一、丙型肝炎病毒NS3蛋白辅助T细胞表位研究（论文文献综述）
朱丹[1]（2021）在《生物信息学预测丙肝病毒与登革病毒T细胞交叉反应的研究》文中研究表明[目 的]本研究以丙型肝炎病毒（HCV）和登革病毒（DENV）两种黄病毒科病毒基因结构、地理分布、感染人群等方面的分析为线索,利用生物信息学方法检验两种病毒之间是否存在相似的氨基酸序列,这些序列是否可以诱导两种病毒特异性的T细胞免疫反应,以及这种T细胞交叉反应在不同HCV基因型之间是否存在差异。[方 法]通过GenBank数据库下载两种病毒不同基因型和血清型的氨基酸序列;使用蛋白质比对数据库Blastp和生物信息学软件DNAMAN 8.0比对分析DENV与HCV氨基酸序列,筛选两种病毒之间5个及以上相同且连续的氨基酸序列作为备选序列,依次用小写字母a、b、c等表示对应序列。根据两种病毒的原始氨基酸序列,将筛选出的备选序列两端分别延长10个氨基酸,用大写字母A、B、C等表示对应序列。以DENV 1型氨基酸序列为参照,通过序列分析软件BioEdit进行HCV与DENV之间对应位置氨基酸保守性比较。最后,以两种病毒代表序列为参照,将延长后的备选序列导入生物信息学软件（SYFPEITHI、NetMHCpan4.1、NetMHCⅡpan4.0）进行 CD4+、CD8+T 细胞表位预测,评估 DENV与HCV在延长后的备选序列中对应位置共有的表位分值,比较HCV基因1型与HCV基因3型预测得分值的差异。[结 果]通过序列比对,发现DENV的NS3区与HCV的NS3区之间存在两条相对保守且连续5个以上的氨基酸序列,分别为备选序列a（TATPPGSV）和备选序列b（GRRQR）;在备选序列a方面,DENV与HCV的相似程度比其他黄病毒属氨基酸序列高。在备选序列a中,DENV不同血清型之间存在1-2氨基酸位点的变异;分析DENV与HCV之间的变异情况时发现,三条HCV基因1a型序列与DENV 1型完全相同,HCV基因1b型中有两条序列与DENV 1型完全相同,仅有一条与DENV 1型有1个氨基酸不同（TATPPGSI）。而HCV基因3型所有序列都有1个氨基酸与DENV 1型不同,并且都是V到I的变异（TATPPGSI）。备选序列b在两种病毒的不同基因型和血清型中完全相同。扩大HCV氨基酸序列数量,比较DENV与HCV两段相同序列间的变异情况,发现该结果与上述结果一致,HCV基因3型表现了更显着的V到I的变异（TATPPGSI）。在对延长后的A序列CD4+T细胞表位预测分析发现,通过SYFPEITHI软件预测出6条DENV表位可能与HCV存在潜在交叉反应,且xxxxxxxTATPPGSx（DENV与HCV相同的位点用氨基酸缩写符号表示,其余位置用x代替）所对应的等位基因HLA-DRB1*0101在HCV基因1型中预测得分高于HCV基因3型（27 vs.19）,其余五条预测表位中HCV基因1型与HCV基因3型得分无差异。利用NetMHCⅡpan4.0在线软件对DENV 1-4型A序列进行表位预测发现其潜在表位主要集中在 xxxxxxxxTATPPGS、xxxxxxxTATPPGSx、xxxxxxTATPPGSxx、xxxxxTATPPGSxxx。将 DENV 与 HCV 对应以上四个主要潜在表位进行分析,发现等位基因 HLA-DRB1*04、DRB4*01 以及DQA10103-DQB10603与HCV基因1型预测得分均高于HCV基因3型。对延长后的A序列进行CD8+T细胞表位预测分析发现,利用SYFPEITHI在线软件预测出11条DENV与HCV可能存在潜在交叉反应的表位。其中6条HCV基因1型潜在表位预测得分高于HCV基因3型,仅1条HCV基因3型得分高于HCV基因1型。采用NetMHCpan4.1对DENV进行免疫表位预测时共预测出17条潜在表位,但与HCV无相对应的潜在表位。对延长后的B序列进行CD8+T细胞表位预测发现,通过SYFPEITHI在线软件预测出12条DENV与HCV可能存在潜在交叉反应的表位,其中有2条HCV基因1型潜在表位预测得分高于HCV基因3型。利用NetMHCpan4.1预测出1条DENV与HCV可能存在潜在交叉反应的CD8+T细胞表位,且HCV基因1型预测得分高于HCV基因3型（0.429 vs.0.421）。通过SYFPEITHI、NetMHCⅡpan4.0在线软件进行DENV与HCV CD4+T细胞免疫表位预测显示,两种病毒之间无对应的潜在表位。[结 论]HCV与DENV之间在NS3区存在相对保守的氨基酸序列,并且两种病毒的对应序列预测出潜在的CD4+T细胞表位和CD8+T细胞表位,HCV基因1型所对应的预测表位分值明显高于HCV基因3型。这提示了 HCV与DENV之间可能存在潜在的T细胞免疫交叉反应,并且DENV特异性T细胞免疫反应可能成为影响HCV基因3型地理分布的原因。此外,这些潜在表位也可为今后HCV与DENV联合疫苗的研发及设计提供一定的理论基础。
夏静[2]（2019）在《丙型肝炎（HCV）广谱中和抗体表位分析和作用机制研究》文中认为丙型肝炎（HCV）感染是一个全球性健康问题,全球范围共有7100万人感染了HCV。80%的患者急性感染后转化为潜伏感染,随着时间的推移,逐渐转变为肝硬化和肝癌。目前,HCV是唯一一种疫苗尚未商业化的肝炎病毒,尽管目前高效的直接抗病毒在HCV治疗方面取得了重要的进展,小分子药疗法会因出现耐药株（RAV）而治疗失败,并且直接抗病毒药物因其昂贵的售价,使得发展中国家的病人对其望而却步。更重要的是,尽管治愈,再次感染依旧会发生。世界卫生组织（WHO）计划在2030年内将HCV新感染患者人数降低90%,所以,一个有效的预防性疫苗对于对抗全球HCV流行至关重要。诱导出能与病毒包膜糖蛋白结合的广谱中和抗体是HCV疫苗研究的主要目标。因此,对于自然感染患者中的广谱中和抗体研究是必不可少的。我们从一个慢性丙肝感染患者体内分离出一株能与HCV包膜糖蛋白E2结合的人源抗体,命名为8D6。这株抗体展示出广谱中和抗体活性,即能中和细胞培养产生的所有亚型的HCV病毒颗粒（HCVcc）。通过功能和表位分析,我们发现8D6可以通过靶向E2保守区域进而阻断E2和受体CD81的结合。更重要的是,8D6对直接抗病毒药物（Direct-acting antiviral reagents,DAA）耐药毒株也显示出了广谱中和活性。随后,我们对抗体序列进行分析时发现,8D6 CDRH3区域上存在一个二硫键桥基序（C-C）,并且在二硫键桥中恒定存在4个氨基酸（CX4C）,进一步研究发现,该二硫键桥一旦发生突变,抗体的广谱中和活性会大大降低,甚至丧失。并且这一基序在一类抗体之中都是保守的,说明抗体广谱中和活性的获得与二硫键桥息息相关。最后,我们重建了8D6推测的胚系（iGL）抗体基因并测试其与HCVcc的结合能力和中和活性,并从中找到了一个1b亚型的毒株PR79L9,8D6胚系抗体可以对PR79L9毒株产生很强的中和效果。这暗示了PR79L9毒株的E2序列可以作为疫苗抗原设计来诱导产生类似8D6的广谱中和抗体（bNAbs）。总之,我们发现了一个新的结合E2保守区的广谱中和抗体8D6,并且其胚系抗体可以作为一种潜在HCV疫苗株的探针。
纪伟[3]（2019）在《HCV和HBV的特异性T细胞免疫反应和分子机制研究》文中研究指明丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（hepatitis Cvirus,HCV）引起的一种主要经血液传播的传染病,呈世界性流行。根据世界卫生组织报告,全球丙型肝炎的流行率平均为3%,估计有1.7亿人感染丙型肝炎病毒,每年新增感染者300万-400万例,死亡25万例,占所有传染病死因的第10位。丙型肝炎已经成为困扰全球公共卫生的一个重要问题。目前,由于HCV基因的多样性以及缺乏理想的动物和细胞感染模型,HCV疫苗研究仍面临很多难题。T细胞免疫在急性HCV感染中病毒是否能自发清除起到关键作用。研究表明,在自限性HCV感染的患者或黑猩猩中发生了强烈的HCV特异性CD8+T细胞应答,但在慢性感染的宿主中观察到较弱CD8+T细胞应答。为了探究T细胞在HCV感染自然进程中的特征,及T细胞免疫与疾病进程的相关性,我们招募河北省某村因献血感染HCV的聚集性人群为研究对象,其中的HCV感染者是1970-1990年左右因献血感染,没有接受过任何治疗。我们用NS3蛋白overlapping多肽库体外刺激PBMC,通过流式分析T细胞细胞因子分泌、记忆细胞分型及抑制性分子表达等,探究T细胞免疫在HCV病毒清除组和慢性感染组的特征及差异。结果表明,病毒清除组的CD8+T和CD4+T细胞因子分泌能力显着高于慢性感染组和健康对照组。两组HCV特异性CD8+T细胞主要以效应性记忆T细胞（TEM）和效应性T细胞为主（TEMRA）,而HCV特异性CD4+T细胞主要以效应性记忆T细胞（TEM）和中心记忆T细胞（TCM）为主。在抑制性分子的表达分析中,慢性感染者病毒特异性CD8+T细胞抑制受体的表达以PD-1高、TIM-3高表达为主要特征,其与以AST或ALT水平异常和形态病理学变化为特征的肝损伤相关。有趣的是,LAG-3在慢性感染者CD8+T细胞上的表达较低,与ALT或AST呈负相关。我们对长时期的HCV感染者的病毒特异性T细胞免疫的特征进行了研究,并有助于阐明免疫应答在相关临床过程中的作用。同时,我们也对慢性感染者感染的HCV病毒进行了分子水平的研究工作。我们对其感染的HCV病毒通过分子生物学实验进行基因分型,并利用一代测序和二代测序手段获得26条全基因组序列。根据基因分型结果,这些感染者感染的是HCV1b（17）、HCV2a（9）两种基因型。对于一代测序的全基因序列,我们根据MEGA7.0的进化距离分析发现,HCV1b间及HCV2a间的序列都有很高的同源性。通过与国内外序列进行系统发育进化树分析,HCV2a的序列相对聚集,聚集在一个独立的分支上,与国外测得的NDM228等株亲缘关系相对较近。HCV1b的17条序列相对分散。对各蛋白编码区也进行了系统进化分析,结果同全基因序列的分析基本一致。通过二代测序,我们获得的信息有原始reads、拼接序列、每条序列每个位点的测序深度、entropy、mutrate等。26条序列的拼接工作已经完成,数据分析还在进行中。我们在病毒“准种”、重要的T细胞表位和中和抗体表位的免疫逃逸突变等角度进行分析,结合临床数据,探究其与肝脏损伤程度的相关性。另外,MHC分子结构在T细胞免疫研究中起了很重要的作用。MHC分子可以限制TCR对多肽的识别,而且多肽与MHC之间的构象协调作用对于TCR的识别至关重要。如果将构像改变的关键氨基酸突变,就会导致pMHC复合物与TCR的结合变弱。同一 MHC-多肽可以被不同TCR识别,MHC-多肽复合物的柔性变化也是TCR可以交叉识别的原因之一。可以看出,MHC-多肽的结合能力以及它们的构象变化影响了TCR识别。我们通过对H-2Kd-HBV peptide复合物分子结构的分析,并结合HLA-B*4001的结构解析及分析,发现两个复合物结构中都有在一个带正电的氨基酸R和负电氨基酸E构成的两种不同形式的盐桥参与MHC与多肽的结合。我们对两个氨基酸进行了单突变和双突变,通过refolding、CD检测MHC与多肽结合的稳定性,以及H-2Kdtetramer对HBV特异性CD8+T的识别,结果证明了盐桥氨基酸的突变影响了多肽与MHC分子的结合能力及多肽-MHC复合物对TCR的识别。综上所述,本研究探究了 T细胞免疫在HCV感染自然进程中的特征和T细胞免疫与肝脏损伤程度的相关性,并对感染者感染的HCV病毒全序列进行了分析。另外,我们基于H-2Kd-HBV peptide HBc87-95和 HLA-B*4001-SARS N216-225复合物结构发现了盐桥在MHC与多肽结合及MHC-多肽复合物对TCR识别的重要性。该研究工作对HCV和HBV的预防和治疗具有一定的提示性和指导性。
刘亚妮[4]（2016）在《用于制备HCV抗原抗体一体化检测试剂盒相关试剂的研究》文中指出在全球范围内丙型病毒性肝炎是可致死的十大感染性疾病之一,在我国也是一种常见的传染病。丙型病毒性肝炎由丙型肝炎病毒引发,简称为丙肝,主要传播途径是经体液及血液传播。HCV感染人群中慢性丙型肝炎约占70%～85%,其中60%～70%的慢性感染患者将发展为慢性肝病,包括肝硬化、肝癌等,在肝硬化患者中,每年有1%～4%发展为肝癌。HCV感染会引发肝硬化的产生,同时也是诱发肝癌的最重要原因。丙肝危害极大的另一主要原因是由于目前尚无切实有效的可用于预防丙型肝炎病毒感染的疫苗。在发展中国家,因为诊断技术不成熟以及治疗方法存在缺陷而导致的HCV感染者死亡率在逐渐升高。由于HCV疫苗的研发在短期内很难获得突破性的进展,所以,控制该疫情的发展只能从切断传染源和阻遏传播途径上入手。而HCV感染初期具有极强的感染性,因此对HCV感染者进行及早而准确的诊断是控制丙型肝炎传播的最为有效的手段。因而建立一种具有高灵敏度、特异性和稳定性的针对HCV的筛查方法具有重要的意义。目前常用的HCV检测方法主要包括:①血清中HCV抗体检测;②血清中HCV核心抗原检测;③血液中HCVRNA检测。这三种检测方法在确诊HCV感染、选择患者治疗方案以及评价治疗效果等方面相辅相成,起到了关键性的作用。但由于目前使用的抗HCV检测试剂盒中抗原均为人工合成的具免疫原性的基因工程抗原配比合成肽抗原,其在特异性方面存在不足,可能会出现假阳性结果。此外,由于“窗口期”的存在,在HCV感染初期,感染者体内尚无抗体的产生,因此,在HCV感染早期诊断还需要其他检测策略来弥补其不足。丙肝病毒核心蛋白由氨基酸序列非常保守的大约190个氨基酸编码而成。病人血液中HCV核心抗原的出现是反映HCV感染的重要标志,因此目前可应用于HCV感染“窗口期”的筛查,HCV抗原的检测可将HCV感染的窗口期缩减50天左右。HCV核心抗原检测中较常用的方法是双抗体夹心法。双抗体夹心法可检测血清样品中总的核心抗原或游离的核心抗原,在明显缩短窗口期的同时,不会受到被检样品中所含有的抗-HCV抗体的影响,检测结果可靠,具有方法简单、用时短、对环境要求低、假阳性率低等特点。在暴露于HCV环境中7～21天内,即可在患者外周血中检测到HCV RNA的存在,其含量在血清阳转之前可达到一个峰值,滴度在1×105至1×108拷贝/mL之间。为了实现HCV感染的早期检测,降低感染率,许多国家采用了灵敏度较高的核酸检测法,但技术该技术对设备、试剂及操作方法等要求均较高,而且检测过程易交叉污染,因此很难在发展中国家推行开来。综上所述,联合检测抗HCV抗体及HCV核心抗原将成为检测HCV感染的有效手段之一。本课题利用检测抗原及抗体相结合的方法,可同时检出样本中HCV抗原和抗体,提高了阳性检出率,并可有效缩短HCV检测窗口期,有利于HCV感染早期诊断。通过比较前三代抗-HCV诊断试剂盒中抗原的组份,我们选择了 core及NS3-5重组型抗原检测病人血液中的抗体,同时应用HCV核心抗原保守区两端小肽分别制备HCV抗核心单克隆抗体,利用双抗体夹心法原理检测病人血液中的抗原。本课题的具体研究内容如下:（1）ELISA试剂盒中用于检测抗体的丙肝病毒抗原的表达与纯化:通过PCR获得HCV core-NS3-5基因片段,将其克隆至实验室构建保存的原核表达载体pRSET-BL,然后通过酶切鉴定及测序获得pRSET-BL/HCV core-NS3-5原核表达载体,将该质粒电转化至E.coliBL21（DE3）菌株,经IPTG诱导,Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白6His-HCV core-NS3-5融合蛋白。该融合蛋白作为ELISA试剂盒中抗原的组份。（2）携带丙型肝炎病毒核心抗原C8-160片段,核心抗原小肽C8-22及C101-115融合蛋白的原核表达载体的构建及其表达纯化:通过公司合成HCV C8-160基因片段、HCV C8-22小肽以及HCV C101-115小肽的Linker。将HCV C8-160基因克隆至实验室构建保存的PGEX-4T-3载体,获得原核表达载体PGEX-4T-3/HCVC8-160。将 HCVC8-22 小肽和 HCVC101-115 小肽分别克隆至实验室保存的pET-28a/HBc-LacZ BS载体和pRSET-B/Grn E BS载体中,获得pET-28a/HBc-HCV C8-22、pET-28a/HBc-HCV C101-115、pRSET-B/Grn E-HCV C8-22和pRSET-B/Grn E-HCV C101-115四种可以表达不同表位小肽的融合蛋白的原核表达载体。将上述五种原核表达载体分别电转化至E.coli BL21（DE3）菌株,经IPTG诱导,Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白,用于制备针对HCV核心不同抗原表位的单克隆抗体。（3）分别携带核心抗原小肽C8-22和C101-115的真核表达载体的构建:将质粒pAd5/E1-CMV-H1H2-Grn E-Flag用BamHI和SfuI分步双酶切后,分别连入HCV C8-22小肽和HCV C101-115小肽,转染HEK 293细胞72 h后收集上清和全细胞裂解液,用于单克隆抗体的Western Blot检测。（4）针对人IgGFc段的单克隆抗体的制备:用购买自Sigma的人IgG蛋白作为免疫原,第一次免疫时将免疫原和Freund完全佐剂等体积混合,研磨后对小鼠进行皮下多点注射,每只小鼠注射的免疫原总量为40 μg;3周后进行第二次免疫,将免疫原与Freund不完全佐剂等体积混合,每只注射剂量和注射方法均同第一次;2周后进行第三次免疫,此次不加佐剂,采用腹腔注射,注射剂量同前两次。2周后,进行断尾取血,用ELISA检测小鼠血清抗体效价,选择抗体效价达到1:64000以上的2只小鼠,于1周后用该蛋白进行腹腔加强免疫。加强免疫后第2天,将饲养细胞接种于96孔板中,第3天将免疫小鼠的脾细胞按照10:1或5:1比例与SP2/0骨髓瘤细胞通过PEG4000进行融合,以HAT/HT选择培养液筛选杂交瘤细胞,融合7天至10天后,采用ELISA法筛选阳性孔,经过3～4次的亚克隆,阳性率达到100%时,即得到分泌小鼠抗人IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞,随后将杂交瘤细胞转移到24孔板中进行扩大培养并冻存。选择8周龄的BALB/c小鼠制备腹水。收集腹水后获得所需的小鼠抗人IgG单克隆抗体。（5）针对HCV核心不同抗原表位的单克隆抗体的制备:为了制备针对HCV C8-22单克隆抗体的制备,将上述获得的GST-6His-HCV C8-160融合蛋白作为初次免疫原,HBc-HCV C8-22融合蛋白作为加强免疫原,Grn E-HCV C8-22融合蛋白用于杂交瘤的筛选检测,筛选获得阳性杂交瘤细胞,扩大培养及制备腹水后由Western Blot和免疫荧光染色进行鉴定,制备得到针对HCV C8-22的单克隆抗体。针对HCV C101-115单克隆抗体的制备,同上述实验策略,初次免疫原同上,HBc-HCV C101-115融合蛋白作为加强免疫原,Gm E-HCV C101-115融合蛋白用.于筛选,制备获得针对HCVC101-115的单克隆抗体。（6）HCV抗原抗体联合检测体系的建立及其应用:应用针对HCV核心抗原不同抗原表位的单克隆抗体Anti-HCV C8-22和Anti-HCV C101-.115及HCV core-NS3-5重组抗原同时包被酶联板。如果是检测样本中的抗体,使用HRP标记的鼠抗人IgG单抗;如果是检测样本中的抗原,使用与固相包被物有不同抗原决定簇的辣根过氧化物酶标记的抗-HCV核心单克隆抗体,显色后进行定性或定量检测。由此可以检测样品中的HCV抗原或其抗体。通过以上研究获得以下研究成果:（1）成功构建了 pRSET-BL/HCV core-NS3-5原核表达载体,纯化获得6His-HCV core-NS3-5 融合蛋白,浓度为 1.0 mg/mL;（2）成功构建了 PGEX-4T-3/HCV C8-160原核表达载体,纯化获得GST-6His-HCV C8-160 融合蛋白,浓度为 1.0 mg/mL;（3）成功构建了 pET-28a/HBc-HCV C8-22 和 pRSET-B/Grn E-HCV C8-22 原核表达载体,纯化获得携带HCV C8-22小肽的融合蛋白HBc-HCV C8-22浓度为0.1 mg/mL,Gm E-HCV C8-22 浓度为 0.25 mg/mL;（4）成功构建了 pET-28a/HBc-HCV C101-115 和 pRSET-B/Grn E-HCV C101-115原核表达载体,纯化获得携带HCVC101-115小肽的融合蛋白HBc-HCV C101-115 浓度为 0.1 mg/mL,Grn E-HCV C101-115 浓度为 1.2 mg/mL;（5）成功构建了 pAd5/E1-CMV-H1H2-Grn E-HCV C8-22-Flag 和 pAd5/E1-CMV-H1H2-Gm E-HCV C101-115-Flag 真核表达载体;（6）通过杂交瘤技术制备获得3株针对人IgG Fc段的单克隆抗体的杂交瘤细胞系,它们分别为33E5、30E1和28D11。经Western Blot鉴定,3株单克隆抗体均特异性针对人IgGFc段。均为IgG1亚类。经ProteinGPlus/ProteinA-Agarose亲和层析法纯化后浓度分别为2.28 mg/mL、1.07 mg/mL和1.61 mg/mL。（7）采用联合免疫的方法,通过杂交瘤技术制备获得3株针对HCV C101-115抗体,它们分别为39A6、43C6和73B6。经Western Blot和免疫荧光染色鉴定,3株单克隆抗体均特异性针对HCV C101-115抗原。均为IgG1亚类。经Protein G Plus/Protein A-Agarose 亲和层析法纯化后浓度分别为 3.41 mg/mL、5.15 mg/mL 和 1.09 mg/mL。上述研究成果为HCV诊断提供了特异性抗体及抗原,为进一步研究HCV的防治途径奠定了重要基础;同时也为小肽的单抗制备提供了一种更有效的免疫方案。
边奕鑫[5]（2013）在《丙型肝炎病毒非结构蛋白3解旋酶保守性表位单克隆抗体及其意义》文中提出丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV）感染而引起的严重威胁人类健康的传染性疾病。全球约有1.3-1.7亿HCV感染者,大约20%可以自然清除,80%发展为HCV慢性感染。10-20%的HCV慢性感染会进一步发展为慢性进行性肝病,包括肝硬化、肝细胞癌等。HCV是一种非甲非乙型肝炎病毒,后命名为丙型肝炎病毒,归属于肝炎病毒属（Hepacivirus）,黄病毒科（Flaviviridae）。HCV病毒体呈球形,为单股正链RNA病毒。HCV-RNA全长约为9.6kb,包括一个位于基因中央的开放阅读框（ORF）。该阅读框编码3000多氨基酸的前体多聚蛋白,其通过宿主和病毒的蛋白酶作用被切割成10个具有独立功能的HCV蛋白,根据功能的不同分别命名为核心蛋白Core （C）,包膜蛋白（envelope protein）1、2（E1、E2）, p7和非结构蛋白（non structural protein） NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。NS3蛋白是HCV病毒复制中重要的功能蛋白之一,发挥丝氨酸蛋白酶,解旋酶和NTP酶活性,成为当今HCV诊断,治疗和预防的研究热点。NS3蛋白N末端1/3具有丝氨酸蛋白酶活性,与NS4A构成复合体,对多聚蛋白前体起到剪切作用。C末端2/3氨基酸构成HCV NS3解旋酶（helicase）,发挥三磷酸腺苷酶（ATPase）和解旋酶作用,使双链RNA解旋,对HCVRNA复制起到重要作用。此外,研究表明,NS3解旋酶含有大量B细胞优势表位,能在HCV感染早期诱导机体发生体液免疫反应,产生抗体。因此NS3蛋白（1192～1457aa）常用作HCV抗体EIA检测试剂盒中的包被蛋白。近年来,由于NS3蛋白功能的进一步明确,发现NS3解旋酶区域中包含大量的高度保守的功能区,例如,模序I （Walker A:207GSGKS211）是ATP结合位点,在ATP水解中发挥作用。因此,NS3解旋酶成为抗HCV病毒复制的理想靶位。研究者致力于抑制剂与NS3解旋酶的相互作用,来研发新一代NS3解旋酶抑制剂。在本课题中,制备了大量抗HCVNS3解旋酶的单克隆抗体（单抗）,研究单抗识别表位位点及意义,并进一步研究单抗对HCVNS3功能的影响,探索表位氨基酸位点和单抗在HCV诊断与治疗中的潜在价值。我们从含有HCVNS3（lb型）全长基因的质粒pMD20NS2-4A中,扩增NS3目的基因,并构建表达载体pET-32a-NS3,采用基因原核表达系统进行目的基因表达。可溶性蛋白通过Ni-NTA亲和层析纯化,获得纯度约为90%的截短型NS3蛋白（1192-1459aa） T-rNS3。以T-rNS3蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,采用鼠脾细胞与骨髓瘤细胞杂交技术制备抗HCVNS3单克隆抗体。此外,我们获得了三种NS3全长蛋白：一种是从转染pTY-CMV-NS3质粒并稳定表达HCV NS3蛋白的293T细胞中获得重组NS3蛋白（FL-rNS3）;一种是从转染HCV2a型RNA（JFH-1）的Huh7.5.1细胞中获得的天然NS3蛋白；还有一种为纯度为95%的商品化蛋白FL4b-rNS3,用来进行解旋酶体外功能实验。为确定B细胞表位,设计并合成了47条多肽。其中,29条为重叠7个氨基酸的长度为16个氨基酸长肽,12条为根据长肽P05、P21设计的短肽,5条为根据P05、P21与其他亚型HCV. GB病毒C比对结果设计的突变肽,一条布鲁士杆菌16肽作为阴性对照。用合成肽通过peptide-ELISA和竞争抑制ELISA方法与单克隆抗体反应,对抗体识别表位进行确定。通过ELISA、Western-Blot和免疫荧光染色（IFS）等方法,用T-rNS3蛋白,FL-rNS3蛋白,天然NS3蛋白,FL4b-rNS3蛋白对单克隆抗体进行鉴定并对抗体识别表位进行分类。为确定线性表位的保守性,我们从GenBank数据库中随机选取了大量HCV不同亚型和黄病毒科其他病毒的氨基酸序列与线性表位氨基酸进行比对。根据比对结果合成突变肽,分别与单抗进行ELISA反应,分析线性表位的保守性和单抗的特异性。为确定线性表位的免疫优势性,通过peptide-ELISA方法对源于我国广东和北京地区献血者中的HCV感染者和健康献血者进行研究,测定表位多肽与血清中抗体的反应性,与常规两种不同血清抗体EIA试剂盒筛查和核酸检测结果相比较,评估表位多肽ELISA检测与常规方法检测的符合率。根据两种EIA方法测定抗体和PCR方法测定病毒载量的结果,将136份HCV感染样本分为50份自然康复性（RNA-/Ab+）和86份慢性（RNA+/Ab+）.以128份健康人血样作为阴性对照,确定健康人血清抗体水平（S/CO值：mean+2SD,95%可信区间）,以此评估多肽与HCV阳性样品的反应阳性率,绘制ROC曲线并确立最优Cut-off值,并以此计算得到表位多肽与抗体反应的灵敏度、特异性、阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV）。用Kolmogorov-Smirnov Z分析ROC值与标准值（0.5）的差异。用Pearson Chi-Square检验比较表位多肽分别与HCV慢性感染样品和HCV自然康复性样品反应两组之间的差异。此外,我们还通过体外HCVNS3解旋酶活性检测实验,评估单克隆抗体对解旋酶的抑制作用程度。用单项方差分析和Dunnett’s T3法来比较实验组和对照组的差异,P<0.05即为差异显着。通过以上实验方法,用杂交瘤技术制备了29株单克隆抗体。单抗分别与多肽进行ELISA反应,结果示,有6株单克隆抗体识别8条16个氨基酸的长肽,其中单抗1C11所识别的P13、P14可以示为一条表位氨基酸序列,而1A10所识别的P09、P16是一条不连续的线性表位序列。因此,表位筛选共获得5条连续性的线性表位和一条非连续性的线性表位。29株单抗与重组NS3蛋白和天然NS3蛋白的Weston-blot结果显示：27株与变性的T-rNS3反应；8株与变性的FL-rNS3反应,其中3株与变性的天然蛋白反应。与重组NS3蛋白和天然NS3蛋白的IFS结果显示：10株单抗与非变性的FL-rNS3蛋白反应；7株与非变性的天然FL-rNS3蛋白反应,其中六株（mAb2E12, mAb4B4, mAb3E5, mAb3H3, mAb5F6, mAb6G7）与FL-rNS3蛋白交叉反应,一株（mAb5C9）不反应。通过上述结果,将29株单抗识别的HCVNS3抗原表位分为线性（6株）、构象性（3株）、半构象性（3株）三个类型（其余17株未分类）。识别线性表位的单抗中,单抗2E12和3E5与天然NS3蛋白结合。为精确这两株单抗识别的表位,我们用短肽与单抗预孵育的混合物通过ELISA方法和16个氨基酸的长肽进行竞争抑制；并用短肽包被,与单抗进行peptide-ELISA。结果示,2E12识别的表位EP05为205PTGSGKSTK213；3E5识别的表位EP21为346EIPFYGKAIPIETIKG361,该表位其核心氨基酸序列为347IPFYGKAI354。分析两条表位在HCVNS3蛋白中的位置,发现EP05所在位置覆盖了NS3解旋酶中的ATP结合位点（207GSGKS211）, EP21的位置接近核苷酸结合位点。将两条表位氨基酸与HCV其他亚型和黄病毒科其他病毒的相似位点的氨基酸序列进行比较,分析线性表位的特异性与相似性。发现EP05氨基酸序列与不同亚型HCV和黄病毒科非人类感染病毒GB病毒B相似位点的氨基酸完全相同,与人感染病毒GB病毒C相近（存在K208A变异）；根据变异情况,设计突变肽GP05’（K208A）,结果示单抗2E12不与GP05’反应,说明EP05在HCV各个亚型中完全保守,在人感染性的黄病毒科中高度特异。EP21与不同亚型的HCV相似序列相比较,氨基酸呈现高度保守性,仅在少数亚型中有I347V、K352R、I354L变异,与黄病毒科GB病毒C比较存在K352H、A353G变异；Peptide-ELISA结果示,单抗3E5不与VatP2101（I347V）、VatP2102（K352R）和GP21’（K352H和A353G）反应,与VatP2103（I354L）弱反应。但是,在ELISA和IFS中,单抗3E5与含有1347V和K352R突变位点的FL-rNS3（4b型）和天然NS3蛋白（2a型）反应阳性,说明EP21核心区域上述位点氨基酸的改变,可能影响表位在线性条件下与单抗的结合,但在空间状态下,由于游离表位氨基酸的结构复杂性,即使上述位点氨基酸改变也不影响与单抗的反应。单抗2E12和3E5均不与登革热病毒发生交叉反应。进一步证明了单克隆抗体能特异性结合HCVNS3蛋白。为评估高度保守性表位与HCV感染性样品中抗体反应的潜在优势,通过Peptide-ELISA方法,用含有表位EP05的长肽P05和含有表位EP21的长肽P21对136份HCV感染性血液样品（86份慢性感染：RNA+/Ab+;50份自然康复：RNA-/Ab+）和128份健康者血液样品（RNA-/Ab-）进行筛查。根据长肽与健康者血样反应结果,通过计算mean+2SD,得到Cut-Off值分别为0.267（P05）和0.298（P21）。以此计算P05和P21与慢性感染样品反应的阳性率分别为79.1%和59.3%,显着高于与自然康复性样品反应的阳性率58%和30%（P<0.001）。以P05和P21分别与214份血样（86份慢性感染样品和128份健康献血者样品）,178份血样（50份自然康复性样品和128份健康献血者样品）,264份全部样品（86份慢性感染样品、50份自然康复性样品和128份健康献血者样品）的ELISA结果与标准检测结果进行符合率比较,绘制ROC曲线。结果示,P05和P21与214份血样反应曲线下面积分别为0.930、0.859；P05,P21与178份自然康复性感染和健康人血清反应的曲线下面积分别为0.843、0.782；P05,P21与264份全部血清反应的曲线下面积分别为0.898、0.830。两条多肽对于诊断HCV均具有显着意义（P<0.001）。P05、P21两个表位多肽与常规法检测结果的符合率分别为73%、88%,是HCV的两个优势抗原表位。由上述结果及分析可知,单抗2E12识别表位覆盖了解旋酶区域I的ATP结合位点,这样抗体与表位的结合就有可能对解旋酶的功能造成影响。为了对此进行研究,我们在体外进行解旋酶活性功能实验。按不同浓度将高纯度4b型重组全长NS3蛋白（FL4b-rNS3）与DNA底物混合,FL4b-rNS3发挥解旋功能,将双链DNA解旋为单链,释放FAM荧光。仪器通过对荧光的检测,来评估解旋酶的效率。结果示：随着FL4b-rNS3浓度的增加,解旋效率越高。根据解旋酶活性功能实验结果,将适当浓度的mAb2E12和一株非相关抗体（作为阴性对照）分别与FL4b-rNS3预孵育后的混合物加入到DNA底物中。通过荧光检测结果,可以发现mAb2E12可以对FL4b-rNS3解旋酶活性起到一定的抑制作用（P=0.003）,使解旋活性降低大约50%,而对照抗体则不具有抑制性（P=0.239）。由此可以推测出,mAb2E12可能起到HCV解旋酶抑制剂的作用,进而有可能影响到HCV病毒复制。但是由于FL4b-rNS3蛋白不能达到相对高的纯度,使蛋白污染了少量的宿主细胞的解旋酶。这种污染会对双链DNA起到一定的解旋作用,产生单链DNA,释放荧光,干扰体外抑制试验结果。为了避免其他解旋酶的污染,精确验证mAb2E12的抑制功能,我们将在下一步的实验研究中进行细胞内的解旋酶功能实验,即把重组mAb2E12的病毒载体转染到稳定复制HCV的Huh7.5.1细胞内,在细胞内评估抗体对解旋酶活性的抑制以及对病毒复制的影响。综上所述,在本研究中,我们共制备29株抗HCV NS3的单克隆抗体。其中,mAb2E12识别HCVNS3解旋酶完全保守性表位EP05,该表位位于结构域Ⅰ中的模序I （WalkerA）的ATP结合位点；mAb3E5识别HCV NS3解旋酶高度保守性表位EP21,该表位接近解旋酶核苷酸结合位点。单抗与表位的特异性结合可能会影响到HCV复制中的解旋酶活性。目前数据表明,mAb2E12和mAb3E5对HCV慢性感染诊断和抗病毒治疗存在一定的生物学价值。
柯晓煜[6]（2012）在《CD8+T细胞免疫压力下丙型肝炎病毒的适应性变异》文中研究表明目的1.检测武汉人群中慢性HCV感染患者基因分型，分析基因分型分布及其临床意义；2.扩增HCV1b型感染患者的HCV NS3区并进行测序，分析HCV NS3功能区氨基酸变异和CD8+T细胞表位内外的变异；3.比较中国武汉人群和德国人群HLA频率分布差异。检测HCV1b型感染患者HLA分型，并比较分析武汉HCV患者人群与武汉健康人群HLA频率分布；4.分析HCV1b病毒株序列变异与宿主HLA-I限制性CD8+T细胞表位变异的相关性，并针对NS3序列预测HLA-I限制性CD8+T细胞表位。方法1.收集227例武汉慢性HCV感染患者血清和全血，抽提血清中HCV RNA，采用型特异性引物扩增法对HCV RNA进行基因分型，分析武汉人群中HCV基因型别分布，并分析HCV1b型的临床意义。2.采用巢式PCR对HCV1b基因型的HCV NS3区进行扩增并测序，采用软件将HCV1b型患者的HCV NS3区序列进行序列比，分析HCV NS3功能区的变异和CD8+T细胞表位内外的变异。3. HLA频率分布网站中比较中国武汉人群和德国人群的HLA频率分布。采用型特异性引物PCR法检测中国武汉HCV1b型患者相应的HLA-I（A-和B-位点）等位基因，与武汉健康人群HLA-I等位基因频率相比较。4.采用ALIGN、DNAMAN等软件分析武汉HCV1b感染患者中不同HLA-I限制性的CD8+T细胞表位的变异频率。采用网络软件预测HCV1b型NS3区序列的HLA-I限制性CD8+T细胞表位。结果1.227份武汉慢性丙肝患者中HCV基因1b型126例（63.6%），其他HCV基因型72例（36.4%），表明在我国慢性丙肝患者HCV主要型别是1b型。比较39例HCV1b型和19例HCV其他基因型别患者肝功能，发现HCV1b型感染者较其他HCV基因型感染者更容易出现肝功能异常，提示HCV1b型较其他HCV基因型更易造成肝脏损伤。2.对30条HCV NS3区全长序列进行分析，发现决定HCV功能的氨基酸序列很难发生变异，表明HCV NS3功能区的氨基酸序列相对保守。而且HCV NS3区CD8+T细胞表位内的氨基酸突变频率明显大于表位外（p<0.05，有统计学意义），提示CD8+T细胞的免疫压力是导致HCV NS3变异的重要原因之一。3.比较中国武汉人群和德国人群的HLA-A和HLA-B基因型频率分布，发现中国武汉人群中HLA-A02/11/24和HLA-B13/15/46频率较高。而且中国武汉和德国人群的HLA基因型频率分布有明显不同，在武汉人群中分布频率较高的HLA-A11、HLA-B46基因型频率在德国人群中明显较低；而在德国人群中分布频率较高的HLA-A01、HLA-A03、HLA-B07、HLA-B08基因型频率在中国武汉人群中较低。分析本研究中135例HCV患者的HLA-A基因型频率和134例HCV患者的HLA-B基因型频率，发现跟中国武汉健康人群的HLA基因型频率基本一致。4.从群体水平上分析HCV1b型患者HLA-I限制性的HCV NS3区CD8+T细胞表位突变，发现两个HLA-A02阳性的HCV NS3区CD8+T细胞表位（NS31169-1177和NS31443-1451）突变频率，明显高于HLA-A02阴性的HCV NS3区CD8+T细胞表位突变频率，有统计学意义（P<0.05）。将预测的HCV1b型患者中HLA-I限制性的HCVNS3区CD8+T细胞表位与30条HCV NS3全长序列联合分析，发现四个预测的HCVNS3区CD8+T细胞表位的变异与HLA-I限制性CD8+T细胞免疫压力可能有关。结论1.武汉人群中主要的HCV病毒株型别是HCV1b型，并且HCV1b型较其他HCV基因型更易造成肝脏损伤。2.决定HCV功能的NS3功能区氨基酸序列很难发生变异，而HCV NS3区CD8+T细胞表位内的氨基酸突变频率明显大于CD8+T细胞表位外的氨基酸突变频率，提示CD8+T细胞的免疫压力是导致HCV NS3变异的重要原因之一。3.武汉和德国人群的HLA基因频率有明显不同，在武汉人群中HLA频率较高比如HLA-A11、HLA-B46在德国人群中明显较低。武汉人群中频率较高的HLA-I限制性的HCV CD8+T细胞表位突变频率则相对较高。4.两个NS3区CD8+T细胞表位（NS31169-1177和NS31443-1451）跟HLA-A02相关，表明HCV NS3区CD8+T细胞表位突变受到宿主HLA等位基因限制。本研究的创新点1.发现武汉和德国人群的HLA基因频率有明显不同，武汉人群中频率较高的HLA-I限制性的HCV CD8+T细胞表位突变频率相对较高，为找出最佳的HCV抗原序列并研制预防性和治疗性疫苗提供了科学基础。2.国内既往多项研究集中在HCV的异质性和HCV CD8+T细胞表位预测，仅少数研究HLA-I类等位基因与HCV变异的关系。本研究的意义探讨HCV在CD8+T细胞免疫压力下演化适应过程，测定HLA-I限制性HCV NS3区CD8+T细胞表位序列多态性，明确不同人群中HCV在CD8+T细胞免疫压力下演变规律，为寻找保护性CD8+T细胞抗原表位和研制基于T细胞HCV疫苗提供科学基础。
杨桂梅[7]（2010）在《丙型肝炎病毒多表位疫苗研究—重组抗原PCXZ及DNA疫苗pDNA-PCXZ在BALB/c体内的免疫原性》文中进行了进一步梳理丙型肝炎病毒（HCV）为单股正链RNA病毒是丙型肝炎的病原体。HCV具有高度遗传多态性,能够迅速突变逃逸宿主的免疫应答,给疫苗的研究带来许多的困难。基于现有的对控制HCV感染有关机制的认识,疫苗应当具有诱导多种特异性和强烈的细胞免疫应答的能力,也就是CD4+和CD8+T细胞反应,并结合强烈的交叉中和抗体应答。本文在前期构建的HCV多表位抗原PCX的基础上新增了三段保守的HCVB/T细胞免疫表位,形成了HCV多表位肽段PCXZ。重组表达得到的多表位抗原PCXZ具有较高阳性HCV识别率的抗原特异性。以PCXZ抗原免疫BALB/c小鼠,在小鼠体内激发出基于Th2的强烈的体液免疫应答,同时也有效诱导了特异性的CD4+和CD8’T细胞免疫应答。三段新增表位中Pa表位显示出良好的B和T细胞免疫应答效果。弗氏佐剂作为PCXZ抗原的免疫佐剂,对体液免疫的影响不显着,而对T细胞免疫应答有一定的增强作用,但是并不足以改变免疫应答形式,仍以Th2免疫应答为主。质粒DNA （pDNA）疫苗能够同时诱导体液免疫和细胞免疫应答,尤其是激活了强烈的Thl型CD4+和CD8+T细胞的免疫应答。本文第三部分将合成的多表位肽段PCXZ克隆至真核表达载体pVAXl内构建了相应的cPCXZ pDNA疫苗；同时为了使外源基因能够以膜锚定的形式进行表达,在载体中又装载了鼠类IgG k-链前导序列和促血小板生成因子受体（PDGFR）穿膜序列,构建了mPCXZ pDNA疫苗。cPCXZ和mPCXZ能够在细胞内正确地有效表达,并且表达产物能被HCV患者血清识别。分别以cPCXZ和mPCXZ的pDNA疫苗直接或联合pGM-CSF细胞因子分子佐剂免疫BALB/c小鼠。结果均能有效地诱导特异性分泌IFN-γ的CD4+T细胞增殖和CD8+T细胞的CTL效应；mPCXZ诱导的T细胞免疫应答效果显着优于cPCXZ; GM-CSF细胞因子的共免疫则有效提高了机体的细胞免疫应答水平；在体液免疫方面,为了加强B细胞的免疫应答,在两次pDNA免疫后以重组蛋白抗原PCXZ加强免疫,结果诱发了高滴度的特异性IgG抗体产生,mPCXZ组和cPCXZ组无显着差异。三段HCV表位中Pa片段代表的表位,不仅有较强的T细胞免疫应答反应,而且是唯一一个有显着特异性抗体应答的表位,而针对Pb和Pc片段仅检测到较高的CTL效应,特异性的IFN-y分泌则相对较弱。总之,本文基于HCV保守表位构建的膜锚定表达的mPCXZ pDNA疫苗联合分子佐剂pGM-CSF在BABL/c小鼠体内能够激发强烈的T细胞免疫应答,以重组蛋白抗原PCXZ加强免疫后,产生了高滴度的特异性IgG抗体,为该疫苗接下来在HCV感染模型中的深入研究奠定了基础,同时也显示出这种形式的疫苗在HCV疫苗研究领域具有巨大的潜能。
邱丰[8]（2010）在《丙型肝炎病毒多表位融合蛋白的表达及免疫效果的评价》文中提出丙型肝炎是一种严重威胁人类生命健康和生活质量的传染性疾病,急性丙型肝炎患者的临床表现包括：乏力,食欲不振,肝脏肿大和叩击痛,部分病人可出现黄疸。这一疾病的致病原为丙型肝炎（丙肝）病毒（hepatitis C virus, HCV）,属于黄病毒科丙型肝炎病毒属,它的基因组由一条单链正义RNA构成,全长约9600nt,只含有单一的开放读码框架,编码3011个氨基酸组成的聚合蛋白,该聚合蛋白在翻译的过程中或者翻译后被宿主和病毒蛋白酶切割成至少10种成熟的结构蛋白以及非结构蛋白,包括：核心蛋白C, El, E2, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A和NS5B。据WHO的统计资料表明,目前全世界约有1.7亿HCV感染者,并且每年新增感染者达300万～400万,所以,研制和开发HCV疫苗来预防HCV感染是当前全世界所共同面临的一个重大而且紧迫的难题。然而迄今为止尚无高效完善的HCV组织培养系统,致使传统减毒疫苗或者灭活疫苗的研制策略困难重重,因此关于HCV疫苗的研究主要集中在HCV重组亚单位蛋白的免疫特性上。此外,疫苗的免疫剂量,免疫方式和免疫程序都是值得深入探讨的问题。一个成功的HCV疫苗必须能够激发出较强的体液免疫反应和细胞免疫反应,体液免疫反应主要指诱导机体产生针对HCV包膜糖蛋白1和2（gpE1和gpE2）的病毒中和抗体,细胞免疫反应包括特异性的受MHC-Ⅱ类分子限制的CD4+辅助性T细胞以及受MHC-Ⅰ类分子限制的CD8+杀伤性T细胞的生成,上述两个类型的T细胞均能够分泌诸如干扰素γ（IFN-γ）之类的抗病毒细胞因子,其中CD8+杀伤性T细胞还具有清除被感染细胞的作用。目前HCV疫苗研究领域中已经诞生了不少候选疫苗,这些研究一般都使用重组HCV包膜糖蛋白gpE1和gpE2作为疫苗中的抗原,但是无论如何在疫苗的前期研究工作中都需要候选分子的高效表达,以便在体外评价其免疫效果,针对HCV的高度变异性以及其他研究中表达的亚单位多肽诱发的体液免疫反应较弱等问题,我们选取了HCV基因组中相对保守并且也是T细胞表位非常集中的NS3区的一段780bp的DNA序列,另外为了提高对B细胞的激活能力,诱生出中和抗体,我们查阅文献后选取了三个保守的广谱中和抗原位点,将这些抗原表位融合表达,可望生成的融合蛋白具备较强的免疫原性并且能够对不同型,不同株的HCV提供保护作用,从而克服阻止HCV的感染,为丙型肝炎疫苗的研制作一些铺垫。本实验中通过微量中和试验以及CTL杀伤实验评价了HCV多表位融合蛋白的体液免疫原性和细胞免疫原性,为HCV疫苗的研制提供了一定的实验基础。另外,该融合蛋白也可作为临床诊断的候选抗原,在提升HCV诊断试剂的灵敏度和特异性方面具有一定的参考价值。一、丙型肝炎病毒多表位融合蛋白在原核系统中的表达根据文献报道：我们挑选出位于HCV包膜蛋白区的三个B细胞表位（aa192～aa202:YEVRNVSGVYH:aa313～aa327:ITGHRMAWDMMMNWS: aa702～aa710:PALSTGLIH）与NS3区一段T细胞表位非常集中的区域融合,利用原核表达系统,以pET-11d作为载体,在大肠埃希菌BL21（DE3）中经IPTG诱导表达获得融合蛋白,之后采用DEAE阴离子交换和镍离子柱亲和层析进行纯化后获得了HCV多表位融合蛋白。通过Western Blot验证融合蛋白的抗原活性。二、丙型肝炎病毒感染模型的建立长期以来,由于缺乏有效的HCV体外细胞培养体系,严重影响了对HCV生命周期的探讨及抗HCV药物的研发。本研究中,我们通过体外转录带有JFH1基因组全长的质粒从而获得了具有感染性的HCV JFH1毒株基因组全长RNA,之后进一步转染Huh7.5细胞建立了HCV的细胞培养体系,该体系能够产生有体外感染活性的HCVcc颗粒,我们使用反转录PCR以及间接免疫荧光两种技术检测到了转染后的细胞培养上清中HCVcc颗粒的存在,并且通过对Huh7.5细胞的再次感染证明了获得的HCVcc颗粒的感染性。三、评价丙型肝炎病毒多表位融合蛋白的细胞免疫原性和体液免疫原性我们通过流式细胞仪分析了免疫后的小鼠脾脏细胞以及外周血淋巴细胞经该多表位蛋白刺激后的增殖情况,显示出了比较好的细胞免疫效果,在小鼠体内产生了能够识别HCV相应抗原位点的典型特异CTL效应,说明免疫应答过程中的T淋巴细胞系统经过此抗原的刺激而得到了有效的激活,并在再次遇到相同的抗原肽时发挥其细胞毒性杀伤细胞效应。另外,该蛋白在家兔体内所诱导的抗体水平迅速升高并且能够维持相当长的时间,当注射到家兔体内的抗原剂量为200ug/只时,HCV中和抗体的检测结果也为阳性,提示HCV多表位融合蛋白可能具有中和HCV野生毒株的能力,可以应用到HCV预防性疫苗的开发上。
祁淑红[9]（2009）在《Al（OH）3和CpG ODN免疫佐剂对丙型肝炎病毒多表位抗原PCX3疫苗免疫效果影响的研究》文中认为丙型肝炎病毒（HCV）为单股正链RNA病毒,其基因组编码约3010～3033aa的蛋白前体,从N-端起依次为核心蛋白（C）、包膜蛋白（E）、非结构蛋白NS1-NS5B。HCV具有高度的变异性,能够迅速突变逃逸宿主的免疫系统。因此,给疫苗的研究带来许多的困难。近年来的研究提示理想的HCV疫苗必须能够诱发高水平、广谱而特异的体液免疫应答和细胞免疫应答。针对HCV的高度变异性及免疫特点,在HCV基因产物中优选了5个具有良好免疫原性的高度保守B/T细胞表位,组合成一个多表位抗原基因pcx,这些表位分别来自核心蛋白（1～16aa,132～141aa）,E1（126～135aa）,NS3（139～147aa）及NS5B（768～775aa）,以及破伤风毒素的T细胞表位用以增强T细胞免疫。pcx基因经过串联重复之后,构建成多表位抗原基因pcx3,与6×His-tag融合后,在E.coli宿主中获得高效表达,并通过Ni2+-NTA-agarose纯化。以HCV蛋白疫苗PCX3为抗原,分别加入Al（OH）3佐剂,CpG ODN佐剂,以及两种佐剂联合作用的复合佐剂,对雄性六周龄BALB/c小鼠进行常规免疫。Al（OH）3和CpG ODN复合佐剂与PCX3抗原联合作用组与其他免疫组相比,在ELISA检测小鼠血清中特异性IgG和IgM抗体实验中,该组小鼠产生的特异性IgG（1×106）和IgM（1×105）抗体滴度最高,持续时间最长;在非放射性细胞毒活性检测试剂盒检测NK细胞的自然杀伤效应（CTL）实验中,该组小鼠诱发的CTL杀伤效应（40.91%）,显着高于其他免疫组（P＜0.05）;流式细胞仪对小鼠淋巴细胞亚群进行分型分析发现,从第2周开始,该组小鼠体内CD4+/CD8+细胞比值（3.26）显着高于PCX3抗原单独作用组（P＜0.05）。结果表明,Al（OH）3和CpG ODN复合佐剂,可以从体液免疫和细胞免疫两方面对HCV蛋白疫苗PCX3的免疫效果进行增强,并且具有协同效应。
杨振[10]（2009）在《中国献血员人群丙型肝炎病毒“窗口期”感染分析》文中提出血液传播是丙型肝炎病毒（HCV）感染的一个重要途径之一。在我国所有临床使用的血液,全部需经过HCV抗体检测以确保血液安全。由于国际上HCV抗体酶联免疫诊断试剂已从第一代向第三代甚至第四代发展,同时也出现了新的HCV抗体诊断方法,如微粒子试剂和化学发光试剂,HCV抗体试剂的质量明显提高。这些试剂在中国的血液中心和医院也已开始使用,这样就提高了血液和血液制品的质量,同时也保障了临床治疗的安全。但是,由于理论上HCV感染存在一个“窗口期”,这一阶段尚无抗体的出现,利用抗体试剂无法检出HCV感染的存在。在实际中,国内外均有因存在“窗口期”问题而导致HCV输血感染的报道。因此,欧洲、美国等国家相继规定在血源筛查中使用HCV抗原和核酸（RNA）检测方法。但中国关于这方面的临床研究及流行病学调查相对薄弱,因此,无法制定关于血液HCV抗原和核酸检测的相关政策。本研究为解决中国因HCV“窗口期”造成的输血感染问题,分别利用了来自北京某血液中心的6190份献血员样品,四川成都某血液中心的766份献血员样品,广东深圳某血液中心的1693份献血员样品,566份河北廊坊某血液中心的HCV可疑感染样品,总共9215份血样,对中国HCV“窗口期”感染情况进行研究分析。HCV游离核心抗原检测发现：在8649份自然供血员血清中,确证检出一份游离核心抗原单独阳性血清,在566份高危人群HCV可疑感染者血清中,确证检出一份游离核心抗原和HCV抗体同时阳性血清,经抗体确证该份血清产生的抗体是核心区抗体（Core）。HCV RNA试剂检测这2份血清,全部阳性,病毒载量分别为42300（copies／ml）和653000（copies／ml）。同时,这两份血清送澳大利亚国家血液中心进行RNA复核,检测结果与我们一致。由于确证检出了游离核心抗原阳性的“窗口期”样品,尽管游离核心抗原的检出率较低,但对于中国庞大的献血员人群仍有其现实意义。核心总抗原检测发现,在收集的血清中,用核心总抗原试剂共筛出91份阳性血清,其中,自然献血员中7份,可疑感染者中84份,这84份可疑感染者血清中HCV抗体同时阳性76份,抗体阴性而总抗原阳性血清8份。应用HCV RNA试剂检测这8份血清,6份RNA为阳性。抗体筛查阴性而总抗原阳性的8份血清中仅确证检出一份单独游离核心抗原阳性样品,这是否与抗原抗体复合物的形成对抗体的检测造成了影响,产生了抗体检测的假阴性结果,尚有待进一步的研究。核心总抗原试剂共筛出的91份阳性血清中,有2份HCV RNA和抗体检测都呈阴性的样品。看来HCV感染存在一个核酸和抗体都阴性,核心总抗原阳性的阶段。这一现象值得重视。HCV RNA检测发现,18-60岁的正常献血员中,筛出7份RNA阳性而抗体阴性的血清,利用HCV核心总抗原试剂检测全部阳性,表明,我们筛查的献血员中“窗口期”样品比例达0.081%,高于西方的0.041%。在566份HCV可疑感染者血清中,也筛出6份HCVRNA阳性而抗体阴性的血清,利用HCV核心总抗原试剂检测,这6份也是阳性,可以认为这些血清也是“窗口期”样品。这13份血清送到澳大利亚国家血液中心进行RNA复核,检测结果与我们一致。在566份HCV可疑感染的献血员血清中,检测出84份核心总抗原阳性样品,阳性率14.84%。检出491份RNA阳性样品,阳性率86.75%。检出抗体阳性样品550份,阳性率97.17%。抗体检出率最高,但仍漏检6份核心抗原与核酸阳性血清。从理论上来说,核酸检测应该是最早期出现的,但伴随免疫压力,它又不是一直得以检出。在566份血清中就可以看出,它的检出率并不是最高的。综上所述,RNA试剂、抗原试剂以及抗体试剂在血清学检测时,所得结果并不完全平行,有一部分重叠检出,也有一部分交叉检出,由于检出了HCV游离核心抗原、核心总抗原以及RNA单独阳性或同时阳性但抗体阴性的“窗口期”样品,利用HCV抗体试剂对血液进行筛查的同时,使用抗原以及RNA试剂做必要的补充实验,可以减少因“窗口期”样品造成的漏检。因此推荐这些检测方法互相补充来解决“窗口期”问题可能是比较可行的。进行基因型别分析,健康献血员中筛出的7份HCVRNA阳性的样本,其中北京3份,基因型分别为2a、lb和3a型。成都1份,基因型为3b型,深圳3份,基因型分别为1a和两个lb型。在566份HCV可疑感染者血清中,对检出RNA阳性的491份血清进行型别分布分析,以1b、2a型为主,分别为41.5%和39.3%。对照已有报道的临床样本基因型别分布情况,献血员样本与临床样本HCV RNA型别分布是一致的。研究不同基因型别样品与病毒载量及转氨酶的相互关系,我们发现在HCV早期感染人群中,1b与2a基因型间病毒载量差异具有统计学意义。2a型人群HCV RNA载量明显高于1b型人群（P<0.01）,其他基因型别病毒载量均低于1b型。由于不同型别抗体检出率没有明显差异（P>0.05）,这说明2a型与其他基因型别不存在免疫压力的差别,表明2a型在自然复制过程中,与其他型别相比,存在复制优势。同时,不同基因型人群,丙氨酸转氨酶（ALT）水平的差异有统计学意义,2a型人群ALT明显高于1b型人群（P<0.01）。由此看来,这两个基因型别之间,HCV对肝的损伤程度可能有差别,2a型更易引起肝损伤,当然,这也需要得到临床进一步的研究来证实。其他基因型由于样本量太少,小样本与1b、2a基因型的大样本无法进行统计分析,也有待进一步研究。基于本研究,我们得出如下结论：（1）由于检出了HCV游离核心抗原、核心总抗原以及RNA单独阳性或同时阳性但抗体阴性的“窗口期”样品,表明,HCV感染“窗口期”的存在会严重威胁血液和血液制品的安全,因此,在HCV抗体筛查的基础上,对血液和血液制品的HCV RNA和核心抗原的进一步检测是必要的,能够减少“窗口期”样品的漏检：（2）在我国,HCV“窗口期”感染率为0.081%,高于西方国家的0.041%；（3）后“窗口期”感染的基因型主要为1b和2a,与我国已报道过的临床样本基因型别分布比例基本一致,有别于西方国家的基因型别分布。（4）2a基因型与其他型别相比,病毒载量有显着升高,它较其他基因型存在复制优势,这一发现,国内外尚没有相关报道。
二、丙型肝炎病毒NS3蛋白辅助T细胞表位研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、丙型肝炎病毒NS3蛋白辅助T细胞表位研究（论文提纲范文）
（1）生物信息学预测丙肝病毒与登革病毒T细胞交叉反应的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 登革病毒与丙型肝炎病毒病原学及流行病学特征分析 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（2）丙型肝炎（HCV）广谱中和抗体表位分析和作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 HCV流行病学 |
| 1.2 HCV基因组分子生物学特征 |
| 1.3 HCV研究模型 |
| 1.3.1 细胞培养模型 |
| 1.3.2 动物模型 |
| 1.4 HCV生命周期 |
| 1.5 HCV预防和治疗手段 |
| 1.5.1 HCV的 DAA治疗 |
| 1.5.2 HCV的抗体治疗和预防 |
| 1.6 HCV广谱中和抗体诱导对疫苗设计的启示 |
| 1.6.1 E1/E2 包膜糖蛋白诱导产生广谱中和抗体 |
| 1.6.2 HCV胚系抗体对疫苗设计的启示 |
| 1.7 8D6 筛选过程及表位分析、功能鉴定 |
| 1.8 课题设计思路 |
| 1.9 总结与展望 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 HCVcc病毒 |
| 2.1.3 抗体及蛋白 |
| 2.1.4 病人血清样本 |
| 2.1.5 试剂 |
| 2.1.6 主要实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 HCVpp中和实验 |
| 2.2.2 HCV E2 分选探针制备 |
| 2.2.3 抗体表达 |
| 2.2.4 Protein-G亲和层析纯化抗体 |
| 2.2.5 胚系抗体设计及改造 |
| 2.2.6 OCTET RED96 仪器检测抗原抗体亲和力 |
| 2.2.7 8D6 Fab制备 |
| 2.2.8 小角度X射线散射(SAXS) |
| 2.2.9 Docking |
| 2.2.10 HCVcc制备 |
| 2.2.11 HCV RNA电转 |
| 2.2.12 HCV耐药株构建 |
| 2.2.13 微中和实验 |
| 2.2.14 免疫荧光 |
| 2.2.15 HCV E2 截短突变体及丙氨酸扫描突变体构建 |
| 2.2.16 Lipo3000 脂质体DNA转染 |
| 2.2.17 酶联免疫吸附实验 |
| 2.2.18 8D6 表位保守性序列分析 |
| 2.2.19 数据分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 HCV广谱中和抗体8D6 的分离和初步评价 |
| 3.2 8D6 与纯化的重组Con1(1b亚型)E2 蛋白具有高亲和力 |
| 3.3 8D6 对不同基因型HCV病毒E2 蛋白具有广谱结合活性 |
| 3.4 8D6 对不同基因型HCVcc病毒具有广谱结合活性 |
| 3.5 8D6 对不同基因型HCV病毒E2 蛋白具有广谱中和活性 |
| 3.6 8D6 可以中和DAA药物耐药毒株 |
| 3.7 8D6 通过阻断E2与CD81 的结合来阻断病毒入侵 |
| 3.8 8D6 是构象表位抗体并且识别保守的E2 表位 |
| 3.9 8D6 识别E2 的具体表位探究 |
| 3.10 E2 N448 去糖基化对8D6 识别的影响 |
| 3.11 8D6 Fab-E2 小角散射(SAXS)模型 |
| 3.12 重组E2(1b/Con1)与8D6 Fab复合物模型 |
| 3.13 8D6 通过体细胞超频突变获得广谱中和活性 |
| 3.14 8D6在CDRH3 上存在一个对抗体广谱活性获得重要的CX_4C基序 |
| 3.15 通过8D6 胚系抗体筛选疫苗合适的HCV免疫原 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 缩略词表(中英文对照) |
| 附录二 抗体序列 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
（3）HCV和HBV的特异性T细胞免疫反应和分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 研究内容 |
| 第一章 聚集性献血导致的HCV感染的T细胞免疫研究 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.2.1 主要实验仪器 |
| 1.2.2 主要实验试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 研究对象 |
| 1.3.2 血样的采集与处理 |
| 1.3.3 抗HCV抗体的定性检测 |
| 1.3.4 临床信息的获得 |
| 1.3.5 HCV基因分型 |
| 1.3.6 HCV RNA足量 |
| 1.3.7 HCV多肽库的设计与合成 |
| 1.3.8 HCV特异性T细胞的刺激及流式分析 |
| 1.3.9 统计分析 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 研究对象的人口学特征 |
| 1.4.2 研究对象的临床特征 |
| 1.4.3 HCV慢性感染者的病毒特征 |
| 1.4.4 HCV病毒清除组与HCV慢性感染组有持续的CD8~+T细胞及CD4~+T细胞应答 |
| 1.4.5 多因子分泌 |
| 1.4.6 HCV特异性T细胞的表型特征 |
| 1.4.7 免疫抑制分子的表达特点 |
| 1.4.8 T细胞免疫与肝功能 |
| 1.5 小结与讨论 |
| 第二章 聚集性献血感染HCV的分子生物学研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要实验仪器 |
| 2.2.2 主要的试剂及耗材 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 HCV RNA提取 |
| 2.3.2 RNA反转录 |
| 2.3.3 全序列引物设计及测序 |
| 2.3.4 序列组装及分析 |
| 2.3.5 二代测序 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 HCV病毒基因组的各片段反转录PCR结果 |
| 2.4.2 HCV病毒5'/3' RACE扩增结果 |
| 2.4.3 全基因序列拼接 |
| 2.4.4 序列同源性分析及进化分析 |
| 2.4.5 二代测序 |
| 2.5 小结与讨论 |
| 第三章 盐桥在HBV特异性多肽呈递和T细胞识别中的作用机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验主要仪器 |
| 3.2.2 主要实验耗材及商品试剂 |
| 3.2.3 实验试剂及其配方 |
| 3.2.4 实验动物、菌株、载体 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 实验所用的多肽合成和载体构建 |
| 3.3.2 H-2K~d-HBV多肽免疫小鼠及脾细胞的获得 |
| 3.3.3 ELISPOT实验 |
| 3.3.4 H-2K~d和HLA-B~*4001分子的表达与纯化 |
| 3.3.5 HLA-B*4001-peptide(GETALALLLL)的结晶条件的筛选 |
| 3.3.6 HLA-B*4001 Χ-射线衍射及结构解析 |
| 3.3.7 圆二色谱实验检测H-2K~d-HBVpeptide的热稳定性 |
| 3.3.8 H-2K~d-HBV peptide四聚体的制备及流式染色 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 H-2K~d分子和HLA-B~*4001-分子的蛋白纯化 |
| 3.4.2 探究H-2K~d/HLA-B~*4001野生型/突变体与多肽的结合能力 |
| 3.4.3 探究H-2-K~d野生型及突变体结合多肽识别TCR |
| 3.4.4 H-2K~d和HLA-B~*4001形成的两种不同的盐桥 |
| 3.4.5 盐桥对MHCI和结合肽的结构构象的影响 |
| 3.4.6 潜在盐桥广泛存在不同脊椎动物中 |
| 3.5 讨论 |
| 第二部分 文献综述 |
| 第四章 HCV病毒及细胞免疫概述 |
| 4.1 HCV病毒的流行病学及临床 |
| 4.1.1 HCV的流行 |
| 4.1.2 HCV的临床表现 |
| 4.1.3 HCV病毒的检测和实验室诊断 |
| 4.1.4 HCV的防控及治疗 |
| 4.2 HCV病毒的基本特征 |
| 4.2.1 HCV病毒的形态特征 |
| 4.2.2 HCV病毒的基因组成及全基因组测序 |
| 4.2.3 HCV病毒的生活周期 |
| 4.2.4 HCV病毒的传播及变异 |
| 4.3 HCV病毒感染的免疫反应特征 |
| 4.3.1 血清学反应 |
| 4.3.2 T细胞免疫 |
| 第五章 MHC分子结构免疫学概述 |
| 5.1 MHC的概念 |
| 5.2 MHC的抗原呈递及T细胞识别 |
| 5.2.1 MHCⅠ类途径 |
| 5.2.2 MHCⅡ类途径 |
| 5.2.3 外源抗原的MHCⅠ类途径交叉呈递 |
| 5.3 MHC及相关分子的结构特征 |
| 5.3.1 MHCⅠ类分子的结构特征 |
| 5.3.2 MHCⅡ类分子的结构 |
| 5.3.3 非经典的MHCⅠ类分子结构 |
| 5.4 MHC分子结构在T细胞免疫研究中的应用 |
| 5.4.1 MHC结构研究对于MHC分子分类的影响-HLA超级型及其意义 |
| 5.4.2 MHC分子对TCR识别的限制性 |
| 5.4.3 MHC交叉呈递和TCR交叉识别的结构基础 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录1 缩略表 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（4）用于制备HCV抗原抗体一体化检测试剂盒相关试剂的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 HCV的基因组结构与生物学特性 |
| 1.3 丙型肝炎的诊断方法 |
| 1.3.1 血清HCV抗体检测 |
| 1.3.2 血清HCV核心抗原检测 |
| 1.3.3 HCV RNA检测 |
| 1.3.4 其他检测方法 |
| 1.4 HCV传播途径 |
| 1.4.1 血液、血制品传播 |
| 1.4.2 经性传播 |
| 1.4.3 母婴传播 |
| 1.5 丙型肝炎病毒抗原抗体一体化检测试剂盒的国内外研究现状 |
| 1.6 丙型肝炎病毒抗原抗体一体化检测试剂盒的研究意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 1.7.1 用于检测针对丙型肝炎病毒抗体的融合蛋白抗原的表达及纯化 |
| 1.7.2 携带丙型肝炎病毒核心不同抗原表位蛋白的表达及纯化 |
| 1.7.3 针对人IgG Fc段单克隆抗体的制备 |
| 1.7.4 针对丙型肝炎病毒核心HCV C101-115抗原表位小肽单克隆抗体的制备 |
| 第2章 用于检测针对丙型肝炎病毒抗体的融合蛋白抗原的表达及纯化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株及质粒载体 |
| 2.1.2 材料及试剂 |
| 2.1.3 试剂配制 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 HCV core-NS3-5基因的克隆 |
| 2.2.2 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 |
| 2.2.3 连接产物转化E. coli DH5α感受态细胞 |
| 2.2.4 pGEMT/HCV core-NS3-5阳性克隆质粒的获得和鉴定 |
| 2.2.5 携带6His-HCV core-NS3-5融合蛋白原核表达载体的构建 |
| 2.2.6 6His-HCV core-NS3-5融合蛋白的原核表达与纯化 |
| 2.2.7 6His-HCV core-NS3-5融合蛋白的Western Blot检测 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 HCV core-NS3-5基因的克隆 |
| 2.3.2 携带6His-HCV core-NS3-5融合蛋白原核表达载体的构建 |
| 2.3.3 6His-HCV core-NS3-5融合蛋白的原核表达与纯化 |
| 2.3.4 6His-HCV core-NS3-5融合蛋白的Western Blot检测 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 携带丙型肝炎病毒核心抗原表位HCV C8-22及HCV C101-115的融合蛋白的表达与纯化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株及质粒载体 |
| 3.1.2 材料及试剂 |
| 3.1.3 试剂配制 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 HCV C8-22小肽的获得 |
| 3.2.2 HBc-HCV C8-22融合蛋白原核表达载体的构建 |
| 3.2.3 HBc-HCV C8-22融合蛋白的诱导表达与纯化 |
| 3.2.4 Grn E-HCV C8-22融合蛋白原核表达载体的构建 |
| 3.2.5 Grn E-HCV C8-22融合蛋白的诱导表达与纯化 |
| 3.2.6 Western Blot检测原核表达的HCV C8-22融合蛋白 |
| 3.2.7 携带HCV C8-22小肽真核表达载体的构建 |
| 3.2.8 HCV C101-115小肽的获得 |
| 3.2.9 HBc-HCV C101-115融合蛋白原核表达载体的构建 |
| 3.2.10 HBc-HCV C101-115融合蛋白的诱导表达与纯化 |
| 3.2.11 Grn E-HCV C101-115融合蛋白原核表达载体的构建 |
| 3.2.12 Gm E-HCV C101-115融合蛋白的诱导表达与纯化 |
| 3.2.13 Western Blot检测原核表达的HCV C101-115融合蛋白 |
| 3.2.14 携带HCV C101-115小肽真核表达载体的构建 |
| 3.2.15 HCV C8-160基因的克隆 |
| 3.2.16 GST-HCV C8-160融合蛋白原核表达载体的构建及其表达纯化 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 HBc-HCV C8-22融合蛋白原核表达载体的构建 |
| 3.3.2 HBc-HCV C8-22融合蛋白的原核表达及纯化 |
| 3.3.3 Gm E-HCV C8-22融合蛋白原核表达载体的构建 |
| 3.3.4 Gm E-HCV C8-22融合蛋白的原核表达及纯化 |
| 3.3.5 Western Blot检测原核表达的HCV C8-22融合蛋白 |
| 3.3.6 携带HCV C8-22小肽真核表达载体的构建及表达 |
| 3.3.7 HBc-HCV C101-115融合蛋白原核表达载体的构建 |
| 3.3.8 HBc-HCV C101-115融合蛋白的原核表达及纯化 |
| 3.3.9 Gm E-HCV C101-115融合蛋白原核表达载体的构建 |
| 3.3.10 Gm E-HCV C101-115融合蛋白的原核表达及纯化 |
| 3.3.11 Western Blot检测原核表达的HCV C101-115融合蛋白 |
| 3.3.12 携带HCV C101-115小肽真核表达载体的构建及表达 |
| 3.3.13 HCV C8-160基因的克隆 |
| 3.3.14 GST-HCV C8-160融合蛋白原核表达载体的构建及其表达纯化 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 针对人IgG Fc段以及丙型肝炎病毒核心抗原不同表位单克隆抗体的制备 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 细胞系 |
| 4.1.2 材料及试剂 |
| 4.1.3 试剂配制 |
| 4.1.4 主要仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 抗人IgG单克隆抗体的制备 |
| 4.2.2 抗人IgG单克隆抗体可特异性结合Fc段的鉴定 |
| 4.2.3 抗人IgG单克隆抗体的亚类测定和纯化 |
| 4.2.4 抗HCV C101-115单克隆抗体的制备 |
| 4.2.5 抗HCV C101-115单克隆抗体的鉴定 |
| 4.2.6 抗HCV C101-115单克隆抗体的亚类测定和纯化 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 制备抗人IgG单克隆抗体免疫鼠血清效价测定 |
| 4.3.2 抗人IgG单克隆抗体可特异性结合Fc段的鉴定 |
| 4.3.3 抗人IgG单克隆抗体的亚类测定和纯化 |
| 4.3.4 制备抗HCV C101-115单克隆抗体免疫鼠血清效价测定 |
| 4.3.5 抗HCV C101-115单克隆抗体特异性的鉴定 |
| 4.3.6 抗HCV C101-115单克隆抗体亚类测定和纯化 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间获奖情况 |
（5）丙型肝炎病毒非结构蛋白3解旋酶保守性表位单克隆抗体及其意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 HCV基本分子生物学特性 |
| 1.2 HCV流行病学及基因分布 |
| 1.3 HCV诊断 |
| 1.4 HCV抗病毒治疗与疫苗研究 |
| 1.5 HCV研究模型 |
| 1.6 HCV NS3解旋酶(HCV Helicase)蛋白结构与功能 |
| 1.7 本研究的目的和意义 |
| 2 材料 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 菌株,质粒,细胞株和实验动物 |
| 2.3 引物合成 |
| 2.4 血清来源 |
| 2.5 合成多肽 |
| 2.6 主要仪器与耗材 |
| 2.7 主要溶液配置 |
| 3 方法 |
| 3.1 HCV T-rNS3目的基因克隆的构建 |
| 3.2 重组蛋白与天然蛋白的获取方法 |
| 3.3 HCV NS3单克隆抗体制备 |
| 3.4 单克隆抗体鉴定 |
| 3.5 表位多肽检测人血清及表位评价 |
| 3.6 抗体对HCV Helicase功能抑制实验 |
| 3.7 软件 |
| 3.8 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 成功构建HCV T-rNS3克隆载体 |
| 4.2 重组蛋白与天然蛋白的获取 |
| 4.3 HCV NS3单克隆抗体制备与特征分析 |
| 4.4 B细胞表位鉴定以及保守性分析 |
| 4.5 B细胞线性抗原表位多肽与人血清样品的反应性评价 |
| 4.6 抗体对HCV Helicase功能的抑制 |
| 5 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
| 统计学审稿证明 |
（6）CD8+T细胞免疫压力下丙型肝炎病毒的适应性变异（论文提纲范文）
| 中英文缩写名词对照表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）丙型肝炎病毒多表位疫苗研究—重组抗原PCXZ及DNA疫苗pDNA-PCXZ在BALB/c体内的免疫原性（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 前言 丙型肝炎病毒疫苗：挑战和进展 |
| 参考文献 |
| 第二部分 HCV多表位抗原PCXZ在BALB/c小鼠体内诱导B细胞和T细胞免疫应答 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 HCV多表位DNA疫苗在BALB/c小鼠体内的免疫应答 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 小结 |
| 附录 |
| 发表论文 |
| 致谢 |
（8）丙型肝炎病毒多表位融合蛋白的表达及免疫效果的评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 丙型肝炎病毒多表位融合蛋白在原核系统中的表达 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 丙型肝炎病毒感染模型的建立 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 评价丙型肝炎病毒多表位融合蛋白的细胞免疫原性和体液免疫原性 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
（9）Al（OH）3和CpG ODN免疫佐剂对丙型肝炎病毒多表位抗原PCX3疫苗免疫效果影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 一 前言(INTRODUCTION) |
| 1.1 丙型肝炎以及丙型肝炎疫苗 |
| 1.1.1 丙型肝炎简介 |
| 1.1.2 丙型肝炎病毒的分子生物学 |
| 1.1.3 丙型肝炎病毒的基因组结构及功能 |
| 1.1.4 HCV复制 |
| 1.1.5 病毒颗粒的生活周期 |
| 1.1.6 HCV的治疗 |
| 1.1.7 丙型肝炎疫苗的研究进展 |
| 1.2 佐剂 |
| 1.2.1 免疫佐剂的功能 |
| 1.2.2 免疫佐剂作用机理 |
| 1.2.3 免疫佐剂的分类 |
| 1.2.4 几种常用佐剂 |
| 1.2.5 佐剂的研究进展 |
| 1.3 总结与展望 |
| 二 材料与方法(MATERIALS AND METHODS) |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 常用储存液以及缓冲液 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 目的基因的表达 |
| 2.2.2 PCX3蛋白的表达 |
| 2.2.4 纯化蛋白的复性 |
| 2.2.5 纯化蛋白的定量 |
| 2.2.6 Al(OH)_3佐剂的配制 |
| 2.2.7 CpG ODN佐剂的配制 |
| 2.2.8 免疫BALB/c小鼠 |
| 2.2.9 小鼠血清特异抗体的检测 |
| 2.2.10 淋巴细胞亚群分析 |
| 2.2.11 细胞毒T淋巴细胞效应(CTL效应) |
| 2.2.12 实验小鼠安全性评价 |
| 2.2.13 统计学分析 |
| 三 结果分析(RESULTS AND ANALYSIS) |
| 3.1 PCX3目的蛋白的表达和纯化 |
| 3.1.1 目的基因的小量表达 |
| 3.1.2 PCX3目的蛋白的大量表达和纯化 |
| 3.1.3 蛋白质浓度的测定 |
| 3.2 不同佐剂诱导的特异性体液免疫应答 |
| 3.2.1 检测特异性抗PCX3 IgG抗体 |
| 3.2.2 检测特异性抗PCX3 IgM小鼠抗体 |
| 3.3 淋巴细胞亚群分析 |
| 3.4 细胞毒T淋巴细胞效应(CTL效应) |
| 3.5 安全性评价 |
| 四 讨论(DISCUSSION) |
| 4.1 HCV蛋白疫苗设计方案 |
| 4.2 PCX3蛋白纯化,复性和定量 |
| 4.3 小鼠免疫的疫苗配制 |
| 4.4 特异性抗体检测 |
| 4.5 流式细胞仪分析小鼠全血的淋巴细胞亚群 |
| 4.6 细胞毒T淋巴细胞效应 |
| 4.7 AL(OH)_3佐剂与CPG ODN佐剂的协同效应 |
| 参考文献(REFERENCES) |
| 致谢 |
（10）中国献血员人群丙型肝炎病毒“窗口期”感染分析（论文提纲范文）
| 缩写词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 中国自然献血员人群丙型肝炎病毒"窗口期"感染检测数据分析 |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 1. 试剂 |
| 2. 样品 |
| 3. 主要仪器设备 |
| 4. 检测与分析 |
| 5. 实验工作流程图 |
| 实验结果 |
| 1. HCV抗体检测 |
| 2. HCV游离核心抗原检测 |
| 3. HCV核心总抗原检测 |
| 4. HCVRNA检测及基因型别分析 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 中国献血员中高危人群丙型肝炎病毒"窗口期"感染流行病学调查与分析 |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 1. 试剂 |
| 2. 样品 |
| 3. 仪器设备 |
| 实验结果 |
| 1. 对收集的廊坊地区献血员进行人群分布情况的流行病学调查 |
| 2. 所收集样本HCV抗体检测 |
| 3. HCV游离核心抗原检测 |
| 4. 所收集样本总抗原检测 |
| 5. HCV RNA检测 |
| 6. HCV RNA阳性血清基因型别检测 |
| 7. 不同HCV基因型别样品的病毒载量和ALT检测以及基因型别与它们的关系研究 |
| 8. 不同HCV基因型别样品对应HCV基因不同区域抗体的检测 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附件:原始数据 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 第一部分:HCV基因结构与功能分析 |
| 第二部分:HCV疫苗的研制 |
| 第三部分:细胞免疫在HCV预防和治疗中的作用 |
| 第四部分:HCV体液免疫疫苗的研制 |
| 简历 |
| 发表文章 |
| 致谢 |
四、丙型肝炎病毒NS3蛋白辅助T细胞表位研究（论文参考文献）
- [1]生物信息学预测丙肝病毒与登革病毒T细胞交叉反应的研究[D]. 朱丹. 昆明医科大学, 2021(01)
- [2]丙型肝炎（HCV）广谱中和抗体表位分析和作用机制研究[D]. 夏静. 中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所), 2019(07)
- [3]HCV和HBV的特异性T细胞免疫反应和分子机制研究[D]. 纪伟. 中国疾病预防控制中心, 2019(12)
- [4]用于制备HCV抗原抗体一体化检测试剂盒相关试剂的研究[D]. 刘亚妮. 陕西师范大学, 2016(04)
- [5]丙型肝炎病毒非结构蛋白3解旋酶保守性表位单克隆抗体及其意义[D]. 边奕鑫. 南方医科大学, 2013(03)
- [6]CD8+T细胞免疫压力下丙型肝炎病毒的适应性变异[D]. 柯晓煜. 华中科技大学, 2012(07)
- [7]丙型肝炎病毒多表位疫苗研究—重组抗原PCXZ及DNA疫苗pDNA-PCXZ在BALB/c体内的免疫原性[D]. 杨桂梅. 复旦大学, 2010(08)
- [8]丙型肝炎病毒多表位融合蛋白的表达及免疫效果的评价[D]. 邱丰. 中国疾病预防控制中心, 2010(01)
- [9]Al（OH）3和CpG ODN免疫佐剂对丙型肝炎病毒多表位抗原PCX3疫苗免疫效果影响的研究[D]. 祁淑红. 复旦大学, 2009(02)
- [10]中国献血员人群丙型肝炎病毒“窗口期”感染分析[D]. 杨振. 中国协和医科大学, 2009(04)