成人单倍体移植中的供体淋巴细胞输注剂量

一、成人单倍同一性移植中供者淋巴细胞输注的剂量（论文文献综述）

许慧敏,张素平,曹伟杰,李丽,张然,王怡然,万鼎铭^[1]（2021）在《人脐带间充质干细胞治疗难治性急性移植物抗宿主病的单臂临床研究》文中提出背景:异基因造血干细胞移植是众多血液系统疾病治愈的重要甚至唯一手段,但移植后急性移植物抗宿主病仍然是致死性并发症之一,且对于难治性急性移植物抗宿主病尚缺乏有效的标准化治疗。不少研究提示间充质干细胞可能通过免疫调节功能治疗急性移植物抗宿主病,但实际疗效尚缺乏足够临床证据支持。目的:探讨人脐带间充质干细胞治疗难治性急性移植物抗宿主病的疗效、安全性及与疗效有关的影响因素。方法:研究共入组难治性急性移植物抗宿主病24例患者,其中儿童8例,成人16例;Ⅱ度10例,Ⅲ-Ⅳ度14例,均在郑州大学第一附属医院造血干细胞移植中心用第三方来源人脐带间充质干细胞治疗,观察其疗效、输注相关不良反应、原发病复发、继发感染及长期生存情况。结果与结论:（1）脐带间充质干细胞中位输注总剂量2.7×106/kg[（2.02-6.00）×106/kg],中位输注次数2.5次（2-6次）,急性移植物抗宿主病发生与首次脐带间充质干细胞输注的中位间隔时间为12.5 d（8-36 d）;（2）首次脐带间充质干细胞应用后第28天的总体有效率为83%（20/24）,2年总体生存率33.3%;完全缓解组与部分缓解/无效组2年总体生存率分别为57%,0%（P <0.000 1）,两组在长期生存方面差异有显着性意义;（3）Ⅱ度难治性急性移植物抗宿主病的疗效优于Ⅲ-Ⅳ度（P=0.024）;年龄、急性移植物抗宿主病累及器官的部位及数量、原发疾病的类型、脐带间充质干细胞输注次数对疗效无显着影响;（4）结果表明,人脐带间充质干细胞治疗难治性急性移植物抗宿主病安全、有效。

王会平^[2]（2021）在《流式细胞术对CART细胞制备前起始T细胞的质量监测和筛选》文中指出背景嵌合抗原受体T细胞（Chimeric Antigen Receptor T Cells,CART Cells）治疗在治疗恶性肿瘤尤其是在血液系统恶性肿瘤中取得了令人瞩目的成果。国内外各个研究中心靶向CD19 CART细胞治疗复发/难治性白血病（Relapsed/Refractory Acute B Lymphocytic Leukemia,r/r B-ALL）的总缓解率（Overall Remission Rate,ORR）最高可达90%。截至目前为止,已有四款CART细胞产品被美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration）批准用于临床治疗各种复发难治性B细胞肿瘤。CART细胞治疗技术迅猛发展,随着数据的积累,其面临的问题也逐渐显现出来。例如患者缺乏相应的治疗靶点或者疾病进展迅速没有使用的时机;或者有靶点但无法在体外制备时获得治疗最低需求量的CART细胞;甚至有大约10-20%的患者即使成功制备足够数量的CART细胞,但是输注后出现免疫耐药,无法清除体内肿瘤细胞。导致上述情况出现的原因很多,其中一个重要的因素是用于制备CART细胞的“种子细胞”——即起始T细胞（The Starting T cells）数量不足或者功能下降。目前美国FDA批准用于临床治疗以及绝大多数临床试验使用的CART细胞产品都是源自患者自身的外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMC）。自体CART细胞的不足在于:（1）每个患者的情况不同,因而获得的CART细胞数量、组分和功能也是千差万别;（2）CART细胞制备过程复杂、制备周期长和费用昂贵等,而且不是每次都可以成功制备。特别是通过基因编辑的同种异体CART细胞技术不断发展,所以选择自体还是异体也成为研究者考虑的重要因素之一。然而究竟哪些患者适合自体CART细胞治疗,目前尚无统一的预测标准。目的通过采用多参数流式细胞术对患者起始T细胞的数量和功能及影响其质量的相关因素进行检测和分析,筛选出与CD19 CART细胞制备成功率和疗效有关的指标,建立一个快速准确的评估系统,从而能够早期预测CART细胞治疗的效果。材料和方法以自2015年12月起在我院行CART细胞治疗的复发/难治性B-ALL患者为研究对象。首先回顾性收集2015年12月至2019年6月期间在我院行CART细胞治疗患者采血时起始T细胞的数量以及多参数流式细胞术检测的传统免疫细胞亚群比例（如总T淋巴细胞、辅助性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞、B淋巴细胞、调节性T细胞和活化效应性T细胞等）,筛选出与CART细胞制备成功率和治疗疗效有关的指标,建立初步的评估系统;并采用2019年6月以后输注CART细胞患者的上述数据验证该评估系统的检验效能;其次筛查其它影响可能起始T细胞质量的指标,如各个细胞亚群上穿孔素和颗粒酶素B的比例、流式微球分析（Cytometric Bead Assay,CBA）法血清多种细胞因子（包括IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17、TNF-α、IFN-α、IFN-γ）的水平、外周血中肿瘤负荷情况、各个细胞亚群上PD-1和PD-L1比例以及起始T细胞中记性性T细胞的比例等,筛选出与CART细胞治疗效果有关的指标,制定评估起始T细胞质量的完整系统。本实验的数据分析处理软件包括Statistical Program for Social Sciences 19.0和Graphpad Prism6.0软件。结果1.CART细胞制备成功组起始T细胞的数量高于制备失败组（1560个/u L&495个/u L,P=0.033）,同样CART细胞治疗有效组起始T细胞的数量高于治疗无效组（1600个/u L&610个/u L,P=0.109）,表明起始T细胞数量是影响CART细胞治疗的重要因素。2.CART细胞制备成功组患者的淋巴细胞比例、CD4/CD8比值和B淋巴细胞比例均高于制备失败组（44.80±24.64&9.70±1.06,P=0.007;2.43±1.04&0.57±0.28,P=0.000;4.22±7.17&0.09±0.18,P=0.001）;而制备成功组的调节性T细胞比例低于制备失败组（6.57±3.58&11.02±3.53,P=0.041）,提示上述指标与CART细胞的制备成功率有关;而CART细胞治疗有效组的调节性T细胞为5.38±2.52,而治疗无效组则为11.06±4.37,两组之间有统计学意义（P=0.004）,表明调节性T细胞与CART细胞治疗效果有关。3.健康人T淋巴细胞各个亚群上均可检测到穿孔素和颗粒酶素B,结果显示NK细胞上穿孔素和颗粒酶素B最高,其占NK细胞的比例均值分别为76.56%（95%的置信区间范围为63.24-89.87）和71.32%（95%的置信区间范围为52.38-90.26）;其次为CD3+CD8+T细胞,两者占CD3+CD8+T细胞的比例均值分别为42.96%（95%的置信区间范围为31.55-54.37）和36.44%（95%的置信区间范围为23.71-49.17）;再次为NKT细胞,两者占NKT细胞比例的均值分别为55.11%（95%的置信区间范围为40.97-69.26）和38.27%（95%的置信区间范围为24.83-51.70）;而表达最低的CD3+CD4+T细胞,两者占CD3+CD4+T细胞比例的均值分别为39.08%（95%的置信区间范围为15.83-62.32）和9.67%（95%的置信区间范围为6.77-12.56）,提示T淋巴细胞的各个亚群都可能通过穿孔素/颗粒酶素B途径发挥细胞毒性作用。根据穿孔素和颗粒霉素B的生物学特点,穿孔素和颗粒霉素B比例小于95%置信区间的最低值则可认为其穿孔素和颗粒霉素B表达异常降低,进而影响T淋巴细胞的功能。4.流式CBA法检测细胞因子谱的检测方案成熟,已经检测了上百例白血病、淋巴瘤患者以及正常人血清中的包括IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17、TNF-α、IFN-α、IFN-γ在内的多种细胞因子,实验结果稳定可靠。采血时血清中细胞因子谱的变化可作为反映起始T细胞质量的指标之一。5.流式细胞术检测健康人不同淋巴细胞亚群上PD-1和PD-L1的表达,结果显示健康人总T淋巴细胞上PD-1和PD-L1比例均不高,其中CD3+T细胞上PD-1的比例（占CD3+T细胞比例）均值为2.96（95%的置信区间范围为1.92-4.00）,PD-L1的比例（占CD3+T细胞比例）均值为0.79（95%的置信区间范围为0.30-1.28）,因此本研究中每个指标高于95%的置信区间范围的上限即认为超出正常范围,具体如下:CD3+T细胞上PD-1的比例（占CD3+T细胞比例）>4.00%;CD3+CD4+T细胞上PD-1的比例（占CD3+CD4+T细胞比例）>4.49%;CD3+CD8+T细胞上PD-1的比例（占CD3+CD8+T细胞比例）>3.93%;Treg细胞上PD-1的比例（占Treg细胞）>1.69%;Teff细胞上PD-1的比例>2.86%;同时也建立了检测不同阶段的记忆性T细胞的实验方法,为筛选起始T细胞的质量和功能提供新的监测指标。6.利用现有的实验结果,筛选出与CART细胞治疗相关的指标,建立评估系统。现阶段纳入的主要指标包括:CD3+T细胞数目、淋巴细胞比例、CD4/CD8比值、Treg细胞比例、B淋巴细胞比例、外周血白血病细胞比例、CD3+CD8+T细胞上穿孔素和颗粒酶素B的比例、CD3+CD8+T细胞上PD-1和PD-L1的比例以及采集起始T细胞时细胞因子谱的变化。其它指标如记忆性T细胞和髓系来源抑制性细胞正在积累病例数,今后是否纳入评估系统,尚需进一步的数据支持。结论多参数流式细胞术对起始T细胞的数量和质量监测和筛查,与CD19 CART细胞的制备成功率和治疗效果密切相关,其中起始T细胞的数量、淋巴细胞比例、CD4/CD8比值、B淋巴细胞比例和Treg比例等指标具有重要的预测价值;而新型指标如少见细胞群中的CD3+CD4-CD8-T细胞和记忆细胞中Tscm的比例、各个淋巴细胞亚群上穿孔素和颗粒酶素B的比例、采血时血清中细胞因子谱变化、各个淋巴细胞亚群中耗竭性T细胞的比例也具有初步的意义,但尚须进一步验证其诊断价值。

李世俊,齐军元^[3]（2020）在《高危骨髓增生异常综合征的治疗》文中进行了进一步梳理骨髓增生异常综合征（MDS）是一类造血干细胞恶性克隆性疾病,其治疗主要集中在表观遗传学治疗、化疗、干细胞移植以及新药方面,现将各种治疗方法进行综述。

杜胜男^[4]（2019）在《定量检测微嵌合体对造血干细胞移植的意义分析》文中提出目的通过定量检测微嵌合体,并分析其动态变化,来早期观察异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）的早期植入情况和早期预测HSCT的复发风险,从而可以进行合适的干预治疗,以达到降低移植失败率的目的。同时对比脐血移植（CBT）和外周血干细胞移植（PBSCT）早期植入的规律。方法行allo-HSCT治疗多种恶性及非恶性难治性血液病15例。其中,中位年龄16岁（0.8-60岁）,中位体重42 kg（8-80 kg）。急性白血病（AL）5例,骨髓增生异常综合征（MDS）2例,再生障碍性贫血（AA）5例,重型β地中海贫血2例,湿疹血小板减少伴免疫缺陷综合征（WAS）1例。在15例患者中,行PBSCT有5例,输入的中位有核细胞数为85.60 x 10^7/kg（69.90-109.90 x 10^7/kg）,CD34+细胞计数为39.80 x 10^5/kg（30.70-49.40 x 10^5/kg）。而CBT有10例,输入的中位有核细胞数为8.91 x 10^7/kg（3.84-11.00 x 10^7/kg）,CD34+细胞计数为2.50 x 10^5/kg（1.34-4.57 x 10^5/kg）。收集患者移植后至少15天的外周血样本,使用插入或缺失多态性实时定量聚合酶链反应（Indel-qPCR）定量检测微嵌合体。结果15例患者中,15例（100%）获得了中性粒细胞植入和11例（73.3%）获得了血小板植入。13例患者通过微嵌合体的检测达到了完全供者嵌合（CDC）。在10名达到CDC并且没有混合嵌合增加（IMC）中,9名获得完全植入,1名中性粒细胞植入,血小板还未植入;3名达到CDC后出现1次IMC的患者中,中性粒细胞全部植入成功,血小板有2名成功植入;在2名出现多次IMC且始终未达到CDC的患者中,2名血小板未植入。在15例患者中,1例出现多次IMC的患者复发。在11例可评估的患者中,3例患者发生了II-IV级急性移植物抗宿主病（GVHD）。患者在存活超过100天的患者中,没有患者发生慢性GVHD。迄今为止,15名患者中有13名存活,中位生存时间为4.7个月（0.9-11.0月）。总生存率（OS）为86.7%。结论1.Indel-qPCR技术是一种有效的检测微嵌合体的方法,可以作为早期预测植入和复发风险的一种有效手段。2.通过对CBT和PBSCT的植入对比,虽然PBSCT血小板植入优于CBT,但是两者中性粒植入无明显不同,两者的总生存率也无明显不同,说明CBT可以作为治疗血液病的一种有效的手段。

方宝枝,何广胜^[5]（2011）在《抗人胸腺细胞免疫球蛋白的临床应用现状》文中研究说明抗人胸腺细胞免疫球蛋白（anti-human thymocyte globulin,ATG）可识别多种细胞表面蛋白,通过T细胞去除,降低白细胞的黏附和迁移,干扰树突状细胞功能以及诱导耐受性树突状细胞和调节性T细胞的产生等多种作用,ATG已被广泛应用于预防和治疗移植中的移植物排斥反应和移植物抗宿主病以及重型再生障碍性贫血中的免疫抑制治疗。

郝磊,陈幸华^[6]（2010）在《移植物抗宿主病的细胞治疗》文中研究表明

江波^[7]（2010）在《KIR基因簇KIR3DL1、KIR2DL1、KIR2DL2/3多态性研究》文中指出【背景与目的】供者杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）基因簇和受者人白细胞抗原（HLA）不匹配诱导的NK细胞异体反应可改善异基因造血干细胞移植的治疗效果。供者KIR和受者HLA I类分子发生错配时,KIR抑制基因KIR3DL1、KIR2DL1和KIR2DL2/3不能阻断NK细胞的细胞毒作用,而表现出异体反应直接杀伤受者的白血病细胞、T细胞和树突状细胞,进而降低白血病复发率、增加移植物存活率、降低急性移植物抗宿主病的发生率和严重程度。2002年Ruggeri等人在《Science》杂志报道后,陆续有多个血液中心进行类似的报道。KIR3DL1、KIR2DL1和KIR2DL2/3在基因水平、等位基因水平和受配体系统都具有极其复杂的多态性。目前国内实验室仅能在基因水平进行研究,尚不能在等位基因水平开展工作。国际上也仅少数几个实验室能够开展KIR基因DNA编码序列的分析研究工作,但是其方法仍不十分完善。为此我们在中国苏州大学附属第一医院和美国乔治城大学医学部探索KIR3DL1、KIR2DL1和KIR2DL2/3可靠的高分辨检测方法,并从基因水平、等位基因水平和受配体系统三个层面进行系统研究。【方法】第一部分90个蒙古族健康人群全血标本采集自内蒙古通辽市科尔沁草原牧区,提取DNA,以两组不同引物对KIR基因簇进行序列特异性引物聚合酶链反应（PCR-SSP）,同时设置阳性对照、阴性对照和空白对照,以GH或β-actin为内参。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。对少数两套引物扩增结果不一致的样本使用第三套引物进行确认。根据扩增的结果计算人群中KIR基因簇各基因的携带率、查询各个体的基因型、计算观察基因遗传的连锁不平衡现象。收集其他24个人群的相关数据,统计分析绘制主成分分析散点图和系统进化树。第二部分100名非裔美国人样本B细胞经EB病毒转染构建细胞株后,常规培养、提取DNA。设计特异性引物、摸索扩增条件对KIR3DL1和KIR2DL1进行大片段的扩增和测序。KIR2DL2/3DNA样本扩增前需先使用单倍型磁珠分离技术和/或限制性内切酶进行预处理,去除干扰测序结果的相似基因,再使用特异性引物进行大片段扩增和测序。第三部分高分辨测定非裔美国人HLA-A、HLA-B和HLA-C的等位基因结果,根据获得的NMDP编码查询各等位基因是否携带HLA-Bw4抗原决定簇和HLA-C1、C2的分组。对照KIR3DL1、KIR2DL1和KIR2DL2/3的实验结果分析受配体系统的多态性。第四部分根据KIR3DL1、KIR2DL1和KIR2DL2/3的高分辨结果,对疑似新等位基因的样本进行分离。使用等位基因特异性引物扩增、单倍型磁珠分离和PCR分子克隆技术对等位基因进行分离、扩增和测序,将获得的新等位基因序列向Genebank和WHO申报,申请新等位基因的命名。【结果】1、所有KIR基因均可在蒙古族人群中发现,其中框架基因KIR3DL2、KIR3DL3携带率为100%。一个样本缺失KIR2DL4基因。KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1携带率分别为93.3%、93.3%和95.6%,KIR2DL2的携带率较低为30.0%。KIR2DL2的携带率介于蒙古利亚人和高加索人之间。蒙古族人群中37.78%个体的基因型为AA,介于蒙古利亚人和高加索人之间。KIR2DL2和KIR2DS2存在连锁遗传关系,KIR2DL5、KIR2DS1、KIR2DS3和KIR2DS5之间也存在有连锁遗传关系。2、主成分分析作蒙古族人群和其他24个人群的散点图见高加索人包括欧洲人、欧裔美国人、阿根廷人、黎巴嫩人及中国的维吾尔族人在散点图中部聚集,蒙古利亚中的上海汉族、云南汉族、云南彝族、日本人、韩国人及新加坡汉族在散点图左侧聚集,而蒙古族人群则位于两大人种之间。Physical6.22系统进化软件包构建系统进化树也发现有类似现象。3、建立使用相互重叠、可以相互验证的大片段扩增测序方法,获得较满意的结果。KIR3DL1、KIR2DL1和KIR2DL2/3的测序结果和欧裔美国人的相关研究结果进行对照研究。非裔美国人中携带KIR3DL1的比例为99%,KIR3DL1*01501和KIR3DL1*01502是最常见等位基因。KIR3DL1*002, *00402, *008, *019,和*029存在于非裔美国人群中,说明了非裔美国人祖先移民美国后,经过数百年历史已逐步混入了其他种族的KIR3DL1等位基因。发现有3个样本携带有KIR3DL1*059,KIR3DL1*059为KIR3DL1和KIR3DL2的融合基因（KIR3DL1/2v）,有2个样本为KIR3DL1/2v的新等位基因需进行分离和分析。4、3%的非裔美国人未携带有KIR2DL1基因。42个样本携带有1个KIR2DL1基因或2个相同的等位基因,55个样本是不同等位基因的杂合子。KIR2DL1*00302和KIR2DL1*00401是非洲人群中最常见的等位基因,携带率分别是68%和22%,KIR2DL1*006, KIR2DL1*007在非裔美国人中携带率为11%和7%。5、非裔美国人中KIR2DL2*001携带频率较多,而KIR2DL2*003的携带率较低,KIR2DL2*00602为非洲人较特异的等位基因。KIR2DL3中KIR2DL3*001在非裔美国人和欧裔美国人中均占较高比例>60%,但是在非洲人中KIR2DL3*002中携带较低。6、19个样品中含有KIR3DL1基因但其HLA系统中不含有可和KIR3DL1结合的Bw4抗原决定簇。1个样本含有纯合的KIR3DL1*004,均不能诱导生成具有细胞毒作用的KIR3DL1+NK细胞。25%的样品中不含有HLA-C2组的等位基因,有32%的样品中不含有HLA-C1组的等位基因。43%的人既含有HLA-C1又含有HLA-C2组的等位基因。7、7个KIR3DL1新等位基因及11个KIR2DL1新等位基因被使用不同方法成功分离,测序获得全长DNA编码序列。【结论】1、从基因水平分析蒙古族人群的KIR基因簇多态性。蒙古族人群活化基因携带率高于蒙古利亚人低于高加索人;蒙古族人群haplotype AA基因型携带率低于蒙古利亚人,高于高加索人;统计学主成分分析和无根系统进化树证明见蒙古族人群介于高加索人和蒙古利亚两大人种之间。蒙古族人群似同时具备了高加索人和蒙古利亚的遗传特征。2、从等位基因水平分析研究KIR基因簇抑制基因在非裔美国人中的多态性。非裔美国人的KIR3DL1抑制基因等位基因水平的分布特征说明了非裔美国人和非洲人群有较近的亲缘关系。3、非裔美国人中有3个（3%）未携带有KIR2DL1基因。KIR2DL1*00302和KIR2DL1*00401是非洲人群中最常见的等位基因。4、非裔美国人中KIR2DL2*001携带频率较高,而KIR2DL2*003的携带率较低,KIR2DL2*00602为非裔美国人较特异的等位基因。KIR2DL3中KIR2DL3*001在非裔美国人中最为常见,KIR2DL3*002中携带较低。5、从KIR-HLA受配体水平分析和研究KIR基因簇受配体系统的多态性,发现了在非裔美国人中19%缺失HLA-Bw4抗原决定簇。25%的非裔美国人为两个HLA-Cw等位基因均为HLA-C1,32%的人HLA-Cw等位基因均为HLA-C2,只有43%的人既含有属于HLA-C1组的等位基因又含有属于HLA-C2组的等位基因。6、本研究成功发现和分离了7个KIR3DL1新等位基因和11个KIR2DL1的新等位基因,已成功申报Genebank,并获得WHO的正式命名。

郝磊^[8]（2010）在《人脐血源基质细胞对MHC半相合造血干细胞移植小鼠GVHD调节作用的研究》文中研究表明异基因造血干细胞移植（Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation,Allo-HSCT）是目前治疗恶性血液病的有效方法。HLA（Human Leucocyte Antigen）相合的亲缘相关或无关供者是Allo-HSCT最合适的供者。然而仅有25%～30%的患者能找到HLA相合的亲缘供者;在无亲缘关系人群中找到HLA相合供者的概率是1/5万1/10万,甚至更低。90%以上的患者能够找到HLA半相合的亲属（父母、子女、兄弟姐妹或堂表亲）供者,若能顺利跨越HLA限制,可为更多需接受移植治疗而无相合供者的患者获得治愈的机会。然而HLA半相合移植患者发生移植物抗宿主病（Graft Versus Host Disease,GVHD）的几率大约为80%左右（1）,GVHD是Allo-HSCT的主要并发症之一,是导致移植失败的重要原因。寻求安全有效的防治Allo-HSCT后GVHD的新措施成为临床关注的焦点。骨髓来源多能间充质基质细胞（multipotent mesenchymal stromal cells, MSC）主要生物学功能包括支持造血细胞的增殖、分化和成熟,同时也具有对免疫细胞的调节作用。大量动物模型和临床研究证实MSC对GVHD有一定的防治作用。但由于骨髓收集方法相对困难、MSC的多向分化潜能等均限制了其在临床的应用。本室采用CD34+细胞分选,结合Dexter培养分离出脐带血中另外一群非造血细胞:人脐血源基质细胞（hUCB-derived stromal cells,hUCBDSC）,且已经证实其具备体外支持造血的能力（3）。推测hUCBDSC可能具有和MSC相似的对免疫细胞调节作用的特性。本研究在构建MHC（Major Histocompability Complex）半相合移植小鼠GVHD模型基础上,着眼于启动GVHD异源反应的两个重要因素T细胞和DC细胞,从体外和体内探讨hUCBDSC的免疫调节作用以及可能机制。一、主要方法（一）体外实验1.采用6%明胶和1.077 g/L percoll分离液分离脐带血中的单个核细胞,磁珠分选CD34+细胞,含12.5%HS、12.5%FBS、10-6mol/L氢化可的松、10ng/mlSCF、10ng/ml bFGF的DMEM培养液培养hUCBDSC,37℃、5%CO2、饱和湿度恒温箱孵育。48h后全量换液,以后每周半量换液;待细胞融合度达到80%左右时,进行传代培养;2.采用流式细胞仪检测原代分离培养和冻存复苏后hUCBDSC细胞表面免疫分子HLA-Ⅰ、Ⅱ类分子,CD80,CD86,CD40和CD40L的表达率;3.采用70%percoll分离液和R&D systems公司的Mouse T cell Enrichment Columns进行小鼠脾脏T细胞的分选;4.分离小鼠骨髓单个核细胞后,rmGM-CSF和LPS诱导BM-DC的分化和成熟;5.将PHA或DC刺激的小鼠脾脏T细胞和不同浓度的hUCBDSC共培养, CCK-8检测细胞增殖情况;6.PHA刺激条件下小鼠T细胞和hUCBDSC共培养后,流式细胞仪检测T细胞的周期、凋亡、CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞（CD4+Treg）以及Th1/Th2亚群的变化。7.小鼠BM-DC和hUCBDSC共培养后,扫描电镜和透射电镜观察BM-DC形态和结构,流式细胞仪检测表面免疫分子MHC-Ⅱ、CD80、CD86的表达,CCK-8检测试剂盒检测其刺激异源T细胞增殖反应的能力。（二）体内实验1.受鼠C57BL/6×BALB/c F1接受750 cGy 60Coγ射线照射后4小时内经尾静脉注射供鼠C57BL/6来源的骨髓细胞BMC（1×107/只）、脾脏细胞SP（1×107/只）,建立MHC半相合造血干细胞移植小鼠急性GVHD模型;2.受鼠移植BMC和SP的同时或1w后输注hUCBDSC（1×107/只）,观察小鼠生存时间、GVHD临床表现和靶器官组织病理变化;3.细胞移植后1w、2w、3w和4w,流式细胞仪检测受鼠脾脏T细胞CD4+Treg、Th1/Th2亚群的比例和DC表面免疫分子MHC-II、CD80和CD86的表达。二、主要结果（一）体外实验1.hUCBDSC组成性高表达HLA-Ⅰ（84.1±2.9%）,几乎不表达HLA-Ⅱ（1.6±0.3%）类分子,共刺激分子CD80（0.8±0.1%）,CD86（0.8±0.1%）,CD40（0.6±0.1%）和CD40L（0.5±0.1%）。细胞冻存复苏不影响上述分子的表达;2.hUCBDSC并不会引起小鼠T细胞的增殖,相反,以剂量依赖性方式抑制PHA或DC刺激的小鼠T细胞增殖;3.在PHA刺激72h后,处于G1期的T细胞占62.1±3.7%,S期占35.6±2.7%。而当与hUCBDSC共培养时, 84.3±3.6%T细胞处于G1期,12.3±1.5%T细胞处于S期。两者比较有显着统计学意义（p<0.01）;4.PHA刺激单独培养的T细胞和与hUCBDSC共培养的T细胞中早期凋亡细胞的比例无明显差别（p>0.05）;5.和单独培养的T细胞比较,与hUCBDSC共培养的T细胞中CD4+Treg亚群所占的比例显着增高（1.2±0.3% vs 12.1±1.4%,p<0.01）;6.在PHA刺激时,T细胞单独培养或与hUCBDSC共培养5天后, Th1/Th2的比例分别为1.4±0.1%和0.7±0.1%,两者之间比较具有显着统计学意义（p<0.01）;7.当BM-DC和hUCBDSC共培养时,电镜观察其表面突起显着减少,细胞器也不丰富。表面免疫分子MHC-II、CD80和CD86的表达显着降低,且其刺激异源T细胞增殖的能力也显着降低。（二）体内实验1.受鼠C57BL/6×BALB/c F1接受750 cGy TBI后输注供鼠C57BL/6来源的BMC和SP后,通过对生存期、临床表现和组织病理的观察,证实成功构建了MHC半相合HSCT小鼠GVHD模型;2.细胞移植后4h内或1w后输注hUCBDSC,小鼠长期生存率从20%分别提高到60%和40%,显着降低了小鼠GVHD临床评分和组织病理评分;3.细胞移植后各时相点流式细胞仪分析受鼠脾脏T细胞亚群和DC的变化,输注hUCBDSC的受鼠脾脏CD4+Treg比例增高、Th1/Th2亚群比值降低、DC表面免疫分子MHC-II、CD80和CD86的表达降低。三、结论1.hUCBDSC体外具有低免疫源性的特点,可以抑制PHA或DC刺激的小鼠T淋巴细胞的增殖。可能的作用机制包括阻止T细胞从G1期进入S期,诱导CD4+Treg的产生,降低Th1/Th2亚群的比例和对BM-DC成熟的影响。2.hUCBDSC可以延长MHC半相合造血干细胞移植后小鼠的生存期,减轻GVHD临床表现和靶器官组织病理变化,这可能与体内CD4+Treg的增多、Th1/Th2极化,以及不成熟DC的产生有关。

王丁^[9]（2010）在《CD14+单核细胞增强人脐带间充质干细胞的免疫抑制作用》文中提出背景：间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC）是存在于多种组织中的一种具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞。因其具有易于分离扩增、多向分化、造血支持、低免疫原性和免疫调节等特性,而成为组织工程和再生医学中理想的种子细胞。目前,试验研究和治疗性临床应用均以成体骨髓来源的间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell, BM-MSC）作为研究对象。但成人骨髓间充质干细胞（hBM-MSC）存在来源有限、取样时要进行侵袭性操作以及间充质干细胞的绝对数量和增殖分化能力会随着供者年龄增加而下降等不足,急需科研人员寻找一种新的更具优势的替代细胞。大量的实验研究表明,人脐带间充质干细胞（human umbilical cord matrix stem cell, hUC-MSC）具有以下不可比拟的优势：第一,利用胎儿分娩后的废弃物,组织来源广泛,无伦理学限制；第二,具有更强的增殖能力,易于长期培养,经体外扩增可获得丰富的细胞；第三,具有成体干细胞和胚胎干细胞（embryonic stem cell, ESC）的双重表面标记；第四,连续多次传代后仍然维持干细胞特性。因此,人脐带间充质干细胞作为细胞治疗中一种非常有希望的干细胞替代来源,具有无限的潜力和广泛的临床应用前景,而其免疫学特性正是细胞治疗成功与否的决定性因素。目的：淋巴细胞（lymphocyte）和单核细胞（monocyte）是外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells, PBMC）重要的组成部分。本研究旨在揭示人脐带间充质干细胞、T淋巴细胞以及单核细胞三者之间的相互作用关系及其机制,为人脐带间充质干细胞的临床应用提供必要的理论基础。方法：（1）应用流式细胞技术检测成人骨髓间充质干细胞和人脐带间充质干细胞的免疫表型以及胚胎干细胞的全能标志物。（2）在诱导体系中,定向诱导人脐带间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化,用油红0染色、Von Kossa染色、茜素红染色以及二型胶原组化染色观测脂滴形成、钙盐沉积和二型胶原合成情况以鉴定人脐带间充质干细胞的多向分化潜能。（3）体外建立人脐带间充质干细胞和CD4+／CD8+T淋巴细胞的共培养体系以及人脐带间充质干细胞、CD4+／CD8+T淋巴细胞和CD14+单核细胞的三者共培养体系。利用流式细胞技术（Brdu掺入试验）检测T淋巴细胞的增殖情况,并且用酶联免疫吸附试验试剂盒检测其IFN-γ（interfern-γ）的分泌水平,从而反映人脐带间充质干细胞对活化后的T淋巴细胞的免疫抑制作用以及CD14+单核细胞对于这一作用的影响。（4）用transwell培养板培养人脐带间充质干细胞和CD4+／CD8+T淋巴细胞以研究人脐带间充质干细胞发挥免疫抑制作用是否需要细胞直接接触。（5）外源添加TGF-β（transforming growth factor-β）单克隆中和抗体、吲哚胺2,3-双加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO）特异性抑制剂1-M-Trp、一氧化氮（N0）合酶竞争性抑制剂L-NMA和前列腺素E2（prostaglandin E2, PGE2）合成抑制剂NS-398（环氧化酶-2选择性抑制剂）和吲哚美辛（环氧化酶非选择性抑制剂）,以IFN-γ的分泌水平作为评价指标,鉴定介导人脐带间充质干细胞免疫抑制作用的可溶性因子。（6）通过添加外源性PGE2并且应用ELISA试剂盒检测人脐带间充质干细胞和CD4+／CD8+T淋巴细胞共培养体系中PGE2的水平佐证PGE2是否中介人脐带间充质干细胞的免疫抑制作用。（7）制备CD3／CD28抗体交联磁珠（anti-CD3/CD28 Dynabeads）活化的CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和外周血单个核细胞三种条件培养基,用ELISA试剂盒检测条件培养基中IFN-γ、TNF-α（tumor necrosis factor-a）、IL-1β（interleukin-1β）和IL-6（inter-leukin-6）的水平。同时应用ELISA方法对以上三种条件培养基以及四种因子的重组蛋白刺激前后,人脐带间充质干细胞分泌PGE2的水平进行定量检测,以明确人脐带间充质干细胞产生PGE2的驱动因子。（8）外源重组IL-1β刺激人脐带间充质干细胞,应用Real-time PCR方法检测环氧化酶-2（cyclooxygenase, COX-2）的表达并用ELISA试剂盒检测PGE2的分泌水平。（9）利用几种特异性的信号通路蛋白抑制剂：PD98059为细胞外信号调节激酶（extra-cellular signal-regulated kinase, ERK）特异性抑制剂、SB203580为p38丝裂原活化蛋白激酶（p38mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK）特异性抑制剂、SP600125为c-Jun氨基末端激酶（c-jun-N-terminal kinase, JNK）特异性抑制剂、H89为蛋白激酶A（protein kinase A, PKA）特异性抑制剂、Wortmannin为磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylnsitol 3-kinase, PI3K）特异性抑制剂、IKK-NBD肽为NF-κB特异性抑制剂、Go6983和Go6976为蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）特异性抑制剂来初步确定IL-1β激发人脐带间充质干细胞产生PGE2的信号通路相关蛋白。（10）应用ELISA试剂盒检测CD14+单核细胞加入人脐带间充质干细胞与CD4+／CD8+T淋巴细胞共培养体系前后,上清中IL-1β和PGE2的含量。（11）利用流式细胞技术（Brdu掺入试验）和ELISA试剂盒检测IL-1受体拮抗剂（IL-1 receptor antagonist,IL-1RA）加入人脐带间充质干细胞、CD4+／CD8+T淋巴细胞和CD14+单核细胞的三者共培养体系前后,T淋巴细胞的增殖情况、IFN-γ的分泌水平以及PGE2的含量,以进一步研究单核细胞是否通过分泌IL-1β促进人脐带间充质干细胞产生PGE2,从而增强人脐带间充质干细胞的免疫抑制作用。结果：（1）人脐带间充质干细胞与成人骨髓间充质干细胞免疫表型相似,但人脐带间充质干细胞高表达胚胎干细胞标志物OCT4和SSEA-4。（2）在特定的诱导条件下,人脐带间充质干细胞具有向脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞三系分化的能力。（3）人脐带间充质干细胞能够抑制CD3／CD28抗体交联磁珠活化的CD4+／CD8+T淋巴细胞的增殖以及IFN-γ的分泌,而且CD14+单核细胞能够增强人脐带间充质干细胞的这一抑制作用。（4）人脐带间充质干细胞发挥免疫抑制作用并不依赖于细胞间的直接接触。PGE2合成抑制剂能够显着反转人脐带间充质干细胞的免疫抑制作用；而外源性PGE2能够模拟人脐带间充质干细胞的免疫抑制作用。（5）炎症因子IFN-γ和IL-1β均能驱动人脐带间充质干细胞产生PGE2。ERK、p38-MAPK和JNK的特异性抑制剂能够显着下调IL-1β诱导的PGE2的分泌。（6）CD14+单核细胞能够显着上调人脐带间充质干细胞与CD4+／CD8+T淋巴细胞共培养上清中IL-1β以及PGE2的水平,并且上调的幅度与单核细胞的数量呈正相关。（7）IL-1RA能够下调人脐带间充质干细胞、CD4+／CD8+T淋巴细胞和CD14+单核细胞三者共培养上清中PGE2的水平,同时显着逆转T淋巴细胞的增殖活力以及IFN-γ的分泌水平。结论：CD14+单核细胞通过分泌炎症因子IL-1β,经由MAPK信号通路显着上调人脐带间充质干细胞中PGE2的表达,从而增强人脐带间充质干细胞对活化CD4+／CD8+T淋巴细胞的免疫抑制作用。背景：间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC）以其卓越的免疫调节能力,日益成为广大科研人员关注的热点。经体内外大量研究证实,间充质干细胞能够调控T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、树突状细胞、巨噬细胞等多种免疫细胞的功能,为治疗免疫相关疾病以及自身免疫性疾病带来了曙光。人胎儿脐带基质来源的间充质干细胞（human umbilical cord matrix stem cell, hUC-MSC）不仅具有许多独特的优势,而且像骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell, BM-MSC）一样,能够高效调节T淋巴细胞的活性和功能。目的：人脐带间充质干细胞能够分泌多种生长因子和细胞因子。本研究旨在揭示人脐带间充质干细胞产生IL-6的机制,以及IL-6在人脐带间充质干细胞影响肿瘤细胞增殖过程中的作用。方法：建立人外周血单个核细胞（hPBMC）和人脐带间充质干细胞的共培养体系以观察两种细胞之间的相互作用。制备多种条件培养基并建立人脐带间充质干细胞的单独培养体系,以研究可溶性因子对IL-6分泌的影响。用ELISA定量检测培养上清中IL-6、IL-1β和PGE2的水平。应用工L-1受体抑制剂和多种信号通路抑制剂确定CD14+单核细胞是否通过分泌IL-1β而上调IL-6的表达以及相关的信号通路。Western blot用以检测NF-KB的活化。用流式细胞仪检测肿瘤细胞Brdu的掺入情况,以证实人脐带间充质干细胞是否能够影响肿瘤细胞的增殖,同时评估IL-6在这一过程中的作用。结果：（1）共培养体系中IL-6的浓度与人脐带间充质干细胞的数量呈正相关,并随着共培养时间的延长而呈进行性富集。（2）IL-6主要由人脐带间充质干细胞分泌。（3）CD14+单核细胞通过释放IL-1β诱导人脐带间充质干细胞产生IL-6。（4）PGE2并不参与诱导人脐带间充质干细胞分泌IL-6。（5）c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号通路及转录因子NF-κB均与IL-1β诱导人脐带间充质干细胞表达IL-6紧密相关。（6）由IL-1β刺激人脐带间充质干细胞所制备的条件培养基能够促进MCF-7细胞的增殖,但IL-6中和抗体部分逆转了这一促进效应。（7）木犀草素以剂量依赖性的方式显着抑制人脐带间充质干细胞IL-6的分泌。结论：（1）CD14+单核细胞释放的IL-1β经由c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号通路活化转录因子NF-κB,从而诱导人脐带间充质干细胞产生IL-6。（2）IL-6中介人脐带间充质干细胞对MCF-7细胞增殖的促进作用。（3）木犀草素以剂量依赖性方式显着抑制人脐带间充质干细胞IL-6的分泌。

王明^[10]（2010）在《免疫抑制剂及凋亡细胞诱导移植免疫耐受的实验研究》文中研究表明研究背景：器官移植是目前治疗器官终末期疾病的最有效的治疗措施,但是移植术后的排斥反应仍是阻碍患者和移植物长期存活的主要原因,传统免疫抑制剂的应用虽然能够有效地抑制急性排斥反应,但是在移植物的慢性排斥方面仍是不能解决其根本原因,并且长期服用免疫抑制剂会增加患者感染、中毒、肿瘤等疾病的发生率,且费用昂贵。因此,解决器官移植术后排斥反应的关键在于诱导受者对供者移植物的免疫耐受,免疫耐受是机体免疫系统在接触某种抗原后所产生的对该抗原的特异性免疫无应答状态,一旦此种免疫无应答状态形成后便无需任何免疫抑制剂维持,从而从更本上解决移植后的排斥反应,达到移植物与宿主能够长期共存的目的。但是,目前摆在移植免疫学界的难题就是如何才能够诱导受者的移植免疫耐受?据此孙尔维等人提出了利用供体凋亡细胞诱导受者免疫耐受的假说。该假说认为凋亡细胞能主动性地调节机体的免疫功能,凋亡细胞通过给其APC主动性地传递吞噬信号"eat me signal"使得吞噬细胞能够快速摄取凋亡细胞并将其所携带的供者抗原被特异性地浓集与受者APC内,从而短时间内提供大量供者MHC抗原,有效地被受者APC提呈给T细胞,最终促进调节性T细胞（Treg）的产生,抑制辅助性T细胞的产生来诱导机体的免疫耐受。国外Fsdok等人也发现巨噬细胞大量吞噬凋亡细胞时,可以抑制一些炎性因子的分泌,促进了TGF-β、IL-10等一些免疫调节因子的产生。Voll等人发现在细菌脂多糖刺激外周血淋巴细胞的反应中加入凋亡细胞不仅能够抑制IL-2、IL-1B、TNF-α等炎性因子的分泌,而且能够促进免疫抑制因子IL-10的产生。本课题组已经成功建立了供者凋亡细胞预输注诱导小动物心脏、肝脏移植免疫耐受模型,但是单纯输注凋亡细胞对大动物的移植模型诱导免疫耐受的作用并不明显,同样,国内外众多学者对诱导成年大动物移植免疫耐受进行了多次尝试,均没有理想的结果,但是凋亡细胞联合免疫抑制剂对大动物移植免疫耐受的诱导实验尚未见报道。目前就如何建立成年大动物和临床诱导免疫耐受已经成为了移植免疫学界的主攻方向和目标。因为大动物免疫系统比较复杂,排斥反应强烈,且购买及饲养价格都比较昂贵,故本课题欲先采用小鼠建立皮肤移植模型,小鼠皮肤移植模型排斥反应较为强烈,并且小鼠免疫系统简单,易操作,费用较为低廉,给受者小鼠预输注凋亡细胞并联合低剂量的免疫抑制剂诱导其免疫耐受,并通过检测其在不同免疫抑制剂作用下的全血中细胞因子的变化来探讨其机制和原理,为下一步大动物和临床诱导免疫耐受做一个探索性研究。本课题为国家自然科学基金（供者凋亡细胞诱导移植免疫耐受的机制）资助项目。本实验利用同种异基因小鼠皮肤移植作为移植模型,皮肤移植是目前可行的器官移植中排斥反应最为强烈的模型,因观察周期短,操作简便,手术成功率高,可控性强等诸多优点而被广泛应用于移植模型的建立；凋亡细胞的制备有多种方法,目前一般采用紫外线照射、抗体诱导、化疗药物诱导、射线诱导、激素诱导等方法,本实验采取地塞米松药物诱导法。地塞米松作为糖皮质激素类药物具有调节细胞生长、发育、死亡以达到维持机体组织细胞平衡稳定的作用。地塞米松诱导淋巴细胞及其它免疫细胞的凋亡较其它方法稳定、易操作已有较多文献报道。第一部分地塞米松诱导供体胸腺细胞的凋亡的初步研究目的：摸索使用地塞米松作为诱导剂对小鼠胸腺细胞凋亡的诱导作用,为下一步实验找到一种稳定性高、可控性强、凋亡率高的诱导方法。方法：将健康成年小鼠胸腺研磨制成细胞悬液,用血球计数板计数后用RPMI-1640完全培养基（含10%胎牛血清）调整细胞浓度为1×106／ml,将所获细胞分装进4个培养皿中进行不同处理：一组置于紫外线灯下20cm处直接照射15分钟后5%C02孵箱37℃恒温培养4小时。另外三组分别加入浓度为1×10-7M、2×10-5M、2×10-3M的地塞米松后置于5%CO2孵箱37℃恒温培养6小时；将处理后的四组胸腺细胞悬液用Annexin V-PI试剂双染后,用流式细胞仪检测胸腺细胞的凋亡和坏死。结果：1、不同浓度地塞米松处理后的小鼠胸腺细胞凋亡率略有不同,经1×10-7M浓度的DEX处理BALB/C小鼠胸腺细胞后,用流式细胞仪检测其凋亡率为53.72%；经2×10-SM浓度的DEX处理BALB/C小鼠胸腺细胞后,检测其凋亡率为58.46%；经2×10-3M浓度的DEX处理BALB/C小鼠胸腺细胞后,测得其凋亡率为55.72%。2、在紫外线灯下20cm处直接照射15分钟后用5%CO2孵箱37℃恒温培养4小时后的小鼠胸腺细胞,测得其凋亡率为50.29%,；结论：用地塞米松诱导小鼠胸腺细胞凋亡过程复杂、耗时较长,而紫外线照射法操作简便、耗时短。但是用地塞米松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡率要高于紫外线照射法,且坏死细胞较少,结果稳定,容易控制,因2×10-5M浓度的DEX处理BALB/C小鼠胸腺细胞凋亡率最高,故下一步实验给受者小鼠注射凋亡细胞采取2×10-5M浓度的地塞米松诱导。第二部分免疫抑制剂及凋亡细胞对诱导小鼠皮肤移植免疫耐受的试验研究目的：探索供体凋亡细胞与免疫抑制剂对小鼠皮肤移植免疫耐受的作用方法：1、制备供体小鼠的胸腺凋亡细胞：采用研磨法获得供者小鼠的胸腺淋巴细胞悬液,经2×10-5M DEX处理后放入5%C02孵箱37℃恒温培养6小时后,获取供体小鼠的胸腺凋亡细胞用Annexin V-PI试剂双染后,流式细胞仪检测胸腺细胞的凋亡率；2、实验分组：将受者小鼠随机分为四组：PBS对照组、凋亡细胞组、雷帕霉素（RAPA）组、RAPA+凋亡细胞联合组。输注供体胸腺凋亡细胞组别的受者小鼠分别在术前7、3、1天经阴茎背静脉输注供体小鼠的凋亡细胞悬液；接受药物处理的受者小鼠在术前3天开始灌胃给予RAPA药物,1次／d,直到所有移植皮片完全坏死时停药；3、建立小鼠背对背皮肤移植模型：将修好的供者小鼠背部皮片采用6-8针间断垂直褥式外翻缝合固定在受者小鼠背部,盖上无菌敷料后创可贴加压包扎；4、术后观察：在行皮肤移植术后第5天打开包扎观察移植皮片存活情况,若植皮与宿主的背底部愈合,色泽一致,无炎症和充血,有毛的皮肤毛发生长良好,则认为未发生排斥反应.50%以上皮片结痂、变硬、坏死、脱落作为排斥标准。结果：1、自体皮肤移植（手术控制组）45例,皮片存活时间>1月的存活率为95%（43／45）；2、受者小鼠术前分别预输注一次、两次、三次凋亡细胞比较移植皮片存活时间没有统计学差异P>0.05,但是输注三次凋亡细胞的受者小鼠移植皮片存活时间呈明显延长趋势；3、C57—>Babl/C小鼠背—背皮肤移植手术82例,其中PBS组18例,平均存活时间6.8天；凋亡组共20例平均存活时间7.4天；RAPA组共行手术22例,平均存活时间10.36天；RAPA联合凋亡细胞组共行22例,平均存活时间10.68天。用Kaplan-Meier统计方法分析后PBS对照组与凋亡细胞组移植皮片存活时间比较无统计学差异（P>0.05）; RAPA组与PBS组比较有显着性统计学差异（P<0.01）;RAPA+凋亡细胞联用与单纯使用RAPA组比较无统计学差异（P>0.05）;4、Babl/C—> C57小鼠小鼠背—背皮肤移植手术78例,其中PBS组共18例,平均存活时间6.5天；凋亡组共20例,平均存活时间7.3天；RAPA组共行手术19例,平均存活时间10.42天；RAPA联合凋亡细胞组共行21例,平均存活时间10.52天。用Kaplan-Meier统计方法分析后PBS组与凋亡细胞组移植皮片存活时间比较无统计学差异（P>0.05）,但是凋亡组较PBS组移植皮片呈延长趋势；RAPA+凋亡细胞联用与单纯使用RAPA组比较无统计学差异（P>0.05）。结论：1、分别输注1次、2次、凋亡细胞均对小鼠皮肤移植存活时间无明显延长,但是输注3次凋亡细胞对移植物存活时间有着明显的延长趋势；2、凋亡细胞对诱导同种异基因小鼠皮肤移植免疫耐受作用不明显。3、低剂量免疫抑制剂能够延长同种异基因小鼠的皮肤移植存活时间；4、免疫抑制剂联合凋亡细胞的协同作用在小鼠皮肤移植模型上效果不明显。第三部分：不同免疫抑制剂对全血中细胞因子分泌的机制研究目的：研究不同免疫抑制剂对全血细胞中不同细胞因子分泌的影响。方法：1.取样：取健康成人外周血加入不同浓度的免疫抑制剂培养6 h后加入10μl浓度为0.15μg／ml的佛波酯（PMA）和10μl浓度为2.5 gg／ml的离子霉素（IONO）,再培养6 h（37℃,5% CO2）后离心（300 G,5 min）,收集上清待测;2.利用用Bio-Plex悬浮蛋白芯片系统检测细胞因子的变化,比较不同免疫抑制剂组细胞因子的水平。3.统计：采用SPSS10.0统计分析软件对数据进行统计分析。采用单向方差分析和LSD检验比较实验组与对照组之间的差异,P<0.05有统计学意义结果：高浓度,中浓度的地塞米松（DEX）及环孢素A （CsA）都能有效抑制MCP-1的分泌,而他克莫司（FK506）和麦考酚酸（MPA）不能有效抑制细胞因子的分泌。结论：DEX和CsA可有效抑制MCP-1的分泌,而FK506和MPA对MCP-1的分泌没有影响。

二、成人单倍同一性移植中供者淋巴细胞输注的剂量（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、成人单倍同一性移植中供者淋巴细胞输注的剂量（论文提纲范文）

（2）流式细胞术对CART细胞制备前起始T细胞的质量监测和筛选（论文提纲范文）

（3）高危骨髓增生异常综合征的治疗（论文提纲范文）

（4）定量检测微嵌合体对造血干细胞移植的意义分析（论文提纲范文）

（6）移植物抗宿主病的细胞治疗（论文提纲范文）

（7）KIR基因簇KIR3DL1、KIR2DL1、KIR2DL2/3多态性研究（论文提纲范文）

（8）人脐血源基质细胞对MHC半相合造血干细胞移植小鼠GVHD调节作用的研究（论文提纲范文）

（9）CD14+单核细胞增强人脐带间充质干细胞的免疫抑制作用（论文提纲范文）

（10）免疫抑制剂及凋亡细胞诱导移植免疫耐受的实验研究（论文提纲范文）

四、成人单倍同一性移植中供者淋巴细胞输注的剂量（论文参考文献）

• [1]人脐带间充质干细胞治疗难治性急性移植物抗宿主病的单臂临床研究[J]. 许慧敏,张素平,曹伟杰,李丽,张然,王怡然,万鼎铭. 中国组织工程研究, 2021(31)
• [2]流式细胞术对CART细胞制备前起始T细胞的质量监测和筛选[D]. 王会平. 安徽医科大学, 2021(01)
• [3]高危骨髓增生异常综合征的治疗[J]. 李世俊,齐军元. 肿瘤防治研究, 2020(12)
• [4]定量检测微嵌合体对造血干细胞移植的意义分析[D]. 杜胜男. 东南大学, 2019(05)
• [5]抗人胸腺细胞免疫球蛋白的临床应用现状[J]. 方宝枝,何广胜. 国际输血及血液学杂志, 2011(05)
• [6]移植物抗宿主病的细胞治疗[J]. 郝磊,陈幸华. 重庆医学, 2010(22)
• [7]KIR基因簇KIR3DL1、KIR2DL1、KIR2DL2/3多态性研究[D]. 江波. 苏州大学, 2010(06)
• [8]人脐血源基质细胞对MHC半相合造血干细胞移植小鼠GVHD调节作用的研究[D]. 郝磊. 第三军医大学, 2010(12)
• [9]CD14+单核细胞增强人脐带间充质干细胞的免疫抑制作用[D]. 王丁. 中国协和医科大学, 2010(09)
• [10]免疫抑制剂及凋亡细胞诱导移植免疫耐受的实验研究[D]. 王明. 南方医科大学, 2010(04)

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