一、大鼠骨髓间充质干细胞适宜分离和培养条件的研究（论文文献综述）
贾麒钰,黄晓夏,郭建,黄金勇,郭晓斌,阿卜杜萨拉木·阿力木江,吴桐,马创[1]（2022）在《整合素靶向肽促进SD大鼠骨髓间充质干细胞的增殖》文中进行了进一步梳理背景:研究报道整合素靶向肽多巴胺-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（dopamine-arginine-glycine-aspatic acid,DOPA-RGD）可以抑制破骨细胞活化和促进细胞黏附,然而对于整合素靶向肽干预骨髓间充质干细胞或改性钛基材料的最适浓度及最适时间尚不明确。目的:探究DOPA-RGD肽促进大鼠骨髓间充质干细胞增殖的最适干预质量浓度及最适干预时间。方法:体外分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,选取纯度达标的细胞进行下一步干预实验。96孔培养板中接种第3代骨髓间充质干细胞,对照组细胞培养采用单纯α-MEM完全培养基,其余各实验组用含2.5,5,10,20,40,80 mg/L DOPA-RGD肽条件培养基培养,CCK-8法测定DOPA-RGD肽干预1,3,5,7 d的细胞增殖情况,筛选出DOPA-RGD肽干预骨髓间充质干细胞的最适质量浓度及干预时间,流式细胞仪测定细胞凋亡率进一步验证最适干预质量浓度,采取划痕实验验证最适质量浓度DOPA-RGD肽对骨髓间充质干细胞迁徙能力的影响。结果与结论:（1）重复测量方差分析结果显示,DOPA-RGD肽干预不同时间组间的吸光度值改变不同,干预至第5天时增殖效果最佳,存在显着性差异（F=3 012.618,P <0.001）,通过LSD法对分组因素行组间两两比较,10 mg/L DOPA-RGD肽组与质量浓度≥20 mg/L的3个DOPA-RGD肽组及对照组比较存在显着性差异（P <0.01）;（2）细胞凋亡率测定显示,与其余各组相比,10 mg/L DOPA-RGD肽干预第5天可显着降低骨髓间充质干细胞的凋亡率（P <0.001）;（3）与对照组相比,10 mg/L DOPA-RGD肽干预24 h后骨髓间充质干细胞呈现出一定迁徙能力,迁徙速度明显加快;（4）结果表明,10 mg/L DOPA-RGD肽干预第5天对骨髓间充质干细胞有显着的促增殖效应。
李强强[2]（2021）在《新型镁合金对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响及机制研究》文中认为目的:（1）体外分离、培养及鉴定SD大鼠骨髓间充质干细胞的研究;（2）研究新型镁合金对SD大鼠骨髓间充质干细胞功能的影响;（3）研究新型镁合金对SD大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的作用及机制。方法:（1）体外分离、培养及鉴定SD大鼠骨髓间充质干细胞:全骨髓贴壁法分离培养、纯化BMSCs;观察细胞形态,绘制细胞生长、贴壁率曲线;检测BMSCs表面标志物、诱导成骨等方法进行鉴定。（2）新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金对SD大鼠BMSCs功能影响:实验分为5组,分别为无新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金浸提液的对照组,25%、50%、75%、100%浓度的新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金浸提液的实验组。取BMSCs分别与25%、50%、75%、100%浓度的新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金浸提液培养,设立对照组,观察细胞生长情况;研究不同浓度新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金浸提液对BMSCs黏附（CCK-8法）及增殖的影响;同时研究其对BMSCs凋亡的影响。（3）新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金对SD大鼠BMSCs成骨分化作用的研究:将从SD大鼠提取分离的BMSCs培养,实验分为5组,实验组加入含有上述不同浓度新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金浸提液的成骨诱导培养基,对照组加入等量的成骨诱导培养基,培养至第3周,采用茜素红染色法检测矿化能力;培养至第2周,测定碱性磷酸酶活性;荧光定量PCR检测成骨相关基因Runx2、OCN、OPN的表达情况;采用Western blot法检测成骨相关蛋白Runx2、OCN、OPG的表达情况。结果:（1）SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离、培养及鉴定:应用全骨髓贴壁法可在体外分离出纯度高的BMSCs;24小时内BMSCs几乎完全贴壁且细胞贴壁率随培养时间增加而上升,说明其活性良好;BMSCs生长曲线基本符合正常细胞生长曲线;P3代BMSCs经流式细胞鉴定:CD44、CD90高表达,CD31、CD45低表达;定向诱导向成骨细胞分化,可见明显矿化结节。（2）新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金对SD大鼠BMSCs功能影响的研究:（1）细胞黏附:除100%浓度浸提液组外,随着培养时间延长,细胞黏附数量增加;与不含浸提液组比较,1小时、3小时、5小时、7小时浸提液组中,75%浓度浸提液组细胞黏附数量增长最显着,差异有统计学意义（P<0.05）;（2）细胞增殖:第1、3、5、7天,各浸提液细胞数量均高于对照组,75%浓度浸提液最高（P<0.05）;（3）细胞凋亡:流式细胞仪检测结果显示未见明显细胞凋亡（P>0.05）。（3）新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金对SD大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化作用的研究:（1）茜素红染色:5组细胞茜素红染色均有矿化结节形成,与对照组比较,实验组增加明显;（2）碱性磷酸酶活性:新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金浸提液干预SD大鼠BMSCs,第7天和第14天各组ALP活性检测结果示:各组碱性磷酸酶活性第14天高于第7天,与空白组比较,各浸提液组均高于空白组,各组间差异均有统计学意义（P<0.05）。第7天和第14天,75%浓度浸提液组碱性磷酸酶活性最高（P<0.05）;（3）RT-PCR检测成骨相关基因的表达:与无新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金浸提液对照比较,新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金浸提液组成骨相关基因Runx2、OPN、OCN的表达增高（P<0.05）,75%浓度最高,有显着性差异（P<0.05）。（4）Western blot法检测成骨相关蛋白的表达:新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金浸提液各组均能提高成骨相关蛋白OCN、Runx2、OPG的表达（P<0.05）。结论:（1）应用全骨髓贴壁培养法体外可成功分离BMSCs。（2）新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金对SD大鼠骨髓间充质干细胞黏附、增殖具有促进作用,无明显细胞毒性,对其凋亡无明显影响,具有良好的生物相容性。（3）新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金可促进SD大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化。
赵浩森[3]（2021）在《白藜芦醇/骨髓间充质干细胞联合治疗大鼠脊髓损伤的作用与机制研究》文中研究说明脊髓损伤是一种严重的中枢神经系统创伤,因为其高致残性,多数患者在脊髓损伤后丧失运动及自理能力,常常给患者家庭及社会带来严重的负担。脊髓损伤后随着脊髓微环境变化而引发一系列病理生理变化所致使的继发性损伤脊髓损伤常常引起“瀑布”样效应,造成灾难性后果,给脊髓损伤的治疗带来困难和障碍。干细胞因为其多种生理学特性,例如可增殖性、多向分化性、自我更新性等,是近年来脊髓损伤治疗的研究热点,其中骨髓间充质干细胞因其容易获得性及免疫学特性和伦理合理性更是被广泛用于研究。然而脊髓损伤后局部微环境中的病理生理反应例如炎症、凋亡、氧化应激等,常常造成干细胞移植存活率的下降,最终导致神经保护功能的减退,造成脊髓损伤治疗效果不佳。白藜芦醇因为“法国悖论”的发现,其卓越的抗炎、抗衰老、抗氧化应激等功效被广泛地研究,其中白藜芦醇被证实能够上调Sirt-1信号通路与其所产生的的相关功效有关联。NF-κB是激活炎症的重要信号通路中的一员,而Sirt-1作为NF-κB上游通路,Sirt-1与脊髓损伤后炎症变化及白藜芦醇能否对炎症环境的骨髓间充质干细胞起到保护作用及其作用机制尚无相关研究,白藜芦醇能否与骨髓间充质干细胞联合治疗提升脊髓损伤治疗效果也无相关研究。因此本研究将通过以下三部分进行研究验证白藜芦醇与骨髓间充质干细胞联合治疗大鼠脊髓损伤的作用与机制:1.大鼠脊髓损伤后Sirt-1表达的变化及其与脊髓损伤后炎症反应变化之间的关系2.体外培养原代大鼠骨髓间充质干细胞,制作炎症模型,探究证实白藜芦醇对大鼠骨髓间充质细胞炎症模型中的作用及作用机制3.通过大鼠脊髓损伤模型来验证评估白藜芦醇/骨髓间充质干细胞联合治疗脊髓损伤的作用及机制。目的:通过探究脊髓损伤后Sirt-1信号通路与炎症的变化、骨髓间充质干细胞在炎症环境中反应机制、白藜芦醇对骨髓间充质干细胞炎症模型的作用及作用机理、脊髓损伤后白藜芦醇和骨髓间充质干细胞联合移植治疗的作用及作用机制等问题进行了探究分析,为指导白藜芦醇与骨髓间充质干细胞移植在脊髓损伤临床中的应用提供理论基础与实验学依据,为脊髓损伤的治疗提供新方法和新思路。研究方法:第一部分:将6-8周龄重约200-220 g雌性健康SD大鼠随机分为Sham组（假手术组）和脊髓损伤组,其中脊髓损伤组按照脊髓损伤后时间设定,细分为脊髓损伤后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d,5个亚组,参照Allen’s法制作大鼠脊髓损伤打击模型,其中Sham组仅咬除相应椎体椎板,不进行打击操作。运用Western Blot方法检测各组脊髓组织之间Sirt-1蛋白表达变化。运用Elisa法检测各组脊髓组织中炎症因子IL-1β和IL-6表达的变化。运用免疫荧光染色法检测Sham组和脊髓损伤3d组中Sirt-1和TNF-α在脊髓组织中表达的变化。第二部分:利用大鼠乳鼠体外培养骨髓间充质干细胞并于光学显微镜下观察细胞生长形态。运用流式细胞术对原代细胞表面CD34/CD45/CD29/CD90抗原表达情况进行检验验证。运用MTT检测验证TNF-α（20 ng/m L）诱导骨髓间充质干细胞炎症模型中细胞存活率随时间变化的变化趋势,选取适宜诱导时常。运用MTT检测检验TNF-α（20 ng/m L）诱导骨髓间充质干细胞炎症模型中,不同浓度白藜芦醇干预对细胞存活率的影响,选取适宜白藜芦醇浓度。将骨髓间充质干细胞随机分为三组:Control组、TNF-α组、TNF-α+白藜芦醇组,运用Elisa法检测各组细胞上清液中炎症因子IL-1β和IL-6表达的变化。运用Western Blot检验三组中Sirt-1和NF-κB蛋白表达的变化。运用Western Blot检验三组中凋亡标志性蛋白Cleaved Caspase-3和Caspase-9表达的变化。再将骨髓间充质干细胞随机分为二组:TNF-α+白藜芦醇组、TNF-α+白藜芦醇+EX527组,运用Real-Time PCR检验两组中Sirt-1和NF-κB基因表达的变化。运用Elisa法检验两组中IL-1β和IL-6表达的变化。运用流式细胞术（Annexin V-FITC-PI）检验两组组中细胞凋亡的变化。第三部分:将6-8周龄重约200-220 g雌性健康SD大鼠随机分为Sham组、脊髓损伤组、脊髓损伤+骨髓间充质干细胞移植组、脊髓损伤+骨髓间充质干细胞+白藜芦醇移植组共四组,参照Allen’s法制作大鼠脊髓损伤打击模型,其中Sham组仅咬除相应椎体椎板,不进行打击操作。运用BBB评分检测四组大鼠随时间变化运动功能变化情况。运用Nissl染色检测各组脊髓前角神经元数量的变化。运用Western Blot检测各组脊髓组织中Sirt-1/NF-κB及炎症因子IL-1β/IL-6蛋白表达的变化和凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3/Caspase-9表达的变化。运用荧光显微镜检测脊髓损伤+骨髓间充质干细胞移植组、脊髓损伤+骨髓间充质干细胞+白藜芦醇移植组脊髓组织中的PKH26和Neu N阳性细胞比率的差异。运用Elisa法检测四组各组脊髓组织中BDNF含量的变化。结果:第一部分:Western Blot检测结果显示随着脊髓损伤后时间变化,Sirt-1的表达也随之变化,脊髓损伤后1天其表达即比假手术组明显增高,约3天时Sirt-1的表达达到最高,随之出现逐渐下降并趋于稳定。Elisa检测结果显炎症因子（IL-1β、IL-6）表达也随着脊髓损伤后时间变化而变化,脊髓损伤后1天其表达即比假手术组明显增高,约3天时炎症因子的表达达到最高,随之出现逐渐下降并趋于稳定。Sham组和SCI 3 d组免疫荧光双染结果可见,损伤后脊髓组织中Sirt-1和TNF-α表达均上调。第二部分:光学显微镜下观察原代提取培养的大鼠骨髓间充质干细胞体外培养增殖3天形态呈长梭形或多角形,呈现纤维细胞样集落生长趋势。流式细胞术检测结果证实所培养细胞具有CD34（-）CD45（-）CD29（+）CD90（+）的表面抗原特性,证实培养的原代骨髓间充质干细胞具有干细胞表型。MTT检测结果可见,随着炎症诱导时间延长,骨髓间充质干细胞细胞存活率呈现逐渐下降趋势,炎症环境可影响骨髓间充质干细胞的存活。其中在12 h与Control组存在统计学意义,时间继续增加,细胞存活率降低趋势逐渐变缓。不同浓度白藜芦醇干预骨髓间充质干细胞炎症模型,细胞生存率变化不同。细胞生存率在1μmmol/L诱导组比炎症组明显提高。Elisa检验结果可见,炎症刺激后,BMSC的炎症因子的表达比Control组明显提升;而白藜芦醇干预组和炎症模型组相比,炎症因子均显着下降。Western Blot检验结果可见,炎症刺激后骨髓间充质干细胞的Sirt-1和NF-κB的表达比Control组提升;而TNF-α+白藜芦醇组和TNF-α组相比,Sirt-1表达显着提升,而相应的NF-κB表达显着下降;炎症刺激后,骨髓间充质干细胞凋亡标志性蛋白Cleaved Caspase-3/Caspase-9的表达比Control组提升;而TNF-α+白藜芦醇组和TNF-α组相比,凋亡蛋白的表达显着下降。Real-Time PCR结果可见,TNF-α+白藜芦醇+EX527组与TNF-α+白藜芦醇组相比,Sirt-1表达明显降低,而相应的,NF-κB表达明显增高。Elisa检验结果可见,TNF-α+白藜芦醇+EX527组与TNF-α+白藜芦醇组相比,炎症因子的表达明显增加。流式细胞术（Annexin V-FITC-PI）检验结果可见,TNF-α+白藜芦醇+EX527组与TNF-α+白藜芦醇组相比,细胞凋亡明显增加。第三部分:BBB评分结果证实,脊髓损伤后,大鼠出现明显运动功能障碍;移植和骨髓间充质干细胞+白藜芦醇联合移植治疗,均表现出对大鼠运动功能的恢复促进作用;其中骨髓间充质干细胞+白藜芦醇联合移植组BBB评分高于单纯骨髓间充质干细胞移植组。Nissl染色检测结果证实,脊髓损伤后,大鼠脊髓前角神经元数量比假手术组明显下降;骨髓间充质干细胞移植和骨髓间充质干细胞+白藜芦醇联合移植治疗,均提升了脊髓前角神经元数量;其中骨髓间充质干细胞+白藜芦醇联合移植组前角神经元计数平均值高于单纯骨髓间充质干细胞移植组,但两组之间并无明显统计学差异。Western Blot检测结果证实,脊髓损伤后,Sirt-1、NF-κB和炎症因子表达均比Sham组明显增高;骨髓间充质干细胞移植组中与SCI组相比,相应的指标变化无明显统计学差异;而白藜芦醇+骨髓间充质干细胞联合移植与SCI组和骨髓间充质干细胞移植组相比,Sirt-1表达明显增高,相应的NF-κB和炎症因子均明显降低。与此同时,脊髓损伤后,凋亡蛋白Cleaved Caspase-3/Caspase-9表达均比Sham组明显增高;骨髓间充质干细胞移植组中与SCI组相比,相应的指标变化无明显统计学差异;而白藜芦醇+骨髓间充质干细胞联合移植与SCI组和骨髓间充质干细胞移植组相比,凋亡蛋白表达明显降低。荧光显微镜检测结果证实,脊髓损伤后,白藜芦醇+骨髓间充质干细胞联合移植与骨髓间充质干细胞移植组相比,PKH26阳性比率和Neu N阳性比率明显增高。Elisa检测结果证实,脊髓损伤后骨髓间充质干细胞移植组和白藜芦醇+骨髓间充质干细胞联合移植组均能显着上调BDNF的表达,而白藜芦醇+骨髓间充质干细胞联合移植与骨髓间充质干细胞移植组相比BDNF表达的均值稍高,但两者间并无明显统计学差异。结论:第一部分:脊髓损伤后Sirt-1的表达随时间变化,和炎症因子表达的变化趋势呈现一致性。而且脊髓损伤后Sirt-1和炎症因子表达变化相关,Sirt-1可能参与脊髓损伤后炎症反应。第二部分:炎症环境可影响骨髓间充质干细胞的存活。适当浓度的白藜芦醇可增加骨髓间充质干细胞在炎症环境中的细胞存活率,起保护作用。白藜芦醇可通过上调Sirt-1的表达,抑制NF-κB,抑制炎症反应,减少骨髓间充质干细胞炎症环境中的细胞凋亡,实现对骨髓间充质干细胞在炎症环境中的保护作用。第三部分:脊髓损伤后白藜芦醇和骨髓间充质干细胞联合移植对大鼠脊髓损伤后运动功能恢复作用优于单纯骨髓间充质干细胞移植。白藜芦醇和骨髓间充质干细胞联合移植可以通过上调Sirt-1表达,抑制NF-κB表达和炎症反应,从而抑制脊髓组织细胞凋亡;而骨髓间充质干细胞移植并无明显此作用。白藜芦醇和骨髓间充质干细胞联合移植能增加骨髓间充质干细胞移植后的存活,能增加脊髓中神经元数量。骨髓间充质干细胞移植或白藜芦醇和骨髓间充质干细胞联合移植均能显着增加BDNF表达量。
高子茏[4]（2020）在《补骨脂素联合TGF-β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究》文中研究指明目的:建立有效的骨髓干细胞培养及鉴定体系;探索补骨脂素对于骨髓间充质干细胞的最佳生长浓度;观察补骨脂素联合转化生长因子β1（TGF-β1）诱导大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）向软骨细胞分化的作用。为细胞组织工程技术治疗大鼠膝关节软骨损伤的动物实验提供实验基础,进而探索中药在组织工程修复技术中的潜力和实用价值;同时为补骨脂“益肾气、强筋骨”的中医功效提供可靠基础实验依据。方法:实验一:对SD大鼠骨髓间充质干细胞进行提取、纯化及鉴定:采用大鼠股骨全骨髓提取+细胞贴壁法分离、提取大鼠骨髓间充质干细胞,对大鼠BMCS进行体外培养及扩增;通过研究其形态结构、流式细胞术共同鉴定。实验二:配置不同浓度梯度的补骨脂素培养液培养骨髓间充质干细胞,用CCK-8法检测含不同浓度补骨脂素培养液对细胞生长的作用。实验三:补骨脂素体外联合转移生长因子β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。1.体外诱导及分组,设置正常对照组（LG-DEME、10%FBS、双抗）,补骨脂素组（10umol/L补骨脂素、LG-DEME、10%FBS、双抗）,补骨脂素联合TGF-β1组（10umol/L补骨脂素、10ng/m LTGF-β1、LG-DEME、10%FBS、双抗）,阳性诱导组（10ng/m LTGF-β1、LG-DEME、10%FBS、双抗）。14d后,光学显微镜观察诱导后的细胞形态,进行Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色;运用RT-PCR技术检测软骨分化标记基因Ⅱ型胶原和Sox9的m RNA表达情况;采用Western-blot检测Ⅱ型胶原蛋白和Sox9的表达量。结果:1.光镜观察原代培养后首次换液,去除未贴壁细胞,大部分细胞呈梭型、三角形,小部分呈圆形。代后细胞纯化,形态均一,杂质细胞极少见。2.骨髓间充质干细胞流式细胞学鉴定显示实验所培养的细胞广泛高度表达CD90、CD44,而极少表达CD43、CD45。3.CCK-8法检测不同浓度的含补骨脂素完全培养基均可促进骨髓间充质干细胞生长增殖,尤以浓度为10umol/L的补骨脂素完全培养基效果最佳。4.骨髓间充质干细胞向软骨细胞定向诱导后鉴定:4.1倒置显微镜观察:诱导两周骨髓间充质干细胞后体积增大,表现为多边形、三角形、星形,有多个突起。4.2 II型胶原免疫细胞化学染色:正常对照组未见阳性细胞,其余3组均可见阳性细胞,胞浆呈棕红色。4.3 Western-blot结果:与正常对照组相比,其余3组Ⅱ型胶原和Sox9的表达增高（P<0.05）,其中联合组效果最佳（P<0.01）;与补骨脂素组和阳性诱导组比较,联合组的Ⅱ型胶原的表达均增高（P<0.05）。4.4 RT-PCR结果:与正常对照组相比,其余3组Ⅱ型胶原基因和Sox9基因表达增高（P<0.05）,其中联合组效果最佳（P<0.01）;与补骨脂素组和阳性诱导组比较,联合组的Ⅱ型胶原基因的表达均增高（P<0.05）。结论1.全骨髓贴壁法贴壁效率高、首次传代时间短、持续增殖能力及细胞活力强;1.CD44、CD90是两种MSCs重要的表面标志物,BMSCs的CD44、CD90表达阳性。因此可作为鉴定BMSCs的一种实用方法。3.不同浓度和时间段的补骨脂素的刺激,BMSCs的增殖得到了增强,以10μmol/L情况下效果最好。4.补骨脂素联合TGF-β1能促进大鼠骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原的表达,诱导其向软骨细胞分化。且效果要优于单独使用补骨脂素效果。为进一步将中药用于组织工程技术治疗大鼠骨关节炎的在体实验提供了实验基础。
董万亮[5]（2020）在《骨髓间充质干细胞来源的外泌体通过TSG-6通路促进脊髓损伤修复的作用及机制研究》文中研究表明脊髓损伤（Spinal Cord Injury,SCI）是脊髓由于外力撞击、压迫等直接或间接因素造成的一种严重的神经损伤性疾病。SCI常在脊髓原发性损伤的基础上,继发缺血、水肿、缺氧、炎症反应、钙超载等病理过程,导致运动功能丧失和SCI后相应节段下的感觉异常[1]。运动功能的丧失以及感觉异常,严重的影响了患者的生存质量,并给患者的家庭带来了沉重的经济负担。目前该病发病率呈逐年上升的趋势[2],且针对脊髓损伤尚无十分有效的治疗方法,大部分治疗以对症治疗为主,因此临床上急需可以改善脊髓损伤后病情的发展和预后的新的治疗方法。近年来,干细胞的生物治疗逐渐引起人们的关注,并在再生医学领域的研究和临床治疗中得到广泛的应用。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）是一类具有自我更新能力和多项分化潜能的成体干细胞,它来源广泛,且具有低免疫原性的特点,是组织工程修复的理想移植物。MSCs作为公认的抗炎症反应屏障,是目前SCI细胞移植治疗的最佳选择。大量的文献报道显示MSCs移植在SCI的治疗中有着积极的效应。研究发现,MSCs不仅可以抑制SCI后损伤局部的炎症反应和细胞凋亡情况,还可以促进损伤处轴突及血管的生成;也有文献发现,MSCs可以减少星形细胞疤痕和组织空洞,促进运动功能恢复,但具体机制尚不清楚。在MSCs的临床应用中,存在着细胞移植后存活率低,疗效不稳定等问题。而MSCs上清中提取的外泌体治疗SCI有很大优势,外泌体在血液、培养基中更加稳定,利于保存,易于质量管理,更加安全、体积小不易堵塞血管,不会诱发或者产生肿瘤,它是纳米级载体,可以有选择地到达炎症部位。外泌体是细胞外小泡的一种,在细胞与细胞间的通讯中起着重要作用,MSCs上清中提取的外泌体治疗SCI是通过基因信息和交换蛋白的方式为解决这些问题提供了新思路,促进细胞间的信息交流。外泌体在自然界中的来源及其分布比较广泛,大多数哺乳动物当中都可以分泌,在各种体液中也存在分布,不同的细胞分泌的外泌体有差异,尤其在发生疾病时,正常细胞分泌的外泌体和病态分泌的外泌体成分差别很大。因此对提高MSCs来源的外泌体治疗效果具有重要意义。肿瘤坏死因子α刺激基因-6（Tumor necrosis factor α stimulated gene 6,TSG-6）编码的分泌性蛋白是一种保护性的炎症反应因子,它通过与透明质酸、硫酸软骨素或蛋白多糖结合,介导炎症细胞迁移、黏附与免疫调节和细胞外基质重塑,进而发挥炎症调控作用[3]。重组TSG-6蛋白已应用于多种疾病模型的研究,并表现出了有效的抗炎作用。最近的研究发现,重组人TSG-6局部应用可减轻多种疾病的炎症反应和病理表现[4]。而TSG-6已被证明可在MSCs中表达,并在MSCs移植治疗一些疾病中,发挥了重要作用[5]。因此,明确TSG-6是否在MSCs来源的外泌体移植治疗中发挥关键作用,并以此为基础对MSCs来源的外泌体进行修饰,提高MSCs来源的外泌体移植治疗SCI的效果,对于临床MSCs来源的外泌体移植治疗SCI,有着指导意义。第一部分 骨髓间充质干细胞来源的外泌体对脊髓损伤的影响目的外泌体（exosomes）是近年来新发现的细胞与细胞相互作用的重要手段。它们是纳米级小囊泡（30-150纳米）,内含复杂的RNA和蛋白质,可以通过膜受体和其他方式结合到靶细胞。外泌体参与生物信息的调节;各种细胞在正常和病理条件下都能分泌外泌体。外泌体主要来源于细胞内溶酶体微粒形成的多胞体,通过多胞外膜与细胞膜融合释放到细胞外基质中。大量研究表明,移植的间充质干细胞来源的外泌体具有良好的治疗效果,在神经系统损伤的修复中起着关键作用。在该研究中,分离来自骨髓间充质干细胞（BMSCs）的外泌体并通过尾静脉移植到大鼠SCI模型中。观察移植前后大鼠SCI模型的行为学和组织学变化,初步观察尾静脉注射BMSCs外泌体对SCI的治疗作用。方法1.从大鼠骨髓中原代分离骨髓间充质干细胞（BMSCs）;2.采集BMSCs细胞培养上清液。用试剂盒提取外泌体。并利用透射电镜观察外泌体的形态。蛋白质印迹法鉴定外泌体表面标记蛋白;3.将30只大鼠随机分为三组,每组分别10只:假手术组、手术对照组和外泌体组。外泌体组大鼠术后1h静脉注射500μl外泌体,手术对照组大鼠术后1h静脉注射500 μl无菌磷酸盐溶液。4.通过BBB评分法和斜板实验评估术后各组大鼠的运动功能;5.通过Nissl染色、HE染色和LFB染色观察脊髓组织形态。结果1.透射电镜结果显示,上清中提取的外泌体,显示出大量具有圆形或椭圆形形状的囊泡状结构。囊泡周围的膜结构明显。尺寸相对均匀,直径约为40-100nm。2.Western Blot检测结果显示CD9和CD63呈阳性,鉴定提取物,确定其为外泌体。3.各组大鼠术前行为学评分均位于正常水平。术后外泌体组以及手术对照组BBB评分和斜板评分均明显低于假手术组（p<0.05）。外泌体注射7天后,外泌体组的BBB评分以及斜板评分高于手术对照组（p<0.05）,且差异具有统计学意义。4.移植后D28结果显示,Nissl染色、HE染色和LFB染色发现假手术组的脊髓形态结构正常,手术对照组大鼠体内Nissl体减少,炎性细胞浸润,髓鞘丢失明显。与手术对照组相比,外泌体组脊髓组织内Nissl体增多,炎性细胞浸润减少,髓质减少,减少了鞘层损耗。结论骨髓间充质干细胞来源的外泌体可以减轻脊髓损伤后的组织损伤程度,促进神经运动功能的恢复。第二部分 骨髓间充质干细胞来源的外泌体治疗脊髓损伤的基因表达谱分析目的本研究中我们制作大鼠脊髓损伤模型后利用转录组测序技术,建立大鼠脊髓损伤及骨髓间充质干细胞来源的外泌体治疗的基因表达谱分析。在转录组测序中,可以通过将读数的数量映射到基因区域来估计基因表达水平,但读数的数量不仅与基因表达水平成正比,而且与基因本身的长度和测序数据的数量成正比。为了使不同基因和不同样品之间的基因表达水平相当,将读数转化为FPKM（每百万映射读数的外显子模型的片段每千克碱基）以标准化基因表达。方法SD大鼠（SPF级）,戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,利用美国PSI公司,型号IH-0400撞机仪制作大鼠脊髓损伤的模型,20g的撞击棒,在4.5cm处自由落体撞击T10椎体层面脊髓中央,造模成功的标志性为,大鼠双下肢抽搐,尾巴甩向一侧,出现双下肢的瘫痪。从损伤脊髓中提取总RNA,以脊髓中心为中点,上5mm,下5mm。采用转录组测序技术扫描总RNA,获得脊髓损伤后大鼠差异mRNA表达谱从。大鼠骨髓中原代分离骨髓间充质干细胞（MSCs）;采集MSCs细胞培养上清液。用试剂盒提取外泌体。并利用透射电镜观察外泌体的形态。蛋白质印迹法鉴定外泌体表面标记蛋白;将12只大鼠随机分为四组,每组分别3只:假手术组、手术对照组、骨髓间充质干细胞组和外泌体组。外泌体组大鼠术后1 h静脉注射500 μl外泌体,手术对照组术后1h静脉注射500 μl无菌磷酸盐溶液,骨髓间充质干细胞组大鼠术后1 h静脉注射500 μ1骨髓间充质干细胞。并于术后24h,通过透射电镜观察外泌体在脊髓组织中的分布情况;成功建立大鼠脊髓损伤模型,并对提取的总RNA进行质量评价,质量可靠。采用转录组测序技术获得脊髓损伤后大鼠mRNA的差异表达谱。观察差异性表达基因数目,并制作基因聚类分析热图。结果通过差异基因筛选并文献查阅,从中选定TSG-6基因进一步研究,测序结果显示,TSG-6在手术对照组中表达比假手术组显着降低;脊髓损伤大鼠经外泌体治疗后,该基因表达水平较手术对照组增高,低于假手术组。结论TSG-6在手术对照组和假手术之间表达有差异;而且治疗组和手术对照组之间存在差异。通过转录组测序,假手术组、手术对照组、外泌体组和骨髓间充质干细胞组之间存在基因表达水平差异。根据基因表达差异和GO功能分析及KEGG信号通路分析,结合文献阅读,选定TSG-6基因与神经损伤相关。第三部分 TSG-6在骨髓间充质干细胞来源的外泌体治疗脊髓损伤中的关键作用目的本研究通过沉默和高表达MSCs来源的外泌体中的TSG-6基因,并将其外泌体注射给SCI大鼠。观察注射前后大鼠脊髓损伤模型的行为学和组织学变化。确定TSG-6在脊髓损伤治疗中的作用。方法1.从大鼠骨髓中纯化并培养MSCs,慢病毒沉默和高表达MSCs中的TSG-6基因和鉴定,提取外泌体。将75只雄性SD大鼠分为五组,每组分别15只:假手术组,手术对照组,外泌体组,TSG-6沉默组,TSG-6高表达组。术后24h进行大鼠灌注,观察外泌体在脊髓组织中的定位和分布。其他大鼠在术后1,3,7,14和D28测试运动能力和行为的变化。同时在术后D28,通过组织切片染色观察损伤处组织形态的变化。2.术后24h观察外泌体在脊髓损伤处分布。术后D28,通过Nissl染色,HE染色和Luxol fast blue（LFB）染色观察脊髓的形态学变化。3.沉默TSG-6基因,并将其外泌体注射给SCI大鼠,通过BBB评分和术后各时间点的斜板实验评分观察各组神经损伤的恢复情况。4.高表达TSG-6基因,并将其外泌体注射给SCI大鼠,通过BBB评分和术后各时间点的斜板实验评分观察各组神经损伤的恢复情况。结果1.荧光显微镜观察慢病毒转染效果。采用聚合酶链反应（PCR）和蛋白质印迹（Western blot）检测转染效果。结果显示MSCs内TSG-6基因沉默和高表达成功;2.外泌体组和TSG-6高表达组大鼠脊髓损伤后BBB评分和斜板评分均显着高于手术对照组（p<0.05）,而TSG-6沉默组与手术对照组相比无显着统计学差异。脊髓损伤后第7天TSG-6高表达组BBB评分以及斜板评分均高于外泌体组（p<0.05）。3.移植后D28结果显示,Nissl染色、HE染色和LFB染色发现假手术组的脊髓形态结构正常,手术对照组和TSG-6沉默组大鼠体内Nissl体减少,炎性细胞浸润,髓鞘丢失明显。与手术对照组相比,外泌体组和TSG-6高表达组脊髓组织内Nissl体增多,炎性细胞浸润减少,髓质减少,减少了鞘层损耗。且TSG-6高表达组优于外泌体组。结论MSCs来源的外泌体可以降低脊髓损伤后组织损伤程度,促进神经运动功能的恢复,为生物移植治疗脊髓损伤提供了新的方向和思路。但是高表达TSG-6的MSCs来源的外泌体显示具有更强的治疗效果,TSG-6在MSCs来源的外泌体治疗脊髓损伤中发挥着重要的作用。
陈一欢[6]（2020）在《不同来源间充质干细胞外泌体修复缺血受损心肌功能差异及机制研究》文中研究指明目的:比较两种间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell,MSC）[骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell,BMSC）与脐带间充质干细胞（Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cell,UMSC）]来源的外泌体（Exosome,EXO）对急性心肌梗死的治疗效果差异,利用蛋白组学手段分析出现差异的分子机制,为应用EXO治疗缺血性心脏病的临床转化提供理论基础。方法:第一部分将冻存的P3代BMSC复苏培养并传代,胰酶-胶原酶消化法分离培养UMSC并传代,对P5代的细胞进行干细胞相关鉴定并进行下一步实验;差速超速离心法提取BMSC和UMSC培养上清液中的EXO并进行鉴定。第二部分通过体外和体内实验（外泌体心肌注射移植入大鼠急性心梗模型）,进行两种外泌体对细胞相关功能及对心肌修复功能的比较,观察两者之间的差异。第三部分提取BMSC-EXO和UMSC-EXO中的蛋白,运用液相色谱-质谱联用分析方法鉴定蛋白并进行注释,筛选差异蛋白进行富集分析,根据分析结果选择典型差异蛋白进行体外验证。结果:复苏接种的P3代BMSC形态均一,呈梭形或纺锤形,5天左右融合达90%以上;经酶消化法贴壁培养得到的UMSC呈成纤维细胞样,呈多角形或梭形,培养3周细胞融合比例超过80%。MSC传代后生长速度明显加快。流式细胞仪检测:超过95%的 BMSC 和 UMSC 表达 CD44、CD90 和 CD105;不表达 CD34 和 HLA-DR。生长曲线显示P5代的UMSC增殖速度明显较BMSC快。在同样诱导条件下,BMSC和UMSC均能被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞,BMSC更易被诱导为脂肪细胞和软骨细胞,而UMSC则易被诱导为成骨细胞。透射电镜观察MSC-EXO呈典型的“杯托样”结构,内可见低密度光亮区;粒径分析结果,BMSC-EXO平均粒径131.5nm,UMSC-EXO 平均粒径 13 7.5nm;Western Blot 显示 BMSC 和 UMSC 来源的EXO均为CD63、TSG101阳性表达。体外实验结果:两种来源MSC的EXO均能抑制H2O2诱导的H9C2细胞凋亡、在体外诱导HUVEC细胞加速迁移和形成管样结构、在体外抑制TGF-β诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化。UMSC-EXO在上述调控能力上优于BMSC-EXO。体内实验结果:术后3天见UMSC-EXO在心肌组织内驻留率更高。HE染色、RT-qPCR、Western Blot结果提示经EXO处理后,心梗区域炎性细胞浸润减少,炎症因子IL-6、TNF-α、IκBα、NF-κB p65表达降低,与凋亡相关的Bax、cleaved-Caspase3的表达降低、Bcl2表达增加,与纤维化相关的MMP-2、MMP-9表达降低、与血管新生相关的eNOS、VEGF表达增加。天狼猩红染色、Masson’s Trichrome染色、TUNEL染色和CD31染色结果显示MSC-EXO能抑制梗死后心肌间质纤维化、抑制心肌细胞凋亡、促进新生血管形成。心脏超声结果提示MSC-EXO能提高急性心梗后的心脏功能。上述指标UMSC-EXO移植组较BMSC-EXO移植组改善更显着。使用液相色谱-质谱联用分析法鉴定到BMSC-EXO中可定量蛋白624个,UMSC-EXO中可定量蛋白635个,两者共同表达的蛋白为558个,139个蛋白在BMSC-EXO中表达上调,153个蛋白在UMSC-EXO中表达上调。富集分析显示UMSC-EXO中的差异上调蛋白较BMSC-EXO能更多地发挥细胞粘附、促细胞增殖和存活、抗凋亡及炎症调节等功能。筛选有明显表达差异的蛋白PDGFC进行验证结果:转染过表达靶向PDGFC的shRNA的UMSC,其EXO中的PDGFC含量下降,使用该外泌体体外与HUVEC细胞共培养后,HUVEC细胞中p-AKT的表达下降,形成管状结构能力下降。结论:BMSC-EXO和UMSC-EXO在体外均可以提高心肌细胞抗凋亡能力、促进内皮细胞增殖迁移及形成管样结构、抑制TGF-β诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化的程度。在体内均能够减轻急性心梗后局部炎性反应,改善心肌细胞存活率,降低心肌组织纤维化程度,促进毛细血管新生,改善心脏功能。总体效果UMSC-EXO较BMSC-EXO更好,其原因可能与其包含的蛋白成分差异有关。MSC-EXO中包含的蛋白质在心梗后心肌修复过程中发挥了一定的作用,而差异蛋白（如PDGFC）表达量的不同可能是不同来源MSC外泌体在心肌修复过程中产生差异的原因之一。
甘凤山[7]（2020）在《胶原蛋白纳米超薄膜PDPB对大鼠股骨缺损修复的研究》文中研究指明[研究背景及目的]目前在骨缺损及骨损伤的临床治疗中,随着研究的不断深入,组织工程骨被认为是治疗大节段骨缺损最有发展前景的方法之一。而具有良好的组织细胞相容性、可吸收性、可塑性、与天然骨组织相似的三维孔隙结构的支架材料是研究的重点,但迄今仍未有一种理想的支架材料应用于临床。研究表明组织工程骨种子细胞粘附生长困难、成骨效率低、血管化不良、排异以及机体干细胞归巢动员能力差是导致组织工程骨体内骨缺损修复不良的重要因素。课题组前期制备的猪椎骨脱蛋白骨为天然骨衍生物,排除了免疫因素,又具有天然的孔隙,但由于脱去蛋白,因此物理强度明显下降,同时种子细胞粘附增殖受到影响,也影响了微血管长入以及体内干细胞的归巢。因此,本研究采用胶原蛋白在部分脱蛋白骨（PDPB）材料表面构建纳米超薄膜,为骨缺损进入临床治疗构建良好机械力学强度、无免疫原性、高亲水性、有利于细胞生长及功能表达,帮助新生血管形成、有利于干细胞归巢、粘附生长的高效修复支架材料提供系统化技术支持。[方法]（1）颈椎脱臼处死SD大鼠,取双侧股骨采用全骨髓贴壁法分离、纯化和培养骨髓间充质干细胞,细胞培养至第3代时进行成骨、成脂、成软骨分化鉴定骨髓间充质干细胞。（2）按动物实验分组制备植入的支架材料及骨髓间充质干细胞（BMSCs）的复苏。将之前制备的单纯PDPB磨制成4x2x2mm大小骨块。经75%乙醇浸泡后冷冻干燥机干燥。并分成两组,分别为未做处理的单纯PDPB和经多聚赖氨酸形成复合胶原蛋白纳米超薄膜的PDPB。并按如下分组植入。A组单纯骨缺损组,无支架材料;B组为单纯PDPB组;C组为复合胶原蛋白纳米超薄膜的PDPB;D组为复合胶原蛋白纳米超薄膜的PDPB+尾静脉注射BMSCs。（3）SD大鼠48只随机分成A、B、C、D4组,每组12只。A组单纯骨缺损组,无支架材料;B组为单纯PDPB组;C组为复合胶原蛋白纳米超薄膜的PDPB;D组为复合胶原蛋白纳米超薄膜的PDPB+尾静脉注射BMSCs)。于大鼠股骨中段用小型电钻磨出4×2×2mm大小不离断骨缺损,并按如上分组给予植入相应的植入物并尾静脉注射BMSCs。于术后2周、4周、6周、8周通过DR摄片、大体标本观察及组织切片HE染色连续动态观察不同组植入的支架材料在骨缺损修复过程中的作用。[结果]（1）SD大鼠采用全骨髓贴壁法分离、纯化和培养骨髓间充质干细胞,可得到高纯度的BMSCs,第三代BMSCs经诱导分化可分化为骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞。（2）支架植入术后一般情况观察:术后平均约2分钟内苏醒,苏醒后在饲养笼内可自由活动,饮食、饮水正常。手术切口无红肿、渗血、渗液,愈合良好。术后第4天首次拍摄X线片观察发现其中有4只大鼠股骨骨折,其余骨缺损形成良好。造模成功率为92%。（3）术后X线观察:A组术后2周X线下骨缺损仍然可见,4周至6-8周缺损处逐渐愈合。B、C、D组术后2周X线可见移植物外型轮廓清晰,4-8周可见移植物外型轮廓逐渐淡化,影像变得模糊,骨块与缺损处界限消失,与原有股骨缺损部位融合。各组的横向对比可见D组较C组、B组随移植、修复时间的延长,移植骨块自身被吸收与缺损处融合更为明显,且愈合较好。（4）大体标本观察结果:A组术后2周缺损处有大量纤维骨痂生成,4周出现骨性修复,6-8周基本骨性愈合。B、C、D组术后2周可见移植骨块被纤维及软组织包裹,并骨块,移植骨块与骨缺损处固定牢固,骨块表面孔隙可见,第4-8周B、C、D各组骨缺损处纤维组织包裹更加致密,第8周可见植入骨块已部分被吸收、体积变小并与缺损处逐渐融合,C、D组的愈合过程优于B组。（5）组织学切片HE染色结果显示第2周、4周、6周、8周A组（单纯骨缺损组）可自行愈合;B、C、D组植入材料的孔隙内有大量骨髓细胞长入,并且D组较C、B组早期有大量血管长入。2周时清晰可见的植入材料在随着新骨的生成逐渐降解,植入物骨端与骨缺损骨端逐渐融合。第8周时D组愈合效果最佳。[结论]（1）全骨髓贴壁法是一种理想的骨髓间充质干细胞分离、体外扩增的方法。通过此方法可以在短时间内可到大量的骨髓间充质干细胞,并且细胞活性好、稳定,具有高度的分化潜能。为骨髓间充质干细胞在组织工程应用及临床损伤修复的治疗的进一步研究提供了基础。（2）通过本实验建立了 SD大鼠的股骨不离断的骨缺损动物模型。验证了不离断的大鼠股骨中段4×2×2mm缺损可自行愈合。（3）复合胶原蛋白的纳米超薄膜PDPB较单纯的PDPB的组织相容性更好,,在支架材料降解的同时能够快速形成新骨,其降解、吸收速度适宜。复合胶原蛋白的纳米超薄膜PDPB复合BMSC构建的组织工程骨有效促进骨缺损修复。（4）经尾静脉注射BMSCs早期有大量的血管长入,提示胶原蛋白纳米超薄膜可诱导骨髓间充质干细胞归巢对骨组织损伤进行修复。
陈靖元[8]（2020）在《低频电磁场联合VEGF干预的间充质干细胞复合PCL/HA支架修复大鼠颅骨缺损的研究》文中进行了进一步梳理目的:1、探索低频电磁场（EMF）联合VEGF干预对大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）增殖、成骨成血管分化的影响及可能的分子机制。2、探究rBMSCs复合聚己内酯（PCL）/羟基磷灰石（HA）支架经EMF和VEGF联合干预后,PCL/HA支架上rBMSCs的活性和增殖情况。3、探究rBMSCs复合PCL/HA支架经EMF和VEGF联合干预后形成的组织工程骨EMF/VEGF/rBMSCs/PCL/HA用于修复大鼠颅骨缺损的骨生成效果。方法:1、体外分离培养4周龄大鼠的骨髓间充质干细胞,并对大鼠骨髓间充质干细胞进行三系分化鉴定。取第三代大鼠间充质干细胞,经EMF（15Hz,1m T,4h/day）联合VEGF（50ng/ml）干预培养1-7天,观察细胞生长形态变化并使用CCK-8检测细胞的增殖情况。2、选用三代大鼠间充质干细胞,经EMF联合VEGF干预培养后,通过RT-PCR检测成骨相关基因OCN、RUNX2、COLI和成血管相关基因VEGFR2、v WF、CD31的表达,通过Western-blot检测成骨相关蛋白OPN、RUNX2、COLI和成血管相关蛋白VEGFR2、v WF、CD31以及Wnt通路相关蛋白的表达。3、将大鼠骨髓间充质干细胞经EMF联合VEGF干预培养后,以免疫荧光染色检测大鼠骨髓间充质干细胞成骨成血管的表达情况。4、采用3D打印技术将聚己内酯（PCL）和羟基磷灰石（HA）打印PCL/HA复合支架,将大鼠骨髓间充质干细胞接种在PCL/HA支架上,经EMF联合VEGF干预培养后,使用live-dead染色检验支架的细胞相容性,使用扫描电子显微镜（SEM）观察大鼠骨髓间充质干细胞在PCL/HA支架上的细胞形态和增殖情况。5、将rBMSCs接种在PCL/HA支架上,经EMF/VEGF干预培养形成组织工程骨EMF/VEGF/rBMSCs/PCL/HA,并构建组织工程骨rBMSCs/PCL/HA、EMF/rBMSCs/PCL/HA、VEGF/rBMSCs/PCL/HA和PCL/HA,对比研究对大鼠颅骨缺损模型的修复程度。6、手术后4周和12周时,对各组动物进行micro-CT扫描、组织学免疫组化染色及组织学切片评估缺损部位骨生成及血管生成情况。在手术12周后进行薄片推出（push-out）实验检测骨缺损修复的力学效果。结果:1、大鼠股骨和胫骨骨髓中分离出的间充质干细胞可以在成骨、成软骨及成脂诱导基培养下进行三系分化。经VEGF以及EMF/VEGF干预的骨髓间充质干细胞呈现出类鹅卵石样形态。经CCK-8检测发现培养7天后经EMF或/和VEGF干预下的细胞增殖速度较快。2、EMF干预刺激能上调基因OCN、RUNX2、COLI和蛋白OPN、RUNX2、COLI、CD31的表达,VEGF干预刺激能上调VEGFR2、v WF、CD31基因和蛋白的表达,同时能轻微上调基因OCN、RUNX2和蛋白OPN、COLI的表达。EMF和VEGF干预刺激均显示了Wnt1、LRP-6和β-catenin的上调。3、免疫荧光染色显示EMF干预后细胞表面分子标记OCN阳性,VEGFR1阴性;相反的VEGF干预后细胞表面分子标记VEGFR1阳性,OCN阴性;共同刺激组均为阳性。4、PCL/HA支架细胞相容性良好,rBMSCs能够在支架上进行正常生长及增殖,经VEGF干预刺激后细胞增殖较快,形态上未见明显区别。5、动物手术后12周micro-CT扫描结果显示构建的EMF/VEGF/rBMSCs/PCL/HA组织工程骨新生的骨量增加最为明显。组织学免疫组化染色显示OPN表达量在EMF/VEGF/rBMSCs/PCL/HA组最高,CD34表达量在VEGF干预组中明显升高。HE和MASSON染色可以发现EMF/VEGF/rBMSCs/PCL/HA组支架部分的骨替换度较其余组明显增多,且有类似髓腔样结构出现。EMF/VEGF/rBMSCs/PCL/HA组及VEGF/rBMSCs/PCL/HA组骨缺损处新生血管最为显着。6、Push-out实验结果显示EMF/VEGF/rBMSCs/PCL/HA组能够承受的最大压力及载荷最高。结论:1、获取的大鼠骨髓间充质干细胞具有分化的潜能。2、EMF能促进rBMSCs的成骨分化相关基因和蛋白的表达,VEGF能促进rBMSCs的成血管分化相关基因和蛋白的表达,且均是通过Wnt/β-catenin通路进行调控。3、PCL/HA支架细胞相容性良好,rBMSCs在EMF/VEGF干预下能在PCL/HA支架上增殖良好。4、组织工程骨EMF/VEGF/rBMSCs/PCL/HA具有良好的组织相容性,具有较强的促进骨缺损修复的作用,同时具有一定的促进血管生成的作用,用于骨缺损修复效果良好,构建方法简单、有效,具有一定的临床应用前景。
邢敏[9]（2019）在《硅—锶体系生物陶瓷离子释放规律及对骨/心肌组织修复相关生物学效应研究》文中指出生物活性陶瓷材料释放的活性离子被证实可以调控细胞行为,能够促进细胞增殖、成骨和成血管,进而有利于组织修复,但是目前关于离子种类和浓度与生物活性关系的研究很少,导致单一离子的特定作用、离子组合的协同作用和最佳作用浓度仍然不明确,主要包括以下几个问题:（1）生物活性陶瓷材料释放离子的精确控制;（2）离子对不同组织不同细胞特定的生物学效应和最佳作用浓度;（3）具有可控离子释放的组织修复材料的设计。本论文以硅和锶离子为研究对象,提出了关于硅-锶体系生物陶瓷离子释放规律及对骨/心肌组织修复相关生物学效应研究的课题,首先探究了硅-锶体系生物活性陶瓷材料的化学组成和物相组成及外部生理微环境对其离子释放的影响,进一步研究了硅-锶离子在骨组织修复中的协同作用、最佳作用浓度和应用,最后受到上一步关于锶离子能够显着促进血管生成研究结果的启发,并联想到修复过程中需要大量血管重建的软组织—心肌组织,深入阐明了锶离子在心肌组织修复中的生物活性、最佳作用浓度和应用,为生物活性离子用于组织修复提供了可行的方法和理论依据。主要研究内容和结果如下:1)首次采用无容器技术制备具有不同化学组成的钙-锶-硅体系玻璃材料,并探究热处理温度对材料物相组成的影响,进而研究材料化学组成和物相组成对离子释放的影响,同时改变外部生理微环境,如p H和蛋白,阐明其对材料离子释放行为的影响规律。研究发现,无容器技术制备的化学成分可控的玻璃材料结合后期热处理,能够精确调控其物相组成。材料的化学组成和物相组成均能进一步调控材料的离子释放行为,同时改变溶解环境的p H也是调控材料离子释放的有效方法。本章研究结果对设计具有可控离子释放的生物材料具有重要的指导意义。同时,材料离子释放的精确可控也为接下来深入探究单一离子和离子协同对细胞行为的影响、最佳作用浓度和作用机制提供了可行的离子获得渠道。2)探究硅-锶离子对骨组织工程快速扩增人骨髓间充质干细胞（h BMSCs）的作用和最佳作用浓度,并阐明最佳作用浓度对h BMSCs干性维持的影响,进一步研究硅-锶离子对h BMSCs成骨分化的影响和最佳作用浓度,并在此基础上设计h BMSCs培育方法和骨组织工程支架材料,探究其在体内对成骨和成血管的影响。结果表明,硅和锶离子能够协同促进h BMSCs增殖并有利于其大量扩增后的干性维持,得到了最佳作用浓度,并基于此设计了h BMSCs的体外培养条件,使得体外短时间内获得了大量保持干性的h BMSCs。进一步发现了硅和锶离子能够协同促进h BMSCs成骨分化,得到了最佳作用浓度,并发现硅和锶离子协同促进h BMSCs成骨分化的最佳作用浓度要高于其协同促进h BMSCs增殖的最佳作用浓度。最后,基于硅和锶离子协同促进h BMSCs成骨分化的最佳作用浓度,设计了硅-锶离子复合可注射水凝胶,使其可以释放处于促进h BMSCs成骨分化作用浓度范围内的硅-锶离子,进而通过动物实验,裸鼠（BALB/c,6周龄,n=6）皮下移植,证明了负载h BMSCs的硅-锶离子复合水凝胶能够在体内促进成血管和成骨。通过对比硅和锶离子的生物学效应差异,结果显示硅离子在促进h BMSCs成骨分化中起到了主导作用,锶离子在促进h BMSCs增殖和成血管中起到了主导作用。本章研究结果为骨组织工程的设计提供了可行的方法,并在此基础上引申出了下一部分的研究工作,为其提供了理论指导。3)基于上一部分的研究结果,发现了锶离子在促进成血管方面具有比硅离子更显着的效果。除了硬组织修复以外,血管生成在软组织修复过程中也具有非常关键的作用,尤其是高度血管化的心肌组织的修复,因此,本章研究了锶离子对心肌修复相关细胞（内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和新生大鼠心肌细胞）的调控和对心肌损伤的修复作用。首先探究锶离子对血管形成的最佳作用浓度和作用机制,进而阐明锶离子对心肌细胞活性维持和缺氧损伤后修复抗凋亡的作用和最佳作用浓度,并基于此设计锶离子复合的水凝胶材料,通过体内实验探究其对心梗后心功能恢复的影响,进而通过血管形成和受损心肌细胞修复揭示锶离子促进心梗后心功能恢复的机制。研究发现,锶离子能够促进血管形成和血管成熟,得到了最佳作用浓度,并发现了其通过刺激旁分泌效应促进血管形成的作用机制。进一步发现了锶离子能促进新生大鼠心肌细胞活性维持,促进其缺氧损伤后的抗凋亡和修复,并得到了其最佳作用浓度。最后,基于锶离子的最佳作用浓度,设计了锶离子复合可注射水凝胶,并使其可以释放处于活性作用浓度范围内的锶离子,通过体内实验（雄性小鼠,BALB/c,12周龄,n=12）,证明了锶离子复合水凝胶能够促进缺血再灌心梗模型心脏功能恢复,并发现了可能的作用机制是其释放的锶离子能够促进血管形成,进而恢复梗死区域的营养和氧气供给,并能够促进缺氧损伤后心肌细胞修复抗凋亡。我们的研究结果为心梗心肌组织的修复提供了新的可行的方法。
李玉琳[10]（2019）在《脉冲电磁场激励骨髓间充质干细胞修复脊髓损伤的实验研究》文中认为【目的】脊髓损伤（Spinal cord injury,SCI）是一种严重的创伤性疾患,会导致肢体感觉和运动功能障碍,致残率较高。目前,细胞移植治疗是脊髓损伤领域研究的热点。然而细胞移植治疗仍面临着很多的困难,如移植细胞在脊髓损伤局部的存活率低;在损伤后抑制性微环境中种子细胞的分化和迁移能力较差;免疫排斥反应以及伦理学问题等。本研究拟探讨不同强度的脉冲电磁场（Pulsed electromagnetic fields,PEMF）对骨髓间充质干细胞（Bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs）生物学活性的影响,并观察PEMF激励的BMSCs移植到SCI大鼠体内的治疗效果,并进一步探讨其潜在的生物学机制。【方法】1.体外实验:从Wistar大鼠体内提取、分离、纯化、培养BMSCs,并采用流式细胞技术进行细胞鉴定;观察不同强度PEMF对BMSCs活性、增殖能力的影响,选择最佳的激励强度;于细胞培养48h内分别采用25,50,75,100Hz（每天1次,每次1h,连续干预1-9天）干预强度进行细胞刺激,观察不同强度刺激下,细胞的活性、增殖能力情况,选择最佳的激励强度;采用Western-blot技术观察不同强度、不同刺激时长的PEMF激励BMSCs后,细胞分泌神经营养因子的水平。2.体内实验:采用Impactor model-Ⅱ打击器建立Wistar大鼠脊髓损伤模型,将大鼠随机分为4组,包括A组:实验对照组（行单纯椎板切除术）;B组:单纯损伤组（行脊髓损伤造模）;C组:BMSCs移植组（移植未经PEMF刺激的BMSCs治疗）、D组:OBMSCs（Optimal BMSCs）移植组（移植高活力BMSCs治疗）;将高活力的BMSCs移植入脊髓损伤大鼠体内,通过免疫组织化学方法观察移植的细胞在脊髓损伤局部的填充状态、活性、增殖能力情况,观察其对脊髓损伤局部组织学修复作用。并探索PEMF影响BMSCs存活、增殖能力与p75NTR-Trk信号通路的相关性;应用BBB评分评价大鼠运动功能恢复情况。数据采用统计学软件SPSS 18.0进行分析,数据以均数±标准差（Mean±SD）形式表示,显着性差异使用ANOVA testing计算,P<0.05被认为具有统计学意义。【结果】1.本实验完成对BMSCs的提取、分离、纯化、培养及鉴定。BMSCs的免疫表型为:CD29,CD90为阳性,CD34,CD45为阴性,符合BMSCs的表型特征,并且细胞中无造血系统的细胞污染;2.50Hz强度的PEMF,每天刺激1h,持续9天,BMSCs的活性明显高于25Hz、75Hz及100Hz组,本研究将50Hz,1h/d,9d作为最佳的激励强度,制备高活力种子细胞;体外实验WB检测结果发现,PEMF激励后的骨髓间充质干细胞BDNF及NGF的表达水平显着高于对照组（p<0.05）,NT-3的表达水平有上升趋势,与对照组比较差异无统计学意义（p>0.05）;3.体内实验发现,OBMSCs组大鼠SCI损伤局部脊髓空洞的面积显着小于对照组（p<0.05）,且NF200阳性面积显着高于对照组（p<0.05）,GFAP阳性面积显着低于对照组（p<0.05）;WB检测结果发现,OBMSCs组BDNF的表达水平显着高于对照组（p<0.05）,同时OBMSCs组NGF的表达水平呈上升趋势,较对照组差异无统计学意义（p>0.05）;在细胞移植3周后,OBMSCs组大鼠BBB功能评分显着高于对照组（p<0.05）;WB检测结果发现,OBMSCs组的p75NTR、TrkA、TrkB及TrkC表达水平显着高于对照组（p<0.05）,差异均具有统计学意义。【结论】本研究成功分离培养了BMSCs,PEMF在50Hz,1h/d,持续刺激9d的激励强度下,BMSCs表达最高的生物学活性,并表达高水平的BDNF和NGF。将高活力的BMSCs移植到大鼠SCI模型后,大鼠损伤局部脊髓空洞形成明显减少,且促进了神经元的存活和神经营养因子的表达,减少了胶质瘢痕的形成,同时大鼠运动功能得到了显着的改善。此外,OBMSCs组p75NTR、TrkA、TrkB及TrkC的表达显着增高,这可能提示了OBMSCs移植修复SCI的潜在信号通路和调控机制。
二、大鼠骨髓间充质干细胞适宜分离和培养条件的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大鼠骨髓间充质干细胞适宜分离和培养条件的研究（论文提纲范文）
（2）新型镁合金对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词量表 |
| 前言 |
| 第一部分 SD大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 SD大鼠BMSCs形态学观察 |
| 2.2 SD大鼠BMSCs贴壁率 |
| 2.3 SD大鼠BMSCs不同代生长曲线 |
| 2.4 SD大鼠BMSCs表面标志物的鉴定结果 |
| 2.5 SD大鼠BMSCs多向分化能力的鉴定结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 新型镁合金对骨髓间充质干细胞功能影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 SD大鼠BMSCs细胞黏附 |
| 2.2 SD大鼠BMSCs细胞增殖 |
| 2.3 SD大鼠BMSCs细胞毒性 |
| 2.4 SD大鼠BMSCs细胞凋亡 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 新型镁合金对骨髓间充质干细胞成骨分化作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 矿化结节检测 |
| 2.2 碱性磷酸酶活性测定 |
| 2.3 成骨相关基因表达 |
| 2.4 成骨相关蛋白表达 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四部分 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 骨髓间充质干细胞成骨分化的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（3）白藜芦醇/骨髓间充质干细胞联合治疗大鼠脊髓损伤的作用与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:大鼠脊髓损伤后Sirt-1 表达变化与炎症的关系探究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂与仪器设备 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 研究对象和实验分组 |
| 2.2.2 大鼠脊髓损伤模型的建立 |
| 2.2.3 样品取材 |
| 2.2.4 组织灌流 |
| 2.2.5 Western Blot检测 |
| 2.2.6 Elisa检测 |
| 2.2.7 免疫荧光染色 |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 脊髓损伤后不同时间点Sirt-1 表达的变化 |
| 3.2 脊髓损伤后不同时间点炎症因子表达的变化 |
| 3.3 脊髓损伤后Sirt-1 和炎症因子表达变化呈相关性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:白藜芦醇对大鼠骨髓间充质细胞炎症环境中的作用及作用机制 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 大鼠骨髓间充质干细胞培养及细胞操作 |
| 2.3.1 细胞培养环境及细胞培养液的制备配方 |
| 2.3.2 大鼠骨髓间充质干细胞原代培养方法 |
| 2.3.3 细胞换液 |
| 2.3.4 细胞传代 |
| 2.3.5 细胞冻存 |
| 2.3.6 细胞复苏 |
| 2.4 流式细胞术抗体标记检测 |
| 2.5 MTT检测 |
| 2.5.1 MTT检测TNF-α不同处理时长细胞生存率 |
| 2.5.2 MTT检测不同白藜芦醇浓度对TNF-α诱导炎症模型细胞生存率作用 |
| 2.6 细胞分组及处理 |
| 2.7 Elisa检测 |
| 2.8 Western Blot检测 |
| 2.8.1 Western Blot样品收集及制备 |
| 2.8.2 Western Blot检测 |
| 2.9 Real-Time PCR检测 |
| 2.9.1 RNA提取 |
| 2.9.2 cDNA合成 |
| 2.9.3 Real-Time PCR反应 |
| 2.10 流式细胞术凋亡检测 |
| 2.11 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 原代培养大鼠骨髓间充质干细胞光学显微镜下形态观察 |
| 3.2 原代培养的大鼠骨髓间充质干细胞表面抗原分子检测 |
| 3.3 骨髓间充质干细胞在炎症模型中细胞存活率与时间变化的关系 |
| 3.4 骨髓间充质干细胞在炎症模型中不同浓度白藜芦醇干预对细胞生存率的影响 |
| 3.5 白藜芦醇干预对大鼠骨髓间充质干细胞炎症刺激环境中炎症因子表达的变化 |
| 3.6 白藜芦醇对大鼠骨髓间充质干细胞在炎症刺激环境Sirt-1/NF-κB表达的干预 |
| 3.7 白藜芦醇对大鼠骨髓间充质干细胞在炎症刺激环境中凋亡蛋白表达的干预 |
| 3.8 白藜芦醇对大鼠骨髓间充质干细胞在炎症刺激环境中作用与Sirt-1 的关系 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:白藜芦醇/骨髓间充质干细胞联合治疗脊髓损伤的作用及机制 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂与仪器设备 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.2 研究对象和实验分组 |
| 2.3 大鼠脊髓损伤模型的建立 |
| 2.4 骨髓间充质干细胞显微注射移植 |
| 2.5 BBB评分 |
| 2.6 样品取材及组织灌流 |
| 2.7 Nissl染色 |
| 2.8 Western Blot检测 |
| 2.9 骨髓间充质干细胞荧光探针标记 |
| 2.10 免疫荧光染色 |
| 2.11 Elisa法检测 |
| 2.12 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同处理组大鼠脊髓损伤后运动功能的变化 |
| 3.2 不同处理组大鼠脊髓运动神经元的数量变化 |
| 3.3 不同处理组大鼠脊髓组织Sirt-1/NF-κB和炎症因子表达的变化 |
| 3.4 不同处理组大鼠脊髓组织凋亡相关蛋白表达的变化 |
| 3.5 白藜芦醇和骨髓间充质干细胞联合移植对骨髓间充质干细胞和神经元的作用 |
| 3.6 不同处理组大鼠脊髓组织BDNF表达的变化 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 白藜芦醇在脊髓损伤后的应用与机制 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）补骨脂素联合TGF-β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究（论文提纲范文）
| 序言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英汉缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 :大鼠BMSCs分离培养、纯化及鉴定 |
| 1.材料与设备 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 BMSCs分离培养 |
| 2.2 细胞传代、冻存与复苏细胞传代 |
| 2.3 BMSCs鉴定 |
| 3.实验结果 |
| 第二部分 :补骨脂素对大鼠BMSCs生长增殖的作用 |
| 1.材料与设备 |
| 1.1主要设备仪器:见表2-1 |
| 1.2主要实验试剂:见表2-2 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 配置不同浓度的含补骨脂素培养基 |
| 2.2 CCK-8细胞毒性实验 |
| 2.3 统计学方法 |
| 第三部分 :补骨脂素诱导兔BMSCs成软骨分化的实验研究 |
| 1.材料与设备 |
| 1.1主要设备仪器:见表3-1 |
| 1.2主要实验试剂:见表3-2 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 单层培养诱导分化 |
| 2.2 诱导分化效果鉴定: |
| 2.3 统计学方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 光学镜检 |
| 3.2 各组免疫细胞化学染色结果 |
| 3.3 western-blot检测结果 |
| 3.4 RT-PCR结果 |
| 讨论 |
| 1 祖国医学对软骨损伤的认识 |
| 1.1 软骨损伤病名: |
| 1.2 祖国医学对骨关节炎的病因认识 |
| 1.3 祖国医学对骨关节炎的病机认识 |
| 1.4 祖国医学关于骨关节炎辩证论治 |
| 1.4.1 骨关节炎的治法治则 |
| 2 现代医学对软骨损伤发病机制的研究 |
| 2.1 软骨细胞的凋亡 |
| 2.2 相关细胞因子 |
| 2.3 基因 |
| 2.4 免疫因素 |
| 2.5 基质蛋白酶(matrixmatalloproteinase,MMPs) |
| 3 中医药治疗软骨损伤的研究 |
| 4 中医药对骨髓间充质干细胞的诱导分化研究 |
| 5 中医药应用于软骨损伤治疗的临床研究进展 |
| 6 间充质干细胞培养方法及意义 |
| 6.1 间充质干细胞获取 |
| 6.2 间充质干细胞换液与传代 |
| 6.3 间充质干细胞培养环境 |
| 6.4 间充质干细胞鉴定 |
| 7 采用CCK-8法来观察骨髓间充质细胞増殖的原理及意义 |
| 8 诱导效果的鉴定及意义 |
| 8.1 光镜下形态学检测及意义 |
| 8.2 Ⅱ型胶原表达旳测定及意义 |
| 8.3 Sox9的表达及意义 |
| 8.4 诱导培养基的运用及意义 |
| 8.5 选择补骨脂素的原因及意义 |
| 8.6 肾精-骨髓间充质干细胞-软骨损伤 |
| 结论 |
| 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 干细胞治疗膝关节软骨缺损和骨关节炎的研究进展 |
| 参考文献 |
（5）骨髓间充质干细胞来源的外泌体通过TSG-6通路促进脊髓损伤修复的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词 |
| 引言 |
| 第一部分 骨髓间充质干细胞来源的外泌体对脊髓损伤的影响 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 骨髓间充质干细胞来源的外泌体治疗脊髓损伤的基因表达谱分析 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 骨髓间充质干细胞来源的外泌体通过TSG-6治疗脊髓损伤 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 脊髓损伤的细胞移植治疗 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（6）不同来源间充质干细胞外泌体修复缺血受损心肌功能差异及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 间充质干细胞的分离、培养及外泌体的提取与鉴定 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞来源 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 间充质干细胞培养 |
| 2.2 间充质干细胞鉴定 |
| 2.3 MSC外泌体的提取 |
| 2.4 外泌体鉴定 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 间充质干细胞形态观察 |
| 3.2 间充质干细胞鉴定结果 |
| 3.3 外泌体鉴定 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 不同来源间充质干细胞外泌体心肌修复功能的比较 |
| 1.材料 |
| 1.1 间充质干细胞来源的外泌体及细胞 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 体外实验 |
| 2.2 体内实验 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 体外实验 |
| 3.2 体内实验 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 不同来源间充质干细胞外泌体的蛋白质组学分析及功能验证 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞及外泌体准备 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 蛋白提取 |
| 2.2 胰酶酶解 |
| 2.3 液相色谱-质谱联用分析(LC-MS/MS Analysis) |
| 2.4 数据库搜索 |
| 2.5 蛋白质生物信息学分析 |
| 2.6 差异蛋白验证 |
| 2.7 统计方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 两种来源MSC外泌体的蛋白表达谱分析 |
| 3.2 蛋白质注释结果 |
| 3.3 差异表达蛋白质功能富集分析 |
| 3.4 验证差异蛋白的选择 |
| 3.5 差异蛋白验证结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 干细胞来源的外泌体在心肌梗死治疗中的作用进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间主要科研成果 |
| 中英文缩略词表 |
| 致谢 |
（7）胶原蛋白纳米超薄膜PDPB对大鼠股骨缺损修复的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 间充质干细胞的迁移和归巢以及提高其治疗效率的方法 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（8）低频电磁场联合VEGF干预的间充质干细胞复合PCL/HA支架修复大鼠颅骨缺损的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 磁场和 VEGF 对大鼠骨髓间充质干细胞成骨成血管的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 组织工程骨的体外构建 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 组织工程骨修复大鼠颅骨缺损的体内应用 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 综述 电磁场在骨组织工程中的研究现状及进展 |
| 参考文献 |
| 附录一 英文缩略词表 |
| 附录二 攻读学位期间发表论文目录 |
| 致谢 |
（9）硅—锶体系生物陶瓷离子释放规律及对骨/心肌组织修复相关生物学效应研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 生物材料概述 |
| 1.1.1 生物惰性陶瓷 |
| 1.1.2 生物活性陶瓷 |
| 1.2 生物活性陶瓷释放活性离子的生物学效应和其在组织修复中的应用 |
| 1.2.1 生物活性陶瓷释放活性离子的生物学效应 |
| 1.2.2 生物活性离子在组织修复中的应用 |
| 1.3 课题的提出及主要研究内容 |
| 1.3.1 课题的提出 |
| 1.3.2 课题的主要研究内容 |
| 第2章 钙-锶-硅体系生物玻璃/陶瓷离子释放行为研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 钙-锶-硅体系材料合成及表征 |
| 2.2.2 钙-锶-硅体系材料相转变 |
| 2.2.3 钙-锶-硅体系材料的离子释放行为 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 钙-锶-硅体系材料合成及表征 |
| 2.3.2 钙-锶-硅体系材料相转变 |
| 2.3.3 钙-锶-硅体系材料的离子释放行为 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 基于硅-锶离子协同对骨髓间充质干细胞的调控及其在骨组织工程的应用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 硅酸钙和硅酸锶生物陶瓷的合成及硅-锶离子浸提液的制备 |
| 3.2.2 硅-锶离子对人骨髓间充质干细胞增殖和干性维持的调控 |
| 3.2.3 硅-锶离子对人骨髓间充质干细胞成骨分化的调控 |
| 3.2.4 硅-锶离子复合生物活性水凝胶的制备及性能表征 |
| 3.2.5 硅-锶离子复合生物活性水凝胶体外成骨活性 |
| 3.2.6 硅-锶离子复合生物活性水凝胶体内生物活性 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 硅酸钙和硅酸锶生物陶瓷的合成及硅-锶离子浸提液的制备 |
| 3.3.2 硅-锶离子对人骨髓间充质干细胞增殖和干性维持的影响 |
| 3.3.3 硅-锶离子对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响 |
| 3.3.4 硅-锶离子复合生物活性水凝胶的制备及性能表征 |
| 3.3.5 硅-锶离子复合生物活性水凝胶体外成骨活性 |
| 3.3.6 硅-锶离子复合生物活性水凝胶体内生物活性 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 锶离子对心肌相关细胞的调控及对心肌损伤的修复作用研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 锶离子浸提液的制备 |
| 4.2.2 锶离子对血管形成的调控 |
| 4.2.3 锶离子对新生大鼠心肌细胞正常条件下细胞活性维持的调控 |
| 4.2.4 锶离子对新生大鼠心肌细胞缺氧损伤后细胞活性和凋亡的调控 |
| 4.2.5 锶离子复合水凝胶的制备及性能表征 |
| 4.2.6 锶离子复合水凝胶的体内生物学效应 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 锶离子浸提液的制备 |
| 4.3.2 锶离子对血管形成的影响 |
| 4.3.3 锶离子对新生大鼠心肌细胞正常条件下细胞活性维持的影响 |
| 4.3.4 锶离子对新生大鼠心肌细胞缺氧损伤后细胞活性和凋亡的影响 |
| 4.3.5 锶离子复合水凝胶的制备及性能表征 |
| 4.3.6 锶离子复合水凝胶的体内生物学效应 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 全文总结和展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（10）脉冲电磁场激励骨髓间充质干细胞修复脊髓损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、骨髓间充质干细胞分离和培养 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验材料和器械 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 细胞形态观察 |
| 1.2.2 BMSCs细胞流式细胞仪鉴定 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 间充质干细胞的特点 |
| 1.3.2 骨髓间充质干细胞的分离和培养 |
| 1.3.3 骨髓间充质干细胞的应用 |
| 1.4 小结 |
| 二、PEMF激励BMSCs制备高活力种子细胞 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 选择最佳脉冲电磁场强度 |
| 2.2.2 观察干预后神经营养因子表达水平 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 脉冲电磁场在医学领域的应用 |
| 2.3.2 神经营养因子的生物学作用 |
| 2.4 小结 |
| 三、高活力BMSCs移植修复脊髓损伤的实验研究 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 行为学观察 |
| 3.2.2 组织学修复情况 |
| 3.2.3 WB检测结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 脊髓损伤的机制探讨 |
| 3.3.2 细胞移植治疗SCI相关机制 |
| 3.4 小结 |
| 四、高活力BMSCs移植修复脊髓损伤的机制研究 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 观察各组p75NTR-Trk蛋白表达水平 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、大鼠骨髓间充质干细胞适宜分离和培养条件的研究（论文参考文献）
- [1]整合素靶向肽促进SD大鼠骨髓间充质干细胞的增殖[J]. 贾麒钰,黄晓夏,郭建,黄金勇,郭晓斌,阿卜杜萨拉木·阿力木江,吴桐,马创. 中国组织工程研究, 2022
- [2]新型镁合金对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响及机制研究[D]. 李强强. 兰州大学, 2021(09)
- [3]白藜芦醇/骨髓间充质干细胞联合治疗大鼠脊髓损伤的作用与机制研究[D]. 赵浩森. 中国医科大学, 2021(02)
- [4]补骨脂素联合TGF-β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究[D]. 高子茏. 成都中医药大学, 2020(02)
- [5]骨髓间充质干细胞来源的外泌体通过TSG-6通路促进脊髓损伤修复的作用及机制研究[D]. 董万亮. 郑州大学, 2020
- [6]不同来源间充质干细胞外泌体修复缺血受损心肌功能差异及机制研究[D]. 陈一欢. 苏州大学, 2020(06)
- [7]胶原蛋白纳米超薄膜PDPB对大鼠股骨缺损修复的研究[D]. 甘凤山. 昆明医科大学, 2020
- [8]低频电磁场联合VEGF干预的间充质干细胞复合PCL/HA支架修复大鼠颅骨缺损的研究[D]. 陈靖元. 华中科技大学, 2020(01)
- [9]硅—锶体系生物陶瓷离子释放规律及对骨/心肌组织修复相关生物学效应研究[D]. 邢敏. 中国科学院大学(中国科学院上海硅酸盐研究所), 2019(03)
- [10]脉冲电磁场激励骨髓间充质干细胞修复脊髓损伤的实验研究[D]. 李玉琳. 天津医科大学, 2019(02)