一、琥珀酸在慢性癫痫模型的作用研究（论文文献综述）
陈思宇[1]（2021）在《ALOXE3过表达在匹罗卡品诱导癫痫发作小鼠模型中发挥神经保护作用的研究》文中进行了进一步梳理【研究背景】癫痫是一种由于大脑神经元突发性异常放电引起的神经系统中的常见疾病,其起病机制复杂,发病原因众多,反复发作的癫痫可导致大脑神经元受损。已有多项研究证明癫痫的发病需经过急性期、沉默期、自发性癫痫期三个时期,其中癫痫急性期为癫痫疾病发生发展过程中的重要时期,人们认为在癫痫急性期中产生的伤害可能会逐渐演化为一些与自发性癫痫形成有关的病理生理现象,如神经元凋亡、苔藓纤维发芽、突触回路重新形成、异位细胞增殖和胶质细胞激活。花生四烯酸（Arachidonic acid,AA）是一种在人体中广泛存在的不饱和脂肪酸,既往的研究表明,在癫痫发生后AA会在大脑中堆积,继而促使神经突触谷氨酸释放增多,导致神经网络兴奋性的进一步增高。但AA的代谢在癫痫发生发展中的作用需要进一步鉴定。花生四烯酸脂氧合酶-3（Arachidonate lipoxygenase 3,ALOXE3）是AA的脂氧合酶代谢途径中的主要催化酶。我们近期发现ALOXE3在小鼠海马中与神经元共定位,且ALOXE3在小鼠海马的局部过表达可以减轻匹罗卡品诱导的癫痫的严重程度。但ALOXE3在整体动物水平上过表达在癫痫的发生发展中的作用仍未被研究。在我们的另一项研究中发现,一例Dravet综合征患者的ALOXE3启动子区域中的一个位点变异后可以使ALOXE3酶活性下降,通过该变异可使AA含量上升。综上所述,ALOXE3有可能通过参与脑中AA的代谢,在癫痫的发生发展过程中起到一定的作用,但关于其到底起到促进还是抑制作用仍需进一步探讨。【研究目的】本研究通过构建过表达Aloxe3基因小鼠模型,探索其对匹罗卡品（Pilocarpine）诱导癫痫小鼠模型急性期海马中AA含量及发作程度的影响并验证其在癫痫发生发展过程中的神经保护作用,为理解癫痫发病的机制及相关临床应用提供新的依据。【研究方法】（1）利用Piggy BAC转座酶系统,构建Thy1-Aloxe3-3XFlag过表达转基因小鼠模型,用PCR鉴定初代阳性小鼠。并用Western blot及RT-q PCR实验验证过表达转基因小鼠后代海马中ALOXE3蛋白及m RNA的表达水平。（2）采用观测及测量称重方法对比Aloxe3过表达转基因小鼠和WT小鼠在外表、身长及体重的差异。（3）采用Western blot分析了WT及转基因小鼠癫痫急性期时的ALOXE3蛋白表达水平,ELISA实验分析AA在8周龄WT小鼠匹罗卡品癫痫模型急性期海马、Aloxe3过表达转基因小鼠匹罗卡品癫痫模型急性期海马、WT小鼠对照组海马及Aloxe3过表达转基因小鼠对照组海马中的含量。（4）采用行为学观测方法检测8周龄WT小鼠及Aloxe3过表达转基因小鼠在小鼠癫痫急性期的癫痫发作程度。（5）采用Western blot分析了WT及转基因小鼠在癫痫沉默期（10 d）小鼠海马中ALOXE3的蛋白表达水平。（6）采用荧光玉染色（Fluoro-Jade C,FJC）及电镜观察实验方法检测8周龄WT小鼠匹罗卡品癫痫模型沉默期海马、Aloxe3过表达转基因小鼠匹罗卡品癫痫模型沉默期海马、WT小鼠对照组海马及Aloxe3过表达转基因小鼠对照组海马CA1及CA3中神经元损伤情况及海马中神经元及线粒体的形态变化。（7）采用行为学观测方法检测8周龄WT小鼠匹罗卡品癫痫模型及Aloxe3过表达小鼠匹罗卡品癫痫模型在自发性癫痫期的癫痫自发情况。【研究结果】工具鼠的建立:（1）构建Aloxe3过表达转基因小鼠模型,使用PCR技术验证了初代阳性鼠并用Western blot及RT-q PCR验证了其后代海马中ALOXE3的过表达效果。（2）通过观测、测量及称重证明了Aloxe3过表达转基因小鼠与同周龄WT小鼠相比其外表、身长及体重无区别。以上说明Aloxe3过表达转基因对小鼠表型无影响。ALOXE3过表达在急性期的作用:（1）通过Western blot实验证明了癫痫急性期（12 h）中小鼠海马中ALOXE3蛋白水平表达下降（**P<0.01）,ELISA实验证明了ALOXE3过表达可使AA在癫痫急性期小鼠海马中的含量减少（**P<0.01）,说明ALOXE3过表达可逆转由SE的导致的ALOXE3蛋白表达水平下降,并同时调节海马中AA含量。（2）通过行为学观测WT小鼠及Aloxe3过表达小鼠癫痫急性期发作程度行为学结果显示,与WT小鼠相比,Aloxe3过表达小鼠在首次肌肉阵挛性抽动、强直性后肢伸展、死亡的潜伏期和持续5 s以上的阵挛性惊厥均明显延长,且死亡率降低（*P<0.05）。以上说明ALOXE3过表达可使小鼠癫痫急性期发作程度减轻。ALOXE3过表达在沉默期的作用:（1）通过Western blot实验证明了Aloxe3过表达可使小鼠匹罗卡品癫痫模型癫痫沉默期（10 d）中的ALOXE3蛋白表达水平上调（*P<0.05）,说明Aloxe3过表达可逆转由于小鼠由于进入癫痫沉默期导致的ALOXE3蛋白水平表达下降。（2）FJC结果显示Aloxe3过表达转基因小鼠在癫痫沉默期中海马CA1及CA3损伤神经元明显减少（*P<0.05）,说明ALOXE3过表达在小鼠癫痫沉默期对海马神经元有保护作用。（3）电镜结果显示在小鼠癫痫沉默期中,Aloxe3过表达转基因小鼠海马中的神经元及线粒体形态轻度异常,WT小鼠海马中的神经元及线粒体形态重度异常,说明ALOXE3过表达在小鼠癫痫沉默期中对海马神经元及线粒体有保护作用。ALOXE3过表达在自发性癫痫期的作用:（1）观测WT小鼠及Aloxe3过表达转基因小鼠自发性癫痫期行为学结果显示,Aloxe3过表达转基因小鼠在发作频率及发作持续时间上较WT小鼠明显减少（*P<0.05）。以上提示ALOXE3过表达可减少小鼠匹罗卡品癫痫模型自发性癫痫的严重程度。【结论】本研究表明ALOXE3过表达可通过降低匹罗卡品癫痫小鼠模型癫痫急性期海马中AA的含量,使癫痫急性期发作程度下降,在癫痫疾病发生发展中对神经元起到保护作用,最终缓解自发性癫痫发作程度。本研究在整体动物上验证了ALOXE3过表达的神经保护作用,为寻找癫痫潜在治疗靶点提供了数据。
高晓宇[2]（2020）在《天麻素对小鼠癫痫持续状态后海马组织自噬的作用及机制》文中指出背景:癫痫是由各种原因导致的脑部神经元高度同步化异常放电的慢性脑部疾病,具有较高的患病率、致残率、死亡率。反复发作的癫痫可加重脑神经元的损伤,据报道自噬可能参与了癫痫后脑损伤的病理生理机制。适度的自噬对机体维持内环境的稳态起着不可或缺的作用,但是过度激活的自噬反而会造成机体细胞的死亡。有研究显示自噬可能是癫痫后海马神经元死亡的原因且与癫痫后脑损伤密不可分。目前临床以抗癫痫药治疗为主,但缺乏很有效的脑保护剂。因此把自噬作为靶点来寻求有效的治疗药物是今后研究中不可忽视的新方向。天麻素（GAS）,是天麻中最重要的生物活性成分,临床用于治疗头痛、头晕等疾病。有研究显示在双侧颈总动脉结扎诱导的血管性痴呆（VD）模型中,天麻素通过抑制自噬减轻海马神经元损伤。这提示我们天麻素可能通过抑制自噬减轻癫痫后脑损伤,但具体作用及机制仍需进一步研究。本研究旨在观察自噬在癫痫持续状态（SE）中的表达特点及天麻素对癫痫持续状态后脑损伤的作用,从而为探索癫痫脑损伤的发病机制及临床治疗提供新的思路和实验依据。方法:（1）本实验通过建立匹鲁卡品诱导的癫痫持续状态（SE）模型,选择56只雄性C57BL/6黑色小鼠,将小鼠随机分为对照组、SE组,分别于SE后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h取海马组织,每组4只。应用qRT-PCR与Western blot分别检测海马组织中Beclin-1及LC3的mRNA及蛋白水平的表达及变化规律。（2）选择40只雄性C57BL/6黑色小鼠,按上述方法制作模型,按不同处理随机分为对照组、SE组、GAS50 mg/kg组、GAS100 mg/kg组、GAS150 mg/kg组,每组4只,将0.2g天麻素注射液溶于83 ml生理盐水中,分别按50 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg剂量腹腔注射给药,2次/日,于SE后自噬活性表达最高的时间点取海马组织,应用qRT-PCR与Western blot分别检测海马中Beclin-1及LC3的mRNA及蛋白水平的表达及变化规律。（3）选择32只雄性C57BL/6黑色小鼠,按上述方法制作模型,将小鼠随机分为对照组、SE组、GAS150 mg/kg组、WM组,每组4只,将5 mg WM溶于1 ml二甲基亚砜（DMSO）中,后用生理盐水配制于12.5 ml,按1 mg/kg剂量在给予硫酸阿托品30 min前腹腔注射干预,于SE后自噬活性表达最高的时间点取海马组织,应用qRT-PCR与Western blot分别检测海马中Beclin-1及LC3的mRNA及蛋白水平的表达及变化规律。结果:（1）与对照组相比,小鼠海马组织Beclin-1 mRNA的表达在SE后72 h达最高,96 h开始下降,但仍未降至正常水平,差异具有统计学意义（P﹤0.05）;与对照组相比,Beclin-1蛋白的表达在SE后72 h达最高,差异具有统计学意义（P﹤0.05）。（2）与对照组相比,小鼠海马组织LC3 mRNA的表达在SE后72 h达最高,96 h开始下降,但仍未降至正常水平,差异具有统计学意义（P﹤0.05）;与对照组相比,LC3II/I比值在SE后72 h达最高,差异具有统计学意义（P﹤0.05）。（3）与对照组相比,小鼠海马组织Beclin-1 mRNA的表达在SE组明显升高;与SE组相比,Beclin-1 mRNA的表达在GAS100 mg/kg组开始降低,于GAS150mg/kg组降至最低,差异具有统计学意义（P<0.05）;与对照组相比,Beclin-1蛋白的表达在SE组明显升高;与SE组相比,Beclin-1蛋白的表达在GAS150 mg/kg组降至最低,差异具有统计学意义（P<0.05）。（4）与对照组相比,小鼠海马组织LC3 mRNA的表达在SE组明显升高;与SE组相比,LC3 mRNA的表达在GAS100 mg/kg组开始降低,于GAS150 mg/kg组降至最低,差异具有统计学意义（P<0.05）;与对照组相比,LC3II/I比值在SE组明显增高;与SE组相比,LC3II/I比值在GAS100 mg/kg组开始降低,在GAS 150 mg/kg组降至最低,差异具有统计学意义（P<0.05）。（5）与对照组相比,小鼠海马组织Beclin-1 mRNA的表达在SE组明显升高;与SE组相比,Beclin-1 mRNA的表达在GAS150 mg/kg组显着降低;与GAS150mg/kg组相比,Beclin-1 mRNA的表达在WM组增高且低于SE组,差异具有统计学意义（P<0.05）;与对照组相比,小鼠海马组织的Beclin-1蛋白的表达在SE组明显升高;与SE组相比,Beclin-1蛋白的表达在GAS150 mg/kg组显着降低;与GAS150 mg/kg组相比,Beclin-1蛋白的表达在WM组显着增加,但仍低于SE组,差异具有统计学意义（P<0.05）。（6）与对照组相比,小鼠海马组织LC3 mRNA的表达在SE组明显升高;与SE组相比,LC3 mRNA的表达在GAS150 mg/kg组显着降低;与GAS150 mg/kg组相比,LC3 mRNA的表达在WM组增高,且低于SE组,差异具有统计学意义（P<0.05）;与对照组相比,LC3II/I比值在SE组明显升高;与SE组相比,LC3II/I比值在GAS150 mg/kg组显着降低;与GAS150 mg/kg组相比,LC3II/I比值在WM组显着增加,但仍低于SE组,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:（1）Beclin-1、LC3在SE小鼠中表达增高,增高程度具有时间依赖性,提示自噬可能参与了SE后脑损伤;（3）天麻素可降低Beclin-1、LC3表达,降低程度与天麻素剂量相关,提示天麻素可能对SE后脑损伤具有保护作用;（5）WM可减弱天麻素对自噬活性因子Beclin-1、LC3的影响,提示天麻素可能通过调节自噬在SE后脑损伤中发挥作用。
赵雪[3]（2020）在《α-细辛醇抗慢性癫痫作用机制的代谢组学研究》文中指出癫痫是一种复杂的慢性脑部疾病,以长期反复发作和所累及的中枢神经生物学异常为主要特征。α-细辛醇是中药石菖蒲活性成分α-细辛醚在体内的核心代谢物之一,其抗癫痫活性强且毒副作用低,具有成为一种新型抗癫痫药物的潜力,但其作用机制有待更为深入地研究。本论文首先对α-细辛醇的抗癫痫效用进行评价,再结合基于NMR代谢组学方法考察癫痫发生发展的动态过程以及α-细辛醇干预癫痫大鼠的代谢模式,从代谢水平监测癫痫发作过程筛选生物标志物,阐释α-细辛醇抗癫痫的分子机制,在以中药为源泉将α-细辛醇开发成抗癫痫新药方面具有重要意义。（1）给予大鼠隔天腹腔注射PTZ亚惊厥剂量（35mg/kg）29天,依据神经行为学、脑电图、脑内神经递质水平和组织病理学对癫痫模型进行评价;α-细辛醇（50 mg/kg）灌胃给药后能够显着降低癫痫发作等级、延长癫痫发作潜伏时间、抑制大脑异常放电、调节神经递质紊乱、保护神经元受损。结果表明,α-细辛醇具有抗癫痫活性,其效用与临床西药苯妥英钠相当、优于传统中成药α-细辛醚。（2）采用基于NMR的代谢组学方法,分析慢性癫痫模型大鼠血浆、尿液和粪提取液在点燃前（Day0）、点燃初期（Day5）、点燃期（Day15）和完全点燃期（Day29）的代谢模式,筛选出与癫痫发生发展过程相关的潜在生物标志物（血浆中24个、尿液中14个、粪样中30个）。主要涉及氨基酸代谢、脂肪酸代谢和能量代谢等过程,推断癫痫疾病的发生发展与能量缺乏、神经炎症、神经毒性以及线粒体功能异常有关。（3）采用基于NMR的代谢组学方法,分析药物（α-细辛醇、α-细辛醚和苯妥英钠）干预PTZ诱导癫痫大鼠血浆、尿液、粪提取液和脑组织提取物的代谢模式,发现三种药物均可使癫痫大鼠的代谢水平向正常动物回调,但是α-细辛醇的调节作用不同于α-细辛醚和苯妥英钠。共有6条代谢途径与α-细辛醇抗癫痫作用相关度较高,依次为丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢,酮体代谢,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,苯丙氨酸代谢,烟酸和烟酰胺代谢。表明α-细辛醇通过调节兴奋性与抑制性神经递质平衡、改善线粒体功能、强化脑组织能量代谢,以及提高烟酰胺的水平降低谷氨酸毒性发挥抗癫痫作用。
金玉子[4]（2020）在《柚皮素通过Nrf2/HO-1通路抑制氧化损伤及其对癫痫大鼠的神经保护作用机制研究》文中指出目的:癫痫是多种病因导致的慢性脑部病变,以大脑神经元过度、反复超同步化放电为特征,临床表现为短暂性中枢神经系统功能失常的综合征。氧化应激损伤、谷氨酸兴奋性毒性、钙超载等多种因素都能诱导神经元异常放电触发癫痫。其中氧化应激产生的氧自由基连锁反应是神经元受损的核心病理环节。已有研究表明,癫痫发作时脑内自由基含量明显增加,ROS大量产生和释放,会引起细胞内氧化还原平衡状态被打破,导致一系列诸如DNA损伤、细胞膜结构被破坏、线粒体等细胞器被破坏等现象,最终导致细胞凋亡。因此,抑制氧化应激和清除氧自由基可能是癫痫治疗的重要策略。Keap1-Nrf2-ARE信号通路在细胞抗氧化过程中起着重要作用。Keap1为E3泛素连接酶CUL3提供支架,而后者能够通过泛素-蛋白酶体介导Nrf2降解,使Nrf2仅维持较低水平,以保证日常生命活动。氧化应激时,上游相关信号通路被激活,介导Nrf2降解终止并入核,促进下游HO-1等抗氧化相关基因的转录,参与细胞抗氧化防御机制。柚皮素为黄酮类化合物,具有较强的抗氧化活性。本研究以癫痫持续状态大鼠模型和人神经母细胞瘤细胞氧化损伤模型为研究对象,通过体内和体外实验,探讨柚皮素对癫痫大鼠脑损伤的神经保护作用以及通过Nrf2/HO-1通路抑制神经细胞氧化损伤的可能作用机制,为癫痫的抗氧化治疗提供研究基础。研究方法:1.建立氯化锂-匹罗卡品诱导的大鼠癫痫持续状态（status epilepticus,SE）模型,实验分为对照组、SE组和柚皮素组。应用脑电记录仪检测大鼠脑电图改变;水迷宫实验观察大鼠空间学习记忆能力;HE染色观察大鼠海马组织病理改变;尼氏染色观察存活神经元变化;TUNEL染色检测程序化死亡细胞;Western blot检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、Nrf2和HO-1蛋白表达水平。2.体外培养人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）,MTT检测各组细胞增殖活性;DCFH-DA荧光染色检测活性氧（ROS）水平;JC-1荧光染色和罗丹明123染色检测线粒体膜电位;流式细胞分析检测细胞凋亡率;Western blot检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cyto C蛋白表达变化。3.Western blot检测Nrf2和HO-1蛋白表达水平;免疫荧光观察Nrf2核内移情况以及HO-1蛋白定位;免疫共沉淀检测Nrf2与Keap1蛋白相互作用;转染Nrf2shRNA质粒,Western blot验证质粒转染效果;Western blot检测Nrf2基因沉默后各组细胞Nrf2、HO-1蛋白表达水平;Western blot检测pERK、ERK、pAKT、AKT蛋白表达水平;流式细胞分析检测细胞凋亡率;MTT检测细胞增殖活性。结果:1.脑电记录仪结果显示,对照组大鼠脑电图节律规整,未见异常波形;癫痫组大鼠脑电图可见广泛性棘波节律发放。2.水迷宫实验结果显示,与对照组比较,癫痫模型组大鼠的逃避潜伏期明显延长;柚皮素干预组逃避潜伏期明显缩短;与对照组相比,癫痫模型组大鼠穿越平台次数明显减少,柚皮素干预组大鼠穿越平台次数显着增加。3.HE染色结果显示,对照组大鼠海马组织结构和形态基本正常,细胞着色均匀,排列较规整,细胞核及核仁的大小正常,胞浆及胞核清亮,呈现浅红色及淡蓝色。癫痫后12h组,神经元细胞发生肿胀,胞浆透明,胞核及胞浆着色不均匀,细胞结构与形态紊乱;癫痫后ld组,可见锥体细胞明显丢失,神经元体积缩小,细胞核呈现固缩深染,核仁变小甚至消失,胞核及胞浆染色呈深蓝色和紫蓝色,且着色不均匀,大小不一,形态紊乱;癫痫后3d、7d和14d组,细胞形态与结构较癫痫后ld时逐渐恢复,神经元胞核及胞浆着色较前均匀,形态基本规整。4.尼氏染色结果显示,对照组大鼠海马区椎体神经元排列规则紧密,形态完整,核仁清晰,胞浆内尼氏体丰富,没有明显神经元丢失;与对照组相比,癫痫后ld组,大鼠海马神经元丢失明显,排列紊乱,可见细胞皱缩,染色质凝集成块、胞核固缩,胞浆内尼氏体明显减少;癫痫后3d、7d和14d组可见锥体细胞数目逐步回升,细胞间隙缩小,排列较规整,胞浆内尼氏体分布较丰富,核仁深染、固缩、碎裂等现象逐渐好转。5.Western blot结果显示,与对照组比较,癫痫后12h Nrf2表达水平升高,癫痫后1d达到高峰,3d、7d和14d逐渐下降。6.Western blot结果显示,与对照组比较,癫痫后12h HO-1表达水平升高,癫痫后1d达到高峰,3d、7d和14d逐渐下降。7.HE染色结果显示,与对照组相比,癫痫组细胞形态与结构明显紊乱,锥体细胞显着丢失,神经元体积缩小,细胞核固缩深染,核仁变小甚至消失。与癫痫组相比,柚皮素干预组细胞形态与结构较癫痫组明显恢复,锥体细胞丢失减少,胞核及胞浆着色较前均匀。8.尼氏染色观察柚皮素对癫痫大鼠海马组织病理损伤的影响。结果显示,与对照组相比,癫痫组大鼠海马神经元丢失明显,排列紊乱,可见细胞皱缩,染色质凝集成块,尼氏体数量显着减少。与癫痫组相比,柚皮素干预组海马神经元边缘较清晰,仅有少量染色质凝集,尼氏体数量显着增加。9.TUNEL染色结果显示,对照组海马神经元胞核呈蓝色,细胞排列规整,着色均匀,偶见凋亡神经元;与对照组相比,癫痫组大鼠海马神经元TUNEL阳性细胞数显着增多;与癫痫组相比,柚皮素干预组TUNEL阳性细胞数明显减少。10.Western Blot结果表明,柚皮素可上调癫痫大鼠海马Bcl-2/Bax比例,抑制Caspase-3的激活。11.Western blot实验结果显示,与对照组比较,癫痫组大鼠海马组织Nrf2表达升高;与癫痫组比较,柚皮素干预组Nrf2表达显着升高。12.Western blot实验结果显示,与对照组比较,癫痫组大鼠海马组织HO-1表达升高;与癫痫组比较,柚皮素干预组HO-1蛋白表达显着升高。13.MTT检测结果显示,柚皮素呈剂量依赖性抑制H2O2诱导的SH-SY5Y细胞增殖活性的降低。14.H2DCF-DA荧光染色检测细胞内ROS,结果表明H2O2组ROS显着增多;柚皮素干预可显着抑制H2O2诱导引起的ROS释放增加。15.线粒体膜电位检测结果显示,H2O2组线粒体膜电位显着降低;柚皮素干预可抑制H2O2诱导引起的线粒体膜电位下降。16.流式细胞分析发现,H2O2组凋亡率显着增多,柚皮素干预可抑制H2O2诱导的凋亡增加。17.Western Blot结果显示,氧化应激条件下,柚皮素可上调Bcl-2/Bax比例;抑制细胞色素C的释放;抑制Caspase-3的激活。18.Western Blot结果显示,柚皮素上调HO-1的表达,免疫荧光结果显示上调的HO-1主要分布于细胞浆内。19.柚皮素激活Nrf2,Western Blot结果显示,柚皮素上调Nrf2的表达;柚皮素促进Nrf2进入细胞核,免疫荧光结果亦显示柚皮素促进Nrf2的进入细胞核。20.免疫共沉淀实验结果显示,对照组Nrf2与Keap1存在蛋白相互结合,柚皮素干预后,Nrf2与Keap1结合明显减少。21.Western Blot结果显示,转染shRNANrf2后,SH-SY5Y细胞Nrf2和HO-1蛋白表达水平均降低。22.Western Blot结果显示,沉默Nrf2后抑制柚皮素对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞Nrf2和HO-1表达升高。23.流式细胞凋亡检测发现,Nrf2沉默部分逆转柚皮素对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的抑制作用。24.柚皮素激活ERK1/2和PI3K/Akt。Western Blot免疫印迹结果显示,柚皮素时间依赖性激活ERK1/2和PI3K/Akt。25.ERK1/2抑制剂PD98059和PI3K/Akt抑制剂LY294002抑制柚皮素引起的HO-1表达上调,提示ERK1/2和PI3K/Akt参与柚皮素诱导的HO-1的表达上调。26.HO-1活性抑制剂ZnPP预处理可逆转柚皮素对H2O2诱导的氧化损伤的抑制作用,说明柚皮素上调HO-1的表达参与抑制H2O2诱导的氧化损伤。结论:1.柚皮素改善癫痫大鼠的空间学习记忆能力。2.柚皮素通过抗凋亡途径抑制癫痫大鼠脑损伤。3.柚皮素促进癫痫大鼠海马神经元Nrf2和HO-1的表达。4.柚皮素可能通过线粒体相关抗凋亡途径抑制SH-SY5Y细胞氧化损伤。5.柚皮素通过促进Keap1与Nrf2解离上调Nrf2表达。6.柚皮素通过激活ERK1/2和Akt通路上调Nrf2依赖的HO-1表达。总之,柚皮素对匹罗卡品诱导的幼年癫痫大鼠脑损伤具有神经保护作用。柚皮素通过激活ERK1/2和Akt通路,进而上调Nrf2/HO-1通路,从而抑制H2O2诱导的SH-SY5Y细胞氧化损伤。
刘伟[5]（2019）在《转录因子KLF4的抗癫痫作用及其机制研究》文中指出癫痫是常见的神经系统疾病,以大脑神经元异常放电活动引起的暂时性的症状或综合征（例如:强直性抽搐或痉挛性抽搐）为主要特征,通常具有持久性的发作倾向。癫痫的病因主要是神经系统兴奋与抑制间的失衡,如神经兴奋性提高及兴奋性、抑制性的神经传导机制失衡。目前认为,癫痫的发病机制可能涉及神经递质及其受体功能异常、离子通道功能受损、遗传因素、轴突发芽以及星型胶质细胞异常等。这些发病机制中涉及到很多基因,由基因突变或者表达变化引起蛋白表达或功能失常都可能参与癫痫的发病。虽然已经报道很多基因与癫痫发病密切相关,但临床上单基因遗传型的癫痫非常罕见,绝大多数情况是多种基因功能异常和外界因素协同作用的结果。随着测序技术和CRISPR等基因编辑技术的不断成熟,各种基因在癫痫发病中的作用和致病机理也逐渐被揭秘。转录因子在基因表达中扮演着重要的角色,但在癫痫发病机制的研究中关注得较少。近年来,研究发现肿瘤相关的转录因子可以参与神经系统疾病的发病。P53是肿瘤研究中非常广泛的转录因子,能激活参与促进生长停止或细胞死亡的基因。最近的研究发现P53在癫痫的中具有非常重要的作用。多种癫痫模型中,包括PTZ癫痫模型、红藻氨酸癫痫模型及顽固性颞叶癫痫患者,发现海马P53表达水平增加。P53表达增加可介导神经元凋亡、增加癫痫易感性,而P53基因敲除或表达下调后可产生抗癫痫作用。KLF4是P53的上游蛋白,是转录抑制因子,参与氧化应激、神经炎性反应、神经再生、干细胞分化及细胞凋亡等多个神经生物过程。海马颗粒细胞轴突（苔藓纤维）发芽是癫痫后海马轴突再生和突触可塑性的重要表现,引起癫痫易感性增加,KLF4是调控轴突生长最重要的转录因子。KLF4基因敲除后的视网膜神经节细胞在体外和体内视神经损伤后均表现出轴突再生能力增加,KLF4过表达后显着降低了海马神经元轴突再生,而在正常生理状态下KLF4对轴突再生是抑制的。此外研究发现PTZ诱导的大鼠癫痫模型中,海马KLF4蛋白表达显着降低,苔藓纤维出芽显着增加。基于以上证据,我们认为KLF4可能参与癫痫发病,海马神经元KLF4过表达后可能产生抗癫痫作用。在本研究中,我们通过行为药理学、电生理学、分子生物学和基因组学等研究方法,探究了KLF4在癫痫发病中作用及其机制。我们首先验证了致癫痫药物PTZ和抗癫痫药物VPA及CBZ对大鼠癫痫行为的影响及对海马KLF4蛋白的调控。结果显示PTZ抑制KLF4表达,而VPA和CBZ都会使KLF4表达增加。接着,在小鼠PTZ模型中,我们观察到了与大鼠相同的实验结果,同时PTZ小鼠海马P53表达增加,给予VPA后P53表达降低。在体外研究中,我们将小鼠海马锥体细胞进行原代培养,通过慢病毒感染使锥体细胞KLF4基因过表达。电生理记录证明PTZ可使海马锥体细胞动作电位频率显着增加,KLF4过表达后可显着降低PTZ诱导的动作电位频率增加。这表明KLF4与神经元兴奋性有关,并且KLF4表达上调后可能产生抗癫痫作用。进一步通过脑立体定位微量注射技术,我们在小鼠海马区过表达KLF4蛋白,行为学结果表明KLF4过表达后增加了癫痫的潜伏期。蛋白免疫印记实验结果表明,KLF4表达增加可直接引起P53表达下调。同时我们通过免疫组织化学和免疫荧光技术研究了海马区KLF4过表达后对海马和梨状皮质c-fos表达的影响。结果显示PTZ可显着增加海马和梨状皮质神经元c-fos表达,海马KLF4过表达后降低了两个脑区中神经元c-fos表达,同时蛋白免疫印记实验证明了KLF4过表达后GAD67的表达增加,对GAD65无影响。此外,我们实验室目前正在进行与长春市七色光特殊教育机构合作进行一项癫痫及自闭症儿童的基因组学研究,目前已经完成了6名儿童的全基因组重测序,包括其中2名癫痫合并自闭症,2名自闭症及2名正常儿童。结果发现KLF4 rs2236599,GABRA6 rs13184586、GABRB2 rs2808536、GABBR1 rs29225可能是与癫痫相关的SNP,GABRG2 rs211037、GABRD rs2229110和rs28398772、SLC6A13 rs2289954、GABBR2 rs10985765和rs2304389可能与癫痫和自闭症均相关。上述研究结果表明:KLF4表达上调可能参与VPA和CBZ的抗癫痫作用;KLF4表达上调后具有抗癫痫作用,KLF4过表达后可显着降低PTZ诱导的海马锥体细胞动作电位频率增加;小鼠海马KLF4过表达后可显着延长癫痫潜伏期,降低PTZ引起的海马及梨状皮质c-fos过表达,这种抗癫痫作用可能通过抑制P53和激活GAD67介导。KLF4 rs2236599,GABRA6rs13184586、GABRB2 rs2808536、GABBR1 rs29225可能是与癫痫相关的SNP,GABRG2 rs211037、GABRD rs2229110和rs28398772、SLC6A13 rs2289954、GABBR2 rs10985765和rs2304389可能与癫痫和自闭症均相关。转录因子KLF4对多个基因都具有调控作用,是否有其他机制参与KLF4的抗癫痫作用需要进一步研究,同时我们测序发现的相关SNPs其生物学和临床价值仍需深入研究。
邓楚欣[6]（2019）在《PTA对癫痫大鼠的疗效及对GABA能系统和BDNF/TrkB表达的影响》文中研究指明目的:研究半夏生物总碱（Pinelliatotal alkaloids,PTA）对匹罗卡品（Pilocarpine,PILO）癫痫大鼠模型的治疗作用及可能机制;并评价PTA对健康小鼠神经系统的运动及认知功能的抑制作用。方法:1.雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠92只,首先进行第1次强迫路线转换测试（Forced alternation test,FAT）、旷场活动（Open field locomotion,OFL）及自发路线转换测试（Spontaneousalternationtest,SAT）。然后随机分为致痫组（n=74）和对照组（n=18）,前者使用氯化锂（LiCl）-匹罗卡品（Pilocarpine,PILO）法诱发癫痫持续状态（Status epilepticus,SE）并持续90分钟。致痫组在SE后第6天仍存活的大鼠再随机分到癫痫对照组（Epilepsy group,EP 组;n=13）、托吡酯组（Topiramategroup,TPM组;n=12）、PTA-400组（n=12）和PTA-800组（n=13）;而对照组存活的大鼠全部进入正常对照组（Normal control group,NC 组;n=17）。TPM 组予 TPM60mg/kg,PTA-400组予PTA 400mg/kg,PTA-800组予PTA 800mg/kg,EP组和NC组予等体积的生理盐水,每天灌胃1次,连续14天。治疗结束后,先复查FAT、OFL及SAT,再进行为期7天、每天8小时的自发痫性发作（Spontaneousrecurrentseizure,SRS）监测,然后留取脑组织。新鲜海马结构组织用酶联免疫吸附法测定γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyricacid,GABA）的含量,用蛋白质印迹（Western-blotting,WB）法和定量聚合酶链反应法检测谷氨酸脱羧酶65（Glutamatedecarboxylase 65,GAD65）、GABA转运体-1（GABA transporter-1,GAT-1）、GABA 氨基转移酶（GABA transaminase,GABA-T）和 GABAa 受体（GABAA receptor,GABAAR）的 α5、αα4、γ2 和 δ 亚基的蛋白和mRNA表达水平,用WB法检测脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor,BDNF）及络氨酸蛋白激酶受体 B（Tyrosine kinase receptor B,TrkB）的蛋白表达水平。固定脑组织用Nissl染色和Timm染色进行病理检查,前者用于量化海马结构神经元的减损,后者用于量化齿状回的苔藓纤维发芽（Mossy fiber sprouting,MFS）现象。2.雄性Kunming（KM）小鼠30只,首先进行第1次转棒测试（Rotarod test,RT）和SAT（DO）,然后随机分到PTA组（n=15）及正常对照组（n=15）,并分别给予PTA 2000mg/kg及等体积的纯水灌胃1次（D0）。给药后8小时内（8H）、第7天（D7）及第14天（D14）复查RT和SAT。试验结束后留取脑和脊髓组织,进行苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin,HE）染色病理检查。3.雄性KM小鼠60只,首先进行第1次RT和SAT（DO）,然后随机分到PTA低剂量组（n=15）、PTA中剂量组（n=15）、PTA高剂量组（n=15）和正常对照组（n=15）,并分别给予 PTA81.63mg/kg、PTA285.71mg/kg、PTA1000mg/kg 及等体积的纯水,每天灌胃1次,连续28天。给药第14天（D14）、第28天（D28）及停药1周后（D35）复查RT和SAT。D28及D35每组随机抽取小鼠留取脑和脊髓组织,进行HE染色病理检查。结果:1.与NC组比,EP组海马结构中GABA含量下降（P<0.001）;GAD65的蛋白表达水平下降（P<0.01）;GAT-1的蛋白（P<0.05）和mRNA（P<0.01）及GABA-T的蛋白（P<0.01）和 mRNA（P<0.001）表达水平升高;GABAA受体（GABAA receptors,GABAARs）的δ（P<0.001）、α4（P<0.05）和γ2（P<0.001）亚基的蛋白表达水平升高;而α5（P<0.001）、S（P<0.001）及y2（P<0.01）亚基的mRNA表达水平下降。与EP组比,PTA提高海马结构的GABA含量（两个剂量均P<0.001）;提高GAD65（PTA-800 组,P<0.01）的 mRNA 表达水平;降低 GAT-1（PTA-400 组,P<0.05;PTA-800组,P<0.01）和 GABA-T（PTA-400 组,P<0.01;PTA-800 组,P<0.001）的 mRNA 表达水平;降低GABAARsS（PTA-800组,P<0.05）和γ2（两个剂量均P<0.01）亚基的蛋白表达水平;提高GABAARsα5（PTA-400组,P<0.01）、S（PTA-800组,P<0.05）及γ2（PTA-400组,P<0.05）亚基的mRNA表达水平。与NC组比,EP组海马结构mBDNF和TrkB的蛋白表达水平稍下降而proBDNF的表达水平稍升高（各P>0.05）。与NC组比,PTA-400组及PTA-800组降低mBDNF的蛋白表达水平（各P<0.01）。与EP组比,PTA-400组监测可见SRS的大鼠只数构成比降低,PTA-400组及PTA-800组的SRS发作频率降低（各P>0.05）。经治疗后,与NC组比,EP组在FAT中强迫路线转换行为比（Forced alternation behavior,FAB%）下降（P<0.05）,在 SAT 中自发路线转换行为比（Spontaneous alternation behavior,SAB%）下降（P<0.05）,在OFL中进入格数增加（P<0.001）;与其它3个致痫组不同,PTA-400组的SAB%与NC组比较无统计学差异,并高于EP组（P>0.05）。与自身第1次测试比,EP组在FAT中目标臂停留时间下降（P<0.01）;与其它3个致痫组不同,PTA-800组的组内差异无统计学意义。与NC组比,EP组海马结构CA1区、CA3区及DH的神经元数量减少（各P>0.05）,DG内侧分子层可见MFS现象（Timm染色评分及MFS平均光密度,各P>0.05）。PTA-800组提高CA3区和DH区的神经元计数,降低MFS的严重程度（vs.NC组,各 P>0.05）。2.观察期间两组小鼠的患病及死亡只数均为0。与正常对照组比,PTA组在D7和D14的体重较高（各P<0.05）;PTA组在8H、D7和D14的跌落潜伏期（Latencyto fall,LTF）较低（各P>0.05）;PTA组在8H的SAB%高于正常对照组（P<0.05）。总进入臂次数的组间比较无统计学差异。两组的额叶次级运动皮层、尾状核、颞叶皮层、海马结构、黑质、脑桥、小脑皮质及颈、胸、腰髓前角的组织形态在HE染色镜检下未见明显异常。3.观察期间4组小鼠的患病及死亡只数均为0。与正常对照组比,PTA低剂量组和PTA高剂量组在D7和D14的体重较低（各P<0.05）,至D28和D35时4组间的体重无统计学差异;3个PTA组在D14和D28的LTF较低（各P>0.05）。SAB%和总进入臂次数在D28和D35的组间比较无统计学差异;镜检正常对照组及PTA高剂量组在D28取材的组织,额叶次级运动皮层、尾状核、颞叶皮层、海马结构、黑质、脑桥、小脑皮质及颈、胸、腰髓前角的组织形态在HE染色下未见明显异常。结论:1.在PILO癫痫大鼠的海马结构中,PTA通过上调GAD65和GABA并下调GAT-1和GABA-T,显着提高GABA能系统活性;PTA下调GABAARs S及γ2亚基的蛋白表达水平并上调GABAARsα5、S及y2亚基的mRNA表达水平;PTA下调mBDNF的蛋白表达水平。PTA改善记忆和认知障碍,并可能减轻SRS和海马结构组织病变的严重程度。2.PTA对健康小鼠神经系统的运动和认知功能的抑制作用不显着。
李丽丽[7]（2019）在《生酮饮食对发育期惊厥性脑损伤神经保护作用中Plpprs家族蛋白的作用及对线粒体功能的调节机制》文中进行了进一步梳理第一部分青霉素致反复惊厥模型远期可塑性相关蛋白家族Plpprs和线粒体功能相关蛋白表达变化和相互作用目的:探讨青霉素致反复惊厥模型远期发育、神经行为、认知和海马形态损伤与海马和大脑皮层可塑性相关蛋白家族Plpprs、线粒体功能相关蛋白分子和锌离子转运体分子表达变化和相互作用。方法:200只雄性SD（日龄21天,P21）大鼠随机分成2组:Control组（n=80/每组）,建模组（n=120/每组）。建模组建立青霉素致发育期反复惊厥性脑损伤模型:每只大鼠500万单位/kg剂量腹腔注射青霉素,隔日注射一次,共注射6次建模完成（P21-31）。根据入选标准获得RS组80只（n=80/每组）。Control组在与RS组处理相同时间腹腔注射相同剂量的生理盐水。隔日监测大鼠体重。分别在建模7天,14天,21天,28天后,监测神经反射发育,神经行为,学习记忆指标变化:Neo-Timm’s染色观察海马苔藓纤维发芽和杏仁核Timm着色;尼氏染色观察海马和杏仁核神经元细胞数量和形态;Real-Time RT-PCR检测海马可塑性相关蛋白家族Plpprs,线粒体功能相关蛋白的mRNA表达,同时还检测了锌离子通道蛋白ZnTs mRNA表达并分析可塑性相关蛋白家族Plpprs和线粒体功能相关蛋白白的mRNA表达的相关性;Western-Blot 检测海马和大脑皮层可塑性相关蛋 白家族 Plpprs 和线粒体功能相关蛋白的表达。结果:（1）体重:建模当天各时间点Control组与RS组体重均没有统计学差异,在建立青霉素致发育期反复惊厥性脑损伤模型后7天（P38,n=20/每组）,14天（P45,n=20/每组）,21天（P52,n=20/每组）,RS组在第二次注射青霉素时体重开始显着低于Control组（P<0.05）;28天（P59,n=20/每组）时间点的RS组在第三次注射青霉素时体重开始显着低于Control组（P<0.05）;当RS组开始出现这种低体重状态均会一直持续到取脑组织当天;在建立青霉素致发育期反复惊厥性脑损伤模型后7天,14天,28天,三个时间点的RS组的日均体重增长率均显着低于Control组（P<0.05）,末次青霉素注射后21天时间点的RS组的日均体重增长率低于Control组,但是没有统计学意义;（2）神经发育:在前肢悬吊试验中,RS组在7天,14天,21天,28天四个时间点前肢悬吊反射时间均显着低于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）。在负向趋地试验中,RS组在7天,14天,21天,28天四个时间点负向趋地反射时间均显着高于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）。在悬崖回避试验中,RS组在7天,21天,28天三个时间点悬崖回避反射时间均显着高于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）,RS组在14天时间点悬崖回避反射时间高于Control组,但是差异没有统计学意义。在平面翻正试验中,RS组在天时间点平面翻正反射时间显着高于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）,其余三个时间点的差异没有统计学意义;（3）神经行为:在旷场实验中,RS组在7天,14天,21天,28天四个时间点水平穿越格子数均显着低于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）。RS组在7天,21天,28天三个时间点修饰胡须的次数均显着高于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）,RS组在14天时间点修饰胡须的次数高于Control组,但是差异没有统计学意义。RS组在7天,14天,21天,28天四个时间点双后肢着地站立的次数均显着低于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）;（4）学习记忆:在新异物识别实验中,RS组在14天21,21天,28天三个时间点认知指数均显着低于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS组在7天时间点认知指数低于Control组,但是差异没有统计学意义;（5）Neo-Timm’s 染色:①海马区:RS组在21天,28天两个时间点CA3和DG区着色的Timm颗粒数量显着高于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS组在7天和14天两个时间点CA3和DG区着色的Timm颗粒与Control组差异没有统计学意义;②杏仁核:通过对Neo-Timm’s染色中杏仁核区分析可见,RS组在21天,28天两个时间点杏仁核区着色光密度显着高于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS组在7天和14天两个时间点杏仁核区着色光密度与Control组差异没有统计学意义;（6）尼氏染色:RS组在7天,14天,21天,28天四个时间点海马CA1区,CA3区及杏仁核区神经元数量显着低于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）,且神经元结构紊乱,胞浆尼氏染色不均匀;（7）Real-Time RT-PCR:①可塑性相关蛋白家族Plpprs基因:青霉素处理使SD大鼠在28天时间点Plppr3,Plppr4,Plppr5 mRNA表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS组在其他时间点Plppr3,Plppr4,Plppr5 mRNA表达较Control组没有统计学意义。RS组7天,14天,21天,28天四个时间点Plpprl和Plppr2 mRNA表达与Control组相比并没有统计学上的差异;②锌离子通道蛋白ZnTs基因:青霉素处理使SD大鼠在28天时间点ZnTl mRNA表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS组在14天时间点ZnT1 mRNA表达较Control组升高,但是并没有统计学意义;RS组在7天,21天两个时间点ZnT1 mRNA表达与Control组相比并没有统计学上的差异。RS组在21天,28天两个时间点ZnT3 mRNA表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS组在7天,14天两个时间点ZnT3 mRNA表达与Control组相比并没有统计学上的差异。RS组在7天,14天,21天,28天四个时间点ZnT6和ZnT7 mRNA表达与Control组相比并没有统计学上的差异:③线粒体功能相关基因:青霉素处理使SD大鼠在28天时间点Bnip3L和BAD mRNA表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;在7天,14天,21天三个时间点RS组Bnip3L和BAD mRNA表达较Control组升高,但是并没有统计学意义。在14天和28天时间点RS组低氧诱导因子HIF-1α和mTOR mRNA表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS组在7天和21天两个时间点低氧诱导因子HIF-1α和mTOR mRNA表达较Control组升高,但是并没有统计学意义。RS组在7天,14天,21天和28天四个时间点HDAC1,FOUNDC1和PARKIN mRNA表达均较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。RS组在21天和28天时间点sesn2 mRNA表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS组在7天和14天两个时间点Sesn2 mRNA表达较Control组升高,但是并没有统计学意义。RS组在7天,14天,21天,28天四个时间点Bnip3,UCP2,P53,NF-κB,DRP1,E21F,Endog 和 Pink1 mRNA 表达与 Control 组相比并没有统计学上的差异;（8）相关性分析:将海马可塑性相关家族蛋白Plpprs和线粒体功能相关蛋白mRNA表达进行相关性分析,发现可塑性相关家族蛋白P1ppr1与P53,SENSN2和PARKIN mRNA表达呈显着性负相关,且具有统计学意义（P<0.05）,与E21F mRNA表达呈显着性正相关,且具有统计学意义（P<0.05）;可塑性相关家族蛋白P1ppr2与UCP2 mRNA表达呈显着性负相关,且具有统计学意义（P<0.05）;可塑性相关家族蛋白P1ppr3与E21F mRNA表达呈显着性负相关,且具有统计学意义（P<a05）,与Bnip3L,mTOR,HDAC1,BAD和FUNDC1 mRNA表达呈显着性正相关,且具有统计学意义（P<0.05）;可塑性相关家族蛋白P1ppr4与Bnip3L mRNA表达呈显着性正相关,且具有统计学意义（P<0.05）;可塑性相关家族蛋白P1ppr5与PINK1 mRNA表达呈显着性负相关,且具有统计学意义（P<0.05）,与Bnip3L和HIF1αα mRNA表达呈显着性正相关,且具有统计学意义（P<0.05）;以上结果显示可塑性相关家族蛋白和线粒体功能相关多个分子有相关性关系,在这些有相关性的分子mRNA表达中,P1ppr5和HIF1α mRNA表达相关性最高,相关系数达到0.8586,P<0.0001;（9）Western Blot:①可塑性相关蛋白Plpprs:在海马组织中,RS组在7天,14天,21天和28天四个时间点海马可塑性相关蛋白P1ppr1,P1ppr4和P1ppr5蛋白表达均较Contro1组显着升高,差异具有统计学意义（P<a05）。皮层,P1ppr1:RS组在14天时间点大脑皮层P1ppr1蛋白表达较Contro1组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS组在21天和28天两个时间点大脑皮层P1ppr1蛋白表达较Contro1组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS组在7天时间点大脑皮层P1ppr1蛋白表达较Contro1组无统计学上的差异。P1ppr4:RS组在7天和14天两个时间点大脑皮层可塑性相关蛋白P1ppr4蛋白表达较Control组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS组在28天时间点大脑皮层可塑性相关蛋白P1ppr4蛋白表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;P1ppr5:RS组在7天,14天,21天和28天四个时间点大脑皮层可塑性相关蛋白P1ppr5蛋白表达均较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;②线粒体功能相关蛋白:HIF-1α:RS组在7天,14天,21天和28天四个时间点海马低氧诱导因子HIF-1α蛋白表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS组在7天,14天和28天三个时间点大脑皮层低氧诱导因子HIF-1α蛋白表达均较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS组在21天时间点大脑皮层低氧诱导因子HIF-1α蛋白表达较Control组升高,但是并没有统计学意义。PGC-1α:RS组在7天,21天和28天三个时间点海马转录共激活因子PGC-天时间点海马转录共激活因子PGC-1α蛋白表达较Control组降低,但是并没有统计学意义。RS组在7天,14天,21天和28天四个时间点大脑皮层转录共激活因子PGC-1α蛋白表达均较Control组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。Sirt3:RS组在14天和28天时间点海马Sirt3蛋白表达较Control组降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS组在7天和21天时间点海马Sirt3蛋白表达较Control组没有统计学上的差异。RS组在7天,14天和28天三个时间点大脑皮层Sirt3蛋白表达均较Control组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS组在21天时间点大脑皮层Sirt3蛋白表达较Con1α蛋白表达均较Contro1组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS组在14 trol组降低,但是并没有统计学意义。Prohibitin:RS组在14天,21天和28天三个时间点海马线粒体标记蛋白Prohibitin表达较Control组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS组在7天时间点海马线粒体标记蛋白白 Prohibitin表达较Control组无统计学上的差异。RS组在7天,14天,21天和28天三个时间点大脑皮层线粒体标记蛋白Prohibitin表达均较Control组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:青霉素反复惊厥所致远期发育、神经行为、认知和海马形态损伤可能与海马和大脑皮层可塑性相关蛋白分子和线粒体功能相关蛋白分子分子表达变化和相互作用有关。第二部分 生酮饮食干预远期前脑可塑性相关蛋白分子和线粒体功能相关蛋白分子表达目的:探讨海马和大脑皮层可塑性相关蛋白分子、线粒体功能相关蛋白分子和锌离子转运体分子表达在生酮饮食对发育期惊厥性脑损伤神经保护中的作用。方法:100只SD（日龄21天,P21）大鼠随机分成2组:对照组（n=40/每组）和建模组（n=60/每组）,建模组建立青霉素致发育期反复惊厥性脑损伤模型:每只大鼠500万单位/kg腹腔注射青霉素,隔日注射一次,共计注射6次建模完成（P21-31）。根据入选标准获得成功建模组40只（n=40/每组）。对照组在与建模组处理相同时间腹腔注射相同剂量的生理盐水。在建模完成后进一步将对照组随机分为Control组（n=20/每组）和KD组（n=20/每组）,成功建模组随机分为RS组（n=20/每组）,RS+KD组（n=20/每组）。建模完成后一日开始（P32）,KD组和RS+KD组给予生酮饮食干预28天（P32-P59）,Control组和RS组继续食用普通颗粒饲料,所有大鼠均不限制饮水,隔日监测大鼠体重。监测神经反射发育,神经行为,学习记忆指标变化;Neo-Timm’s染色观察海马苔藓纤维发芽和杏仁核Timm着色;尼氏染色观察海马和杏仁核神经元细胞数量和形态;高尔基染色观察神经元轴突长度,分级及棘突数量;Real-Time RT-PCR检测海马可塑性相关蛋白家族Plpprs,线粒体功能相关蛋白的mRNA表达,同时还检测了锌离子通道蛋白ZnTs mRNA表达;Western-Blot检测海马和大脑皮层可塑性相关蛋白家族Plpprs和线粒体功能相关蛋白的表达;EMSA检测海马和大脑皮层HIF-1α的转录活性。结果:（1）体重:四组体重在实验过程中总体差异具有统计学意义。在P21-P23四组体重均没有统计学差异,从P25开始四组体重开始出现差异,RS组和RS+KD组体重开始显着低于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）,这种差异持续到处死当天（P59）,KD组体重从P35开始显着低于Control组,差异具有统计学意义,这种差异持续到P59,RS+KD组体重从P39开始显着低于RS组,差异具有统计学意义（P<0.05）,这种差异持续到P59。在四组日均体重增长率的比较中,KD组,RS组和RS+KD组日均体重增长率均显着低于Control组,差异具有统计学意义（P<05）,KD组和RS+KD组均显着低于RS组,差异具有统计学意义（P<0.05）;（2）神经发育:在建立发育期反复惊厥模型28天后,在前肢悬吊试验中,RS组前肢悬吊反射时间显着低于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组前肢悬吊反射时间显着高于RS组,差异具有统计学意义（P<0.05）;与Control组无显着差异,趋于正常。在负向趋地试验中,RS组负向趋地反射时间显着高于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组负向趋地反射时间显着低于RS组,差异具有统计学意义（P<0.05）;与Control组无显着差异,趋于正常。在悬崖回避试验中,RS组悬崖回避反射时间均显着高于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）,RS+KD组悬崖回避反射反射时间显着低于RS组,差异具有统计学意义（P<0.05）;与Control组无显着差异,趋于正常。在平面翻正试验中,RS组平面翻正反射时间高于Control组,但差异并没有有统计学意义;（3）学习记忆:在新异物识别实验中,建立发育期反复惊厥模型28天后,RS组认知指数显着低于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组认知指数显着高于RS组,差异具有统计学意义（P<0.05）:与Control组无显着差异,趋于正常:（4）血糖,血酮水平:在建立发育期反复惊厥模型28天后,KD组和RS+KD组血糖水平显着低于Control组和RS组,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS组与Control组血糖水平无显着差异。KD组和RS+KD组血酮水平显着高于Control组和RS组,差异具有统计学意义（P<0.05）:RS组与Control组血酮水平无显着差异;（5）Neo-Timm’s 染色:通过对Neo-Timm’s染色中海马区分析可见,RS组CA3和DG区着色的Timm颗粒数量显着高于Control组和KD组,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组CA3和DG区着色的Timm颗粒数量显着低于RS组,差异具有显着的统计学意义（P<0.05）,与Control组和KD组差异没有统计学意义,趋于正常。通过对Neo-Timm’s染色中杏仁核区分析可见,RS组和RS+KD组杏仁核Timm着色的光密度显着高于Control组和KD组,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组杏仁核Timm着色的光密度值显着低于RS组,差异具有显着的统计学意义（P<0.05）;（6）尼氏染色:在对海马区尼氏染色中RS组在海马CA1区,CA3区神经元数量显着低于Control组和KD组,差异具有统计学意义（P<0.05）,且神经元结构紊乱,胞浆尼氏染色不均匀;RS+KD组在海马CA1区,CA3区神经元数量显着高于RS组,差异具有统计学意义（P<0.05）,与Control组差异没有统计学意义,趋于正常。在对杏仁核区尼氏染色中RS组在杏仁核区神经元数量显着低于Control组和KD组,差异具有统计学意义（P<0.05）,且神经元结构紊乱,胞浆尼氏染色不均匀;RS+KD组在杏仁核区神经元数量显着高于RS组,差异具有统计学意义（P<0.05）,与Control组差异没有统计学意义,趋于正常;（7）高尔基染色:本论文使用高尔基染色及Sholl分析来分析大脑皮层神经元复杂性,结果发现KD组,RS组和RS+KD组神经元突起分支等级显着低于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）,RS+KD组神经元突起分支等级显着高于RS组,差异具有统计学意义（P<0.05）。在对大脑皮层神经元突起长度的分析中我们发现,RS组神经元突起长度显着低于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）,RS+KD组神经元突起长度高于RS组,但是差异没有统计学意义。在对大脑皮层神经元树突上的棘突数量的分析中我们发现:RS组神经元棘突数量显着低于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）,生酮饮食可以显着改善这种缺陷,使RS+KD组神经元棘突数量显着高于RS组,差异具有统计学意义（P<0.05）,趋于正常;（8）Real-Time RT-PCR:①可塑性相关蛋白Plpprs基因:RS组Plppr3,Plppr4,Plppr5 mRNA表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组Plppr3,Plppr4,Plppr5 mRNA表达较RS组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;与Control组相比并没有统计学上的差异,趋于正常。RS组可塑性相关蛋白Plppr1和Plppr2mRNA表达较Control组升高,但是并没有统计学意义。RS+KD组可塑性相关蛋白Plppr1mRNA表达与Control组相比并没有统计学上的差异;②锌离子通道蛋白ZnTs基因:RS组ZnT1 mRNA表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组ZnT1 mRNA表达较RS组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组ZnT1 mRNA表达与Control组相比并没有统计学上的差异,趋于正常。RS组ZnT3mRNA表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。RS组ZnT6和ZnT7 mRNA表达与Control组相比并没有统计学上的差异;③线粒体功能相关基因:RS 组 Bnip3L,HIF-1α,HDAC1,mTOR 和 ParkinmRNA表达均较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组Bnip3L,HIF-1α,HDAC1,mTOR和ParkinmRNA表达均较RS组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD 组 Bnip3L,HIF-1α,HDAC1,mTOR 和 ParkinmRNA 表达与Control组相比并没有统计学上的差异,趋于正常。RS组Bnip3,UCP2,P53,NF-κB,DRP1,E21F,Endog和Pink1 mRNA表达与Control组相比并没有统计学上的差异;（9）Western Blot:①Plppr1:在海马组织中,RS组海马Plppr1蛋白表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组海马Plppr1蛋白表达较RS组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组海马Plppr1蛋白表达与Control组没有统计学显着性差异,趋于正常。在大脑皮层组织中,RS组大脑皮层Plppr1蛋白表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<O.05）;RS+KD组大脑皮层Plppr1蛋白表达较RS组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组大脑皮层Plppr1蛋白表达与Control组没有统计学显着性差异,趋于正常;②Plppr5:在海马组织中,KD组,RS组和RS+KD组海马Plppr5蛋白表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组海马Plppr5蛋白表达较RS组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。在大脑皮层组织中,RS组和RS+KD组皮层Plppr5蛋白表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组皮层Plppr5蛋白表达较RS组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;③线粒体功能相关蛋白:HIF-1α:在海马组织中,KD组,RS组和RS+KD组海马HIF-1 α表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组海马HIF-1α蛋白表达较RS组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。在大脑皮层组织中,RS组HIF-1α蛋白表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组大脑皮层HIF-1α蛋白表达较RS组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）,RS+KD组大脑皮层HIF-1α蛋白表达与Control组相比并没有统计学上的差异,趋于正常;PGC-1α:在海马组织中,RS组PGC-1α蛋白表达较Control组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;KD组和RS+KD组海马PGC-1α蛋白表达较Control组和RS组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。在大脑皮层组织中,KD组,RS组和RS+KD组PGC-1α蛋白表达较Control组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组大脑皮层PGC-1α蛋白表达较RS组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;Sirt3:在海马组织中,RS组Sirt3蛋白表达较Control组和KD组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组海马Sirt3蛋白表达较RS组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组海马Sirt3蛋白表达与Control组相比并没有统计学上的差异,趋于正常。在大脑皮层组织中,RS组RS+KD组大脑皮层Sirt3蛋白表达较Control组和KD组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组大脑皮层Sirt3蛋白表达较RS组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;p-AMPK:在海马组织中,RS组海马AMPK蛋白磷酸化水平较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。RS+KD组海马AMPK蛋白磷酸化水平较RS组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组海马AMPK蛋白磷酸化水平与Control组没有统计学显着性差异,趋于正常。在大脑皮层组织中,KD组和RS组大脑皮层AMPK蛋白磷酸化水平较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组大脑皮层AMPK蛋白磷酸化水平较RS组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组大脑皮层AMPK蛋白磷酸化水平与Control组没有统计学显着性差异,趋于正常;Bnip3L:在海马组织中,RS组海马LC3受体Bnip3L蛋白表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组海马LC3受体Bnip3L蛋白表达较RS组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组海马Bnip3L蛋白表达与Control组没有统计学显着性差异,趋于正常。在大脑皮层组织中,RS组大脑皮层LC3受体Bnip3L蛋白表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组大脑皮层LC3受体Bnip3L蛋白表达较RS组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组大脑皮层Bnip3L蛋白表达与Control组没有统计学显着性差异,趋于正常;Prohibitin:在海马组织中,KD组和RS组海马线粒体标记蛋白Prohibitin表达较Control组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组海马线粒体标记蛋白Prohibitin表达较RS组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组海马线粒体标记蛋白Prohibitiin表达与Control组没有统计学显着性差异,趋于正常。在大脑皮层组织中,KD组和RS组大脑皮层线粒体标记蛋白Prohibitin表达较Control组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组大脑皮层线粒体标记蛋白Prohibitin表达较RS组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组大脑皮层线粒体标记蛋白Prohibitin表达与Control组没有统计学显着性差异,趋于正常。（10）EMSA:KD组,RS组和RS+KD组海马和皮层HIF-1α的转录活性均较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论::生酮饮食对发育期惊厥性脑损伤的神经保护作用可能通过调节海马和大脑皮层可塑性相关蛋白分子、线粒体功能相关蛋白分子和锌离子转运体分子表达实现。第三部分酮体在离体细胞模型中对谷氨酸毒性的保护作用及Plppr5神经保护作用义（P<0.05）;β-HB共处理显着降低了 Glutamate处理后AMPK磷酸化,差异具有的机制研究目的:探讨酮体在离体细胞模型中对谷氨酸毒性的保护作用及Plppr5神经保护作用的机制方法:第一节采用小鼠海马神经元细胞株HT22,按照处理不同分为四组:Control组、β-HB组、Glutamate组和Glutamate+β-HB组。每组定义及处理如下:Control组:空白对照组,细胞不做处理;β-HB组:酮体β-HB（β-羟丁酸,无血清培养基配制,PH7.4）处理细胞 24h（5mmol/L）;Glutamate 组:谷氨酸处理细胞 24h（5mmol/L,无血清培养基配制,PH7.4）;Glutamate+β-HB组:谷氨酸（5mmol/L）和β-HB（5mmol/L）共同处理细胞24h。通过CCK8法测各组细胞存活率,酶标仪检测各组乳酸脱氢酶LDH释放和超氧化物歧化酶SOD活性,流式仪检测各组细胞线粒体膜电位,活性氧ROS和线粒体数量,激光共聚焦显微镜检测各组细胞线粒体ROS,活性线粒体比例和线粒体自噬活性,Western-Blot检测低氧诱导因子HIF1α,可塑性相关蛋白Plppr5,pAMPK,线粒体自噬LC3受体Bnip3L,转录共激活因子PGC-1α,人类沉默信息调节因子2相关酶家族蛋白Sirt3和线粒体标记蛋白Prohibitin表达。第二节按照处理不同分为四组:shControl组、shPlppr5组、shControl+Glutamate组、shPlppr5+Glutamate组,各组定义及处理如下:shControl组:空载慢病毒侵染细胞72小时后更换为正常培养基继续培养24h;shPlppr5组:shPlppr5慢病毒侵染细胞72小时后更换为正常培养基继续培养24h;shControl+Glutamate组:空载慢病毒侵染细胞 72 小时后,谷氨酸（5mmol/L）处理 24h;shPlppr5+Glutamate 组:shPlppr5慢病毒侵染细胞72小时后,谷氨酸（5mmol/L）处理24h。通过CCK8法测各组细胞存活率,酶标仪检测各组LDH释放和SOD活性,流式仪检测各组细胞线粒体膜电位,ROS和线粒体数量,激光共聚焦显微镜检测各组细胞线粒体ROS,活性线粒体比例和线粒体自噬水平,Western-Blot检测低氧诱导因子HIF1α,可塑性相关蛋白Plppr5,pAMPK,线粒体自噬受体Bnip3L,转录共激活因子PGC-1α,人类沉默信息调节因子2相关酶家族蛋白Sirt3和线粒体标记蛋白Prohibitin表达。结果:第一节（1）细胞生长:使用CCK8检测各组细胞存活率,发现Glutamate组细胞存活率显着低于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）;β-HB共处理明显提高了 Glutamate处理后细胞的存活率,差异具有统计学意义（P<0.05）;（2）线粒体氧化应激指标:①使用LDH试剂盒检测各组细胞LDH释放量,发现Glutamate组细胞LDH释放量显着高于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）;β-HB共处理明显抑制了 Glutamate处理后细胞LDH释放,差异具有统计学意义（P<0.05）:②使用SOD活性试剂盒检测各组细胞SOD活性,发现Glutamate组细胞SOD活性显着低于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）;β-HB共处理明显提高了Glutamate处理后细胞的SOD活性,差异具有统计学意义（P<0.05）;③使用流式细胞仪检测各组细胞Mitotraker Green探针和MitoSOX探针荧光强度,发现Glutamate组细胞Mitotraker Green和MitoSOX荧光双阳性细胞比例显着高于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）;β-HB共处理明显降低了 Glutamate处理后细胞的Mitotraker Green和MitoSOX荧光双阳性细胞比例,差异具有统计学意义（P<0.05）;使用激光共聚焦显微镜检测Mitotraker Green探针和MitoSOX探针荧光时,我们发现Glutamate组细胞MitoSOX荧光密度显着高于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）;β-HB共处理明显降低了 Glutamate处理后细胞的MitoSOX荧光密度,差异具有统计学意义（P<0.05）;（3）线粒体功能指标:①使用流式细胞仪检测各组细胞JC-1,发现Glutamate组线粒体膜电位显着低于 Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）;β-HB共处理明显升高了 Glutamate处理后细胞的膜电位,差异具有统计学意义（P<0.05）;②使用流式细胞仪检测各组细胞Mitotraker Green探针和Mitotraker Red探针荧光强度,发现Glutamate组细胞活性线粒体比例显着低于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）;β-HB共处理显着增加了 Glutamate处理后细胞活性线粒体比例,差异具有统计学意义（P<0.05）;使用激光共聚焦显微镜检测Mitotraker Green探针和Mitotraker Red探针荧光时,我们发现Glutamate组细胞Mitotraker Red荧光密度显着低于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）;β-HB共处理明显增加了 Glutamate处理后细胞的Mitotraker Red荧光密度,差异具有统计学意义（P<0.05）:（4）线粒体自噬:使用激光共聚焦显微镜检测Mtphagy Dye和Lyso Dye探针时,我们发现Glutamate组细胞线粒体自噬活性显着高于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）;β-HB共处理明显降低了 Glutamate处理后细胞的线粒体自噬活性,差异具有统计学意义（P<0.05）;（5）Western Blot:①Plppr5:Glutamate组可塑性相关蛋白Plppr5蛋白表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;β-HB共处理显着降低了Glutamate处理后可塑性相关蛋白Plppr5蛋白表达,差异具有统计学意义（P<0.05）;②线粒体功能相关蛋白:HIF1α:Glutamate组低氧诱导因子HIF-1α蛋白表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;β-HB共处理显着降低了Glutamate处理后低氧诱导因子HIF-1α蛋白表达,差异具有统计学意义（P<0.05）;pAMPK:Glutamate组AMPK磷酸化水平较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;β-HB共处理显着降低了 Glutamate处理后AMPK磷酸化,差异具有统计学意义（P<0.05）;Bnip3L:Glutamate组线粒体LC3受体Bnip3L蛋白表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;β-HB共处理显着降低了Glutamate处理后线粒体LC3受体Bnip3L蛋白表达,差异具有统计学意义（P<0.05）;PGC1α:Glutamate组转录共激活因子PGC-1α蛋白表达较Control组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;β-HB共处理显着增加了 Glutamate处理后转录共激活因子PGC-lα蛋白表达,差异具有统计学意义（P<0.05）;Sirt3:Glutamate组Sirt3蛋白表达较Control组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;β-HB共处理显着增加了 Glutamate处理后Sirt3蛋白表达,差异具有统计学意义（P<0.05）;Prohibitin:Glutamate组线粒体标记蛋白Prohibitin表达较Control组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;β-HB共处理显着增加了 Glutamate处理后线粒体标记蛋白Prohibitin表达,差异具有统计学意义（P<0.05）;第二节（1）细胞生长:使用CCK8检测各组细胞存活率,发现shPlppr5组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate 组细胞存活率均显着低于 ShControl组,差异具有统计学意义（P<0.05）;（2）线粒体氧化应激指标:①使用LDH试剂盒检测各组细胞LDH释放量,发现 shPlppr5 组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate 组细胞 LDH 释放量显着高于ShControl组,差异具有统计学意义（P<0.05）;Plppr5基因沉默使Glutamate处理后细胞LDH释放增加,但差异没有统计学意义;②使用SOD活性试剂盒检测各组细胞SOD活性,发现ShControl+Glutamate组和ShPlppr5+Glutamate组细胞SOD活性均显着低于ShControl组,差异具有统计学意义（P<0.05）;可塑性相关蛋白Plppr5基因沉默降低了 Glutamate处理后细胞的SOD活性,但差异不具有统计学意义;③使用流式细胞仪检测各组细胞Mitotraker Green探针和MitoSOX探针荧光强度,发现 shPlppr5 组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate 组细胞 Mitotraker Green和MitoSOX荧光双阳性细胞比例显着高于ShControl组,差异具有统计学意义（P<0.05）;可塑性相关蛋白Plppr5基因沉默明显增加了 Glutamate处理后细胞的Mitotraker Green和MitoSOX荧光双阳性细胞比例,差异具有统计学意义（P<0.05）;使用激光共聚焦显微镜检测Mitotraker Green探针和MitoSOX探针荧光时,我们发现shPlppr5 组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate 组细胞 MitoSOX 荧光密度显着高于ShControl组,差异具有统计学意义（P<0.05）;可塑性相关蛋白Plppr5基因沉默明显增加了 Glutamate处理后细胞的MitoSOX荧光密度,差异具有统计学意义;（3）线粒体功能指标:①使用流式细胞仪检测各组细胞JC-1,发现shPlppr5组,ShControl+Glutamate组和ShPlppr5+Glutamate组细胞线粒体膜电位显着低于ShControl组,差异具有统计学意义（P<0.05）;可塑性相关蛋白Plppr5基因沉默明显降低了 Glutamate处理后细胞的线粒体膜电位,差异具有统计学意义（P<0.05）;②使用流式细胞仪检测各组细胞Mitotraker Green探针和Mitotraker Red探针荧光强度,发现 shPlppr5 组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate 组细胞Mitotraker Green和Mitotraker Red焚光双阳性细胞比例显着低于ShControl组,差异具有统计学意义（P<0.05）;可塑性相关蛋白Plppr5基因沉默显着降低了 Glutamate处理后细胞Mitotraker Green和Mitotraker Red荧光双阳性细胞比例,差异具有统计学意义（P<0.05）;使用激光共聚焦显微镜检测Mitotraker Green探针和Mitotraker Red 探针荧光时,我们发现 shPlppr5 组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate组细胞Mitotraker Red荧光密度显着低于ShControl组,差异具有统计学意义（P<05）;可塑性相关蛋白Plppr5基因沉默降低了 Glutamate处理后细胞的Mitotraker Red荧光密度,但差异并没有统计学意义;（4）线粒体自噬:使用激光共聚焦显微镜检测Mtphagy Dye和Lyso Dye探针时,我们发现 shPlppr5 组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate 组细胞线粒体自噬活性显着高ShControl组,差异具有统计学意义（P<0.05）;可塑性相关蛋白Plppr5基因沉默明显增加了 Glutamate处理后细胞的线粒体自噬活性,差异具有统计学意义（P<0.05）;（5）Western Blot:①Plppr5:Plppr5 基因沉默显着降低了 HT22 细胞 Plppr5 蛋白表达,差异具有统计学意义（P<0.05）;谷氨酸显着增加了 HT22细胞Plppr5蛋白表达,差异具有统计学意义（P<0.05）;Plppr5基因沉默后谷氨酸处理不能增加Plppr5蛋白表达,差异具有统计学意义（P<0.05）;②线粒体功能相关蛋白:HIF-1α:shPlppr5 组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate组低氧诱导因子HIF-1α表达显着高于ShControl组,差异具有统计学意义（P<0.05）,ShPlppr5+Glutamate组低氧诱导因子HIF-1α表达显着低于ShControl+Glutamate 组,差异具有统计学意义（P<0.05）;p-AMPK:shPlppr5 组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate 组 AMPK 磷酸化水平较 ShControl 组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）,ShPlppr5+Glutamate组AMPK磷酸化水平较ShControl+Glutamate组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;BNIP3L:shPlppr5 组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate 组线粒体 LC3 受体 BNIP3L蛋白表达较ShControl组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;PGC-1α:shPlppr5组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate 组转录共激活因子 PGC-1α 蛋白表达较ShControl组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;Sirt3:shPlppr5组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate 组 Sirt3 蛋白表达较 ShControl 组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;Plppr5基因沉默显着降低了 Glutamate处理后Sirt3蛋白表达,差异具有统计学意义（P<0.05）;Prohibitin:shPlppr5组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate 组线粒体标记蛋白 Prohibitin 表达较ShControl组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;Plppr5基因沉默显着降低了 Glutamate处理后Prohibitin表达,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:在离体神经细胞兴奋毒性损伤模型中,Plppr5通过调节线粒体功能发挥酮体的神经保护作用。
王梅玲[8]（2019）在《PTCHD1在癫痫中的作用及其机制研究》文中研究表明第一部分PTCHD1在难治性癫痫患者（Temporal lobe epilepsy,TLE）及两种动物模型中的表达实验目的:用免疫印迹的方法检测PTCHD1在两种（海人酸及戊四氮）慢性癫痫小鼠模型脑组织中的表达及难治性癫痫患者和对照组表达情况。方法:1.从本课题组之前脑标本库中（约380例难治性颞叶癫痫患者术后脑组织和约100例非癫痫脑外伤患者脑组织）随机选取15例难治性颞叶癫痫脑组织作为实验组,选取10例的脑外伤非癫痫脑组织作为对照组标本。2.选取成年雄性C57BL小鼠（体重20-30g,10-14周龄）,构建癫痫动物模型之一:戊四氮（PTZ）慢性点燃小鼠模型,癫痫发作4级以上为点燃成功组（例数为8）和无癫痫发作即未点燃成功组（例数为8）作为动物模型标本。3.另一种动物模型为海人酸腹腔注射诱导慢性癫痫模型,选取有自发性反复发作为癫痫组（SRS,n=8）和无自发性反复发作为无癫痫发作组（non-SRS,n=8）。4.用免疫荧光检测PTCHD1表达部位后用免疫印迹方法检测PTCHD1表达情况。实验结果:1.免疫印迹方法检测表达后发现难治性颞叶癫痫患者（Temporal lobe epilepsy,TLE）术后脑组织及对照组脑外伤非癫痫脑组织中均有PTCHD1表达,并且统计其表达量在癫痫患者术后脑组织中PTCHD1的表达较对照组脑外伤非癫痫脑组织中的表达量显着降低（★p<0.05）。2.在两种动物模型中PTCHD1在戊四氮慢性点燃成功小鼠组中海马和皮质中的表达较未点燃成功组中的表达明显减低。在另一种动物模型即海人酸诱导的慢性癫痫小鼠模型中PTCHD1在有癫痫发作组（有自发性发作）小鼠海马和皮质中表达水平均较对应的无癫痫发作组明显减低（★p<0.05）。3.免疫荧光结果提示难治性颞叶癫痫患者脑组织中PTCHD1与神经元标记物MAP2共表达。两种慢性癫痫动物模型中的免疫荧光也得出同样的结果。结论我们实验结果提示PTCHD1在TLE患者和两种慢性癫痫小鼠模型脑组织中表达较相应的对照组比较明显降低,免疫荧光检测提示PTCHD1与神经元共表达。以上结果提示PTCHD1可能参与了癫痫的发生发展。第二部分PTCHD1对海人酸动物模型及戊四氮癫痫动物模型行为学的影响及可能机制实验目的:为进一步探讨PTCHD1与癫痫的关系是因果关系还是伴随关系,我们构建了以GV358为载体的PTCHD1过表达病毒（LV-PTCHD1）和以GV248为载体的PTCHD1 sh RNA干扰病毒（LV-sh-PTCHD1）。通过小鼠海马立体定位注射改变小鼠海马内PTCHD1表达水平,观察PTCHD1对海人酸慢性癫痫模型和戊四氮慢性点燃模型行为学的影响及可能机制。实验方法:1.分别构建PTCHD1过表达病毒（LV-PTCHD1）、PTCHD1过表达空病毒（LV-CON）、PTCHD1 sh RNA干扰病毒（LV-sh-PTCHD1）和PTCHD1 RNA干扰空病毒（LV-sh-CON）。2.实验动物选成年雄性C57BL/6小鼠,并用随机方法分为五组,用立体定位在双侧侧脑室内分别注射PTCHD1过表达病毒、PTCHD1过表达空病毒、PTCHD1 sh RNA干扰病毒、PTCHD1 sh RNA干扰空病毒,余下的一组为对照组:不注射任何病毒也叫假手术组。3.打完病毒2周后应用Western-blot技术检测病毒转染效率,观察是否特异性影响PTCHD1的表达水平。4.海人酸慢性癫痫模型行为学观察的结果:在过表达PTCHD1和抑制PTCHD1的癫痫模型中,造模后从第一次发作开始持续视频监测小鼠癫痫自发性发作情况。分别统计潜伏期和总的发作次数,严重程度以Racine评分评估。视频监测完行为学后记录场电位,观察和统计每次癫痫样放电持续的时间和癫痫样放电的次数。5.戊四氮慢性点燃模型（另外一种机制的模型）行为学观察:在抑制PTCHD1和过表达PTCHD1的癫痫模型中,阈下剂量腹腔注射戊四氮,间隔时间为每隔一天注射一次,每次注射后观察发作级别及潜伏期并做统计。6.通过免疫荧光方法检测PTCHD1在突触前后的定位来说明其可能作用的部位。实验结果:1.海马立体定位分别给LV-PTCHD1、LV-CON、LV-sh-con、LV-sh-PTCHD1组注射后Western-blot结果显示:与对照组比较LVsh-PTCHD1组的表达量显着降低（★★p<0.01）。而过表达组LVPTCHD1表达与相应时间点对照组相比表达显着增高（★★p<0.01）。2.戊四氮慢性点燃模型整个过程中LV-PTCHD1组每次打完PTZ后平均发作分级较对照组在相应的时间点上显着降低,LV-sh-PTCHD1组各时间点平均发作分级较对照组显着升高（★★p<0.01）。3.海人酸动物模型行为学统计结果为:与对照组相比慢性自发性发作期内（2-6w）,LV-PTCHD1组潜伏期延长并自发性发作次数减少。LV-sh-PTCHD1组潜伏期缩短并自发性发作次数增多（★p<0.05,★★p<0.01）而局部场电位中癫痫样放电的次数增加。4.免疫荧光结果显示PTCHD1只与抑制性突触后标志物Gephyrin共定位与抑制性突触前标记物v GAT无共定位。实验结论:1.海马立体定位注射慢病毒PTCHD1过表达、PTCHD1-sh RNA抑制病毒可以使海马PTCHD1的表达水平有变化,注射后2周病毒转染成效。2.在戊四氮动物模型中慢病毒介导的PTCHD1抑制能加重各时间点平均发作分级,在点燃过程中,PTCHD1过表达组各时间点的发作级别明显减低。3.海人酸诱导的动物模型中慢病毒介导的海马PTCHD1过表达能减少慢性期自发性发作的次数、癫痫样放电的频率、癫痫样放电的持续时间和延长潜伏期,而抑制PTCHD1则导致相反的结果。4.免疫荧光结果显示PTCHD1只与抑制性突触后标志物共定位。故PTCHD1可能作用于抑制性突触后受体来影响癫痫的发病发展。
陈成[9]（2019）在《基于1H NMR代谢组学方法评价天麻对慢性萎缩性胃炎的预防及治疗作用》文中研究表明慢性萎缩性胃炎（CAG）是世界范围内最常见的消化系统疾病之一,世界卫生组织将其定义为胃癌的初始阶段。天麻（Gastrodia elata Blume,GEB）是一种具有多种药理活性的传统草药,在亚洲国家被广泛应用。本研究旨在探讨自身免疫诱导的慢性萎缩性胃炎对大鼠体内代谢物产生的影响及评价天麻对慢性萎缩性胃炎的预防及治疗作用。在本次研究中,大鼠被分为6组,空白对照组（CON,生理盐水）、模型组（MCG,生理盐水）、预防给药组（PGE,0.4g/kg）、天麻高剂量组（HGE,0.4g/kg）、天麻低剂量组（LGE,0.1g/kg）和阳性药组（DOM,1mg/kg）。我们首次运用基于1H NMR的代谢组学方法辅以组织病理学检查对大鼠的胃组织进行分析,并测定MDA、SOD、GSH、NO、XOD等生化指标。结果表明天麻在0.4g/kg的剂量下对慢性萎缩性胃炎具有显着的治疗效果,它明显改善胃腺损伤及生化指标,促进胃酸分泌,明显减轻胃部炎症。大鼠胃组织的NMR谱图的正交信号校正-偏最小二乘-判别分析（OSC-PLS-DA）和相关网络分析表明,天麻通过调节能量和嘌呤代谢,发挥抗氧化和抗炎作用。在评价天麻不同极性部位药效的实验中,我们将天麻分为水部位,正丁醇部位,乙酸乙酯部位和石油醚部位四个极性部位,在0.4g/kg的剂量下评价不同极性部位对慢性萎缩性胃炎的治疗效果,代谢组学分析结果表明天麻的水部位和正丁醇部位提取物药效更好,据此我们推测天麻抗氧化和抗炎的有效成分集中在大极性部位。
罗浩帆[10]（2020）在《重水为氘源8-胺基喹啉导向选择性原位合成氘代羧酸及氘代丙戊酸钠的抗癫痫活性评价》文中提出氘代化合物是一类分子中氢原子被氘原子取代得到的化学物质。由于碳-氘化学键具有独特的理化性质,长久以来氘代化合物被广泛应用于药物分析,有机化学反应研究等领域。近年来,氘代化合物也相继被人们发现其在药物化学领域中的潜在价值。部分氘代药物相较于普通药物具有能够减慢药物代谢失活,减少有毒代谢物的生成以及防止药物立体异构化失活的特点。因此,将药物分子中的特定氢原子取代为氘原子作为一种改善药物药效性质的药物设计思路被逐步开发和应用于新药研发当中。相应地,为了合成需要的氘代化合物,开发一系列氘代尤其是选择性氘代反应方法的需求也在日益增长。本文第一部分对氘代化合物的应用和近年来发现的各种氘代反应进行了综述,第二部分结合8-胺基喹啉导向碳氢键活化反应和钯催化均相体系氘代反应方法的特点提出了一种以价格较为低廉的重水为氘源,8-胺基喹啉导向选择性原位合成氘代羧酸的经济高效的合成方法。利用该方法我们合成了7个苯环上不同取代基的N-8-喹啉基苯甲酰胺邻位氘代的化合物和8种不同结构的N-8-喹啉基脂肪酰胺β位氘代的化合物,并选取其中5个氘代酰胺化合物进行酰胺键水解反应最终得到5个氘代羧酸化合物,其中我们得到了β-氘代丙戊酸化合物并将其合成过程放大到了克级规模。除化合物2e,2m外,反应氘代率均在75-100%之间。对于该反应方法,我们也提出了可能的反应机理。丙戊酸钠是一种广谱的抗癫痫的药物。由于丙戊酸β位是该药物一个的代谢位点,我们试想β-氘代丙戊酸钠具有改善药物药效性质的可能。本文第三部分利用PTZ小鼠模型对氘代丙戊酸钠的抗癫痫活性进行评价。我们对比了丙戊酸钠和氘代丙戊酸钠对小鼠急性癫痫潜伏期,急性癫痫大发作次数,急性癫痫发作等级和急性癫痫死亡率四个方面的影响。结果显示氘代丙戊酸钠与丙戊酸钠的抗癫痫活性各有特点,总体上两者抗癫痫活性没有明显优劣差别。
二、琥珀酸在慢性癫痫模型的作用研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、琥珀酸在慢性癫痫模型的作用研究（论文提纲范文）
（1）ALOXE3过表达在匹罗卡品诱导癫痫发作小鼠模型中发挥神经保护作用的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 一、AA及其代谢产物在癫痫中的作用 |
| 二、ALOXE3 在降低癫痫发作程度中的可能机制 |
| 三、ALOXE3 在神经保护作用中的可能机制 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 氧化应激在癫痫发作中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（2）天麻素对小鼠癫痫持续状态后海马组织自噬的作用及机制（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物及分组 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 癫痫持续状态小鼠模型建立 |
| 2.2.2 癫痫持续状态小鼠模型分级评定 |
| 2.2.3 小鼠海马组织Real-time PCR |
| 2.2.4 小鼠海马组织Western blot |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 癫痫持续状态小鼠模型的建立 |
| 3.1.1 行为学观察 |
| 3.2 癫痫持续状态小鼠海马组织中Beclin-1及LC3的表达变化 |
| 3.2.1 癫痫持续状态小鼠海马组织中Beclin-1 mRNA的表达变化 |
| 3.2.2 癫痫持续状态小鼠海马组织中Beclin-1 蛋白的表达变化 |
| 3.2.3 癫痫持续状态小鼠海马组织中LC3 mRNA的表达变化 |
| 3.2.4 癫痫持续状态小鼠海马组织中LC3蛋白的表达变化 |
| 3.3 天麻素对癫痫持续状态小鼠海马组织中Beclin-1及LC3的表达影响 |
| 3.3.1 天麻素对癫痫持续状态小鼠海马组织中Beclin-1 mRNA的表达影响 |
| 3.3.2 天麻素对癫痫持续状态小鼠海马组织中Beclin-1 蛋白的表达影响 |
| 3.3.3 天麻素对癫痫持续状态小鼠海马组织中LC3 mRNA的表达影响 |
| 3.3.4 天麻素对癫痫持续状态小鼠海马组织中LC3蛋白的表达影响 |
| 3.4 WM预处理后天麻素对Beclin-1及LC3 的表达影响 |
| 3.4.1 WM预处理后天麻素对Beclin-1 mRNA的表达影响 |
| 3.4.2 WM预处理后天麻素对Beclin-1蛋白的表达影响 |
| 3.4.3 WM预处理后天麻素对LC3 mRNA的表达影响 |
| 3.4.4 WM预处理后天麻素对LC3蛋白的表达影响 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 癫痫持续状态小鼠模型建立成功 |
| 4.2 小鼠癫痫持续状态后Beclin-1及LC3表达增加 |
| 4.3 天麻素可降低癫痫持续状态小鼠中Beclin-1及LC3的表达 |
| 4.4 WM可减弱天麻素对自噬活性因子Beclin-1及LC3 的影响 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 |
（3）α-细辛醇抗慢性癫痫作用机制的代谢组学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语中英文对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 癫痫的研究现状 |
| 1.1.1 癫痫概述 |
| 1.1.2 癫痫发病机理 |
| 1.2 抗癫痫药物的研究现状 |
| 1.2.1 临床常用西药 |
| 1.2.2 传统中医用药 |
| 1.2.3 α-细辛醚的临床应用 |
| 1.3 α-细辛醇的发现 |
| 1.4 代谢组学 |
| 1.4.1 代谢组学的一般研究程序 |
| 1.4.2 代谢组学在中医药领域的应用 |
| 1.5 本论文的研究内容及意义 |
| 第二章 α-细辛醇抗PTZ诱导慢性癫痫的效用评价 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 药品与试剂 |
| 2.2.2 仪器 |
| 2.2.3 药液配制 |
| 2.2.4 动物分组与给药 |
| 2.2.5 神经行为学评定和潜伏时间记录 |
| 2.2.6 脑电图(EEG)监测 |
| 2.2.7 脑神经递质含量测定 |
| 2.2.8 脑组织病理学检测 |
| 2.2.9 数据处理 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 α-细辛醇对PTZ诱导癫痫大鼠神经行为学的影响 |
| 2.3.2 α-细辛醇对PTZ诱导大鼠癫痫发作潜伏时间的影响 |
| 2.3.3 α-细辛醇对PTZ诱导癫痫大鼠脑电图的影响 |
| 2.3.4 α-细辛醇对PTZ诱导癫痫大鼠脑神经递质含量的影响 |
| 2.3.5 α-细辛醇对PTZ诱导癫痫大鼠海马组织形态的影响 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 PTZ诱导慢性癫痫发生发展过程的代谢组学研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 药品与试剂 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.2.3 动物分组及给药 |
| 3.2.4 样品采集 |
| 3.2.5 NMR样品制备 |
| 3.2.6 NMR图谱采集 |
| 3.2.7 模式识别分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 大鼠血浆、尿液和粪提取液中代谢物的NMR鉴定 |
| 3.3.2 PTZ点燃癫痫不同发展阶段的模式识别分析 |
| 3.3.3 癫痫发生发展过程中潜在生物标志物的发现 |
| 3.3.4 与PTZ点燃癫痫发生发展过程相关的代谢通路分析 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 α-细辛醇抗PTZ诱导癫痫的代谢组学研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 样品采集与处理 |
| 4.2.2 NMR图谱采集、模式识别分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 代谢物的NMR鉴定 |
| 4.3.2 α-细辛醇抗癫痫大鼠代谢组的模式识别分析 |
| 4.3.3 与α-细辛醇抗癫痫作用相关的潜在生物标志物 |
| 4.3.4 与α-细辛醇抗癫痫作用相关的代谢通路分析 |
| 4.4 小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 攻读硕士学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）柚皮素通过Nrf2/HO-1通路抑制氧化损伤及其对癫痫大鼠的神经保护作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 柚皮素对匹罗卡品诱导的癫痫大鼠脑损伤的保护作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和分组 |
| 2.2.1 研究对象 |
| 2.2.2 实验分组 |
| 2.3 研究方法 |
| 2.3.1 建立癫痫大鼠模型 |
| 2.3.2 灌胃给药 |
| 2.3.3 脑电图检测 |
| 2.3.4 Morris水迷宫试验 |
| 2.3.5 组织包埋 |
| 2.3.6 HE染色 |
| 2.3.7 尼氏染色 |
| 2.3.8 TUNEL染色 |
| 2.3.9 Western blot免疫印迹 |
| 2.4 统计学分析方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 癫痫大鼠脑电图改变 |
| 3.2 柚皮素对癫痫大鼠空间学习记忆能力的影响 |
| 3.3 不同时间点癫痫大鼠海马组织病理形态学的变化 |
| 3.4 不同时间点癫痫大鼠海马神经元Nrf2的表达 |
| 3.5 不同时间点癫痫大鼠海马神经元HO-1的表达 |
| 3.6 柚皮素对癫痫大鼠海马组织病理形态学的影响 |
| 3.7 柚皮素对癫痫大鼠海马神经元凋亡的影响 |
| 3.8 柚皮素对癫痫大鼠海马神经元凋亡相关蛋白的影响 |
| 3.9 柚皮素对癫痫大鼠海马神经元Nrf2表达的影响 |
| 3.10 柚皮素对癫痫大鼠海马神经元HO-1表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 柚皮素对SH-SY5Y细胞氧化应激损伤的抑制作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和分组 |
| 2.2.1 研究对象 |
| 2.2.2 实验分组 |
| 2.3 研究方法 |
| 2.3.1 SH-SY5Y细胞的培养及处理 |
| 2.3.2 MTT检测 |
| 2.3.3 ROS测定 |
| 2.3.4 线粒体膜电位测定 |
| 2.3.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.3.6 Western blot免疫印迹 |
| 2.4 统计学分析方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 柚皮素对H_2O_2 诱导的SH-SY5Y细胞活力的影响 |
| 3.2 柚皮素对H_2O_2 诱导的SH-SY5Y细胞线粒体功能的影响 |
| 3.2.1 柚皮素抑制H_2O_2 诱导的SH-SY5Y细胞活性氧的产生 |
| 3.2.2 柚皮素抑制H_2O_2 诱导的SH-SY5Y细胞线粒体膜电位的降低 |
| 3.2.3 柚皮素抑制H_2O_2 诱导的SH-SY5Y细胞细胞色素C的释放 |
| 3.3 柚皮素对H_2O_2 诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的影响 |
| 3.3.1 柚皮素抑制H_2O_2 诱导的SH-SY5Y细胞活凋亡的发生 |
| 3.3.2 柚皮素抑制H_2O_2 诱导的SH-SY5Y细胞Bcl-2/Bax比例降低 |
| 3.3.3 柚皮素抑制H_2O_2 诱导的SH-SY5Y细胞Caspase3 的激活 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 柚皮素通过调控Nrf2/HO-1 通路抑制SH-SY5Y细胞氧化损伤的机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 SH-SY5Y细胞的培养及处理 |
| 2.2.2 细胞转染 |
| 2.2.3 MTT检测 |
| 2.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.2.5 免疫荧光检测 |
| 2.2.6 细胞浆和细胞核蛋白的提取 |
| 2.2.7 Western blot技术 |
| 2.2.8 免疫共沉淀技术 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 柚皮素对SH-SY5Y细胞HO-1 表达的影响 |
| 3.2 柚皮素对SH-SY5Y细胞Nrf2 表达的影响 |
| 3.3 柚皮素通过促进Nrf2与Keap1 解离激活Nrf2 |
| 3.4 Western blot验证Nrf2 sh RNA转染SH-SY5Y细胞的效果 |
| 3.5 柚皮素通过激活Nrf2上调HO-1表达 |
| 3.6 沉默Nrf2 后柚皮素对氧化损伤的SH-SY5Y细胞Nrf2 表达的影响 |
| 3.7 沉默Nrf2 后柚皮素对氧化损伤的SH-SY5Y细胞HO-1 表达的影响 |
| 3.8 沉默Nrf2 后柚皮素对氧化损伤的SH-SY5Y细胞凋亡的影响 |
| 3.9 柚皮素激活ERK1/2和Akt信号通路 |
| 3.10 ERK1/2和Akt信号通路参与柚皮素诱导的HO-1 表达上调 |
| 3.11 HO-1 抑制剂逆转柚皮素对氧化损伤SH-SY5Y细胞的保护作用 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）转录因子KLF4的抗癫痫作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 癫痫流行病学 |
| 1.2 癫痫的发病机制 |
| 1.2.1 癫痫与突触传递及神经递质释放 |
| 1.2.2 转录因子与癫痫 |
| 1.3 实验设计的研究方案 |
| 第2章 实验部分 |
| 2.1 癫痫和抗癫痫药物对KLF_4 表达的影响 |
| 2.1.1 材料与方法 |
| 2.1.2 实验结果 |
| 2.2 KLF_4 过表达对海马锥体细胞兴奋性的影响 |
| 2.2.1 材料与方法 |
| 2.2.2 实验结果 |
| 2.3 KLF_4 过表达对小鼠癫痫的影响 |
| 2.3.1 材料与方法 |
| 2.3.2 实验结果 |
| 2.4 癫痫儿童全基因组重测序 |
| 2.4.1 实验对象 |
| 2.4.2 实验方法 |
| 2.4.3 实验结果 |
| 第3章 讨论 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 个人简历及学术成果 |
| 致谢 |
（6）PTA对癫痫大鼠的疗效及对GABA能系统和BDNF/TrkB表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 癫痫及治疗癫痫的药物的研究进展 |
| 一、现代医学加深对癫痫病理机制的认识并提出新的治疗概念 |
| 二、治疗癫痫的药物的研发及临床应用存在的难题 |
| 三、治疗癫痫的药物的发展方向及应用目标的转型 |
| 四、评价药物对癫痫病理机制的作用的实验方法 |
| 第二节 GABA能系统在癫痫中的角色 |
| 一、GABA能系统的组成、功能及与癫痫的联系 |
| 二、作用于GABA能系统的AEDs |
| 第三节 海马结构在癫痫中的角色 |
| 一、海马结构的解剖学关系 |
| 二、海马结构与癫痫的联系 |
| 第四节 PILO致痫大鼠模型的研究进展 |
| 一、PILO癫痫模型的造模原理及方法 |
| 二、PILO癫痫模型的症状行为学、EEG、脑功能及脑结构改变的特点 |
| 第五节 本课题研究PTA对癫痫病理机制的作用的依据 |
| 一、中医药治疗癫痫的渊源及研究进展 |
| 二、半夏治疗癫痫的中医学渊源 |
| 三、半夏及其成分治疗癫痫的研究进展 |
| 四、PTA可能是半夏治疗癫痫的活性成分 |
| 第六节 本课题评估PTA对正常神经功能的影响的必要性 |
| 一、治疗癫痫的药物必须进行神经毒性筛查 |
| 二、PTA的毒理研究现状及本课题前期研究的背景 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 实验材料及统计学方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、统计学方法 |
| 第二节 实验一:PTA对癫痫大鼠的疗效及对GABA能系统和BDNF/TrkB表达的影响 |
| 一、目的 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 第三节 实验二:PTA对健康KM小鼠运动平衡、自主活动及空间工作记忆能力的影响 |
| 一、目的 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 第四节 实验一及实验二的综合讨论 |
| 一、PTA的系统毒性不显着 |
| 二、PTA的神经毒性不显着 |
| 结语 |
| 第一节 本研究的结论 |
| 第二节 本研究的创新之处 |
| 第三节 进一步研究的设想 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1: 实验仪器及实验图片 |
| 附录2: 前期研究报告——PTA急性经口给药LD_(50)的测定(扩展试验法) |
| 附录3: 英文缩略语 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（7）生酮饮食对发育期惊厥性脑损伤神经保护作用中Plpprs家族蛋白的作用及对线粒体功能的调节机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 实验流程图 |
| 第一部分 青霉素反复惊厥模型远期可塑性相关蛋白分子和线粒体功能相关蛋白分子表达变化和相互作用 |
| 绪论 |
| 1.1 研究材料 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 研究结果 |
| 1.4 小结 |
| 1.5 结论 |
| 1.6 讨论 |
| 第二部分 实验流程图 |
| 第二部分 生酮饮食干预远期前脑可塑性相关蛋白分子和线粒体功能相关蛋白分子表达 |
| 绪论 |
| 2.1 研究材料 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.3 研究结果 |
| 2.4 小结 |
| 2.5 结论 |
| 2.6 讨论 |
| 第三部分 酮体在离体细胞模型中对谷氨酸细胞毒性的保护作用及Plppr5神经保护作用的机制研究 |
| 绪论 |
| 第三部分 第一节实验流程图 |
| 第三部分 第二节实验流程图 |
| 3.1 第一节酮体在离体细胞模型中对兴奋性细胞毒性的保护作用及Plppr5神经保护作用 |
| 3.2 第二节可塑性相关蛋白Plppr5通过调节线粒体功能发挥神经保护作用 |
| 3.3 结论 |
| 3.4 讨论 |
| 结论及展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 在读期间公开发表的论文 |
| 本课题资助项目 |
| 致谢 |
（8）PTCHD1在癫痫中的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 PTCHD1在难治性癫痫患者(Temporal lobe epilepsy,TLE)及两种动物模型中的表达 |
| 1 本实验中所用材料与实验方法 |
| 2 结果 |
| 3 实验讨论 |
| 第二部分 PTCHD1对海人酸动物癫痫模型和戊四氮癫痫动物模型行为学的影响 |
| 1 实验材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 实验讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述:GABA能神经元与癫痫关系研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
（9）基于1H NMR代谢组学方法评价天麻对慢性萎缩性胃炎的预防及治疗作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 天麻概述 |
| 1.2 天麻的化学成分 |
| 1.3 天麻的药理研究 |
| 1.3.1 抗惊厥与抗癫痫作用 |
| 1.3.2 镇静催眠作用 |
| 1.3.3 镇痛作用 |
| 1.3.4 对心脑血管的作用 |
| 1.3.5 增强免疫力 |
| 1.3.6 促智及延缓衰老作用 |
| 1.3.7 抗炎作用 |
| 1.3.8 其它作用 |
| 1.3.9 毒副作用 |
| 1.4 慢性萎缩性胃炎概述 |
| 1.4.1 慢性萎缩性胃炎的类型及病因 |
| 1.4.2 慢性萎缩性胃炎的药物治疗现状 |
| 1.5 代谢组学研究进展 |
| 1.5.1 代谢组学简介 |
| 1.5.2 代谢组学研究对象与检测技术 |
| 1.5.3 代谢组学分析方法 |
| 1.5.4 代谢组学在药效评价中的应用 |
| 1.6 本文研究内容及意义 |
| 2 天麻对于慢性萎缩性胃炎的药效评价实验 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 试剂与仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 天麻的提取 |
| 2.2.2 实验动物和实验条件 |
| 2.2.3 动物模型的选择和建立 |
| 2.2.4 实验设计 |
| 2.2.5 组织病理学研究 |
| 2.2.6 胃酸测定 |
| 2.2.7 生化指标检测 |
| 2.2.8 核磁样品制备及测试 |
| 2.2.9 ~1H NMR数据的预处理 |
| 2.2.10 代谢物指认 |
| 2.2.11 多元统计分析 |
| 2.2.12 单变量分析 |
| 2.2.13 代谢相关网络分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 大鼠体重变化 |
| 2.3.2 大鼠胃酸含量的变化 |
| 2.3.3 组织病理学检查 |
| 2.3.4 生化指标 |
| 2.3.5 代谢物归属 |
| 2.3.6 多元统计分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 氧化应激 |
| 2.4.2 能量代谢 |
| 2.4.3 嘌呤代谢 |
| 2.4.4 抗炎活性的研究 |
| 2.4.5 相关网络分析 |
| 2.5 天麻不同极性部位的药效评价 |
| 2.6 总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（10）重水为氘源8-胺基喹啉导向选择性原位合成氘代羧酸及氘代丙戊酸钠的抗癫痫活性评价（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 缩写、符号清单、术语 |
| 1 绪论 |
| 1.1 氘代化合物简介 |
| 1.1.1 氘代化合物在药物分析中的应用 |
| 1.1.2 氘代化合物在有机化学中的应用 |
| 1.1.3 氘代化合物在药物化学中的应用 |
| 1.2 氢-氘交换反应简介 |
| 1.2.1 酸碱催化氢-氘交换反应 |
| 1.2.2 非均相体系的过渡金属催化氢-氘交换反应 |
| 1.2.3 均相体系的过渡金属催化氢-氘交换反应 |
| 参考文献 |
| 2 选择性氘代羧酸的合成 |
| 2.1 导向基团介导过渡金属催化碳氢键活化反应 |
| 2.2 邻位氘代芳香酸的合成 |
| 2.2.1 合成路线的设计 |
| 2.2.2 氘代反应条件优化 |
| 2.2.3 底物适应范围考察 |
| 2.3 β-氘代脂肪酸及β-氘代苯丙(烯)酸类化合物的合成 |
| 2.4 可能的反应机理 |
| 2.5 克级氘代丙戊酸的合成 |
| 2.5.1 文献报道的氘代丙戊酸合成方法 |
| 2.5.2 克级β-氘代丙戊酸的合成 |
| 2.6 小结 |
| 2.7 实验部分 |
| 参考文献 |
| 3 β-氘代丙戊酸钠的抗癫痫活性评价 |
| 3.1 丙戊酸钠简介 |
| 3.1.1 丙戊酸钠的药理学性质 |
| 3.1.2 丙戊酸钠的药代学性质 |
| 3.2 β-氘代丙戊酸钠对PTZ小鼠模型抗癫痫活性评价 |
| 3.2.1 癫痫小鼠模型构建 |
| 3.2.2 药物抗癫痫病症等级的判断指标 |
| 3.2.3 β-氘代丙戊酸钠和丙戊酸钠抗癫痫活性评价 |
| 3.3 实验部分 |
| 参考文献 |
| 4 结论 |
| 附录 |
| 作者简历 |
四、琥珀酸在慢性癫痫模型的作用研究（论文参考文献）
- [1]ALOXE3过表达在匹罗卡品诱导癫痫发作小鼠模型中发挥神经保护作用的研究[D]. 陈思宇. 广州医科大学, 2021
- [2]天麻素对小鼠癫痫持续状态后海马组织自噬的作用及机制[D]. 高晓宇. 延安大学, 2020(12)
- [3]α-细辛醇抗慢性癫痫作用机制的代谢组学研究[D]. 赵雪. 西北大学, 2020(02)
- [4]柚皮素通过Nrf2/HO-1通路抑制氧化损伤及其对癫痫大鼠的神经保护作用机制研究[D]. 金玉子. 中国医科大学, 2020(01)
- [5]转录因子KLF4的抗癫痫作用及其机制研究[D]. 刘伟. 吉林大学, 2019(10)
- [6]PTA对癫痫大鼠的疗效及对GABA能系统和BDNF/TrkB表达的影响[D]. 邓楚欣. 广州中医药大学, 2019(03)
- [7]生酮饮食对发育期惊厥性脑损伤神经保护作用中Plpprs家族蛋白的作用及对线粒体功能的调节机制[D]. 李丽丽. 苏州大学, 2019(04)
- [8]PTCHD1在癫痫中的作用及其机制研究[D]. 王梅玲. 重庆医科大学, 2019
- [9]基于1H NMR代谢组学方法评价天麻对慢性萎缩性胃炎的预防及治疗作用[D]. 陈成. 南京理工大学, 2019(06)
- [10]重水为氘源8-胺基喹啉导向选择性原位合成氘代羧酸及氘代丙戊酸钠的抗癫痫活性评价[D]. 罗浩帆. 浙江大学, 2020(04)