一、胎儿卵巢促性腺激素受体的免疫组化研究（论文文献综述）
奚婷[1]（2021）在《培元补肾安胎方治疗RSA的临床研究及基于内膜衰老的药物机制研究》文中研究说明目的1 探究培元补肾安胎方治疗黄体功能不足（LPD）型复发性流产（RSA）的临床疗效和安全性。2 通过网络药理学和分子对接学探讨培元补肾安胎方治疗RSA的作用机制。3 探究孕酮诱导“种植窗期”子宫内膜急性衰老对胚胎着床的影响。4 以“种植窗期”子宫内膜急性衰老为切入点,探究培元补肾安胎方治疗RSA的分子机制,并对上述网络药理学预测机制进行验证。方法1 采用临床随机对照研究方法,收集脾肾两虚型LPD型RSA患者60例,随机分为两组:治疗组30例和对照组30例。治疗组予培元补肾安胎方和西药地屈孕酮片治疗,对照组予西药地屈孕酮片治疗。观察对比两组患者的一般情况、孕12周妊娠结局、治疗前后中医证候积分、血清E2、P和β-HCG、盆腔B超,及治疗前后肝肾功、血常规等安全性指标。2 采用网络药理学方法对培元补肾安胎方治疗RSA的作用机制进行分析,并运用分子对接学对结果进行初步验证,具体方法如下:通过检索TCM、TCMSP数据库得到培元补肾安胎方的化合物;通过TCMSP、Pubchem、CHEMBL得到化合物对应的靶点;利用Genecards和OMIM数据库收集RSA相关基因;利用R语言得到培元补肾安胎方治疗RSA的潜在靶点;string数据库构建PPI网络图;应用clusterProfiler包对共同靶点完成GO和KEGG富集分析;最后采用MOE软件分子对接评估培元补肾安胎方重要活性成分与关键靶点的结合活性。3 采用体内和体外实验相结合方法,体内实验:将ICR雌鼠随机分为PD0-PD9组、除衰组、对照组①、米非司酮（RU486）组、对照组②。PD0-PD9组分别于PD0-9天下午取材,除衰组、对照组①、RU486组、对照组②分别于PD5和PD9下午取材,观察对比胚胎着床数目,应用SA-β-gal染色、IHC、WB检测子宫内膜组织衰老标志物（SA-β-gal活性、P16蛋白）的表达。体外实验:不同浓度、时间点的甲羟孕酮（MPA）对2BS细胞进行干预,应用WB检测各组2BS衰老标志蛋白P53、P21、P16表达量,SA-β-gal染色检测2BS SA-β-al活性,光学显微镜观察2BS形态的改变,EdU检测2BS增殖功能,RT-PCR检测2BS SASP、PRL mRNA表达量。收集MPA诱导2BS的衰老上清液与HTR-8/SVneo共培养,应用CCK8、EdU、划痕及Transwell实验分别检测HTR-8/SVneo的增殖、迁移和侵袭功能。4采用Clark经典复发性流产模型鼠造模方法造模,将CBA/J雌鼠随机分为12组。正常组B、模型组B、西药组B、中药低剂量组B、中药中剂量组B、中药高剂量组B在PD14取材计算胚胎丢失率;正常组A、模型组A、西药组A、中药低剂量组A、中药中剂量组A、中药高剂量组A在PD5下午取材,应用HE染色观察小鼠卵巢黄体面积,Elisa检测血清P水平,SA-β-gal染色检测内膜的SA-β-gal活性,WB和RT-PCR检测子宫内膜P16、P53、P21蛋白和mRNA表达,IHC检测子宫P16蛋白定位分布及表达。结果1培元补肾安胎方对LPD型RSA临床疗效1.1保胎结局:治疗组保胎成功率93.33%高于对照组70%（p<0.05）。1.2中医证候疗效:治疗组总有效率96.67%高于对照组60.00%（p<0.01）。1.3中医证候积分:治疗后两组患者脾肾两虚型中医证候总积分均明显低于治疗前（p<0.01）。治疗组改善LPD型RSA患者脾肾两虚型证候优于对照组（p<0.05）。1.4止血时间:治疗组平均止血时间4.29±0.46天短于对照组6.48±0.54天（p<0.05）。1.5腹痛消失时间:治疗组平均腹痛消失时间5.48±0.35天短于对照组8.63±0.84天（p<0.05）。1.6血清激素水平:治疗组在孕9、11、12周血清E2值高于对照组（p<0.05）;治疗组孕6、7、9、11、12周血清P值高于对照组（p<0.05）;治疗组孕8、9、10、11、12周血清β-HCG值高于对照组（p<0.01）。1.7 B超检查:治疗组胚胎发育与孕周相符22例,小于孕周6例,胎停育2例;对照组胚胎发育与孕周相符14例,小于孕周7例,停育9例。1.8不良反应:治疗组肝功异常1例,对照组肝功异常3例、皮疹1例,两组在安全性方面无差异（p>0.05）。2网络药理学和分子对接探讨培元补肾安胎方治疗复发性流产的作用机制2.1培元补肾安胎方潜在化合物及作用靶点:潜在化合物186个,作用靶点136个。2.2 RSA疾病靶点:经过筛选去重共得到RSA靶点1658个。2.3共同靶点筛选及互作网络构建:共同靶标65个,潜在靶点分别至少与两个化合物相连接。2.4 PPI网络的构建和关键靶点的提取:PPI网络中有65个节点,其中VEGFA、IL6、EGFR、MPAK8、ESR1等是关键靶点。2.5 GO和KEGG富集:GO主要涉及转录因子活性、单加氧酶活性等。KEGG主要涉及 PI3K-Akt、MPAK、P53 等。2.6分子对接:核心化合物和潜在靶点分子对接得分均≤-5.0 kcal/mol。3孕酮诱导“种植窗期”内膜细胞衰老在胚胎着床中的作用研究3.1“种植窗期”内膜存在急性衰老的生理表现:IHC结果显示,P16蛋白在子宫内膜间质成纤维细胞、上皮细胞胞核呈阳性表达,PD0-PD5组随着怀孕天数的增加P16蛋白表达量逐渐增多,于PD5达到最大值,PD6-PD9组P16表达量逐渐减少。WB和β-gal染色也得出相同结果。3.2“种植窗期”内膜衰老有利于胚胎着床:清除衰老细胞后胚胎着床数目、SA-β-gal活性、内膜P16蛋白表达量少于对照组（p<0.01）。3.3孕酮可诱导成纤维细胞衰老:与空白组相比,各组MPA干预后2BS细胞SA-β-gal活性和衰老标志蛋白P16、P21、P53表达量增多（p<0.01）,细胞形态不规则、细胞核增大,其中MPA（8μM）作用16天,各指标变化显着（p<0.01）。EDU结果显示MPA干预后2BS增殖减慢（;p<0.01）。RT-PCR实验结果显示,MPA组CXCL-2、CXCL-1 等 SASP、PRL mRNA 表达高于空白组（p<0.01）。3.4孕酮诱导细胞衰老是胚胎着床的重要条件:RU486阻断孕酮作用后胚胎着床数目、内膜P16蛋白表达量及SA-β-gal活性小于对照组（p<0.01）。3.5孕酮诱导形成的衰老微环境有利于滋养细胞功能:Senescent CM共培养的HTR-8/SVneo细胞水平和垂直迁移、侵袭功能强于Young CM组（p<0.01）。4基于“种植窗期”内膜衰老探讨培元补肾安胎方治疗RSA的作用研究4.1胚胎丢失率:模型组胚胎丢失率高于正常组（p<0.01）,提示造模成功。中药各剂量组和西药组均低于模型组（p<0.05）。4.2血清P水平:模型组血清P水平低于正常组（p<0.05）。中药中剂量组和西药组血清P水平高于模型组（p<0.05）。4.3卵巢黄体面积:模型组黄体面积少于正常组（p<0.05）。中药中剂量组和西药组卵巢黄体面积多于模型组（p<0.05）。4.4 SA-β-gal染色:模型组内膜SA-β-gal活性少于正常组（p<0.01）。中药中、高剂量组和西药组内膜组织SA-β-gal活性多于模型组（p<0.01）。4.5内膜组织P16、P53、P21蛋白和mRNA表达:模型组P16、P53、P21蛋白和mRNA表达低于正常组（p<0.05）。中药低、中剂量组、西药组P16、P53、P21蛋白和mRNA表达高于模型组（p<0.05）。4.6免疫组化:P16蛋白在内膜成纤维细胞、上皮细胞的胞核中呈阳性表达,模型组内膜P16蛋白表达量低于正常组（p<0.01）,中药低、中剂量组、西药组内膜P16蛋白表达量高于模型组（p<0.01）。结论1培元补肾安胎方能明显改善脾肾两虚证候,减轻阴道流血、腹痛症状,提高血清E2、P、β-HCG水平,促进胚胎发育,提高LPD型RSA的保胎成功率。2通过网络药理学初步明确培元补肾安胎方治疗RSA的分子机制可能是通过调控P53信号通路,调节细胞衰老,从而治疗RSA。3“种植窗期”内膜急性衰老是胚胎着床的必要条件之一,其中足量足时间的孕酮是诱导内膜衰老的重要因素。4 P不足、“种植窗期”内膜急性衰老不足可能是LPD型RSA发病机制。培元补肾安胎方可能通过提高血清P和卵巢黄体面积,增加“种植窗期”内膜P53、P21、P16表达,促进“种植窗期”内膜衰老从而发挥保胎作用。
赵畅[2]（2021）在《能量负平衡奶牛产后乏情的关键蛋白筛选及作用机制研究》文中认为奶牛产后能量负平衡（NEB）会抑制卵泡发育,使得乏情率升高。尽管集约化牛场应用同期发情定时输精技术（TAI）来提高奶牛发情率,但仍有部分NEB奶牛产后经TAI处理后无优势卵泡供机体选择排卵,出现乏情表现。目前,高产奶牛产后NEB所致的乏情率升高已成为制约奶牛繁殖效率的一大瓶颈。为此,本研究针对这一问题,通过NEB乏情奶牛血清、卵泡液和卵巢皮质组织的蛋白质组学分析的体内实验,结合ADPN对低糖培养奶牛体外颗粒细胞（GCs）生长发育和类固醇激素合成的影响的体外实验,阐明NEB奶牛产后乏情蛋白质组学变化特征,明确所筛选的差异蛋白如脂联素（ADPN）与奶牛产后乏情的关系及其对奶牛乏情发生的风险预警作用,以及ADPN影响奶牛产后乏情和体外GCs生长发育的分子机制,为今后研究奶牛产后NEB导致乏情的机制提供理论依据。1.体内实验。为了明确奶牛产后乏情蛋白组学特征谱以及差异蛋白的作用,本实验在奶牛产后14-21 d根据血清中β-羟丁酸（BHBA）浓度高于1.20 mmol/L,同时葡萄糖（Glu）浓度低于2.80 mmol/L,被分成能量负平衡组（NEB,n=30）和能量平衡组（PEB,n=30）,跟踪至产后55-60 d;在产后50-55d根据是否发情及卵泡直径大小选择NEB组乏情奶牛（NEB-A,n=6,卵泡直径<8 mm）和PEB组发情奶牛（PEB-E,n=6,优势卵泡直径在15-20 mm之间）进行屠宰采集样品,开展了系列实验,结果如下:（1）应用TMT/LC-MS/MS蛋白组学技术筛选NEB-A和PEB-E奶牛血清、卵泡液和卵巢皮质组织的差异表达蛋白（DEP）,分析DEP功能和富集通路等。与PEB-E组相比,NEB-A组奶牛血清中DEP有82个下调,78个上调,主要富集通路包括:补体和凝血系统、P13K-AKT通路、胰高血糖素信号通路、MAPK通路等;NEB-A组奶牛卵泡液中DEP有135种下调,37种上调,主要富集通路包括:脂质代谢、IGF调节系统、免疫系统等;NEB-A组奶牛卵巢皮质组织中DEP有88个下调,70个上调,主要富集通路包括:类固醇激素代谢、脂肪酸代谢、免疫系统等。（2）应用Western blot验证筛选的5种DEP,即超氧化物歧化酶（SOD）、视黄醇结合蛋白4（RBP4）、胰岛素样生长因子2（IGF2）、ADPN、和C反应蛋白（CRP）在卵泡液和血液中的表达水平,与组学结果一致。同时,验证试验奶牛卵巢皮质组织中AKT和ERK1/2磷酸化水平,与PEB-E组相比,AKT和ERK1/2在NEB-A组奶牛卵巢皮质组织的磷酸化水平显着下调（p<0.05）。（3）应用免疫组化对ADPN在卵巢组织中进行定位,与PEB-E组相比,NEB-A组奶牛ADPN在卵巢髓质下调,与血液、卵泡液和脂肪组织中的下调一致（p<0.05）,证实ADPN主要分布于卵巢髓质。（4）NEB和PEB奶牛血清中肝功指标、胰岛素调控相关指标及血清和卵泡液中ADPN和Glu,经生化分析、聚类分析、二元逻辑回归分析、风险指数分析和受试者工作特征曲线（ROC）分析发现,血清中ADPN与胰岛素调控和肝功指标呈强相关,卵泡液中Glu与ADPN呈正相关。并且,奶牛产后14-21 d血清中ADPN<2.365μg/m L可以用于奶牛产后乏情发生的风险预警。体内实验结果表明,奶牛产后经历NEB后血液、卵泡液及卵巢皮质组织中DEP主要通过富集通路影响奶牛产后发情,其中AKT和ERK1/2在奶牛卵巢皮质组织的磷酸化水平下调,以及血液、卵泡液和卵巢组织中ADPN的下调在奶牛产后乏情发生中起了重要的作用。2.体外实验。为了阐明低糖/ADPN在奶牛卵泡发育或GCs生长发育的作用,本实验在建立低糖培养体外牛GCs模型基础上,开展了系列实验,结果如下:（1）用Western blot检测低糖培养和正常培养下牛GCs细胞周期蛋白（CCNA1、CCND1、CCNE2、CDK1）、类固醇激素合成蛋白（St AR、HSD3B1）、ADPN蛋白受体（Adipo R2）的表达水平,与正常培养相比,低糖培养GCs细胞周期蛋白、类固醇激素合成蛋白、Adipo R2的表达水平都显着下调（p<0.05）。（2）在低糖培养下,添加低（0.1μg/m L）、中（0.5μg/m L）和高剂量（1μg/m L）的牛重组ADPN蛋白,仅添加蛋白包被溶剂为对照组。在处理12 h、24 h、48 h后,用CCK8、Western blot检测细胞活性、ADPN受体R2、细胞周期蛋白、类固醇激素合成蛋白的蛋白表达水平,用放射免疫方法检测培养基中E2和P4含量。与其他组相比,高剂量组48 h后细胞活性最高;与对照组相比,高剂量组St AR蛋白水平极显着升高（p<0.05）,三组HSD3B1蛋白水平极显着升高（p<0.01）;低剂量组GCs分泌E2能力无显着变化,高浓度ADPN显着增加E2合成能力;与对照组相比,不同剂量ADPN对GCs分泌P4无明显影响。（3）在低糖培养下,外源性添加LY294002（PI3K/AKT抑制剂）和高剂量ADPN,在处理12 h、24 h、48 h后,用Western blot检测AKT磷酸化水平以及CDK2、St AR、HSD3B1、Adipo R2的蛋白水平,用q-PCR检测CYP19A1、3β-HSD的基因表达水平,用放免法检测不同组中E2、P4含量。与对照组相比,添加ADPN+PI3K抑制剂组细胞活性显着下降（p<0.01）,CDK2蛋白水平极显着下降（p<0.01）,St AR和HSD3B1蛋白水平极显着下降（p<0.01）,培养基中P4含量无明显变化,但E2含量显着下降（p<0.05）。体外实验结果表明,高剂量ADPN经Adipo R2激活PI3K-AKT-CDK2通路刺激低糖环境下GCs类固醇激素E2的分泌,增强细胞活性,促进细胞生长发育。综上所述,本研究获得了奶牛产后乏情蛋白组谱,发现NEB通过补体和凝血系统、P13K-AKT通路、胰高血糖素信号通路、MAPK通路、脂肪酸代谢、免疫系统调控以及IGF调节系统等主要富集通路影响奶牛产后卵泡发育,确立了ADPN对NEB奶牛产后乏情发生的风险预警作用,证实了ADPN可以经Adipo R2-PI3K-AKT通路影响低糖培养下牛GCs活性和类固醇激素合成,进而调控卵泡生长发育。
何全阔[3]（2021）在《有机硫类杀菌剂克菌丹暴露影响小鼠卵巢功能和卵母细胞发育》文中提出有机硫类杀菌剂克菌丹（Captan）属于领苯二甲酰亚胺家族,是现代农业中使用最广泛的非系统性杀菌剂。但在Captan广泛使用的同时,其环境残留物所造成的生态效应和生物毒性引起了普遍关注,已有研究报道Captan可对组织产生多种毒性,但是关于Captan对哺乳动物雌性生殖过程的毒性尚不清楚。雌性生殖过程是物种繁衍的基本生理途径,包括卵子发生的内分泌调控、卵泡的生成和发育、卵子的减数分裂成熟、受精卵的形成和着床、胚胎的形成与发育等。维持正常的生殖发育不仅取决于遗传因素,还很大程度上依赖于环境因素。环境污染暴露对生殖过程的每一个环节都可能造成损害,导致生育力降低,胎儿生长迟缓,流产以及出生缺陷。在我们的研究中,使用Captan建立小鼠灌胃毒理模型。我们发现Captan会降低小鼠体重和卵巢系数,并干扰雌性激素受体的表达,进而影响卵泡的发育,并且Captan处理组卵巢颗粒细胞凋亡率较高。通过转录组分析,我们发现Captan暴露改变了与自噬、凋亡和内质网应激相关的多个卵母细胞基因的表达。Captan对卵母细胞发育也有不利影响。蛋白免疫印迹（Western blot）,荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,qPCR）,免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）和免疫荧光染色（Immunofluorescence staining,IF）结果表明Captan的暴露可以诱导卵泡发育障碍、雌激素受体表达下降、颗粒细胞凋亡、炎性因子积累、卵母细胞数量和成熟能力下降。此外,Captan暴露会增加氧化应激和线粒体功能障碍,表现为ROS水平升高,线粒体结构和分布异常,以及去极化电位。除此之外,Captan还会引发DNA损伤、自噬和早期凋亡,表现为γ-H2AX、LC3和Annexin-V信号的出现以及相关基因的增加。总的来说,我们的结果表明,Captan暴露会损害卵巢稳态,进而影响卵母细胞的发育。
华荣茂[4]（2021）在《体外重组装人促卵泡激素的制备及转基因小鼠模型的构建》文中研究表明促卵泡激素（FSH）是一种糖蛋白类激素,它是由FSHα亚基和FSHβ亚基通过非共价键组成的异源二聚体蛋白。解离分开的FSHα亚基和FSHβ亚基都不具备生物学功能,只有两个亚基正确的组装在一起才具备生物学功能。在女性体内,FSH的主要作用是刺激卵泡的发育、排卵和子宫内膜的生长。在男性体内,FSH的主要作用是刺激精子的产生和次级精母细胞的发育,并通过与促黄体生成素（LH）及雄激素的协同作用来刺激精子发育成熟。在临床上,FSH主要用于试管婴儿的制备以及不孕不育的治疗。目前上市的FSH产品主要有尿源FSH（uh FSH）和基因工程重组FSH（rh FSH）。尿源FSH来源不均一、纯化工艺较复杂,并且存在其他蛋白的残留,生物活性也不如rh FSH。rh FSH来源均一、生物活性好,且便于提取。目前上市的rh FSH产品主要由哺乳动物细胞生产,如商业化的rh FSH产品Puregon和Gonal-F,它们都是由中国仓鼠卵巢细胞（CHO）细胞分泌的,然而细胞制备的rh FSH蛋白产量相对较低且价格昂贵。随着转基因技术的发展,利用动物乳腺生物反应器来制备外源重组蛋白是一种富有前景的方法。动物乳腺生物反应器制备的外源蛋白有完整的翻译后修饰,且它们和天然的蛋白结构相似,最重要的是产量高。但是,国内外未见利用转基因大动物乳腺生物反应器来制备rh FSH蛋白药物的研究报导,主要原因是很多研究发现过量的具备生物活性的FSH积累在动物乳腺内会引发动物疾病乃至肿瘤,这预示着利用大动物乳腺制备FSH会对动物造成潜在的不良影响。因此如何实现利用大动物乳腺制备出rh FSH蛋白,同时又能避免因为有生物活性的FSH积累可能导致的转基因动物患肿瘤的风险,这仍需进一步研究和探索。本研究围绕上述问题进行了五个方面的研究工作,并获得了如下结果。（1）人FSHα、FSHβ亚基蛋白的表达通过构建p IRES-Hyg3-FSHα及p IRES-Neo-FSHβ/His真核表达载体,在CHO细胞中分别表达人FSHα、FSHβ亚基基因,获得了能够稳定表达人FSHα、FSHβ亚基蛋白的细胞株CHO-FSHα以及CHO-FSHβ。利用p Ad-FSHα及p Ad-FSHβ/His腺病毒表达载体在HEK 293A细胞中包装获得包含FSHα、FSHβ基因的重组腺病毒Ad-FSHα、Ad-FSHβ。通过腺病毒介导FSHα、FSHβ基因在牛乳腺上皮细胞、羊乳腺上皮细胞（GMECs）以及羊乳腺中暂态表达,结果显示,在牛乳腺上皮细胞、GMECs以及羊乳腺中均能成功制备FSHα、FSHβ亚基蛋白,FSHα、FSHβ亚基蛋白经过PNGase F酶切分析发现它们都具备N端的糖基化修饰。（2）人FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装方法的建立CHO细胞表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白经过纯化后分别以不同的浓度在4℃按照1:1的摩尔比进行体外重组装,His tag pull-down试验表明CHO细胞表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白能够在体外组装成一定的蛋白结构。ELISA结果显示,随着FSHα、FSHβ亚基蛋白浓度的升高,两个亚基蛋白的体外重组装效率也越高。利用建立的亚基蛋白体外重组装方法对牛乳腺上皮细胞、GMECs以及羊乳腺表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白进行体外重组装,结果发现牛乳腺上皮细胞、GMECs以及羊乳腺表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白都能够在体外进行重新组装,进一步证明了本研究建立的FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装方法的有效性。（3）体外重组装rh FSH生物活性恢复技术及生物活性研究通过对FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装后体外稳定性环境条件（温度、浓度、p H值）进一步的优化,发现体外重组rh FSH在4℃、p H 7.4以及高浓度下具备更好的稳定性。对CHO细胞、牛乳腺上皮细胞、GMECs以及羊乳腺表达的体外重组装rh FSH生物活性进行分析,结果表明,在4℃、p H 7.4条件下体外重组装rh FSH能够促使表达在HEK 293/SNAP-FSHR细胞膜上的FSHR受体内吞,同时显着刺激细胞产生环磷酸腺苷（c AMP）（P<0.01）。另外,一定剂量（6 pmol,8×）的体外重组装rh FSH能够显着促进大鼠卵巢增重（P<0.01）,并刺激大鼠卵泡成熟以及子宫内膜的生长。同时,10 pmol的体外重组装能够显着增加小鼠的排卵数（P<0.01）,其效果和Gonal-F相当。以上结果表明,本研究成功建立了体外重组装rh FSH生物活性恢复技术,CHO细胞、牛乳腺上皮细胞、GMECs以及羊乳腺制备的重组装rh FSH在体外重新恢复了生物活性。（4）基于CRISPR/Cas9技术在山羊β-乳球蛋白基因座定点整合人FSHα、FSHβ基因打靶体系的建立基于CRISPR/Cas9技术构建了针对山羊β-乳球蛋白（BLG）基因座第二外显子区域定点整合FSHα和FSHβ基因的2个基因打靶载体p Cas9-sg1、p Cas9-sg2和含目的基因的Donor载体p GHA-FSHα、p GHA-FSHβ/His,并利用GMECs细胞筛选出了具备打靶活性的p Cas9-sg2载体。将Donor载体p GHA-FSHα、p GHA-FSHβ/His分别与p Cas9-sg2共转染GMECs细胞后,筛选出2株稳定表达FSHα-G、FSHβ-G蛋白的GMECs阳性克隆细胞株,经过糖基化和唾液酸化分析发现GMECs细胞表达的FSHα-G、FSHβ-G具备N端糖基化修饰以及唾液酸化。将GMECs细胞表达的FSHα-G、FSHβ-G亚基蛋白体外重组装成rh FSH-G,利用体内、体外生物活性试验进一步检测重组装rh FSH-G蛋白的生物学活性,结果表明rh FSH-G蛋白同样能够促使其受体FSHR内吞,并且刺激细胞产生c AMP。注射一定剂量的重组装rh FSH-G能够明显的促进小鼠排卵、大鼠卵巢增重、卵泡成熟以及子宫内膜的生长,并且呈现剂量依赖性。另外,基于建立的CRISPR/Cas9体系,构建了转FSHα和FSHβ基因的羊胎儿成纤维细胞,筛选出的两株阳性克隆细胞株中分别含有FSHα和FSHβ基因的整合。综上所述,本研究基于CRISPR/Cas9技术建立了有效的基因打靶体系,并利用该体系获得了转人FSHα和FSHβ基因羊胎儿成纤维细胞,为将来转基因羊的制备奠定了研究基础。（5）转人FSHα、FSHβ基因小鼠的制备及其功能研究将构建的pBC1-FSHα和p BC1-FSHβ/His乳腺特异性表达载体显微注射到小鼠受精卵中制备转基因小鼠,经过PCR鉴定,分别制备得到1只转FSHα基因的阳性母鼠和2只转FSHβ基因的阳性母鼠,通过Western blotting和ELISA分析转基因小鼠乳汁中目的蛋白的表达,结果显示获得的转基因小鼠乳汁中含有FSHα和FSHβ目的蛋白的表达,免疫组化分析结果进一步证实了FSHα、FSHβ目的蛋白表达在转基因母鼠乳腺腺泡内壁。利用建立的亚基蛋白体外组装技术和体外重组装rh FSH恢复技术将转基因小鼠乳腺表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白进行体外组装和组装后生物活性鉴定,结果表明,转基因小鼠乳腺表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白在体外组装成了具备生物活性的重组装rh FSH。对转基因小鼠乳腺和卵巢进行组织形态学分析发现,转FSHα及FSHβ基因小鼠的乳腺和卵巢组织形态与野生型小鼠卵巢形态无明显差异。总之,本研究成功制备了乳腺表达FSHα、FSHβ蛋白的转基因小鼠,更重要的是从转基因动物层面初步证明了转基因小鼠乳腺和卵巢组织未受到转基因带来的影响。综上所述,本研究创新性的建立了FSHα、FSHβ亚基蛋白的体外重组装方法。另外,通过建立重组装rh FSH体外生物活性恢复技术,将CHO细胞、牛乳腺上皮细胞、GMECs以及羊乳腺中制备的体外重组装rh FSH生物活性进行了恢复。利用CRISPR/Cas9技术针对山羊BLG基因座构建了定点整合FSHα、FSHβ目的基因的转基因体系,并获取了转FSHα、FSHβ目的基因的羊胎儿成纤维细胞。最后,通过制备的转FSHα、FSHβ基因小鼠模型进一步验证了FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装技术的有效性,初步证实了转FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺及卵巢组织未明显受到转基因过程带来的影响。总之,本研究为将来通过转基因大动物乳腺生物反应器生产体外重组装rh FSH蛋白奠定了基础。
秦弦[5]（2021）在《慢性铁过载对雌性C57BL/6J小鼠卵巢功能的影响及机制研究》文中研究表明研究背景及目的:随着我国出生人口的锐减和人口老龄化趋势的加剧,保护女性卵巢的内分泌及生育功能、提高女性生活质量,成为社会日趋关注的问题。对于女性而言,健康的卵巢可以维持正常的内分泌和生殖功能,尤其是雌激素可以保护心血管、骨骼和神经系统,以维持女性较高的生活质量。铁作为一种人体必需的微量元素,参与能量代谢、DNA和蛋白质合成、氧化呼吸、免疫功能调节等多项生理活动,在女性卵巢中可参与调控卵泡发育、排卵等过程,可见维持机体铁稳态十分重要。然而,临床上需要长期慢性输血的疾病常常导致患者体内铁过载,如重型地中海贫血,在我国南部地区包括云南、四川、广东、广西、福建、海南等地发病率较高。过量铁沉积不仅对肝脏、心脏和内分泌系统产生损伤,还会导致女性出现低促性腺激素性性腺功能减退,表现为血清性激素如FSH、LH、E2和AMH水平降低、窦状卵泡数量减少、月经紊乱或闭经、甚至不孕。尽管部分患者具有自然受孕能力,或经过辅助生殖技术受孕,但怀孕后流产、胎儿生长受限、低出生体重儿等并发症的发病率明显升高。AMH的分泌不受促性腺激素影响,降低的AMH表明铁过载可能会直接对卵巢组织造成损伤。目前尚无明确研究表明慢性铁过载导致卵巢功能受损的机制。因此,建立有效的雌性小鼠慢性铁过载模型,探究铁过载损伤卵巢功能的机制,为保护慢性铁过载女性的卵巢功能、提高生育力、避免妊娠并发症、提高生活质量具有重要的理论价值和临床意义。研究方法:目前尚无文献报道雌性小鼠慢性铁过载的动物模型。本研究所构建模型的理论基础为文献报道对雄性小鼠腹腔注射0.1g/kg,0.5g/kg,1.0g/kg浓度的右旋糖酐铁可导致骨质疏松,对女性而言,骨质疏松与雌激素减少密不可分。我们推测该浓度作用于雌性小鼠,其骨质疏松的形成可能不仅由于过量铁沉积于骨质,还可能是由于过量铁对雌激素合成的干扰。本研究通过对8周龄雌性C57BL/6J小鼠进行每周1次、持续8周的不同浓度右旋糖酐铁的腹腔注射构建雌性小鼠慢性铁过载模型:对照组（OF组,生理盐水）、低浓度组（LF组,0.1g/kg）、中浓度组（MF组,0.5g/kg）,高浓度组（HF组,1.0g/kg）。（1）观察小鼠的体重和进食量以评估铁过载对小鼠健康情况的影响。检测小鼠血清铁离子和铁蛋白水平,肝脏、下丘脑、垂体、卵巢、子宫、卵巢周围脂肪等组织的铁沉积水平来验证小鼠慢性铁过载模型的有效性;（2）观察小鼠动情周期、检测性激素水平来评估铁过载对小鼠卵巢内分泌功能的影响;（3）通过对卵巢组织的H&E染色和普鲁士蓝染色,观察铁的沉积部位及水平、卵巢组织的形态变化。对卵巢组织进行卵泡计数、免疫组织化学（IHC）检测PCNA蛋白表达、免疫印迹试验（WB）检测始基卵泡激活相关蛋白的表达（p-YAP/YAP,p-PTEN/PTEN,p-mTOR/mTOR,p-rpS6/rpS6）,从而评估铁过载对卵泡发育、卵巢细胞的增殖能力的影响;（4）通过交配实验来评估铁过载对小鼠卵巢生殖功能的影响。观察交配产仔后的年老小鼠体内铁沉积和卵巢情况来评估铁过载对小鼠的远期影响;（5）通过观察断乳后子代小鼠的铁水平、卵泡数量及产仔能力来检测母代铁过载对子代小鼠的影响;（6）检测铁过载卵巢组织的氧化应激水平、转录组测序和PCR验证、WB检测初步探究慢性铁过载影响卵巢功能的机制。研究结果:（1）随着铁剂浓度增高,小鼠血清铁离子和铁蛋白水平增加,肝脏、下丘脑、垂体、卵巢、子宫和卵巢周围脂肪组织中铁离子沉积增多,各脏器大体形态和脏器指数改变;（2）LF组小鼠动情周期、性激素水平、卵泡数量和产仔能力与对照组相比无明显差异。卵巢组织中氧化应激水平无明显升高,且与对照组具有相似的转录组表达水平;（3）MF组和HF组小鼠出现动情周期紊乱、E2和AMH水平降低;各级卵泡数量减少、凋亡卵泡数量增加、卵巢细胞增殖能力减弱。始基卵巢激活相关蛋白的磷酸化水平降低;（4）长达10月的产仔结果表明MF组小鼠均可怀孕,但不良妊娠结局发生率升高。HF组中40%小鼠出现不孕症状,其余60%自然受孕的小鼠中20%死于不良妊娠结局,40%小鼠的平均产仔数量和平均产仔窝数较对照组少。产仔实验结束后,MF组年老的小鼠体内铁沉积状态有所缓解;怀孕的HF组小鼠体内铁蛋白处于较高水平,但铁离子水平明显降低;未孕的HF组（HF-I组）小鼠血清铁离子和铁蛋白仍维持在较高水平,卵巢组织中铁沉积较多,残余卵泡数量较少且无明显黄体生成;（5）HF组小鼠的子代雌性小鼠的始基卵泡数量降低、卵巢细胞增殖能力减弱;交配实验表明其平均产仔数量有降低趋势;（6）MF组和HF组小鼠的卵巢组织氧化应激水平增加。转录组测序、PCR验证和WB结果表明它们在卵巢性激素合成、卵巢细胞外基质生成和WNT通路中相关基因和蛋白表达下调。研究结论:（1）本研究成功构建并验证了雌性小鼠慢性铁过载模型;（2）低浓度铁过载（0.1g/kg）对小鼠卵巢功能无明显损伤作用;（3）中浓度（0.5g/kg）和高浓度（1.0g/kg）铁过载会扰乱小鼠卵巢的内分泌功能、抑制卵泡发育、增加卵巢氧化应激水平;（4）中、高浓度铁过载会导致小鼠不良妊娠结局,尽管可随着铁排出而缓解。高浓度铁过载会抑制排卵和黄体形成,降低产仔能力,甚至导致不孕。血清和卵巢中过量铁离子沉积可能是造成不孕的原因;（5）母代高浓度铁过载会降低子代雌性小鼠的卵巢储备;（6）中浓度和高浓度铁过载通过抑制卵巢性激素合成、干扰卵巢微环境和抑制WNT通路来抑制卵巢功能。
揭秘秘[6]（2021）在《Tsp1a/b在尼罗罗非鱼卵子发生中的功能研究》文中研究指明血小板反应蛋白（Thrombospondins,Tsps）是进化上保守的细胞外基质糖蛋白。哺乳动物的Tsp在血管生成、伤口愈合和突触发生等生物学过程中发挥重要作用。血小板反应蛋白1（Thrombospondin1,Tsp1）是Tsp家族五个成员之一。Tsp1在哺乳动物肺、骨骼肌、肾脏、卵巢等多种组织中均有表达,具有激活转化生长因子TGF-β信号通路,调控创伤修复和肿瘤生长过程中血管生成等生物学功能。在真骨鱼中,由于其特有的第三轮基因组复制,绝大多数种类存在两个拷贝的tsp1基因即tsp1a和tsp1b。实验室前期原位杂交分析显示tsp1a和tsp1b在尼罗罗非鱼性腺中的表达存在差异,tsp1a表达于卵巢的颗粒细胞;tsp1b在精巢输出精管上皮细胞和卵巢的鞘膜细胞表达。目前对于Tsp1在脊椎动物性腺发育和配子发生的研究仅限于小鼠Tsp1的敲除导致卵巢形态发生改变和育性降低以及罗非鱼中tsp1a/b突变嵌合体对精子发生的影响,在生殖中的功能特别是在硬骨鱼类卵子发生中的功能还有待阐明。以尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）为对象,在实验室前期已经获得了F0突变体的基础上,本研究通过传代建系获得了tsp1a和tsp1b纯合突变体,重点分析其在卵巢发育和卵子发生中的功能。主要研究结果如下:1)tsp1a和tsp1b在罗非鱼卵巢中的表达模式。实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR,q RT-PCR）分析表明tsp1a m RNA在孵化后5天（day after hatching,dah）的性腺中就有表达,并随着卵巢的发育表达不断升高,在180 dah（卵黄发生期）达到最高。为了研究Tsp1a的蛋白表达,本研究制备了Tsp1a的多克隆抗体。荧光免疫组化分析表明Tsp1a在卵原细胞和颗粒细胞中表达,且在初级生长卵泡颗粒细胞中表达较低,而在次级生长卵泡颗粒细胞中表达较高。荧光原位杂交分析显示,tsp1b在雌鱼未分化性腺的体细胞以及已分化卵巢的鞘膜细胞中表达。这表明tsp1a和tsp1b的表达模式存在明显差异。2)tsp1a突变对卵子发生的影响。实验室前期已经获得了F0代突变嵌合体,主要分析了tsp1a突变嵌合体的精巢表型。本研究通过传代建系成功获得tsp1a纯合突变鱼,并分析了其卵巢表型。在60 dah时,组织学分析显示tsp1a突变鱼卵巢发育和卵子发生与野生型相比没有明显异常。在120 dah时,组织学分析显示,tsp1a突变鱼卵巢中卵原细胞数量显着高于野生型（wild type,WT）鱼卵巢,II时相卵泡的数量显着低于WT鱼卵巢,而I时相卵泡的数量没有显着差异。tsp1a突变鱼的性腺成熟系数GSI（Gonadosomatic index）与WT鱼相比也没有显着差异。在180 dah时,与WT鱼相比,tsp1a突变鱼的GSI显着降低。形态学分析表明,WT鱼卵巢中含有不同发育阶段的卵泡,包括大量卵黄发生期的卵泡,而tsp1a突变鱼卵巢中含有大量初级生长阶段的卵泡,仅有少量卵黄发生期卵泡。统计学分析表明,tsp1a突变鱼卵巢中卵原细胞、I和II时相卵泡的数量显着高于WT鱼卵巢,而III和IV时相卵泡数量显着低于WT鱼卵巢。细胞增殖标志基因PCNA阳性的卵原细胞在tsp1a突变鱼中显着增多。与此相一致的是,转录组分析表明tsp1a突变鱼卵巢中DNA复制相关基因的表达显着上调,而抑制细胞增殖并促进细胞分化的环腺苷酸（Cyclic adenosine monophosphate,c AMP）和有丝分裂原激活蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路相关基因的表达显着下调。此外,tsp1a突变鱼中雌激素合成酶编码基因cyp19a1a表达和血清雌激素水平均显着下调。这些结果表明,tsp1a突变会导致卵原细胞增殖增加而分化受阻,进而导致卵原细胞增多,次级生长阶段卵泡减少,血清雌激素水平降低。3)tsp1b突变对卵子发生的影响。实验室前期已经获得了F0代突变嵌合体,主要分析了tsp1b突变嵌合体的精巢表型。本研究通过传代建系获得tsp1b纯合突变鱼,并分析了其卵巢表型。在90 dah,组织学分析显示tsp1b突变鱼卵巢发育没有明显异常。在180 dah,形态学分析发现,WT鱼的卵巢中含有大量进行卵黄发生的卵泡,而tsp1b突变鱼卵巢中仅有极少量卵黄发生的卵泡。组织学分析显示,tsp1b突变鱼卵巢I和II时相卵泡的数量显着高于WT鱼卵巢,而III和IV时相卵泡的数量显着低于WT鱼卵巢。而tsp1b突变鱼GSI与WT鱼相比无显着差异。荧光免疫组化结果显示,在90 dah时,与WT雌鱼相比tsp1b突变雌鱼卵巢中的颗粒细胞标志基因amh、cyp17a1和cyp19a1a的表达均无显着差异,血清雌激素水平也无显着差异。在180 dah时,与WT雌鱼相比,tsp1b突变雌鱼卵巢中的amh、cyp17a1和cyp19a1a的表达均显着减弱,血清雌激素水平也显着下调。为了系统的研究tsp1b基因敲除对基因表达的影响,对90 dah时的tsp1b突变鱼和WT鱼的卵巢进行了转录组测序分析,结果表明tsp1b突变体中tsp家族相关基因的表达无显着差异,表明敲除tsp1b基因后其他的tsp成员没有补偿作用;而染色质组装相关基因的表达显着下调,细胞粘附相关基因和粘着斑相关基因的表达显着上调。对卵泡发育至关重要的卵泡细胞表达基因amh、cyp17a1和cyp19a1a的下调,以及与卵泡生长和分化相关的染色质组装相关基因的下调,可能是tsp1b突变体鱼中,血清雌激素水平降低和初级生长卵泡向次级生长卵泡过渡失败的原因。细胞粘附分子是参与卵巢内分泌细胞的识别和细胞间相互作用的重要因子其在tsp1b突变体鱼卵巢中表达是显着上调的。这些结果表明tsp1b突变对卵原细胞的增殖和初级卵泡发育没有影响,可能是因为细胞粘附分子和黏着斑相关基因的补偿作用。综上所述,本研究分析了tsp1a/b基因在罗非鱼卵巢的表达模式,证实了tsp1a和tsp1b在尼罗罗非鱼卵巢的表达发生了分化,tsp1a在卵巢的颗粒细胞中表达,而tsp1b在卵巢的鞘膜细胞中表达。缺失功能研究表明tsp1a突变导致卵原细胞和初级卵泡增加,次级卵泡减少,卵泡发育延迟。tsp1b突变对卵原细胞增殖没有影响,但导致初级卵泡不能向次级卵泡发育,卵泡发生停滞在初级生长阶段。因此,tsp1a或tsp1b纯合突变均会影响罗非鱼卵子发生过程,但表型存在差异。本研究通过基因表达和功能研究揭示了复制基因tsp1a/b在硬骨鱼类卵子发生中的功能,有助于拓宽和深化我们对Tsp1在脊椎动物卵子发生中的认识,又能为鱼类获得更高质量的卵子提供理论支持。
康宇[7]（2020）在《非人灵长类早期胚胎发育与疾病模型研究》文中研究说明哺乳动物的胚胎早期发育开始于精子和卵子融合形成合子,之后经历卵裂、囊胚孵化、子宫定植等过程最终发育为完整个体。胚胎植入前发育的过程中会发生一系列重要的生物学事件,如母源——合子转化、合子基因激活、细胞谱系分化等。这些事件的有序发生均依赖于细胞内复杂的分子调控机制,并且极易受到环境应激因素的影响,如高温和内分泌干扰素都会干扰发育中的配子和胚胎正常发育,甚至产生可遗传的表观遗传变异。非人灵长类（NHPs）由于与人类极高的相似性,对其植入前胚胎发育机制的研究有助于解答人类早期胚胎发育的重要问题,同时,非人灵长类也是人类疾病研究的重要动物模型。本论文以猕猴和食蟹猴为对象,利用体外受精技术,开展植入前胚胎发育的转录调控机制和转化研究。研究通过收集猕猴植入前胚胎各个发育阶段的胚胎单细胞样本进行转录组测序,建立了完整的猕猴体外受精胚胎植入前发育转录组图谱。之后经过深入分析胚胎植入前发育过程的转录调控模式,发现灵长类早期胚胎发育中存在转录阻滞现象,桑葚胚时期的胚胎中有部分细胞的转录组停滞在合子基因激活之前阶段。在研究中还构建了体细胞核移植胚胎和单性生殖胚胎,这两类胚胎是研究合子基因组重编程机制及父源/母源印记基因调控的重要材料,通过获取这些胚胎的植入前发育单细胞转录组数据并与正常体外受精胚胎进行比较,发现体细胞核移植（SCNT）和单性生殖（孤雄/孤雌）胚胎的转录模式存在更为普遍的延迟,分析表明这种延迟主要是由异常的表观遗传修饰而导致的合子基因组激活不完全,胚胎发育率下降。通过外源手段消除体细胞核移植胚胎异常的H3K9me3,可以提高体细胞核移植胚胎发育率并且获得克隆动物。非人灵长类是研究人类疾病的理想动物模型。本论文利用CRISPR/Cas9技术进行了食蟹猴植入前胚胎的靶向基因编辑,获得DAX1基因突变猴模型。模型动物出现人类患者肾上腺发育不全（AHC）和低促性腺素性功能减退症（HH）的相关表型,经分析发现Wnt/β-catenin信号通路的异常激活导致的血管发生缺陷可能是DAX1基因突变胎儿时期肾上腺发育不良的主要原因。研究同时发现雄性食蟹猴DAX1缺陷导致的肾上腺和性腺发育缺陷在胎儿期性腺决定阶段就已经开始。通过食蟹猴植入前胚胎的干细胞嵌合实验,证明了非人灵长类胚胎干细胞（ESC）、诱导多能干细胞（i PS）和体细胞核移植来源的胚胎干细胞（NT-ESC）都可以实现食蟹猴胚胎和成体水平嵌合,并且具有三胚层及胚外组织分化潜能。通过收集分析嵌合胚胎的单细胞转录组数据发现,食蟹猴多能干细胞的胚胎嵌合效率差异与其自身的多能性状态密切相关,并且受到嵌合胚胎微环境的调控。综上,本论文研究了非人灵长类胚胎早期发育的转录调控,并构建了疾病动物模型以及嵌合体,从而开展疾病机制和干细胞多能性研究。首次绘制了完整的灵长类植入前发育转录图谱,是对灵长类早期发育调控研究领域的重要补充;利用CRISPR/Cas9技术构建的疾病猴模型表现了其它物种不能出现的、与病人高度相似的表型,是人类复杂疾病研究的理想动物模型。
林静[8]（2020）在《从LncMEG3介导PI3K/AKT/mTOR调控卵巢颗粒细胞自噬探讨针刺对PCOS排卵障碍效应机制》文中指出多囊卵巢综合征（PCOS）是妇科临床常见疾病,针刺治疗PCOS临床效果确切,但针刺治疗PCOS的作用靶点及起效途径研究尚处于初期探索阶段,深入的高质量研究十分有限。因此,开展针刺治疗PCOS机制研究是我们中医界今后应该重视的方向,也是本论文立意的根本所在。第一部分:相关多囊卵巢综合征的文献研究目的:从文献研究角度论述相关多囊卵巢综合征及针刺疗法的研究进展,确立实验内容。方法:全面检索近年国内外报道的PCOS相关文献,对其进行较为系统的整理、总结和综述,进而掌握有关PCOS研究及针刺疗法的前沿动态。结果:（1）西医学对多囊卵巢综合征的认识及诊治进展:PCOS发病率的增长趋势正在逐年增长,严重危害人类健康且增加医疗负担。迄今为止,现代医学对PCOS的发病机制主要从以下几个方面阐述:（1）下丘脑-垂体-卵巢（HPO）轴调节功能异常,（2）胰岛素抵抗,（3）HPA轴调节功能及肾上腺内分泌功能异常,（4）卵母细胞自分泌分子分泌异常,（5）卵巢旁分泌生长因子分泌异常,（6）抗苗勒氏管激素（AMH）、瘦素水平过高,（7）交感神经功能障碍和慢性低度炎症,（8）环境及心理因素,（9）遗传因素九个方面论述。在西医学PCOS的临床治疗中,多针对PCOS单个临床表现进行对症治疗。（2）中医学对多囊卵巢综合征的认识及诊治、研究进展:中医又将PCOS称为月经病、不孕症,在国学历史上记载由来已久,因此历代国学医家及后世中医学学者都在治疗PCOS中积累了丰富的临床经验,还进行了实验深化研究,为医学事业作出了巨大的贡献。（3）针刺治疗多囊卵巢综合征的机制研究:针刺治疗PCOS作用机理与改善PCOS发病机制密切相关,包括（1）改善卵巢微环境及细胞因子表达从而促排卵,（2）改善机体代谢水平-改善胰岛素抵抗和高胰岛素血症、降低体质量,降低机体内瘦素水平,（4）调节下丘脑-垂体-卵巢轴（HPO）或肾上腺皮质轴（HPA）功能,（5）针刺局部刺激作用促排卵,（6）改善子宫内膜容受性,有利于胚胎着床,改变妊娠结局,（7）改善患者精神心理状态。（4）课题立项依据及研究内容:（1）卵泡发育异常是多囊卵巢综合征的重要病理表现,（2）卵巢颗粒细胞自噬是卵泡发育异常的重要因素,（3）已有研究证实Lnc MEG3参与调控组织及细胞自噬,（4）PI3K/AKT/m TOR信号通路是调控细胞自噬的经典通路,（5）Lnc MEG3可能通过PI3K/AKT/m TOR信号通路调控颗粒细胞自噬。综上,我们提出假说:针刺通过调节Lnc MEG3表达,介导PI3K/AKT/m TOR途径调控卵巢颗粒细胞自噬的发生,改善卵泡发育,进而达到治疗PCOS排卵障碍的作用。结论:多囊卵巢综合征的发病机制及针刺治疗PCOS的作用机制相关研究处于初步阶段,尚需要深入探索。为了进一步完善针刺治疗多囊卵巢综合征的机理,本课题选择Lnc MEG3及颗粒细胞自噬为切入点,通过检测相关指标观察针刺对PCOS从宏观到微观的整体性理论,进一步证明其治疗作用与作用机理。第二部分:实验研究目的:明确针刺可以通过改善卵泡发育治疗PCOS排卵障碍;验证Lnc MEG3通过PI3K/AKT/m TOR途径调控卵巢颗粒细胞自噬发生;确定针刺可以影响Lnc MEG3表达变化,进而通过PI3K/AKT/m TOR途径调控卵巢颗粒细胞自噬,影响卵泡发育达到治疗PCOS排卵障碍效果;揭示针刺对多囊卵巢综合征的作用机制。方法:1.以PCOS大鼠为模型,予针刺干预后ELISA检测血清T、FSH、AMH、LH和E2的含量,HE染色等方法同时检测卵巢形态学,观察针刺干预PCOS大鼠后卵泡发育情况,以明确针刺治疗PCOS排卵障碍的疗效。2.以PCOS大鼠为模型,Western-blot及免疫组化法检测PCOS大鼠卵巢颗粒细胞LC3II/I与p62蛋白表达水平变化,ELISA检测血清T、FSH、AMH、LH和E2的含量,HE染色等方法检测卵巢形态学,证实卵巢颗粒细胞自噬与PCOS卵泡发育相关性,明确卵巢颗粒细胞自噬影响卵泡发育促进PCOS发生发展。Western-blot及免疫组化法检测MEG3,PI3K,AKT,m TOR,LC3II/I与p62蛋白表达水平变化,ELISA检测血清T、FSH、AMH、LH和E2的含量,HE染色等方法检测卵巢形态学以明确Lnc MEG3是否介导PI3K/AKT/m TOR途径调控卵巢颗粒细胞自噬,影响卵泡发育参与PCOS的发生发展。3.以PCOS大鼠为模型,造模成功后,予针刺干预11d后,在PCOS大鼠卵巢颗粒细胞取材,通过Western-blot及免疫组化法检测MEG3,PI3K,AKT,m TOR,LC3II/I与p62蛋白表达水平;ELISA法检测大鼠血清性激素（T,E2,LH,FSH）、AMH;HE染色等方法同时检测卵巢形态学,观察针刺对Lnc MEG3表达的影响以及对PCOS卵巢形态学等影响,以期阐明针刺治疗PCOS排卵障碍的作用机制。结果:1.PCOS大鼠建模成功:（1）卵巢形态:正常组卵巢结构完整,可出现正常卵泡,模型组卵巢增大,出现菜花样状,不出现正常卵泡,卵泡包含的颗粒细胞减少散乱;（2）通过观察大鼠阴道涂片确定动情周期:正常组均会出现3～5d动情期,模型组少量出现动情期,且持续时间仅1d,多数处于动情前期或动情后期;（3）整体形态:正常组大鼠体重的增长缓慢;模型组则增长迅速;（4）激素水平:正常组的FSH、E2、LH和T以及AMH整体处于常规水平,模型组的AMH、FSH、LH、T增高,E2降低。2.针刺后PCOS大鼠体重会明显下降（与正常组、模型组、西药组、假针刺组比较P<0.05）。3.针刺组大鼠性激素水平LH、FSH、E2趋向正常（与模型组、假针刺组、西药组比较P<0.05）,但针刺组大鼠AHM水平变化与其余各组（模型组、假针刺组、正常组、西药组）比较无统计学差异（P>0.05）。4.针刺组、正常组、假针刺组、西药组大鼠卵巢可出现1-2个正常卵泡,可正常排卵;模型组大鼠卵巢有了明显的囊性变化,极少出现正常卵泡。5.模型组大鼠卵巢颗粒细胞中自噬因子P62、LC3II/I、MEG3、PI3K、Art、m TOR高表达,正常组大鼠颗粒细胞中自噬因子P62、LC3II/I、MEG3、PI3K、Art、m TOR低表达,针刺组、假针刺组和西药组大鼠卵巢颗粒细胞自噬因子P62、LC3II/I表达降低,且三组之间存在差异,针刺组最趋于正常组。6.模型组大鼠卵巢颗粒细胞的MEG3蛋白高表达,正常组大鼠卵巢颗粒细胞中MEG3低表达,针刺组、假针刺组和西药组大鼠卵巢颗粒细胞中MEG3蛋白表达量较模型组降低。结论:针刺通过调控Lnc MEG3表达,介导PI3K/AKT/m TOR途径调控卵巢颗粒细胞自噬参与PCOS排卵障碍的发生发展,这可能是针刺治疗PCOS的机制之一。
郭长权[9]（2020）在《细胞因子bFGF和LIF对雏鸡原始卵泡发育的调节作用及其机理的研究》文中提出家禽卵巢中早期卵泡的发育与卵母细胞及颗粒细胞之间的物质传递和信息通讯密切相关,而细胞因子在其中扮演了重要的媒介作用。细胞因子能促进细胞的增殖和生长,而且还可以调节细胞的迁移、分化和有丝分裂。细胞因子包含很多种类,各种细胞因子经由旁分泌或自分泌以及卵母细胞和颗粒细胞间的物质运输、信号通讯对卵泡形成发育产生作用:调控颗粒细胞的增殖分化、激素分泌和其他细胞因子生成等。而细胞因子参与家禽早期卵泡生长发育相关的研究很少。同时家禽的繁殖性能是畜牧业上比较关注的问题,而早期卵泡发育对于最终的繁殖性能是有决定性影响的。所以对细胞因子在早期卵泡发育中的调控作用开展深入研究是有意义的。本实验以雏鸡为研究对象,检测雏鸡卵泡发育中基因的表达量变化以及利用已经建立的体外培养的卵巢模型来研究两种细胞因子,即碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor,bFGF）和白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor,LIF）在雏鸡早期卵泡发育中的调控作用和其中的机理,为家禽产蛋性能的后续研究提供理论依据。1.雏鸡卵巢早期卵泡发育中miRNA表达的变化雏鸡早期卵泡的形成和发育涉及许多基因表达的变化。本实验以不同日龄的雏鸡卵巢作为实验样品,利用RNA-seq的实验技术来研究早期雏鸡卵巢中miRNA的表达。取D0、D4、D7的雏鸡卵巢各三个,用于RNA-seq分析。在RNA-seq建库结果中对miRNA进行质检,筛选出有显着差异表达的基因来进行RT-qPCR的验证,验证结果是趋势一致,RNA-seq结果可信。结果显示,与D0卵巢组织相比较,D4卵巢组织共有10种表达显着差异的miRNA,包括8条上调基因,2条下调基因;与D0卵巢组织相比较,D7卵巢组织共有50种表达显着差异的miRNA,包括35条上调基因,15条下调基因;与D4卵巢组织相比较,D7卵巢组织共有18种表达显着差异的miRNA,包括12条上调基因,6条下调基因。对差异表达miRNA的靶基因做汇总,结果显示,D4vs D0中,靶基因与细胞的抗凋亡和细胞因子作用相关;D7vs D0中,靶基因与细胞抗凋亡、细胞因子作用和激素合成相关;D7vs D4中,靶基因与缝隙连接、细胞因子作用、MAPK信号通路相关,其中涉及的靶基因有GJA5、HLF、MAP3K14等。上述结果表明,miRNA可通过缝隙连接、细胞抗凋亡、卵巢发育信号相关通路和细胞因子作用等方面来影响雏鸡卵泡的发育。2.雏鸡卵巢早期卵泡发育中lncRNA表达的变化本实验以不同日龄的雏鸡卵巢作为实验材料,用RNA-seq来分析雏鸡卵巢中lncRNA水平随时间的变化。并像上一章一样筛选出有显着差异表达的基因并用RT-qPCR来进行验证,使用GO数据库把有表达差异的lncRNA靶基因做富集处理分析,使用KEGG数据库给表达差异的lncRNA靶基因做通路注释。结果显示,与D0卵巢组织相比较,D4卵巢组织共有106种表达显着差异的基因,包括65条上调基因,41条下调基因;与D0卵巢组织相比较,D7卵巢组织共有305种表达显着差异的基因,包括214条上调基因,91条下调基因;与D4卵巢组织相比较,D7卵巢组织共有109种表达显着差异的基因,包括52条上调基因,57条下调基因。RT-qPCR的验证实验证实了 RNA-seq结果的可靠性。GO数据库的结果表明差异表达的lncRNA靶基因大多富集于抗原受体介导的信号通路、细胞因子的合成和非膜跨蛋白酪氨酸激酶活性等生理活动,KEGG数据库结果显示差异的表达lncRNA靶基因大多与细胞因子-细胞因子受体间的相互作用、细胞黏附分子和卵泡发育相关的信号通路有关。其中D7 vs D4结果显示,不少靶基因为细胞因子或细胞因子受体的lncRNA表达明显增加,其中包括了FGF2,IL6R以及GDF9等。上述结果表明,lncRNA可通过细胞因子、细胞连接以及卵泡生长相关的信号通路等方面促进早期雏鸡卵泡的形成和发育,其中相关的细胞因子有FGF2,LIF和GDF9等。3.bFGF对雏鸡原始卵泡发育的调控作用许多细胞因子在雌性原始卵泡激活的过程中发挥重要的促进作用。而RNA-seq结果显示,D4雏鸡卵巢发育到D7的过程中表达明显增加的lncRNA的靶基因中有FGF2。同时先前也有研究报道,FGF2在大鼠中可以促进原始卵泡的激活。FGF2在禽类调节原始卵泡激活的作用研究很少。本实验检测了细胞因子bFGF和FSH对原始卵泡发育的相互刺激作用及其可能的信号机制,包括蛋白激酶B（AKT）和细胞外调节蛋白激酶（ERK）通路。对4日龄雏鸡卵巢进行3天的bFGF和FSH处理,观察bFGF和FSH对卵泡发育的影响。本研究采用HE染色、免疫组化、实时定量PCR（qRT-PCR）、Western blot、免疫荧光等方法。在鸡早期卵巢中发现,bFGF受体（FGFR1）mRNA表达和原始卵泡激活的时间进程之间有变化的相关性。bFGF与FSH的相互刺激作用在原始卵泡的激活过程中表现为促进颗粒细胞的增殖、减少细胞的凋亡。FGFR1的抑制剂SU5402减弱了 bFGF的促进作用,降低了生长卵泡的比例。AKT和ERK信号通路介导了 bFGF和FSH促进原始卵泡激活的作用。上述研究结果表明,细胞因子bFGF和FSH通过PI3K-AKT和ERK信号通路对鸡早期卵巢颗粒细胞的增殖和抗凋亡产生相互刺激作用,促进原始卵泡激活。4.LIF对雏鸡原始卵泡发育的调控作用RNA-seq结果显示,D4雏鸡卵巢发育到D7的过程中表达明显增加的lncRNA的靶基因也有IL6R,IL6R与LIF的受体组成有关。LIF对雏鸡原始卵泡激活的作用研究较少。本实验检测了细胞因子LIF和bFGF在原始卵泡发育过程中的作用和相互之间的关联,以及涉及到的信号通路,包括了 AKT、ERK和Wnt/β-catenin信号通路。对出雏后4天的雏鸡进行卵巢组织的取材,并用LIF和bFGF单独或者联合处理3天,观察卵泡发育情况的变化。本研究采用HE染色、免疫组化、Western blot、透射电镜、免疫荧光等实验方法。结果显示,LIF以及其受体（LIFR）蛋白表达的变化与早期卵泡的发育过程之间有一定的时间相关性。LIF和bFGF的对于促进原始卵泡的激活有一定的协同作用,而具体的表现是促进卵泡细胞的增殖、同时减少卵泡细胞的凋亡。而LIFR的抑制剂SC144能够抑制LIF的这种促进原始卵泡激活的作用。同时AKT和ERK信号通路也参与了 LIF和bFGF这两者促增殖抑凋亡的过程,而Wnt/β-catenin信号通路在其中也有一定的介导作用。上述研究结果表明,LIF和bFGF可通过促进雏鸡卵泡细胞的增殖和抑制其凋亡,并产生协同作用从而促进原始卵泡的激活,这一过程中会涉及到AKT,ERK和Wnt/β-catenin信号通路。本实验利用RNA-seq来检测雏鸡卵巢卵泡发育过程中基因表达量的变化,将有显着表达差异的lncRNA与miRNA汇总并进行对比补充,发现在雏鸡原始卵泡激活阶段,靶基因与FGF2和LIF有关的lncRNA表达显着增加;利用已建立的卵巢组织体外培养模型,研究bFGF和LIF在雏鸡卵巢中原始卵泡激活的调控作用,发现FSH与bFGF发挥协同作用,可通过PI3K-AKT和ERK信号通路对雏鸡早期卵巢中颗粒细胞的增殖和抗凋亡的刺激作用从而促进卵泡激活;而LIF和bFGF可通过协同作用促进卵泡细胞增殖并抑制其凋亡,再通过AKT、ERK和Wnt/β-catenin信号通路促进卵泡激活。这些结果将为后续深入研究家禽卵泡发育的调控机制以及提高家禽产蛋性能奠定一定的理论基础。
李晶晶[10]（2020）在《NR1D1调控猪卵巢颗粒细胞雌激素合成的分子机制》文中认为母猪的繁殖性能会直接影响猪场的经济效益,是评判猪场生产能力的重要指标,从长远考虑,提高母猪的繁殖性能显得尤其重要。母猪的繁殖性能受到各种因素的调控,其中类固醇激素的合成与分泌会影响母猪的生殖生理过程,尤其影响卵泡的发育和排卵等关键过程。卵泡是卵巢中合成与分泌性腺类固醇激素的重要场所,颗粒细胞作为主要的卵泡细胞,在性腺类固醇激素的合成过程中发挥重要作用。促卵泡素（FSH）和促黄体素（LH）分别影响未成熟和成熟的颗粒细胞,会促进卵泡细胞的增殖、成熟以及性腺类固醇激素的合成,FSH与LH的合成与分泌有明显的生物节律性特点。生物节律是自然界中广泛存在的生命现象,具有能使机体适应环境和行为活动的周期性变化的功能。已有大量研究表明,卵巢中存在生物钟基因的表达,并且卵巢中的生物钟功能与类固醇激素合成、卵泡发育、卵泡体细胞分化和排卵过程等有关。其中,核受体NR1D1将昼夜节律和许多生理过程结合起来,已有研究报道NR1D1能够调节卵巢的昼夜节律和新陈代谢,但其对性腺类固醇激素合成的具体作用尚未阐明。因此,本研究旨在探讨NR1D1对类固醇激素合成和分泌的作用及其调控分子机制。在本研究中,通过分离培养猪卵巢颗粒细胞,使用NR1D1的激活剂、抑制剂与NR1D1 siRNA处理颗粒细胞,利用免疫组化、细胞免疫荧光染色、实时定量PCR、蛋白质免疫印迹、酶联免疫吸附测定等一系列细胞、分子和生化检测方法,明确NR1D1对于类固醇激素合成和分泌的作用,并进一步探究其作用的分子机制。本研究主要获得以下结果:1.NR1D1广泛表达在猪卵巢颗粒细胞、卵泡内膜细胞、卵母细胞和基质细胞中,其中NR1D1在颗粒细胞中的表达量较高;细胞免疫荧光染色显示,NR1D1主要在颗粒细胞细胞核中表达;实时定量q PCR检测发现生物钟基因NR1D1和类固醇激素合成关键基因CYP19A1、CYP11A1、StAR在卵巢颗粒细胞中的表达呈现节律性变化。2.添加NR1D1激活剂GSK4112显着抑制了生物钟基因BMAL1和类固醇合成关键基因CCYP19A1、CYP11A1、StAR的表达;GSK4112处理后处于S期的细胞减少,说明激活NR1D1后抑制了颗粒细胞的增殖;ELISA的检测结果证明,生物钟基因NR1D1、BMAL1、CRY1,类固醇激素合成过程关键酶的基因CYP19A1、CYP11A1、StAR、3β-HSD和激素受体基因FSHR和LHCGR在对照组中的表达呈现明显的节律性,添加GSK4112能显着抑制猪卵巢颗粒细胞中雌二醇和孕酮的合成（P<0.05）,减弱BMAL1、CRY1、CYP19A1、StAR、3β-HSD、FSHR和LHCGR的m RNA表达节律性,并且降低了基因表达振幅（P<0.05）。3.NR1D1 siRNA和抑制剂SR8278处理猪卵巢颗粒细胞后效果与GSK4112处理后相反,生物钟基因BMAL1、类固醇合成关键基因CYP19A1、CYP11A1、StAR、3β-HSD和激素受体基因FSHR、LHCGR、ERβm RNA的表达水平显着性升高,而且CYP19A1蛋白质表达量也显着上升（P<0.05）;添加SR8278促进了颗粒细胞的增殖,显着抑制了猪卵巢颗粒细胞中雌二醇的合成;同时,生物钟基因BMAL1、CRY1、PER1、PER2,类固醇激素合成关键基因StAR和激素受体基因FSHR、LHCGR、ERβ在SR8278的作用下基因表达节律振幅显着提升,而CYP19A1的节律表达在SR8278处理后消失,并在12h之后表达量显着上升。4.为了探究CYP19A1是否在NR1D1调控雌激素合成过程中发挥作用,我们在添加NR1D1激活剂GSK4112或抑制剂SR8278的条件下分别对CYP19A1进行过表达和干扰,恢复试验证明过表达CYP19A1能消除NR1D1对雌激素合成的抑制作用,而干扰CYP19A1能促进NR1D1对雌激素合成的抑制作用;进一步通过双荧光素酶报告基因活性试验证明NR1D1通过与CYP19A1启动子区域-1228～-1223位点和-1116～-1111位点的RORE元件结合调控CYP19A1的转录,从而影响猪卵巢颗粒细胞中雌二醇的合成与分泌。综上所述,在猪卵巢颗粒细胞中,激活生物钟调控因子NR1D1后增强了NR1D1对转录活性的抑制作用,识别并结合CYP19A1启动子上的RORE元件,抑制CYP19A1的转录,导致雌二醇含量降低;而抑制了NR1D1与其配体结合的活性,从而消除了对CYP19A1的转录抑制能力,增加了猪卵巢颗粒细胞中雌二醇的合成与分泌。
二、胎儿卵巢促性腺激素受体的免疫组化研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、胎儿卵巢促性腺激素受体的免疫组化研究（论文提纲范文）
（1）培元补肾安胎方治疗RSA的临床研究及基于内膜衰老的药物机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 综述一 复发性流产的西医研究进展 |
| 1 复发性流产的病因研究 |
| 2 复发性流产的治疗现状 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 中医药治疗复发性流产的研究进展 |
| 1 中医病因病机 |
| 2 复发性流产的中医证型分布状况 |
| 3 复发性流产的中医治疗现状 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 综述三 子宫细胞衰老与女性生殖功能 |
| 1 衰老细胞 |
| 2 子宫的生理解剖及功能 |
| 3 子宫衰老细胞对女性生殖功能的影响 |
| 4 子宫衰老细胞的治疗现状 |
| 5 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 培元补肾安胎方治疗黄体功能不足型复发性流产临床疗效观察 |
| 前言 |
| 1 研究材料 |
| 2 研究方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于网络药理学和分子对接探讨培元补肾安胎方治疗复发性流产的作用机制 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 第四章 孕酮诱导“种植窗期”子宫内膜细胞衰老在胚胎着床中的作用研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 第五章 基于“种植窗期”内膜衰老探讨培元补肾安胎方对复发性流产作用机制的研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 1 研究总结 |
| 2 创新点 |
| 3 不足与展望 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
（2）能量负平衡奶牛产后乏情的关键蛋白筛选及作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 奶牛能量负平衡与繁殖的关系 |
| 1.1.1 奶牛能量负平衡的概述 |
| 1.1.2 能量负平衡对奶牛发情周期和繁殖的影响 |
| 1.2 奶牛卵泡生长发育的研究进展 |
| 1.2.1 卵泡发育的生理过程 |
| 1.2.2 奶牛产后腔前卵泡发育 |
| 1.2.3 排卵前卵泡的发育 |
| 1.3 能量负平衡对奶牛卵泡发育的影响 |
| 1.3.1 卵泡液中能量代谢对卵泡发育的影响 |
| 1.3.2 卵泡内细胞对葡萄糖的摄取 |
| 1.3.3 卵泡内细胞对脂肪酸的摄取 |
| 1.3.4 葡萄糖和脂肪酸代谢之间的稳态对卵泡内细胞的影响 |
| 1.3.5 能量负平衡对奶牛产后发情的影响 |
| 1.4 奶牛蛋白质组学的研究进展 |
| 1.4.1 蛋白组学技术在奶牛临床上的作用 |
| 1.4.2 奶牛血液蛋白质组学 |
| 1.4.3 奶牛组织蛋白质组学 |
| 1.5 奶牛脂联素的研究进展 |
| 1.5.1 脂联素与能量代谢的关系 |
| 1.5.2 脂联素与生殖机能的关系 |
| 1.5.3 脂联素在奶牛繁殖中的作用 |
| 1.6 PI3K-AKT信号通路与奶牛卵泡生长发育的关系 |
| 1.6.1 PI3K-AKT信号通路 |
| 1.6.2 PI3K-AKT信号通路在卵泡发育中的作用 |
| 1.7 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 主要试验仪器 |
| 2.1.3 实验耗材和试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 试验动物分组 |
| 2.2.2 试验样品采集 |
| 2.2.3 样品处理 |
| 2.2.4 生化指标的检测 |
| 2.2.5 Western blot 检测方法 |
| 2.2.6 免疫组化检测方法 |
| 2.2.7 ELISA 检测方法 |
| 2.2.8 统计学分析方法 |
| 2.2.9 血清、卵泡液和卵巢皮质组织的蛋白组学分析 |
| 2.2.10 差异表达蛋白 ADPN 与 NEB 奶牛乏情的关系及其风险预警作用 |
| 2.2.11 ADPN 对低糖环境下奶牛体外 GCs 增殖和类固醇激素合成的影响 |
| 2.2.12 ADPN 经 PI3K-AKT 信号通路对低糖环境下 GCs 增殖和类固醇激素合成的影响 |
| 3 结果 |
| 3.1 两组试验奶牛临床病理学变化 |
| 3.1.1 试验奶牛临床信息的比较 |
| 3.1.2 试验奶牛血液生化指标水平的比较 |
| 3.2 两组试验奶牛蛋白组学分析结果的比较 |
| 3.2.1 试验奶牛血清、卵泡液和卵泡腔组织匀浆液中蛋白浓度 |
| 3.2.2 蛋白质鉴定结果和质谱总体分析 |
| 3.2.3 血清差异蛋白及其生物信息学分析结果 |
| 3.2.4 卵泡液差异蛋白及其生物信息学分析结果 |
| 3.2.5 卵巢组织差异蛋白及其生物信息学分析结果 |
| 3.3 两组试验奶牛DEP的免疫印迹验证结果 |
| 3.3.1 血清中DEP疫印迹验证 |
| 3.3.2 卵泡液中DEP疫印迹验证 |
| 3.3.3 卵巢皮质组织差异蛋白免疫印迹验证 |
| 3.4 能量负平衡所致的乏情奶牛DEP的韦恩分析结果 |
| 3.5 ADPN与NEB奶牛乏情的关系及其风险预警作用 |
| 3.5.1 试验牛产后生化指标的水平 |
| 3.5.2 试验奶牛产后血液和卵泡液生化指标相关性分析 |
| 3.5.3 试验奶牛卵巢组织中ADPN及其受体的基因表达水平 |
| 3.5.4 试验奶牛组织中ADPN及其受体的蛋白表达水平 |
| 3.5.5 奶牛产后NEB与血清ADPN的关系 |
| 3.5.6 奶牛产后14-21d血清ADPN对产后55-60d卵泡发育的风险预警作用 |
| 3.6 ADPN对低糖环境下奶牛颗粒细胞增殖和激素分泌的影响 |
| 3.6.1 奶牛体外培养的颗粒细胞(GCs)模型的鉴定 |
| 3.6.2 低糖培养对GCs类固醇激素分泌的影响 |
| 3.6.3 低糖培养对GCs增殖的影响 |
| 3.6.4 低糖培养GCs对ADPN受体的影响 |
| 3.6.5 低糖培养模型中ADPN最佳添加剂量和时间 |
| 3.6.6 低糖培养模型下不同浓度ADPN对GCs激素分泌的影响 |
| 3.6.7 低糖培养模型中添加不同浓度ADPN对GCs增殖的影响 |
| 3.7 ADPN经PI3K-AKT信号通路对低糖环境下GCs增殖和激素分泌的影响 |
| 3.7.1 ADPN对低糖培养GCs模型中AKT磷酸化的影响 |
| 3.7.2 ADPN 经 PI3K/AKT 通路对低糖培养 GCs 模型细胞活性的影响 |
| 3.7.3 ADPN 通过 PI3K-AKT-CDK2 对低糖培养 GCs 模型 CDK2 的影响 |
| 3.7.4 ADPN 经 PI3K/AKT 对低糖培养 GCs 模型类固醇激素合成的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 能量负平衡奶牛产后乏情蛋白组学分析及其差异蛋白的潜在作用 |
| 4.2 ADPN与NEB奶牛卵泡发育的关系及其风险预警作用 |
| 4.3 ADPN对低糖环境下奶牛颗粒细胞增殖和类固醇激素合成的影响 |
| 4.4 ADPN 经 PI3K-AKT 对低糖环境下 GCs 增殖和类固醇激素合成的影响 |
| 5 结论 |
| 6 附表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）有机硫类杀菌剂克菌丹暴露影响小鼠卵巢功能和卵母细胞发育（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 生殖健康问题在全球范围内面临严峻挑战 |
| 1.2 哺乳动物卵泡的发育 |
| 1.2.1 卵泡的概念与分级 |
| 1.2.2 卵泡的发育调控 |
| 1.3 卵母细胞的成熟 |
| 1.3.1 卵母细胞减数分裂概述 |
| 1.3.2 卵母细胞纺锤体的组装 |
| 1.3.3 肌动蛋白细胞骨架在纺锤体极性和不对称分裂中的作用 |
| 1.4 衡量卵母细胞质量的细胞与分子生物学标准 |
| 1.4.1 雌激素受体表达 |
| 1.4.2 氧化应激水平 |
| 1.4.3 线粒体状态 |
| 1.5 选题的依据及意义 |
| 第二章 材料方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要抗体 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 相关基因Quantitative Real-time PCR(qPCR)引物片段 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR) |
| 2.2.2 蛋白免疫印迹 |
| 2.2.3 透射电镜 |
| 2.2.4 免疫组化 |
| 2.2.5 HE染色 |
| 2.2.6 末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色 |
| 2.2.7 卵母细胞收集 |
| 2.2.8 免疫荧光染色和共聚焦显微镜 |
| 2.2.9 RNA-seq analysis(transcriptome sequencing) |
| 2.2.10 卵泡计数 |
| 2.2.11 统计学分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 Captan暴露影响小鼠体重和卵巢重量 |
| 3.2 Captan暴露破坏卵泡发育,干扰雌激素受体的表达 |
| 3.3 Captan暴露诱导卵巢炎症 |
| 3.4 Captan暴露诱导卵巢内质网应激 |
| 3.5 Captan暴露诱导卵巢颗粒细胞凋亡 |
| 3.6 Captan暴露降低卵母细胞的发育潜力 |
| 3.7 Captan暴露改变RNA转录 |
| 3.8 Captan暴露诱导卵母细胞氧化应激 |
| 3.9 Captan暴露诱导卵母细胞早期凋亡 |
| 3.10 Captan暴露诱导卵母细胞自噬 |
| 3.11 Captan暴露诱导卵母细胞DNA损伤 |
| 3.12 Captan暴露引起卵巢超微结构的改变 |
| 3.13 Captan暴露干扰小鼠卵母细胞线粒体功能 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（4）体外重组装人促卵泡激素的制备及转基因小鼠模型的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 FSH的概述 |
| 1.2 FSH的作用机理及应用 |
| 1.3 FSH产品的发展与应用 |
| 1.4 基因工程重组FSH的研究进展 |
| 1.5 蛋白的自组装 |
| 1.5.1 蛋白自组装现象 |
| 1.5.2 蛋白自组装的机制及影响因素 |
| 1.6 乳腺生物反应器研究进展 |
| 1.6.1 乳腺生物反应器简介 |
| 1.6.2 乳腺生物反应器的制备 |
| 1.6.3 乳腺生物反应器的应用 |
| 1.7 基因编辑技术在乳腺生物反应器应用 |
| 1.7.1 基因编辑技术简介 |
| 1.7.2 基因编辑技术在动物乳腺生物反应器中的应用 |
| 1.8 研究目的和意义 |
| 第二章 人FSHα、FSHβ亚基蛋白的表达 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 主要试验材料 |
| 2.2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 FSHα、FSHβ基因在CHO工程细胞中表达及鉴定 |
| 2.3.2 FSHα、FSHβ基因在牛乳腺上皮细胞中表达及鉴定 |
| 2.3.3 腺病毒介导FSHα、FSHβ基因在羊乳腺及GMECs中表达及鉴定 |
| 2.3.4 数据统计和分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 FSHα、FSHβ基因在CHO工程细胞中表达及鉴定 |
| 2.4.2 腺病毒介导FSHα、FSHβ基因在牛乳腺上皮细胞中表达及鉴定 |
| 2.4.3 腺病毒介导FSHα、FSHβ基因在羊乳腺及GMECs中表达及鉴定 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 人FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装方法的建立 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 主要试验材料 |
| 3.2.2 主要仪器设备 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装方法的建立 |
| 3.3.2 牛乳腺上皮细胞表达的人FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装 |
| 3.3.3 羊乳腺及GMECs表达的人FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装分析 |
| 3.3.4 数据统计和分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装方法的建立 |
| 3.4.2 牛乳腺上皮细胞表达的人FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装分析 |
| 3.4.3 羊乳腺及GMECs表达的人FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 体外重组装rhFSH生物活性恢复技术及生物活性研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.2.1 主要试验材料 |
| 4.2.2 主要仪器设备 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 体外重组装rhFSH体外稳定性恢复技术研究 |
| 4.3.2 CHO细胞表达的体外重组装人rhFSH-C生物活性分析 |
| 4.3.3 牛乳腺上皮细胞表达的体外重组装人rhFSH-B生物活性分析 |
| 4.3.4 羊乳腺及GMECs表达的体外重组装rhFSH生物活性分析 |
| 4.3.5 数据统计和分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 体外重组装rhFSH生物活性恢复技术研究 |
| 4.4.2 CHO细胞表达的重组装rhFSH-C生物活性分析结果 |
| 4.4.3 牛乳腺上皮细胞表达的体外重组装rhFSH-B生物活性分析结果 |
| 4.4.4 羊乳腺及GMECs表达的体外重组装rhFSH生物活性分析结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 基于CRISPR/Cas9 技术在山羊BLG基因座定点整合人FSHα、FSHβ基因打靶体系的建立 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.2.1 主要试验材料 |
| 5.2.2 主要仪器设备 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 GMECs的培养 |
| 5.3.2 pCas9-sgRNA敲除载体的构建及基因编辑活性分析 |
| 5.3.3 pGHA-FSHα基因打靶Donor载体的构建及鉴定 |
| 5.3.4 pGHA-FSHβ/His基因打靶Donor载体的构建及鉴定 |
| 5.3.5 CRISPR/Cas9介导人FSHα、FSHβ基因在山羊BLG基因座定点整合及蛋白表达 |
| 5.3.6 GMECs细胞表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白糖基化及唾液酸化分析 |
| 5.3.7 GMECs特异性表达的体外重组装rhFSH生物功能分析 |
| 5.3.8 基于CRSIPR/Cas9构建转FSHα、FSHβ基因的羊胎儿成纤维细胞 |
| 5.3.9 数据统计和分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 pCas9-sgRNA敲除载体的构建及基因编辑活性分析 |
| 5.4.2 pGHA-FSHα基因打靶Donor载体的构建及鉴定 |
| 5.4.3 pGHA-FSHβ/His基因打靶Donor载体的构建及鉴定 |
| 5.4.4 基因打靶载体定点整合目的基因效率及表达功能分析 |
| 5.4.5 GMECs特异性表达的体外重组装rhFSH生物功能分析 |
| 5.4.6 基于CRISPR/Cas9技术构建转FSHα及FSHβ基因羊胎儿成纤维细胞 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 转人FSHα、FSHβ基因小鼠的制备及其功能研究 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 试验材料 |
| 6.2.1 主要试验材料 |
| 6.2.2 主要仪器设备 |
| 6.3 试验方法 |
| 6.3.1 乳腺特异性表达人FSHα、FSHβ基因载体的构建及鉴定 |
| 6.3.2 试验鼠的准备及显微注射 |
| 6.3.3 转人FSHα、FSHβ基因小鼠的制备及鉴定 |
| 6.3.4 转人FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺表达目的蛋白鉴定 |
| 6.3.5 转人FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺和卵巢组织形态学分析 |
| 6.3.6 转人FSHα、FSHβ基因小鼠表达的亚基蛋白体外重组装分析 |
| 6.3.7 转基因小鼠乳腺表达的体外重组装rhFSH生物活性分析 |
| 6.3.8 数据统计和分析 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 乳腺特异性表达人FSHα、FSHβ基因载体的构建及鉴定 |
| 6.4.2 转人FSHα、FSHβ基因小鼠的制备及鉴定 |
| 6.4.3 转人FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺表达目的蛋白检测 |
| 6.4.4 RT-PCR检测转人FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺及其他组织中目的基因的表达 |
| 6.4.5 转人FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺免疫组化分析 |
| 6.4.6 转人FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺和卵巢组织形态学分析 |
| 6.4.7 转人FSHα、FSHβ基因小鼠表达的亚基蛋白体外重组装分析 |
| 6.4.8 转基因小鼠乳腺表达的体外重组装rhFSH生物活性分析 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 研究展望 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）慢性铁过载对雌性C57BL/6J小鼠卵巢功能的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 雌性小鼠慢性铁过载模型的建立与验证 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 铁过载对小鼠卵巢功能的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 母代铁过载对子代小鼠的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 初步探究铁过载抑制卵巢功能的机制 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 铁过载在卵巢相关疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（6）Tsp1a/b在尼罗罗非鱼卵子发生中的功能研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略语对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1 哺乳动物卵巢和卵子发生 |
| 1.1 哺乳动物卵巢 |
| 1.2 哺乳动物卵子发生过程及调控 |
| 2 鱼类卵巢和卵子发生 |
| 2.1 鱼类卵巢 |
| 2.2 鱼类卵子发生过程及调控 |
| 3 Tsp1 的研究进展 |
| 3.1 Tsp1 的表达研究 |
| 3.2 Tsp1 的功能研究 |
| 4 科学问题的提出和本研究的目的意义 |
| 第2章 tsp1a在罗非鱼卵子发生中的功能研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验试剂和仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 tsp1a在罗非鱼卵巢中的表达模式 |
| 3.2 tsp1a纯合突变体的获得 |
| 3.3 tsp1a纯合突变对卵巢发育的影响 |
| 3.4 tsp1a突变鱼卵巢转录组测序分析 |
| 3.5 tsp1a纯合突变对卵原细胞增殖的影响 |
| 3.6 tsp1a纯合突变对雌激素水平的影响 |
| 3.7 tsp1a纯合突变对卵巢血管生成的影响 |
| 4 讨论 |
| 第3章 tsp1b在罗非鱼卵子发生中的功能研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验试剂和仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 tsp1b在罗非鱼卵巢中的细胞定位 |
| 3.2 tsp1b纯合突变体的获得 |
| 3.3 tsp1b纯合突变对卵巢发育的影响 |
| 3.4 tsp1b突变鱼卵巢转录组测序分析 |
| 3.5 tsp1b纯合突变对卵巢血管生成的影响 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 本研究的主要创新点 |
| 本研究的不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表论文 |
| 在读期间参加科研情况 |
（7）非人灵长类早期胚胎发育与疾病模型研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 非人灵长类胚胎早期发育 |
| 1.2.1 配子形成 |
| 1.2.2 受精 |
| 1.2.3 卵裂 |
| 1.2.4 囊胚形成 |
| 1.2.5 植入 |
| 1.2.6 早期胚胎发育的分子调控 |
| 1.2.7 早期胚胎发育与环境应激 |
| 1.3 非人灵长类胚胎早期发育调控研究 |
| 1.3.1 单细胞组学技术揭示胚胎早期发育的分子调控 |
| 1.3.2 利用体细胞核移植研究胚胎重编程过程 |
| 1.4 非人灵长类疾病模型研究 |
| 1.4.1 非人灵长类基因组编辑研究现状 |
| 1.4.2 基因编辑技术的安全性问题 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 基于单细胞转录组测序的猕猴胚胎植入前发育研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验设计 |
| 2.3 实验材料与方法 |
| 2.3.1 动物来源 |
| 2.3.2 实验主要试剂 |
| 2.3.3 实验主要仪器 |
| 2.3.4 卵母细胞采集 |
| 2.3.5 建立体外受精/体细胞核移植/孤雌激活/孤雄发育胚胎 |
| 2.3.6 胚胎培养 |
| 2.3.7 单细胞样本收集 |
| 2.3.8 单细胞转录组数据分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 单精子注射、体细胞核移植、单性生殖胚胎的植入前转录图谱 |
| 2.4.2 猕猴胚胎植入前发育的转录阻滞 |
| 2.4.3 猕猴植入前胚胎转录组的母源—合子转化 |
| 2.4.4 表观遗传调控相关基因的异常表达与胚胎阻滞相关 |
| 2.4.5 通过降低核移植胚胎中异常的H3K9me3修饰提高胚胎发育率 |
| 2.5 讨论及小结 |
| 第三章 建立DAX1基因靶向编辑的食蟹猴模型 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验设计 |
| 3.3 实验材料与方法 |
| 3.3.1 实验主要试剂和仪器 |
| 3.3.2 动物来源、卵采集、体外受精 |
| 3.3.3 建立DAX1基因靶向编辑食蟹猴 |
| 3.3.4 编辑效率检测:T7酶切及测序 |
| 3.3.5 脱靶检测 |
| 3.3.6 H&E染色 |
| 3.3.7 免疫组化和免疫荧光检测 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 建立DAX1基因靶向修饰的食蟹猴模型 |
| 3.4.2 Cas9介导的模型猴生殖系细胞DAX1基因靶向突变 |
| 3.4.3 DAX1基因突变引起模型猴猴睾丸发育异常 |
| 3.4.4 DAX1基因突变不会导致支持细胞发育异常 |
| 3.4.5 DAX1基因突变导致Wnt/β-catenin信号通路异常上调 |
| 3.4.6 DAX1基因突变引起模型猴肾上腺发育异常 |
| 3.5 讨论及小结 |
| 第四章 食蟹猴胚胎的干细胞嵌合研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验设计 |
| 4.3 实验材料与方法 |
| 4.3.1 食蟹猴多能干细胞系的建立 |
| 4.3.2 多能干细胞的荧光标记 |
| 4.3.3 干细胞体外分化实验 |
| 4.3.4 构建嵌合体胚胎 |
| 4.3.5 胚胎培养/延迟培养及胚胎移植 |
| 4.3.6 免疫组化染色 |
| 4.3.7 胚胎移植、孕检、胎儿及新生猴组织样本采集 |
| 4.3.8 胎猴/新生猴组织处理 |
| 4.3.9 特异性基因PCR检测 |
| 4.3.10 单细胞RNA-seq |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 建立多能干细胞嵌合猴胚胎 |
| 4.4.2 建立多能干细胞嵌合食蟹猴 |
| 4.4.3 通过基因表达谱分析揭示多能干细胞的嵌合机制 |
| 4.4.4 食蟹猴pESCs在成体猴生殖系的嵌合 |
| 4.4.5 胚胎微环境影响多能干细胞嵌合效率 |
| 4.5 讨论及小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 攻读博士期间发表论文目录 |
| 附录 B 实验动物伦理审批表 |
| 附录 C 其他需要说明的内容 |
（8）从LncMEG3介导PI3K/AKT/mTOR调控卵巢颗粒细胞自噬探讨针刺对PCOS排卵障碍效应机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 西医学对多囊卵巢综合征的认识及诊治进展 |
| 1.1.1 多囊卵巢综合征的西医认识 |
| 1.1.2 多囊卵巢综合征的西医学发病机制 |
| 1.1.3 多囊卵巢综合征的西医治疗进展 |
| 1.2 中医学对多囊卵巢综合征的认识及诊治研究进展 |
| 1.2.1 多囊卵巢综合征的中医认识 |
| 1.2.2 多囊卵巢综合征的中医病因病机及诊疗 |
| 1.3 多囊卵巢综合征的针刺治疗及其机制研究进展 |
| 1.3.1 针刺治疗多囊卵巢综合征的选穴规律研究 |
| 1.3.2 针刺治疗多囊卵巢综合征的机制研究 |
| 1.4 课题立项依据及研究内容 |
| 1.4.1 卵泡发育异常是多囊卵巢综合征的重要病理表现 |
| 1.4.2 卵巢颗粒细胞自噬是卵泡发育异常的重要因素 |
| 1.4.3 已有研究证实LncMEG3参与调控组织及细胞自噬 |
| 1.4.4 PI3K/AKT/mTOR信号通路是调控细胞自噬的经典通路 |
| 1.4.5 LncMEG3可能通过PI3K/AKT/mTOR信号通路调控颗粒细胞自噬 |
| 第二章 实验研究 |
| 2.1 针刺治疗多囊卵巢综合征大鼠排卵障碍的疗效 |
| 2.1.1 研究内容 |
| 2.1.2 材料与方法 |
| 2.1.3 结果 |
| 2.1.4 讨论 |
| 2.1.5 小结 |
| 2.2 LncMEG3通过PI3K/AKT/mTOR途径诱导卵巢颗粒细胞自噬,影响卵泡发育参与PCOS的发生发展 |
| 2.2.1 研究内容 |
| 2.2.2 材料与方法 |
| 2.2.3 结果 |
| 2.2.4 讨论 |
| 2.2.5 小结 |
| 2.3 针刺通过影响LncMEG3介导PI3K/AKT/mTOR途径调控卵巢颗粒细胞自噬起到治疗PCOS排卵障碍效果 |
| 2.3.1 研究内容 |
| 2.3.2 材料与方法 |
| 2.3.3 结果 |
| 2.3.4 讨论 |
| 2.3.5 小结 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
| 涉及实验动物伦理的审查意见 |
| 涉及生物安全内容的审查意见 |
（9）细胞因子bFGF和LIF对雏鸡原始卵泡发育的调节作用及其机理的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 禽类卵泡生长情况和概述 |
| 1.1.1 鸡胚卵巢发育概述 |
| 1.1.2 鸡原始卵泡发生概述 |
| 1.1.3 鸡原始卵泡发育激活概述 |
| 1.1.3.1 PTEN/PI3K/AKT/FOXO3信号通路 |
| 1.1.3.2 抗缪勒氏管激素 |
| 1.2 细胞因子对早期卵泡发育的调控 |
| 1.2.1 成纤维细胞生长因子家族 |
| 1.2.2 白血病抑制因子 |
| 1.2.3 血管内皮生长因子 |
| 1.2.4 骨形态发生蛋白家族 |
| 1.2.4.1 BMPs |
| 1.2.4.2 GDF9 |
| 1.2.5 胰岛素样生长因子家族 |
| 1.2.6 神经生长因子 |
| 1.2.7 激活素、抑制素和卵泡抑素 |
| 1.3 激素对早期卵泡发育的调控 |
| 1.3.1 性腺激素 |
| 1.3.2 促性腺激素 |
| 1.3.3 生长激素 |
| 1.4 miRNA在早期卵巢发育中的作用 |
| 1.4.1 miRNA的作用方式 |
| 1.4.2 miRNA对雌性生殖的作用 |
| 1.5 lncRNA在早期卵巢发育中的作用 |
| 1.5.1 lncRNA的作用方式 |
| 1.5.2 lncRNA对雌性生殖的作用 |
| 1.6 本研究的目的和内容 |
| 1.6.1 研究目的和意义 |
| 1.6.2 研究目标和内容 |
| 1.6.3 技术路线 |
| 第二章 雏鸡卵巢早期卵泡发育中miRNA表达的变化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 主要器材 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 卵巢的获取 |
| 2.2.5 RNA的提取 |
| 2.2.6 RNA质量及浓度的检测 |
| 2.2.7 文库的构建及质量的检测 |
| 2.2.8 cDNA的合成 |
| 2.2.9 qRT-PCR |
| 2.2.10 测序数据的处理分析 |
| 2.2.11 差异表达基因的筛选 |
| 2.2.12 差异表达基因的聚类分析及富集分析 |
| 2.2.13 差异表达基因的靶基因预测 |
| 2.2.14 数据的处理分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 检测结果总表 |
| 2.3.2 RNA质量的鉴定 |
| 2.3.3 测序数据的质量评估及过滤 |
| 2.3.4 sRNA长度的筛选 |
| 2.3.5 与参考序列的比较 |
| 2.3.6 差异表达miRNA的筛选 |
| 2.3.7 RNA-seq结果的验证 |
| 2.3.8 不同发育阶段卵巢中差异表达miRNA的比较 |
| 2.3.9 miRNA及其主要靶基因的时间表达变化 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 雏鸡卵巢早期卵泡发育中lncRNA表达的变化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 主要器材 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 卵巢的获取 |
| 3.2.5 RNA的提取 |
| 3.2.6 RNA质量及浓度的检测 |
| 3.2.7 文库的构建及质量的检测 |
| 3.2.8 cDNA的合成 |
| 3.2.9 qRT-PCR |
| 3.2.10 测序数据的处理分析 |
| 3.2.11 差异表达基因的筛选 |
| 3.2.12 差异表达基因的聚类分析及富集分析 |
| 3.2.13 差异表达基因的靶基因预测 |
| 3.2.14 数据的处理分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 测序数据的质量评估与比较 |
| 3.3.2 差异表达lncRNA的筛选 |
| 3.3.3 RNA-seq结果的验证 |
| 3.3.4 lncRNA共定位基因的富集分析 |
| 3.3.5 lncRNA共表达基因的富集分析 |
| 3.3.6 不同发育阶段卵巢中差异表达lncRNA的比较 |
| 3.3.7 相关mRNA的差异表达 |
| 3.3.8 lncRNA及其主要靶基因的时间表达变化 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 bFGF对雏鸡原始卵泡发育的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 主要器材 |
| 4.2.3 主要试剂及配制 |
| 4.2.4 卵巢的获取 |
| 4.2.5 卵巢组织的培养和药物处理 |
| 4.2.6 制片及HE染色 |
| 4.2.7 免疫组化 |
| 4.2.8 RNA的提取 |
| 4.2.9 cDNA的合成 |
| 4.2.10 普通PCR及qPCR |
| 4.2.11 BrdU实验 |
| 4.2.12 TUNEL染色 |
| 4.2.13 Westen blot分析 |
| 4.2.14 数据的处理分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 FGFR1在雏鸡卵巢中定位及其表达的变化 |
| 4.3.2 bFGF在雏鸡卵巢中的定位 |
| 4.3.3 bFGF体外处理剂量的筛选 |
| 4.3.4 bFGF对卵泡细胞增殖的影响 |
| 4.3.5 bFGF对卵泡细胞凋亡的影响 |
| 4.3.6 bFGF对原始卵泡激活相关基因表达的影响 |
| 4.3.7 bFGF对原始卵泡激活的影响 |
| 4.3.8 FSHR在雏鸡卵巢中的定位 |
| 4.3.9 bFGF和FSH联合处理对卵泡细胞增殖和凋亡的影响 |
| 4.3.10 FSHR特异性证明 |
| 4.3.11 bFGF和FSH联合处理对细胞增殖相关信号转导蛋白表达的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 LIF对雏鸡原始卵泡发育的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 主要器材 |
| 5.2.3 主要试剂及配制 |
| 5.2.4 卵巢的获取 |
| 5.2.5 卵巢组织的培养和药物处理 |
| 5.2.6 制片及HE染色 |
| 5.2.7 免疫组化 |
| 5.2.8 BrdU实验 |
| 5.2.9 TUNEL染色 |
| 5.2.10 Western blot分析 |
| 5.2.11 透射电镜和细胞超微结构的观察 |
| 5.2.12 数据的处理分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 LIF在雏鸡卵巢中定位及其表达的变化 |
| 5.3.2 LIFR在雏鸡卵巢中定位及其表达的变化 |
| 5.3.3 LIF体外处理剂量的筛选 |
| 5.3.4 LIF对卵泡细胞增殖的影响 |
| 5.3.5 LIF对卵泡细胞凋亡的影响 |
| 5.3.6 LIF对体外培养雏鸡卵巢的缝隙连接的影响 |
| 5.3.7 LIF对原始卵泡激活的影响 |
| 5.3.8 LIF和bFGF联合处理对卵泡细胞发育以及相关信号蛋白表达的影响 |
| 5.3.9 卵泡发育中LIF和Wnt/β-catenin信号通路的交互作用 |
| 5.3.10 卵泡发育中bFGF和Wnt/β-catenin信号通路的交互作用 |
| 5.3.11 LIF体内处理剂量的筛选及其对雏鸡卵巢中增殖相关蛋白表达的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 提示和创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（10）NR1D1调控猪卵巢颗粒细胞雌激素合成的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 颗粒细胞与卵泡发育过程 |
| 1.2 类固醇激素合成 |
| 1.2.1 类固醇激素对卵泡发育的影响 |
| 1.2.2 雌激素合成关键基因CYP19A1的研究进展 |
| 1.3 生物钟系统介绍 |
| 1.3.1 生物钟系统的分子调控机制 |
| 1.3.2 生物钟关键基因NR1D1 |
| 1.4 生物钟系统对繁殖的调控 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 第二章 猪颗粒细胞中NR1D1的表达与定位 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试验材料 |
| 2.2.2 试验方法 |
| 2.2.3 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 生物钟基因NR1D1在卵巢与颗粒细胞中的定位 |
| 2.3.2 生物钟基因与激素合成基因在猪卵巢颗粒细胞中的表达 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 激活NR1D1对猪颗粒细胞激素分泌与基因表达节律的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试验材料 |
| 3.2.2 试验方法 |
| 3.2.3 数据处理 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 NR1D1 激活剂GSK4112 抑制激素合成关键酶和激素受体的表达 |
| 3.3.2 NR1D1 激活剂GSK4112 抑制颗粒细胞增殖和类固醇激素合成 |
| 3.3.3 NR1D1 激活剂GSK4112 对卵巢生物钟基因表达节律的影响 |
| 3.3.4 NR1D1 激活剂GSK4112 对激素合成关键没和激素受体基因的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 抑制NR1D1对猪颗粒细胞激素分泌的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试验材料 |
| 4.2.2 试验方法 |
| 4.2.3 数据处理 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 干扰NR1D1促进类固醇激素合成 |
| 4.3.2 NR1D1抑制剂SR8278促进类固醇激素合成关键酶和激素受体基因表达 |
| 4.3.3 NR1D1抑制剂SR8278促进颗粒细胞增殖和类固醇激素合成 |
| 4.3.4 NR1D1抑制剂SR8278对卵巢生物钟基因表达节律的影响 |
| 4.3.5 NR1D1抑制剂SR8278对类固醇合成关键酶和激素受体基因表达节律的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 NR1D1对猪颗粒细胞雌二醇合成的调控机制 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试验材料 |
| 5.2.2 试验方法 |
| 5.2.3 数据处理 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 过表达CYP19A1 能消除GSK4112 对雌激素合成的抑制作用 |
| 5.3.2 干扰CYP19A1 能削弱SR8278 对雌激素合成的促进作用 |
| 5.3.3 NR1D1 可以结合CYP19A1 启动子区RORE元件 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 下一步研究计划 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、胎儿卵巢促性腺激素受体的免疫组化研究（论文参考文献）
- [1]培元补肾安胎方治疗RSA的临床研究及基于内膜衰老的药物机制研究[D]. 奚婷. 北京中医药大学, 2021(01)
- [2]能量负平衡奶牛产后乏情的关键蛋白筛选及作用机制研究[D]. 赵畅. 黑龙江八一农垦大学, 2021(01)
- [3]有机硫类杀菌剂克菌丹暴露影响小鼠卵巢功能和卵母细胞发育[D]. 何全阔. 广西大学, 2021(02)
- [4]体外重组装人促卵泡激素的制备及转基因小鼠模型的构建[D]. 华荣茂. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [5]慢性铁过载对雌性C57BL/6J小鼠卵巢功能的影响及机制研究[D]. 秦弦. 重庆医科大学, 2021(01)
- [6]Tsp1a/b在尼罗罗非鱼卵子发生中的功能研究[D]. 揭秘秘. 西南大学, 2021
- [7]非人灵长类早期胚胎发育与疾病模型研究[D]. 康宇. 昆明理工大学, 2020(04)
- [8]从LncMEG3介导PI3K/AKT/mTOR调控卵巢颗粒细胞自噬探讨针刺对PCOS排卵障碍效应机制[D]. 林静. 广州中医药大学, 2020(09)
- [9]细胞因子bFGF和LIF对雏鸡原始卵泡发育的调节作用及其机理的研究[D]. 郭长权. 浙江大学, 2020
- [10]NR1D1调控猪卵巢颗粒细胞雌激素合成的分子机制[D]. 李晶晶. 西北农林科技大学, 2020