一、日本科学家开发新的基因载体（论文文献综述）
张婷[1]（2021）在《转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究》文中提出近年来,血栓性疾病越发受到关注,临床上有逐年渐增之势,严重威胁人类的生命健康。用溶栓药消除血栓是一种临床常用的方法。现有的溶栓药虽然有明确的治疗效果,但也存在治疗窗口期窄,用药量大,纤维蛋白特异性低,再灌注率低,系统出血率高,半衰期短,副作用大等问题。而纤维蛋白特异性高,溶栓效率高,出血风险低,半衰期长,毒副作用低的吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂（Desmodus rotundus salivary plasminogen activator alpha 1,DSPAα1）又称去氨普酶（desmoteplase）,有望成为新型、高效的溶栓药物。本研究应用哺乳动物转基因技术,在获得了乳腺特异性表达重组DSPA（recombinant DSPA,rDSPA）转基因兔的基础上,收集兔乳中的表达产物,应用自制的单克隆抗体,用于兔乳的ELISA和Western-blot检测;建立从转基因兔乳汁中分离和纯化rDSPA的方法;对rDSPA进行一级结构和生物活性分析,包括N端和C端氨基酸序列、相对分子量以及体外溶纤活性;应用角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型,并通过此血栓模型研究纯化产物rDSPA的体内溶栓效果及血浆半衰期。1.乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖两只原代兔经扩群繁殖、近交和回交,获得乳腺特异性表达rDSPA转基因兔134只,其中经测交确定纯合子兔2只（F2代）。收集兔乳,离心分离乳清,经ELISA检测,兔乳中rDSPA表达水平为1.19±0.26 mg/mL,纤维平板溶圈法（Fibrin Agarose Plate Assay,FAPA）检测F0代、F1代、F2代转基因兔乳清中DSPA的溶纤活性,溶圈直径大小基本一致（18.6-20.4 mm）,结果表明外源基因rDSPA能稳定遗传给后代,此外培育出的纯合子兔能免除繁琐的基因型检测工作量,为rDSPA的转基因兔的保种提供了保障。2.原核表达去氨普酶（DSPA）基因载体的构建采用分子生物学技术,用PCR法扩增pCL25/DSPA表达载体上的编码DSPAαl成熟肽的DNA序列,用于与原核表达载体连接,构建pET-28a/DSPA原核表达载体。pET-28a/DSPA原核表达载体转入Rosetta感受态细胞,进行诱导表达目的蛋白。SDS-PAGE电泳估测大小约为50 kDa。目的蛋白纯化后纯度为92%,远远满足其作为制备rDSPA单克隆抗体的免疫原的纯度要求。3.rDSPA单克隆抗体制备及筛选纯化的原核表达产物加弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠,分离B淋巴细胞与SP2/0细胞融合,筛选获得阳性杂交瘤细胞株,分泌PR-mAb杂交瘤细胞注入同系小鼠腹腔制备抗体。本研究共得到36株阳性杂交瘤细胞,从中筛选出12株稳定分泌抗体的细胞株（命名M1-M12）。经ELISA-elution筛选,其中M3、M4两株为多羟基反应单克隆抗体（PR-mAb）,筛选率为16.67%（2/12）。注射M3和M4细胞株的小鼠腹水的抗体效价为1:125000,腹水抗体可用于ELISA和western blot检测。4.转基因兔乳中rDSPA的分离、纯化小鼠腹水抗体经rProtein A亲和层析柱纯化后与CNBr-activated Bestarose 4 FF介质偶联制成免疫亲和层析柱。rDSPA转基因兔乳经超速离心和硫酸铵沉淀预处理后。分别选用自制免疫亲和层析、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析纯化rDSPA。结果表明rDSPA转基因兔乳通过超速离心、55%硫酸铵沉淀、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析分离纯化,获得纯度为98%的rDSPA。运用阴离子交换层析去除纯化产物中的内毒素,使用内毒素检测试剂盒检测结果表明纯化rDSPA内毒素含量低于0.015 EU/mL,符合注射剂标准。5.乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测运用Edman降解法测定rDSPA的N端氨基酸序列,结果显示rDSPA的N端氨基酸序列为 Val Ala Cys Lys Asp Glu IIe Thr Gln Met Thr Tyr Arg Arg Gln,与设计的 DSPA编码序列的理论N端的第4-18位氨基酸序列完全一致,表明rDSPA编码序列N-端的山羊β-乳球蛋白（β-lactoglobulin）的信号肽已完全切除;运用液相色谱-质谱/质谱联用技术（LC-MS/MS）测定rDSPA的C端氨基酸序列及其它部分的氨基酸序列,结果显示 rDSPA 的 C 端氨基酸序列为 Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Tyr Leu Gly Trp IIe Arg Asp Asn Met His Leu,与设计的rDSPA编码序列的C末端完全一致,共有47%（208个氨基酸）的序列与DSPA编码序列完全同源。经高分辨率质谱仪检测后确定rDSPA的相对分子量为53126.75 Da,大于理论的49535.94 Da,推测是翻译后的糖基化修饰导致;运用纤维平板溶圈法（FAPA）检测纯化产物rDSPA的体外纤溶活性（773333 IU/mg）略高于阿替普酶（580000 IU/mg）。6.rDSPA体内外溶栓效果的初步评价SD大鼠腹主动脉采血,血凝块切成约0.1 cm3方块并称重,分成7组（0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL DSPA;0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL 阿替普酶;生理盐水）,37℃孵育16 h,称重剩余血凝块并计算血凝块溶解率。结果显示rDSPA体外大鼠血凝块溶解率（48.34±2.25%）明显高于阿替普酶组（40.91±1.36%）的血凝块溶解率（p<0.05）,表明rDSPA体外溶栓活性强于阿替普酶。8周龄的雄性SD大鼠随机分成4组,每组6只,分成低、中、高剂量rDSPA组（2 mg/kg、8 mg/kg、32mg/kg）和阿替普酶组（8 mg/kg）,安慰剂组,空白对照组。各组大鼠心脏采血检测凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）,纤维蛋白原（FIB）和D-二聚体,同时测量大鼠尾部血栓长度。结果显示rDSPA有显着的溶栓效果,rDSPA低（APTT:18.80±1.26 s;TT:35.75±0.41 s）、中（APTT:27.78±1.88 s;TT:39.18±0.82 s）、高（APTT:36.51±1.29 s;TT:37.56±1.07 s）剂量组和阿替普酶组（APTT:27.00±1.76 s;TT:34.05±0.99 s）的 APTT、TT 均较安慰剂组（APTT:12.53±0.54 s;TT:26.87±1.31 s）相比有所延长,且差异极显着（p<0.01）,rDSPA 中（PT:14.28±0.79 s;D-二聚体:2.49±0.07 mg/L）、高（PT:17.07±1.19 s;D-二聚体:3.12±0.55 mg/L）剂量组和阿替普酶组（PT:14.26±0.93 s;D-二聚体:2.53±0.12 mg/L）的PT、D-二聚体水平均比安慰剂组（PT:12.29±0.76 s;D-二聚体:2.30±0.07 mg/L）显着升高（p<0.05）,表明大鼠注射rDSPA和阿替普酶后都有效激活纤溶系统。阿替普酶组（200.22±6.09mg/dL）较rDSPA低（222.40±7.89 mg/dL）、中（228.30±1.72mg/dL）、高（228.19±1.89mg/dL）剂量组的 FIB 水平较有所下降（p<0.05）,rDSPA低、中、高剂量组之间的FIB水平差异不显着,表明rDSPA在溶栓过程中FIB消耗量小于阿替普酶,相比阿替普酶不易引起颅内出血副作用,更具有安全性。rDSPA低（48.96±9.42%）、中（24.71±6.26%）、高（0.00±0.00%）剂量组和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比明显小于安慰剂组（67.76±6.06%）,即rDSPA低、中、高剂量组的尾栓消溶相对长度明显长于安慰剂组,并与剂量成正比例,且rDSPA高剂量组大鼠尾部不形成血栓。相同剂量的rDSPA中剂量组（24.71±6.26%）和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比差异极显着（p<0.01）,表明纯化产物rDSPA的溶栓能力明显优于阿替普酶。8周龄的SD雄性大鼠随机分成2组,每组4只,分为rDSPA组和阿替普酶组。rDSPA组和阿替普酶组均以8 mg/kg的剂量尾静脉注射rDSPA或阿替普酶,采集血浆进行纤溶酶-抗纤溶酶复合物（PAP）的测定,计算rDSPA半衰期。结果显示rDSPA组和阿替普酶组大鼠血浆PAP浓度分别在6 min及3 min达到顶峰（133.06±63.90 ng/mL,219.44±1.18 ng/mL）,rDSPA和阿替普酶在SD大鼠体内的血浆半衰期分别为52.41 min和10.41 min。推算rDSPA的半衰期较阿替普酶延长5倍,表明rDSPA可用于单次注射针剂溶栓药的制备。综上所述,本研究成功培育出乳腺特异性表达rDSPA转基因兔,且rDSPA转基因兔具有较高的表达水平,建立了有效的分离纯化的实验室工艺,并保持原有的溶纤溶栓活性,表明该研究迈出临床应用的第一步。rDSPA的一级结构分析表明,重组DSPA编码序列可以在转基因兔乳腺上皮细胞中表达,并剪切去除异源性的信号肽序列,翻译后加工为有溶栓活性的成熟蛋白,这一结果在国内外尚未见报道。大鼠体内外溶栓试验中rDSPA表现出优于阿替普酶的溶栓性能,且rDSPA在大鼠体内的半衰期长于阿替普酶,体内溶栓试验呈现出更安全、更持续的溶栓效果,该结果在国内外也未见报道。本研究成果为开发和生产新的高效溶栓药奠定了实验基础。
常宇鑫[2]（2021）在《AAV-NT3与运动对脊髓损伤后肢体痉挛的干预及新型基因载体AAV-CPP.16的初步构建》文中指出研究背景肢体痉挛是脊髓损伤（SCI）后的最常见的并发症之一,据报道,12%～37%的急性脊髓损伤患者患有肌肉痉挛,而这一比例在慢性脊髓损伤患者中高达65%～78%。尽管严重的痉挛极大地影响了患者的生活质量和脊髓损伤后的恢复,但目前临床上对痉挛的治疗方式仍局限于对症处理。因此,开发一种新的抗痉挛疗法和康复模式,对于脊髓损伤患者的功能恢复和生活质量的提高至关重要。神经营养因子3（NT3）不仅能够降低运动神经元的兴奋性,而且是感觉神经元和运动神经元生存所必需的神经营养因子。研究表明,来自周围肌肉传入信号的输入对于恢复运动功能和重建脊髓损伤段的神经回路至关重要,而这可能是因为周围的肌肉纺锤体合成了NT3。同时,NT3在肌肉中的过度表达会重新平衡兴奋性和抑制性的输入。然而其能否使脊髓损伤后大鼠的脊髓反射正常化尚未得到证实。此外,运动被认为是临床上最简单,最安全,最有效的治疗方法,它能通过平衡感觉的输入和运动的输出来改善运动功能,从而改善患者的生活质量。同时强化训练可使脊髓的本体感受反射正常化。单一的治疗方法可能可以改善某种特定的功能,却无法做到面面俱到,而基于个体化医疗的某些疗法的组合,将预计取得更好的疗效。以病毒为载体的基因治疗能够将治疗基因特异性地输送到病变部位,使其在局部或全身长期稳定的表达,因此目前被广泛应用于中枢系统疾病的诊疗中。其中,腺相关病毒由于其安全、高效的优势被认为是最有希望的基因治疗载体。在众多血清型的AAV载体中,AAV9型腺相关病毒被认为是AAV载体中治疗中枢系统疾病的“标准”载体,但是由于AAV9型腺相关病毒载体穿过血脑屏障的效率仍未能达到预期,导致其治疗中枢系统疾病的效果欠佳。提高病毒的使用剂量或者调整给药途径例如鞘内给药是人们解决上述问题的两种尝试,但是前者会导致体内其他外周器官过大的暴露而产生毒性反应,而后者增加了显着的并发症风险。于是人们将目光聚集到了另外一种可能性的方式——通过对AAV载体的衣壳结构蛋白进行改造,从而改变其转染效率。研究目的构建编码人NT3的重组腺相关病毒（Adeno-associated virus,AAV）,探究编码人NT3的重组腺相关病毒（AAV-NT3）与运动干预相结合的联合疗法对脊髓损伤后肌肉痉挛的保护作用,并探究这种联合疗法减轻痉挛的作用机制,为临床工作中脊髓损伤后肌肉痉挛的防治提供理论基础。此外,构建具有更高传递效率的重组AAV,并探究不同的给药途径其对大脑、脊髓等中枢神经系统的传递效率及对外周组织器官的毒性,为基因治疗在中枢神经系统疾病中的应用起到指导和借鉴意义。研究方法1.编码人NT3的腺相关病毒的构建与验证:将绿色荧光蛋白（f-GFP）、神经营养因子3（NT3）及辅助质粒插入到由人类CMV启动子驱动的AAV载体中,然后通过HEK293细胞包装生产重组AAV。使用Western Blot法检测病毒注射后大鼠后肢肌肉与脊髓背根神经节中NT3蛋白表达的变化。2.AAV-NT3与运动干预对大鼠脊髓损伤后肌肉痉挛的保护作用:通过游泳测试及大鼠后肢肌肉的H反射评价大鼠的痉挛频率,并通过BBB评分评价大鼠的后肢运动功能。3.AAV-NT3与运动干预对大鼠脊髓损伤后肌肉痉挛保护作用的机制研究:运用免疫荧光染色法探究脊髓运动神经元和中间神经元的可塑性变化,并运用Western Blot法检测重组氯化钾协同转运蛋白2（KCC2转运体）的表达。4.新型中枢靶向性基因载体AAV-CPP.16的构建:将多肽序列插入AAV载体的衣壳蛋白基因组进行改造,生产出多种不同的腺相关病毒基因载体,并通过小鼠尾静脉注射和血脑屏障3D体外模型进行筛选。5.新型中枢靶向性基因载体AAV-CPP.16的转导效率:通过静脉注射和侧脑室注射两种主流的中枢神经系统给药途径,探究AAV-CPP.16是否可以在脊髓中高效、稳定地表达,以及其对外周器官的暴露毒性。结果1.成功构建了NT3重组腺相关病毒,并将其成功转染至大鼠体内;相比于对照组与AAV-GFP组,后肢肌肉注射了AAV-NT3的大鼠,其后肢肌肉与脊髓背根神经节（DRG）中NT3的表达水平显着增加。2.游泳测试及H反射的RDD显示AAV-NT3的基因治疗、运动干预及联合治疗均能降低肌肉痉挛的发生频率,但是只有AAV-NT3和联合治疗可以增加后肢BBB评分。3.联合疗法可以明显增加脊髓运动神经元的数量和面积,但是单独的AAVNT3基因疗法不具有此作用;联合治疗可以显着增加脊髓胆碱能中间神经元的面积与GABA能中间神经元的数量;AAV-NT3的基因疗法与联合治疗组脊髓中KCC2的表达显着增加。4.相比于对照组wt AAV9,注射了AAV-CPP.16的小鼠大脑内RFP阳性细胞百分比显着提高,同时在血脑屏障3D体外模型中表达的荧光强度明显增加。5.经静脉及侧脑室给药后,相比于AAV9,AAV-CPP.16在脊髓中绿色荧光蛋白的表达量提高,并且有更高比例的运动神经元与GFP标记的细胞相重合。6.经静脉注射后,相比于AAV9,AAV-CPP.16在脊髓DRG及除肝脏和心脏外的外周组织器官中GFP阳性细胞的比例显着增高;经侧脑室注射后,AAV9与AAV-.CPP.16在外周组织器官中几乎不表达GFP蛋白。结论1.AAV-NT3的基因治疗、运动干预及联合治疗均能减轻损伤后的肌肉痉挛;与单纯的基因治疗或运动干预相比,联合治疗有一定的疗效趋势,但差异并不显着。2.AAV-NT3的基因疗法对运动神经元的作用效果有限,而单纯的运动干预无法改善后肢的运动功能。二者的联合治疗不仅可以通过改变脊髓运动神经元、中间神经元的兴奋性以及增加脊髓内KCC2的含量来减轻脊髓损伤后的肌肉痉挛,也可以显着改善后肢的运动功能。3.相比于wt AAV9,AAV-CPP.16在多种品系小鼠及食蟹猴体内均具有更高的血脑屏障穿透效率和大脑细胞转染效率,并且随着病毒剂量的提升,其效率也随之显着提升。4.经静脉内或侧脑室给药后,相对于AAV9,AAV-CPP.16将基因传递给成年小鼠脊髓及运动神经元的效率均显着提高。5.静脉注射AAV-CPP.16不会带来明显的DRG与肝脏毒性,但是会引起外周组织的大量暴露;而在侧脑室给药途径下,极高传递效率的AAV-CPP.16不会造成明显的DGR毒性,其对外周组织也几乎不具有暴露毒性。
刘洪金[3]（2021）在《BUD31和LAMP3在肿瘤基因剪接和免疫调控的作用》文中指出mRNA可变剪接在肿瘤发生发展中发挥着重要作用,其功能的失调与肿瘤的发生发展息息相关;mRNA可变剪接在肿瘤演变过程中发挥着举足轻重的作用,很大程度上影响临床患者预后及治疗疗效等,但关于mRNA可变剪接在肿瘤演变过程中机制至今仍未完全阐明。BUD31首次被报道在酵母菌的内含子剪接及mRNA成熟中发挥作用,其功能障碍导致酵母菌特定基因的mRNA成熟受损和基因表达下降,影响着酵母菌的发芽增值和细胞形态。另一篇文献报道BUD31在c-MYC基因驱动的乳腺癌细胞系中通过内含子剪接调控着多个基因表达水平,c-MYC基因激活导致转录水平的上调依赖着剪接体的功能;剪接体成分之一,BUD31功能抑制导致了多个基因功表达水平下降,并增加了 c-MYC基因敲降的细胞合成致死性,这提示BUD31在真核细胞中通过内含子剪接调控基因网络进而发挥重要作用。根据我们前期实验结果,我们发现和正常组织相比,BUD31在肿瘤组织中出现上调表达,这提示BUD31可能在肿瘤演变过程中发挥着重要作用,其作用机制可能也是介导于mRNA剪接体。鉴于mRNA内含子剪接和mRNA可变剪接存在功能的相似性和广泛的交集性,因此我们提出假设BUD31可能不仅仅通过内含子剪接作用机制调控肿瘤基因,也可能通过mRNA可变剪接或两种作用机制同时存在以调控肿瘤基因网络进而促进肿瘤特性发生。本文重点探究BUD31通过mRNA可变剪接或mRNA内含子剪接联合mRNA可变剪接调控肿瘤基因以促进肿瘤发生。首先,我们通过本实验94对食管鳞癌RNA-seq和TCGA食管癌RNA-seq数据进行BUD31 mRNA表达水平分析,结果提示和正常组织相比,食管癌肿瘤组织中BUD31基因表达水平呈现显着上调,随后我们通过TCGA泛癌RNA-seq数据进行分析,结果提示和正常组织相比,BUD31在多个肿瘤组织中呈现显着上调表达,如头颈鳞癌、肺癌、肝癌及乳腺癌。同时,我们也进行BUD31基因表达水平和肿瘤患者临床预后进行生存分析,结果提示在多个肿瘤中,BUD31基因表达水平和患者总生存期呈现显着相关,如头颈鳞癌、恶性胶质瘤、子宫内膜癌,高表达BUD31基因水平的患者临床预后更差,这些结果提示BUD31可能在肿瘤癌特性中发挥着重要作用。接下来,我们通过细胞表型实验证实,BUD31基因的敲降导致了肿瘤细胞恶性表型的降低,如细胞增殖、细胞迁移和细胞侵袭及细胞克隆形成;反之BUD31基因的过表达导致了肿瘤细胞恶性表型的增加。鉴于BUD31基因在多个肿瘤中出现异常上调表达,如食管癌和乳腺癌,BUD31在肿瘤中作用机制具有广泛性,因此我们下载了已公开发表在乳腺癌中BUD31瞬时敲降的RNA-seq数据,进行了基因差异表达分析,共获得750个上调表达基因和940个下调表达基因,随后分别在本实验室94对食管鳞癌RNA-seq数据和TCGA食管癌RNA-seq数据中对以上基因进行基因相关分析,分别获得113个基因和242个基因（其中81个基因为两个数据集所共有）,并找出两个数据集正相关和负相关前10位的基因,其中包括MCM7和CPSF4基因。鉴于MCM7和CPSF4基因在肿瘤中发挥着癌基因作用,二者同时具有多个mRNA转录本及多个蛋白异构体,因此我们选择MCM7和CPSF4两个基因作为典型,以探究BUD31通过mRNA可变剪接或同时通过mRNA可变剪接和内含子剪接发挥着癌基因作用以促进肿瘤发生。为了确认BUD31通过内含子剪接调控基因表达水平,我们瞬时敲降了BUD31基因表达水平,qRT-PCR检测结果提示BUD31表达水平下降导致了多个基因内含子保留率上升和基因表达水平下降,这也和之前文献报道一致。令人惊讶的,我们通过qRT-PCR和WB实验证实,BUD31基因表达水平下降导致MCM7转录本1和MCM7转录本2比例失调及后续MCM7蛋白异构体1和MCM7蛋白异构体2比例失调;反之BUD31基因过表达导致了相反的MCM7 mRNA和蛋白变化情况。接下来我们也在CPSF4基因进行了验证,也取得类似的实验结果。以上结果首次证实BUD31存在mRNA可变剪接作用机制,并通过mRNA可变剪接和mRNA内含子剪接同时调控基因表达水平以促进肿瘤发生。此外,我们还发现了BUD31调控着两个经典癌基因,PIK3CA和c-MYC基因的表达水平,但未检测到这两个基因的内含子保留率显着变化,这可能与CPSF4和MCM7表达水平上升有关。我们通过MCM7和CPSF4基因敲降实验证实了 MCM7和CPSF4在肿瘤发挥着癌基因作用,此外我们在食管肿瘤组织中发现,和正常组织相,肿瘤组织中MCM7蛋白异构1为主要表达形式出现了显着上调表达,而MCM7蛋白异构体2变化不明显。在细胞系中也得到类似的实验结果,这提示MCM7蛋白异构体1发挥着促肿瘤特性作用,这也和BUD31通过上调MCM7蛋白异构体1进而发挥促癌作用一致。为了进一步确认BUD31基因作用机制具有广泛的肿瘤特性,我们选择了其他肿瘤细胞系进行了验证,实验结果和在食管癌细胞结果完全一致,这提示BUD31基因作用机制具有广泛肿瘤特性。综上所述,我们首次发现了BUD31在肿瘤特性中功能作用新机制,即BUD31通过mRNA可变剪接调控着MCM7和CPSF4转录本及蛋白异构体比例变化,发挥促癌作用,并证实BUD31基因通过mRNA内含子剪接和mRNA可变剪接分别调控MCM7和CPSF4表达水平和转录比例变化共同发挥促癌作用。此外,我们通过多种肿瘤细胞系进行了验证,表明BUD31基因的作用机制具有广泛的肿瘤特性,这提示BUD31基因是一个潜在的肿瘤治疗靶基因和广泛肿瘤应用价值,同时也突出了 mRNA可变剪接在肿瘤特性的重要作用。在目前的肿瘤免疫治疗中,以PD-1/PD-L1免疫检查点阻断剂为代表免疫治疗取得一定的治疗效果;但其肿瘤客观有效率仅约40%,部分肿瘤患者对PD-1/PD-L1阻断剂应答不佳,疗效欠佳。部分患者肿瘤组织检测到肿瘤浸润淋巴细胞聚集,但未检测到肿瘤组织PD-L1的表达,这提示肿瘤组织可能通过非PD-1/PD-L1通路负向调控肿瘤免疫,借助于非PD-1/PD-L1肿瘤免疫检查点负向调控肿瘤免疫,进而影响肿瘤微环境,逃避免疫细胞的杀伤。因此,寻找新的免疫检查点对PD-1/PD-L1免疫检查点阻断剂疗效欠佳及开发新的肿瘤免疫手段至关重要。本课题尝试寻找新的肿瘤免疫检查点以探究新的肿瘤免疫负向调控机制和阐述肿瘤免疫微环境。首先,我们根据对本实验94对食管鳞癌RNA-seq数据和TCGA数据进行基因差异表达分析,结果提示和正常组织相比,肿瘤组织中LAMP3（lysosomal associated membraneprotein3,溶酶体相关膜蛋白3）,LAMP家族蛋白的一个成员,表达水平出现显着上调。LAMP3被报道在树突状细胞成熟过程表达,提示LAMP3可能参与正常免疫的调控机制,尤其负向调控免疫反应以防止免疫过激反应。随后我们查询了 HPA数据库中LAMP3数据,结果提示LAMP3极少表达于正常组织中,除了肺脏、阑尾和睾丸;LAMP3广泛表达于免疫细胞不同类型和多种肿瘤组织中,这提示LAMP3可能在免疫细胞和肿瘤细胞中发挥着类型的免疫调控机制,LAMP3参与的免疫调控机制可能广泛存在与免疫系统和肿瘤组织中。此外,我们对TCGA泛癌RNA-seq数据进行基因表达分析,结果提示和正常组织相比,肿瘤组织中LAMP3呈现显着上调表达,如乳腺癌、结肠癌、胃癌和头颈鳞癌。随后进行了生存相关分析,结果提示肿瘤组织中LAMP3表达水平和患者总生存期相关,高表达LAMP3的患者总生存期更短,如乳腺癌、子宫内膜癌和肾癌,这表明LAMP3可能通过肿瘤免疫调控机制在肿瘤特性中发挥着重要作用,并影响着临床预后。接下来,我们进一步对本实验食管鳞癌RNA-seq和TCGA食管癌RNA-seq进行基因表达水平相关性分析,结果均提示肿瘤组织中LAMP3表达水平和多种免疫标志基因表达水平存在显着相关,如CD3E、GZMA、GZMB、GNLY、PRF-1、IFNG等。此外,我们在TCGA乳腺癌和黑色素瘤RNA-seq也进行了基因表达水平相关性分析,结果和食管癌中情况一致,这表明肿瘤组织中LAMP3和免疫功能存在显着相关,可能广泛参与肿瘤免疫调控。本文进一步对LAMP3表达水平和PD-L1表达水平进行相关分析,结果提示LAMP3和PD-L1表达水平不存在相关性,肿瘤组织中同时出现LAMP3和PD-L1高表达的比例约5%,蛋白质BLAST也提示二者不具有任蛋白质相似性或同源性,这提示LAMP3可能通过和PD-L1完全不同的调控机制对肿瘤免疫进行调控。GZMA、GZMB、GNLY和IFNG均出现显着上升,这提示在肿瘤组织中,免疫标志基因表达水平出现了增强,而肿瘤并未得到有效控制,提示肿瘤中出现其他免疫负向调控机制进而导致肿瘤免疫逃逸。最后,本文对本实验64例食管癌组织单细胞数据进行相关分析,结果提示表达CD3e的T淋巴细胞和肿瘤上皮细胞上LAMP3阳性比例呈现显着正相关,效应性T细胞的IL-2水平和肿瘤上皮上LAMP3表达水平呈现显着负相关,这提示LAMP3可能直接参与了肿瘤免疫负向调控。根据实验室数据分析结果提示,肿瘤组织中LAMP3可能参与肿瘤免疫负向调控,进而引起了肿瘤免疫逃逸现象。首先,我们对肿瘤细胞系进行验证发现LAMP3广泛表达于多种肿瘤细胞系和正常细胞系中,这提示LAMP3广泛表达于肿瘤细胞中。接下来,我们通过细胞免疫实验探究LAMP3蛋白是否表达于肿瘤细膜上,结果提示LAMP3蛋白除了表达于肿瘤细胞细胞质内,还表达于肿瘤细胞细胞膜上,这提示肿瘤细胞可能通过细胞膜上LAMP3进行肿瘤免疫负向调控,这为后续的免疫功能实验提供了关键的实验依据。我们成功构建了 KYSE450 LAMP3稳定敲降和稳定过表达细胞系。细胞表型结果实验提示肿瘤细胞LAMP3对细胞增殖无显着影响,但对细胞迁移和细胞侵袭有显着影响,这提示肿瘤细胞通过转移和侵袭发挥肿瘤特性作用。随后T淋巴细胞杀伤实验证实,和对照组相比,LAMP3稳定敲降细胞系对T淋巴细胞杀伤更为敏感;和对照组相比,LAMP3稳定过表达细胞系对T淋巴细胞杀伤不敏感,T淋巴细胞对LAMP3稳定过表达细胞系具有较差的杀伤效果,这提示提示肿瘤细胞LAMP3降低了 T淋巴细胞杀伤能力。免疫细胞和肿瘤细胞共培养实验结果提示,对照组相比,LAMP3稳定敲降组中PBMC多个免疫标志基因表达水平出现显着上升,如GZMA、GZMB、GNLY、PRF-1、IFNG,这提示肿瘤细胞LAMP3负向调控T淋巴细胞免疫功能。此外,我们还发现和对照组相比,LAMP3稳定敲降组中T淋巴细胞功能出现增强时,LAMP3表达水平也出现了显着上升,这也和之前文献报道LAMP3显着上调表达在激活的T淋巴细胞上完全一致,这提示T淋巴细胞的LAMP3表达可能直接负向调控T淋巴细胞功能,是一个全新的潜在免疫检查点。综上所述,肿瘤组织中LAMP3表达水平出现广泛上调,并和患者预后显着相关。肿瘤细胞LAMP3对细胞迁移和细胞转移有显着影响,但对细胞增殖和细胞克隆形成无显着影响。肿瘤细胞LAMP3直接负向调控T淋巴细胞功能,结合LAMP3显着上调表达于激活的T淋巴细胞,表明LAMP3是一个新的肿瘤免疫负向调控分子,很可能是全新的免疫检查点。
张庆飞[4]（2020）在《基于铂前药的多功能基因载体用于肿瘤协同治疗》文中研究表明化疗是目前癌症治疗中最为有效的三大传统治疗手段之一,其中,金属铂类化合物是目前应用最广泛的一类化疗药物,在临床中参与一半以上的癌症治疗。然而,金属铂类化合物由于缺乏选择性,在发挥抗肿瘤作用的同时,对正常组织或器官产生较大的毒副作用;同时,溶解度低、血液循环时间短、易被代谢等问题导致其生物利用率较低;更为严重的是,先天或后天因多次化疗产生的耐药性,极大地限制了铂类药物的治疗效果。作为一种能从遗传物质基础上治愈疾病的新兴技术,基因疗法在癌症治疗中发挥着越来越重要的作用。相比于化疗药物,基因药物靶点明确、选择性好、能够特异性调控各种致病基因的表达,且无耐药性。因此,针对肿瘤治疗中的耐药性和异质性等问题,通过联合基因治疗和铂药化疗,在基因水平调控癌细胞增殖状态的同时联合化疗药物,具有良好的临床应用前景。考虑到小分子铂药用于化疗所面临的问题以及基因药物在体内循环过程中易被降解、清除等不利因素,通过简单的设计制备铂药和基因药物的共递送系统用于实现化疗和基因治疗的协同作用具有重要意义。近年来,纳米药物递送系统已在基础研究和临床应用中展现出诸多优势,如改善药物溶解性、延长药物血液循环时间、增加靶向部位药物浓度等。目前,有研究工作实现了将铂药和基因共担载于纳米载体,并取得了较好的协同治疗效果。然而,上述纳米药物递送系统面临铂药和基因的担载量较低、缺乏有效的溶酶体逃逸能力、铂药的释放和基因的卸载较难且不受控制等问题,这些极大地限制了联合治疗效率的最大化。因此,构建新型的共输送体系用于同时解决以上问题,对推进联合治疗的发展并进一步推广到临床更有理论指导意义。相对于经典的二价铂药,四价铂前药具有毒性较低的优势,且可以在外界光照条件下或肿瘤细胞内较高还原环境下被还原成相应的二价铂药,因此可以在肿瘤部位特定的响应性释放,从而实现肿瘤精准治疗。将四价铂前药通过化学键合或单体聚合的方式引入到高分子侧链或主链,利用其疏水性、光响应性或还原响应性等制备刺激响应性纳米药物,可以提高铂药的生物利用度、降低系统毒性、增强化疗效果。基于这些优势,本论文通过设计制备一系列刺激响应性含铂前药多功能纳米载体用于联合不同基因治疗技术,利用细胞内还原微环境或外部光照条件,实现铂药和基因可控共递送,达到最大化联合治疗效果。首先,我们制备了一种主链含光敏四价铂前药的高分子纳米递送系统（CNPptCP/si（c-fos））用于光控Pt（Ⅳ）和siRNA的共递送。通过将Pt（Ⅳ）作为聚合单体引入到高分子主链中得到光敏感的高分子基因载体,担载能沉默铂耐药基因c-fos的siRNA（si（c-fos））,并在复合纳米粒表面构建了透明质酸的遮蔽层,来增加其稳定性并赋予其肿瘤靶向能力。相比于之前的铂药和基因共递送系统,该体系具有以下优势:1)以聚前药为载体,避免了复杂的担载过程且药物含量较高;2)在温和光照条件下,CNPptCP/si（c-fos）能有效产生N3·,创新性地用于促进溶酶体逃逸;3)在光控条件下实现按需Pt（Ⅱ）的释放和基因卸载;4)具有很好的稳定性及肿瘤靶向能力,提高了肿瘤部位药物蓄积量。在光照条件下,CNPPtCP/si（c-fos）在细胞水平及动物水平实验均能有效地沉默耐药基因c-fos,从而逆转铂耐药卵巢癌的耐药性,实现了协同光化学疗法（PACT）和RNAi有效联合。为了进一步增加光的穿透深度以及丰富纳米共递送载体的功能,我们以上转换纳米粒（UCNP）和光敏铂聚前药（PtP）为基础制备了一个多功能纳米共递送系统（UCNP@Pt@siRNA）。实验结果表明,UCNP@Pt@siRNA在体内表现出良好的核磁共振成像（MRI）、上转换荧光成像（UCL）及CT成像能力。在980 nm NIR光激发下,UCNP可以发射出紫外到可见光激活表面PtP,在释放出Pt（Ⅱ）的同时促进了 siRNA卸载。细胞及动物实验结果均证明该纳米系统在NIR光照下可实现有效基因沉默并增强了联合治疗的效果。该纳米系统为联合铂药和基因治疗提供了一种更方便、切实可行的策略,具有很好的临床应用前景。至今为止,用同一纳米载体将铂药化疗和CRISPR/Cas9基因编辑技术联合用于肿瘤治疗的研究还没有。因此,我们设计和制备了一种简单的Pt（Ⅳ）前药骨架的聚合物纳米平台（NPCSPt）用于CRISPR/Cas9系统的递送（NPCSPt/pEZH2）。实验表明,NPCSPt/pEZH2能将CRISPR/Cas9系统有效递送进细胞内并从溶酶体逃逸。随后,NPCSPt/pEZH2中的聚合物被癌细胞中的还原剂以链消除的模式降解,同时释放出CRISPR/Cas9系统和Pt（Ⅱ）,实现了对目标基因EZH2的有效编辑。在沉默EZH2后会造成H3K27me3蛋白的降低,使得细胞核中染色体结构变得更松散,增加Pt（Ⅱ）与核DNA的结合,造成更多的DNA损伤及进一步癌细胞的杀伤。最后,NPCSPt/pEZH2显着抑制了前列腺癌细胞的增殖以及皮下前列腺癌移植瘤的生长。
闫列梅[5]（2020）在《特殊形貌多糖/无机复合纳米颗粒在肿瘤和抗感染治疗中的应用》文中研究表明肿瘤和细菌感染严重危害着人们的身体健康,制备安全高效的材料用于肿瘤和细菌感染治疗十分必要。有机/无机复合纳米颗粒由于其良好的稳定性、生物相容性以及多功能性在生物应用中获得了广泛的关注。天然多糖具有生物相容性好、易修饰以及便宜易得等优点成为生物医用材料的优良选择。特殊形貌的纳米颗粒已经被证明与肿瘤细胞或者细菌有更强的相互作用,可提高其在肿瘤细胞中的内吞以及在细菌上的粘附等来提高治疗效果。因此我们利用水溶性良好的天然多糖葡聚糖分别与多功能的四氧化三铁、硒化铋纳米颗粒复合,制备具有特殊形貌的多功能多糖/无机复合纳米颗粒分别用于肿瘤和抗感染治疗。一维形貌的纳米颗粒在肿瘤细胞中具有更好的内吞,同时磁性的一维纳米颗粒在旋转磁场下产生的剪切力可以对细胞产生杀伤,因此我们在磁场诱导下制备了一维形貌的氨基化葡聚糖包裹四氧化三铁（Fe3O4@Dex）纳米颗粒,随后用戊二醛交联形成酸响应的希夫碱键固定一维形貌。通过主客体自组装修饰上阳离子聚合物CD-PGEA作为高效低毒的非病毒基因载体。实验结果表明,相比于球形,一维Fe3O4@Dex-PGEA具有更高的基因转染效率和更高的细胞内吞效率,施加静态磁场可以进一步增强转染效率和内吞。并且体内外实验表明一维Fe3O4@Dex-PGEA在施加近红外光照、旋转磁场后具有良好的MRI引导的光热/基因/磁力三联合治疗效果。同时在酸环境下希夫碱键发生断裂实现一维结构降解,进一步提高了材料在体内应用的安全性。具有光热性能的Janus结构复合纳米颗粒在近红外光下产生自驱动会提高其光热性能。我们利用非溶剂辅助静电作用的方法制备出了 Janus结构的葡聚糖包硒化铋（Bi2Se3@Dex）复合纳米颗粒。其中葡聚糖可以靶向细菌生物膜加快渗透,同时材料和细菌静电结合后可以增强细菌在生物膜中的流动性实现了对生物膜的消散。Bi2Se3是一种光热稳定性和光热转换效率良好的光热材料。此外,具有还原性的Bi2Se3还具有减轻感染部位炎症的作用。实验结果表明,Bi2Se3@Dex相对于Bi2Se3@CS具有更快更好的生物膜渗透性,Bi2Se3@Dex可以通过静电作用和金黄色葡萄球菌进行良好的结合。由于Janus结构带来的光热性能提升和葡聚糖的靶向和消散作用,Bi2Se3@Dex相对于Bi2Se3@CS和Bi2Se3具有更好的光热溶液抗菌、光热抗生物膜以及生物膜消散性能。该工作表明所构建的Janus结构Bi2Se3@Dex具有良好的抗感染应用前景。
孙祺[6]（2020）在《遗传资源立法保护中基因权研究》文中提出遗传资源是国家的重要战略物资,在经济发展中发挥重要作用。遗传资源的价值主要体现在其是医学、农业、制药生物技术创新的原材料,例如,利用基因工程可以将野生动植物或其提取物用于生物制药,产生巨大的经济效益,“青蒿素”就是如此。正是因为遗传资源具有巨大的经济价值,遗传资源匮乏且生物技术先进的发达国家对遗传资源丰富且没有能力开发利用的发展中国进行各种形式的生物掠夺,导致发展中国家某些具有价值的生物资源被大肆挖掘、猎杀,进而导致生物多样性受到破坏。为了制止这一现象,发展中国家与发达国家两大阵营经过多次磋商达成《生物多样性公约》,遗传资源的获取与惠益分享是公约的三大目标之一。为了更好履行《生物多样性公约》,遏制“生物海盗”行为,各国纷纷制定国内立法与其接轨。发达国家国内立法侧重于遗传资源的利用管理,而发展中国家则更侧重保护管理。我国是生物多样性最丰富的国家之一,同时也是世界上最大的发展中国家。与其他发展中国家不同的是,我国自“十二五”战略生物资源计划以及“生命科学研究中心”的成立以来为生物技术发展打下基础,至2011年我国生物技术研究硕果累累,中国现在已经有能力对国内遗传资源自主开发利用。因此,我国更适合从遗传资源利用管理方面进行立法,兼顾遗传资源的保护与利用,而不再是对外来“生物海盗”行为的消极防御。本文提出设立基因权保护遗传资源设想,基因权利人（包括遗传资源权利人）通过主张基因权能够高效便捷的解决遗传资源获取与惠益分享中出现的问题,为遗传资源知识产品化前的权利空白阶段撑起保护伞。本文分为四个部分。第一部分是引言,简单概括我国遗传资源保护及基因权利研究现状,根据研究现状以及对比各国立法模式利弊,介绍选择在民法中财产权之下设立基因权的私法立法模式的原因。第二部分是本文的主体,根据新兴权利构造理论证成基因权,并构造基因权利内容。因遗传资源的定义容易把遗传资源无形财产本质与其作为载体的生物资源混淆,提出以“基因权”代替“遗传资源权”,从生物学以及“基因”一词来源分析并定义“基因”与“基因权”。根据权利构造理论论证“生物海盗”频发与生物技术发展需要提出建立便捷高效的遗传资源权利体系的要求,遗传资源作为无形财产符合型塑为财产权时对稀缺性、经济价值、正义、法律体系兼容性以及权利实现的可能性要求后,提出把遗传资源作为一项财产权利放置在民法中财产权之下与知识产权、物权、债权并列。根据权利构造理论,从基因权的主体、对象、权利内容三个方面构造基因权。基因权的主体根据基因来源不同分为两类,自然基因的权利属于国家或者集体,而人工改良基因属于改良者,可以是自然人、法人、国家或其他组织。基因权的客体是遗传信息,包括但不限于碱基序列,生物资源是基因的天然载体但不是唯一载体。基因权权利束之下有六个财产性子权利,分别是样本提取权、复制权、首次固定权、使用权和公示权;四个人格性子权利,分别是命名权、署名权和事先知情同意权、保护基因完整权。第三部分是在基因权利证成中遇到的问题以及解决方法的介绍,遇到的问题是基因人格与财产双重属性导致基因权在权利体系中的安置困境、基因权以人类为中心给其他生物基因完整性带来挑战、遗传资源知识产权法保护的做法给基因权存在的必要性提出质疑。针对以上问题提出以“权利束”理论中权力来源区分人格权与财产权、赋予非人类生物保护基因完整权由基因所有权人代为行使、区分基因与知识产品权利来源及范围的做法解释上述问题。第四部分是对基因权发展的展望,主要是总结了本文在基因权立法方面解决的问题和还未解决的问题,展望了基因权未来的发展,希望本文能给之后的基因权研究学者一点灵感。本文的创新点在于:提出基因权概念用于保护遗传资源。现有对基因权的讨论仅限于人类基因,而基因概念不仅包含人类基因,还包括其他动物、植物、微生物等其他生物基因。因此,基因权可以将人类对人类以及其拥有的生物财产的基因权利包含其中。基因与生物资源是等位概念,而遗传资源是指具有实际或者潜在价值的生物资源,即生物资源包含遗传资源以及非遗传资源,二者之间是包含关系。同样的,基因与遗传资源概念之间也是包含关系,遗传资源是具有实际或者潜在价值的基因。构造基因权利可以全方位无死角保护遗传资源,免去遗传资源权利行使中必须事先进行遗传资源备案的麻烦。同时,在基因不具有经济价值时基因权处于沉默阶段,基因实际产生价值时自动激活基因权,避免了《生物多样性》公约中以经济价值划分遗传资源和生物资源导致的“身份”的转换。
张正奎[7]（2019）在《柱状聚合物分子刷的合成及其生物学效应研究》文中进行了进一步梳理在过去的二十年中,人们一致认为作为抗癌药物载体的纳米医用材料（NMs）的尺寸在决定其细胞内化、生物分布、肿瘤富集和穿透以及体内血液和组织清除方面起着关键作用。当前,纳米药物载体的尺寸效应研究大多集中在球形系统上,由于难以根据需求控制合成不同形状的纳米材料,关于各向异性纳米材料的体外和体内行为的研究相对较少。柱状聚合物分子刷（CPBs）具有典型的一维蠕虫状纳米结构、可调节的柔韧性、精确可控的长度和直径、理想的稳定性和高度的可修饰性。为了优化CPBs药物载体的综合性能,我们需要准确地理解和掌握其物理化学性质如形状、长度、主链和侧链结构对其体外和体内生物学性能的影响。本论文设计合成了不同长度和形状的聚合物分子刷,系统地研究了不同尺寸和形状带来的生物学差异,并初步探索了利用聚合物分子刷作为基因运载工具的转染效率。具体研究内容如下:1.采用可逆加成-断裂链转移聚合（RAFT）方法制备了不同聚合度的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGMA）,并通过利用该材料上的环氧侧基和叠氮化钠反应合成了叠氮基修饰的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯主链。进一步通过Cu（I）-催化的炔-叠氮化物1,3-偶极环加成（CuAAC）反应将聚乙二醇（PEG）链接枝到主链上,我们合成了三种不同长度的蠕虫状聚合物分子刷（CPBs）,其长度分别为 34 nm（CPBs 1）、61 nm（CPBs 2）和 117 nm（CPBs 3）。原子力测试结果显示,该材料具有均一的蠕虫状结构,这为我们研究由尺寸效应带来的体内外生物学差异提供了支撑。此外,通过运用激光共聚焦、流式细胞术以及正电子发射断层扫描等精确的检测技术,我们发现,相对于较长的CPBs 3,较短的CPBs 1和CPBs 2具有更低的细胞摄取率、更高的组织渗透性、更长的血液循环时间以及更多的肿瘤富集。2.结合原子转移自由基聚合（ATRP）和CuAAC的合成手段,通过对分子量的精准控制,我们合成了以β-环糊精为核的球状单分子聚合物纳米材料（SPNPs）,以及与SPNPs体积相同的蠕虫状聚合物分子刷CPBs,这两种材料均具有良好的水溶性和生物相容性。进一步地,我们采用激光共聚焦、流式细胞术和正电子发射断层扫描等精确表征技术来深入研究这两种不同形状材料的生物学效应。研究结果显示,相较于SPNPs,同体积的蠕虫状聚合物分子刷具有更高的细胞摄取率、更高的3D细胞渗透能力和更快的体内清除率,同时,其也更易于被巨噬细胞吞噬。此外,我们还发现,相较于CPBs,在肝癌小鼠模型中,SPNPs具有更长的血液循环时间和更高的肿瘤血管渗透性。3.综合运用RAFT（主链的合成方法）、ATRP（侧链的合成方法）和CuAAC（主链和侧链接枝的方法）方法,我们合成了具有不同电位的两种蠕虫状的阳离子聚合物刷（PB-1和PB-2）。运用DNA凝胶电泳、荧光成像和流式细胞术,我们探索并分析了这两种阳离子聚合物刷的DNA复合能力及基因转染效率。研究结果表明,相较于具有较低电位的阳离子PB-2,具有较高电位的阳离子PB-1具有更强的基因复合能力和更高的基因转染效率,而且,PB-1的转染效率也显着高于商品化的PEI转染试剂,并显示出更低的细胞毒性。这表明,PB-1具有作为基因运载工具的应用潜力。4.利用具有四个引发位点的ATRP引发剂合成了四个臂的主链,再利用CuAAC接枝侧链PEG,合成了水溶性具有四个臂的星形聚合物分子刷。运用核磁、凝胶渗透色谱和原子力显微技术对其化学结构和形貌进行表征并初步探索了其细胞摄取行为。
莫丽芬[8]（2019）在《鸡Dazl荧光报告基因追踪生殖细胞迁移和分化的研究》文中研究表明诱导多能干细胞（Induced Pluripotent stem Cell,iPSC）具有分化成多种类型细胞的潜能。其中iPSC在体外诱导分化成生殖细胞对于畜禽保种育种、转基因动物以及发育生物学研究具有重要的意义。Dazl是调控生殖细胞发育与分化的关键因子,是生殖细胞鉴定的主要标志物。由于Dazl在iPSC不表达,因此可以作为报告基因追踪iPSC诱导分化为生殖细胞的过程。本研究利用 CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）技术介导的同源末端连接（Homology-Mediated End Joining,HMEJ）将红色荧光蛋白基因mCherry定点敲入鸡内源Dazl基因第10个内含子处,通过Dazl启动子驱动mCherry表达,从而精确追踪内源Dazl在iPSC分化为原始生殖细胞（Primordial germ cell,PGC）的过程中的表达情况。具体研究结果如下:（1）DAZL在鸡PGC和iPSC细胞中的表达鉴定。我们首先克隆鸡Dazl基因,制备DAZL多克隆抗体。纯化的抗体对鸡PGC进行Western blot,结果显示DAZL抗体能识别PGC中的特异性条带,相对分子量为33KDa,与预测分子量一致,说明DAZL抗体特异性高。q-PCR和免疫荧光染色结果显示DAZL在iPSC中不表达,在PGC中高表达,说明Dazl能作为报告基因追踪生殖细胞的特异性。（2）Dazl荧光报告载体的构建和定点敲入验证。首先针对Dazl基因设计和构建hpl80-sgRNA-spCas9表达载体和打靶供体质粒pDazl-HMEJ donor。然后将hpl80-sgRNA-spCas9转染DF-1细胞,验证CRISPR/Cas9系统的切割Dazl基因的效率。T7E1酶切鉴定证明hp180-sgRNA-spCas9质粒有效靶向目的位点实现基因敲除。而后将hpl80-sgRNA-spCas9表达载体和pDazl-HMEJ donor报告载体共转染PGC和iPSC,成功建立Dazl-mCherry+/EGFP+ PGC细胞系和Dazl-mCherry/EGFP+ iPSC细胞系。（3）Dazl荧光报告系统示踪PGC细胞迁移和iPSC细胞分化。本实验将Dazl-mCherry+/EGFP+标记的PGC细胞移植到15HH的鸡胚血液系统,结果显示细胞会随着血脉系统迁移并归巢到性腺,并且在新生鸡的睾丸继续发育。说明Dazl荧光报告系统能追踪生殖细胞的迁移。最后,我们将Dazl-mCherry/EGFP+标记的iPSC制作类配体（Embryoid body,EB）,并用EB培养液诱导,3天后形成的EB同时表达mCherry和EGFP。将EB收集检测生殖细胞特异性基因的和多能性相关基因的表达,q-PCR结果显示生殖细胞特异性基因显着上调,多能性相关基因显着下调。说明Dazl荧光报告系统在iPSC体外诱导分化过程中可起指示作用。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas9技术建立鸡Dazl荧光报告系统,追踪生殖细胞的迁移和体外分化。通过可视化诱导iPSC获得生殖细胞,将为进一步利用iPSC进行珍稀禽类保种育种、转基因鸡制备以及发育生物学研究的奠定基础。
许晨[9]（2019）在《基于生物小分子构建多羟基阳离子基因载体》文中研究说明基因治疗作为一种新型的医学手段可以用于治疗遗传性疾病,心血管疾病以及癌症等严重疾病,其主要是通过导入治疗性的基因取代突变基因或补充缺失基因,或者通过抑制相关病变蛋白的表达来实现根源上的治疗。基因治疗中最为重要的是要寻找到高效安全的基因载体。相比于安全性不高,具有免疫原性的病毒类载体,越来越多的非病毒类载体开始逐渐被人们引入治疗体系的构建。近年来我们组报道了一系列关于乙醇胺（EA）功能化的甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGMA）衍生物（PGEA）拥有较好的基因转染效率。同时其结构中大量的羟基可以保证载体具有较好的血液循环性和较低的毒性。然而这类载体的功能比较单一,转染效率仍然没有达到预期的目标,需要进一步功能化修饰。脂质是一类优异的生物小分子,也是细胞膜的重要组成部分。由于这类生物小分子具有优良的生物特性,其被广泛的应用于各种生物应用中。通过将膜脂质引入基因载体体系可以有效的增加载体的生物相容性,细胞吞噬效率和转染效率。在第二章中,我们通过原子转移自由基活性聚合（ATRP）方法构建了 一系列膜脂质胆固醇基和磷脂酰肌醇基的PGEA,分别为CHO-PGEA和PI-PGEA。这两种载体相比于国际金标PEI（25 kDa）和单纯的PGEA而言这两者都具有更好的转染效率。此外,在体内外两个载体与抑瘤基因p53形成的络合物都有良好的抗肿瘤效果,相比较于对照组肿瘤的质量可以平均降至0.15g以下。基于在肿瘤治疗中的良好的性能,我们又探究了 CHO-PGEA在心血管疾病中的应用。CRISPR/Cas9系统作为一类高效的工具可以通过基因编译对基因突变的疾病进行治疗。但是由于血管内皮结构完整这一生理障碍,目前递送CRISPR/Cas9系统治疗血管遗传病仍然是一个挑战,尤其是在胸主动脉上。在第三章中,我们提出可以利用CHO-PGEA携带pCas9-sgFbn1在体外编译Fbn1基因的10号外显子。更为重要的是,在血管紧张素（Ang Ⅱ）的辅助下,CHO-PGEA/pCas9-sgFbn1纳米系统可以有效的在体内实现血管基因的编译,编辑后的血管扩张约0.01 mm,与预期结果一致。在这章中,我们同时证明了 CHO-PGEA可以被当作心脏肥厚基因治疗的有效载体,以防止其过度发展导致心脏衰竭和猝死。在体内治疗中,CHO-PGEA载体可以有效的递送miR-182-in进入心肌细胞,拮抗心脏中过量的miR-182从而上调FOX03因子。相比于未经治疗组心脏体重比扩大到正常组1.5倍的情况,该治疗可以有效的改善心脏肥厚的状况。CHO-PGEA在这类疾病中有两大优点,首先是由于心肌细胞中有大量的胆固醇的存在,这种载体可以更有效的进行转染。其次,大量的羟基可以使耐受力较差的心肌细胞能在低毒性下被有效的转染。主动脉夹层（TAD）是一种危及生命的急性血管疾病,需要早期诊断和有效的治疗。但是由于病变血管结构的复杂性和狭小性,目前还没有较好的药物治疗体系。在第四章,我们构建了一种多功能的核酸递送系统（TP-Gd/miRNA-ColIV）。这个系统中以钆螯合的生物小分子单宁酸作为基体,包括低毒性的阳离子聚合物PGEA以及IV型胶原的靶向多肽ColIV,通过组装的方式形成的纳米复合物可以对TAD进行靶向治疗,早期诊断和病情监控。TP-Gd/miR-145-ColIV可以有效的携带miR-145对TAD进行治疗,在治疗后下TAD模型小鼠的胸主动脉夹层发生率可以有效的降低到不足20%。除此之外,实验数据证明TP-Gd/miRNA-ColIV拥有很好的核磁造影能力并且能够无伤的监控核酸系统对TAD的治疗效果。综上所述,我们使用不同的生物小分子修饰PGEA阳离子基因载体,构建出一系列效率更高,功能更丰富的基因载体,可以有效的针对不同的严重疾病。这些工作为将来的基因治疗策略的设计提供了借鉴意义
胡贻僧[10]（2019）在《功能化硅基介孔材料的制备及其抗癌应用》文中研究说明硅基介孔材料比表面积大,孔道结构致密,反应位点丰富,这些结构特点赋予硅基介孔材料多功能的特性:既能利用硅材料表面官能团及介孔孔道吸附或负载蛋白、药物、重金属离子等,也可以利用表面反应位点对材料进行进一步的功能化修饰。目前,硅基介孔材料凭借自身结构特点及功能化优势,已经广泛应用于催化、传感、吸附、生物医药等领域。硅基介孔材料按照来源与制备方式的不同,可以分为天然硅基介孔材料和合成硅基介孔材料两种。与天然硅基材料相比,合成硅基材料具有形貌及孔道尺寸可调的优点。本篇论文通过巧妙的设计合成,得到功能化硅基介孔材料,并探索其在光热-化疗联合治疗以及基因治疗等方面的抗癌应用。本文研究工作主要分为以下两个方面:1.为研究硅基介孔材料在光热-化疗联合治疗方面的应用,设计制备了一种以硒化铜为核,介孔二氧化硅为壳的核壳式纳米粒子,并对其纳米性质、药物控释以及癌症光热-化疗等方面性能进行了详细研究。本章首先利用高温注入法合成尺寸均一、光热转化效率高的油溶性硒化铜（Cu2-xSe）光热纳米粒子,然后采用配体置换的制备手法去除Cu2-xSe表面的油酸包覆层,包覆上介孔二氧化硅层,赋予纳米粒子亲水性与生物相容性,最后使用月桂酸将化疗药物三苯基膦阿霉素（TPDOX）封装在介孔内,即硒化铜-介孔二氧化硅载药纳米粒子（Cu2-xSe@MSNs-TPDOX）。光热性能测试及药物控释实验结果表明Cu2xSe@MSNs-TPDOX光热转化效率高、光热稳定性好,并且具有良好的光控药物释放性能。本章工作的生物实验部分,采用人乳腺癌耐药株（MCF-7/ADR）和不耐药株（MCF-7）对比进行研究,结果证明Cu2-xSe@MSNs-TPDOX在细胞及活体水平均具有克服癌症多药耐药性的能力。此外,Cu2xSe@MSNs-TPDOX能够通过光热-化疗联合治疗高效杀灭的癌细胞,且治疗效果明显优于单一的化疗和单一的热疗。2.为研究硅基介孔材料在基因治疗领域的应用,基于天然硅基介孔材料硅藻土,设计制备了一种在硅藻土表面接枝聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯（PDMAEMA）的有机无机杂化基因载体,即硅藻土基因载体。硅藻土基因载体将硅藻土良好的生物相容性与聚合物PDMAEMA优异的载基因能力结合,具有性能优异、合成简单、价格低廉等优点。首先将天然硅藻土表面功能化修饰作为引发剂核,聚合带有叔胺官能团的PDMAEMA链段。通过高氯酸滴定结晶紫显色实验,研究聚合时间对硅藻土表面PDMAEMA叔胺官能团含量的影响。此外,凝胶电泳及基因转染实验结果表明,硅藻土基因载体能够有效递送DNA进入细胞。硅藻土基因载体作为一种高效、廉价、易合成的基因载体,有望应用于癌症的基因治疗。
二、日本科学家开发新的基因载体（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、日本科学家开发新的基因载体（论文提纲范文）
（1）转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 血栓性疾病与溶栓药物的研究进展 |
| 1.1 血栓的概述及溶栓机理 |
| 1.2 去氨普酶(DSPA)研究进展 |
| 1.3 其它生物溶栓药物的研究进展 |
| 1.4 问题及展望 |
| 2 乳腺生物反应器研究进展 |
| 2.1 乳腺生物反应器简介 |
| 2.2 乳腺生物反应器优势 |
| 2.3 作为乳腺生物反应器的常用动物 |
| 2.4 乳腺生物反应器应用 |
| 2.5 问题与展望 |
| 3 蛋白质分离纯化研究进展 |
| 3.1 蛋白质分离纯化概述及其常用技术 |
| 3.2 乳腺生物反应器生产的重组蛋白的分离纯化 |
| 3.3 DSPA的分离纯化 |
| 3.4 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 常用试剂的配制 |
| 1.5 DSPA编码区设计 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 2.2 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 2.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 3.2 rDSPA转基因兔后代测交 |
| 3.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 3.4 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第二章 原核表达去氨普酶(DSPA)基因载体的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 载体 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 DSPA功能基因的引物设计 |
| 2.2 PCR扩增pCL25/DSPA表达载体 |
| 2.3 PCR产物和表达载体双酶切 |
| 2.4 PCR产物和表达载体酶切产物纯化 |
| 2.5 DSPA与pET-28a表达载体连接 |
| 2.6 DSPA与pET-28a表达载体连接产物转化TOP10 |
| 2.7 菌落PCR鉴定 |
| 2.8 pET-28a/DSPA重组质粒提取 |
| 2.9 pET-28a/DSPA重组质粒转化Rosetta |
| 2.10 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达 |
| 2.11 亲和层析柱纯化DSPA |
| 2.12 蛋白透析 |
| 2.13 浓缩及定量 |
| 3 结果 |
| 3.1 pCL25/DSPA表达载体的构建 |
| 3.2 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达及可溶性鉴定 |
| 3.3 Ni-NTA Resin亲和层析柱纯化DSPA |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第三章 rDSPA单克隆抗体制备及筛选 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物及免疫原 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及材料 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 小鼠免疫 |
| 2.2 小鼠血清检测 |
| 2.3 细胞融合 |
| 2.4 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 2.5 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化 |
| 2.6 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 2.7 阳性杂交瘤细胞的扩大培养和冻存 |
| 2.8 rDSPA单克隆抗体(PR-mAb)的大量制备 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫小鼠血清检测 |
| 3.2 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 3.3 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化鉴定结果 |
| 3.4 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 3.5 小鼠腹水抗体制备及腹水抗体ELISA检测 |
| 3.6 小鼠腹水抗体纯化及SDS-PAGE蛋白电泳检测 |
| 3.7 纯化抗体的ELISA检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第四章 转基因兔乳中rDSPA的纯化 |
| 1 材料 |
| 1.1 纯化原料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 兔乳前处理 |
| 2.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 2.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 2.4 小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 2.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.10 纯化产物脱盐 |
| 2.11 FAPA 法检测rDSPA |
| 2.12 SDS-PAGE检测rDSPA |
| 2.13 Western Blot检测rDSPA |
| 2.14 纯化产物纯度测试 |
| 2.15 纯化产物去除内毒素 |
| 2.16 纯化产物内毒素检测 |
| 2.17 rDSPA注射剂配制 |
| 3 结果 |
| 3.1 兔乳前处理 |
| 3.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 3.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 3.4 纯化小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 3.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.10 转基因兔乳中rDSPA的最终纯化方案 |
| 3.11 纯化产物脱盐 |
| 3.12 纯化产物SDS-PAGE及Western Blot检测 |
| 3.13 纯化产物纯度测试 |
| 3.14 纯化产物去除内毒 |
| 3.15 纯化产物内毒素检测 |
| 3.16 DSPA注射剂配制 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第五章 乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 2.2 蛋白质N端测序 |
| 2.3 蛋白质C端测序 |
| 2.4 相对分子量测序 |
| 2.5 纯化产物体蛋白三维结构模拟 |
| 2.6 纯化产物体外活性测试 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 3.2 蛋白质N端测序 |
| 3.3 蛋白质C端测序 |
| 3.4 相对分子量测序 |
| 3.5 纯化产物蛋白三维结构模拟 |
| 3.6 纯化产物体外活性测试 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文 |
| 第六章 rDSPA体内外溶栓效果的初步评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验试剂及耗材 |
| 1.5 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 体外血凝块溶解试验 |
| 2.2 角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型 |
| 2.3 体内溶栓试验 |
| 2.4 大鼠血浆rDSPA半衰期试验 |
| 2.5 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA体外血凝块溶解效果评价 |
| 3.2 大鼠尾部血栓模型制备结果 |
| 3.3 rDSPA对大鼠尾部血栓模型溶栓效果评价 |
| 3.4 大鼠血浆rDSPA半衰期评价 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（2）AAV-NT3与运动对脊髓损伤后肢体痉挛的干预及新型基因载体AAV-CPP.16的初步构建（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 脊髓损伤后肌肉痉挛神经机制的研究进展 |
| 1.1.1 脊髓损伤后肌肉痉挛概述 |
| 1.1.2 脊髓损伤后肌肉痉挛的发生机制 |
| 1.2 以构建新型腺相关病毒为代表的基因疗法 |
| 1.2.1 基因疗法概述 |
| 1.2.2 腺相关病毒作为基因疗法关键工具的研究进展 |
| 1.3 神经营养因子3 的研究现状 |
| 1.3.1 概述 |
| 1.3.2 神经营养因子3 在脊髓损伤后肌肉痉挛中的作用 |
| 1.4 运动干预与脊髓损伤可塑性 |
| 1.4.1 概述 |
| 1.4.2 运动干预疗法在脊髓损伤后肌肉痉挛中的作用 |
| 1.5 选题依据及研究意义 |
| 第2章 编码人神经营养因子3 的腺相关病毒的构建及其在大鼠后肢肌肉及背根神经节中的表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物与细胞系 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器与耗材 |
| 2.1.4 实验试剂的配制 |
| 2.2 实验方法与步骤 |
| 2.2.1 重组腺相关病毒载体的制备 |
| 2.2.2 重组腺相关病毒的注射 |
| 2.2.3 Western blot法检测NT3 蛋白的表达变化 |
| 2.2.4 大鼠脊髓组织NT3 的半定量分析 |
| 2.2.5 统计学处理 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 大鼠后肢肌肉中人神经营养因子3 的表达 |
| 2.3.2 大鼠脊髓背根神经节中神经营养因子3 的表达 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 编码人神经营养因子3 的腺相关病毒与运动干预对大鼠脊髓损伤后肌肉痉挛的保护作用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器与耗材 |
| 3.2 实验方法与步骤 |
| 3.2.1 实验设计 |
| 3.2.2 脊髓挫伤模型的建立 |
| 3.2.3 运动训练 |
| 3.2.4 游泳测试 |
| 3.2.5 BBB评分 |
| 3.2.6 H反射的RDD记录 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 AAV-NT3、运动干预及二者的联合治疗对大鼠脊髓损伤后游泳测试时痉挛行为发生频率的影响 |
| 3.3.2 单独或联合治疗对后肢运动功能的影响 |
| 3.3.3 单独或联合治疗对H反射RDD的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 编码人神经营养因子3 的腺相关病毒与运动干预对大鼠脊髓损伤后肌肉痉挛保护作用的机制研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器与耗材 |
| 4.2 实验方法与步骤 |
| 4.2.1 脊髓切片的灌注、固定和免疫荧光染色 |
| 4.2.2 免疫荧光定量 |
| 4.2.3 蛋白质印迹 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 单独或联合治疗后脊髓运动神经元及突触素(SYN)的变化 |
| 4.3.2 单独或联合治疗后 Ch AT 兴奋性中间神经元可塑性变化 |
| 4.3.3 单独或联合治疗后GABA抑制性中间神经元可塑性变化 |
| 4.3.4 单独或联合治疗后脊髓KCC2 蛋白表达的变化 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 新型中枢靶向性基因载体AAV-CPP.16 的构建 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物与细胞系 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 实验仪器 |
| 5.1.4 实验试剂的配置 |
| 5.2 实验方法与步骤 |
| 5.2.1 生产病毒载体所需的质粒构建 |
| 5.2.2 重组腺相关病毒载体的制备 |
| 5.2.3 中枢靶向性基因载体AAV-CPP.16的构建模式 |
| 5.2.4 新一代血脑屏障3D体外模型构建、鉴定与AAV筛选 |
| 5.2.5 小鼠尾静脉注射进行AAV体内筛选 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 小鼠体内筛选高效率转导的新型中枢靶向性病毒载体 |
| 5.3.2 血脑屏障3D体外模型验证AAV-CPP.16 穿透BBB的 能力 |
| 5.3.3 探索适宜的用于小鼠体内AAV-CPP.16 的病毒载量 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 新型中枢靶向性基因载体AAV-CPP.16的转导效率 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.2 实验方法与步骤 |
| 6.2.1 小鼠尾静脉注射 |
| 6.2.2 小鼠侧脑室病毒注射 |
| 6.2.3 脊髓和外周组织器官切片的灌注、固定和免疫荧光染色 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 IV注射AAV-CPP.16 靶向脊髓的转导效率 |
| 6.3.2 IV注射AAV-CPP.16 靶向脊髓运动神经元的转导效率 |
| 6.3.3 IV注射AAV-CPP.16 靶向脊髓背根神经节的转导效率 |
| 6.3.4 IV注射AAV-CPP.16 外周毒性研究 |
| 6.3.5 ICV注射AAV-CPP.16 在小鼠大脑中的转导效率 |
| 6.3.6 ICV注射AAV-CPP.16 靶向脊髓的转导效率 |
| 6.3.7 ICV注射AAV-CPP.16 靶向脊髓运动神经元的转导效率 |
| 6.3.8 ICV注射AAV-CPP.16 靶向脊髓背根神经节的转导效率 |
| 6.3.9 ICV注射AAV-CPP.16 外周毒性研究 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第7章 结论 |
| 7.1 研究工作总结 |
| 7.2 本研究的创新性 |
| 7.3 工作局限及未来方向 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）BUD31和LAMP3在肿瘤基因剪接和免疫调控的作用（论文提纲范文）
| 第一部分 BUD31在肿瘤基因剪接机制研究 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 在肿瘤免疫调控中的机制研究 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 基金资助 |
| 文献综述 肿瘤免疫治疗的发展和现状 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（4）基于铂前药的多功能基因载体用于肿瘤协同治疗（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 癌症治疗 |
| 1.1.1 铂药化疗 |
| 1.1.2 基因治疗 |
| 1.1.3 联合铂药化疗和基因治疗 |
| 1.2 联合治疗纳米递送载体 |
| 1.2.1 无机纳米载体 |
| 1.2.2 高分子纳米载体 |
| 1.2.3 其它载体 |
| 1.3 本论文选题依据和研究内容 |
| 第二章 含铂聚前药纳米载体用于光控基因递送及协同逆转肿瘤耐药性 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料及测试方法 |
| 2.2.1 主要药品及化学试剂 |
| 2.2.2 主要生化试剂 |
| 2.2.3 测试仪器及方法 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 四价光敏铂trans,trans,trans-[Pt(N_3)_2(OH)_2(py)(NH_3)] (Pt(Ⅳ)的合成 |
| 2.3.2 光敏铂前药骨架的阳离子聚合物(PtCP)的合成 |
| 2.3.3 合成罗丹明B(RhB)标记的PtCP (RhB-PtCP) |
| 2.3.4 端氨基聚乙二醇mPEG_(2k)-NH_2的合成 |
| 2.3.5 合成聚乙二醇接枝的透明质酸(HA-PEG,HP) |
| 2.3.6 光源及光照条件 |
| 2.3.7 光响应主链含铂阳离子聚合物纳米粒(NP_(PtCP))的制备及表征 |
| 2.3.8 PtCP的缓冲能力 |
| 2.3.9 NP_(PtCP/si(c-fos))的制备及表征 |
| 2.3.10 透明质酸遮蔽的复合纳米粒CNP_(PtCP/si(c-fos))的制备及表征 |
| 2.3.11 抗反离子能力 |
| 2.3.12 CNP_(PtCP/si(c-fos))的稳定性 |
| 2.3.13 Pt(Ⅳ)对基因的安全性 |
| 2.3.14 CNP_(PtCP/si(c-fos))的光敏感性 |
| 2.3.15 检测叠氮自由基(N_3~·) |
| 2.3.16 叠氮自由基(N_3~·)对基因的安全性 |
| 2.3.17 Pt及si(c-fos)的光响应性释放 |
| 2.3.18 细胞培养 |
| 2.3.19 NP_(PtCP/si(c-fos))及CNP_(PtCP/si(c-fos))的细胞内吞比较 |
| 2.3.20 叠氮自由基(N3·)诱导溶酶体破裂 |
| 2.3.21 光控溶酶体逃逸及基因卸载 |
| 2.3.22 细胞毒性评价 |
| 2.3.23 联合用药指数(Combination Index (CI)) |
| 2.3.24 细胞凋亡 |
| 2.3.25 Western blotting分析 |
| 2.3.26 细胞Pt内吞 |
| 2.3.27 确立肿瘤模型 |
| 2.3.28 Pt的体内分布 |
| 2.3.29 抑瘤实验 |
| 2.3.30 肿瘤组织氧化型自由基检测及肿瘤细胞溶酶体破裂 |
| 2.3.31 血常规及生化指标分析 |
| 2.3.32 组织学及免疫荧光分析 |
| 2.3.33 TUNEL检测 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 四价光敏铂前药Pt(Ⅳ)的合成 |
| 2.4.2 PtCP的合成 |
| 2.4.3 mPEG_(2k)-NH_2的合成 |
| 2.4.4 聚乙二醇接枝的透明质酸(HP)的合成 |
| 2.4.5 NP_(PtCP),NP_(PtCP/si(c-fos))及CNP_(PtCP/sic-fos))的制备及表征 |
| 2.4.6 CNP_(PtCP/si(c-fos))的稳定性 |
| 2.4.7 Pt(Ⅳ)对基因的安全性分析 |
| 2.4.8 Pt(Ⅳ)和PtCP的光响应性 |
| 2.4.9 CNP_(PtCP/si(c-fos))的光敏性 |
| 2.4.10 CNP_(PtCP/si(c-fos))的靶向性 |
| 2.4.11 叠氮自由基(N3·)的产生 |
| 2.4.12 N_3~·的安全性 |
| 2.4.13 N_3~·辅助溶酶体逃逸及光控基因卸载 |
| 2.4.14 CNP_(PtCP/si(c-fos))的体外抗癌效果评价 |
| 2.4.15 CNP_(PtCP/si(c-fos))的抗癌机理分析 |
| 2.4.16 细胞凋亡检测 |
| 2.4.17 动物水平抑瘤实验 |
| 2.4.18 血液生化指标及H&E染色 |
| 2.4.19 机制研究 |
| 2.5 本章结论 |
| 第三章 近红外光激活的多模式成像诊疗系统用于癌症联合治疗 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料及测试方法 |
| 3.2.1 主要药品及化学试剂 |
| 3.2.2 主要生化试剂 |
| 3.2.3 测试仪器及方法 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 四价光敏铂trans,trans,trans-[Pt(N_3)_2(OH)_2(py)(NH_3)] (Pt(Ⅳ)的合成 |
| 3.3.2 光敏铂前药骨架的聚合物(PtP)的合成 |
| 3.3.3 上转换纳米粒(UCNP)的制备及表征 |
| 3.3.4 UCNP@Pt的制备及表征 |
| 3.3.5 UCNP@Pt@siRNA的制备及表征 |
| 3.3.6 光源 |
| 3.3.7 UCNP@Pt@siRNA的近红外光响应性 |
| 3.3.8 UCNP@Pt@siRNA的近红外光响应性释放 |
| 3.3.9 细胞培养 |
| 3.3.10 UCNP@Pt@siRNA的细胞内吞 |
| 3.3.11 细胞毒性评价 |
| 3.3.12 细胞凋亡 |
| 3.3.13 Western blotting分析 |
| 3.3.14 确立肿瘤模型 |
| 3.3.15 多模式成像 |
| 3.3.16 抑瘤实验 |
| 3.3.17 血常规及生化指标分析 |
| 3.3.18 组织学及免疫荧光分析 |
| 3.3.19 TUNEL检测 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 Pt(Ⅳ)的合成 |
| 3.4.2 PPt的合成 |
| 3.4.3 UCNP@Pt@siRNA的制备及表征 |
| 3.4.4 UCNP@Pt@siRNA的光敏感性 |
| 3.4.5 UCNP@Pt@siRNA的细胞内吞 |
| 3.4.6 UCNP@Pt@siPlk1的体外抗癌效果评价 |
| 3.4.7 MR/CT/UCL三模式成像 |
| 3.4.8 动物水平抑瘤实验 |
| 3.4.9 血液生化指标及H&E染色 |
| 3.4.10 机制研究 |
| 3.5 本章结论 |
| 第四章 链消除聚铂高分子用于高效CRISPR/Cas9基因编辑-化疗协同治疗 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料及测试方法 |
| 4.2.1 主要药品及化学试剂 |
| 4.2.2 主要生化试剂 |
| 4.2.3 测试仪器及方法 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 四价铂前药cis,cis,trans-[Pt(Cl)_2(N_3)(OH)_2][Pt(Ⅳ)]的合成 |
| 4.3.2 链消除聚铂高分子(CSPt)的制备 |
| 4.3.3 纳米粒NP_(CSPt)的制备与表征 |
| 4.3.4 NP_(CSPt)还原电势测定 |
| 4.3.5 NP_(CSPt/pNC)的制备及表征 |
| 4.3.6 NP_(CSPt)和NP_(CSPt/pNC)的稳定性比较 |
| 4.3.7 NP_(CSPt)和NP_(CSPt/pNC)的还原敏感性 |
| 4.3.8 NP_(CSPt/pNC)中Pt及pNC的响应性释放 |
| 4.3.9 细胞培养 |
| 4.3.10 细胞内吞 |
| 4.3.11 细胞转染 |
| 4.3.12 细胞毒性评价 |
| 4.3.13 细胞凋亡 |
| 4.3.14 细胞划痕实验 |
| 4.3.15 细胞增殖分析 |
| 4.3.16 确立肿瘤模型 |
| 4.3.17 抑瘤实验 |
| 4.3.18 血常规及生化指标分析 |
| 4.3.19 组织学及免疫荧光分析 |
| 4.3.20 TUNEL检测 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 Pt(Ⅳ)的合成 |
| 4.4.2 CSPt的合成 |
| 4.4.3 NP_(CSPt)和NP_(CSPt/pNC)的制备及表征 |
| 4.4.4 NP_(CSPt)和NP_(CSPt/pNC)的还原敏感性 |
| 4.4.5 溶酶体逃逸和基因卸载 |
| 4.4.6 NP_(CSPt/pEZH2)高效的基因编辑能力 |
| 4.4.7 NP_(CSPt/pEZH2)的体外抗癌效果及机理 |
| 4.4.8 动物水平抑瘤实验 |
| 4.4.9 血液生化指标及H&E染色 |
| 4.4.10 机制研究 |
| 4.5 本章结论 |
| 全文总结及展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（5）特殊形貌多糖/无机复合纳米颗粒在肿瘤和抗感染治疗中的应用（论文提纲范文）
| 学位论文数据集 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肿瘤诊疗 |
| 1.1.1 基因治疗 |
| 1.1.2 光热治疗 |
| 1.1.3 磁力治疗 |
| 1.1.4 多模式治疗 |
| 1.1.5 成像 |
| 1.2 抗感染治疗 |
| 1.2.1 药物治疗 |
| 1.2.2 光治疗 |
| 1.2.3 化学动力学治疗 |
| 1.2.4 气体治疗 |
| 1.2.5 其他治疗 |
| 1.2.6 多模式治疗 |
| 1.3 特殊形貌的纳米颗粒在肿瘤和抗感染治疗中的应用 |
| 1.3.1 特殊形貌纳米颗粒的合成与性能 |
| 1.3.2 特殊形貌纳米颗粒在肿瘤治疗中的应用 |
| 1.3.3 特殊形貌纳米颗粒在抗感染治疗中的应用 |
| 1.4 多糖/无机复合纳米颗粒的优势 |
| 1.5 课题的目的及意义 |
| 第二章 可降解一维葡聚糖/四氧化三铁复合纳米颗粒用于肿瘤的基因/光热/磁力三联合治疗 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 原料和仪器 |
| 2.2.1 原料 |
| 2.2.2 仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 制备四氧化三铁(Fe_3O_4)纳米颗粒 |
| 2.3.2 合成Dextran-NH_2 |
| 2.3.3 合成Fe_3O_4@Dextran |
| 2.3.4 合成CD-PGEA |
| 2.3.5 合成一维和球形Fe_3O_4@Dextran-PGEA纳米颗粒 |
| 2.3.6 Fe_3O_4@Dextran在酸环境下响应降解 |
| 2.3.7 1D FDP、s-FDP以及1D FDP/pDNA、s-FDP/pDNA复合物的表征 |
| 2.3.8 细胞毒性测试 |
| 2.3.9 转染测试 |
| 2.3.10 细胞吞噬测试 |
| 2.3.11 抑制迁移、抑制增殖和Western blot |
| 2.3.12 材料旋转毒性、光热性能以及体外联合治疗 |
| 2.3.13 体内外MR成像 |
| 2.3.14 体内基因/光热/磁力三联合治疗 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 材料的合成与表征分析 |
| 2.4.2 1D FDP和s-FDP络合DNA能力的表征 |
| 2.4.3 1D FDP和s-FDP的细胞毒性测试 |
| 2.4.4 1D FDP和s-FDP的基因转染效率测试 |
| 2.4.5 1D FDP和s-FDP在细胞中的内吞测试 |
| 2.4.6 1D FDP抑制细胞迁移、增殖和Western blot测试 |
| 2.4.7 体外1D FDP的磁力治疗,光热性能及联合治疗 |
| 2.4.8 1D FDP的体内外MR成像 |
| 2.4.9 ID FDP的体内抗肿瘤实验 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 Janus葡聚糖/硒化铋复合纳米颗粒用于光热与消散抗生物膜治疗 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 原料和仪器 |
| 3.2.1 原料 |
| 3.2.2 仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 制备硒化铋纳米颗粒 |
| 3.3.2 合成Dextran-NH_2 |
| 3.3.3 制备葡聚糖-硒化铋和壳聚糖-硒化铋复合纳米颗粒 |
| 3.3.4 Bi_2Se_3、Bi_2Se_3@Dex和Bi_2Se_3@CS的表征 |
| 3.3.5 Bi_2Se_3、Bi_2Se_3@Dex和Bi_2Se_3@CS光热性能的表征 |
| 3.3.6 Bi_2Se_3@Dex-cy5.5和Bi_2Se_3@CS-cy5.5的合成 |
| 3.3.7 Bi_2Se_3@Dex和金黄色葡萄球菌的相互作用 |
| 3.3.8 Bi_2Se_3@Dex-cy5.5和Bi_2Se_3@CS-cy5.5的渗透性的表征 |
| 3.3.9 Bi_2Se_3、Bi_2Se_3@Dex和Bi_2Se_3@CS溶液光热抗菌表征 |
| 3.3.10 Bi_2Se_3、Bi_2Se_3@Dex和Bi_2Se_3@CS和金黄色葡萄球菌的相互作用 |
| 3.3.11 Bi_2Se_3、Bi_2Se_3@Dex和Bi_2Se_3@CS光热抗生物膜 |
| 3.3.12 Bi_2Se_3、Bi_2Se_3@Dex-cy5.5相Bi_2Se_3@CS-cy5.5消散生物膜 |
| 3.3.13 Bi_2Se_3、Bi_2Se_3@Dex和Bi_2Se_3@CS对L929细胞的毒性测试 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 材料的合成与表征 |
| 3.4.2 材料的光热性能测试 |
| 3.4.3 Bi_2Se_3@CS和Bi_2Se_3@Dex在金黄色葡萄球菌生物膜中的渗透性表征 |
| 3.4.4 材料的溶液光热抗菌测试 |
| 3.4.5 材料和金黄色葡萄球菌的相互作用 |
| 3.4.6 材料的光热抗生物膜性能测试 |
| 3.4.7 材料消散生物膜测试 |
| 3.4.8 材料的细胞毒性测试 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究成果及发表的学术论文 |
| 导师及作者简介 |
| 附件 |
（6）遗传资源立法保护中基因权研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| (一) 文献综述 |
| (二) 现有遗传资源立法模式利弊分析 |
| (三) 我国立法模式的选择 |
| 一、基因权利构造 |
| (一) 新型权利构造理论 |
| (二) “基因权”概念的提出 |
| 1. 将遗传资源权利命名为“基因权”的缘由 |
| 2. 与现有基因权概念及区别 |
| 3. 基因概念的渊源与生物学定义 |
| 4. 基因权相关法律概念 |
| (三) 基因权证成 |
| 1. 遗传资源具有现实的立法需求 |
| 2. 遗传资源权利被保护的合理性 |
| 3. 遗传资源具有财产属性 |
| 4. 遗传资源利益形塑为权利符合自然法学中正义的要求 |
| 5. 遗传资源可以在现有法律框架下找到容身之地 |
| 6. 权利具有实现的可能性 |
| (四) “基因权”权利内容的构造 |
| 1. 基因权的权利主体与义务主体 |
| 2. 基因权的客体与对象 |
| 3. 基因权权利内容 |
| 二、基因权利财产权证成中遇到的问题及解决方法 |
| (一) 基因财产与人格权双重属性带来权利体系解释的困境 |
| 1. 基因具有人格、财产双重属性 |
| 2. 现有权利体系中安置基因人格权存在理论上的困境 |
| 3. 区分人格权与基因人格权 |
| (二) 基因权以人类为中心给保护基因完整性带来挑战 |
| (三) 基因和基因产品专利化否定设定基因权的必要性 |
| 三、基因权发展的未来展望 |
| (一) 基因权法真正落实并不遥远 |
| (二) 基因权法在未来可能解决的问题 |
| (三) 本文基因权研究尚未解决的问题 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（7）柱状聚合物分子刷的合成及其生物学效应研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1. 前言 |
| 2. 聚合物分子刷的介绍 |
| 2.1 1D聚合物刷 |
| 2.2 2D聚合物刷 |
| 2.3 3D聚合物刷 |
| 3. 聚合物分子刷的合成方法 |
| 3.1 原子转移自由基聚合(ATRP) |
| 3.2 可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT) |
| 3.3 开环复分解聚合(ROMP) |
| 4. 聚合物分子刷的合成策略 |
| 4.1 “graft-from”合成策略 |
| 4.2 “graft-through”合成策略 |
| 4.3 “graft-to”合成策略 |
| 5. 聚合物分子刷的应用 |
| 5.1 聚合物分子刷用作热塑性弹性体 |
| 5.2 聚合物分子刷用作光子晶体材料 |
| 5.3 聚合物刷用作药物载体 |
| 6. 本论文的主要内容和创新点 |
| 6.1 本论文的主要内容 |
| 6.2 本论文的创新之处 |
| 7. 参考文献 |
| 第二章 不同长度聚合物分子刷的合成及生物学效应研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 细胞和动物 |
| 2.3 仪器设备 |
| 2.4 合成及表征 |
| 2.4.1 RAFT聚合链转移剂(CTA)的合成 |
| 2.4.2 不同分子量大小的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA)的合成 |
| 2.4.3 叠氮基团取代的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGA)的合成 |
| 2.4.4 炔基修饰的PEG(PEG2)的合成 |
| 2.4.5 侧链末端为BOC保护氨基的CPBs-BOC 1、CPBs-BOC 2和CPBs-BOC 3的合成 |
| 2.4.6 不同长度的柱状聚合物分子刷(CPBs 1、CPBs 2和CPBs 3)的合成 |
| 2.4.7 FITC和RBITC标记的CPBs 1、CPBs 2和CPBs 3的合成 |
| 2.4.8 放射性同位素~(18)F标记的CPBs 1和CPBs 3的合成 |
| 2.4.9 体外细胞毒性实验 |
| 2.4.10 体外细胞摄取实验 |
| 2.4.11 体外3D细胞球(MCs)渗透实验 |
| 2.4.12 聚合物分子刷的小鼠microPET成像及体内分布研究 |
| 2.4.13 FITC标记的CPBs 1和CPBs 3的血液半衰期研究 |
| 2.4.14 FITC标记的CPBs 1和CPBs 3巨噬细胞摄取及定量研究 |
| 3. 结果与讨论 |
| 3.1 聚合物分子刷CPBs 1、CPBs 2和CPBs 3的合成与表征 |
| 3.2 细胞毒性研究 |
| 3.3 细胞摄取研究 |
| 3.4 体外3D细胞球(MCs)渗透研究 |
| 3.5 CPBs的PET成像及体内分布研究 |
| 3.6 血液半衰期及巨噬细胞摄取研究 |
| 4. 本章小结 |
| 5. 参考文献 |
| 第三章 同体积球形和线性聚合物分子刷的合成及生物学效应研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 细胞和动物 |
| 2.3 仪器设备 |
| 2.4 合成及表征 |
| 2.4.1 21Br-β-CD的合成 |
| 2.4.2 线形聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(L-PGMA)的合成 |
| 2.4.3 21个臂的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(S-PGMA)的合成 |
| 2.4.4 叠氮基团修饰的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(L-PGA、S-PGA)的合成 |
| 2.4.5 炔基修饰聚乙二醇单甲醚(PEG 2)的合成 |
| 2.4.6 CPBs 1和SPNPs 1的合成 |
| 2.4.7 CPBs 2和SPNPs 2的合成 |
| 2.4.8 FITC和RBITC标记的CPBs 2和SPNPs 2的合成 |
| 2.4.9 放射性同位素~(18)F标记的CPBs 2和SPNPs 2的合成 |
| 2.4.10 CPBs 2和SPNPs 2的体外细胞毒性研究 |
| 2.4.11 FITC标记的CPBs 2和SPNPs 2的细胞摄取 |
| 2.4.12 FITC标记的CPBs 2和SPNPs 2的内吞途径 |
| 2.4.13 FITC标记的CPBs 2和RBTIC标记的SPNPs 2体外3D细胞球(MCs)渗透 |
| 2.4.14 小鼠microPET成像及体内分布研究 |
| 2.4.15 实时活体CLSM成像 |
| 2.4.16 CPBs 2和SPNPs 2的血液半衰期 |
| 2.4.17 FITC标记的CPBs 2和SPNPs 2的巨噬细胞摄取及定量研究 |
| 3.结果与讨论 |
| 3.1 CPBs和SPNPs的合成与表征 |
| 3.2 CPBs 2和SPNPs 2的细胞毒性研究 |
| 3.3 CPBs 2和SPNPs 2的细胞摄取研究 |
| 3.4 CPBs 2和SPNPs 2的细胞内吞途径研究 |
| 3.5 CPBs 2和SPNPs 2的体外3D细胞球(MCs)渗透研究 |
| 3.6 CPBs 2和SPNPs 2的体内行为研究 |
| 3.7 实时活体CLSM成像研究 |
| 3.8 血液半衰期研究 |
| 3.9 巨噬细胞摄取研究 |
| 4. 本章小结 |
| 5. 参考文献 |
| 第四章 聚合物分子刷作为基因载体的研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 细胞和质粒 |
| 2.3 仪器设备 |
| 2.4 合成及表征 |
| 2.4.1 ATRP引发剂(PBI)的合成 |
| 2.4.2 聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(PDMAEMA)的合成 |
| 2.4.3 聚合物分子刷的主链及侧链炔基PEG的合成 |
| 2.4.4 柱状阳离子聚合物分子刷(PB-1、PB-2)的合成 |
| 2.5 基因复合能力实验 |
| 2.6 细胞毒性实验 |
| 2.7 绿色荧光蛋白表达实验 |
| 2.8 转染效率检测 |
| 3. 结果与讨论 |
| 3.1 阳离子聚合物分子刷的合成与表征 |
| 3.2 基因复合能力研究 |
| 3.3 阳离子聚合物分子刷的细胞毒性研究 |
| 3.4 绿色荧光蛋白表达情况研究 |
| 3.5 基因转染效率定量研究 |
| 4. 本章小结 |
| 5. 参考文献 |
| 第五章星形聚合物分子刷的合成及细胞摄取研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 细胞 |
| 2.3 仪器设备 |
| 2.4 合成及表征 |
| 2.4.1 四个臂ATRP引发剂(4BriPr)的合成 |
| 2.4.2 四个臂聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(4arm-PGMA)的合成 |
| 2.4.3 叠氮基团修饰的四个臂聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(4arm-PGA)的合成 |
| 2.4.4 四个臂聚合物分子刷(4arm-CPBs 1)的合成 |
| 2.4.5 4arm-CPBs 2的合成 |
| 2.4.6 FITC标记的4arm-CPBs 2的合成 |
| 2.4.7 FITC标记的4arm-CPBs 2的细胞摄取 |
| 3. 结果与讨论 |
| 3.1 4arm-CPBs的合成与表征 |
| 3.2 4arm-CPBs 2的细胞摄取研究 |
| 4. 本章小结 |
| 5. 参考文献 |
| 论文不足之处 |
| 已发表和待发表的论文 |
| 已发表的论文 |
| 致谢 |
（8）鸡Dazl荧光报告基因追踪生殖细胞迁移和分化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 附录：缩略词（中英文对照） |
| 第一部分 综述 |
| 前言 |
| 1 家禽种质资源的保存 |
| 1.1 利用胚盘细胞制备生殖系嵌合体 |
| 1.2 利用ESC制备生殖系嵌合体 |
| 1.3 利用PGC制备生殖系嵌合体 |
| 2 转基因鸡的产生 |
| 3 iPSC的研究进展 |
| 3.1 iPSC的概述 |
| 3.2 禽类iPSC的研究进展 |
| 3.3 诱导多能干细胞分化为生殖细胞的研究进展 |
| 4 Dazl的研究进展 |
| 4.1 DAZ基因家族的起源与结构 |
| 4.2 Dazl在生殖细胞发育中的作用 |
| 5 基因组定点编辑技术 |
| 5.1 基因组定点编辑技术的分类 |
| 5.2 CRISPR/Cas9技术 |
| 5.3 CRISPR/Cas9的在转基因动物中的应用 |
| 5.4 脱靶效应 |
| 6 本研究的目的和意义 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第一章 DAZL在鸡PGC和iPSC细胞中的表达鉴定 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 DAZL多克隆抗体的制备 |
| 2.2 DAZL在鸡PGC和iPSC细胞中的表达鉴定 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 鸡Dazl荧光报告载体的构建和定点敲入验证 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 CRISPR/Cas9表达载体的构建与敲除效率验证 |
| 2.2 Dazl荧光报告基因载体的构建 |
| 2.4 荧光报告载体在PGC打靶Dazl的验证 |
| 2.5 荧光报告载体在iPSC打靶Dazl的验证 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 Dazl荧光报告基因示踪PGC细胞迁移和iPSC分化 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 Dazl荧光标记PGC的迁移归巢鉴定 |
| 2.2 鸡Dazl报告基因示踪iPSC分化 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 总结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
（9）基于生物小分子构建多羟基阳离子基因载体（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 两大重要疾病与基因治疗的简介 |
| 1.2 基因递送体系 |
| 1.2.1 基因的种类 |
| 1.2.1.1 DNA |
| 1.2.1.2 RNA |
| 1.2.1.3 mRNA |
| 1.2.1.4 siRNA和shRNA |
| 1.2.1.5 miRNA和lncRNA |
| 1.2.1.6 CRISPER/Cas9 |
| 1.2.2 基因载体 |
| 1.2.2.1 病毒载体 |
| 1.2.2.2 非病毒载体 |
| 1.2.3 递送基因过程中非病毒类载体需要克服的障碍 |
| 1.3 生物小分子 |
| 1.3.1 脂质 |
| 1.3.2 多酚类 |
| 1.3.3 小分子糖类 |
| 1.3.4 小分子活性肽 |
| 1.4 原子转移自由基活性聚合(ATRP)在生物材料构建中的应用 |
| 1.5 分子影像学在疾病中的应用 |
| 1.6 本课题的设计和意义 |
| 第二章 基于细胞膜脂质构建多羟基阳离子基因载体 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 引发剂(CHO-Br和PI-Br)的合成 |
| 2.2.4 CHO-PGMA,PI-PGMA和PGMA及其各自衍生物的制备 |
| 2.2.5 合成的聚阳离子以及聚阳离子/pDNA复合物的表征 |
| 2.2.6 细胞毒性分析 |
| 2.2.7 体外转染分析 |
| 2.2.8 细胞吞噬分析 |
| 2.2.9 体外抗肿瘤细胞分析 |
| 2.2.10 体内抗肿瘤实验 |
| 2.2.11 统计学分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 脂质基PGEA载体的制备和表征 |
| 2.3.2 CHO-PGEAs/pDNA和PI-PGEAs/pDNA复合物的表征 |
| 2.3.3 细胞毒性分析 |
| 2.3.4 细胞转染分析 |
| 2.3.5 细胞内吞分析 |
| 2.3.6 体外抗肿瘤实验 |
| 2.3.7 体内抗肿瘤实验 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 CHO-PGEA阳离子载体在心血管疾病中的应用 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 聚阳离子/核酸的复合物的筛选和表征 |
| 3.2.4 体内CRISPR/Cas9质粒的吞噬效率 |
| 3.2.5 体内Ang Ⅱ刺激下CRISPR/Cas9质粒的表达效率 |
| 3.2.6 体内编译实验 |
| 3.2.7 体内安全性实验 |
| 3.2.8 体内心脏肥厚治疗实验 |
| 3.2.9 统计学分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 体内CRISPR/Cas9质粒的吞噬效率 |
| 3.3.2 体内Ang Ⅱ刺激下CRISPR/Cas9质粒的表达效率 |
| 3.3.3 体内编译实验 |
| 3.3.4 体内安全性实验 |
| 3.3.5 体内心脏肥厚治疗实验 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 多功能阳离子纳米核酸系统用于胸主动脉夹层治疗 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 引发剂TA-Br的合成 |
| 4.2.4 引发剂TA-Br-Gd的再修饰 |
| 4.2.5 TA-PGMA及其衍生物TA-PGEA的合成 |
| 4.2.6 钆螯合的TA-PGEA的合成 |
| 4.2.7 TA-E,TP-ColⅣ和TA-ColⅣ-RhB的合成 |
| 4.2.8 聚阳离子/miRNA复合物的构建 |
| 4.2.9 材料及其复合物理化性质的表征 |
| 4.2.10 抗蛋白吸附实验 |
| 4.2.11 溶血实验 |
| 4.2.12 体外毒性分析 |
| 4.2.13 细胞吞噬分析 |
| 4.2.14 体外miR-145的基因递送效率 |
| 4.2.15 体外miR-145调控下游蛋白KLF4表达 |
| 4.2.16 体内miRNA的递送效率 |
| 4.2.17 体内治疗实验 |
| 4.2.18 体外材料核磁造影能力的检测 |
| 4.2.19 体内核磁诊断与监控 |
| 4.2.20 体内毒性分析 |
| 4.2.21 统计学分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 复合物TP-Gd/miRNA-ColIV的制备和表征 |
| 4.3.2 蛋白吸附,溶血和体外毒性实验 |
| 4.3.3 体外吞噬实验和目的蛋白调控实验 |
| 4.3.4 体内摄取实验 |
| 4.3.5 体内TAD治疗 |
| 4.3.6 体外核磁能力检测 |
| 4.3.7 体内诊断与监控 |
| 4.3.8 体内毒性检测 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究成果及发表的学术论文 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
| 附件 |
（10）功能化硅基介孔材料的制备及其抗癌应用（论文提纲范文）
| 学位论文数据集 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 硅基介孔材料 |
| 1.1.1 硅基介孔材料的种类 |
| 1.1.1.1 天然硅基介孔材料 |
| 1.1.1.2 合成硅基介孔材料 |
| 1.1.2 硅基介孔材料的合成 |
| 1.1.2.1 模板法 |
| 1.1.2.2 凝胶法 |
| 1.1.2.3 干胶法 |
| 1.1.2.4 微波法 |
| 1.1.3 硅基介孔材料的功能化 |
| 1.1.3.1 物理包覆 |
| 1.1.3.2 化学共沉淀 |
| 1.1.3.3 后修饰 |
| 1.2 硅基介孔材料在癌症治疗中的应用 |
| 1.2.1 生物成像 |
| 1.2.2 化疗 |
| 1.2.3 热疗 |
| 1.2.4 基因治疗 |
| 1.3 课题的创新点 |
| 第二章 介孔二氧化硅包覆硒化铜纳米粒子的合成及其抗癌应用 |
| 2.1 本章引论 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验仪器和药品 |
| 2.2.2 材料的合成 |
| 2.2.2.1 Cu_(2-x)Se纳米粒子的合成 |
| 2.2.2.2 靶向化疗药物的合成(TPDOX) |
| 2.2.2.3 Cu_(2-x)Se@MSNs的合成 |
| 2.2.2.4 Cu_(2-x)Se@MSNs-TPDOX的制备 |
| 2.2.3 高分辨电镜观测(HRTEM) |
| 2.2.4 粒径测量(DLS) |
| 2.2.5 X光衍射仪(XRD) |
| 2.2.6 紫外荧光光谱 |
| 2.2.7 Cu_(2-x)Se@MSNs-TPDOX纳米粒子的性能测试 |
| 2.2.7.1 光热升温性能 |
| 2.2.7.2 光照稳定性 |
| 2.2.7.3 可控药物释放性能 |
| 2.2.8 细胞摄取及抗肿瘤评价 |
| 2.2.8.1 细胞实验 |
| 2.2.8.2 动物实验 |
| 2.2.9 作用机理 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 Cu_(2-x)Se@MSNs-TPDOX的结构表征 |
| 2.3.2 Cu_(2-x)Se@MSNs-TPDOX的光响应性能 |
| 2.3.3 Cu_(2-x)Se@MSNs-TPDOX的治疗效果表征 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 硅藻土基因载体的制备 |
| 3.1 本章引论 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验仪器和药品 |
| 3.2.2 材料的合成 |
| 3.2.3 扫描电镜观测(SEM) |
| 3.2.4 粒径测量(DLS) |
| 3.2.5 细胞毒性实验 |
| 3.2.6 基因递送效率实验 |
| 3.2.7 凝胶阻滞电泳实验 |
| 3.2.8 基因转染 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 硅藻土基因载体的设计原理 |
| 3.3.2 滴定法测定叔胺含量 |
| 3.3.3 样品(Z2、Z4、Z6)的结构表征 |
| 3.3.4 样品(Z2、Z4、Z6)的生物性能 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究成果及发表的学术论文 |
| 作者和导师简介 |
| 附件 |
四、日本科学家开发新的基因载体（论文参考文献）
- [1]转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究[D]. 张婷. 扬州大学, 2021
- [2]AAV-NT3与运动对脊髓损伤后肢体痉挛的干预及新型基因载体AAV-CPP.16的初步构建[D]. 常宇鑫. 吉林大学, 2021(01)
- [3]BUD31和LAMP3在肿瘤基因剪接和免疫调控的作用[D]. 刘洪金. 北京协和医学院, 2021
- [4]基于铂前药的多功能基因载体用于肿瘤协同治疗[D]. 张庆飞. 中国科学技术大学, 2020(01)
- [5]特殊形貌多糖/无机复合纳米颗粒在肿瘤和抗感染治疗中的应用[D]. 闫列梅. 北京化工大学, 2020(02)
- [6]遗传资源立法保护中基因权研究[D]. 孙祺. 山东大学, 2020(02)
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