一、养禽业面临着新威胁──禽骨髓性白血病（论文文献综述）
闫泽一[1]（2020）在《禽白血病病毒单克隆抗体识别抗原表位的鉴定与分析》文中进行了进一步梳理禽白血病（Avian leukosis,AL）是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）引起的鸡的一种传染性肿瘤性疾病。它在全世界广泛存在,并引起鸡免疫抑制、肿瘤、生长发育迟缓和死亡,每年给家禽业造成巨大经济损失。迄今为止,尚无有效的疫苗或药物针对此病。ALV是一种逆转录病毒,根据致病性和抗体中和特性在鸡群中分为七个亚群（ALV-A/B/C/D/E/J/K）。虽然内源性的ALV-E不引起严重损害,因为其基因组已广泛插入宿主鸡的细胞基因组中,所以它会干扰外源ALV的测定。另外,由于外源ALV的高变异性以及新亚群、新毒株的不断出现,使得检测外源ALV变得越来越困难。目前缺乏针对ALV-A检测的单克隆抗体,而且对其抗原表位也了解甚少。本研究制备出针对ALV-A的单克隆抗体,并鉴定其抗原表位,为单抗的应用提供了科学依据,为建立ALV-A的检测方法提供了新生物材料。本研究首先利用设计的引物从ALV-A-SDAU09C1病毒的全基因组DNA中扩增gp85基因,将其插入pET-32a表达载体中,将构建好的重组质粒导入大肠杆菌中,诱导表达gp85蛋白,并进行纯化。选取健康的6周龄雌性Balb/c小鼠,用纯化的gp85蛋白进行免疫,三免后取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合,利用ELISA和IFA两种方法筛选出阳性的杂交瘤细胞,并克隆培养阳性杂交瘤细胞。对单克隆抗体进行ELISA效价测定、western blot鉴定。然后用同样的方法表达纯化了14段截短的重叠的gp85蛋白,利用western blot的方法,用完整的gp85蛋白作为阳性对照,鉴定抗体与gp85分段蛋白的反应性,确定抗原表位。再对初次筛选的抗原多肽截短合成,结合ELISA方法鉴定最佳线性表位。最后通过生物信息技术分析构象表位和特性,利用单抗介导的IFA分析单抗与不同亚群毒株的结合作用。结果显示,利用设计的引物成功扩增出1005 bp的gp85基因序列,在大肠杆菌中诱导表达的gp85融合蛋白大小为46 KD。利用免疫获得的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合后成功筛选出一株阳性杂交瘤细胞,命名为A18GH。给小鼠腹腔注射阳性杂交瘤细胞以使其产生腹水。通过抗体纯化柱将腹水纯化,其SDS-PAGE电泳结果显示纯度较高,并测得其抗体亚类为IgG1,测得其效价为1:210,western blot结果显示单抗可特异性结合原核表达的gp85蛋白以及在细胞中表达病毒蛋白。而后分别对分段表达的gp85蛋白和合成的多肽进行与单抗反应性的鉴定,综合蛋白的western blot结果和多肽的ELISA结果可得,其抗原表位为146-ATRFLLR-152。通过对抗原表位的空间结构分析得出,构象表位为亲水性、抗原指数和可及性均较高的一段弯曲线性结构,其在A亚群中高度保守,其次在K亚群中含有4个相同的氨基酸,而在其他亚群中同源性较低。利用IFA的方法鉴定单抗可以识别的ALV亚群,其结果显示,单抗与ALV-A-SDAU09C1毒株产生较强反应,与ALV-K-JS11C1毒株产生较弱反应,不与ALV-B-SDAU09C2和ALV-J-NX0101毒株反应。以上结果表明,成功筛选出一株分泌抗ALV-A单克隆抗体的杂交瘤细胞株A18GH,并制备出ALV-A单克隆抗体,鉴定其抗原表位为146-ATRFLLR-152。
俞燕[2]（2019）在《地方品种鸡群禽白血病流行病学调查及检测净化技术研究》文中研究指明禽白血病是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）/肉瘤病毒群病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称。根据病毒囊膜蛋白的抗原性,ALV可分为A～J 10个亚群,以及新鉴定的K亚群。其中,对鸡具有致病性的外源性ALV包括A、B、C、D、J和K亚群。自1908年首次报道并分离到ALV以来,世界上许多国家都有该病的发生和流行,我国肉鸡、蛋鸡及地方品种鸡群也普遍存在ALV的感染。除典型的肿瘤性病变外,ALV感染引起的免疫抑制、生长迟缓、产蛋下降等亚临床表现所造成的经济损失更为严重。禽白血病是垂直传播性疫病,至今尚无有效的药物和疫苗可供使用,控制该病最有效的措施是通过病原检测,淘汰阳性鸡,达到净化种群的目的。国际育种公司在20世纪80年代末就实现了对经典外源性ALV的净化,2005年前后又实现了 ALV-J的基本净化。国内一些自繁自养的育种公司从2002年起也开始在种鸡核心群开展禽白血病净化,有些已取得显着效果。但在大多数黄羽肉鸡和众多地方品种鸡群中,禽白血病仍在流行和蔓延,对我国家禽种质资源的安全构成了极大威胁。本研究对某原种场保存的20多个地方品种鸡进行了禽白血病流行病学调查,全面了解地方品种鸡群禽白血病感染动态;并对分离到的一株ALV-K全基因组做了系统分析,解析其来源及分子特性;针对地方品种鸡群流行最广的ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K,建立了多重PCR检测方法;为丰富禽白血病检测净化技术,对种公鸡精液ALV检测方法进行了摸索和可行性分析;在此基础上,对DX、LY、XJ和LH 4个地方品种鸡核心群开展了禽白血病净化示范,验证和完善净化技术方案,为原种场禽白血病净化提供参考依据。1.地方品种鸡群禽白血病流行病学调查为深入了解我国地方品种鸡群禽白血病流行情况,2013～2017年间对某原种场从全国各地收集并保存的26个地方品种鸡开展了禽白血病流行病学调查,包括血清学ALV-J和ALV-A/B抗体检测、蛋清p27抗原检测、血浆和组织病料病毒分离检测等;对部分外源性ALV分离株前病毒DNA的env基因进行克隆和测序,将分离株gp85氨基酸序列与GenBank登录的各亚群ALV参考株进行比对和绘制遗传进化树,鉴定病毒亚群,并进行序列分析。血清学调查结果显示,有22个鸡种ALV-J抗体呈阳性,18个鸡种ALV-J和ALV-A/B抗体呈双阳性,且绝大多数（19/26）鸡种ALV-J抗体阳性率高于ALV-A/B抗体,个别鸡种ALV-J抗体阳性率大于50%。蛋清p27抗原检测结果显示,各品种鸡群均存在排毒状态的母鸡,尤其YJ、WX、BJ、DJ和ZJ鸡种蛋清p27抗原阳性率高于50%。血浆病毒分离检测结果表明,各品种鸡对ALV均易感,感染水平存在显着差异;大部分（15/21）鸡种母鸡病毒血症阳性率高于公鸡,但差异不显着。56个外源性ALV分离株经亚群鉴定,27株为ALV-J,17 株为 ALV-K,8 株为 ALV-B,3 株为 ALV-A,1 株为 ALV-C。其中,有 9 株 ALV-J、3株ALV-K、1株ALV-A分离自组织病料;其余毒株均分离自表观健康鸡群血浆样品。表明,ALV-K已成为除ALV-J外,对地方品种鸡感染最严重的外源性ALV。与参考株相比,ALV分离株gp85氨基酸序列普遍存在点突变、插入或缺失性变异,部分变异呈规律性。研究结果证实了禽白血病在地方品种鸡群感染的普遍性和复杂性,开展禽白血病净化工作势在必行。2.K亚群禽白血病病毒全基因组测序及分析为全面了解ALV-K基因组特性,本研究对在流行病学调查过程中从LY鸡种血浆样品分离鉴定的一株ALV-K（JS13LY19株）前病毒DNA进行了分段克隆和测序,获得全长基因组序列,并将其各基因片段与GenBank登录的ALV参考株进行比对分析。结果显示,JS13LY19株基因组全长7483bp,符合复制完整C型反转录病毒特征,缺乏肿瘤基因。其gp85氨基酸序列与ALV-K参考株一致性90.9%～98.6%,显着高于其它亚群ALV,遗传进化树上与ALV-K参考株划为同一支;其中,与ALV-K原型株JS11C1一致性最高,二者显示出较多位点的规律性变异,但也存在5个位点差异。JS13LY19株gag、pol、gp37、LTR、UTR与内源性ALV显示更高的一致性（92.0%～99.4%）;LTRU3区比大部分外源性ALV LTR少了一个CAAT enhancer盒、PRE盒、CArG盒及Y盒。推测,JS13LY19株极有可能是JS11C1株与内源性ALV重组产生。拥有内源性ALVLTR及U3区转录调控元件的部分缺失,可能使JS13LY19株转录能力下降而致病性降低,其生物学特性有待进一步研究。3.禽白血病病毒多重PCR检测方法的建立及初步应用流行病学调查结果显示,鸡群中存在的外源性ALV主要包括ALV-J、ALV-K、ALV-A和ALV-B。为快速掌握鸡群感染状态,本研究针对ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K参考株,设计了一条通用上游引物PF和四条特异性下游引物AR、BR、JR和KR,通过构建质粒标准品,对最适引物浓度、退火温度、循环数等反应条件进行优化,建立了一种能同时检测ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K的多重PCR方法,并对其特异性、敏感性和重复性进行了验证,将其应用于从地方品种鸡群分离的119份ALV样品的检测中。试验结果显示,使用 0.2 μM PF、0.1 μM AR、0.1 μM BR、0.1 μM JR 和 0.1 μM KR,56.0℃退火温度和30个循环的反应条件,建立的多重PCR方法检测效果最优,能检测出最低10 pg/μL的ALV前病毒DNA样品,特异性高,重复性好。对ALV样品的检测结果与流行病学调查结果基本相符,并能更高效地检测出ALV的多重感染。表明,地方品种鸡群除单一感染外,还存在 ALV-B+J、ALV-J+K 的二重感染,以及 ALV-A+B+J、ALV-A+B+K、ALV-B+J+K的三重感染。本研究为禽白血病流行病学调查及外源性ALV初步鉴定提供了技术支撑。4.种公鸡精液禽白血病病毒检测方法研究与应用选择合适的检测材料与方法对禽白血病净化会起到事半功倍的效果,为探讨种公鸡精液ALV检测的可行性与实用性,本研究对LK品种种公鸡精液经过滤、稀释、离心、冻融等不同处理方法,以及精液不同稀释度对病毒分离效果的影响进行了研究,并将确定的检测方法应用于LK、MQ和LH 3个品种种公鸡的检测净化中,同时与血浆病毒分离或血浆斑点杂交检测结果进行比较。结果,以血浆病毒分离为标准,精液样品经稀释离心后,取上清接种DF-1细胞,确保在培养基中最终稀释度为1:28～1:56时病毒分离效果最佳。初步应用结果显示,不同鸡种精液p27抗原ELISA检测阳性率均最高,但并不能将血浆和精液病毒分离检测为阳性的鸡均检出,存在“假阴性”;同一鸡种血浆和精液病毒分离阳性率高低不同,在LK和MQ种公鸡中,二者阳性符合率均低于50%,两种方法不可互相取代;LH种公鸡精液病毒分离阳性率显着高于血浆病毒分离,亦高于血浆斑点杂交,二者阳性符合率分别为100%和36.4%,精液病毒分离效果优于血浆病毒分离。研究结果提示,对种公鸡精液进行ALV检测具有可行性和必要性,由于不同鸡种净化进程不同、带毒排毒状态不一,检测方法也应灵活运用。本研究为种禽场禽白血病净化材料的选择与方案制定提供了参考依据。5.地方品种鸡群禽白血病示范性净化本研究在2013～2016年间对原种场保存的DX、LY、XJ和LH 4个鸡种核心群开展了禽白血病净化,通过新建净化鸡舍,采用1日龄胎粪p27抗原检测、6周龄血浆病毒分离、25～27周龄血浆/精液病毒分离+蛋清p27抗原检测、36～40周龄血浆/精液病毒分离+蛋清p27抗原检测等净化方案,在强化饲养管理的基础上,经过2～3个世代净化,各品种鸡群取得了显着净化效果。DX鸡种经过3个世代净化,25～27周龄蛋清p27抗原阳性率由26.4%降至0.3%,36～40周龄血浆病毒分离阳性率由36.4%降至0.4%,公鸡病毒分离阳性率连续2个世代均为零;LY鸡种经过3个世代净化,6周龄血浆病毒分离阳性率由33.2%降至1.2%,36～40周龄蛋清p27抗原和血浆病毒分离阳性率均降至零;XJ鸡种经过2个世代净化,留种前血浆病毒分离阳性率由61.8%降至0.9%;LH鸡种经过2个世代净化,留种前蛋清p27抗原阳性率由20.7%降至1.9%,血浆病毒分离阳性率降至0.2%。禽白血病净化对种鸡生产性能的影响,以DX鸡种为例,经过3个世代净化,育雏期、育成期和产蛋期死亡率均逐级下降,净化第一世代效果最为显着;产蛋性能亦明显提高,43周龄总产蛋数平均增加了 13枚/只,66周龄总产蛋数平均增加了 23枚/只。本研究为众多地方品种鸡群及原种场禽白血病净化工作的开展起到了良好的示范作用。
赵广武[3]（2017）在《六种家禽免疫抑制相关病液相芯片检测试剂盒的研制》文中进行了进一步梳理本研究以家禽免疫抑制性疾病为研究对象,以建立快速、灵敏、准确、简便、实用、高通量的检测方法为目标,建立了家禽免疫抑制性疾病多重通用扩增鉴别诊断（General multiplex RT-PCR integrated with luminex,GMPLex）检测方法。本论文主要研究内容如下:按照国家标准采用HA（Hemagglutination）、HI（Hemagglutination ingibition）和real time RT-PCR（real time reversetranscriptionpolymerase chain reaction）三种方法对10株深圳出入境检验检疫局保存的不同年代的家禽免疫抑制性病毒毒株进行了确证。通过HA和HI试验确定A/Chicken/Hongkong/SZ-HI/1997（H5N1）毒株和NDV-F48E9毒株对鸡胚的特异性死亡数量,根据Reed-Muench算法计算出A/C hicken/Hongkong/SZ-HI/1997（H5N1）毒株的鸡胚半数致死量ELD50为10-7.75/0.2mL,NDV-F48E9毒株的鸡胚半数致死量ELD50为10-8.5/0.2mL。设计了针对禽流感病毒的M基因（AIV-M）、新城疫病毒的F基因（NDV-F）、传染性法氏囊病毒的VP2基因（IBDV-VP2）、马立克氏病毒1型的PP38基因（MDV-PP38）、J型禽白血病病毒的ENV基因（ALV-J-ENV）、鸡传染性贫血病毒的VP2（CAV-VP2）的特异性鉴别诊断引物和探针,引入通用超级引物,创建了一个全新的通用多重RT-PCR检测方法,实现了对家禽免疫抑制性病毒多个亚型的目标片段一次多重RT-PCR扩增目的,解决芯片检测过程中需要多次PCR扩增的瓶颈。将通用多重RT-PCR检测方法与液相芯片高通量检测方法结合,建立起家禽免疫抑制性疾病多重通用扩增鉴别诊断GMPLex检测方法。所建GMPLex检测方法检测通量高,可一次对六种家禽免疫抑制性病毒的六个目的基因进行鉴别诊断;方法快速,家禽免疫抑制性病毒鉴别诊断检测可在6h内完成;特异性强,通过两套套式引物和一个特异性探针来确保每个亚型的特异性,病毒各个亚型毒株相互之间没有发现交叉反应,与其他病原体之间也无非特异性反应;灵敏度高,GMPLex法检测出H5病毒的检测灵敏度为病毒尿囊液稀释至10-5(相当于280 ELD50),检测出新城疫毒株的检测灵敏度为病毒尿囊液稀释至10-5(相当于280 ELD50)。GMPLex快速高通量检测方法检测三个RNA毒株检测灵敏度为病毒尿囊液稀释至10-4(相当于2800 ELD50)。采用所建立的家禽免疫抑制性疾病多重通用扩增鉴别诊断GMPLex检测方法对实验室保存的160株禽病病毒株进行小样本检测,检测结果与经典检测方法结果一致。证明所建立的GMPLex快速高通量鉴别诊断检测方法能够满足口岸家禽免疫抑制性病毒检测快速高通量的要求,为搭建家禽免疫抑制性病毒快速高通量的检测平台打下良好基础。
朱丽君[4]（2017）在《泰山松花粉多糖对ALV-J不同接种途径诱导的鸡群免疫抑制的免疫调理作用》文中提出家禽免疫抑制病是养禽业中不可忽视的重大疫病之一,其传染因子通过侵害家禽的免疫系统、免疫器官、免疫细胞而造成鸡群疫苗免疫失败、病原继发感染和病原混合感染,导致禽业生产损失严重。免疫抑制病由于其亚临床感染及极易误诊的免疫抑制形成巨大的潜在危害性,使疫病防控面临严峻形势和巨大挑战。禽白血病（Avian Leucosis,AL）是由ALV（Avian Leukosis Virus）和ASV（Avian Sarcoma Virus）感染引起的肿瘤性免疫抑制病。J亚群禽白血病病毒（Subgroup J avian leucosis virus,ALV-J）是具有更强致病性和感染性的新亚型,可产生多种肿瘤,诱发鸡群死亡,造成亚临床感染及免疫抑制等不容忽视的危害。ALV-J具有比其他禽白血病亚型更快更强的水平传播能力,雏鸡出壳后是ALV-J发生水平传播的一个重要时期,不同接触及接种途径均可导致ALV-J水平感染,但不同接种途径诱导的雏鸡免疫抑制情况尚未明确,亟待探究。本实验室前期研究的泰山松花粉多糖（Taishan pinus massoniana pollen polysaccharide,TPPPS）免疫增强和抗病毒活性显着,经注射给药能够有效缓解B亚群禽白血病病毒的致病性,但TPPPS注射给药不仅会给机体造成应激而且也不利于生产应用,目前TPPPS口服给药的作用效果及其对ALV-J早期水平感染的调理作用亟需探究。鉴于上述研究背景,本研究首先通过建立ALV-J不同接种途径的人工感染雏鸡模型,分析ALV-J不同感染途径诱导雏鸡免疫抑制程度的差异,以评价ALV-J不同水平传播途径对鸡的感染力和致病力。1日龄SPF鸡分别经口服、点眼、腹腔注射、肌肉注射途径感染ALV-J,监测各感染组鸡只的生长性能、带毒和排毒规律,并对其病毒血症、相关免疫学指标及抗体反应进行动态检测。结果发现,各感染组鸡的生长性能和免疫应答水平存在明显差异。从感染后第2周开始腹腔注射和肌肉注射组可检出泄殖腔排毒和病毒血症,此后持续带毒、排毒;体重、免疫器官指数、CD4+和CD8+T淋巴细胞数、细胞因子（IL-2、IL-4和IFN-γ）分泌量以及淋巴细胞转化率显着低于对照组;抗体转阳不明显。而口服、点眼感染组与对照组相比引起的免疫抑制程度并不显着。结果表明,低日龄雏鸡感染ALV-J易造成免疫抑制,其中腹腔注射和肌肉注射感染造成鸡体带毒、排毒和免疫抑制的能力最强。本研究明确了鸡群ALV-J水平传播的不同途径与鸡的感染力、免疫抑制力之间的关系,为研究ALV-J的感染机制、种群净化以及防控提供了理论依据。其次,为了探讨TPPPS对ALV-J不同接种途径诱导1日龄SPF雏鸡免疫抑制的免疫调理作用,本研究分别经口服、点眼、腹腔注射、肌肉注射模拟水平传播感染ALV-J,同时连续10 d口服给予TPPPS,分别对各组试验鸡体重及免疫器官指数、带毒、排毒及抗体、相关免疫学指标进行检测比较。结果显示,饲喂多糖组与接毒组相比,试验鸡体重及免疫器官指数抑制程度得到改善,血液带毒及泄殖腔排毒量降低,抗体分泌提前、分泌量增加,T淋巴细胞转化率、IL-2及IFN-γ细胞因子分泌量、CD4+和CD8+T细胞数提升较大,其中以腹腔注射和肌肉注射组TPPPS的免疫调理作用最显着,而健康对照组饲喂TPPPS后试验鸡相关免疫指标水平提高。本试验结果揭示了TPPPS对健康雏鸡具有一定的免疫增强作用,口服TPPPS对不同水平传播途径感染ALV-J引起的免疫抑制具有免疫调理作用,TPPPS可作为有效免疫增强剂以防控ALV-J早期水平感染,降低其免疫抑制程度,减少经济损失。
吕佳泓[5]（2014）在《鸭群中禽白血病病毒的核酸检测》文中研究说明禽白血病是由禽白血病/肉瘤病毒群引起的以造血细胞增生为主的一类肿瘤性疾病。禽白血病病毒（Avian leukosis virus）属于反转录病毒科的a-反转录病毒属。根据其囊膜蛋白的不同，禽白血病在鸡的体内分为A、B、C、D、E、J六个亚群。其中，E亚群病毒为内源性禽白血病病毒，普遍存在于鸡群中，几乎没有致瘤性，对鸡群的影响较低。A、B、J亚群是鸡群中引发肿瘤的主要外源性ALV，C、D亚群的外源性ALV较为少见。其他的内源性ALV如F、G、H、I,存在于雉、鹌鹑、鹧鸪等鸟体内。鸡是禽白血病病毒的自然宿主，而目前为止，还没有关于鸭群中禽白血病的报道。为了解鸭群中禽白血病的流行情况，本研究采集了四川绵阳、江苏徐州、山东烟台、潍坊、聊城和滨州六个不同地区鸭群的鸭子组织样品共510份，通过PCR方法用p27抗原检测鸭子体内禽白血病病毒核酸的携带情况。根据核酸序列测定分析，结果表明：11%（58/510）的鸭子体内携带禽白血病病毒的核酸。另外设计引物对58份阳性样品进行完整的env基因扩增，结果其中2份扩增出完整的env基因，长度为1857bp，另有5份扩增出缺失808bp的env基因，长度为1049bp。将扩增出的7份阳性样品的env基因与ALV各个型的env基因进行序列比对，结果显示其与内源性E亚群ALV的env基因高度同源。研究结果显示ALV的核酸在鸭群中普遍存在，并呈现出与鸡的白血病病毒核酸不一样的分子生态，但是否在鸭群中存在外源性白血病病毒仍然需要进一步研究。近年来，我国不少地区尤其是地方品系鸡中分别分离到A亚群和B亚群禽白血病病毒，这说明我国鸡群中ALV存在的普遍性。继ALV-J的特异性单克隆抗体研制成功后，抗A、B亚群ALV囊膜糖蛋白的单克隆抗体也成功的制备出来，为外源性ALV的诊断提供了依据，但均不能区分A、B亚群ALV。为区分经典型A、B亚群ALV，本研究通过比较A、B亚群ALV的gp85基因，对B亚群ALV的gp85基因进行了部分分段原核表达，免疫小鼠获得单因子血清，用获得的单因子血清与A、B、J型ALV做IFA，以达到分型目的。试验结果表明，本方法获得的单因子血清均不与J亚群的毒株发生反应，却均能与A、B亚群的毒株发生阳性反应，无法达到区分A、B亚群的目的。
王琦[6]（2014）在《J亚群禽白血病病毒致病性增强的分子机制》文中研究表明J亚群禽白血病是由J亚群禽白血病病毒（ALV-J）引起的一类禽肿瘤性疾病。自1988年从鸡中首次分离ALV-J以来，ALV-J在世界各地鸡群广泛流行。欧美国家通过净化措施几乎在鸡群中根除ALV-J,但ALV-J自1999年传入我国鸡群后，就一直在鸡群中流行，特别是2008年以来，ALV-J在我国一些蛋鸡群中暴发，发病率高达60%，致鸡死亡率超过30%，其主要引起临床症状为血管瘤及各实质脏器肿瘤，由于禽白血病是垂直传播为主的种原性疾病，一些种禽场纷纷被告倒闭。ALV-J给我国养禽业造成的严重损失，受到了政府和养殖业的广泛关注。本研究以流行病学和ALV-J基因组遗传演化分析为突破口，运用反向遗传技术阐明了ALV-J致病力增强的分子基础，并从ALV-J与宿主互作角度解析了ALV-J致病性增强的分子机制。本研究首先在我国ALV-J暴发的疫区进行系统流行病学调查，共分离鉴定了16株ALV-J蛋鸡分离株，遗传演化分析发现，ALV-J蛋鸡分离株较早期ALV-J肉鸡分离株有多个基因发生了突变或缺失，其中77.8%（21/27）的ALV-J蛋鸡分离株env基因存在显着差异；虽然U3区中转录元件都较为保守，但仍有84.2%（16/19）的ALV-J蛋鸡分离株U3区存在点突变；89.5%（17/19）的ALV-J蛋鸡分离株的3’UTR出现跨rTM和DR-1区的205nt缺失。进一步根据ALV-J毒株分离年代比对3’UTR序列，发现ALV-J3’UTR随着时间推移逐步发生缺失并最终形成205nt缺失，提示近年来造成我国蛋鸡群疫情的ALV-J流行株，其基因组3’UTR的205nt缺失，是由ALV-J早期毒株历经基因组序列变异而逐渐演化产生。为探究该205nt缺失是否与ALV-J在我国鸡群中致病力增强有关，利用反向遗传拯救了一对病毒：一株是以中国蛋鸡ALV-J流行毒株HLJ09SH01为亲本毒拯救的rHLJ09SH01，即缺失205nt病毒；另一株是在缺失位置嵌合插入205nt的拯救病毒rHLJ09SH01A205，即嵌合205nt病毒。利用亚病毒基因组载体，发现缺失205nt的3’UTR通过促进未剪切RNA的核质穿梭，使缺失205nt病毒在血管内皮细胞中的更高水平的复制；通过238天的动物实验，发现缺失205nt病毒造成蛋鸡死亡率达63.2%、出瘤率达57.9%、垂直传播达100%；而嵌合205nt病毒造成蛋鸡死亡率为38.1%、出瘤率为33.3%、垂直传播为44%；缺失205nt病毒造成肉鸡死亡率达75%、出瘤率达83.3%；而嵌合205nt病毒造成肉鸡死亡率为50%、出瘤率为57.1%（8/14）。这些结果表明不论在蛋鸡还是肉鸡中，缺失205nt病毒均有更强的致死力，更高的致瘤性和更为严重的垂直传播能力。因此证明ALV-J3’UTR的205nt缺失是ALV-J致病性增强的分子基础。为深入揭示缺失205nt病毒致病性与致瘤性增强的机制，结合ALV-J在我国鸡群中致血管瘤的临床表现特点，在模拟血管新生的鸡胚中，通过卵黄囊途径接缺失205nt病毒和嵌合205nt病毒，发现缺失205nt病毒可以引起血管内皮生长因子A（VEGF-A）及其受体血管内皮生长受体2（VEGFR-2）更高水平表达，同时缺失205nt病毒在鸡胚中有更高的复制水平，说明ALV-J的复制水平与VEGF-A和VEGFR-2表达水平呈正相关，利用反向PCR，发现VEGF-A和VEGFR-2的高水平表达不是通过ALV-J病毒基因组插入引起。揭示ALV-J是通过基因组变异而提高自身复制能力，从而致使VEGF-A和VEGFR-2的表达水平有更多机会超过其体内致瘤阈值，从而增强ALV-J致病致瘤的机制。TP53基因是抑癌基因，可抑制肿瘤发生，已是学术界的共识。为明确TP53基因在ALV-J致病过程中的作用，本研究建立了ALV-J感染DF-1的持续感染细胞模型，证实ALV-J持续感染可以使细胞中TP53基因发生突变。为探究TP53基因突变前后功能差异，分别表达DF-1原型p53蛋白和TP53基因突变后编码的突变型p53蛋白，通过染色体免疫共沉淀试验和凝胶阻滞试验发现，原型p53蛋白可以与ALV-J U3在细胞核中发生相互作用而抑制ALV-J的复制，而突变型p53蛋白不能在细胞核中与U3发生结合，而最终失去抑制ALV-J复制的能力。ALV-J感染宿主细胞后，原型p53蛋白作为细胞反应压力上调表达，通过与U3结合抑制ALV-J复制，病毒采取致TP53基因突变的对抗手段，最终使宿主细胞失去限制ALV-J复制的作用，复制增快的ALV-J最终具有了更强的致病性。目前对ALV-J的防治以淘汰净化为主，而microRNAs（miRNAs）抗病毒功能在无疫苗的病毒防治中具有广阔前景。通过生物信息学分析发现有4个候选miRNAs分子可以靶向5’UTR，利用特异miRNA抑制子分别抑制候选miRNAs分子，发现抑制gga-miR-1650可以显着还原psi-5’UTR被抑制的活性（P=0.0014）。同时，过表达gga-miR-1650可以显着抑制psi-5’UTR活性，利用突变策略验证gga-miR-1650与5’UTR的结合靶点，发现gga-miR-1650的种子区和非种子区都在结合过程中发挥作用，过表达gga-miR-1650抑制含有其靶点ALV-J的复制。进一步分析gga-miR-1650靶点序列，发现靶点序列在ALV-J毒株中保守存在，说明gga-miR-1650可用于抑制ALV-J各流行毒株复制。本研究基于ALV-J在我国致病力增强且对我国养禽业造成巨大危害的大背景环境下，首先对我国鸡群流行的ALV-J毒株进行了分离鉴定及遗传演化分析，发现3’UTR205nt的缺失是ALV-J中国蛋鸡毒株基因组的重要进化特点。通过反向遗传和致病性研究，证明3’UTR205nt的缺失是ALV-J致病性增强的分子基础。宿主多种因子参与ALV-J的致病过程，VEGF-A和VEGFR-2高水平表达及TP53基因突变均参与ALV-J致病力的形成。另外，从无疫苗的病毒防治角度入手，筛选和鉴定了能够限制ALV-J感染的宿主miRNA gga-miR-1650。本研究阐明了ALV-J在我国鸡群中致病性增强的分子基础和分子机制，同时为ALV-J的防控和净化提供重要科学思路和依据。
王帅[7]（2013）在《地方品系鸡白血病流行病学调查与ALVp27基因的表达分析》文中研究说明为了解地方品系鸡禽白血病的感染情况以及禽白血病的净化效果，本研究对莱芜黑鸡、百日鸡、芦花鸡、琅琊鸡、寿光鸡和石岐杂鸡六个地方品系鸡和经两个世代净化的B1、B3两个纯系鸡的禽白血病的抗原和血清进行了检测。结果表明：莱芜黑、百日、芦花、琅琊、寿光和石歧杂六个地方品系鸡蛋清P27抗原阳性率分别为60.33%、30.40%、37.63%、72.96%、42.11%、5.74%，公鸡泄殖腔棉拭子p27抗原阳性率分别为71.23%、44.30%、57.95%、45.83%、70.43%、14.88%，ALV-AB抗体阳性率分别为6.82%、7.81%、9.80%、8.57%、19.18%、13.13%，琅琊鸡和石岐杂鸡ALV-J抗体阳性率分别为1.43%、2.02%；B1、B3两个纯系鸡蛋清p27抗原阳性率分别为5.19%、3.34%，公鸡泄殖腔棉拭子p27抗原阳性率分别为20.51%、25.00%，其子代1日龄胎粪p27抗原阳性率分别为6.17%、1.38%。调查结果显示地方品系鸡不同品系之间禽白血病病毒阳性检出率差异较大，总体上禽白血病病毒阳性检出率明显较高，且公鸡泄殖腔棉拭子禽白血病病毒阳性检出率普遍高于母鸡，下一步应重点控制。经过净化的鸡群禽白血病病毒阳性检出率有明显的下降，J亚群禽白血病病毒得到有效净化，种群净化效果较为明显。本研究通过调查初步掌握了当前地方品系鸡禽白血病的感染情况及净化的效果，对下一步禽白血病的净化和控制提供了一定的理论依据和参考。对地方品系鸡p27抗原检测为阳性的鸡采集外周抗凝血，接种DF-1细胞，连续传代两次后，进行p27抗原ELISA检测和PCR检测,初步确认分离毒为ALV，将其命名为YZ株。为进一步分析其亚群，针对gp85设计特异性引物，进行扩增、克隆及测序，同源性分析结果表明YZ株与ALV-J代表株同源性在91.6%-94.3%，与ALV－AB、ALV-E代表株同源性较低,进化关系分析结果表明ALV-YZ与AF125527-J株的遗传距离最近，处于同一个分支。根据已发表序列设计一对特异性引物RT-PCR扩增ALV-YZ株p27基因，克隆至pMD18-T载体,定向插入到pET32a（+）表达载体上，构建了重组质粒pET-32a-p27。将构建的重组表达质粒转化受体菌BL21（DE3），获得含有重组质粒的工程菌,进行IPTG诱导表达,诱导表达4h时表达量最高。SDS-PAGE电泳结果显示表达产物大小约为45KD，与预期结果大小相符。Western blotting鉴定结果表明，该融合蛋白能与ALV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。为下一步研制针对鸭、鹅等非鸡源的单抗和多抗，进行鸭、鹅等禽类禽白血病的感染和流行情况的调查奠定了基础。
禚雯超[8]（2013）在《J亚群ALV的分离鉴定及三种方法动态比较分析其在DF-1细胞中的增殖》文中提出禽白血病（Avian Leukosis，AL）是由反转录病毒科禽白血病病毒/肉瘤病毒群病毒（ALV/RSV）引起的，以造血细胞恶性增生为主要病变的一类禽的多种良性和恶性肿瘤性传染病。根据病毒的囊膜蛋白、与病毒宿主特异性相关的gp85蛋白抗原性的差异以及交叉中和试验等，将禽白血病可分为A～J10个亚群，其中只有A、B、C、D、E和J亚群能感染鸡。目前，商品鸡群中以致病性外源性病毒以A亚群和J亚群感染为主，二者流行性最为广泛，且ALV-J较其它亚群的外源性ALVs有更强的水平传播能力。病毒分离鉴定表明，白血病/血管瘤主要是由J亚群禽白血病病毒引起，但也同时有的是由A、B亚群白血病病毒感染引起的。这不仅仅是肉鸡和蛋鸡的问题，这也是我国地方品系鸡（如麻鸡、三黄鸡等）的主要问题。由于经典的A、B、C、D亚群白血病在我国长期得不到关注且无任何净化措施，极有可能已经在地方品系鸡中广泛流行，甚至发生了新的变异产生了新的亚型。1. SDAU12株ALV-J病毒的分离鉴定本实验通过接种DF-1细胞，成功的从广州某三黄鸡种鸡场分离到一株外源性ALVSDAU12，测得了其env基因序列，并与其他亚群的已知参考毒株进行了同源性比较。分析结果表明，SDAU12毒株的gp85基因与AD亚群外源性参考毒株的同源性在49.5%51.4%；与内源性E亚群参考毒株的同源性仅51.1%左右，而与4株J亚群国际参考株之间的同源性较高，为87.4%94.6%，其中与SD07LK1的同源性最高，可达94.6%；gp37基因与SD07LK1的同源性最高为95.2%。SDAU12毒株gp85基因编码的氨基酸序列与其他参考毒株的同源性与4株J亚群参考株之间的同源性较高，为84.3%92.5%之间，其中与SD07LK1株的同源性为92.5%。其gp37基因编码的氨基酸序列的同源性与内源性E亚群参考毒株的同源性仅为58.2%，而与4株J亚群参考株之间的同源性较高，为91.3%94.4%之间，其中与SD07LK1株gp37基因编码的氨基酸序列的同源性最高，为92.5%。2.利用ELISA、FA及IFA法对该病毒在DF1细胞上增殖动态的比较分析为了比较酶联免疫吸附试验、直接免疫荧光和间接免疫荧光技术三种试验方法在J亚群禽白血病病毒增殖过程中动态监测的敏感性，并以此为基础分析评估者三种试验方法在生产实践中的实用性，首先将该毒株其接种于DF-1细胞（C/E系）上，运用间接免疫荧光法测得其半数致死量TCID50为10-4.02，然后分别按照1×104，1×103，1×102TCID50四个浓度接种于处在对数期的DF1细胞上，并设置空白对照组，每个梯度设三个重复。分别在接种后维持1d、2d、3d、4d、5d、6d时收取细胞上清液，并立刻保存至-80℃，用于酶联免疫吸附试验法针对禽白血病病毒P27抗原的特异性检测；此外，飞片法收集每个梯度1d～6d的DF1细胞，用于直接免疫荧光法和间接免疫荧光法针对J亚群禽白血病病毒特异性单克隆抗体JE9的检测。实验结果表明，酶联免疫吸附试验法在接种维持后的第三天可检测出1×104和1×103TCID50浓度的上清液中含有少量的阳性细胞，而直至第四天才能检测出1×102TCID50浓度上清液有阳性细胞；直接免疫荧光法第三天便能检测到接种1×102TCID50浓度的细胞中含有阳性细胞，另外两个浓度在第一天即可观察到阳性细胞，但阳性细胞量较少；间接免疫荧光法在接种1×102TCID50浓度病毒后维持的第二天便有阳性细胞的检出，而1×104和1×103TCID50浓度第一天即可检测到大量的阳性细胞。结论：1.通过对SDAU12毒株基因序列的分析，根据该病毒与其他参考毒株之间的gp85及gp37基因的核酸序列及他们所编码的氨基酸序列同源性的比较分析，可以确定本实验所分离的SDAU12毒株确实是ALV-J，该毒株与参考毒株SD07LK1的同源性最高，这两株ALV-J的关系比较密切。该病毒是从广州某三黄鸡种鸡场疑似ALV感染病鸡中分离得到的，由此可知，ALV-J已经蔓延至我国多种地方品系鸡。2.接种病毒后，间接免疫荧光法对SDAU12病毒感染的阳性细胞的检出率最高而且检出病毒的时间最早，直接免疫荧光法次之，而酶联免疫吸附试验的敏感性最低。酶联免疫吸附试验的可操作性强，步骤简单明了，但其敏感性较低，且假阳性率和假阴性率较高；而间接免疫荧光法准确性和敏感性都很高，但需要配备荧光显微镜，技术要求较高，因此，在家禽养殖的生产实践中，为了更好地进行J亚群禽白血病病毒感染的监测，我们应选择在对样本进行酶联免疫吸附试验检测的同时，结合间接免疫荧光法以确保实验结果的准确性和可信度。
杨凤[9]（2011）在《山东地区禽白血病发病鸡群的流行病学调查及致病特性的研究》文中进行了进一步梳理禽白血病（avian leucosis, AL）是指由反转录病毒科甲型反转录病毒属禽白血病病毒引起的以禽类造血组织中某些细胞成分过度增生为主的一类可传染的肿瘤性疾病,其病毒可划分为A-J 10个亚群,本病以垂直和水平传播两种方式在世界各国鸡群中广泛流行,引起鸡死亡或消瘦、生长和发育不良,同时引起机体抵抗力下降和免疫抑制,成为危害养禽业的主要疾病之一。至目前为止,无任何可预防和治疗的药物。为减轻该病毒对养鸡业的危害,探索合适的预防和治疗方法成为生产上亟待解决的问题。1.山东地区禽白血病发病鸡群血清及棉拭子ELISA检测结果表明:山东地区鸡群P27抗原及ALV抗体均有阳性, P27抗原平均阳性率为19.36%;ALV-A/B、ALV-J及REV抗体平均阳性率分别为9.29%、5.18%、13.77%,个别鸡呈现抗体双阳性,说明部分鸡群可能存在ALV-A/B和ALV-J 2种或3种病毒同时感染。各品系鸡群抗体阳性率不尽相同,海兰鸡从祖代到商品代,其P27抗原阳性率、ALV-J、ALV-A/B抗体阳性率逐渐升高。检测结果表明山东地区鸡群普遍存在ALV感染,某些引进的祖代鸡群也不例外,其中以ALV-J为主,ALV-A和ALV-B同时存在,且存在与MDV、REV的混合感染。病理学诊断证明:肿瘤类型主要为髓细胞瘤（27/41）、血管瘤或血管内皮细胞瘤（7/41）、纤维肉瘤（2/41）、平滑肌肉瘤（2/41）及马立克氏病（5/41）,其中许多病例为多种组织起源的混合肿瘤,如髓细胞及血管混合瘤。发病鸡群主要是商品鸡群和父母代鸡群,海兰褐祖代鸡群也有发病。病鸡主要由ALV-J感染所致,病鸡均表现骨髓髓系细胞灶状或弥漫性增生,严重时骨髓可完全被这种髓细胞取代。PCR检测结果显示,41份病料中有33份为ALV-J阳性（80.49%）;22份为MDV阳性（53.66%）;两者共感染率高达43.9 %;从疑似病例分离到的17株ALV-J病毒gp85基因的同源性为94.0%100%,与ALV-J原型株HPRS-103 gp85基因同源性为94.3%98.7%;与其它已发表的分离毒株ALV-J gp85基因的同源性较低（84.496.8%）。血液常规指标检测中,海兰蛋鸡白细胞总数、淋巴细胞总数、血小板总数、血小板平均体积及血小板压积均低于健康对照组,且差异显着,而红细胞总数、血红蛋白含量及血红蛋白浓度与对照组差异不显着。调查结果表明,目前山东地区鸡群均存在ALV感染,其中以ALV-J为主,ALV-A和ALV-B同时存在,且存在与MDV、REV的混合感染,病鸡主要由ALV-J感染所致主要表现髓细胞瘤和血管瘤,不同鸡群分离的ALV-J毒株存在一定的变异。2.中国特有品种-芦花鸡鸡群在240日龄时出现13.24%的ALV-AB抗体阳性率,未检测到ALV-J抗体,REV抗体在120日龄时出现阳性,且阳性率随日龄增加而升高;P27阳性率从34.21%-66.18%不等;开产前后鸡群开始出现肿瘤性疾病,一直持续至240日龄,死亡率达32%,120-190日龄为死亡高峰期;剖检病鸡可见内脏器官普遍肿大,肝、脾、肾表面及切面有大小不等的灰白色肿瘤样结节,部分病鸡坐骨神经肿胀;组织学检查,肿瘤组织为浸润性生长的多形态淋巴样细胞构成,符合MD的病变特征;PCR检测16份肿瘤病料中有14份为ALV-J阳性（87.5%）,13份MDV阳性（81.25%）,2份为REV阳性（12.5%）, ALV-J与MDV、REV混感率分别为68.8%（11/16）、12.5%（2/16）,三重感染率为6.3%（1/16）。该芦花鸡群存在ALV-J、MDV和REV的共感染,但主要表现MD肿瘤性疾病,在肿瘤病例中存在严重的ALV-J免疫耐受性感染。血液常规指标检测中,中国特有品种芦花鸡红细胞总数、血红蛋白含量、血红蛋白浓度均低于对照组,且差异显着;淋巴细胞总数高于对照组,且差异显着;血小板总数、血小板平均体积、血小板压积均低于对照组,且差异极显着,而白细胞总数与对照组差异不显着。检测结果表明,目前山东地区鸡群包括中国地方品种芦花鸡均存在ALV感染,其中以ALV-J为主,ALV-A和ALV-B同时存在,且存在与MDV、REV的混合感染;病鸡主要由ALV-J感染所致,不同品系商品鸡群主要表现髓细胞瘤和血管瘤,并见其它组织肿瘤,芦花鸡则主要表现马立克氏病病变;自不同鸡群分离的ALV-J毒株存在一定的变异。
孙亚妮[10]（2011）在《免疫组织化学技术在鸡三种病毒性肿瘤病鉴别诊断中的应用》文中研究指明近几年来,随着饲养规模的扩大,禽白血病、马立克氏病和网状内皮组织增生症等肿瘤病的发病率越来越高,给养殖业带来巨大的经济损失,并且以前的流行病学调查发现,临床上三种肿瘤病的混合感染非常普遍,从而导致通过临床症状对这三种肿瘤病进行鉴别诊断非常困难,容易出现误诊。另外,目前该三种肿瘤病的实验室检测方法也存在许多不足之处。本研究结合免疫组织化学检测方法具有快速、特异性好、可鉴别诊断等优点,利用实验室保存的J亚群禽白血病病毒HN0001株、马立克氏病毒GX0101株和网状内皮组织增生症病毒SNV株分别攻毒1日龄SPF鸡,取攻毒后鸡的脏器,利用针对这三种病毒的单抗,分别建立这三种疾病的免疫组织化学检测方法;并且通过三种病毒共感染1日龄SPF鸡,对感染后不同周龄鸡的肝脏、肾脏和法氏囊等脏器进行HE染色和病理学观察,了解三种病毒共感染1日龄SPF鸡后不同脏器的动态病理学变化;同时通过免疫组化检测不同脏器内的病毒,研究三种病毒在不同脏器组织细胞内的动态分布,以及利用连续切片对病毒感染进行细胞定位,在同一视野下观察三种病毒是否能够感染同一个组织细胞。最后本研究利用建立的免疫组织化学方法,和特异性强的传统的病毒分离方法对来自北京、山东和河南部分养鸡场的肿瘤病死鸡进行了这三种病毒感染的调查,比较了两种检测方法在鸡肿瘤病诊断中的优缺点。1. J亚群禽白血病、马立克氏病和网状内皮组织增生症免疫组织化学检测方法的建立1.1 J亚群禽白血病免疫组织化学检测方法的建立J亚群禽白血病病毒HN0001株腹腔攻毒1日龄SPF鸡,从攻毒后第4周鸡只开始出现死亡,通过利用该病毒传统的实验室诊断技术IFA实验验证了HN0001成功感染鸡只。同时取病死鸡的不同脏器制作石蜡切片后,通过对免疫组化的关键步骤:抗原修复时间和方式、过氧化氢消化时间、一抗稀释比例、DAB显色时间等条件的优化,成功建立了ALV-J免疫组织化学检测方法。结果发现抗原修复采用柠檬酸盐缓冲液中92-98℃加热15min;过氧化氢消化为室温消化20-30min;DAB显色时间为室温下10min。ALV-J单克隆抗体JE9稀释比例为1:150,检测到的阳性染色主要出现在肝脏和法氏囊的胞核和胞浆中、脾脏的胞浆和肾脏的胞膜、胞浆中。1.2鸡马立克氏病免疫组织化学检测方法的建立马立克氏病病毒GX0101株腹腔攻毒1日龄SPF鸡,从攻毒后第5周开始出现死亡,也利用IFA实验验证了GX0101成功感染鸡只。通过对抗原修复时间和方式、过氧化氢消化时间、一抗稀释比例、显色时间等条件的优化,成功建立了MDV免疫组织化学染色方法。结果发现MDV单克隆抗体H19稀释比例为1:150,其它条件与ALV-J的方法一致;同时检测到阳性染色主要出现在肝脏、肾脏和法氏囊的胞核和胞浆、脾脏的胞浆中。1.3鸡网状内皮组织增生症免疫组织化学检测方法的建立网状内皮组织增生症病毒SNV株腹腔攻毒1日龄SPF鸡,从攻毒后第4周开始出现死亡,也通过病毒分离实验验证了SNV株成功感染鸡只。同时也通过对抗原修复时间和方式、过氧化氢消化时间、一抗稀释比例、显色时间等条件的优化,成功建立了该病免疫组织化学染色方法。结果发现REV单克隆抗体11B118稀释比例为1:300,同样其他条件也与ALV-J的相同。可以从肝脏、肾脏、脾脏和法氏囊组织细胞的胞浆中观察到阳性染色。2.三种肿瘤病毒共感染SPF鸡的动态病理学观察本研究利用HN0001、GX0101和SNV株共感染1日龄SPF鸡,取感染后不同周龄鸡的脏器制作石蜡切片进行HE染色,了解三种病毒混合感染引起的鸡只不同脏器的动态病理学变化,同时利用建立的免疫组织化学方法研究三种病毒共感染鸡后在不同脏器组织细胞内的动态分布以及利用连续切片在同一视野下观察三种病毒能否感染同一组织细胞。三种病毒共感染1日龄SPF鸡后,每周剖杀3只鸡,取自然死亡和剖杀鸡只的肝脏、法氏囊和肾脏,制作石蜡切片,进行HE染色,观察其病理学变化,结果发现:肝脏:攻毒早期（1-42天）,肝细胞索并未消失,中期（42-120天）部分肝细胞索消失,到了攻毒晚期（120-180天）,肝细胞索基本全部消失。淋巴细胞浸润生长。随着肝细胞索的消失,肝脏上皮细胞胞核也发生溶解;肾脏:攻毒早期（1-42天）,肾小管上皮细胞萎缩,中期（42-120天）部分肾小管上皮细胞消失,到了攻毒晚期（120-180天）,大量上皮细胞发生崩解。法氏囊:攻毒后早期（1-42天）和中期（42-120天）,法氏囊滤泡未消失,滤泡髓质细胞部分发生崩解,攻毒晚期（120-180天）,法氏囊滤泡结构模糊,法氏囊滤泡髓质细胞几乎全部崩解。同时利用免疫组化方法检测三种病毒在感染后不同周龄鸡的脏器内分布发现,REV在感染后第7天首先在法氏囊被检测到;MDV和ALV-J在攻毒后第14天可以被检测到。对三种病毒在不同脏器内的动态分布研究发现:ALV-J阳性信号最早出现在肝脏中,随着感染日龄的增大,肝脏内阳性细胞的数量和阳性染色的深浅并没有发生显着变化,而法氏囊组织细胞内,随着日龄增大阳性细胞数量逐渐增多,染色也加深,肾脏中却是阳性细胞的数量变化不大,但是阳性染色随着感染日龄的增大而加深;REV阳性信号最早是出现在法氏囊中,并且随着感染日龄的增加,肝脏和法氏囊滤泡细胞和间质细胞内的阳性细胞数量发生一过性增多又降低,染色也是先加深又变浅,肾脏中阳性细胞数量和阳性染色随着感染日龄的增大而增加;MDV阳性信号与REV的一样,最早也是出现在法氏囊中,但是法氏囊滤泡细胞和间质细胞和肝脏内阳性细胞的数量随着感染日龄增加而增多,阳性染色深浅变化不大,而在肾脏中一直未发现阳性细胞。并且,阳性染色在细胞内出现的部位与单独感染时一致。利用连续组织切片,对三种病毒进行同视野观察发现,三种病毒共感染鸡后,可以共同感染脾脏和法氏囊的同一个组织细胞,还未发现可以感染肝脏和肾脏的同一组织细胞;而三种病毒可以感染同一只鸡的肝脏、脾脏和法氏囊,不能感染同一只鸡的肾脏,REV和ALV-J可以感染同一只鸡的肝脏、脾脏、肾脏和法氏囊组织。3.中国部分地区肿瘤病死鸡三种肿瘤病毒的感染情况调查本实验收集了来自我国北京、山东和河南部分地区肿瘤病死鸡91只,利用特异性较强的IFA和免疫组化方法检测了J亚群禽白血病、马立克氏病和网状内皮组织增生症的感染情况,比较了两种检测方法的优缺点。调查结果表明,肿瘤病死鸡中ALV-J的单独检出率最高,尤以北京地区最高,而MDV单独检出率则相对较低,REV位于两者之间,说明目前危害家禽的肿瘤病仍然是以J亚群禽白血病为主;同时发现,三种病毒的混合感染也是较为普遍的,其中ALV-J和REV的混合感染最为普遍,其次是MDV和REV,混合感染率较低的是MDV和ALV-J。免疫组化检测方法不仅可以观察脏器的病理学变化,而且还可以利用不同的单抗对三种疾病进行鉴别诊断,在临床病例的诊断中,这两者的结合可以更加有力的对疾病进行判断。另外,通过对临床肿瘤病料的显微病理学观察和三种肿瘤病毒的免疫组化检测发现,ALV-J引起肿瘤类型越来越复杂多样,不仅仅局限于以前的髓细胞瘤和肾瘤等,近期还出现了血管瘤、纤维肉瘤等新的类型。
二、养禽业面临着新威胁──禽骨髓性白血病（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、养禽业面临着新威胁──禽骨髓性白血病（论文提纲范文）
（1）禽白血病病毒单克隆抗体识别抗原表位的鉴定与分析（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 禽白血病 |
| 1.1.1 禽白血病概述 |
| 1.1.2 禽白血病病原学 |
| 1.1.3 禽白血病的致病性及危害 |
| 1.1.4 禽白血病鉴别诊断 |
| 1.1.4.1 组织病理学检查 |
| 1.1.4.2 病毒分离和鉴定 |
| 1.1.4.3 ELISA法 |
| 1.1.4.4 IFA法 |
| 1.1.4.5 PCR法 |
| 1.1.5 禽白血病预防控制 |
| 1.2 禽白血病病毒单克隆抗体及其识别抗原表位 |
| 1.2.1 单克隆抗体研制原理概述 |
| 1.2.2 单克隆抗体研制应用概述 |
| 1.2.3 禽白血病病毒单克隆抗体 |
| 1.2.4 禽白血病病毒单克隆抗体应用及其制约因素 |
| 1.3 抗原表位 |
| 1.3.1 抗原表位概述 |
| 1.3.2 抗原表位鉴定及其应用 |
| 1.3.3 禽白血病病毒单克隆抗体抗原表位及其特性 |
| 1.3.4 禽白血病病毒单克隆抗体抗原表位研究存在的问题 |
| 1.4 研究的目的意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒和细胞来源 |
| 2.1.2 菌种和载体质粒 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 实验动物 |
| 2.1.6 主要仪器 |
| 2.1.7 实验地点 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 ALV-A gp85 基因扩增 |
| 2.2.2 ALV-A gp85 重组表达质粒构建 |
| 2.2.3 ALV-A gp85 分段扩增和表达 |
| 2.2.4 ALV-A单克隆抗体制备 |
| 2.2.5 ALV-A单克隆抗体特性分析 |
| 2.2.6 ALV-A单克隆抗体线性识别抗原表位western blot分析 |
| 2.2.7 ALV-A单克隆抗体线性识别抗原表位的ELSIA分析 |
| 2.2.8 ALV-A单克隆抗体线性识别抗原表位生物信息分析 |
| 2.2.9 ALV-A单克隆抗体介导的IFA |
| 2.3 研究平台 |
| 2.4 数据处理与统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 ALV-A单克隆抗体制备 |
| 3.1.1 ALV-A gp85 蛋白基因的扩增与重组表达质粒的构建 |
| 3.1.2 gp85 重组蛋白的诱导表达及纯化 |
| 3.1.3 阳性杂交瘤细胞的筛选以及染色体数目的鉴定 |
| 3.1.4 腹水的制备 |
| 3.1.5 抗体的纯化 |
| 3.2 ALV-A单克隆抗体亚类鉴定 |
| 3.3 ALV-A单克隆抗体特性分析 |
| 3.4 ALV-A单克隆抗体识别抗原表位鉴定 |
| 3.5 ALV-A单克隆抗体识别抗原表位的生物信息分析 |
| 3.6 ALV-A单克隆抗体介导的IFA |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（2）地方品种鸡群禽白血病流行病学调查及检测净化技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 禽白血病研究进展 |
| 1 禽白血病病原学 |
| 2 禽白血病流行病学 |
| 3 禽白血病检测技术 |
| 4 禽白血病防控措施 |
| 5 本研究目的和意义 |
| 第二章 地方品种鸡群禽白血病流行病学调查 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 K亚群禽白血病病毒全基因组测序及序列分析 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第四章 禽白血病病毒多重PCR检测方法的建立及初步应用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第五章 种公鸡精液禽白血病病毒检测方法研究与应用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第六章 地方品种鸡群禽白血病示范性净化 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文、获得成果及奖励 |
（3）六种家禽免疫抑制相关病液相芯片检测试剂盒的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 家禽免疫抑制病概述 |
| 1.2 常见检测方法 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 第二章 家禽免疫抑制性病毒毒株初步鉴定 |
| 2.1 供试材料与主要仪器 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 仪器 |
| 2.1.3 耗材 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 毒株的复苏与培养 |
| 2.2.2 微量血球凝集(HA)试验 |
| 2.2.3 微量血球凝集抑制(HI)试验 |
| 2.2.4 real time RT-PCR检测 |
| 2.2.5 禽流感病毒H5参考毒株和新城疫F48E9参考毒株半数致死量的测定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 各个毒株的real time RT-PCR检测结果 |
| 2.3.2 禽流感病毒H5参考毒株和新城疫F48E9参考毒株半数致死量的测定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 各个病毒的培养与效价测定 |
| 2.4.2 禽流感病毒H5参考毒株和新城疫F48E9参考毒株半数致死量的确定 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 GMPLex快速高通量鉴别诊断检测方法的建立 |
| 3.1 供试材料与主要仪器 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物与探针的设计与合成 |
| 3.2.2 家禽免疫抑制性病毒GM RT-PCR扩增体系的建立 |
| 3.2.3 家禽免疫抑制性病毒GMPLex检测体系的建立 |
| 3.2.4 GMPLex快速高通量检测方法灵敏性试验 |
| 3.2.5 GMPLex快速高通量检测方法特异性试验 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 引物与探针的设计与合成结果 |
| 3.3.2 家禽免疫抑制性病毒GM RT-PCR检测方法的建立结果 |
| 3.3.3 家禽免疫抑制性病毒GMPLex检测体系的建立结果 |
| 3.3.4 GMPLex快速高通量检测方法灵敏性试验结果 |
| 3.3.5 GMPLex快速高通量检测方法特异性试验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 GMPLex检测技术 |
| 3.4.2 GM RT-PCR引物与探针的设计 |
| 3.4.3 GM RT-PCR扩增体系的建立 |
| 3.4.4 LiquiC hip检测体系的建立 |
| 3.4.5 GMPLex快速高通量检测方法灵敏性试验 |
| 3.4.6 GMPLex快速高通量检测方法特异性试验 |
| 3.5 结论 |
| 全文小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（4）泰山松花粉多糖对ALV-J不同接种途径诱导的鸡群免疫抑制的免疫调理作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 禽免疫抑制病 |
| 1.1.1 禽免疫抑制的分类 |
| 1.1.2 禽免疫抑制的产生因素及危害 |
| 1.2 禽白血病 |
| 1.2.1 病毒粒子结构及特性 |
| 1.2.2 病毒基因组结构 |
| 1.2.3 病毒的复制过程 |
| 1.2.4 ALV的分类及各亚群 |
| 1.3 J亚群禽白血病病毒 |
| 1.3.1 病原特性 |
| 1.3.2 流行病学 |
| 1.3.3 致病性 |
| 1.4 ALV-J诱导的免疫抑制及其机理 |
| 1.4.1 免疫抑制 |
| 1.4.2 免疫抑制的临床症状 |
| 1.4.3 免疫抑制的危害 |
| 1.4.4 免疫抑制的主要机理 |
| 1.5 ALV-J的病理变化及诊断检测 |
| 1.5.1 临床症状及病理变化 |
| 1.5.2 诊断与检测 |
| 1.6 ALV-J的预防与控制措施 |
| 1.6.1 疫苗接种 |
| 1.6.2 种群净化 |
| 1.7 植物多糖的研究进展 |
| 1.7.1 植物多糖的研究进展 |
| 1.7.2 植物多糖的生物活性 |
| 1.8 松花粉多糖的研究进展 |
| 1.8.1 松花粉的研究进展 |
| 1.8.2 泰山松花粉及泰山松花粉多糖的研究进展 |
| 1.9 本研究的目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 主要试剂及材料 |
| 2.1.2 常规试剂的配制方法 |
| 2.1.3 试验用主要仪器 |
| 2.1.4 试验动物和道德声明 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 ALV-J不同接种途径感染SPF雏鸡免疫抑制模型的建立 |
| 2.2.2 ALV-J不同接种途径感染SPF雏鸡后体重及免疫器官指数的变化 |
| 2.2.3 ALV-J不同接种途径感染SPF雏鸡后带毒与排毒变化检测 |
| 2.2.4 ALV-J不同接种途径感染SPF雏鸡后相关免疫学指标变化 |
| 2.2.5 TPPPS对ALV-J不同接种途径诱导的鸡群免疫抑制的免疫调理作用 |
| 2.2.6 TPPPS对不同水平感染ALV-J鸡体重及免疫器官指数的影响 |
| 2.2.7 TPPPS对不同水平感染ALV-J鸡带毒与排毒的影响 |
| 2.2.8 TPPPS对不同水平感染ALV-J鸡的免疫调理作用 |
| 2.2.9 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 ALV-J不同接种途径诱导SPF鸡免疫抑制状况的比较分析 |
| 3.1.1 各组体重及免疫器官指数的比较分析 |
| 3.1.2 各组病毒血症及免疫器官病毒载量的比较分析 |
| 3.1.3 各组泄殖腔排毒动态的比较分析 |
| 3.1.4 各组CD~(4+)、CD~(8+) T淋巴细胞数及T淋巴细胞转化率的比较分析 |
| 3.1.5 各组血清中细胞因子浓度及ALV-J抗体水平的比较分析 |
| 3.1.6 各组血清中抗NDV抗体滴度的比较分析 |
| 3.2 TPPPS对ALV-J不同接种途径诱导鸡群免疫抑制的免疫调理作用 |
| 3.2.1 不同浓度TPPPS对DF-1 细胞的毒性作用 |
| 3.2.2 TPPPS对免疫抑制鸡体重及免疫器官指数的影响 |
| 3.2.3 TPPPS对免疫抑制鸡病毒血症的调理作用 |
| 3.2.4 TPPPS对免疫抑制鸡泄殖腔排毒的影响 |
| 3.2.5 TPPPS对免疫抑制鸡淋巴细胞转化率的影响 |
| 3.2.6 TPPPS对免疫抑制鸡外周血CD~(4+)、CD~(8+)T细胞数的影响 |
| 3.2.7 TPPPS对免疫抑制鸡血清中细胞因子浓度的影响 |
| 3.2.8 TPPPS对免疫抑制鸡血清ND抗体滴度及抗ALV-J特异性抗体的影响 |
| 3.2.9 TPPPS对免疫抑制鸡血清中抗ALV-J特异性抗体的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表论文情况 |
| 个人简介 |
（5）鸭群中禽白血病病毒的核酸检测（论文提纲范文）
| 符号及缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 禽白血病的研究概述 |
| 1.2 病原学 |
| 1.2.1 分类 |
| 1.2.2 病毒形态 |
| 1.2.3 化学组成 |
| 1.2.4 基因组结构与功能 |
| 1.2.5 病毒复制 |
| 1.2.6 毒株分类 |
| 1.2.7 内源性白血病病毒 |
| 1.3 流行病学 |
| 1.3.1 发病率 |
| 1.3.2 传播方式 |
| 1.4 病理生物学 |
| 1.4.1 临床症状 |
| 1.4.2 病理变化 |
| 1.5 禽白血病的检测和诊断 |
| 1.5.1 病原分离和鉴定 |
| 1.5.2 聚合酶链式反应（PCR） |
| 1.5.3 血清学检测 |
| 1.5.4 鉴别诊断 |
| 1.6 致肿瘤机制 |
| 1.7 预防和控制 |
| 1.7.1 净化原代种鸡场 |
| 1.7.2 保持鸡群对 ALV 的高度洁净状态 |
| 1.7.3 政府部门强化种鸡群的监控 |
| 1.8 本研究的背景、目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 鸭群中禽白血病病毒 p27 基因的核酸检测 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 鸭组织样品 |
| 2.1.1.2 菌种和载体 |
| 2.1.1.3 主要试剂 |
| 2.1.1.4 主要仪器 |
| 2.1.1.5 常规试剂及配制 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.2.1 引物设计与合成 |
| 2.1.2.2 组织 DNA 的提取 |
| 2.1.2.3 目的片段的 PCR 扩增和纯化回收 |
| 2.1.2.4 目的片段与载体的连接 |
| 2.1.2.5 DH5α大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.1.2.6 连接产物的转化 |
| 2.1.2.7 质粒 DNA 的提取 |
| 2.1.2.8 重组质粒酶切鉴定 |
| 2.1.2.9 阳性克隆序列的测定 |
| 2.2 禽白血病病毒 env 基因的 PCR 扩增 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.2.2.1 引物设计与合成 |
| 2.2.2.2 env基因的PCR扩增和纯化回收 |
| 2.2.2.3 目的片段与载体的连接 |
| 2.2.2.4 DH5α大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.2.5 连接产物的转化 |
| 2.2.2.6 质粒 DNA 的提取 |
| 2.2.2.7 重组质粒酶切鉴定 |
| 2.2.2.8 阳性克隆序列的测定 |
| 2.3 ALV-B 单因子血清的制备 |
| 2.3.1 材料 |
| 2.3.2 方法 |
| 2.3.2.1 设计引物 |
| 2.3.2.2 四段基因的 PCR 扩增和纯化回收 |
| 2.3.2.3 目的片段与载体的连接 |
| 2.3.2.4 Rosetta（DE3）PLys 感受态细胞的制备 |
| 2.3.2.5 连接产物的转化 |
| 2.3.2.6 重组质粒 DNA 的提取 |
| 2.3.2.7 重组质粒的 PCR 鉴定 |
| 2.3.2.8 重组质粒的诱导表达 |
| 2.3.2.9 表达蛋白的 SDS-PAGE 检测 |
| 2.3.2.10 重组蛋白的大量表达和纯化 |
| 2.3.2.11 免疫疫苗的制备及免疫 |
| 2.4 四种单因子血清分别与 A、B 和 J 型 ALV 分别作 IFA 区分鉴定 |
| 2.4.1 材料 |
| 2.4.2 方法 |
| 2.4.2.1 病毒感染细胞 DNA 的提取及 ELISA 检测 |
| 2.4.2.2 单因子血清对已知 ALV-A、ALV-B 与 ALV-J 的间接免疫荧光（IFA）鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鸭群中禽白血病病毒 p27 基因的核酸检测 |
| 3.1.1 p27 基因的 PCR 扩增结果 |
| 3.1.2 ALV P27 基因在不同地区鸭群中的携带率分析 |
| 3.1.3 p27 基因的测序结果 |
| 3.2 env 基因的 PCR 扩增 |
| 3.2.1 env 基因的扩增结果 |
| 3.2.2 env 基因的序列比对结 |
| 3.2.3 env 基因与 ALV 参考株 env 基因的同源性分析结果 |
| 3.3 ALV-B 单因子血清与 A、B 和 J 型 ALV 分别作 IFA 区分鉴定 |
| 3.3.1 四段基因的 PCR 扩增结果 |
| 3.3.2 四段基因重组质粒的 PCR 鉴定 |
| 3.3.3 SDS-PAGE 凝胶分析 |
| 3.3.4 IFA 鉴定结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）J亚群禽白血病病毒致病性增强的分子机制（论文提纲范文）
| 附件 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 禽白血病 |
| 1.2 我国 J 亚群禽白血病的流行情况 |
| 1.3 J 亚群禽白血病病毒 |
| 1.3.1 病毒的分类地位 |
| 1.3.2 病毒的形态与理化特性 |
| 1.3.3 病毒的基因组结构及蛋白组成 |
| 1.3.4 病毒复制周期 |
| 1.3.5 病毒致病致瘤机制 |
| 1.4 血管内皮生长及其受体与肿瘤发生 |
| 1.4.1 血管内皮生长因子 A 与血管生成 |
| 1.4.2 血管内皮生长因子受体 2 与血管生成 |
| 1.4.3 血管生成与肿瘤发生 |
| 1.5 p53 与病毒及肿瘤 |
| 1.5.1 认知 p53 |
| 1.5.2 p53 基因突变与肿瘤 |
| 1.5.3 病毒与 p53 |
| 1.5.4 p53 与病毒引起的禽类肿瘤 |
| 1.6 microRNAs 与反转录病毒 |
| 1.6.1 microRNAs 的发现与命名 |
| 1.6.2 microRNAs 的生成与调控机制 |
| 1.6.3 microRNAs 与反转录病毒 |
| 1.7 本研究的目的与意义 |
| 第二章 我国 ALV-J 遗传演化分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 载体、菌株和细胞 |
| 2.1.2 临床样品 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 病毒分离与前病毒 DNA 提取 |
| 2.2.2 病毒基因克隆与测序 |
| 2.2.3 DNA 序列比对及进化树分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 ALV-J 的病毒分离及鉴定 |
| 2.3.2 ALV-J env 基因的遗传演化分析 |
| 2.3.3 ALV-J U3 的进化分析 |
| 2.3.4 ALV-J 3’UTR 的进化分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 3’UTR 205nt 缺失增强 ALV-J 致病性 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 载体、菌株和细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 ALV-J 感染性克隆构建策略 |
| 3.2.2 病毒拯救和鉴定 |
| 3.2.3 拯救病毒的体外复制动力学 |
| 3.2.4 p27 蛋白表达和反转录酶活性鉴定 |
| 3.2.5 亚病毒基因组构建 |
| 3.2.6 亚病毒基因组中 p27 蛋白的表达和未剪切 RNA 的核质穿梭 |
| 3.2.7 拯救病毒的体内致病性 |
| 3.2.8 数据分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 拯救缺失 205nt 和嵌合 205nt 的两株 ALV-J 病毒 |
| 3.3.2 205nt 缺失增强 ALV-J 在血管内皮细胞中的复制 |
| 3.3.3 205nt 缺失促进 ALV-J 未剪切 RNA 从细胞核输出到细胞质 |
| 3.3.4 205nt 缺失增强 ALV-J 在体内的复制 |
| 3.3.5 205nt 缺失增强 ALV-J 致瘤性和致死率 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 ALV-J 致病性增强的分子机制 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 载体、菌株和细胞 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 VEGF-A 和 VEGFR-2 表达 |
| 4.2.2 ALV-J 病毒载量及其插入位点的鉴定 |
| 4.2.3 p21WAF1的表达和 p53 表达载体的构建 |
| 4.2.4 DF-1 原型 p53 蛋白和突变型 p53 蛋白的细胞定位 |
| 4.2.5 U3 介导的报告基因载体和亚病毒基因组构建 |
| 4.2.6 亚病毒基因组中 p27 蛋白的表达和未剪切 RNA 的核质穿梭 |
| 4.2.7 染色体免疫共沉淀（CHIP）验证 p53 蛋白与 ALV-J U3 互作 |
| 4.2.8 凝胶阻滞试验（EMSA）验证 p53 蛋白与 U3 互作作用域 |
| 4.2.9 数据分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 ALV-J 致瘤组织中 VEGF-A 及其受体 VEGFR-2 高水平表达 |
| 4.3.2 VEGF-A 和 VEGFR-2 表达水平与 ALV-J 复制呈正相关 |
| 4.3.3 ALV-J 持续感染致 TP53 基因突变 |
| 4.3.4 DF-1 细胞中原型 p53 蛋白抑制 ALV-J U3 活性 |
| 4.3.5 突变型 p53 蛋白失去对抑制 ALV-J 复制的作用 |
| 4.3.6 ALV-J 感染 DF-1 细胞增加 DF-1 原型 p53 蛋白表达 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 宿主 miRNAs 在 ALV-J 致病过程中的作用 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 载体、菌株，毒株和细胞 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 预测 ALV-J 基因组编码 miRNAs 的预测 |
| 5.2.2 预测 ALV-J 编码 miRNAs 前体分子的验证 |
| 5.2.3 原型及突变型报告基因的构建和检测 |
| 5.2.4 预测 miRNA 与靶标的结合 |
| 5.2.5 宿主 miRNAs 抑制子和表达载体的构建 |
| 5.2.6 宿主 miRNAs 的 Northern Blot 验证 |
| 5.2.7 原型 ALV-J 和突变型 ALV-J 的拯救 |
| 5.2.8 ALV-J p27 蛋白的表达及病毒复制 |
| 5.2.9 宿主 gga-miR-1650 茎环法荧光定量 PCR 检测 |
| 5.2.10 数据分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 ALV-J 基因组中 miRNAs 前体分子预测 |
| 5.3.2 Northern Blot 检测不到预测的 ALV-J 编码的前体分子 |
| 5.3.3 DF-1 细胞中可能存在 miRNAs 调控 ALV-J 5’UTR 介导的报告基因活性 |
| 5.3.4 gga-miR-1650 调控 5’UTR 介导的报告基因活性 |
| 5.3.5 ALV-J 5’UTR 是 gga-miR-1650 的靶标 |
| 5.3.6 过表达 gga-miR-1650 抑制 ALV-J 蛋白表达和病毒复制 |
| 5.3.7 ALV-J 感染引起细胞 gga-miR-1650 表达上调 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）地方品系鸡白血病流行病学调查与ALVp27基因的表达分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 综述部分 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 病毒病原学特性 |
| 1.3 病毒的基因组结构 |
| 1.4 病毒流行病学特性 |
| 1.5 禽白血病的病理学变化和免疫抑制作用 |
| 1.6 诊断方法 |
| 1.6.1 病毒的分离和鉴定 |
| 1.6.2 PCR 技术 |
| 1.6.3 琼脂双向扩散试验 |
| 1.6.4 免疫组织化学技术 |
| 1.6.5 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 1.7 禽白血病的防控和种群净化 |
| 1.8 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒、菌株及载体 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂及试剂盒等 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 主要试剂的配制 |
| 2.2.2 地方品系鸡禽白血病流行病学调查 |
| 2.2.3 禽白血病病毒 YZ 株的分离与鉴定 |
| 2.2.4 禽白血病病毒 p27 基因的克隆与表达分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 地方品系鸡禽白血病流行病学调查 |
| 3.1.1 地方品系鸡的普查 |
| 3.1.2 纯系 B1 和 B3 的普查 |
| 3.2 禽白血病病毒 YZ 株的分离鉴定及序列分析 |
| 3.2.1 分离毒 ELISA 鉴定 |
| 3.2.2 分离毒 PCR 鉴定 |
| 3.2.3 gp85 基因测序分析 |
| 3.3 禽白血病病毒 p27 基因的克隆与表达分析 |
| 3.3.1 p27 基因的扩增 |
| 3.3.2 p27 基因的克隆 |
| 3.3.3 表达载体的构建 |
| 3.3.4 重组菌的诱导表达 |
| 3.3.5 重组蛋白的纯化及 Western blotting 分析结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 地方鸡品系白血病流行病学调查 |
| 4.2 病毒分离和序列分析 |
| 4.3 p27 基因的克隆表达分析 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）J亚群ALV的分离鉴定及三种方法动态比较分析其在DF-1细胞中的增殖（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 禽白血病病毒亚群 |
| 1.2 ALV-J 的形态学 |
| 1.3 流行病学特点 |
| 1.3.1 ALV-J 的宿主范围 |
| 1.3.2 ALV-J 的传播途径 |
| 1.3.3 临床症状 |
| 1.3.4 剖检特点 |
| 1.3.5 组织病理学变化 |
| 1.3.6 ALV-J 的新流行特点 |
| 1.4 鉴别诊断 |
| 1.5 ALV-J 的分子生物学特性 |
| 1.6 ALV-J 的易变性 |
| 1.7 病毒的研究进展及其危害 |
| 1.7.1 ALV-J 的研究进展 |
| 1.7.2 实验室现有的检测技术 |
| 1.7.3 ALV-J 的主要危害 |
| 1.8 本研究的意义 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病料来源 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 DF-1 细胞 |
| 2.1.4 ALV-J 特异性单抗 |
| 2.1.5 FITC |
| 2.1.6 ELISA 检测试剂盒 |
| 2.1.7 培养基配制 |
| 2.1.8 PCR 引物 |
| 2.1.9 仪器与其他试剂 |
| 2.1.10 相关溶液的配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 病毒的分离与增殖培养 |
| 2.2.2 细胞上清 p27 的检测 |
| 2.2.3 外源性病毒的分离 |
| 2.2.4 间接免疫荧光实验 |
| 2.2.5 前病毒基因组 cDNA 的提取 |
| 2.2.6 PCR 产物的克隆及测序 |
| 2.2.7 利用 ELISA、FA 及 IFA 法对新分离病毒在 DF1 细胞上的增殖进行动态比较分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 ALVP27 检测结果 |
| 3.2 IFA 检测结果 |
| 3.3 PCR 检测结果 |
| 3.4 SDAU12 株 ENV 基因测序结果 |
| 3.5 SDAU12 株 ENV 基因氨基酸序列 |
| 3.6 SDAU12 株 ENV 基因氨基酸序列分析 |
| 3.6.1 SDAU12 毒株与其他亚群参考株 ALVgp85 氨基酸序列同源性比较分析 |
| 3.6.2 SDAU12 毒株 gp85 高变区的氨基酸变异 |
| 3.6.3 SDAU12 毒株与其他亚群参考株 ALVgp37 氨基酸序列同源性比较分析 |
| 3.7 ELISA 检测结果 |
| 3.8 FA 检测结果 |
| 3.9 IFA 检测结果 |
| 3.10 三种试验结果的比较分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 禽白血病病毒亚群的划分标准 |
| 4.2 该地方品系鸡中禽白血病病毒的来源 |
| 4.3 病毒的分离鉴定及序列分析 |
| 4.4 ELISA、FA 和 IFA 三种试验方法的比较分析 |
| 4.5 禽白血病的防控 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况及着作 |
（9）山东地区禽白血病发病鸡群的流行病学调查及致病特性的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 病原学 |
| 1.2.1 分类 |
| 1.2.2 形态学 |
| 1.2.3 病毒基因组结构 |
| 1.2.4 病毒囊膜基因及受体 |
| 1.2.5 病毒复制 |
| 1.2.6 ALV 对理化因素的抵抗力 |
| 1.2.7 ALV 的培养特性 |
| 1.2.8 ALV 的致病机制 |
| 1.3 流行病学 |
| 1.3.1 传播 |
| 1.3.2 感染特征 |
| 1.3.3 流行特点 |
| 1.4 临诊症状及病理变化 |
| 1.5 诊断与检测 |
| 1.5.1 临床诊断 |
| 1.5.2 实验室诊断 |
| 1.6 防制 |
| 1.6.1 对种鸡群的净化 |
| 1.6.2 核心群净化 |
| 1.6.3 祖代父母代以下鸡场的生物安全措施 |
| 1.6.4 弱毒疫苗的污染问题 |
| 1.7 血液常规指标检测 |
| 1.8 本研究的目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验仪器 |
| 2.1.2 试验材料和试剂 |
| 2.1.3 试验地点 |
| 2.2 方法及检测指标 |
| 2.2.1 被检样品背景及来源 |
| 2.2.2 病理学检测 |
| 2.2.3 血清及棉拭子ELISA 检测 |
| 2.2.4 聚合酶链反应(PCR)检测 |
| 2.2.5 DH5a 感受态细胞的制备 |
| 2.2.6 胶回收产物与T 载体连接以及连接产物的转化 |
| 2.2.7 质粒DNA 的提取 |
| 2.2.8 重组质粒的酶切和PCR 鉴定 |
| 2.2.9 序列测定和结果分析 |
| 2.2.10 ALV 对鸡血液学指标的影响 |
| 3 结果 |
| 3.1 ELISA 检测结果 |
| 3.1.1 山东地区禽白血病发病鸡群 |
| 3.1.2 芦花鸡群 |
| 3.2 病理学检测 |
| 3.2.1 临床症状及剖检病变 |
| 3.2.2 病理组织学观察 |
| 3.3 病毒学检测 |
| 3.3.1 PCR 检测 |
| 3.3.2 PCR 产物序列测定 |
| 3.4 血液常规指标的检测 |
| 3.4.1 海兰蛋鸡 |
| 3.4.2 芦花鸡 |
| 4 讨论 |
| 4.1 山东地区禽白血病发病鸡群 |
| 4.2 中国特有地方品种-芦花鸡群 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介及攻读学位期间发表论文 |
| 硕士学位论文内容简介及自评 |
（10）免疫组织化学技术在鸡三种病毒性肿瘤病鉴别诊断中的应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1.1 禽白血病的研究进展 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 禽白血病病毒的细胞培养 |
| 1.1.3 流行病学 |
| 1.1.4 临床症状和病理变化 |
| 1.1.4.1 临床症状 |
| 1.1.4.2 病理变化 |
| 1.1.5 发病机理 |
| 1.1.6 禽白血病的诊断 |
| 1.1.7 禽白血病的预防和控制 |
| 1.1.7.1 加强种鸡群的监控 |
| 1.1.7.2 保持种鸡群对ALV 的高度洁净状态 |
| 1.1.7.3 强化弱毒疫苗中ALV 污染的检测和监控 |
| 1.2 马立克氏病的研究进展 |
| 1.2.1 病原学 |
| 1.2.2 流行病学 |
| 1.2.3 临床症状和病理变化 |
| 1.2.4 致病机理 |
| 1.2.4.1 病毒复制和早期溶细胞性感染期 |
| 1.2.4.2 潜伏感染期 |
| 1.2.4.3 转化和肿瘤形成 |
| 1.2.5 诊断技术 |
| 1.2.5.1 病毒分离 |
| 1.2.5.2 病毒抗原的检测 |
| 1.2.5.3 聚合酶链反应（PCR）技术 |
| 1.2.5.4 DNA 探针技术 |
| 1.2.5.5 病理学诊断 |
| 1.2.6 防治策略 |
| 1.3 网状内皮组织增生症的研究进展 |
| 1.3.1 病原学 |
| 1.3.2 流行病学 |
| 1.3.3 诊断技术 |
| 1.3.4 REV 感染的鉴别诊断 |
| 1.3.4.1 临床诊断 |
| 1.3.4.2 病毒分离与鉴定 |
| 1.3.4.3 血清学检测 |
| 1.3.4.4 病理学检查 |
| 1.3.4.5 鉴别诊断 |
| 1.3.5 防控策略 |
| 1.4 免疫组织化学技术 |
| 1.4.1 概念 |
| 1.4.2 免疫组织化学技术的分类 |
| 1.4.3 免疫组化的判断标准 |
| 1.4.4 免疫组织化学技术在人类肿瘤病理诊断中的应用 |
| 1.4.4.1 肿瘤的诊断与鉴别诊断 |
| 1.4.4.2 确定原发性肿瘤的组织来源和转移性恶性肿瘤的原发部位 |
| 1.4.4.3 对某类肿瘤进行进一步的病理分型 |
| 1.4.4.4 在肿瘤分期上的应用 |
| 1.4.4.5 发现微小病灶 |
| 1.4.4.6 为临床治疗方案的选择和肿瘤的预后提供依据 |
| 1.4.5 免疫组织化学技术在兽医学诊断中的应用 |
| 1.4.5.1 对组织中常规或特殊病原的检测 |
| 1.4.5.2 病原在机体的定位 |
| 1.4.5.3 病原在机体的动态分布研究 |
| 1.4.5.4 新病原的发现 |
| 1.4.5.5 活体动物中病原的检测 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 J 亚群禽白血病、马立克氏病和网状内皮组织增生症免疫组化检测方法的建立 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 病毒及单抗来源 |
| 2.1.1.2 主要试剂 |
| 2.1.1.3 主要仪器 |
| 2.1.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.1.2.1 J 亚群禽白血病免疫组化检测方法的建立 |
| 2.1.2.2 马立克氏病免疫组织化学检测方法的建立 |
| 2.1.2.3 网状内皮组织增生症免疫组织化学检测方法的建立 |
| 2.2 三种肿瘤病毒共感染SPF 鸡的动态病理学观察 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.1.1 病毒及单抗来源 |
| 2.2.1.2 主要试剂 |
| 2.2.2 试验方法 |
| 2.2.2.1 病毒扩增 |
| 2.2.2.2 病毒的定量 |
| 2.2.2.3 实验动物及攻毒 |
| 2.2.2.4 病毒分离 |
| 2.2.2.5 石蜡切片的制备 |
| 2.2.2.6 HE（苏木精-伊红）染色 |
| 2.2.2.7 病理学观察 |
| 2.3 中国部分地区J 亚群禽白血病、马立克氏病和网状内皮组织增生症感染率调查 |
| 2.3.1 材料与方法 |
| 2.3.1.1 材料 |
| 2.3.1.1.1 病料来源 |
| 2.3.1.1.2 主要试剂 |
| 2.3.1.1.3 主要仪器 |
| 2.3.1.2 试验方法 |
| 2.3.1.2.1 病毒分离 |
| 2.3.1.2.2 石蜡切片的制备 |
| 2.3.1.2.3 HE（苏木精-伊红）染色 |
| 2.3.1.2.4 免疫组化检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 J 亚群禽白血病、马立克氏病和网状内皮组织增生症免疫组化检测方法的建立 |
| 3.1.1 J 亚群禽白血病免疫组化检测方法的建立 |
| 3.1.1.1 病毒扩增 |
| 3.1.1.2 病毒TCID50 的测定 |
| 3.1.1.3 实验动物及攻毒 |
| 3.1.1.4 间接免疫荧光（IFA） |
| 3.1.1.5 免疫组织化学染色方法的建立 |
| 3.1.2 马立克氏病免疫组化检测方法的建立 |
| 3.1.2.1 病毒扩增 |
| 3.1.2.2 病毒的定量 |
| 3.1.2.3 实验动物及攻毒 |
| 3.1.2.4 间接免疫荧光（IFA） |
| 3.1.2.5 免疫组织化学染色方法的建立 |
| 3.1.3 网状内皮组织增生症免疫组化检测方法的建立 |
| 3.1.3.1 病毒扩增 |
| 3.1.3.2 病毒的定量 |
| 3.1.3.3 实验动物及攻毒 |
| 3.1.3.4 间接免疫荧光（IFA） |
| 3.1.3.5 免疫组织化学染色方法的建立 |
| 3.2 三种肿瘤病毒共感染SPF 鸡的动态病理学观察 |
| 3.2.1 病毒扩增 |
| 3.2.2 病毒的定量 |
| 3.2.3 实验动物及攻毒 |
| 3.2.4 HE（苏木精-伊红）染色 |
| 3.2.5 病理学观察 |
| 3.2.5.1 三种病毒在组织细胞内的动态变化 |
| 3.2.5.2 三种病毒对同一组织细胞的感染情况 |
| 3.3 中国部分地区J 亚群禽白血病、马立克氏病和网状内皮组织增生症感染率调查 |
| 3.3.1 病毒分离 |
| 3.3.2 HE（苏木精-伊红）染色 |
| 3.3.3 免疫组化检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 J 亚群禽白血病、马立克氏病和网状内皮组织增生症免疫组化检测方法的建立 |
| 4.2 三种肿瘤病毒共感染SPF 鸡的动态病理学观察 |
| 4.3 中国部分地区J 亚群禽白血病、马立克氏病和网状内皮组织增生症感染率调查 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文情况 |
| 博士学位论文内容简介及自评 |
四、养禽业面临着新威胁──禽骨髓性白血病（论文参考文献）
- [1]禽白血病病毒单克隆抗体识别抗原表位的鉴定与分析[D]. 闫泽一. 山东农业大学, 2020
- [2]地方品种鸡群禽白血病流行病学调查及检测净化技术研究[D]. 俞燕. 扬州大学, 2019
- [3]六种家禽免疫抑制相关病液相芯片检测试剂盒的研制[D]. 赵广武. 华南农业大学, 2017(08)
- [4]泰山松花粉多糖对ALV-J不同接种途径诱导的鸡群免疫抑制的免疫调理作用[D]. 朱丽君. 山东农业大学, 2017(01)
- [5]鸭群中禽白血病病毒的核酸检测[D]. 吕佳泓. 山东农业大学, 2014(12)
- [6]J亚群禽白血病病毒致病性增强的分子机制[D]. 王琦. 中国农业科学院, 2014(10)
- [7]地方品系鸡白血病流行病学调查与ALVp27基因的表达分析[D]. 王帅. 山东农业大学, 2013(05)
- [8]J亚群ALV的分离鉴定及三种方法动态比较分析其在DF-1细胞中的增殖[D]. 禚雯超. 山东农业大学, 2013(05)
- [9]山东地区禽白血病发病鸡群的流行病学调查及致病特性的研究[D]. 杨凤. 山东农业大学, 2011(08)
- [10]免疫组织化学技术在鸡三种病毒性肿瘤病鉴别诊断中的应用[D]. 孙亚妮. 山东农业大学, 2011(08)