 1 肝细胞毒性机制研究 |
| 2 心血管毒性机制研究 |
| 本章总结 |
| 第三章 基于蛋白组学和代谢组学探索重楼皂苷Ⅰ的体内肝毒性机制 |
| 第一节 TMT标记定量蛋白质组学 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 生物信息分析 |
| 6 机制分析 |
| 7 PPI网络 |
| 8 潜在生物标志物 |
| 第二节 Q300靶向代谢组学 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 通路富集 |
| 6 通路分析 |
| 7 潜在生物标志物 |
| 第三节 小结与讨论 |
| 1 TMT标记定量蛋白质组学 |
| 2 Q300靶向代谢组学 |
| 3 蛋白组学-代谢组学关联分析 |
| 第四节 重楼皂苷Ⅰ肝毒性机制验证 |
| 1 动物组织Western blot验证 |
| 2 斑马鱼qPCR实验验证 |
| 3 小结与讨论 |
| 结语 |
| 1 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的体内外毒性评价 |
| 2 重楼皂苷Ⅰ的细胞毒性机制研究 |
| 3 重楼卓苷Ⅰ的蛋白组学和代谢组学研究 |
| 4 重楼皂苷Ⅰ肝毒性机制推测与分析 |
| 5 不足与展望 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）长链非编码RNA CYTOR通过调节miR-125b-5p/KIAA1522轴影响肝细胞癌增殖、凋亡和细胞周期的机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 第一部分: 应用生物信息学方法筛选新的肝细胞癌相关的lncRNA/miRNA/mRNA调控轴 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第三章 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分: lncRNA CYTOR/miR-125b-5p/KIAA1522调控轴在肝细胞癌细胞系中的作用 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第三章 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 非编码RNA在肝细胞癌发生与发展中的调节作用及临床应用(文献综述) |
| 第一章 引言 |
| 第二章 作为ceRNA的ncRNA及其它ncRNA在肝细胞癌发展中的可能作用及机制 |
| 第三章 ncRNA在HCC诊断及预后中的临床应用 |
| 第四章 结论、局限性和展望 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（5）益气活血方促进肝再生的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 益气活血方促进肝再生改善肝纤维化的临床研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 益气活血方对大鼠部分肝切除术后肝再生的作用研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 益气活血方促进大鼠部分肝切除术后肝再生的分子机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 益气活血方促进肝再生改善肝纤维化的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 JNK信号通路在肝再生中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 中医药对肝硬化及肝再生机制影响的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）CDK1在胰腺癌中的生物学功能、临床意义及相关抑制剂研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 1. 胰腺癌的靶向治疗现状 |
| 2. 细胞周期蛋白依赖性激酶CDKs在肿瘤中的研究 |
| 3. 抗凋亡蛋白Mcl-1 |
| 4. 研究方案 |
| 5. 参考文献 |
| 第一部分 敲减CDK1对胰腺癌体内外生长的影响 |
| 1. 引言 |
| 2. 实验材料与方法 |
| 3. 实验结果与讨论 |
| 4. 小结 |
| 5. 参考文献 |
| 第二部分 CDK1在胰腺癌患者中的表达及临床意义 |
| 1. 引言 |
| 2. 实验材料与方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 参考文献 |
| 第三部分 CDK1抑制剂抗胰腺癌活性与及作用机制研究 |
| 1. 引言 |
| 2. 实验材料与方法 |
| 3. 实验结果与讨论 |
| 4. 小结 |
| 5. 参考文献 |
| 第四部分 新型CDK1抑制剂和相关抗凋亡蛋白Mcl-1抑制剂的研究 |
| 1. 引言 |
| 2. 实验材料与方法 |
| 3. 实验结果与讨论 |
| 3.1 CDK1小分子抑制剂的虚拟筛选 |
| 3.2 Mcl-1小分子抑制剂的虚拟筛选 |
| 3.3 Mcl-1抑制剂M02和M08的抗胰腺癌活性 |
| 4. 小结 |
| 5. 参考文献 |
| 综述: CDKs在胰腺癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| English manuscript Ⅰ Structure-based virtual screening, biological evaluation and biophysical study of novel Mcl-1 inhibitors |
| English manuscript Ⅱ Recent progress in development of cyclin-dependent kinase 7 inhibitors for cancer therapy |
（7）百里酚通过Wnt/β-catenin信号通路抗结直肠癌作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语索引 |
| 第一章 绪论 |
| 1 结直肠癌的发病率和死亡率 |
| 2 百里酚在肿瘤中的研究进展 |
| 2.1 百里酚抑制肿瘤细胞增殖 |
| 2.2 百里酚诱导肿瘤细胞凋亡 |
| 2.3 百里酚影响细胞周期进展 |
| 2.4 百里酚在肿瘤转移中的抑制作用 |
| 2.5 百里酚增加肿瘤组织放疗敏感性 |
| 3 Wnt/β-catenin信号通路生物学功能 |
| 3.1 Wnt/β-catenin信号通路与结直肠癌 |
| 3.2 Wnt/β-catenin与 NF-κB信号通路 |
| 3.3 Wnt/β-catenin与 PI3K/Akt/m TOR信号通路 |
| 3.4 Wnt/β-catenin通路调节EMT |
| 4 总结 |
| 5 本课题的研究目的及意义 |
| 6 技术路线图 |
| 第二章 百里酚提取及体外对人结直肠癌HCT116和Lovo细胞增殖抑制和凋亡诱导作用研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞和主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器与耗材 |
| 2.1.3 植物样品 |
| 2.1.4 常用溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 百里酚提取 |
| 2.2.2 细胞复苏、培养、冻存 |
| 2.2.3 药物配制 |
| 2.2.4 CCK-8 法检测百里酚对HCT116、Lovo细胞增殖和FHC细胞活力的影响 |
| 2.2.5 细胞克隆形成实验 |
| 2.2.6 百里酚对HCT116和Lovo细胞凋亡的影响 |
| 2.2.7 百里酚对结直肠癌HCT116和Lovo细胞周期的干预作用 |
| 2.2.8 qRT-PCR检测百里酚处理后人结直肠癌HCT116、Lovo细胞中凋亡相关基因Bcl-2和Bax m RNA表达的变化 |
| 2.2.9 Western blot检测百里酚处理对人结直肠癌HCT116、Lovo细胞中凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3和cleaved-PARP表 |
| 2.2.10 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 百里酚结构鉴定 |
| 3.2 百里酚对结直肠癌细胞增殖的影响 |
| 3.2.1 百里酚对HCT116、Lovo细胞增殖的抑制作用 |
| 3.2.2 百里酚对FHC的细胞毒性作用 |
| 3.3 百里酚对HCT116和Lovo细胞克隆形成能力的影响 |
| 3.4 Hoechst33258 检测百里酚对HCT116和Lovo细胞凋亡的影响 |
| 3.5 百里酚对结直肠癌HCT116和Lovo细胞的凋亡诱导效应 |
| 3.5.1 百里酚对HCT116细胞凋亡的影响 |
| 3.5.2 百里酚对Lovo细胞凋亡的影响 |
| 3.6 百里酚对结直肠癌HCT116和Lovo细胞周期的影响 |
| 3.6.1 百里酚对HCT116细胞周期的影响 |
| 3.6.2 百里酚对Lovo细胞周期的影响 |
| 3.7 百里酚对结直肠癌HCT116和Lovo细胞中凋亡相关分子m RNA表达的影响 |
| 3.8 百里酚对结直肠癌HCT116和Lovo细胞中凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 百里酚体外抑制人结直肠癌HCT116、Lovo细胞转移作用及机制 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞和主要试剂 |
| 2.1.2 主要实验仪器与耗材 |
| 2.1.3 相关试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞的冻存、复苏、传代方法 |
| 2.2.2 不同浓度的百里酚对人结直肠癌HCT116、Lovo细胞迁移能力的影响 |
| 2.2.3 不同浓度的百里酚对人结直肠癌HCT116、Lovo细胞侵袭能力的影响 |
| 2.2.4 Western blot检测百里酚对人结直肠癌HCT116、Lovo细胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、snail蛋白表达的变化 |
| 2.2.5 统计学方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 百里酚对结直肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响 |
| 3.1.1 百里酚对HCT116细胞迁移能力的影响 |
| 3.1.2 百里酚对Lovo细胞迁移能力的影响 |
| 3.1.3 百里酚对HCT116细胞侵袭能力的影响 |
| 3.1.4 百里酚对Lovo细胞侵袭能力的影响 |
| 3.2 百里酚对人结直肠癌HCT116和Lovo细胞中EMT相关蛋白表达的影响 |
| 3.2.1 百里酚对人结直肠癌HCT116 细胞中EMT的影响 |
| 3.2.2 百里酚对人结直肠癌Lovo细胞中EMT关键蛋白的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 百里酚通过抑制结直肠癌细胞内wnt/β-catenin信号通路的激活抑制细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验细胞和主要试剂 |
| 2.2 主要仪器与耗材 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 主要试剂的配制 |
| 2.3.2 质粒转化 |
| 2.3.3 菌种的活化 |
| 2.3.4 扩大培养 |
| 2.3.5 质粒的抽提 |
| 2.3.6 质粒转染和转染后细胞功能试验 |
| 2.3.7 RNA干扰 |
| 2.3.8 CCK-8法检测β-catenin在百里酚抑制结直肠癌细胞增殖中的作用 |
| 2.3.9 Transwell检测β-catenin在百里酚结直肠癌细胞迁移和侵袭能力抑制中的作用 |
| 2.3.10 Western blot |
| 2.3.11 qRT-PCR |
| 2.3.12 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 百里酚对结直肠癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路活性的影响 |
| 3.1.1 百里酚处理后结直肠癌细胞中β-catenin、C-Myc、cyclin D1、survivin基因m RNA表达的变化 |
| 3.1.2 百里酚对结直肠癌HCT116和Lovo细胞中β-catenin、c-myc、cyclin D1、survivin蛋白表达的影响 |
| 3.2 转染结直肠癌HCT116和Lovo细胞中β-catenin的蛋白表达 |
| 3.2.1 β-catenin-siRNA对HCT116及Lovo中β-catenin 蛋白表达的影响 |
| 3.2.2 pc DNA3.1-β-catenin过表达质粒转染对HCT116及Lovo中β-catenin蛋白表达的影响 |
| 3.3 β-catenin在百里酚抑制结直肠癌细胞生长中的作用 |
| 3.3.1 β-catenin过表达降低百里酚对结直肠癌细胞生长的抑制作用 |
| 3.3.2 沉默β-catenin能够增加百里酚对结直肠癌细胞生长抑制作用 |
| 3.4 β-catenin在百里酚抑制结直肠癌细胞转移中的作用 |
| 3.4.1 β-catenin过表达减弱百里酚对结直肠癌细胞迁移和侵袭的抑制作用 |
| 3.4.2 沉默β-catenin能够增加百里酚对结直肠癌细胞迁移和侵袭的抑制作用 |
| 3.5 百里酚通过抑制β-catenin信号通路诱导细胞凋亡和抑制转移 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 百里酚对人结直肠癌细胞裸鼠体内成瘤及转移的影响及作用机制的研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验动物和药物 |
| 2.2 实验主要试剂 |
| 2.3 主要试剂的配制 |
| 2.4 主要仪器与耗材 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 裸鼠皮下移植瘤模型的建立、分组及给药方法 |
| 3.3 建立裸鼠尾静脉转移模型 |
| 3.4 动物组织石蜡切片及HE染色 |
| 3.5 qRT-PCR方法检测瘤体组织中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、β-catenin、c-myc、cyclin D1、survivin、Bcl-2及Bax基因mRNA的表达 |
| 3.6 Western blot检测瘤体组织中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、β-catenin、c-myc、cyclin D1、survivin、Bcl-2及Bax蛋白的表达情况 |
| 3.7 免疫组织化学(IHC)检测不同处理组裸鼠移植瘤中ki-67的表达情况 |
| 3.8 结肠癌细胞HCT116 裸鼠移植瘤TUNEL凋亡检测 |
| 3.9 qRT-PCR方法检测转移肺组织中E-cadherin、Vimentin、Snail及β-catenin m RNA的表达 |
| 3.10 免疫组织化学(IHC)检测转移肺组织中β-catenin、Vimentin及E-cadherin的表达情况 |
| 3.11 统计学分析方法 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 百里酚抑制裸鼠HCT116移植瘤的生长 |
| 4.2 百里酚对结肠癌细胞HCT116裸鼠移植瘤组织形态结构的影响 |
| 4.3 百里酚对结肠癌HCT116细胞裸鼠移植瘤组织中Ki-67蛋白表达的影响 |
| 4.4 TUNEL染色检测各组移植瘤组织中细胞凋亡情况 |
| 4.5 百里酚对裸鼠移植瘤组织中增殖、转移相关蛋白表达的影响 |
| 4.6 裸鼠体内血行播散脏器转移观察 |
| 4.7 百里酚对HCT116 细胞肺转移瘤组织中E-cadherin、Vimentin、Snail、β-catenin m RNA表达的影响 |
| 4.8 百里酚对肺转移瘤组织中上皮性标记E-cadherin蛋白表达的影响 |
| 4.9 百里酚对肺转移瘤组织中间质性标记Vimentin蛋白表达的影响 |
| 4.10 百里酚对肺转移瘤组织中β-catenin蛋白表达的影响 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第六章 结论、创新点、存在的问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A:攻读学位期间发表论文和国际会议论文摘要 |
| 附录 B:攻读学位期间获奖情况 |
（8）细胞因子bFGF和LIF对雏鸡原始卵泡发育的调节作用及其机理的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 禽类卵泡生长情况和概述 |
| 1.1.1 鸡胚卵巢发育概述 |
| 1.1.2 鸡原始卵泡发生概述 |
| 1.1.3 鸡原始卵泡发育激活概述 |
| 1.1.3.1 PTEN/PI3K/AKT/FOXO3信号通路 |
| 1.1.3.2 抗缪勒氏管激素 |
| 1.2 细胞因子对早期卵泡发育的调控 |
| 1.2.1 成纤维细胞生长因子家族 |
| 1.2.2 白血病抑制因子 |
| 1.2.3 血管内皮生长因子 |
| 1.2.4 骨形态发生蛋白家族 |
| 1.2.4.1 BMPs |
| 1.2.4.2 GDF9 |
| 1.2.5 胰岛素样生长因子家族 |
| 1.2.6 神经生长因子 |
| 1.2.7 激活素、抑制素和卵泡抑素 |
| 1.3 激素对早期卵泡发育的调控 |
| 1.3.1 性腺激素 |
| 1.3.2 促性腺激素 |
| 1.3.3 生长激素 |
| 1.4 miRNA在早期卵巢发育中的作用 |
| 1.4.1 miRNA的作用方式 |
| 1.4.2 miRNA对雌性生殖的作用 |
| 1.5 lncRNA在早期卵巢发育中的作用 |
| 1.5.1 lncRNA的作用方式 |
| 1.5.2 lncRNA对雌性生殖的作用 |
| 1.6 本研究的目的和内容 |
| 1.6.1 研究目的和意义 |
| 1.6.2 研究目标和内容 |
| 1.6.3 技术路线 |
| 第二章 雏鸡卵巢早期卵泡发育中miRNA表达的变化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 主要器材 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 卵巢的获取 |
| 2.2.5 RNA的提取 |
| 2.2.6 RNA质量及浓度的检测 |
| 2.2.7 文库的构建及质量的检测 |
| 2.2.8 cDNA的合成 |
| 2.2.9 qRT-PCR |
| 2.2.10 测序数据的处理分析 |
| 2.2.11 差异表达基因的筛选 |
| 2.2.12 差异表达基因的聚类分析及富集分析 |
| 2.2.13 差异表达基因的靶基因预测 |
| 2.2.14 数据的处理分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 检测结果总表 |
| 2.3.2 RNA质量的鉴定 |
| 2.3.3 测序数据的质量评估及过滤 |
| 2.3.4 sRNA长度的筛选 |
| 2.3.5 与参考序列的比较 |
| 2.3.6 差异表达miRNA的筛选 |
| 2.3.7 RNA-seq结果的验证 |
| 2.3.8 不同发育阶段卵巢中差异表达miRNA的比较 |
| 2.3.9 miRNA及其主要靶基因的时间表达变化 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 雏鸡卵巢早期卵泡发育中lncRNA表达的变化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 主要器材 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 卵巢的获取 |
| 3.2.5 RNA的提取 |
| 3.2.6 RNA质量及浓度的检测 |
| 3.2.7 文库的构建及质量的检测 |
| 3.2.8 cDNA的合成 |
| 3.2.9 qRT-PCR |
| 3.2.10 测序数据的处理分析 |
| 3.2.11 差异表达基因的筛选 |
| 3.2.12 差异表达基因的聚类分析及富集分析 |
| 3.2.13 差异表达基因的靶基因预测 |
| 3.2.14 数据的处理分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 测序数据的质量评估与比较 |
| 3.3.2 差异表达lncRNA的筛选 |
| 3.3.3 RNA-seq结果的验证 |
| 3.3.4 lncRNA共定位基因的富集分析 |
| 3.3.5 lncRNA共表达基因的富集分析 |
| 3.3.6 不同发育阶段卵巢中差异表达lncRNA的比较 |
| 3.3.7 相关mRNA的差异表达 |
| 3.3.8 lncRNA及其主要靶基因的时间表达变化 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 bFGF对雏鸡原始卵泡发育的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 主要器材 |
| 4.2.3 主要试剂及配制 |
| 4.2.4 卵巢的获取 |
| 4.2.5 卵巢组织的培养和药物处理 |
| 4.2.6 制片及HE染色 |
| 4.2.7 免疫组化 |
| 4.2.8 RNA的提取 |
| 4.2.9 cDNA的合成 |
| 4.2.10 普通PCR及qPCR |
| 4.2.11 BrdU实验 |
| 4.2.12 TUNEL染色 |
| 4.2.13 Westen blot分析 |
| 4.2.14 数据的处理分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 FGFR1在雏鸡卵巢中定位及其表达的变化 |
| 4.3.2 bFGF在雏鸡卵巢中的定位 |
| 4.3.3 bFGF体外处理剂量的筛选 |
| 4.3.4 bFGF对卵泡细胞增殖的影响 |
| 4.3.5 bFGF对卵泡细胞凋亡的影响 |
| 4.3.6 bFGF对原始卵泡激活相关基因表达的影响 |
| 4.3.7 bFGF对原始卵泡激活的影响 |
| 4.3.8 FSHR在雏鸡卵巢中的定位 |
| 4.3.9 bFGF和FSH联合处理对卵泡细胞增殖和凋亡的影响 |
| 4.3.10 FSHR特异性证明 |
| 4.3.11 bFGF和FSH联合处理对细胞增殖相关信号转导蛋白表达的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 LIF对雏鸡原始卵泡发育的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 主要器材 |
| 5.2.3 主要试剂及配制 |
| 5.2.4 卵巢的获取 |
| 5.2.5 卵巢组织的培养和药物处理 |
| 5.2.6 制片及HE染色 |
| 5.2.7 免疫组化 |
| 5.2.8 BrdU实验 |
| 5.2.9 TUNEL染色 |
| 5.2.10 Western blot分析 |
| 5.2.11 透射电镜和细胞超微结构的观察 |
| 5.2.12 数据的处理分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 LIF在雏鸡卵巢中定位及其表达的变化 |
| 5.3.2 LIFR在雏鸡卵巢中定位及其表达的变化 |
| 5.3.3 LIF体外处理剂量的筛选 |
| 5.3.4 LIF对卵泡细胞增殖的影响 |
| 5.3.5 LIF对卵泡细胞凋亡的影响 |
| 5.3.6 LIF对体外培养雏鸡卵巢的缝隙连接的影响 |
| 5.3.7 LIF对原始卵泡激活的影响 |
| 5.3.8 LIF和bFGF联合处理对卵泡细胞发育以及相关信号蛋白表达的影响 |
| 5.3.9 卵泡发育中LIF和Wnt/β-catenin信号通路的交互作用 |
| 5.3.10 卵泡发育中bFGF和Wnt/β-catenin信号通路的交互作用 |
| 5.3.11 LIF体内处理剂量的筛选及其对雏鸡卵巢中增殖相关蛋白表达的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 提示和创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（9）S4TdR/UVA对乳腺癌细胞MCF-7的抑制作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 乳腺癌及其治疗手段 |
| 1.1.1 乳腺癌简介 |
| 1.1.2 乳腺癌治疗研究进展 |
| 1.2 近紫外光辅助四硫胸苷疗法 |
| 1.2.1 光动力疗法研究进展 |
| 1.2.2 近紫外光辅助四硫胸苷疗法 |
| 1.3 细胞周期与调控 |
| 1.3.1 细胞周期调控与细胞增殖 |
| 1.3.2 细胞凋亡 |
| 1.3.3 P53通路 |
| 1.4 本课题的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验仪器和设备 |
| 2.3 实验耗材及试剂 |
| 2.3.1 实验耗材 |
| 2.3.2 实验试剂 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 细胞复苏 |
| 2.4.2 细胞传代 |
| 2.4.3 细胞冻存 |
| 2.4.4 细胞计数及铺盘 |
| 2.4.5 S4TdR/UVA暴露处理 |
| 2.4.6 细胞活性检测实验 |
| 2.4.7 细胞周期检测实验 |
| 2.4.8 蛋白质免疫印迹实验 |
| 2.4.9 目的基因实时荧光定量检测 |
| 2.5 统计学分析 |
| 2.6 技术路线 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 S~4TdR/UVA对MCF-7细胞活性与周期的影响 |
| 3.1.1 UVA及不同浓度S4TdR联合暴露对MCF-7细胞活性的影响 |
| 3.1.2 UVA及S4TdR联合暴露对MCF-7细胞周期的影响 |
| 3.2 S~4TdR/UVA对MCF-7细胞抑制作用的机制研究 |
| 3.2.1 S~4TdR/UVA联合暴露对P53-Mdm2-P21通路的影响 |
| 3.2.2 S~4TdR/UVA联合暴露对P53-Bax/Bcl-2-Caspase 3通路的影响 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 流式细胞仪检测原始数据 |
| 附录B 待测基因标准曲线 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读硕士学位期间的科研成果 |
（10）茶树花皂苷Chakasaponin Ⅰ、Ⅳ对人卵巢癌细胞增殖抑制及其分子机制（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 茶树花的研究现状 |
| 1.1.1 茶树花资源概述 |
| 1.1.2 茶树花主要生化成分及活性功能 |
| 1.2 卵巢癌研究进展 |
| 1.2.1 卵巢癌细胞的凋亡诱导和周期阻滞 |
| 1.2.2 p53蛋白在卵巢癌细胞凋亡及周期阻滞中的作用 |
| 1.2.3 OCSLCs研究进展 |
| 1.2.4 茶相关资源的功能性成分在卵巢癌研究中的应用 |
| 1.3 研究内容及技术路线 |
| 1.3.1 立题依据及研究意义 |
| 1.3.2 研究内容 |
| 1.3.3 技术路线 |
| 第二章 茶树花皂苷的提取、纯化及鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 材料与试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 茶树花皂苷HPLC分析 |
| 2.2.4 茶树花皂苷的提取与大孔树脂色谱柱分离 |
| 2.2.5 茶树花皂苷的制备液相色谱分离 |
| 2.2.6 茶树花皂苷的UPLC-Q-TOF/MS/MS分子结构鉴定 |
| 2.2.7 数据统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 大孔树脂柱分离后主滤分的分析 |
| 2.3.2 中低压制备液相第一次皂苷分离结果 |
| 2.3.3 中低压制备液相第二次皂苷分离结果 |
| 2.3.4 PTFSs分子结构鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 PTFSS对卵巢癌细胞的增殖抑制和周期阻滞作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 材料与试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 细胞培养与传代 |
| 3.2.4 细胞冻存与复苏 |
| 3.2.5 PTFSs对卵巢癌细胞活力的影响(MTS法) |
| 3.2.6 细胞克隆形成和染色 |
| 3.2.7 流式细胞仪测定细胞周期 |
| 3.2.8 蛋白质免疫印迹法(Western Blot) |
| 3.2.9 数据统计分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 PTFSs对卵巢癌细胞增殖的抑制效果 |
| 3.3.2 PTFSs对卵巢癌细胞克隆形成能力的影响 |
| 3.3.3 PTFSs引起卵巢癌细胞S期阻滞 |
| 3.3.4 PTFSs通过CDK2-CyclinE/A通路引起S期阻滞 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 PTFSS诱导卵巢癌细胞发生内凋亡 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料与试剂 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 细胞培养与传代 |
| 4.2.4 细胞冻存与复苏 |
| 4.2.5 Hoechst33342 染色测定PTFSs引起的细胞凋亡 |
| 4.2.6 流式细胞仪定量测定PTFSs引起的细胞凋亡 |
| 4.2.7 JC-1染色测定细胞凋亡线粒体膜电位的变化 |
| 4.2.8 Caspase-3/7,Caspase-8,Caspase-9 酶活测定 |
| 4.2.9 蛋白免疫印迹法(Western blot) |
| 4.2.10 数据统计分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 PTFSs诱导A2780/CP70和OVCAR-3 细胞的凋亡作用 |
| 4.3.2 PTFSs对卵巢癌细胞凋亡途径的研究 |
| 4.3.3 PTFSs对内凋亡通路关键蛋白的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 PTFSS诱导人卵巢癌细胞内凋亡及S期阻滞的机制 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料与试剂 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 细胞培养与传代 |
| 5.2.4 细胞冻存与复苏 |
| 5.2.5 siRNA转染 |
| 5.2.6 蛋白免疫印迹(Western blot) |
| 5.2.7 Hoechst33342 染色测定茶树花皂苷引起的细胞凋亡 |
| 5.2.8 JC-1染色测定细胞凋亡线粒体膜电位 |
| 5.2.9 Caspase-3/7,Caspase-8,Caspase-9 酶活测定 |
| 5.2.10 数据统计分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 PTFSs对卵巢癌细胞中p53、p-p53 蛋白表达的影响 |
| 5.3.2 p53 蛋白在PTFSs诱导人卵巢癌细胞凋亡中的作用 |
| 5.3.3 p53抑制剂PFT-α对细胞内凋亡通路相关蛋白表达的影响 |
| 5.3.4 p53 siRNA转染对细胞内凋亡通路相关蛋白表达的影响 |
| 5.3.5 p53 抑制剂PFT-α和 p53 siRNA转染对细胞S期阻滞相关蛋白表达的影响 |
| 5.3.6 PTFSs引起卵巢癌细胞DNA的损伤 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 PTFSS抑制卵巢癌干性细胞的作用研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料与方法 |
| 6.2.1 实验材料与试剂 |
| 6.2.2 实验仪器 |
| 6.2.3 细胞培养与传代 |
| 6.2.4 细胞冻存与复苏 |
| 6.2.5 流式细胞术测定高ALDH活性细胞比例 |
| 6.2.6 MTS法检测细胞活力 |
| 6.2.7 细胞克隆和肿瘤球形成实验 |
| 6.2.8 流式细胞仪测定干性细胞凋亡 |
| 6.2.9 蛋白免疫印迹(Western blot) |
| 6.2.10 数据统计分析 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 卵巢癌干性细胞的富集与鉴定 |
| 6.3.2 PTFSs对卵巢癌干性细胞增殖能力与干性特征的影响 |
| 6.3.3 PTFSs诱导卵巢癌干性细胞凋亡 |
| 6.3.4 PTFSs对 Wnt/β-catenin通路相关蛋白的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 总结与展望 |
| 7.1 全文总结 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及所获科研成果 |
四、VES抑制Raji细胞增殖中对CDK2和Bcl-2/Bax蛋白表达的影响（论文参考文献）
- [1]三七总皂苷对视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖、凋亡及PI3K/AKT信号通路的影响[D]. 刘景晨. 大理大学, 2021(09)
- [2]IL-7促进抗CD19 CAR-T细胞的增殖作用及其机制研究[D]. 杨利蓉. 昆明医科大学, 2021(02)
- [3]重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性评价及重楼皂苷Ⅰ的肝毒性机制探究[D]. 王文平. 北京中医药大学, 2021(02)
- [4]长链非编码RNA CYTOR通过调节miR-125b-5p/KIAA1522轴影响肝细胞癌增殖、凋亡和细胞周期的机制研究[D]. 胡博. 北京协和医学院, 2021(02)
- [5]益气活血方促进肝再生的作用及机制研究[D]. 李文聪. 河北医科大学, 2021(02)
- [6]CDK1在胰腺癌中的生物学功能、临床意义及相关抑制剂研究[D]. 杜金童. 山东大学, 2020(04)
- [7]百里酚通过Wnt/β-catenin信号通路抗结直肠癌作用研究[D]. 曾琼瑶. 昆明理工大学, 2020(05)
- [8]细胞因子bFGF和LIF对雏鸡原始卵泡发育的调节作用及其机理的研究[D]. 郭长权. 浙江大学, 2020
- [9]S4TdR/UVA对乳腺癌细胞MCF-7的抑制作用及机制研究[D]. 刘香佚. 大连海事大学, 2020(01)
- [10]茶树花皂苷Chakasaponin Ⅰ、Ⅳ对人卵巢癌细胞增殖抑制及其分子机制[D]. 任苎. 浙江大学, 2020(01)