一、急性髓性白血病多药耐药基因的表达及其临床意义（论文文献综述）
赵欢[1]（2020）在《复方浙贝颗粒逆转小鼠急性淋巴细胞白血病多药耐药的研究》文中指出急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia,ALL）是造血系统常见的恶性肿瘤,以克隆性增殖异常分化的恶性细胞浸润骨髓、血液及其他组织为特点,是全球最常见的儿童恶性肿瘤之一,约占成人白血病的20%。化疗、造血干细胞移植及生物靶向治疗是其主要手段,目前的化疗使将近80%的患者缓解期达到10年以上,随着复发现象的发生,最终治愈率约为25～40%[1]。骨髓移植及多药联合强化治疗方案的应用,ALL临床治愈率进一步提高,但仍有一些患者治疗效果不佳,研究表明,白血病细胞对化疗药物耐药是ALL复发和难治的重要因素[2-4]。因此发现逆转ALL多药耐药的药物对增加化疗药物的敏感性,提高临床疗效具有重要意义。复方浙贝颗粒是我科陈信义教授针对急性白血病“痰瘀互阻”基本病机拟定的针对白血病复发难治的中药复方,在前期大量的临床研究中发现,复方浙贝颗粒联合化疗可减轻急性髓系白血病（AML）患者的临床症状,提高临床缓解率,并在基础研究中证实复方浙贝颗粒可以降低AML多药耐药相关耐药蛋白和基因的表达,从而提高化疗敏感性,对AL的治疗具有重要意义,为验证复方浙贝颗粒是否在ALL的治疗中具有类似的机制,我们复制了小鼠ALL耐药模型,从药效学和逆转多药机制的角度观察复方浙贝颗粒的有效性,为临床用药提供理论依据。目的1.构建L1210/CDDP皮下移植瘤小鼠模型,从药效学和多药耐药机制角度观察复方浙贝颗粒对急性淋巴细胞白血病的作用。2.构建L1210/CDDP尾静脉小鼠模型,从药效学探讨复方浙贝颗粒对尾静脉模型小鼠的治疗作用。方法1.L1210/CDDP细胞经维持耐药培养,于小鼠右腋下注射细胞1×106个构建荷瘤ALL模型,观察复方浙贝颗粒对该模型小鼠的治疗作用。2.应用real-time PCR方法观察复方浙贝颗粒对荷瘤ALL小鼠瘤块组织Mdr-1基因表达的影响;免疫组化法观察复方浙贝颗粒对荷瘤ALL小鼠瘤块组织p-gp、GST、TopoⅡ、Bcl-2、Bax 表达的影响。3.构建L1210/CDDP尾静脉模型,观察复方浙贝颗粒对L1210/CDDP尾静脉模型小鼠的治疗作用。结果1.注射细胞7天后成功复制L1210/CDDP模型,复方浙贝颗粒联合顺铂干预后可减小荷瘤小鼠的肿瘤体积,减轻瘤质量,增加抑瘤率,并延长生命时长。2.与模型组比较,CDDP 组 Mdr-1、p-gp、Topo Ⅱ、bax 表达升高,GST、Bcl-2 表达降低,（P<0.05）。与CDDP组比较,中剂量复方浙贝组、中剂量联合组Mdr-1表达升高;中剂量复方浙贝组、低、中、高剂量联合组P-gp表达升高;高剂量联合组TopoⅡ表达升高;中剂量复方浙贝组、低剂量联合组GST表达升高,中、高剂量联合组GST表达降低;中剂量复方浙贝组Bcl-2表达升高,高剂量联合组Bcl-2表达降低;中剂量联合组Bax表达升高（P<0.05）。3.尾静脉注射L1210/CDDP细胞21d后,随机抽取6只小鼠,取骨髓,作涂片,观察计算原始细胞比例在5～15%之间。外周血未见骨髓原始细胞外排,与正常对照组相比,模型组白细胞计数、血小板数降低（P<0.05）;与模型组相比,低剂量联合组生存期延长、骨髓原始细胞比例降低（P<0.05）;与CDDP组相比,低剂量联合组血红蛋白含量、白细胞计数、血小板计数升高（P<0.05）。结论复方浙贝颗粒联合顺铂可延长L1210/CDDP荷瘤小鼠生存期,减小肿瘤质量、体积,增加肿瘤抑制率;对于L1210/CDDP尾静脉模型可延长小鼠生命期、降低骨髓原始细胞比例,保护血象,从而起到治疗作用,即可以提高两种ALL耐药模型治疗效果并可通过Mdr-1、P-gp、GST、Bcl-2、Bax机制逆转L1210/CDDP多药耐药,增强化疗有效性。
仇宝玲[2]（2014）在《多药耐药相关蛋白（MRPs）基因家族在儿童急性淋巴细胞白血病中的表达模式及其临床意义》文中研究表明本论文包括三个部分：（一）多药耐药相关蛋白（MRPs）基因家族6个家族成员（MRP1-6）基因荧光定量RT-PCR的优化；（二）儿童急性淋巴细胞白血病MRP1的表达及意义；（三）儿童急性淋巴细胞性白血病MRP2-6的表达及意义。第一部分多药耐药相关蛋白（MRPs）基因家族荧光定量RT-PCR的优化目的：通过定量PCR技术检测MRP1-6基因mRNA在白血病细胞株中的表达水平，优化荧光定量RT-PCR的条件，鉴定引物的特异性，为研究MRP1-6基因在儿童急性淋巴细胞性细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia, ALL）中的表达及意义提供基础。方法：培养和收集3株白血病细胞株为模板，提取总RNA，逆转录合成cDNA，优化实时定量RT-PCR条件，通过测定MRP1-6基因在各个细胞株中的表达水平和溶解曲线分析，鉴定MRP1-6基因引物的特异性。结果：MRP1-6基因引物具有特异性，通过优化荧光定量RT-PCR条件为研究MRPs在儿童ALL中的表达奠定了基础。第二部分儿童急性淋巴细胞白血病MRP1基因的表达及临床意义目的：多药耐药相关蛋白基因（multidrug resistance associated protein-1，MRP1）在多种肿瘤中高表达，与肿瘤多药耐药具有密切相关性。通过定量PCR检测儿童急性淋巴细胞细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）MRP1基因mRNA的表达水平，分析其在儿童ALL中的表达特点及临床意义。方法：收集2013年期间在苏州大学附属儿童医院诊断和治疗的ALL患儿146例（初诊=67例，完全缓解=70例，复发=9例），10例特发性血小板减少性紫癜（idiopathicthrombocytopenic purpura，ITP）患儿骨髓为对照。应用定量RT-PCR方法检测MRP1基因的表达水平，利用SPSS18统计学软件，分析MRP1基因表达水平与儿童ALL临床预后指标的相关性。结果：（1）初诊组和复发组MRP1的中位表达水平分别为5.82和8.49，明显高于完全缓解组（1.99），P值均＜0.05；其中复发组表达水平最高。（2） MRP1的表达水平与ALL危险程度具有密切相关性，低危组表达水平最低、中危组居中、高危组最高，中位数依次为4.28、5.62和7.56，中危组与标危组、高危组与标危组之间的差异具有统计学意义，P值分别为0.015、0.007。（3）以中位表达水平为界将初诊患儿分为高、低表达量两组，高表达组（n=34例）第7天强的松预处理敏感率为70.6%，而低表达组（n=33例）敏感率为90.9%，P=0.035；第33天骨髓完全缓解率高表达组为64.7%，低表达组为87.9%，P=0.026；第15天骨髓完全缓解率高表达组为68.8%，低表达组为69.7%，P=0.664。（4）初诊T-ALL组（n=10例）MRP1的表达水平高于B-ALL组（n=57例），中位数分别为7.71和5.18，差异有统计学意义（P=0.007）。（5）单因素分析显示MRP1mRNA表达水平与患儿性别、年龄、初诊时白细胞计数、血红蛋白、血小板计数、外周血涂片幼稚细胞比例及骨髓涂片幼稚细胞比例无相关性。结论：在儿童急性淋巴细胞性白血病中，MRP1的表达与免疫分型、治疗反应、危险程度及疾病复发密切相关，是ALL预后差的有效指标。第三部分儿童急性淋巴细胞白血病MRP2-6的表达及临床意义目的：MRP2-6基因在多种肿瘤中高表达，与肿瘤多药耐药具有密切相关性，目前有关它们在儿童ALL中的表达及意义国内鲜见报道，使用荧光定量PCR检测MRP2-6mRNA在儿童ALL中的表达水平，分析其在儿童ALL中的表达特点及临床预后指标的相关性。方法：于2013年收集在苏州大学附属儿童医院诊断和治疗的ALL患儿133例（初诊=56例，完全缓解=68例，复发=9例），10例特发性血小板减少性紫癜（idiopathicthrombocytopenic purpura，ITP）患儿骨髓为对照。应用定量RT-PCR方法检测MRP2-6基因的表达水平，利用SPSS18统计学软件，分析它们在儿童ALL预后指标的相关性。结果：（1）初诊组MRP2基因的中位表达水平最高（2.99），复发组次之（1.18）完全缓解组最低（1.17），但各组比较差异无统计学意义，P值分别为0.065和0.763；完全缓解组MRP3基因的中位表达水平为2.09，高于初诊组、复发组，后两者中位表达水平分别为0.52和0.38，且初诊组与完全缓解组之间差异有统计学意义，P值＜0.001；MRP4在初诊组和复发组的中位表达水平分别为2.46和5.47，均高于完全缓解组（1.64），差异有统计学意义，P值分别为0.039、0.029，以复发组表达水平最高；MRP5的在儿童ALL中的表达模式与MRP4相似，其中位表达水平在初诊组和复发组分别为1.60和3.84，高于完全缓解组（0.91），且差异有统计学意义，P值分别为0.003、0.002，以复发组表达水平最高； MRP6的中位表达水平在复发组最高，为2.0，高于初诊组、完全缓解组，后二者分别为0.56和1.13，但差异无统计学意义。（2）最终危险程度分级显示MRP2和MRP5的表达在中危组最高，分别为4.62和1.71，但与低危组、高危组比较没有统计学意义；MRP4的中位表达水平以高危组最高，但与中危组、低危组比较，差异无统计学意义。（3）以MRP2-6mRNA中位表达水平为界，将初诊ALL患儿分为高、低表达组，分析它们在3个治疗反应评估点（第7天、15天和33天）的表达差异，发现没有统计学意义。且与免疫分型没有相关性。（4）单因素分析显示MRP2与初诊时血小板计数呈负相关、MRP4与性别具有有关性。结论：在儿童急性淋巴细胞性白血病中，MRP2-6mRNA的表达水平具有不同的表达模式，其中MRP4和MRP5mRNA的表达水平在疾病复发时最高。
黄山[3]（2011）在《复方浙贝颗粒改善难治性急性白血病患者生存的临床观察》文中研究说明对化疗反应差,诱导缓解率低,病死率高是难治性急性白血病的主要特点。目前,轮换化疗方案与加大化疗药物剂量为治疗难治性白血病的主要手段,但临床上仍只有30%-45%的缓解率。除此之外,难治性白血病尚存在持续缓解时间短,易复发,生存期短等问题。因此,在提高难治性白血病患者缓解率同时,延长其持续缓解时间以及降低其死亡率,也具有重要意义。本临床研究为“十一五”国家科技支撑计划《难治性急性白血病围化疗期中医干预治疗方案临床应用研究》的部分内容。研究目的：观察以“复方浙贝颗粒”为主的中医干预治疗方案,对难治性急性白血病患者持续缓解时间、中位生存时间,以及患者复发率、死亡率等方面的影响。研究方法：依据科技部关于“国家科技支撑计划”要求与GCP规范,采用随机双盲、安慰剂对照、多中心协作的临床试验原则,在围化疗期对238例难治性急性白血病患者实施中医干预治疗方案与西医标准化疗方案联合应用,并对一个标准化疗疗程结束后取得完全缓解的受试者开始随访,了解其持续缓解时间、生存时间,复发率及死亡率等情况。进入统计病例共41例,其中浙贝组20例,对照组21例。研究结果：治疗组与对照组比较：①浙贝组和对照组的中位持续缓解时间分别为172天、115天；中位生存期分别为363天、201天,均无明显差异（P>0.05）。但浙贝组在持续缓解时间及生存期上更有优势。②浙贝组在3个月内、6个月内、1年内以及总复发率分别为30%、50%、70%、90%,均低于对照组的42%、76%、90.48%、90.48%,无统计学意义（P>0.05）。浙贝组有降低复发率的趋势。③浙贝组的死亡率为80%,与对照组的85.71%相比,低了5.7个百分点,两组无统计学意义（P>0.05）。但浙贝组有降低死亡率的趋势。与国外文献比较：浙贝组的中位持续缓解时间及中位生存时间与近几年国外相关文献比较,均有一定优势。结论：复方浙贝颗粒具有延长难治性急性白血病患者持续缓解时间,提高患者生存时间,降低患者复发率以及死亡率等趋势。
杨洪涌[4]（2006）在《清毒饮（片）和养正片联合化疗治疗急性白血病疗效及其分子机制的研究》文中指出急性白血病（AL）是严重危害人类健康和生命的重大疾病。上个世纪70年代以后,随着化疗策略逐渐完善,抗白血病新药的应用,造血干细胞移植技术的发展,免疫和基因疗法的使用,白血病的治疗有了巨大的进步。但是,欲真正明了其病因和发病机理,探求安全、高效而经济可行的防治方法,则仍然任重而道远。从祖国医药宝库里探求抗AL新药,仍具有重要的学术价值与经济价值。 据此,我院血证研究室从1991年至今,进行了中医药治疗白血病的临床和实验研究,本人作为主要研究人员之一,参与其中。在国家中医药管理局和广东省科委科研基金等的资助下,在自拟抗白血病中药Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号方治疗白血病取得较好疗效的基础上,我们制订了清毒饮和养正片两个中药复方,辨证用于AL化疗的不同阶段,取得良好效果;我们又进而利用AL动物模型和细胞株,开展了该二方抗AL疗效机理的研究,取得了一系列成果。但受限于病床数等原因,既往的观察病例数偏少;自2002年以后,我们在先前研究的基础上,为了便于患者服用和携带,进一步改良了清毒饮,并将其改为素片,即成为清毒片;并增加了观察样本,继续与养正片一道辨证应用于化疗的不同阶段,并取得了较满意的疗效。 研究目的 本研究旨在进一步观察中医药联合化疗治疗人类AL的增效减毒方案,并探讨其对人类白血病疗效的分子机制,为临床治疗AL提供安全、有效、廉价的更佳方案,并为将来开发抗AL中药新药打下基础。 研究方法与内容 本研究包括文献研究、临床研究与实验研究,在先前系列观察的基础上,进一步扩大临床观察样本,以观察中药清毒饮（片）和养正片联合化疗治疗AL近、中、远期增效减毒作用,并直接观察服用该二方后AL病人体内药物作用的分子机制。 文献研究:总结分析了近年来,特别是近5年来国内外AL中西医研究领域的一系列进展,并提出存在问题和可能的解决方案。 临床研究:1994年2月-2005年12月选取137例AL患者,随机分为中西医联合治疗组和单纯化疗组。中西医联合治疗组92例,再按中医辨证分为两组,治以辨证分期、序贯服用清毒饮（片）和养正片并联合化疗;与单纯化疗组45例作组间和自身前后比较,从临床疗效、提高生存质量、降低症候积分等进行分析;并比较了清毒片和清毒饮、中西医联合疗法对AL不同亚型的疗效差异。 实验研究:选取AL患者作为研究对象,采用自身前后对照,抽取化疗前患者用清毒饮和养正片治疗前、后的骨髓液,运用免疫细胞化学染色和原位杂交法检测观察了中药对其Bcl-2、p53、Fas及其mRNA表达影响。
钱红兰,俞康,胡旭东,高申孟[5]（2002）在《急性髓性白血病P170、CD34表达与预后关系》文中研究指明目的 观察急性髓性白血病患者P170 与CD3 4 抗原表达及临床意义。方法 用流式细胞仪测 30例初治急性髓性白血病患者P170 与CD3 4 抗原的表达。结果 P170 总表达率 36 6 7%,P170 阳性的患者临床耐药率较阴性者高 （P <0 0 1）。CD3 4 表达者耐药率也较CD3 4 阴性者高 （P <0 0 1）。结论 P170 和CD3 4 表达是初治急性髓性白血病患者预后的重要指标之一。
佘志远[6]（2020）在《Sall4在耐铂类非小细胞肺癌中的研究》文中认为目的:对比观察人类婆罗双树样基因4（Spalt-like protein4,Sall4）在非小细胞肺癌及耐铂类非小细胞肺癌细胞株中的表达,探讨非小细胞肺癌铂类耐药可能机制。方法:对照组为A549细胞株,实验组为耐顺铂A549/DDP细胞株,细胞培养基为:F-12K培养液+10%胎牛血清,培养条件为:37℃+5%CO2的恒温培养箱中。通过细胞免疫荧光方法观察Sall4蛋白表达,逆转录-聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）测定Sall4 mRNA的表达。结果:细胞免疫荧光结果显示Sall4蛋白主要表达在非小细胞肺癌细胞胞浆中,实验组平均荧光强度（23.87?1.04）明显高于对照组（17.63?3.36）,两组比较差异显着（P<0.05）,RT-PCR结果显示SALL4 mRNA在实验组和对照组灰度值分别为1.06?0.15、0.65?0.13,两组比较具有统计学意义（P<0.05）。结论:Sall4可能参与非小细胞肺癌的铂类药物获得性耐药。
王静璐[7]（2019）在《CDK9在卵巢癌进展中的作用及对细胞生物学影响的初步研究》文中指出研究背景和目的:卵巢癌是目前死亡率最高的女性生殖道恶性肿瘤,其发病率呈逐年上升趋势,严重威胁妇女生命和健康。美国癌症协会预计仅在2019年,美国约有22,530例新的卵巢癌病例和13,980例死亡病例。起病隐匿、发病晚、恶性程度高、易转移、预后差是卵巢癌的主要临床特点。肿瘤细胞减灭术和以铂类及紫杉醇为基础的联合化疗是晚期卵巢癌患者的主要治疗手段。超过50%的晚期卵巢癌患者在治疗后的最初5年内复发,获得了对标准化疗的耐药性,并对其他功能和结构上不相关的化疗药物产生了交叉耐药性。在过去的30年里,即使诊断和治疗水平的不断提高,卵巢癌患者的5年生存率并没有显着改善,仍徘徊于3040%。因此迫切需要制定新的治疗策略,以改善卵巢癌患者的治疗。周期依赖性蛋白激酶（Cyclin-dependent kinases,CDKs）是丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶,参与细胞周期和转录活性的调节。CDK1、CDK2、CDK4和CDK6主要参与细胞周期的调节,CDK8、CDK9、CDK12、CDK13和CDK19主要参与基因转录的调节。CDK7和CDK20与细胞周期和转录过程都有关。最近的研究表明,CDKs在许多癌症类型中过度表达,并最终导致了不受控制的细胞增殖和耐药性的产生。因此,CDKs逐渐成为人类癌症治疗的的潜在药物靶点。CDK4/6抑制剂帕博西尼（palbociclib）已经被食品和药物管理局批准为雌激素受体阳性和人表皮生长因子受体2阴性的晚期乳腺癌患者的临床一线治疗药物。目前有100多项I/II临床试验研究CDKs抑制剂对各种癌症类型的影响（http://clinicaltrials.gov/）。最近,CDK9逐渐成为癌症治疗的重要靶点,因为它在RNA转录、延伸和其他细胞生物学过程中发挥重要作用。CDK9和细胞周期蛋白T构成正相转录延伸因子b复合物,该复合物通过激活RNA聚合酶II（RNA polymerase II,RNAPII）的磷酸化促进转录延伸。CDK9已经被证实在多种肿瘤的发展过程中起着至关重要的作用,包括白血病、宫颈癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤、乳腺癌、黑素瘤和肺癌。然而,CDK9表达与卵巢癌临床预后之间的关系,CDK9与卵巢癌耐药形成的关系,以及靶向CDK9在卵巢癌中的治疗潜力仍不清楚。本研究分为以下三个部分:第一部分:CDK9在卵巢癌中的表达及其临床意义;第二部分:CDK9在卵巢癌细胞株中的生物学作用及其作用机制的初步探讨;第三部分:CDK9在卵巢癌耐药中的作用及其机制的探讨。第一部分:CDK9在卵巢癌中的表达及其临床意义目的:通过检测CDK9在原发的卵巢癌组织和其对应的转移和复发的肿瘤组织中的表达水平,结合患者临床病例资料,分析其表达与卵巢癌患者临床病理及预后的关系。方法:1.免疫组化染色法检测人类卵巢癌组织芯片中CDK9的表达水平。纳入本课题的研究对象是在美国哈佛大学麻省总医院接受治疗的26例卵巢癌患者,其中每例患者均有原发、转移和复发的肿瘤组织标本。2.应用配对t检验分析CDK9在原发、转移和复发的卵巢癌组织中的表达。3.应用Kaplan-Meier生存曲线分析CDK9的表达与卵巢癌患者无病生存率及总生存率之间的相关性。应用Cox比例风险回归模型确定无病生存期及总生存期的预后因子。4.采集26例患者的临床数据,Pearson卡方检验用来分析CDK9表达与卵巢癌患者临床病理参数间的相关性。5.采用蛋白免疫印迹（Western blot）法检测不同卵巢癌细胞系内CDK9蛋白的表达。6.采用Graph Pad Prism 7软件对数据进行统计学分析,所有数据用均数±标准差表示。应用配对t检验比较CDK9在原发、转移和复发的卵巢癌组织中的表达。应用Kaplan-Meier生存曲线分析CDK9的表达与卵巢癌患者无病生存率及总生存率之间的相关性。应用Cox比例风险回归模型确定无病生存期及总生存期的预后因子。Pearson卡方检验用来分析CDK9表达与卵巢癌患者临床病理参数间的相关性。以α=0.05作为检验水准。结果:1.CDK9蛋白主要表达在细胞核上,根据免疫组化CDK9的细胞核着色将其进行评分:1+,<10%细胞核着色;2+,10-25%细胞核着色;3+,26-50%细胞核着色;4+,51-75%细胞核着色;5+,>75%细胞核着色。CDK9低表达组为评分1+-2+,CDK9高表达组为评分3+-5+。2.免疫组化染色人类卵巢癌组织芯片的结果表明,原发、转移和复发的卵巢癌组织CDK9表达相对评分分别为2.58,3.23和3.19。其中转移组与原发组比较P=0.003,复发组与原发组比较P=0.001。3.生存分析结果显示,与CDK9低表达组卵巢癌患者相比,CDK9高表达组患者的无病生存率和总生存率明显缩短,且差异有统计学意义（P<0.001）。Cox回归模型显示,高表达的CDK9对缩短的无病生存期和总生存期是一个显着的风险因子,风险比分别为4.1和5.39。4.CDK9低表达与CDK9高表达组患者在临床分期、组织分化、有无腹水和组织病理类型方面均没有统计学差异（P>0.05）。5.CDK9在卵巢癌细胞系SKOV3、OVCAR8、A2780、IGROV-1、OVCAR5和CAOV-3中均表达。小结:1.原发病灶的卵巢癌组织CDK9的表达水平明显低于其对应的转移和复发的肿瘤组织。2.CDK9高表达与卵巢癌患者预后不良相关。3.CDK9表达于多个卵巢癌细胞系中。第二部分:CDK9在卵巢癌细胞株中的生物学作用及其作用机制的初步探讨目的:通过抑制CDK9表达对卵巢癌细胞增殖、凋亡、迁移、克隆形成及3D细胞成球的影响,初步探讨CDK9参与卵巢癌细胞生物学行为的分子机制。方法:1.应用MTT增殖试验法检测通过CDK9 si RNA或CDK9抑制剂LDC000067抑制CDK9的表达后对卵巢癌细胞增殖能力的影响。2.应用Western blot法检测通过CDK9 si RNA或CDK9抑制剂LDC000067作用后对CDK9、基因转录及凋亡相关蛋白的影响。3.采用Three-dimensional（3D）细胞培养法检测CDK9抑制剂LDC000067对卵巢癌细胞球体形成能力的影响。4.应用克隆形成实验检测CDK9抑制剂LDC000067对卵巢癌细胞克隆形成能力的影响。5.采用划痕修复实验检测CDK9抑制剂LDC000067对卵巢癌细胞迁移能力的影响。6.采用Graph Pad Prism 7软件对数据进行统计学分析,所有数据用均数±标准差表示。多组间的数值比较采用one-way ANOVA,组间两两比较采用LSD-t法,以α=0.05作为检验水准。结果:1.应用CDK9 si RNA或CDK9抑制剂LDC000067后卵巢癌SKOV3和OVCAR8细胞的增殖能力明显受到抑制,并呈现浓度依赖性。2.CDK9 si RNA可抑制CDK9蛋白的表达,而CDK9抑制剂LDC000067仅抑制CDK9的活性,其蛋白表达量并无显着性差异。CDK9 si RNA和LDC000067均可抑制转录蛋白RNAPII的磷酸化,并可增加促凋亡蛋白cleaved PARP及Bax的表达,同时抑制抗凋亡蛋白Mcl-1的表达,呈浓度依赖性。3.3D细胞培养结果显示,与对照组相比,应用CDK9抑制剂LDC000067后细胞球体直径明显缩小,并呈时间依赖性,差异有统计学意义（P<0.05）。4.与对照组相比,应用CDK9抑制剂LDC000067后卵巢癌细胞克隆形成能力明显受到抑制,并呈浓度依赖性,差异有统计学意义（P<0.05）。5.划痕实验结果显示,与未加药组相比,应用CDK9抑制剂LDC000067后细胞迁移距离明显受到抑制,并呈时间依赖性,差异有统计学意义（P<0.05）。小结:1.抑制CDK9可降低卵巢癌细胞的增殖、3D细胞成球、克隆形成及迁移的能力。2.抑制CDK9可降低卵巢癌细胞转录蛋白RNAPII的磷酸化水平,同时促进细胞的凋亡。第三部分:CDK9在卵巢癌耐药中的作用及其机制的探讨目的:构建卵巢癌耐药细胞系,探讨CDK9在卵巢癌耐药中的作用。抑制CDK9的表达对卵巢癌耐药细胞化疗敏感性的影响并探讨其潜在的分子机制。方法:1.采用紫杉醇浓度递增的诱导方法处理药物敏感性的卵巢癌SKOV3和OVCAR8细胞,经过6个月左右的加药,建立紫杉醇耐药的卵巢癌细胞SKOV3TR和OVCAR8TR。2.应用Western blot法比较卵巢癌药物敏感细胞株和其构建的紫杉醇耐药细胞株中CDK9、Pgp、s2 RNAPII、RNAPII、p-Stat3及Stat3的蛋白水平。3.应用MTT增殖试验法检测CDK9 si RNA或CDK9抑制剂LDC000067对卵巢癌耐药细胞株化疗敏感性的影响。4.采用Compusyn软件计算combination index（CI）值,分析紫杉醇联合CDK9抑制剂LDC000067对卵巢癌耐药细胞增殖的相互作用。5.应用Western blot法检测通过CDK9 si RNA作用后对耐药细胞株CDK9、Stas3信号通路、RNA转录及凋亡相关蛋白的影响。6.应用Western blot法检测单独应用紫杉醇或CDK9抑制剂LDC000067以及联合应用紫杉醇和LDC000067后对耐药细胞株CDK9、Stas3信号通路、转录及凋亡相关蛋白的影响。7.采用3D细胞培养法检测CDK9抑制剂LDC000067对卵巢癌耐药细胞球体形成能力的影响。8.应用克隆形成实验检测CDK9抑制剂LDC000067对卵巢癌耐药细胞克隆形成能力的影响。9.采用划痕修复实验检测CDK9抑制剂LDC000067对卵巢癌耐药细胞迁移能力的影响。10.采用Graph Pad Prism 7软件对数据进行统计学分析,所有数据用均数±标准差表示。多组间的数值比较采用one-way ANOVA,组间两两比较采用LSD-t法,以α=0.05作为检验水准。结果:1.紫杉醇耐药的卵巢癌细胞SKOV3TR和OVCAR8TR对紫杉醇的敏感性显着降低,而亲代细胞则保持对紫杉醇的敏感性。2.SKOV3/SKOV3TR和OVCAR8/OVCAR8TR均表达一定蛋白水平的CDK9,但是,SKOV3TR和OVCAR8TR均比其对应的敏感细胞SKOV3和OVCAR8表达较高蛋白水平的CDK9。Pgp、s2 RNAPII及p-Stat3的蛋白水平在耐药细胞中表达均高于敏感细胞株,且差异有统计学意义（P<0.05）。3.应用CDK9 si RNA或CDK9抑制剂LDC000067后可提高卵巢癌耐药株SKOV3TR和OVCAR8TR对紫杉醇的敏感性。4.Compusyn软件计算显示,联合应用紫杉醇和CDK9抑制剂LDC000067对卵巢癌耐药细胞的增殖有协同的抑制效应,可增加耐药细胞对化疗药物紫杉醇的敏感性（CI<0.7）。CI>1.1,拮抗作用;0.9–1.1,叠加效应;0.7–0.9,微弱协同效应;0.3–0.7,协同效应;<0.3,强协同效应。5.CDK9 si RNA可抑制卵巢癌耐药细胞转录蛋白RNAPII和信号通路蛋白Stas3的磷酸化,并可增加促凋亡蛋白Bax的表达,同时降低抗凋亡蛋白Mcl-1的表达,并呈浓度依赖性。6.Western blot法结果显示,联合应用紫杉醇和CDK9抑制剂LDC000067可增强其单一用药的作用,可抑制卵巢癌耐药细胞转录蛋白RNAPII和信号通路蛋白Stas3的磷酸化,并可增加促凋亡蛋白cleaved PARP及Bax的表达,同时降低抗凋亡蛋白Mcl-1的表达。7.3D细胞培养结果显示,与对照组相比,应用CDK9抑制剂LDC000067后耐药细胞球体直径明显缩小,并呈时间依赖性,差异有统计学意义（P<0.05）。8.与对照组相比,应用CDK9抑制剂LDC000067后卵巢癌耐药细胞克隆形成能力明显受到抑制,并呈浓度依赖性,差异有统计学意义（P<0.05）。9.与未加药组相比,应用CDK9抑制剂LDC000067后卵巢癌耐药细胞迁移距离明显受到抑制,并呈时间依赖性,差异有统计学意义（P<0.05）。小结:1.CDK9在卵巢癌耐药细胞株中表达高于其敏感细胞株。2.抑制CDK9可提高卵巢癌耐药细胞对紫杉醇的敏感性。3.抑制CDK9可降低卵巢癌耐药细胞转录蛋白RNAPII和Stat3信号通路的磷酸化水平,同时促进细胞的凋亡。4.联合应用紫杉醇和CDK9抑制剂LDC000067对卵巢癌耐药细胞的增殖有协同的抑制效应。5.抑制CDK9可降低卵巢癌耐药细胞克隆形成、3D细胞成球及迁移的能力。结论:1.CDK9高表达与卵巢癌的复发及转移关系密切,并与患者的预后呈现负相关。2.CDK9可能通过激活基因转录,抑制凋亡,进而促进卵巢癌细胞的增殖。3.CDK9可能参与了卵巢癌耐药的形成,抑制CDK9表达可有效逆转耐药细胞对紫杉醇的敏感性。4.CDK9有作为卵巢癌预后指标和靶向治疗的潜在价值。
马乾章[8]（2018）在《小白菊内酯及大黄素抑制肠腺癌细胞增殖作用机制的实验研究》文中进行了进一步梳理目的:近年来,新兴的化学生物学学科发展非常迅猛。该学科利用现有的数量庞大而且化学结构多样的小分子化合物库,针对研究者所需要的化合物的生物活性进行筛选,并以此为依据进行相关的作用机制研究。本研究所选药物为小白菊内酯和大黄素,二者是从天然植物中提取的小分子化合物。其生物活性均具有明显的抗癌作用,尤其是肠腺癌,近年来的研究逐渐增多。因此,延续我们前期对小白菊内酯和大黄素抗肠腺癌生物活性的研究,本课题采用体外实验的方式,对小白菊内酯诱导HCT-8/VCR细胞凋亡和耐药逆转作用机制靶点,以及大黄素诱导CACO-2细胞凋亡和调控PI3K/AKT信号通路的作用机制靶点进行了相关研究。通过对小白菊内酯和大黄素抗癌活性及作用机制的研究,为天然植物药物来源的小分子化合物抗癌作用提供基础,为天然植物药物用于临床肿瘤的治疗开拓市场。后续,我们将针对前期的研究成果,对两种小分子化合物的生物活性与其结构的相关性进行分析,对于不理想的结构进行修饰,为新的抗癌小分子药物的研发做出贡献。研究方法:一、小白菊内酯诱导HCT-8/VCR细胞凋亡和耐药逆转作用研究1、MTT法检测PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞的增殖抑制作用培养结肠癌细胞株HCT-8、HCT-8/VCR细胞株,加入96孔板,实验组加入不同浓度的PTL,对照组则加等量不含药物的培养液,处理12、24、48小时后,MTT法检测各孔吸光度（OD）值,计算细胞增殖抑制率。2、流式细胞仪（Annexin V-FITC/PI染色）检测PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞凋亡的影响。消化收集对照组、PTL5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L处理24h的HCT-8、HCT-8/VCR细胞,AnnexinV/FITC染色后,流式细胞仪检测,分析细胞凋亡百分比。3、吖啶橙（AO）/溴化乙锭（EB）荧光染色检测PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞凋亡的影响。取对数生长期HCT-8、HCT-8/VCR细胞,每孔1×104个/ml、2ml接种于6孔板中,孔内放入盖玻片。设小白菊内酯浓度5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、及对照组共4组,每组3个复孔,每组给药24h后,取出盖玻片,固定、AO/EB染色、、封片,荧光显微镜观察,每组分别计数,每次计数细胞300个,计算凋亡率。4、Western-blot法检测PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞Bax、Bcl-2、蛋白表达的影响。收集对照组、PTL5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L处理24h的HCT-8、HCT-8/VCR细胞蛋白,用western blot方法检测Bax、Bcl-2蛋白的表达。5、MTT法检测PTL对HCT-8/VCR的耐药逆转作用（1）取对数生长期HCT-8、HCT-8/VCR细胞,加入96孔板,分别加入不同浓度的VCR,处理24小时后,MTT法检测HCT-8、HCT-8/VCR细胞VCR的半数抑制浓度,及HCT-8/VCR对VCR的耐药指数。（2）取对数生长期HCT-8/VCR细胞,加入96孔板,分别设对照组、PTL5μmol/L、VCR（0.25、0.5、1、2、4、6、10μg/ml）、PTL5μmol/L+VCR各浓度组,处理24小时后,MTT法检测PTL对HCT-8/VCR的耐药逆转作用。6、流式细胞仪（Annexin V-FITC/PI染色）检测PTL对HCT-8/VCR的耐药逆转作用。消化收集对照组、PTL5μmol/L、VCR2μg/ml、PTL5μmol/L+VCR2μg/ml处理24h的HCT-8/VCR细胞,AnnexinV/FITC染色后,流式细胞仪检测,分析细胞凋亡百分比。7、Western-blot法检测PTL对HCT-8/VCR细胞P-gp、MRP、GST-π蛋白表达的影响。收集HCT-8对照组、HCT-8/VCR对照组、PTL5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L处理24h的HCT-8/VCR细胞蛋白,用western blot方法检测P-gp、MRP、GST-π蛋白的表达。二、大黄素诱导CACO-2细胞凋亡及对PI3K/AKT信号通路的调控作用研究1、MTT法检测大黄素对CACO-2细胞增殖抑制的影响对数生长期的CACO-2细胞,加入96孔板,实验组加入不同浓度的PTL,对照组则加等量不含药物的培养液,处理24小时后,MTT法检测各孔吸光度（OD）值,计算细胞增殖抑制率。2、流式细胞术检测大黄素对CACO-2细胞凋亡的影响。消化收集对数生长期的CACO-2细胞,以大黄素处理CACO-2细胞24h,终浓度分别为0μmol/L、15μmol/L、30μmol/L和60μmol/L,然后以AnnexinV/FITC染色,流式细胞仪检测,分析细胞凋亡百分比。3、DAPI染色检测大黄素对CACO-2细胞凋亡的影响取对数生长期CACO-2细胞,每孔1×104个/ml、2ml接种于6孔板中,孔内放入盖玻片。设大黄素浓度15μmol/L、30μmol/L和60μmol/L、及对照组共4组,每组3个复孔,,每组给药24h后,取出盖玻片,固定、DAPI染色、碳酸盐缓冲甘油封片,荧光显微镜观察,激发波长为359 nm。观察细胞凋亡情况。4、流式细胞术检测大黄素对CACO-2细胞周期的影响取对数生长期的CACO-2细胞,用RPMI-1640完全培养基制成2×104个/m1的单细胞悬液,接种于6孔培养板中,每孔2ml,37℃培养12小时,更换培养液,加入药物。大黄素物终浓度分别为0μmol/L、15μmol/L、30μmol/L和60μmol/L;对照组为加入完全培养基组,空白对照为只加入完全培养基,置培养箱中培养24h后,用胰酶消化细胞,调整细胞浓度为1x106个/ml,取0.25ml细胞,PBS清洗,1000rpm,4℃离心5分钟,弃上清（重复两次）;将细胞重悬于0.25ml结合缓冲液中,取0.1ml细胞悬液置于5ml流式管中,加入PI 20ul至终浓度50ug/ml,锡箔纸包住,避光4度染色30min,24h内上机检测。用流式细胞仪进行细胞周期检测,重复实验3次。5、Western-blot法检测大黄素对CACO-2细胞Bax、Bcl-2、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达的影响收集对照组、15μmol/L、30μmol/L和60μmol/L大黄素处理24h的CACO-2细胞蛋白,用western blot方法检测Bax、Bcl-2蛋白的表达。结果:1、PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞的增殖抑制作用小白菊内酯对结肠癌HCT-8、HCT-8/VCR细胞株有增殖抑制作用,并呈浓度及时间依赖关系,PTL12h半数抑制浓度IC50分别为20.21±2.63μmol/L,21.52±3.25μmol/L。PTL24h半数抑制浓度IC50分别为15.46±1.22μmol/L,17.05±2.78μmol/L。PTL48h半数抑制浓度IC50分别为11.44±1.65μmol/L,10.85±2.02μmol/L。2、PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞凋亡的影响。对照组HCT-8细胞凋亡率4.23%±0.75%,与对照组比较,经5、10、20μmol/L的PTL处理24h后,HCT-8细胞的凋亡率显着增加（p<0.05）,分别为8.23%±1.45%,22.46%±2.75%,38.16%±3.25%。对照组HCT-8/VCR细胞凋亡率4.42%±1.16%,与对照组比较,经5、10、20μmol/L的PTL处理24h后,HCT-8/VCR细胞的凋亡率显着增加（p<0.05）,分别为8.43%±0.95%,21.67%±3.53%,39.16%±3.51%。上述结果表明PTL以浓度依赖方式诱导HCT-8、HCT-8/VCR细胞凋亡。3、荧光染色检测PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞凋亡的影响荧光染色结果显示,PTL以浓度依赖方式诱导HCT-8、HCT-8/VCR细胞凋亡。对照组HCT-8细胞凋亡细胞比率为10.33%±2.05%,与对照组比较,经5、10、20μmol/L的PTL处理24h后,HCT-8细胞的凋亡率显着增加（p<0.05）,分别为20.55%±3.55%,32.46%±3.76%,46.8%±4.28%。对照组HCT-8/VCR细胞凋亡细胞比率9.42%±1.25%,与对照组比较,经5、10、20μmol/L的PTL处理24h后,HCT-8/VCR细胞的凋亡率显着增加（p<0.05）,分别为18.66%±2.15%,30.65%±2.87%,45.44%±3.81%。4、Western-blot法检测PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响。对照组HCT-8、HCT-8/VCR细胞可见Bax低表达,与对照组比较,PTL 5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L组Bax表达显着增加（p<0.05）。对照组HCT-8、HCT-8/VCR细胞可见Bcl-2高表达,与对照组比较,PTL 5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L组Bax表达显着减少（p<0.05）。上述结果表明,PTL通过以浓度依赖方式增加HCT-8、HCT-8/VCR细胞Bax的表达,降低Bcl-2的表达,诱导HCT-8、HCT-8/VCR细胞凋亡。5、MTT法检测PTL对HCT-8/VCR的耐药逆转作用（1）VCR对结肠癌HCT-8、HCT-8/VCR细胞株有增殖抑制作用（p<0.05）,并呈浓度依赖关系（p<0.05）,VCR半数抑制浓度IC50分别为2.21±0.24μg/ml、38.9±3.04μg/ml,HCT-8/VCR对VCR的耐药指数为17.6倍。（2）VCR0.25、0.5、1、2、4μg/ml对HCT-8/VCR细胞无显着增殖抑制作用（p>0.05）,VCR 6、10μg/ml对HCT-8/VCR细胞有轻度增殖抑制作用（p<0.05）,PTL5μmol/L与VCR（0.25、0.5、1、2、4、6、10μg/ml）联用可显着增加VCR对HCT-8/VCR细胞的增殖抑制作用（p<0.05）。联用后VCR IC50为3.01±0.45μg/ml,与VCR单独应用时比较,IC50显着降低（p<0.05）,PTL可显着降低HCT-8/VCR对VCR的耐药指数（p<0.05）。上诉结果说明,PTL可显着增加显着增加VCR对HCT-8/VCR细胞的增殖抑制作用,逆转HCT-8/VCR的耐药。6、流式细胞仪（Annexin V-FITC/PI染色）检测PTL对HCT-8/VCR的耐药逆转作用。Annexin V-FITC/PI染色检测凋亡结果显示,对照组细胞凋亡率5.01%±0.47%,经VCR2μg/ml处理24h后,HCT-8/VCR细胞的凋亡率为6.93%±1.45%,与对照组比较,无显着差异（p>0.05）,经PTL5μmol/L处理24h后,HCT-8/VCR细胞的凋亡率为10.02%±0.86%,与对照组比较,凋亡率显着增加（p<0.05）,PTL5μmol/L+VCR2μg/ml处理24h的HCT-8/VCR细胞凋亡率为34.7%±2.33%,与VCR2μg/ml组及PTL5μmol/L组比较,凋亡率均显着性增加（p<0.05）。结果表明,PTL可显着增加VCR诱导HCT-8/VCR细胞凋亡能力,逆转HCT-8/VCR细胞对VCR的耐药。7、Western-blot法检测PTL对HCT-8/VCR细胞P-gp、MRP、GST-π蛋白表达的影响。western blot方法检测结果显示,HCT-8对照组可见P-gp、MRP、GST-π蛋白的低表达;与HCT-8对照组比较,HCT-8/VCR对照组P-gp、MRP、GST-π蛋白表达显着增加（p<0.05）;与HCT-8对照组比较,HCT-8/VCR对照组PTL5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L处理HCT-8/VCR细胞24h后,P-gp、MRP、GST-π蛋白表达显着减少（p<0.05）,且PTL浓度越大蛋白表达越低。8、随着大黄素浓度的逐渐提高,CACO-2细胞生存率逐渐降低,至200μmol/L,细胞生存率几乎接近0。而大黄素对CACO-2细胞培养24h的IC 50值为30μmol/L。9、随着大黄素浓度的逐渐升高,CACO-2细胞凋亡率也随之升高,从对照组的1.85%,升至60μmol/L大黄素组的42.66%。大黄素对CACO-2细胞诱导凋亡的作用呈剂量依赖趋势。10、30μmol/L和60μmol/L的大黄素干预后,细胞核明显浓缩,染色加深,偶见核染色质呈新月形聚集于核膜一边。尤其是60μmol/L的大黄素干预后,凋亡细胞核碎裂成大小不等的圆形小体,并被细胞膜所包绕,疑似凋亡小体。11、对照组细胞大部分处于G0/G1期,为62.3%,处于S期33.7%,处于G2/M期4.0%;大黄素干预后,细胞周期在G2/M期明显发生停滞,该期细胞数显着增多。并且随着大黄素浓度的提高,停滞于G2/M期的细胞也逐渐增多。以60μmol/L的大黄素组G2/M细胞周期阻滞最为明显。12、对照组细胞Bax呈低水平表达,而随着大黄素浓度的增高,表达水平逐渐上调;Bcl-2表达水平与Bax正好相反,对照组细胞Bcl-2、p-PI3K和p-AKT呈高水平表达,随着大黄素浓度的增高,表达水平逐渐下调。而非磷酸化PI3K、AKT表达水平各组间无明显差异。结论:1、小白菊内酯对HCT-8、HCT-8/VCR细胞具有抑制增殖及诱导凋亡作用,小白菊内酯对结肠癌细胞增殖抑制及诱导凋亡作用不受HCT-8/VCR细胞耐药性的影响,小白菊内酯可通过增加Bax的表达,降低Bcl-2的表达来诱导结肠癌细胞凋亡。2、小白菊内酯可显着增加VCR对HCT-8/VCR细胞的增殖抑制能力及凋亡诱导能力,小白菊内酯对HCT-8/VCR细胞具有耐药逆转作用。其机制主要是通过PTL降低HCT-8/VCR细胞P-gp、MRP、GST-π蛋白的表达,逆转HCT-8/VCR细胞的耐药性。3、大黄素对CACO-2结肠癌细胞的生长具有明显的抑制作用。其抗癌作用主要是由于诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞。此外,它还能抑制CACO-2细胞的PI3/AKT信号级联,提示大黄素在结肠癌治疗中的潜在应用。
杨臻[9]（2016）在《浙贝黄芩汤对急性髓系白血病化疗敏感性的影响》文中提出目的1.观察比较浙贝黄芩汤水提取物、醇提取物、酸水提取物对急性髓系白血病HL60、HL60/ADR细胞增殖及化疗药物敏感性的影响。2.探讨野生型p53诱导的磷酸酶1（Wipl）在难治性急性髓系白血病患者外周血中性粒细胞及单个核细胞中的表达情况。3.观察浙贝黄芩汤醇提取物对急性髓系白血病HL60、HL60/ADR细胞凋亡的影响及其与Wipl表达的相关性。4.探讨浙贝黄芩汤醇提取物增加急性髓系白血病HL60、HL60/ADR细胞对阿霉素敏感性与Wipl表达的相关性。方法1.采用MTS法检测比较浙贝黄芩汤水提取物、醇提取物、酸水提取物对急性髓系白血病敏感细胞HL60、耐药细胞HL60/ADR的增殖抑制作用,计算各提取物的IC5。值。测定非毒剂量（<IC,0）浙贝黄芩汤水提取物、醇提取物、酸水提取物联合阿霉素作用后HL60、HL60/ADR细胞阿霉素IC50的变化。2.中性粒细胞分离液分离5例难治性急性髓系白血病患者（难治组）、3例化疗敏感的急性髓系白血病患者（缓解组）、3例健康成年人（正常对照组）外周血中性粒细胞及单个核细胞,分别提取总RNA,应用Real-time PCR法检测Wip1mRNA的表达情况。3.浙贝黄芩汤醇提取物作用于HL60、HL60/ADR细胞,Real-time PCR法检测Wip1mRNA的表达变化；经Annexin/PI双染后,应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。4.Real-time PCR法检测HL60、HL60/AD R细胞Wip1mRNA表达的差异。非毒剂量（<IC,0）浙贝黄芩汤醇提取物联合阿霉素作用HL60、HL60/ADR细胞,Real-time PCR法检测Wip1mRNA表达的变化。利用Lipofectamine 3000转染试剂将Wipl高表达质粒（hWIP1-FLAG-pCMV-Neo-Bam）及对照质粒（pCMV-Neo-Bam）转染入HL60细胞,上调HL60细胞Wip1表达。MTS法检测Wipl高表达HL60细胞及转染对照质粒HL60细胞对阿霉素的敏感性。结果1.浙贝黄芩汤提取物对HL60细胞的IC50值由低到高依次为醇提取物（141.06±11.29ug/ml）、水提取物（177.28±4. OOug/ml）、酸水提取物（217.66±16.78 ug/m1）,P<0.05。浙贝黄芩汤水提取物、醇提取物对HL60/ADR细胞的IC50值均大于200ug/ml,浙贝黄芩汤酸水提取物对HL60/ADR细胞的IC50值大于400ug/ml,各提取物对HL60/ADR细胞的工C50值均高于HL60细胞。200ug/m1浙贝黄芩汤水提取物、醇提取物、酸水提取物对HL60/ADR细胞增殖的抑制率分别为（27.28±4.69）%、（37.67±3.43）%、（25.39±4.98）%,其中醇提取物抑制率高于水提取物及酸水提取物,P<0.05；水提取物及酸提取物抑制率比较差异无统计学意义,P>0.05。非毒剂量（<IC10）浙贝黄芩汤水提取物、醇提取物联合阿霉素作用于HL60细胞,阿霉素的IC50值降低,P<0.05,增敏倍数分别为1.60、2.00倍。非毒剂量（<IC10）浙贝黄芩汤醇提取物联合阿霉素作用于HL60/ADR细胞,阿霉素的IG50值降低,P<0.05,逆转倍数为1.50倍。2. Real-time PCR检测结果显示难治组外周血中性粒细胞中Wip1mRNA目对内参基因β-actin的表达量为0.0969±0.0684,缓解组外周血中性粒细胞中Wip1mRNA相对内参基因β-actin的表达量为0.0083±0.0078,正常对照组外周血中性粒细胞中Wip1mRNA相对内参基因β-actin的表达量为0.0116（0.0021,0.0118）。Wip1mRNA在难治组外周血中性粒细胞中的表达水平分别较缓解组及正常对照组增高,差异有统计学意义,P<0.05；WiplmRNA在缓解组及正常对照组外周血中性粒细胞中的表达水平无统计学差异,P>0.05。正常对照组、缓解组、难治组外周血.单个核细胞中Wip1mRNA的表达水平差异无统计学意义,P>0.05。3.浙贝黄芩汤醇提取物作用于HL60、HL60/ADR细胞,HL60细胞早期凋亡率及晚期凋亡率增加,P<0.05;HL60/ADR细胞早期凋亡率增加,P<0.05,晚期凋亡率与对照组相比差异无统计学意义,P>0.05。浙贝黄芩汤醇提取物作用后,HL60细胞Wip1mRNA水平下调,HL60/ADR细胞WiplmRNA表达水平无明显变化。4.WiplmRNA在HL60/ADR细胞中的表达水平低于HL60细胞。与单用阿霉素组相比,非毒剂量（<IC10）浙贝黄芩汤醇提取物联合阿霉素作用后,HL60细胞WiplmRNA表达上调、HL60/ADR细胞WiplmRNA表达下调。Wipl高表达HL60细胞阿霉素的IC50值为0.35±0.09ug/m1,转染对照质粒HL60细胞阿霉素的IC50值为0.36±0.17ug/ml,两组比较差异无统计学意义,P>0.05。结论1.浙贝黄芩汤水提取物、醇提取物、酸水提取物能不同程度的抑制HL60及HL60/ADR细胞增殖,以醇提取物抑制作用最强。浙贝黄芩汤水提取物、醇提取物、酸水提取物对HL60/ADR细胞的抑制作用弱于HL60细胞。非毒剂量（<IC,0）浙贝黄芩汤醇提取物能有效增加HL60细胞对阿霉素的敏感性,并部分逆转HL60/ADR细胞对阿霉素的耐药性。2.Wipl可能在难治性急性髓系白血病患者外周血中性粒细胞中高表达,其在急性髓系白血病中的表达情况仍有待进一步检测研究。3.浙贝黄芩汤醇提取物能促进HL60、HL60/ADR细胞凋亡,但与Wip1的相关性不明确。4.本实验未显示Wipl高表达与HL60细胞化疗敏感性的相关性,浙贝黄芩汤醇提取物对HL60/ADR细胞的耐药逆转作用与Wipl表达未显示相关性。
赵炳军[10]（2016）在《MDR1、MRP1和ABCG2在结直肠腺癌的表达及其临床意义》文中提出本课题采用免疫组化技术和原位分子杂交技术检测MDR1、MRPl和ABCG2蛋白及其m RNA在结直肠腺癌切端正常粘膜、结直肠腺瘤和结直肠腺癌中的表达,探讨三者在结直肠腺癌切端正常粘膜、腺瘤和腺癌中的表达差异;三者与结直肠腺癌临床病理特征的关系;以及三者在结直肠腺癌组织中表达的相关性。旨在进一步了解结直肠腺癌的发生、发展机制,并为临床结直肠腺癌化疗以及判断预后提供有价值的参考指标及实验依据。收集河北北方学院附属第一医院2013年1月至2014年6月存档的蜡块标本,结直肠腺癌116例,结直肠腺瘤50例,结直肠腺癌切端正常粘膜30例。所选结直肠腺癌患者术前均未进行放化疗。分别采用免疫组化和原位分子杂交技术检测MDR1、MRPl和ABCG2蛋白及相应m RNA的表达情况;分析结直肠腺癌中MDR1、MRPl和ABCG2蛋白及m RNA的表达与患者年龄、性别、组织分化程度、病变部位、淋巴结转移和TNM分期的关系及其三者之间的相关性;免疫组化结果显示:MDR1蛋白在结直肠腺癌切端正常粘膜、结直肠腺瘤和结直肠腺癌组织中的阳性表达率分别为30%（9/30）、10%（5/50）、72.4%（84/116）,三组间差异均具有统计学意义（P<0.05）;MDR1蛋白在结直肠腺癌组织中的表达与肿瘤的分化程度、淋巴结转移和TNM分期相关（P<0.05）,而与肿瘤患者的性别、年龄及肿瘤部位无关（P>0.05）。MRP1蛋白在切端正常黏膜、腺瘤和腺癌组织中的阳性表达率分别为16.7%（5/30）、40%（20/50）、70.6%（82/116）,三组间差异均具有统计学意义（P<0.05）;MRP1蛋白在结直肠腺癌组织中的表达与肿瘤的分化程度、淋巴结转移和TNM分期相关（P<0.05）,而与肿瘤患者的性别、年龄及肿瘤部位无关（P>0.05）。ABCG2蛋白在切端正常黏膜、腺瘤和腺癌组织中的阳性表达率分别为43.3%（13/30）、12%（6/50）、75.6%（88/116）,三组间差异均具有统计学意义（P<0.05）;ABCG2蛋白在结直肠腺癌组织中的表达与肿瘤的分化程度、淋巴结转移和TNM分期相关（P<0.05）,而与肿瘤患者的性别、年龄及肿瘤部位无关（P>0.05）。经Spearman相关分析显示MDR1,MRPl和ABCG2蛋白在结直肠腺癌中的表达均呈正相关（P<0.05）。原位杂交结果显示:MDR1 m RNA在结直肠腺癌切端正常粘膜、结直肠腺瘤和结直肠腺癌组织中的阳性表达率分别为33.3%（10/30）、6%（3/50）、72.4%（80/116）,三组间差异均具有统计学意义（P<0.05）;MDR1 m RNA在结直肠腺癌组织中的表达与肿瘤的分化程度、淋巴结转移和TNM分期相关（P<0.05）,而与肿瘤患者的性别、年龄及肿瘤部位无关（P>0.05）。MRP1蛋白在切端正常黏膜、腺瘤和腺癌组织中的阳性表达率分别为20%（6/30）、44%（22/50）、74.1%（86/116）,三组间差异均具有统计学意义（P<0.05）;MRP1 m RNA在结直肠腺癌组织中的表达与肿瘤的分化程度、淋巴结转移和TNM分期相关（P<0.05）,而与肿瘤患者的性别、年龄及肿瘤部位无关（P>0.05）。ABCG2 m RNA在切端正常黏膜、腺瘤和腺癌组织中的阳性表达率分别为36.7%（11/30）、10%（5/50）、72.4%（84/116）,三组间差异均具有统计学意义（P<0.05）;ABCG2蛋白在结直肠腺癌组织中的表达与肿瘤的分化程度、淋巴结转移和TNM分期相关（P<0.05）,而与肿瘤患者的性别、年龄及肿瘤部位无关（P>0.05）。经Spearman相关分析显示MDR1,MRPl和ABCG2 m RNA在结直肠腺癌中的表达均呈正相关（P<0.05）。以上结果提示:大多数结直肠腺癌中可能存在MDR1,MRPl和ABCG2介导的原发性多药耐药,且MDR1,MRPl和ABCG2的高表达与结直肠腺癌的淋巴结转移、TNM分期及肿瘤分化程度密切相关,同时三者在结直肠腺癌的上述恶性生物学行为中可能存在相互协同作用。MRPl表达的上调及MDR1和ABCG2在腺瘤表达的下调可能与结直肠腺癌的形成有关。联合检测MDR1,MRP1及ABCG2在结直肠腺癌组织中的表达,有助于评估结直肠腺癌患者耐药状态及肿瘤潜在的转移能力,有可能成为指导结直肠腺癌临床化疗及判断预后有价值的参考指标。
二、急性髓性白血病多药耐药基因的表达及其临床意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、急性髓性白血病多药耐药基因的表达及其临床意义（论文提纲范文）
（1）复方浙贝颗粒逆转小鼠急性淋巴细胞白血病多药耐药的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 成人急性淋巴细胞白血病耐药机制研究进展 |
| 1. ABC转运体 |
| 2. 细胞质/核内蛋白 |
| 3. 细胞凋亡与耐药 |
| 4 癌相关基因 |
| 5 其他 |
| 6 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 中医药诊治成人急性淋巴细胞白血病研究进展 |
| 1 中医病名 |
| 2 临床研究 |
| 3 基础研究 |
| 4. 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 复方浙贝颗粒对L1210/CDDP移植瘤抑制作用研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 复方浙贝颗粒对L1210/CDDP移植瘤抑制作用机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 复方浙贝颗粒对L1210/CDDP尾静脉小鼠模型抑制作用研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在校期间主要科研成果 |
| 个人简历 |
（2）多药耐药相关蛋白（MRPs）基因家族在儿童急性淋巴细胞白血病中的表达模式及其临床意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 多药耐药相关蛋白（MRPs）基因家族荧光定量 RT-PCR 的优化 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 儿童急性淋巴细胞白血病 MRP1 的表达及临床意义 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 儿童急性淋巴细胞白血病 MRP2-6 的表达模式及其临床意义 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 英汉双解缩略词表 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（3）复方浙贝颗粒改善难治性急性白血病患者生存的临床观察（论文提纲范文）
| 目录 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词英汉对照 |
| 上篇: 综述文献 |
| 综述一 难治性白血病相关危险因素分析 |
| 参考文献 |
| 综述二 难治性白血病西医化疗与中西医结合治疗进展 |
| 参考文献 |
| 下篇: 临床研究 |
| 前言 |
| 研究方案 |
| 诊疗标准 |
| 研究结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）清毒饮（片）和养正片联合化疗治疗急性白血病疗效及其分子机制的研究（论文提纲范文）
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 第一节 西医研究进展 |
| 一 病因和发病机理 |
| 二 西医治疗进展 |
| (一) 联合化疗 |
| 1 急性淋巴细胞白血病 |
| 2 急性髓细胞性白血病 |
| (二) 基因治疗 |
| (三) 免疫治疗 |
| (四) 干细胞移植治疗 |
| (五) 抗多药耐药 |
| (六) 抗微小残留病 |
| 第二节 白血病中医中药研究进展 |
| 一 病因病机研究 |
| 二 抗白血病实验研究 |
| 三 治疗白血病临床研究 |
| 第三节 存在问题 |
| 第二部分 临床研究 |
| 1 临床资料 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 实验研究 |
| 清毒饮和养正片对急性白血病人细胞凋亡相关基因表达的影响 |
| 1 临床资料 |
| 2 观察方法 |
| 3 结果 |
| 4 分析与讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（6）Sall4在耐铂类非小细胞肺癌中的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 资料与方法 |
| 2.1 主要试剂及实验器材 |
| 2.2 细胞培养流程 |
| 2.3 细胞免疫荧光流程 |
| 2.4 RT-PCR流程 |
| 2.5 统计方法及分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 细胞免疫荧光观察Sall4蛋白位置及表达水平 |
| 3.2 RT-PCR检测两组细胞系中Sall4 m RNA表达水平 |
| 第四章 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 主要中英文略缩语 |
| 致谢 |
（7）CDK9在卵巢癌进展中的作用及对细胞生物学影响的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 CDK9在卵巢癌中的表达及其临床意义 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 CDK9在卵巢癌细胞株中的生物学作用及其作用机制的初步探讨 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 CDK9在卵巢癌耐药中的作用及其机制的探讨 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| CDK9在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（8）小白菊内酯及大黄素抑制肠腺癌细胞增殖作用机制的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 小白菊内酯对HCT-8、HCT-8/VCR细胞的增殖抑制及诱导凋亡作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计学处埋 |
| 3 结果 |
| 3.1 PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞的增殖抑制作用 |
| 3.2 PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞凋亡的影响。 |
| 3.3 荧光染色检测PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞凋亡的影响 |
| 3.4 Western-blot法检测PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 小白菊内酯对HCT-8/VCR细胞耐药逆转作用及机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计学处埋 |
| 3 结果 |
| 3.1 MTT法检测PTL对HCT-8/VCR的耐药逆转作用 |
| 3.2 流式细胞仪(Annexin V-FITC/PI染色)检测PTL对HCT-8/VCR的耐药逆转作用 |
| 3.3 Western-blot法检测PTL对HCT-8/VCR细胞P-gp、MRP、GST-π蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 大黄素通过调控PI3K/AKT信号通路诱导CACO-2凋亡的实验研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计学处埋 |
| 3 结果 |
| 3.1 大黄素对CACO-2细胞的增殖抑制作用 |
| 3.2 大黄素对CACO-2细胞凋亡的影响。 |
| 3.3 DAPI染色检测大黄素对CACO-2细胞凋亡的影响 |
| 3.4 流式细胞术检测大黄素对CACO-2细胞周期的影响 |
| 3.5 Western-blot法检测大黄素对CACO-2细胞Bax、Bcl-2、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 总结 |
| 本研究自我创新性评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 第一篇 结肠癌研究现状 |
| 1.1 结肠癌的流行病学研究现状 |
| 1.2 结肠癌的致病因素 |
| 1.3 结肠癌相关基因的研究进展 |
| 1.4 结肠癌的治疗 |
| 第二篇 肿瘤多药耐药逆转剂研究进展 |
| 2.1 化学药物逆转剂 |
| 2.2 基因治疗逆转剂 |
| 2.3 免疫逆转剂 |
| 2.4 中药逆转剂型 |
| 2.5 其它 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）浙贝黄芩汤对急性髓系白血病化疗敏感性的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 中药逆转白血病细胞多药耐药机制的研究进展 |
| 1 白血病细胞多药耐药的机制 |
| 2 单味中药及其活性成分逆转白血病细胞多药耐药的研究现状 |
| 3 中药复方逆转白血病细胞多药耐药的研究现状 |
| 4 中药与西药逆转剂的联合应用 |
| 5 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 Wip1与肿瘤发生发展及耐药关系的研究进展 |
| 1 Wip1基因的致癌特性 |
| 2 Wip1基因在人类恶性肿瘤中的表达 |
| 3 Wip1基因促进肿瘤发生的机制 |
| 4 Wip1表达的调控 |
| 5 Wip1与肿瘤耐药 |
| 6 Wip1高表达与肿瘤患者预后的关系 |
| 7 Wip1抑制剂的研究现状 |
| 8 结语 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 浙贝黄芩汤提取物对HL60、HL60/ADR细胞增殖及耐药的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 5 结论 |
| 6 讨论 |
| 实验二 Wip1在难治性急性髓系白血病患者外周血细胞中的表达 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 5 结论 |
| 6 讨论 |
| 实验三 浙贝黄芩汤醇提取物对白血病细胞凋亡的影响以及与Wip1相关性研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 5 结论 |
| 6 讨论 |
| 实验四 浙贝黄芩汤醇提取物逆转白血病细胞耐药与Wip1相关性研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 5 结论 |
| 6 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简介 |
（10）MDR1、MRP1和ABCG2在结直肠腺癌的表达及其临床意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 ABC转运蛋白功能及其与消化系统恶性肿瘤关系 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、急性髓性白血病多药耐药基因的表达及其临床意义（论文参考文献）
- [1]复方浙贝颗粒逆转小鼠急性淋巴细胞白血病多药耐药的研究[D]. 赵欢. 北京中医药大学, 2020(04)
- [2]多药耐药相关蛋白（MRPs）基因家族在儿童急性淋巴细胞白血病中的表达模式及其临床意义[D]. 仇宝玲. 苏州大学, 2014(11)
- [3]复方浙贝颗粒改善难治性急性白血病患者生存的临床观察[D]. 黄山. 北京中医药大学, 2011(10)
- [4]清毒饮（片）和养正片联合化疗治疗急性白血病疗效及其分子机制的研究[D]. 杨洪涌. 广州中医药大学, 2006(10)
- [5]急性髓性白血病P170、CD34表达与预后关系[J]. 钱红兰,俞康,胡旭东,高申孟. 中国医师杂志, 2002(10)
- [6]Sall4在耐铂类非小细胞肺癌中的研究[D]. 佘志远. 湖南师范大学, 2020(01)
- [7]CDK9在卵巢癌进展中的作用及对细胞生物学影响的初步研究[D]. 王静璐. 郑州大学, 2019(07)
- [8]小白菊内酯及大黄素抑制肠腺癌细胞增殖作用机制的实验研究[D]. 马乾章. 中国医科大学, 2018(03)
- [9]浙贝黄芩汤对急性髓系白血病化疗敏感性的影响[D]. 杨臻. 北京中医药大学, 2016(08)
- [10]MDR1、MRP1和ABCG2在结直肠腺癌的表达及其临床意义[D]. 赵炳军. 河北北方学院, 2016(03)